CN117417429A - 肿瘤微环境激活的细胞因子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种肿瘤微环境激活的细胞因子IFNα及其用途。本公开揭示了一种优化改造的INF‑α，以其搭配肿瘤高表达的可以识别切割的底物和掩蔽体(R)，可形成生物分子偶联物，该生物分子偶联物在正常组织中INF‑α活性被阻碍、不造成对正常组织的毒性，在肿瘤环境中INF‑α活性被激活、进行有效的肿瘤抑制。本公开的偶联物，可使得INF‑α的抑制活性高度聚焦于肿瘤环境中，从而实现非常理想的抑瘤效应。

Description

肿瘤微环境激活的细胞因子及其应用
技术领域
本公开属于生物化学领域；更具体地，本公开涉及一种肿瘤微环境激活的细胞因子及其应用。
背景技术
细胞因子是分子信使，它允许免疫系统的细胞相互交流，以产生对目标抗原的协调、稳健但自限性的反应。虽然免疫系统的许多形式的交流是通过直接的细胞间相互作用发生的，但细胞因子的分泌使免疫信号以多方面和有效的方式快速传播。
近年来，许多细胞因子，包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21，进入晚期癌症患者的临床试验。基于在动物模型中发现的几种促炎细胞因子的强效抗肿瘤活性，重组干扰素-α和白细胞介素-2用于治疗多种恶性肿瘤临床研究被批准，即使疗效还亟待提高。
干扰素根据它们与称为I型、II型和最近描述的III型IFN受体的特定受体结合的能力进行分类。虽然在向黑色素瘤患者提供辅助IFNα时，大剂量IFNα是最常用的方案，但非常需要具有更好治疗指数的疗法，目前正在研究多种这种情况下的各种其他方案。使用IFN的经验已经形成了识别和管理毒性和副作用的既定指南。IFNα的毒性特征通常与剂量有关，大多数副作用可以在不停止治疗的情况下控制，全身症状包括发热、疲乏、头痛、胃肠道症状和肌痛是很常见的，并且可能会发生在80％或更多的患者身上。IFNα也使一些患者的肝酶升高，特别是在高剂量静脉注射期间，此时应经常监测患者，并在治疗期间对肝酶升高的患者保持治疗或减少剂量。因此，降低IFNα的使用剂量、提高IFNα的给药效果，是这一领域亟待解决的问题。
发明内容
本公开的目的在于提一种供肿瘤微环境激活的IFNα细胞因子及其用途。
在本公开的第一方面，提供一种IFNα细胞因子生物分子偶联物，有以下结构：
R1-AAN-PABC-R3-S-Cys-IFNα
其中，
Cys代表包含在IFNα表面单点突变成的半胱氨酸残基；
S代表半胱氨酸残基上的硫原子；
IFNα具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
R1是一个阻止IFNα突变体与它的配体或受体结合的基团；
AAN代表三肽，A为丙氨酸，N为天冬氨酸，PABC为对-氨基苄基氨甲酰基；
R3是一个带有EMC基团与IFNα的单点突变的半胱氨酸的硫原子共价偶联形成的连接臂，其作用是当AAN断裂后，R3结构仍偶联在细胞因子上，R3-S-Cys-IFNα部分恢复，完全恢复，甚至提高与IFNα受体的亲合力。
在一个或多个实施方式中，所述的生物分子偶联物中R1选自(但不限于)分子量44至132000的聚乙二醇，例如1000至50000、3000至80000或10000至60000的聚乙二醇。
在一个或多个实施方式中，所述IFNα突变体为INF-α进行单点突变后获得的突变体，其氨基酸序列根据SEQ ID NO:1，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys。
在一个或多个实施方式中，所述的生物分子偶联物中，R1选自：
在一个或多个实施方式中，所述的生物分子偶联物中，R3选自(但不限于)：
在一个或多个实施方式中，所述的生物分子偶联物中，R1-AAN-PABC-R3的结构选自：
在本公开的另一方面，提供所述的生物分子偶联物的用途，用于制备抑制肿瘤的组合物或药盒。
在本公开的另一方面，提供所述的生物分子偶联物的用途，用于与抗肿瘤抗体联合、制备抑制肿瘤的组合物或药盒。
在本公开的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的组合物或药盒，所述组合物或药盒中含有所述的生物分子偶联物；较佳地，所述组合物还含有药学上可接受的载体。
在一个或多个实施方式中，所述组合物中还含有抗肿瘤抗体。
在一个或多个实施方式中，所述药盒中还含有：抗肿瘤抗体或含有抗肿瘤抗体的组合物。
在一个或多个实施方式中，所述的抗肿瘤抗体是抗PD-1抗体。
在一个或多个实施方式中，所述的生物分子偶联物与所述抗PD-1抗体的按照质量比为1:(0.05～50)(如1:0.1，1:0.15，1:0.2，1:0.4，1:0.5，1:0.6，1:0.8，1:1，1:2，1:4，1:5，1:6，1:8，1:10，1:20，1:30，1:40)；较佳地为1:(0.2～8)；更佳地为1:(0.4～5)。
在一个或多个实施方式中，所述的组合物的剂型包括(但不限于)：注射剂，输液剂，粉剂，片剂，胶囊剂等；较佳地为注射剂。
在一个或多个实施方式中，所述药盒中包括容器，所述的INF-α突变体和/或抗肿瘤抗体或包含其的组合物被置于容器中。
在一个或多个实施方式中，所述的容器包括(但不限于)：注射器。
在一个或多个实施方式中，所述的药盒中还含有：使用说明书，说明抑制肿瘤的方法。
在本公开的另一方面，提供一种制备肿瘤微环境中活化的INF-α的方法，包括：将INF-α进行单点突变，使其氨基酸序列的特定残基突变为Cys。
在本公开的另一方面，提供一种INF-α突变体，其为INF-α进行单点突变后获得的突变体，其氨基酸序列根据SEQ ID NO:1，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys。
在本公开的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的INF-α突变体。
在本公开的另一方面，提供一种表达载体，它含有所述的多核苷酸。
在本公开的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本公开的另一方面，提供一种生产所述的INF-α的突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的INF-α突变体。
在本公开的另一方面，提供所述的INF-α突变体的用途，用于与R1-AAN-PABC-R3偶联形成抑制肿瘤的生物分子偶联物；其中，R1是一个阻止IFNα突变体与它的配体或受体结合的基团；AAN代表三肽，A为丙氨酸，N为天冬氨酸，PABC为对-氨基苄基氨甲酰基；R3是一个带有EMC基团与IFNα的单点突变的半胱氨酸的硫原子共价偶联形成的连接臂，其作用是当AAN断裂后，R3结构仍偶联在细胞因子上，R3-S-Cys-IFNα部分恢复，完全恢复，甚至提高与IFNα受体的亲合力。
在一个或多个实施方式中，所述的抑制肿瘤包括：预防、缓解和/或治疗肿瘤。
在一种或多种实施方式中，所述的抗肿瘤抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在一种或多种实施方式中，所述的抗PD-1抗体为任意的特异性中和/结合PD-1的抗体。
在一个或多个实施方式中，所述的肿瘤包括：黑色素瘤，NSCLC，头颈鳞状细胞癌，尿路上皮癌，经典霍奇金淋巴癌，胃癌，食管胃交界腺癌，宫颈癌，B细胞淋巴癌，肝细胞癌，默克尔细胞癌，肾细胞癌，原发性肝癌，小细胞肺癌。
本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、突变的INF-α与偶联物偶联后以及激活后对细胞信号传导的影响情况。
图2、在肿瘤微环境中活化的INF-α在MC38肿瘤中的治疗效果。
图3、INF-α的偶联物与抗PD-1抗体联合应用的抑瘤效果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种优化改造的INF-α，以其搭配肿瘤高表达的可以识别切割的底物和掩蔽体(R)，可形成生物分子偶联物，该生物分子偶联物在正常组织中INF-α活性被阻碍、不造成对正常组织的毒性，在肿瘤环境中INF-α活性被激活、进行有效的肿瘤抑制。本公开的偶联物，可使得INF-α的抑制活性高度聚焦于肿瘤环境中，从而实现非常理想的抑瘤效应。
术语
如本文所用，除非另外说明，“IFNα突变体”、“突变型IFNα”可互换使用，是指对野生型的IFNα进行突变后的产物；较佳地，是指对应于野生型IFNα(如SEQ ID NO:1)，发生以下位置的氨基酸残基突变后所构成的蛋白：Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162”；较佳地，所述Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68的残基突变形成的Cys。
如本文所用，若需要表示野生型的IFNα，其被称为WT、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白。
如本文所用，“重组的(Recombinant)”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。
如本文所用，“抗体”涵盖了单克隆抗体，多克隆抗体，二聚体，多聚体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要能表现出想要的生物学活性即可。
如本文所用，“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本公开的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”、“包含”或“包括”中。所有重量百分比或体积百分比的总和应等于100％。
如本文所用，所述的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”等，是指具有统计学意义的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。如与对照组相比，显著“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”；更具体例如20％以上、较佳的50％以上、更佳的80％以上的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。本公开中，除非另外说明，所述的抑制肿瘤包括：预防、缓解和/或治疗肿瘤。
如本文所用，所述的抗PD-1抗体为任意的特异性中和/结合PD-1的抗体。
本公开中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，“药学上可接受的载体”是用于将本公开的活性组分传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。“药学上可接受的载体”可以是液体或固体。
如本文所用，“有效量”表示成分的量足以产生所需的反应。
INF-α突变体
本公开中，提供一种INF-α突变体，其氨基酸序列的Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys；优选地Arg149残基突变为Cys。
本公开的INF-α突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本公开还包括所述INF-α突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本公开的天然INF-α突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本公开的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的INF-α突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本公开上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys；优选地Arg149残基突变为Cys。
在本公开中，术语“INF-α突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括INF-α突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本公开上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys；优选地Arg149残基突变为Cys。
在本公开中，术语“INF-α突变体”还包括(但并不限于)：与所述的INF-α突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本公开上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys；优选地Arg149残基突变为Cys。
本公开还提供所述INF-α突变体的类似物。这些类似物与所述INF-α突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本公开的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本公开还提供了编码本公开INF-α突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。
本公开的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本公开也涉及包含本公开的多核苷酸的载体，以及用本公开的载体或INF-α突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本公开所述突变的酶的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本公开的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的INF-α突变体。一般来说有以下步骤：(1).用本公开的编码INF-α突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本公开中，INF-α突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含INF-α突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本公开中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，优选地如大肠杆菌；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。本公开建立的重组细胞(宿主细胞)可以用常规方法培养，表达本公开的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在表达时，本公开的INF-α突变体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本公开的优化的INF-α突变体有多方面的与INF-α特性相关的用途，包括用于作为抑制肿瘤的活性分子。应理解，表达该突变体的宿主细胞或其表达产物(如裂解产物或分泌产物)也具有该用途。
在一种优选的实施方式中，所述的INF-α突变体用于与R1-AAN-PABC-R3偶联形成抑制肿瘤的生物分子偶联物。
生物分子偶联物
本公开所述的INF-α突变体可以被制备成生物分子偶联物，有以下结构：
R1-L-IFNα突变体
R1是IFNα突变体的保护基团，它可以选自能够阻止IFNα突变体与其配体或受体结合的任何基团，以防止其受到其他分子的干扰，例如，在其到达病理性微环境，如肿瘤微环境之前阻止其与其配体或受体结合的分子。合适的R1可选自聚乙二醇，聚乙二醇-C1-5烷基羰基，萘基羰基，喹啉基羰基，芴基羰基，金刚烷基羰基。
上述结构式中每个R基团独立地是C1-4烷基；每个n独立地是1至30000范围内的整数，例如1至15000，1至5000，1至2000，1至300，1至150，1至50，1至20的整数或3至12；聚乙二醇或Pegm表示分子量为44至132000的聚乙二醇，例如1000至50000或10000至30000的聚乙二醇；m表示聚乙二醇的分子量；波浪线表示连接所述L的R1的位置。
在一些实施方案中，R1可选自：
/>
在本公开中，L为linker连接子部分；较佳地L包括L1和L2；较佳地L1为AA-PABC，L2为R3；其中，AA为二肽或三肽片断(即2-3个氨基酸通过肽键连接形成的片段)，优选Ala-Ala-Asn(甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺)，PABC为对-氨基苄基氨甲酰基。
在本公开中，L2也可以为可切割的连接臂。它可以是能够被蛋白水解酶，蛋白酶或肽酶活化的肽。在本公开中，蛋白水解酶，蛋白酶或肽酶可以是存在于病理微环境中的各种蛋白水解酶，蛋白酶或肽酶。例如，蛋白酶可能是半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，谷氨酸蛋白酶，苏氨酸蛋白酶，明胶酶，金属蛋白酶或天冬酰胺肽裂解酶。在一些实施方案中，L2也可以为被天冬酰胺内肽酶(Legumain)，组织蛋白酶B，组织蛋白酶C，组织蛋白酶D，组织蛋白酶E，组织蛋白酶K，组织蛋白酶L，激肽释放酶，hK1，hK10，hK15，纤溶酶，胶原酶，IV型胶原酶，星形胶质素，Xa因子，胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，胰蛋白酶样蛋白酶，弹性蛋白酶样蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶，猕猴桃蛋白酶(actinidain)，菠萝蛋白酶，钙蛋白酶，半胱天冬酶，半胱天冬酶-3，Mirl-CP，木瓜蛋白酶，HIV-1蛋白酶，HSV蛋白酶，CMV蛋白酶，凝乳酶，肽酶(pepsm)，间质蛋白酶(matriptase)，天冬酰胺内肽酶，血浆蛋白酶(plasmepsm)，猪笼草蛋白酶(nepenthesin)，金属外肽酶，金属内切蛋白酶(metalloendopepasease)，基质金属蛋白酶(MMP)，MMP1，MMP2，MMP3，MMP8，MMP9，MMP10，MMP11，MMP12，MMP13，MMP14，ADAM10，ADAM12，尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)，肠内激酶，前列腺特异性抗原(PSA，hK3)，白细胞介素-113转化酶，凝血酶，FAP(FAP-a)，跨膜肽酶(meprin)，颗粒酶，二肽基肽酶和二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26)中的至少一种切割。在优选的实施例中，本公开的内容可涉及天冬酰胺内肽酶，其在肿瘤微环境中主要由肿瘤细胞表达和分泌。通过天冬酰胺内肽酶的表达，肿瘤相关巨噬细胞(M2型)也不同于单核细胞和炎性巨噬细胞(M1型)。在本公开中，多肽可以是蛋白水解酶的底物，可以被蛋白水解酶识别和切割。本公开的L2可以由-L2a-，-L2b-，-L2a-N-，-L2a-D-，-L2a-AAN-，-L2a-AAD-或-L2a-L2b-表示；其中L2a是能够被一种或多种蛋白水解酶在酰胺键上切割的肽；L2b是一种可以通过侧链中的氨基与PABC形成氨基甲酸酯的肽，氨基甲酸酯可被一种或多种蛋白水解酶切割；A是丙氨酸；N是天冬酰胺，其侧链中的氨基与附近基团形成氨基甲酸酯，氨基甲酸酯可被天冬酰胺内肽酶切割；D是天冬氨酸，其侧链中的氨基与PABC形成氨基甲酸酯，且可以被颗粒酶B裂解。L2a和L2b可以通过形成酰胺键而连接。在天冬酰胺内肽酶之后，颗粒酶B裂解L2和PABC之间的键(例如氨基甲酸酯)，PABC可以快速地自动释放。
在一些实施例中，能够被蛋白水解酶活化的合适的多肽可以是三肽。在本领域已知的病理微环境中能够被蛋白水解酶识别和切割(活化)的任何底物肽可以用作本文公开的L2。此类肽具有WO 2016/026458中公开的结构，其主体通过引用并入本公开。在一些实施方案中，在适用于本公开的三肽结构中，与R1连接的氨基酸残基可以选自Ala，Thr，Val和Ile，中间氨基酸残基可以选自Ala，Thr，Val和Asn，第三个氨基酸残基可选自Asn和Asp。通常，L通过其氨基酸残基的氨基以酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲或腙的连接方式与R1连接，并通过其氨基酸残基的羧基以酰胺，酯，氨基甲酸酯，尿素或腙的连接方式与PABC连接。在本公开的一些优选实施方案中，三肽选自Ala-Ala-Asn和Ala-Ala-Asp。Ala-Ala-Asn可以被天冬酰胺内肽酶识别和切割，并且Ala-Ala-Asp可以被颗粒酶识别和切割。
合适的R3可以用下式表示：
其中Rc选自C1-12烷基，C1-12氧烷基-C1-12烷基，C1-12烷基-C3-8环烷基，(C1-4烷基-O)p-C1-12烷基，C1-12烷基羰基氨基-(C1-4烷基-O)p-C1-12烷基，苯基-C1-12烷基，C3-8环烷基，C1-12烷基-C3-8环烷基-C1-12烷基和C1-12烷基-苯基-C1-12烷基，其中苯基可以为一个或两个任一取代的苯基，取代基可以为卤素原子；
在本公开的一些实施例中，具体的R3的结构可以选自：
在本公开的偶联物中，R3可与IFNα突变体的特定位置的半胱氨酸的S形成共价连接。R1通过蛋白水解酶从R1-AAN-PABC-R3-S-Cys-IFNα上切割下来，并释放PABC-R3-S-Cys-IFNα。然后PABC自动脱落，R3-S-Cys-IFNα突变体被释放。
应当理解的是，在本公开中，在每个指示的公式中使用的波浪线指示包含波浪线的部分与其他部分的连接位置。
本公开所述的偶联物中，例如R1-AAN-PABC-R3，R1-AAN-PABC-R3-S-Cys-IFNα等可通过本领域已知的方法合成。
组合物
本公开还包括含有所述生物分子偶联物的组合物(如药物组合物)，其包含如本文所述的偶联物。药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。载体可以是任何药学上可接受的载体或赋形剂，其可以根据剂型和给药方式而变化。药学上可接受的载体通常是安全且无毒的，并且可包含在制药工业中配制药物组合物中使用的任何已知物质，包括填料，稀释剂，凝结剂，粘合剂，润滑剂，助流剂，稳定剂，着色剂，润湿剂和崩解剂等。药学上可接受的合适的载体包括糖，如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂和/或磷酸钙，如磷酸三钙或磷酸氢钙；淀粉，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；二氧化硅，滑石粉，硬脂酸或其盐，如硬脂酸镁或硬脂酸钙；和/或聚乙二醇等等。当选择药学上可接受的载体时，主要考虑的是药物剂型的给药方式。这在本领域中是众所周知的。
药物组合物可包含治疗或预防有效量的偶联物。具体有效量取决于各种因素，例如待治疗的具体疾病，患者的身体状况，如体重，年龄和性别，治疗的持续时间，共同给药的治疗(如果有的话)，以及使用的具体配方。通常，如本文所述的“有效量”是常规量的生物分子。然而，在一些实施方案中，本公开药物组合物中包含的治疗或预防有效量的偶联物可以低于常规量的生物分子但可以产生更好的治疗或预防效果，因为生物分子在到达病理微环境与其配体或受体结合之前受保护基团保护。
本公开的药物组合物可以配制成各种合适的剂型，包括但不限于片剂，胶囊，注射剂等，并且可以通过任何合适的途径给药以达到预期目的。例如，它可以肠胃外，皮下，静脉内，肌肉内，腹膜内，透皮，口服，鞘内，颅内，鼻内或外给药。药物的剂量可取决于患者的年龄，健康状况和体重，并行进行的治疗，以及治疗的频率等。本公开的药物组合物可以施用于任何有此需要的受试者，例如作为哺乳动物，尤其是人类。
在肿瘤患者中，携带肿瘤抗原的肿瘤细胞或抗原呈递细胞(APC)通过与T细胞结合而部分或完全抑制宿主对肿瘤的免疫杀伤。在一些实施方式中，本公开的偶联物通过蛋白水解酶，尤其是天冬酰胺内肽酶或粒酶，或在酸性条件下，在病理微环境中被活化和释放。
因此，本公开的偶联物可以有效地突破个体的免疫屏障，到达病理微环境，然后在病理微环境中被激活和释放。结果，它可以选择性地促进肿瘤微环境中T细胞等的增殖或杀伤作用，从而实现低自身免疫性和高效力。
本公开开的生物分子偶联物可以用于治疗肿瘤，或者可以用作制备用于治疗肿瘤的药物的活性成分。本文所述的肿瘤可以是已知由本文所述的IFNα治疗的任何肿瘤，包括但不限于前文中所列举的。
本公开还包括用于治疗或预防肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗或预防有效量的如本文所述的偶联物或其药物组合物。该方法可以与任何已知的放射疗法或免疫疗法组合使用。
因此，本公开构建了一种细胞因子前药，其通过化学连接子将掩蔽体(R)与突变的细胞因子进行化学偶联，从而使细胞因子在正常组织中的活性丧失，降低该细胞因子的毒性，同时也可以进一步将该细胞因子前药与抗体偶联，进一步提高药物性能(对靶向性、半衰期、以及表达量进行进一步的优化)，在靶向组织附近，经酶切激活或者酸性条件激活后，恢复至原来或者更好活性发挥其药效。
生物偶联物与抗体的联用
本公开提供了一种联合用药的方法，包括利用所述生物分子偶联物联合抗肿瘤抗体的用药方法。
所述的抗肿瘤抗体例如可包括：抗PD-1抗体，抗Her2抗体，抗EGFR抗体，抗VEGFR抗体，抗CD20抗体，抗CD33抗体，抗PD-L1抗体，抗CTLA-4抗体，抗TNFα抗体，抗CD28抗体，抗4-1BB抗体，抗OX40抗体，抗GITR抗体，抗CD27抗体，抗CD40抗体或抗ICOS抗体，抗CD25抗体，抗CD30抗体抗体，抗CD3抗体，抗CD22抗体，抗CCR4抗体，抗CD38抗体，抗CD52抗体，抗补体C5抗体，RSV的抗F蛋白，抗GD2抗体，抗GITR抗体，抗糖蛋白受体lib/Illa抗体，抗ICOS抗体，抗IL2R抗体，抗LAG3抗体，抗整合素α4抗体，抗lgE抗体，抗PDGFRa抗体，抗RANKL抗体，抗SLAMF7抗体，抗LTIGIT抗体，抗TIM-3抗体，抗VEGFR2抗体，抗VISTA抗体的抗体或其功能片段。
作为本公开的优选方式，所述的抗肿瘤抗体为抗PD-1抗体，在发明的具体实施例中，其与本公开的生物分子偶联物联合应用后呈现了非常显著的增效。
本公开提供了所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体(如抗PD-1抗体)的用途，用于制备抑制肿瘤的混合物、药物组合物或药盒。
在给药时，所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体可以分别进行给药；或者也可同时进行给药。应理解，多种给药方式均被包含在本公开中。
所述抗肿瘤抗体可以是鼠，人，人源化，嵌合或来自其他物种。所述抗体可以是任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)，类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。所述抗体可以来自任何物种。作为一些具体实施方式，所述抗体来源于人，鼠或兔。
抗体片段或抗体的结合部分也可被应用于本公开的技术方案中。所述抗体片段或抗体的结合部分包含抗体全长的一部分，通常包含抗体的抗原结合区或可变区。优选地，抗体的片段是一个功能性片段，即保留完整抗体的抗原结合能力。抗体片段或功能片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2和Fv片段；双体；线性抗体；和单链抗体分子(scFv)；等等。
本公开提供了一种混合物，含有所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体作为活性组分。较佳地，所述的混合物中，所述生物分子偶联物与所述抗肿瘤抗体的按照质量比为1:(0.05～50)，如1:0.1，1:0.15，1:0.2，1:0.4，1:0.5，1:0.6，1:0.8，1:1，1:2，1:4，1:5，1:6，1:8，1:10，1:20，1:30，1:40。
本公开提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的所述生物分子偶联物；(b)有效量的抗肿瘤抗体；以及(c)药学上可接受的载体或赋形剂。较佳地，所述的组合物中，所述生物分子偶联物与所述抗肿瘤抗体的按照质量比为1:(0.05～50)，如1:0.1，1:0.15，1:0.2，1:0.4，1:0.5，1:0.6，1:0.8，1:1，1:2，1:4，1:5，1:6，1:8，1:10，1:20，1:30，1:40。
本公开的药物组合物或混合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂，输液剂，片剂，胶囊剂，丸剂。其中活性组分可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。适用的药学上可接受的载体同前述。
本公开的生物分子偶联物和抗肿瘤抗体的混合物或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本公开的药物组合物中，所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体作为活性成分可以占药物组合物总重量的0.0001-20％，其余可以为药学上可接受的载体。
所用的所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。必要的时候，所述生物分子偶联物和还可与其它活性成分或药物联合给药。
当将所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体联用时，本公开还提供了一种用于治疗肿瘤的药盒，所述的药盒中，含有：容器1，以及置于容器1中的所述生物分子偶联物；以及容器2以及置于容器2中的抗肿瘤抗体。
所述的药盒中，也可含有所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体的混合物，其中所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体的含量如前述。
此外，所述的药盒中还可以还有一些辅助用药的材料，例如注射用针管等。
此外，所述的药盒中还可含有使用说明书，说明利用本公开的联合用药方法来抑制肿瘤的方法。
本公开中首次披露所述生物分子偶联物和抗肿瘤抗体的联合应用具有优异的肿瘤抑制作用，可实现极为显著的协同增效作用，这大大超出了本领域一般人员/医师的预料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第3版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
INF-alpha氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met LeuLeu Ala
Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp PheGly Phe
Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro ValLeu His Glu
Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala AlaTrp Asp Glu
Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp LeuGlu Ala
Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu AspSer Ile Leu
Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys LysTyr Ser Pro
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu SerThr Asn Leu
Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
与IFNα蛋白形成的生物分子偶联物，有以下结构：
R1-AAN-PABC-R3-S-Cys-IFNα
其中，
Cys代表包含在IFNα里的半胱氨酸残基；
S代表半胱氨酸残基上的硫原子；
R1是一个阻止IFNα蛋白与它的配体或受体结合的基团；
AAN代表三肽，A为丙氨酸，N为天冬氨酸；
PABC为对-氨基苄基氨甲酰基；
R3是一个含有EMC基团、可以与半胱氨酸残基里的硫原子共价结合的基团，其作用是当AAN被切割后，维持或者提高IFNα与其抗原的结合能力。
后续实施例中，所用的R1如表1。
表1
名称 分子式
R1-12 Peg-5000
R1-13 Peg-10000
R1-15 Peg-20000
R1-17 Peg-40000
本公开实验中，选择了一些链接子R1-AAN-PABC-R3进行研究。合成好的连接子化合物统一溶解，并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在37℃、2小时条件下在100微克legumain中加入1毫克/毫升的样品化合物，酶能够剪切连接子导致释放出R3，通过HPLC能够检测链接子的减少和R3的增加而比较酶对链接子的激活效率(指被酶剪切而释放出来的R3占原化合物的比例)。如表2，R1＝peg5000时，链接子及其激活效率如表2所示。
表2
R1＝peg20000时，优选的链接子R1-AAN-PABC-R3及其激活效率如表3所示：
表3
上述结果说明：从稳定性和激活效率综合评价下，链接子1，链接子3均能呈现非常高的激活效率，链接子10的激活效率也很高。
实施例1、INF-α蛋白表面的氨基酸突变后与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联的情况
采用链接子R1-AAN-PABC-R3，R1为peg5000，该链接子为表2中链接子3。
INF-α蛋白表面的任一氨基酸突变为Cys后都可以与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联，但是偶联效率各有不同。对INF-α蛋白的氨基酸序列进行第2-165位的单一位点的氨基酸突变，根据含突变位点的INF-α的氨基酸序列及其DNA序列，构建可在哺乳细胞中表达出His*6-INF-α的质粒(金唯智)。表达宿主是HEK293细胞(Life Technologies)。转染之前，HEK293细胞在含有10％FBS完全培养基(Gibico)中于37℃，5％CO2中培养。转染前一天，将细胞以合适的密度接种在15cm的培养盘中，培养基更换为低IgG的FBS。在转染6个小时后或者2天后，培养基更换为Freestyle293(Gibico)。转染当天，当细胞达到一定汇合度时，使用脂质体2000(Life Technologies)和PEI(Sigma)将表达目标蛋白的质粒共转染到293T细胞中。在转染后的第4天和第6天分别更换培养上清。检测蛋白的表达与活性，然后纯化蛋白。
将纯化的突变体以0.3mg/mL的浓度在含有5mM EDTA的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中温育。将TCEP溶液以100:1的摩尔比添加到突变体中将所得混合物在4℃温育4小时，同时轻轻搅拌。然后将混合物用含有150mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃透析2小时。然后，立即将R1-AAN-PABC-R3以20：1的摩尔比加入混合物中，并将所得混合物在25℃温和搅拌16小时。停止反应并除去残留的R1-AAN-PABC-R3化合物。取等体积的样品，然后进行SDS-PAGE检测，通过扫描条带灰度得到偶联效率(扫描灰度的比例即为偶联效率：偶联后蛋白条带的灰度/(未偶联蛋白条带的灰度+偶联后蛋白条带的灰度))。INF-α蛋白表面的单一位点氨基酸突变为Cys后与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联效率列表如表4。
表4
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实施例2、INF-α蛋白表面的氨基酸突变后与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联后的受体结合能力变化情况
对INF-α蛋白的氨基酸序列进行第2-165位的单一位点的氨基酸突变，通过ELISA检测与野生型INF-α相比具有点突变的每个突变体偶联后的结合活性。特别地，96孔板用INFR1或INFR2孵育过夜，然后用1％BSA阻断剂(ThermoFisher)在37℃阻断2小时，用PBST洗三次。对应的抗体或突变体加入其中并在37℃结合1小时，然后用PBST洗三次。加入与抗人INF-α2b偶联的HRP酶，并在37℃结合1小时，然后用PBST洗三次。加入TMB底物(Solarbio，Inc)在450nm检测吸光度。对偶联后的突变体结合强度的影响通过偶联后的EC50/野生型EC50来计算，即(偶联后的结合能力/野生型的结合能力)*100％＝1/(偶联后的EC50/野生型EC50)。
INF-α蛋白表面的单一位点氨基酸突变为Cys后与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联后的受体结合能力变化情况见表5。R1-AAN-PABC-R3中，R1为peg5000，该链接子为表2中链接子3。
表5
/>
/>
实施例3、INF-α蛋白表面的氨基酸突变后与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联并激活后的受体结合变化情况
对INF-α蛋白的氨基酸序列进行第2-165位的单一位点的氨基酸突变，进行活化试验。在活化试验中，1mg/ml的偶联后突变体放置在pH＝6的酸性环境中在37℃下反应过夜。通过ELISA检测激活后的受体结合情况。
INF-α蛋白表面的单一位点氨基酸突变为Cys后与R1-AAN-PABC-R3化合物偶联并激活后的受体结合变化情况见表6。R1-AAN-PABC-R3中，R1为peg5000，该链接子为表2中链接子3。
表6
/>
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实施例4、突变的INF-α与不同R1-AAN-PABC-R3化合物偶联后的结合活性变化情况
对INF-α蛋白的氨基酸序列进行第2-165位的单一位点的氨基酸突变，根据INF-α和含突变位点的INF-α的氨基酸序列及其DNA序列，构建出可在哺乳细胞中表达出His*6-INF-α的质粒(金唯智)。表达宿主是HEK293细胞(Life Technologies)。转染之前，HEK293细胞在含有10％FBS完全培养基(Gibico)中于37℃，5％CO2中培养。转染前一天，将细胞以合适的密度接种在15cm的培养盘中，培养基更换为低IgG的FBS。在转染6个小时后或者两天后，培养基更换为Freestyle293(Gibico)。转染当天，当细胞达到一定汇合度时，使用脂质体2000(Life Technologies)和PEI(sigma)将表达目标蛋白的质粒共转染到293T细胞中。在转染后的第4天和第6天分别更换培养上清。检测蛋白的表达与活性，然后纯化蛋白。
将纯化的突变体以0.3mg/mL的浓度在含有5mM EDTA的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中温育。将TCEP溶液以100：1的摩尔比添加到突变体中将所得混合物在4℃温育4小时，同时轻轻搅拌。然后将混合物用含有150mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃透析2小时。然后，立即将R1-AAN-PABC-R3以20:1的摩尔比加入混合物中，并将所得混合物在25℃温和搅拌16小时。停止反应并除去残留的R1-AAN-PABC-R3化合物。
在本公开中，通过ELISA检测与野生型INF-α相比具有点突变的每个突变体偶联后的结合活性。特别地，96孔板用INFR1或INFR2孵育过夜，然后用1％BSA阻断剂(ThermoFisher)在37℃阻断2小时，用PBST洗三次。对应的抗体或突变体加入其中并在37℃结合1小时，然后用PBST洗三次。加入与抗人INF-α2b偶联的HRP酶，并在37℃结合1小时，然后用PBST洗三次。加入TMB底物(Solarbio，Inc)在450nm检测吸光度。对偶联后的突变体结合强度的影响通过偶联后的EC50/野生型EC50来计算，即(偶联后的结合能力/野生型的结合能力)*100％＝1/(偶联后的EC50/野生型EC50)。
根据以上方法，检测不同位点突变的突变体与不同的R1-AAN-PABC-R3化合物偶联后结合活性的变化情况。
突变的INF-α与R偶联后的结合活性变化情况如表7。
表7
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因此对于抑制INFR1结合的突变位点而言，将His57，Gln61，Phe64，Ser68分别突变为Cys后，与部分R1-AAN-PABC-R3进行偶联，其结合INFR1的能力均下降至野生型的10％以下。对于抑制INFR2结合的突变位点而言，将Ala145，Arg149分别突变为Cys后，与一些R1-AAN-PABC-R3进行偶联，其结合INFR2的能力均下降至野生型的1％以下，甚至小于0.1％。第Phe27、Ser152、Arg162也有不同程度的下降。
实施例5、突变的INF-α与R1-AAN-PABC-R3偶联并激活后的结合活性变化情况
在活化试验中，将10μg用于活化的Legumain酶(可在AAN位置切割)加入到1mg/ml的偶联后突变体中，在37℃下反应1小时或者1mg/ml的偶联后突变体放置在pH＝6的酸性环境中在37℃下反应4h。通过ELISA检测激活后的结合活性情况。
突变的INF-α与R1-AAN-PABC-R3偶联并激活后的结合活性变化情况如表8。
表8
/>
结果说明，对于抑制INFR1结合的变位点而言，除了侧链与R3结构相似的Phe64，Ser68外，与R3结构差异比较大的His57和侧链带电的Gln61相对应的突变体偶联后再激活，其结合INFR1的能力大部分可以恢复至野生型的200％以上。由于INF-α与INFR2结合活性很高，所以INF-α上的任意变动都可能引起其与INFR2结合活性的降低，因此针对INFR2的突变位点的筛选的关键在于偶联并激活后结合活性的恢复情况。对于抑制INFR2结合的突变位点而言，除了侧链与R3结构相似的Phe27，Ala145，Ser152外，Arg149(R149，也即第149位由Arg突变为Cys)相对应的突变体偶联后活性降至原来的0.27％，再激活后其结合INFR2的能力可以恢复至接近野生型的100％。
实施例6、突变的INF-α与R1-AAN-PABC-R3偶联后以及激活后对细胞信号传导的影响情况
准备280000cells/ml HEK-Blue IFN-a/b细胞悬浮液在含10％热灭活的FBS的培养基中。在96孔细胞板中分别加入20ul不同梯度的INF-α，突变的INF-α+R1-AAN-PABC-R3(其中R1为peg20000)，Active form，然后每个孔加入180ul细胞悬浮液。将96孔细胞板放在37℃的二氧化碳培养箱中培养20-24小时。
按照产品说明书准备QUANTI-BlueTM，并在新的96孔细胞板中每个孔中加入180ulQUANTI-BlueTM。然后再加入20ul上述的HEK-Blue IFN-a/b细胞上清液，在37℃条件下孵育1h。在620-055nm波长下检测SEAP水平。
突变的INF-α与R1-AAN-PABC-R3偶联后以及激活后对细胞信号传导的影响情况如表9。
表9
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*偶联后的信号传导/野生型的信号传导*100％。
表6的结果表示，INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3偶联后的样品和激活后的样品对细胞信号传导的影响效果最理想。
INF-αR149偶联后以及激活后对细胞信号传导的影响情况如图1。结果表明，多种突变形式的INF-α与R1-AAN-PABC-R3偶联后，细胞信号传导减至极弱或没有、而激活后呈现显著的恢复。其中，INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3偶联后的样品可以完全抑制相应的细胞信号传导，但激活后的激活形式可以恢复至与野生型的INF-α一样的细胞信号传导水平。
实施例7、在肿瘤微环境中活化的INF-α抑制MC38肿瘤的生长情况
将MC38细胞皮下接种到C57BL/6小鼠(上海模拟生物研究中心)，每只小鼠2×106个细胞。一周后，将植入MC38肿瘤的小鼠随机分组。第1组G1注射溶剂对照，每周给药1次，其余每组分别注射100ug突变的INF-α+R1-AAN-PABC-R3，每周给药1次。给药周期为3周。每周记录3次小鼠肿瘤体积。不同的INF-α+R1-AAN-PABC-R3给药后的TGI(肿瘤生长抑制，TumorGrowth Inhibition)情况如表10。
表10
该表的结果表明，多种突变形式的INF-α与R1-AAN-PABC-R3偶联后，具有抑制肿瘤生长的效果。其中，INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3抑制肿瘤生长的效果最明显。
实施例8、INF-α的偶联物在肿瘤微环境中活化的INF-α的抑瘤效果
将MC38细胞皮下接种到C57BL/6小鼠(上海模拟生物研究中心)，每只小鼠2×106个细胞。一周后，将植入MC38肿瘤的小鼠随机分成4组。
分组如下：
第1组：G1注射100ug INF-α，每周给药3次；
第2组：G2注射300ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3，每周给药1次；
第3组：G3注射100ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3，每周给药1次；
第4组：G4注射溶剂对照，每周给药1次。
给药周期为3周。每周记录3次小鼠肿瘤体积。给药结束后的肿瘤体积结果显示在图2中。
其中，R1-AAN-PABC-R3具体为表3中链接子10。
结果表明，300ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3可有效抑制MC38肿瘤的生长，一只小鼠被治愈，五只小鼠具有显著的抑制作用，其为80％或更高。一周给药一次100ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3比一周给药三次100ug INF-α的抑制肿瘤效果更好。
该结果表明，INF-α的偶联物可以增强效应T细胞的活性和INF-α在肿瘤微环境中的富集，因此偶联物表现出比原始INF-α更高的功效。
实施例9、INF-α的偶联物与PD-1抗体联合应用的抑瘤效果
将CT26细胞皮下接种到Balb/c小鼠(上海模拟生物研究中心)，每只小鼠2×106个细胞。一周后，将植入CT26肿瘤的小鼠随机分成4组：
第1组(G1)：注射100ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3，每周给药1次；
第2组(G2)：注射100ug抗PD-1的鼠抗(Sino Biological；Cat:50124-RP02)，每周给药2次；
第3组(G3)：注射100ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3，每周给药1次；同时，注射100ug抗PD-1的鼠抗，每周给药2次；
第4组(G4)：注射溶剂对照，每周给药1次。
其中，R1-AAN-PABC-R具体为表3中链接子10。
给药周期为3周。每周记录3次小鼠肿瘤体积。给药结束后的肿瘤体积结果显示在图3中。结果表明，100ug INF-αR149+R1-AAN-PABC-R3与抗PD-1抗体的联合可有效抑制CT26肿瘤的生长，四只小鼠被治愈，全部小鼠具有显著的抑制作用。肿瘤体积的降低极为显著，可见两者的联合应用实现了协同增效。
因此，在肿瘤微环境中活化的INF-αR149与PD-1抗体联合表现出更高的功效和治愈率。
以上所述实施例仅表达了本公开的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本公开专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本公开的保护范围。因此，本公开专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本公开提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (16)

1.一种IFNα细胞因子生物分子偶联物，有以下结构：
R1-AAN-PABC-R3-S-Cys-IFNα
其中，
Cys代表包含在IFNα表面单点突变成的半胱氨酸残基；
S代表半胱氨酸残基上的硫原子；
IFNα具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
R1是一个阻止IFNα突变体与它的配体或受体结合的基团；
AAN代表三肽，A为丙氨酸，N为天冬氨酸，PABC为对-氨基苄基氨甲酰基；
R3是一个带有EMC基团与IFNα的单点突变的半胱氨酸的硫原子共价偶联形成的连接臂，其作用是当AAN断裂后，R3结构仍偶联在细胞因子上，R3-S-Cys-IFNα部分恢复，完全恢复，甚至提高与IFNα受体的亲合力。
2.如权利要求1所述的生物分子偶联物，其特征在于，其中R1选自分子量44至132000的聚乙二醇，例如1000至50000、3000至80000或10000至60000的聚乙二醇；或
所述IFNα突变体为INF-α进行单点突变后获得的突变体，其氨基酸序列根据SEQ IDNO:1，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys。
3.如权利要求2所述的生物分子偶联物，其特征在于，R1选自：
4.如权利要求1所述的生物分子偶联物，其特征在于，其中R3选自：
5.如权利要求1所述的生物分子偶联物，其特征在于，R1-AAN-PABC-R3的结构选自：
6.权利要求1-5任一所述的生物分子偶联物的用途，用于制备抑制肿瘤的组合物或药盒。
7.权利要求1-5任一所述的生物分子偶联物的用途，用于与抗肿瘤抗体联合、制备抑制肿瘤的组合物或药盒。
8.一种用于抑制肿瘤的组合物或药盒，其特征在于，所述组合物或药盒中含有权利要求1-5任一所述的生物分子偶联物；较佳地，所述组合物还含有药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的组合物或药盒，其特征在于，所述组合物中还含有抗肿瘤抗体；或
所述药盒中还含有：抗肿瘤抗体或含有抗肿瘤抗体的组合物。
10.如权利要求9所述的组合物或药盒，其特征在于，所述的抗肿瘤抗体是抗PD-1抗体。
11.如权利要求8所述的组合物或药盒，其特征在于，所述的生物分子偶联物与所述抗PD-1抗体的按照质量比为1:(0.05～50)；较佳地为1:(0.2～8)；更佳地为1:(0.4～5)。
12.一种制备肿瘤微环境中活化的INF-α的方法，包括：将INF-α进行单点突变，使其氨基酸序列的特定残基突变为Cys。
13.一种INF-α突变体，其为INF-α进行单点突变后获得的突变体，其氨基酸序列根据SEQ ID NO:1，Arg149、Ala145、His57、Gln61、Phe64或Ser68、Phe27、Ser152、Arg162残基突变为Cys。
14.分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求13所述的INF-α突变体。
15.权利要求13所述的INF-α突变体的用途，用于与R1-AAN-PABC-R3偶联形成抑制肿瘤的生物分子偶联物；
其中，
R1是一个阻止IFNα突变体与它的配体或受体结合的基团；
AAN代表三肽，A为丙氨酸，N为天冬氨酸，PABC为对-氨基苄基氨甲酰基；
R3是一个带有EMC基团与IFNα的单点突变的半胱氨酸的硫原子共价偶联形成的连接臂，其作用是当AAN断裂后，R3结构仍偶联在细胞因子上，R3-S-Cys-IFNα部分恢复，完全恢复，甚至提高与IFNα受体的亲合力。
16.如权利要求1-15任一所述，其特征在于，所述的肿瘤包括：黑色素瘤，NSCLC，头颈鳞状细胞癌，尿路上皮癌，经典霍奇金淋巴癌，胃癌，食管胃交界腺癌，宫颈癌，B细胞淋巴癌，肝细胞癌，默克尔细胞癌，肾细胞癌，原发性肝癌，小细胞肺癌。
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