CN1738640A - 干扰素－α多肽和偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了干扰素－α多肽和偶联物，以及编码这些多肽的核酸。本发明还提供了包括这些多肽、偶联物和核酸的组合物，含有或表达所述多肽、偶联物和核酸的细胞，制备所述多肽、偶联物和核酸的方法；以及所述多肽、偶联物和核酸的使用方法。

Description

干扰素-α多肽和偶联物

相关申请的参考

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2003年9月12日提交的美国临时专利申请流水号60/502,560和2002年11月18日提交的美国临时专利申请流水号60/427,612的优先权，所述各申请公开的全部内容为所有目的而包含在本文中作为参考。

版权声明

依据37C.F.R.1.71(e)，申请人注意到该公开的部分内容包含受版权保护的资料。当其出现在专利商标局的专利文档或档案中时，版权所有人不反对任何人复制专利文件或专利公开文本，在其它情况下，版权所有人将保留所有的版权。

发明领域

本发明一般地涉及多核苷酸及其编码的多肽，多肽的偶联物，以及载体，细胞，抗体和使用及制备该多核苷酸，多肽和偶联物的方法。

发明背景

干扰素-α是多种细胞因子基因螺旋束超家族的成员(Sprang，S.R.等(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3：815-827)。人干扰素-α由含有20多个串联复制的非等位基因以及假基因的家族编码，这些人干扰素-α在氨基酸水平上有85-98％的序列同一性(Henco，K.等(1985)J.Mol.Biol.185：227-260)。表达活性干扰素-α蛋白质的基因可根据基因座分为13个家族。已知表达的人干扰素-α蛋白质及其等位基因变体公开于Allen G.和Diaz M.O.(1996)J.Interferon And Cytokine Res.16：181-184中。

干扰素-α可抑制多种类型的细胞增生，具体可用于治疗多种细胞增生性疾病，这些疾病常常与癌症，具体是血液学恶性疾病(hematologicmalignancy)诸如白血病相关。这些蛋白质显示出对以下疾病的抗增生活性：多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocyticleukemia)，低级淋巴瘤(low-grade lymphoma)，卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)，慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)，肾细胞癌(renal-cellcarcinoma)，尿道膀胱肿瘤(urinary bladder tumor)和卵巢癌(ovariancancer)(Bonnem，E.M.等(1984)J.Biol.Response Modifiers 3：580；Oldham，R.K(1985)Hospital Practice 20：71)。

干扰素-α也可用于抗多种类型的病毒感染(Finter，N.B等(1991)Drugs42(5)：749)。干扰素-α还显示出抗人乳头瘤病毒感染，乙肝病毒和丙肝病毒感染的活性(Finter，N.B.等，1991，同上；Kashima，H等(1988)Laryngoscope 98：334；Dusheiko，G.M.等(1986)J.Hematology 3(增刊2)：S199；Davis，GL等(1989)N.England J.Med.321：1501)。另外，还研究了干扰素和干扰素受体在一些自身免疫和炎性疾病的发病机理中的作用(Benoit，P.等(1993)J.Immunol.150(3)：707)。

尽管这些蛋白质对多种疾病都有治疗价值，但尚未使它们最优化以用作药物。例如，剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity)，受体交叉反应性(receptor cross-reactivity)和短的血清半寿期显著减少了多种此类细胞因子的临床应用(Dusheiko，G.(1997)Hepatology 26：112S-121S；Vial，T和Descotes，J.(1994)Drug Experience 10：115150；Funke，I.等(1994)Ann.Hematol.68：49-52；Schomburg，A.等(1993)J.Cancer Res.Clin.Oncol.119：745-755)。与施用干扰素相伴的多种多样的严重副作用谱(profile)包括流感样症状，疲劳，幻觉，发热，肝酶升高和白细胞减少(Pontzer，C.H.等(1991)Cancer Res.51：5304；Oldham，1985，同上)。

丙型肝炎病毒(HCV)是非宿主整合型RNA病毒，其具有非常高的复制率，因此其伴随高度遗传多样性。已经鉴定了HCV RNA的至少六种基因型和超过30种亚型。HCV基因型是IFN-α治疗的预测物。已经发现感染HCV基因型2和3的患者通常对干扰素治疗反应良好。感染基因型4，5和6的患者倾向于反应较差。感染HCV基因型1的患者倾向于对干扰素治疗反应非常差，大约50％的基因型l患者被归类为对IFN-α治疗的“无反应者”。基因型1是丙型肝炎目前最普遍的形式，在美国的感染患者中占大约为70％而在欧洲为50％。很明显，迫切需要对HCV，特别是基因型1种型感染的更有效治疗。

遗传和生物化学证据显示基因型1 HCV(和其它亚型)通过抑制关键IFN反应性蛋白质诸如dsRNA活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKR而主动地减弱IFN-α信号通路(Katze M.G.，等，(2002)Nat.Rev.Immunol.2(9)：675-687)。作为该遗传多样性和抗病毒反应的主动抑制的可能结果，HCV(具体是基因型1)具有逃脱宿主免疫监视的能力，这导致高比率的慢性感染。HCV的广泛遗传异质性存在严重的诊断和临床问题，可能导致临床过程的改变，疫苗发展中的困难，以及缺乏对治疗的反应。

本发明说明了对表现增强的抗病毒和/或免疫调节效力的干扰素-α分子的需要。本发明提供了新的干扰素-α多肽和多肽偶联物，编码所述多肽的核酸，和使用所述分子的方法。所述分子将在多种应用中有益，包括例如，治疗性和预防性处理，具体是对于病毒感染诸如HCV。本发明满足这些及其它需要。

发明简述

本发明提供了新的多肽，包括变体和融合多肽。本发明还提供了包含本发明多肽的偶联物，所述多肽与一个或多个非多肽部分共价连接。本发明还提供了编码本发明任何多肽的核酸，以及包含所述核酸的载体和宿主细胞。此外，本发明提供了制备和使用所述多肽，偶联物，和核酸的方法，以及根据进一步描述而显而易见的其它特征。

一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，该多肽包含被鉴定为SEQID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104之一的序列(诸如SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：75，SEQ IDNO：76，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ IDNO：94，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102，SEQ IDNO：103或SEQ ID NO：104之一)。

本发明还提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列与SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104之一，例如SEQ ID NO：1-15，47，或53之一(例如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53)在0-16个氨基酸位置(诸如在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在0-14个氨基酸位置，0-12个氨基酸位置，0-10个氨基酸位置，0-8个氨基酸位置，0-6个氨基酸位置，0-5个氨基酸位置，0-4个氨基酸位置，0-3个氨基酸位置，0-2个氨基酸位置，或0-1个氨基酸位置中不同。在一些情况下，该多肽表现出干扰素-α活性(诸如抗病毒活性，TH1分化活性，和/或抗增殖活性(anti-proliferative activity)等)。在一些情况下，该多肽序列包括在位置47，51，52，53，54，55，56，57，58，60，61，64，69，71，72，75，76，77，78，79，80，83，84，85，86，87，90，93，133，140，154，160，161，和162中一个或多个位置的取代，所述位置为相对于SEQ ID NO：1-15，47，或53之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)的位置。在一些情况下，该多肽序列包含以下一或多个氨基酸：47位的His或Gln；51位的Val，Ala或Thr；52位的Gln，Pro或Glu；53位的Ala或Thr；55位的Phe，Ser，或Pro；56位的Leu，Val或Ala；57位的Phe或Leu；58位的Tyr或His；60位的Met，Leu或Val；61位的Met或Ile；64位的Thr或Ile；69位的Ser或Thr；71位的Lys或Glu；72位的Asn或Asp；75位的Ala或Val；76位的Ala或Thr；77位的Trp或Leu；78位的Asp或Glu；79位的Glu或Gln；80位的Thr，Asp，Ser，或Arg；83位的Glu或Asp；84位的Lys或Glu；85位的Phe或Leu；86位的Tyr，Cys或Ser；87位的Ile或Thr；90位的Phe，Tyr，Asp或Asn；93位的Met或Leu；133位的Lys或Glu；140位的Ser或Ala；154位的Phe或Leu；160位的Lys或Glu；161位的Arg或Ser；和162位的Arg或Ser；所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。在一些情况下，该多肽序列包括His47，Val51，Phe55，Leu56，Tyr58，Lys133，和Ser140的一个或多个，所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。一些所述多肽包括SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104。本发明还提供了包含任何这些多肽的融合蛋白质和偶联物，编码所述多肽的核酸，和制备所述多肽的方法。

一些本发明的多肽包含一个或多种取代，其包括但不限于选自以下组的取代：D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，G10C，R12C，R13C，M16C，A19C，Q20C，R22C，R23C，I24C，S25C，L26C，F27C，S28C，L30C，K31C，R33C，H34C，D35C，R37C，Q40C，E41C，E42C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，V51C，Q52C，E59C，Q62C，Q63C，N66C，S69C，T70C，K71C，N72C，S74C，A75C，D78C，E79C，T80C，L81C，E83C，K84C，I87C，F90C，Q91C，N94C，D95C，E97C，A98C，V100C，M101C，Q102C，E103C，V104C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，M112C，N113C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，T128C，L129C，T132C，K133C，K134C，K135C，Y136C，S137C，P138C，A146C，M149C，R150C，S153C，F154C，N157C，Q159C，K160C，R161C，L162C，R163C，R164C，K165C和E166C(或相对于SEQ ID NO：1的等效位置)，或其组合。

一些本发明的多肽包含一个或多种取代，其包括但不限于选自以下组的取代：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，G10K，R12K，R13K，M16K，A19K，Q20K，R22K，R23K，I24K，S25K，L26K，F27K，S28K，L30K，R33K，H34K，D35K，R37K，Q40K，E41K，E42K，D44K，N46K，H47K，Q49K，V51K，Q52K，E59K，Q62K，Q63K，N66K，S69K，T70K，N72K，S74K，A75K，D78K，E79K，T80K，L81K，E83K，I87K，F90K，Q91K，N94K，D95K，E97K，A98K，V100K，M101K，Q102K，E103K，V104K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，M112K，N113K，V114K，D115K，L118K，R121K，Q125K，R126K，T128K，L129K，T132K，Y136K，S137K，P138K，A146K，M149K，R150K，S153K，F154K，N157K，Q159K，R161K，L162K，R163K，R164K和E166K(或相对于SEQ ID NO：1的等效位置)，或其组合。

一些本发明的多肽包括一或多种氨基酸残基对不同氨基酸残基的取代，或一或多种氨基酸残基的缺失，其从任何本发明的多肽中去除一个或多个赖氨酸，例如，K31，K50，K71，K84，K122，K133，K134，K135，K160，和/或K165(相对于SEQ ID NO：1)，所述本发明的多肽例如是SEQ IDNO：1-15或SEQ ID NO：44-104的任一种(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53)。要被去除的一个或多个赖氨酸残基可以被任何其它氨基酸取代，可被Arg(R)或Gln(Q)取代，或被缺失。

一些本发明的多肽包括一或多种氨基酸残基对不同氨基酸残基的取代，或一或多种氨基酸残基的缺失，其从任何本发明的多肽中去除一个或多个组氨酸，例如，H7，H11，H34，和/或H47(相对于SEQ ID NO：1)，所述本发明的多肽例如为，SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)。要被去除的一个或多个组氨酸残基可以被任何其它氨基酸取代，可被Arg(R)或Gln(Q)取代，或被缺失。

一些本发明的多肽包含一个或多个取代，其包括但不限于选自以下组的取代：D2N+P4S/T，L3N+Q5S/T，P4Q，P4Q+T6S，Q5N+H7S/T，T6N，T6N+S8T，H7N+L9S/T，S8N+G10S/T，L9N+H11S/T，G10N+R12S/T，R12N，R12N+T14S，R13N+M15S/T，M16N+L18S/T，A19N+M21S/T，Q20N+R22S/T，R22N+I24S/T，R23N，R23N+S25T，I24N+L26S/T， S25N+F27S/T，L26N，L26N+S28T，S28N+L30S/T，L30N+D32S/T，K31N+R33S/T，R33N+D35S/T，H34N+F36S/T，D35N+R37S/T，R37N+P39S/T，Q40N+E42S/T，E41N+F43S/T，E42N+D44S/T，D44N+N46S/T，F48S/T，H47N+Q49S/T，Q49N+V51S/T，K50N+Q52S/T，V51N+A53S/T，Q52N+I54S/T，E59N+M61S/T，Q62N，Q62N+T64S，Q63N+F65S/T，F68S/T，S69N+K71S/T，T70N+N72S/T，K71N，K71N+S73T，S74T，S74N+A76S/T，A75N+W77S/T，D78N，D78N+T80S，E79N+L81S/T，T80N+L82S/T，L81N+E83S/T，E83N+F85S/T，K84N+Y86S/T，I87N+L89S/T，F90N+Q92S/T，Q91N+M93S/T，L96S/T，D95N+E97S/T，E97N+C99S/T，A98N+V100S/T，V100N+Q102S/T，M101N+E103S/T，Q102N+V104S/T，E103N+G105S/T，V104N+V106S/T，G105N+E107S/T，E107，E107N+T109S，E108N+P110/T，L111N+N113S/T，M112N+V114S/T，N113N+D115S/T，V114N，V114N+S116T，D115N+I117S/T，L118N+V120S/T，R121N+Y123S/T， K122N+F124S/T，Q125N+1127S/T，R126N，R126N+T128S，T128N+Y130S/T，L129N+L131S/T，T132N+K134S/T，K133N+K135S/T，K134N+Y136S/T，K135N，K135N+S137T，Y136N+P138S/T，P138N，P138N+S140T，A146N+1148S/T，M149N，M149N+S151T，R150N+F152S/T，S153N，S153N+S155T，F154N+F156S/T，Q159S/T，K160N+L162S/T，R161N+R163S/T，L162N+R164S/T，R163N+K165S/T和R164N+E166S/T(或相对于SEQ ID NO：1的等效位置)，或其组合。

本发明还提供了包含任何上述多肽的融合蛋白质和偶联物，编码所述多肽的核酸，和制备所述多肽的方法。

另一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，其各包含这样的序列，所述序列具有与SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一，例如，SEQ IDNO：1-15，47或53之一(诸如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53)至少约90％的氨基酸序列同一性。一些所述多肽表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性，T_H1分化活性，和/或抗增殖活性。在一些情况下，该序列具有与SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO 44-104之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)至少约91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在一些情况下，该多肽序列包含在位置47，51，52，53，54，55，56，57，58，60，61，64，69，71，72，75，76，77，78，79，80，83，84，85，86，87，90，93，133，140，154，160，161，和162中的一个或多个位置的取代，所述位置相对于例如SEQ ID NO：1-15之一。在一些情况下，该多肽序列包含以下一或多个氨基酸：47位的His或Gln；51位的Val，Ala或Thr；52位的Gln，Pro或Glu；53位的Ala或Thr；55位的Phe，Ser，或Pro；56位的Leu，Val或Ala；57位的Phe或Leu；58位的Tvr或His；60位的Met，Leu或Val；61位的Met或Ile；64位的Thr或Ile；69位的Ser或Thr；71位的Lys或Glu；72位的Asn或Asp；75位的Ala或Val；76位的Ala或Thr；77位的Trp或Leu；78位的Asp或Glu；79位的Glu或Gln；80位的Thr，Asp，Ser，或Arg；83位的Glu或Asp；84位的Lys或Glu；85位的Phe或Leu；86位的Tyr，Cys或Ser；87位的Ile或Thr；90位的Phe，Tyr，Asp或Asn；93位的Met或Leu；133位的Lys或Glu；140位的Ser或Ala；154位的Phe或Leu；160位的Lys或Glu；161位的Arg或Ser；和162位的Arg或Ser(所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号)。在一些情况下，该多肽序列包含His47，Val51，Phe55，Leu56，Tyr58，Lys133和Ser140中的一个或多个氨基酸，所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。一些所述的多肽包括选自SEQ IDNO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一的序列。本发明还提供了包含任何上述这些多肽的融合蛋白质和偶联物，编码所述多肽的核酸，和制备所述多肽的方法。

另一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，其是亲本多肽的变体，每种变体都包含变体序列，所述序列与亲本多肽序列在相对于亲本多肽序列的至少一个氨基酸位置中存在不同，其中所述亲本多肽序列是SEQ IDNO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一，例如，SEQ ID NO：1-15，47或53之一，例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：47或SEQ ID NO：53。在一些情况下，该变体表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性，T_H1分化活性和/或抗增殖活性)。在一些情况下，该变体序列与亲本多肽序列在1-16个氨基酸位置(诸如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)，例如在1-14个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置，或1-2个氨基酸位置中不同。在一些情况下，该变体序列包括在位置47，51，52，53，54，55，56，57，58，60，61，64，69，71，72，75，76，77，78，79，80，83，84，85，86，87，90，93，133，140，154，160，161，和162中的一个或多个位置的取代，相对于SEQ ID NO：1-15。在一些情况下，该变体序列包括以下一或多种氨基酸：47位的His或Gln；51位的Val，Ala或Thr；52位的Gln，Pro或Glu；53位的Ala或Thr；55位的Phe，Ser，或Pro；56位的Leu，Val或Ala；57位的Phe或Leu；58位的Tyr或His；60位的Met，Leu或Val；61位的Met或Ile；64位的Thr或Ile；69位的Ser或Thr；71位的Lys或Glu；72位的Asn或Asp；75位的Ala或Val；76位的Ala或Thr；77位的Trp或Leu；78位的Asp或Glu；79位的Glu或Gln；80位的Thr，Asp，Ser，或Arg；83位的Glu或Asp；84位的Lys或Glu；85位的Phe或Leu；86位的Tyr，Cys或Ser；87位的Ile或Thr；90位的Phe，Tyr，Asp或Asn；93位的Met或Leu；133位的Lys或Glu；140位的Ser或Ala；154位的Phe或Leu；160位的Lys或Glu；161位的Arg或Ser；和162位的Arg或Ser；所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。在一些情况下，该变体序列包括His47，Val51，Phe55，Leu56，Tyr58，Lys133，和Ser140中的一种或多种，所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。一些所述变体包含选自SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104的序列。本发明还提供了包含任何这些变体的融合蛋白质和偶联物，编码这些变体的核酸，和制备所述变体的方法。

另一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，其是亲本干扰素-α多肽的变体，每种变体包括这样的变体序列，该序列与亲本干扰素-α多肽序列在至少一个氨基酸位置中不同，其中所述变体序列包括His47，Val51，Phe55，Leu56，Tyr58，Lys133，和Ser140中的一种或多种，所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。在一些情况下，亲本干扰素-α多肽序列是天然存在的人干扰素-α的序列，诸如SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：42或SEQ IDNO：32+R23K之一，或非天然存在的(即，合成的)干扰素-α，诸如SEQ IDNO：43。在一些情况下，该变体序列与亲本干扰素-α多肽序列在1-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在1-14个氨基酸位置，在1-12个氨基酸位置，在1-10个氨基酸位置，在1-8个氨基酸位置，在1-6个氨基酸位置，在1-5个氨基酸位置，在1-4个氨基酸位置，在1-3个氨基酸位置，或在1-2个氨基酸位置中存在不同。在一些情况下，该变体表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性，T_H1分化活性，和/或抗增殖活性等)。本发明还提供了包含任何这些变体的融合蛋白质和偶联物，编码这些变体的核酸，和制备所述变体的方法。

本发明还提供了偶联物，其包含本发明的多肽，诸如上述任何本发明的多肽(包括变体)以及至少一种与所述多肽的连接基团相连接的非多肽部分，其中所述偶联物表现出干扰素-α活性。在一些情况下，非多肽部分是聚合物(诸如，PEG或mPEG)，或糖部分。所述至少一种非多肽部分可与半胱氨酸、赖氨酸、所述多肽的N末端氨基，所述多肽的体内糖基化位点连接。本发明还提供了制备和使用所述偶联物的方法。

本发明还提供了分离的或重组的核酸，该核酸编码本发明的任何多肽(包括变体)。本发明还提供了包含所述核酸的载体和宿主细胞，以及制备本发明多肽的方法，所述方法包括培养含有所述核酸的宿主细胞。

另一方面，本发明提供了抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制的方法，该方法包括将感染了病毒的细胞与本发明的多肽或偶联物相接触。本发明还提供了降低感染了病毒的细胞中的病毒拷贝数量的方法，该方法包括将感染了病毒的细胞与本发明的多肽或偶联物相接触。

以下详细的描述联同附图将更为清楚地显示本发明的这些以及其它目的和特征。

附图说明

图1A和1B显示了IFN-α治疗后感染了HCV的细胞的病毒清除二相时程(biphasic timecourse)(A.无反应者(Nonresponder)动力学；B.反应者(responder)动力学)。

图2显示了本发明多肽的序列(SEQ ID NO：1)与以下人干扰素-α多肽序列的比对：huIFN-α1a(SEQ ID NO：31)，huIFN-α2b(SEQ ID NO：32)，huIFN-α4b(SEQ ID NO：33)，huIFN-α5(SEQ ID NO：34)，huIFN-α6(SEQ IDNO：35)，huIFN-α7(SEQ ID NO：36)，huIFN-α8b(SEQ ID NO：37)，huIFN-α10a(SEQ ID NO：38)，huIFN-α14a(SEQ ID NO：39)，huIFN-α16(SEQ IDNO：40)，huIFN-α17b(SEQ ID NO：41)和huIFN-α21b(SEQ ID NO：42)。huIFN-α序列的命名原则参照Allen G.和Diaz M.O.(1996)J.Interferon andCytokine Res.16：181-184。箭头显示SEQ ID NO：1的残基His47，Val51，Phe55，Leu56，Tyr58，Lys133，和Ser140，其不存在于SEQ ID NO：31-SEQID NO：42任一项中。SEQ ID NO：31-42中与SEQ ID NO：1相同的氨基酸残基位置用点(.)标示，而序列中的缺口用短线(-)标示。

图3显示了本发明多肽的序列(SEQ ID NO：3)与huIFN-α14a(SEQ IDNO：39)(LeIF H；Goeddel，(1981)Nature 290：20-26)的比对，采用如下参数：BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分(gap open penalty)11，缺口延伸罚分(gapextension penalty)1。SEQ ID NO：39中与SEQ ID NO：3相同的氨基酸残基位置用点(.)标示。

图4显示了本发明多肽的序列(SEQ ID NO：8)与人干扰素-α多肽序列SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：42的比对。SEQ ID NO：31-42中与SEQ ID NO：8相同的氨基酸残基位置用点(.)标示，而序列中的缺口用短线(-)标示。

图5显示了本发明多肽的序列(SEQ ID NO：12)与huIFN-α14a(SEQ IDNO：39)(LeIF H；Goeddel，(1981)Nature 290：20-26)的比对，采用如下参数：BLOSUM62阵列，缺口开放罚分11，缺口延伸罚分1。SEQ ID NO：39中与SEQ ID NO：12相同的氨基酸残基位置用点(.)标示。

图6显示了BLOSUM62取代矩阵(substitution matrix)。

图7A，7B和7C显示了计算用于测定最佳序列比对的比对评分实例，其中采用如下参数：BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分＝11，缺口延伸罚分＝1。

发明详述

定义

除非本说明书其余部分的上下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。

根据上下文，“多肽序列”(例如蛋白质，多肽，肽等)是氨基酸的聚合物，其中包含天然存在的氨酸或人工氨基酸类似物，或代表氨基酸聚合物的字符串。根据遗传密码的简并性，编码具体多肽序列的一种或多种核酸，或其互补核酸可从该多肽序列来确定。

根据上下文，“多核苷酸序列”(例如，核酸，多核苷酸，寡核苷酸等)是核苷酸的聚合物，其中包含核苷酸A，C，T，U，G，或者是天然存在的核苷酸或人工核苷酸类似物，或代表核苷酸的字符串。由任何具体的多核苷酸序列可确定给定的核酸或其互补核酸。

当任何给定聚合物组分(氨基酸，核苷酸，也在类属上称为“残基”)的位置通过参照选定氨基酸或核酸聚合物中的相同或等效位置，而不是给定聚合物中的组分的实际编号(numerical)位置来命名时，给定氨基酸聚合物或核苷酸聚合物的编号“相应于”或“对应于”选定氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。因此，例如给定多肽序列中给定位置氨基酸的编号对应于用作参照序列的选定多肽序列中的相同或等效氨基酸位置。

“等效位置(equivalent position)”(例如，“等效氨基酸位置”或“等效残基位置”)在本文中被定义为受试多肽序列中的位置(诸如，氨基酸位置或残基位置)，采用本文所述的比对算法时，其与参照多肽序列的相应位置相对应(align with)。受试多肽序列的等效氨基酸位置无须具有与受试多肽的相应位置相同的位置编号。作为实例，图2显示了与多种已知人干扰素-α多肽序列相对应的本发明多肽的序列(SEQ ID NO：1)。在该实例中，SEQ IDNO：1的氨基酸位置47被认为是SEQ ID NO：32(huIFN-α2b)的氨基酸位置46的等效氨基酸位置(即“与其等效”)，因为SEQ ID NO：1的第47位氨基酸与SEQ ID NO：32的第46位氨基酸相对应。换言之，SEQ ID NO：1的第47位氨基酸对应于SEQ ID NO：32的第46位氨基酸。同样地，SEQ ID NO：1中残基H47被认为对应于SEQ ID NO：5中残基Q47，由此例如相对于SEQID NO：1的取代H47C被认为对应于例如，SEQ ID NO：5中的取代Q47C(等等)。

用于鉴定氨基酸位置和氨基酸取代的方法描述如下：H47表示参照氨基酸序列例如SEQ ID NO：1中第47位被组氨酸(His)残基占据。H47Q表示第47位组氨酸被谷氨酰胺(Gln)残基取代。可选的取代用“/”表示，例如，H47S/T是指这样的氨基酸序列，其中第47位的组氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸取代。多重取代(multiple substitution)可用“+”表示，例如H47Q+V51S/T是指这样的氨基酸序列，其中包含第47位组氨酸残基被谷氨酰胺的取代且第51位缬氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基的取代。缺失用星号表示，例如，H47^*表示第47位组氨酸残基缺失。两个或多个连续氨基酸的缺失可如下表示，例如，R161^*-E166^*表示残基R161-E166包含性(inclusive)缺失(即，残基161，162，163，164，164，和166缺失)。插入按如下方式表示：在第47位组氨酸后其它丝氨酸残基的插入表示为H47HS。联合取代和插入按如下方式表示：第47位组氨酸被丝氨酸的取代且第47位氨基酸残基后丙氨酸的插入表示为H47SA。

除非另有所述，本文所述氨基酸残基的位置编号均相对于氨基酸序列SEQ ID NO：1。应当理解虽然亲本多肽的实例和修饰通常在本文中相对序列SEQ ID NO：1(或相对于其它具体序列)给出，关于本文所述本发明的其它多肽的实例和修饰可在本文所述任何其它多肽的等效氨基酸位置中进行。因此，例如相对于SEQ ID NO：1的取代H47C被认为对应于SEQ ID NO：5中的取代Q47C，等等。

术语“表现出(或表现，或具有)干扰素-α活性”意指本发明的多肽或偶联物具有至少一种由参照干扰素-α多肽(诸如人干扰素-α多肽，例如，在本文中鉴定为SEQ ID NO：32的huIFN-α2b，在本文中鉴定为SEQ IDNO：32+R23K的huIFN-α2a，在本文中鉴定为SEQ ID NO：37的hIFN-α8b，或本领域中已知的任何其它人干扰素α多肽，例如，本文中图2和4所示和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)见上文所列的那些多肽)表现出的活性。所述活性包括通过干扰素-α受体产生信号的能力，如，例如以下一或多种活性所证明的：抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制(“抗病毒活性”)；增强初始T细胞至T_H1表型的分化和/或抑制初始T细胞至T_H2表型的分化(“T_H1分化活性”)；或抑制细胞增殖(“抗增殖活性”)。一种或多种干扰素-α活性可采用本领域已知的和/或实施例中所述的测定法进行测定。

表现出干扰素-α活性的多肽或偶联物被认为当其显示可检测活性(例如，可检测的抗病毒活性，抗增殖活性，或T_H1分化活性)时其具有所述活性(例如，如本领域已知的和/或实施例中所述的测定法所测定的)。本领域技术人员应能理解可检测活性的构成依赖于采取的测定法的特性，但作为一般指导，可检测的活性是这样的活性，其中在存在受试化合物(例如，本发明的多肽)时产生的测定信号的定量与不存在该受试化合物时产生的测定信号的定量不同。应当理解本发明的多肽或偶联物无须表现出具体参照干扰素-α的所有已知活性，或表现出与参照干扰素-α相同程度的活性。在一些情况下，本发明的多肽或偶联物所表现出的活性(例如由EC₅₀，比活，或其它与活性相关的值所呈现的)可大约等于，低于，或高于参照干扰素-α表现出的具体活性。

“变体”是包含一种序列的多肽，所述序列在一个或多个氨基酸位置中与亲本多肽序列不同。例如，变体可包括这样的序列，该序列与亲本多肽序列在该亲本多肽序列残基总数的最高10％，诸如在最高为所述残基的8％，例如，在该亲本多肽序列残基总数的最高5％，4％，3％，2％或1％中存在不同。例如，SEQ ID NO：1的变体可包括与SEQ ID NO：1在1-16个氨基酸位置(诸如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)，例如在1-15个氨基酸位置，1-14个氨基酸位置，1-13个氨基酸位置，1-12个氨基酸位置，1-11个氨基酸位置，1-10个氨基酸位置，1-9个氨基酸位置，1-8个氨基酸位置，1-7个氨基酸位置，1-6个氨基酸位置，1-5个氨基酸位置，1-4个氨基酸位置，1-3个氨基酸位置，或1-2个氨基酸位置中不同的序列。

术语“亲本多肽”或“亲本干扰素-α”意指将根据本发明而进行修饰的多肽序列。亲本多肽序列可以是天然存在的IFN-α的序列(诸如哺乳动物IFN-α，例如，灵长类IFN-α，诸如人IFN-α，诸如在本文中被鉴定为SEQ IDNO：31-42，SEQ ID NO：32+R23K的huIFN-α多肽，或本文所述和/或在AllenG.和Diaz M.O.(1996)中的其它huIFN-α序列，如上)。亲本多肽序列可以是非天然存在的(即“合成的”)干扰素-α的序列，诸如IFN-αCon1(SEQ IDNO：43)。在一些情况下，待修饰的亲本多肽自身可以是本发明的多肽，诸如，SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104的任一个。

用于对象(object)的“天然存在的”是指如下事实，天然发现的该对象与人工制备的不同。例如，存在于生物体(包括病毒，细菌，原生动物，昆虫，植物或哺乳动物组织)中的多肽或多核苷酸序列，如果可从天然来源中分离并且尚未在实验室中经过有意的人工修饰则是天然存在的。用于对象的“非天然存在的”(也称为“合成的”或“人工的”)是指该对象不是天然存在的，即不能在自然界中发现该对象不同于人工合成形式的形式。

“片段”或“亚序列”是完整序列的任意部分，最多为但不包括完整序列。因此，片段或亚序列是指包括较长的氨基酸(例如，多肽)或核酸(例如，多核苷酸)的部分的氨基酸或核酸的序列。

本发明所涉及的一类片段是这样的片段，其中从亲本多肽的N末端或C末端(或二者)去除氨基酸残基的片段；所述多肽被分别称为“N末端截短的”或“C末端截短的”。已知从N末端缺失至少四个氨基酸不会显著影响干扰素-α活性(Lydon，N.B.，(1985)Biochemistry 24：4131-41)。此外，保留干扰素-α活性的变体已得到描述，其中7-11个氨基酸已从C末端缺失(Cheetham B.F.，(1991)Antiviral Res.15(1)：27-39；Chang N.T.，(1983)Arch.Biochem Biophys.221(2)：585-589；Franke A.E.，(1982)DNA 1(3)：223-230)。

“受体”例如，“干扰素-α受体”(也称为“I型干扰素受体”)是细胞中被干扰素-α活化的受体，例如，与干扰素-α结合并起动细胞内信号发生，诸如包含亚单位IFNAR-2和IFNAR-1的I型干扰素受体(Domanski等，(1998)J.Biol.Chem.273(6)：3144-3147；Mogensen等，(1999)Journal of Interferon andCytokine Research，19：1069-1098)。在本文中，受体还意在包括全长受体分子的截短形式，例如缺少膜结合部分的受体分子，诸如包含细胞外结合域的受体分子可溶形式(也称为“可溶性受体”)，所述细胞外结合域结合干扰素-α，但无须结合膜和/或起动细胞内信号发生。

两种分子，例如配体和受体之间的“特异性结合亲和力”是指在一种分子优先与分子混合物中的另一种分子结合。如果结合亲和力约为1×10⁴M^-1至约1×10⁹M^-1或更高(即，K_D约为10^-4至10^-9M或更低)，则分子的结合通常被认为是特异性的。配体和受体的结合亲和力可通过本领域技术人员已知的标准技术进行检测。检测结合亲和力的众所周知的技术的非限制性实例包括Biacore_技术(Biacore AB，Sweden)，等温滴定微量热法(isothermal titration microcalorimetry)(MicroCal LLC，Northampton，MAUSA)，ELISA和FACS。例如，FACS或其它分选法可用于选择分子群(诸如，细胞表面呈现的配体)，所述分子群特异性与相关结合对成员(associatedbinding pair member)(诸如受体，例如，可溶性受体)结合。配体-受体复合物可通过例如，荧光(例如，通过将复合物与识别复合物的荧光抗体反应)进行检测和分选。收集与相关结合对(例如，受体)结合的兴趣分子，然后在存在较低浓度受体的情况下进行再分选。通过在存在浓度渐增(示例性浓度数量级范围为10^-6M至10^-9M，即，1微摩尔(μM)至1毫微摩尔(nM)，或更低，这依赖于配体-受体相互作用的性质)的受体的情况下实施多次分选，可分离出表现对受体的特异性结合亲和力的兴趣分子群。

当多肽、核酸或其它组分与天然状态下与其通常相结合的组分(其它肽，多肽，蛋白质(包括复合物，例如与天然序列相伴随的聚合酶和核糖体)，核酸，细胞，合成试剂，细胞杂质，细胞组分等)，例如与其所来源的细胞中通常与其相结合的其它组分部分或完全分开时，即可认为它们是“分离的”。当多肽、核酸或其它组分与其天然环境中的其它组分部分或完全分离或从中部分或完全回收，使得它们在组合物，混合物或组分收集物中作为占优势的种类存在(即以摩尔数计，它们比组合物中的任何其它各个种类的含量更高)时，所述多肽、核酸或其它组分是分离的。在一些情况下，制备物由大于约60％、70％或75％，一般大于约80％，或优选大于约90％的分离的种类组成。

“基本上纯的”或“分离的”核酸(例如RNA或DNA)，多肽，蛋白质或组分也指目标种类(例如核酸或多肽)占所存在的所有大分子种类之重量(以摩尔计)的至少约50，60或70％。基本上纯的或分离的组分也可以占组合物中所存在的所有大分子种类之重量的至少约80，90或95％。分离的目标种类也可以被纯化成基本上为均质(通过常规的检测方法检测不到组分中的杂质种类)，其中所述组分基本由单一大分子种类的衍生物组成。术语“纯化的”通常是指在电泳凝胶中通常基本上产生一条带的核酸，多肽，或蛋白质。其通常是指核酸，多肽，或蛋白质的纯度为至少约50％，60％，70％，75％，更优选至少约85％，最优选至少约99％。

术语“分离的核酸”可以指这样的核酸(如DNA或RNA)，其不与衍生出本发明核酸的生物体的天然存在基因组中与该核酸紧邻的两个编码序列(即一个在5’末端，一个在3’末端)相紧邻。因此，该术语包括例如通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理而产生的cDNA或基因组DNA片段，而不论该cDNA或基因组DNA片段是被掺入载体，整合至与其所来源的生物体相同或不同物种(包括例如病毒)的基因组中，还是与其它编码序列连接形成编码嵌合多肽的杂合基因，或者是不依赖于任何其它DNA序列。DNA可以是双链或单链，有义或反义。

“重组核酸”或“重组多肽”是非天然存在的多核苷酸或多肽，其可分别包含来自多于一种源核酸或多肽的核酸或氨基酸序列，所述源核酸或多肽可以是天然存在的核酸或多肽，或其自身可经过诱变或其它类型的修饰。当核酸或多肽为合成的或人工的或经改造的，或者衍生自合成的或人工的或改造的蛋白质或核酸时，可以说它们是“重组的”。术语“重组核酸”(例如DNA或RNA)分子指的是例如非天然的核苷酸序列，或通过至少两个一般不同时出现，彼此不相关，或者要不然彼此是分开的序列片段的组合(例如人工组合)而制备的核苷酸序列。重组核酸可含有通过将不同来源的和/或人工合成的核酸片段连接在一起或组合起来而形成的核酸分子。“重组多肽”通常分别指由克隆的或重组的基因或核酸产生的多肽。例如，衍生出不同核酸或氨基酸序列的源多核苷酸或多肽有时具有同源性(即，具有，或编码具有相同或相似结构和/或功能的多肽)，其通常来自于生物体的不同分离体，血清型，品系，物种或来自不同的疾病状态。

当用于谈及例如细胞，核苷酸，载体或多肽时，术语“重组”一般表示已通过导入异源(或外源)核酸或改变天然核酸来修饰所述细胞，核苷酸或载体，或者表示已通过导入异源氨基酸来修饰多肽，或者表示细胞源自经所述修饰的细胞。重组细胞表达在细胞的天然(非-重组)形式中未曾发现过的核酸序列(例如基因)，或者表达可能会被异常表达、少量表达或根本不表达的天然核酸序列(例如基因)。当涉及细胞时，术语“重组”是指复制异源核酸或表达由异源核酸编码的多肽的细胞。重组细胞可包含在天然(非重组)形式的细胞中未被发现的编码序列。重组细胞还可包含在天然形式的细胞中发现的编码序列，其中编码序列被修饰并通过人工手段而被再导入细胞中。该术语还包括含有核酸的细胞，所述核酸对已经过修饰且未从细胞中去除该核酸的细胞而言是内源的；所述修饰包括通过基因取代，定点突变，重组以及相关技术获得的那些。

术语“重组产生的”指的是通常通过以下方法即可实现的人工组合，所述方法包括化学合成方法，核酸片段的循环(recursive)序列重组或其它核苷酸多样性的生成方法(例如改组(shuffling))，或通过例如本领域技术人员已知的基因工程技术对分离的核酸片段进行操作。“重组表达的”一般指这样的技术，其在体外产生重组核酸，在体内，体外或离体将重组核酸转移至细胞中，使该核酸在所述细胞中表达或增殖。

“重组表达盒”或简称“表达盒”是一种核酸构建体，其由重组或化学方法产生，并具有能影响与所述序列相容的宿主中结构基因的表达的核酸元件。表达盒至少包括启动子以及任选地包括，转录终止信号。通常，重组表达盒包括要被转录的核酸(例如，编码所需多肽的核酸)，和启动子。影响表达的其它必需或辅助性的因子也可如本文所述进行使用。例如，表达盒还可包括编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可指导所表达的多肽从宿主细胞的分泌。转录终止信号，增强子，和其它可影响基因表达的核酸序列也可被包含在表达盒中。

“免疫原”指的是能引起免疫应答的物质。免疫原的例子包括例如抗原，在诱导自身免疫病中起作用的自身抗原，和癌细胞上表达的肿瘤-相关抗原。免疫反应通常是指针对试剂，诸如抗原或其片段或编码所述试剂的核酸的细胞或抗体介导的反应。在一些情况下，所述反应包括产生CTL，B细胞，或多种类型的T细胞(其可特异性针对表达兴趣抗原的抗原呈递细胞)中的至少一种或其组合。

“抗原”是这样一种物质，它能在宿主中引发抗体形成，或者能产生与所述物质反应的特异性淋巴细胞群体。抗原一般为对宿主而言外源的大分子(例如蛋白质和多糖)。

佐剂”是指能够增强抗原的免疫刺激特性或药物的药理学作用的物质。佐剂可以非特异性地增强针对抗原的免疫反应。例如，“弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvant)”是一种油和水的乳剂，其包含免疫原，乳化剂和分枝杆菌(mycobacteria)。另一实例，“弗氏不完全佐剂”与之相同，但不含分枝杆菌。

载体是便于由选定核酸进行细胞转导或转染，或在细胞中表达该核酸的成分或组合物。载体包括例如质粒，粘粒，病毒，YAC，细菌，多聚-赖氨酸等。“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体或序列，它具有一系列允许在宿主细胞中转录具体核酸的具体核酸元件。表达载体可以是质粒，病毒或核酸片段的一部分。表达载体一般包括与启动子可操作相连的待转录核酸。要被转录的核酸通常处于启动子的指导或控制下。

“基本上多核苷酸序列的全长”或“基本上多肽序列的全长”指多核苷酸序列或多肽序列长度的至少约50％，一般至少约为60％，70％或75％，一般至少约为80％，或通常至少约为85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或更长。

术语“免疫测定法”包括使用抗体或免疫原来结合或特异性结合抗原的检测法。免疫测定法的常见特征在于利用具体抗体的特异性结合特性来分离，靶向，和/或定量抗原。

本文所用术语“受试者(object)”包括但不限于生物体；哺乳动物，包括例如人，非人灵长类动物(如狒狒(baboon)、猩猩(orangutan)、猴)，小鼠，猪，牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，猴，绵羊或其它非人哺乳动物；非-哺乳动物，包括例如非-哺乳类脊椎动物，如鸟类(如鸡或鸭)或鱼；和非-哺乳类无脊椎动物。

术语“药物组合物”指的是适于给予包括动物或人的受试者以用作药物的组合物。药物组合物一般包含有效量的活性剂和载体，包括例如可药用的载体。

术语“有效量”指的是足以产生所需效果的剂量或量。所需效果包括在所述剂量或量的受体中产生的客观或主观的改善。

“预防性治疗”是这样的治疗，其被给予未显示出疾病、病理或医学病症的体征或症状，或仅显示出疾病、病理或医学病症的早期体征或症状的受试者，由此该治疗的目的在于减轻，防止疾病、病理或医学病症或减少患疾病、病理或医学病症的可能性。预防性治疗的作用是预防性地治疗疾病或病症。“预防活性”指诸如核酸，载体，基因，多肽，蛋白质，物质，或其组合物的药剂在施用于未显示出疾病、病理或医学病症的体征或症状，或仅显示出疾病、病理或医学病症的早期体征或症状的受试者时，能减轻，防止疾病、病理或医学病症或减少受试者患疾病、病理或医学病症的可能性的活性。“预防上有用的”药剂或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于减轻，防止，治疗疾病、病理或医学病症或减少疾病、病理或医学病症的发生的药剂或化合物。

“治疗性治疗”是对显示出疾病、病理或医学病症的症状或体征的受试者所施用的治疗，其中对所述受试者施用该治疗的目的是减轻或消除所述疾病、病理或医学病症的体征或症状。“治疗活性”指诸如核酸，载体，基因，多肽，蛋白质，物质，或其组合物的药剂施用于显示出疾病、病理或医学病症的体征或症状的受试者时，能消除或减弱疾病、病理或医学的体征或症状的活性。“治疗上有用的”药剂或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于减弱，治疗或消除疾病、病理或医学病症的所述体征或症状的药剂或化合物。

术语“基因”广义地指任何与生物学功能相关的DNA片段。基因包括其表达所需的编码序列和/或调控序列。基因也包括非-表达型的DNA核酸片段，例如形成其它蛋白质的识别序列的片段(例如启动子、增强子或其它调节区)。基因可获自多种来源，包括由兴趣来源所克隆的或由已知或预测的序列信息合成的基因，且可包括被设计为具有所需参数的序列。

一般说来，下文所用的术语和下文所述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学的实验室方法都是本领域技术人员众所周知的和常用的那些术语和方法。如Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第2版)，Vol.1-3，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(下文简称为“Sambrook”)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc和John Wiley & Sons，Inc(1999年增补)(下文简称为“Ausubel”)中所述的标准技术可用于重组核酸方法，核酸合成，细胞培养方法和转基因掺入，如电穿孔，注射、透皮加压(impressing through the skin)和脂质转染法。一般情况下，根据说明书进行寡核苷酸合成和纯化步骤。一般根据本领域的常规方法和本文中提供的多篇普通参考文献进行技术和方法的操作。其中的方法据信是本领域技术人员众所周知的，为了方便读者，提供了这些方法。

本文所用的“抗体”指的是蛋白质，其含有一种或多种基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所编码的多肽。术语抗体用于意指完整抗体及其结合片段。公知的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或λ。重链被分为γ，μ，α，δ或ε，它们反过来也将免疫球蛋白的类型分别限定为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。常见的免疫球蛋白(如抗体)结构单位含有四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指的是这些轻链和重链。

抗体包括单克隆抗体，单链抗体(包括单链Fv(sFv)抗体，其中可变重链和可变轻链(直接或通过肽接头)连接在一起，形成连续的多肽)，以及双抗体(diabody)，三抗体(tribody)，四抗体(tetrabody)(Pack等，(1995)J MolBiol246：28；Biotechnol 11：1271；和Biochemistry 31：1579)。所述抗体是例如多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，Fab片段，通过Fab表达文库产生的片段等。

术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白质决定子。表位通常由分子的化学活性表面簇诸如氨基酸或糖侧链组成，并通常具有独特的三维结构特性以及独特的电荷特性。构象表位和非构象表位的区别在于，存在变性溶剂时，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。

抗体的“抗原-结合片段”是抗体中与抗原结合的肽或多肽片段。抗体中有益于、参与、或影响与抗原的结合的那些氨基酸形成了抗原-结合位点。参见Scott，T.A和Mercer，E.I.，Concise Encyclopedia：Biochemistry andMolecular Biology(de Gruyter，第3版，1997)和Watson，J.D等，RecombinantDNA(第2版，1992)[下文简称为“Watson，Recombinant DNA”]，各文献均全文引入本文作为参考。

术语“筛选”通常是指鉴定本发明最优分子，例如本发明的多肽，和包含其的相关融合多肽，和编码所有所述分子的过程。各种分子的数种特性可用于选择和筛选中，例如：各分子结合配体或受体的能力，抑制细胞增殖的能力，抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制的能力，诱导或抑制细胞细胞因子产生的能力，改变免疫反应的能力，例如，在受试系统或体内，离体或体外应用中诱导或抑制所需免疫反应。在抗原的情况下，抗原的数种特性可用于选择和筛选中，包括抗原表达，折叠，稳定性，免疫原性和对数种相关抗原表位的呈递。

“选择”是一种筛选方式，其中鉴定和物理分离同时进行，例如，通过表达选择标志，该标志在一些遗传环境下能使细胞表达该标志而存活但其它细胞则死亡(或反之)。筛选标记物包括，例如萤光素酶，β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白等。选择标志包括药物和抗毒素性基因等。其它形式的选择包括的基于可检测事件的物理分选，所述事件诸如配体与受体的结合，底物与酶的反应，或任何其它直接(例如，通过使用显色型底物或配体)或间接(例如，通过与显色性第二抗体反应)产生可检测信号的物理过程。通过物理分选的选择可通过多种方法实现，例如通过在全细胞或微滴形式中的FACS。

本文所使用的“外源核酸”，“外源DNA片段”，“异源序列”，或“异源核酸”来自于具体宿主细胞以外的来源，或如果来自相同来源，是由其原始形式修饰而来的。因此，宿主细胞中的异源基因包括对具体宿主细胞内源的，但未经修饰的基因。本文所述在应用中对异源序列的修饰通常通过使用重复序列重组发生。术语是指这样的DNA片段，其是对细胞外源或异源的，或是对细胞同源但位于宿主细胞核酸中通常无该元件的位置。外源DNA片段被表达以生成外源多肽。

术语“核酸”是指是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非有具体限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核苷酸具有与参照核酸相似的结合特性并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有所示，具体核酸序列还隐含地包括其保守性修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子取代可通过产生这样的序列来实现，所述序列中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三个位点被混合的碱基和/或脱氧次黄苷残基取代(Batzer，(1991)Nucleic Acid Res 19：5081；Ohtsuka，(1985)JBiol Chem 260：2605-2608；Cassol，(1992)；Rossolini，(1994)Mol Cell Probes8：91-98)。术语核酸可与基因，cDNA，和由基因编码的mRNA互换使用。

“来源于基因的核酸”是指其合成最终以基因或其亚序列作为模板的核酸。因此，mRNA，从mRNA反转录的cDNA，从该cDNA转录的RNA，从cDNA扩增的DNA，从扩增的DNA转录的RNA等全都来源于该基因，且检测所述来源产物可指示样品中存在和/或有大量原始基因和/或基因转录物。

当核酸与另一核酸序列发生功能关系时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子增加编码序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接于编码序列。可操作地连接是指被连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，所述DNA序列是连续的且在读框内。然而，因为增强子在与启动子被数千碱基隔开时通常发挥作用，且内含子序列可以具有可变的长度，一些多核苷酸元件可以是可操作地连接但不连续。

术语“细胞因子”包括，例如，白细胞介素，干扰素，趋化因子，造血生成因子，肿瘤坏死因子和转化生长因子。一般来说，它们是低分子量蛋白质，其可调节免疫系统的细胞的成熟，活化，增殖和分化。

在本发明的说明书和权利要求中，任何涉及“一种”组分(例如在有关非多肽部分，氨基酸残基，取代，缓冲液，阳离子等的内容中)的内容意指一种或多种所述组分，除非另有所述或除非从具体上下文中清楚地得出并非该情况。例如，术语“选自A，B和C组成的组的组分”意指包括A，B和C的所有组合，例如，A，B，C，A+B，A+C，B+C或A+B+C。

多种其它术语在此处给出定义或进行定性。

本发明的分子和方法

慢性HCV感染患者在治疗前通常具有10⁴-10⁷拷贝的HCV RNA/ml血清的病毒载量。通过用IFN-α治疗，这些患者中的病毒载量特征性地历经两个不同的对数线性衰减期(图1B；Neumann A.U.，，(1998)Science282：103-107)。IFN-α治疗的前两日中发生的病毒载量的起始快速下降，被认为是由于干扰素-α介导的病毒在被感染肝细胞中的生成减少及原始细胞对抗感染的伴随保护。在约二日时，病毒产生的速率达到新的稳定状态，此时可观测到病毒清除率的第二个快速对数线性期(速率较低)。病毒清除率的该第二期通常被认为部分由于T细胞介导的对感染的肝细胞的杀伤(Neumann等，如上)。IFN-α被认为在该生物反应中通过刺激抗原特异性T细胞分化为TH1细胞而发挥关键性作用。此外，利巴韦林的作用模式被认为是由于TH1反应的放大，且被认为是其与IFN-α治疗联合效力的机理基础。对目前使用的干扰素-α治疗无反应的感染了HCV的患者(通常被称为“无反应者”)表现出更浅的(shallow)病毒载量清除图(图1A)。

虽然本发明并非意在受潜在机制的具体理论的限制，应当理解替代(surrogate)测定系统(诸如本文更详细描述的那些系统)中的抗病毒活性可作为干扰素-α分子效力(例如在病毒清除率第一相)的预测物。示例性抗病毒测定法(实施例章节中所述)监测IFN-α抑制EMCV(RNA病毒)在HuH7人肝来源细胞中复制的有效性，其可作为人肝细胞中HCV复制的替代系统。其它有用的抗病毒测定系统包括EMCV在WISH细胞中，和VSV在WISH细胞中。其它在感染肝细胞中的HCV替代测定系统包括HCV复制子系统，例如，Lohmann V.等，(1999)Science 285(5424)：285-3；Randall G.和Rice C.M.(2001)Curr Opin Infect Dis 14(6)：743-7；和Bartenschlager，R.(2002)NatureReviews/Drug Discovey 1：911中所述。可用于监测HCV抗病毒效力的体内系统的实例是嵌合人肝SCID小鼠，如Mercer，(2001)Nature Medicine7(8)：927-933中所述。

不受理论的限制，还认为由IFN-α导致的T_H1分化增强和/或T_H2分化的抑制可以是干扰素-α效力的促成因素，例如在病毒清除率第二阶段中。根据该理论，预计这些生物活性(即，T_H1分化的增强和/或T_H2分化的抑制)方面的效力增强的改进型IFN-α具有相对例如目前批准的治疗性干扰素-α分子(以相同剂量施用)而言增加的效力。示例性测定法(实施例章节中所述)借助ELISA或借助细胞内染色及FACS分选来测定与T_H1-表型(例如，IFN-γ)和/或T_H2-表型(例如，IL-5，IL4)相关的细胞因子的产生，从而监测IFN-α对T_H0细胞的T_H1分化的增强和/或T_H2分化的抑制。

IFN-α分子的治疗效果会部分由于剂量限制性毒性(dose-limitingtoxicity)，例如血小板减少和中性白细胞减少而出现降低。虽然本发明并非意在受潜在机制的具体理论的限制，应当理解所述毒性或许与IFN-α对血小板和中性白细胞前体的抗增殖作用相关，而在替代测定系统(诸如本文所述的那些系统)中的抗增殖活性可作为干扰素-α分子的相对毒性的预测物。因此，与IFN-α治疗相关的剂量限制性毒性可在IFN-α分子中减少，所述分子表现出相对于例如目前批准的治疗性干扰素-α分子诸如ROFERON_-A(干扰素α-2a，重组；Hoffmann-La Roche Inc.)，INTRON_A(干扰素-α-2b，重组；Schering Corporation)，和INFERGEN_(干扰素-α-1；InterMune，Inc.)而言减低的抗增殖活性。示例性抗增殖活性测定法(实施例章节中所述)监测IFN-α对人Daudi淋巴细胞增殖的作用。可选地，或此外，施用更具治疗活性的分子可产生剂量限制性毒性，所述分子的给药浓度或频率可低于目前批准的分子的给药浓度或频率。

本发明的一个目的是提供新的干扰素-α多肽，和编码该多肽的核酸。一些本发明的多肽表现出干扰素-α活性，例如，抗病毒活性，抗增殖活性，和/或T_H1分化活性。一些本发明的多肽表现出以下特性的一种或多种：与参照IFN-α多肽相比抗病毒活性增加或降低；与参照IFN-α多肽相比T_H1分化活性增加或降低；与参照IFN-α多肽相比抗增殖活性增加或降低。参照IFN-α多肽可包括非天然存在的干扰素-α的序列，诸如IFN-αCon1(SEQ IDNO：43)，或可包含天然存在的(即，野生型)干扰素-α多肽。天然存在的干扰素-α多肽的序列的实例包括人IFN-α多肽的序列，例如，huIFN-α2b(SEQ IDNO：32)，huIFN-α2a(23位＝Lys的SEQ ID NO：32)，huIFN-α2c(34位＝Arg的SEQ ID NO：32)，huIFN-α8b(SEQ ID NO：33)，huIFN-α8a(98位＝Val，99位＝Leu，100位＝Cys，和101位＝Asp的SEQ ID NO：33)，huIFN-α8c(161位＝Asp且162-166位氨基酸缺失的SEQ ID NO：33)，huIFN-α14a(SEQID NO：39)，huIFN-α14c(152位＝Leu的SEQ ID NO：39)，或任何其它天然存在的人干扰素α多肽的序列，诸如图2和4中所示(SEQ ID NO：31-42)和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)中所列，如上。

另一方面，本发明提供了干扰素-α多肽，该多肽使得从被感染细胞中清除HCV的有效性与参照干扰素-α分子，诸如目前用作治疗剂的参照干扰素-α分子(例如，ROFERON-A，INTRON A，或INFERGEN)相比增强。所述增强的有效性可来自相对参照分子增强的抗病毒活性和/或增强的T_H1-分化活性。本发明的一些干扰素-α多肽具体适用于清除对目前使用的干扰素-α分子反应较弱的HCV株，所述毒株例如是，HCV基因型1(Genotype 1 HCV)。

一些本发明的多肽表现出与参照IFN-α分子相比增高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或与参照IFN-α分子相比增高的(T_H1分化活性/抗增殖活性)比率。表现出所述特性的多肽对于治疗病毒感染诸如HCV感染特别有效。例如，一些所述多肽在双阶段病毒清除图谱的一个或两个二阶段中在对HCV的治疗中的治疗效力高于目前批准的干扰素-α分子，和/或可表现出降低的毒性。一些所述多肽在对HCV基因型1的治疗中的治疗效力超过现今批准的干扰素-α分子的治疗效力。

本发明的另一目的是提供偶联物，所述偶联物包含一个或多个与本发明的多肽连接的非多肽部分，所述本发明的多肽表现出干扰素-α活性(诸如上述活性的一种或多种)，并任选地表现出其它所需特性，诸如相对于非偶联型多肽增强的血清半寿期和/或功能性体内半寿期，和/或降低的抗原性。一些所述偶联物在从感染细胞中HCV清除方面的效力比参照干扰素-α分子的所述效力更强，所述参照干扰素-α分子诸如目前用作治疗剂的干扰素-α偶联物(例如，PEGASYS_(Peg干扰素α-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)或PEG-INTRON_(peg干扰素α-2b；Schering Corporation)增强的效力。所述增强的效力可来自相对参照分子而言增强的抗病毒活性和/或增强的T_H1-分化活性。本发明的一些干扰素-α偶联物特别适用于清除对目前使用的干扰素-α分子反应较弱的HCV株，所述毒株例如是HCV基因型1。

一些本发明的偶联物表现出与参照IFN-α分子相比增高的(抗病毒活性/抗增殖活性)比率，和/或与参照IFN-α分子相比增高的(T_H1分化活性/抗增殖活性)比率。表现出所述特性的偶联物对于治疗病毒感染诸如HCV感染特别有效。例如，一些所述偶联物在双阶段病毒清除图谱的一或两个二阶段中对HCV的治疗效力高于目前批准的干扰素-α分子，和/或可表现出降低的毒性。一些所述偶联物在对HCV基因型1的治疗中的治疗效力超过现今批准的干扰素-α分子的治疗效力。

本发明的另一目的是提供抑制感染了病毒的细胞中的病毒复制的方法，该方法包括对感染了病毒的细胞施用本发明的多肽或偶联物，所述多肽或偶联物的量能有效抑制所述细胞中的病毒复制。本发明还提供了降低感染了病毒的细胞中病毒拷贝数的方法，该方法包括对感染了病毒的细胞本发明的多肽或偶联物，所述多肽或偶联物的量能有效降低所述细胞中病毒的拷贝数。例如，所述病毒可以是RNA病毒，诸如HCV，或DNA病毒，诸如HBV。所述细胞可在培养物中或从哺乳动物中分离(即，体外或离体)，或可以在体内，例如，在哺乳动物(例如SCID小鼠模型，如Mercer，，(2001)Nature Medicine.7(8)：927-933所述)、灵长类或人中。

本发明还提供了增强T_H0细胞的T_H1分化的方法，该方法包括对包含T_H0细胞的细胞群施用本发明的多肽或偶联物，所述多肽或偶联物的量能有效增加在所述细胞群中与T_H1-表型相关的细胞因子(例如，IFN-γ)的产生和/或降低与T_H2-表型相关的细胞因子(例如，IL-4或IL-5)的产生。所述细胞可在培养物中或从哺乳动物中分离(即，体外或离体)，或可以在体内，例如在哺乳动物，灵长类或人中。

本发明还提供了抑制细胞群增殖的方法，包括将该细胞群与本发明的多肽，变体，或偶联物接触，所述多肽，变体或偶联物的量可有效地降低细胞群的增殖。该细胞群可在培养物中的或从哺乳动物中分离(即，体外或离体)，或可以在体内，例如，在哺乳动物，灵长类或人中。

以下将对本发明的这些和其它目的进行详细描述。

本发明的多肽

本发明提供了新的干扰素-α多肽，在本文中统称为“本发明的多肽”。“本发明的多肽”通篇意指包括本文所述的多肽序列的变体。本发明还包括包含本发明多肽的融合蛋白质，和包含本发明多肽的偶联物。

多种干扰素-α编码序列的片段被重复重组以便形成包含重组多核苷酸的文库，从中发现一些本发明的多肽。获得重组多核苷酸文库的方法和/或在用作递归序列重组基质的核酸中得到多样性的方法同样描述如下。

示例性本发明的多肽包括含有如下序列的多肽，所述序列在本文中被鉴定为SEQ ID NO：1-15，诸如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEO ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，其由如下核酸编码，所述核酸在本文中被鉴定为SEQ ID NO：16-30，诸如SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30。本发明的多肽还包括含有如下序列的那些多肽，所述序列在本文中被鉴定为SEQ IDNO：44-104，诸如SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：65，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：73，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：83，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：91，SEQ IDNO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100，SEQ IDNO：101，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：103，和SEQ ID NO：104。一些所述多肽还包括其它氨基酸，诸如甲硫氨酸，其被加至N末端。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白质和偶联物，和编码这些多肽的分离的或重组的核酸。

本发明还包括这样的多肽，其包含在0-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个位置)，例如在0-16个位置，0-15个位置，0-14个位置，在0-13个位置，在0-12个位置，在0-11个位置，在0-10个位置，在0-9个位置，在0-8个位置，在0-7个位置，在0-6个位置，在0-5个位置，在0-4个位置，在0-3个位置，在0-2个位置，或0-1个位置中与SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104之一，诸如，SEQ ID NO：1-15，47或53之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)不同的序列。在一些情况下，所述多肽表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性，TH1分化活性，和/或抗增殖活性等)。一些所述多肽还包括其它氨基酸，诸如甲硫氨酸，其被加至N末端。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白质和偶联物，和编码这些多肽的分离的或重组的核酸。

在一些情况下，本发明多肽的序列包含在一个或多个位置用氨基酸对不同氨基酸的取代，所述位置包括，但不限于，位置47，51，52，53，54，55，56，57，58，60，61，64，69，71，72，75，76，77，78，79，80，83，84，85，86，87，90，93，133，140，154，160，161，和162，所述位置相对于SEQ ID NO：1-15，47，和53任一项，例如，SEQ ID NO：1，SEQID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53的，。在一些情况下，所述多肽序列包括下组的一或多个氨基酸：47位的His或G1n；51位的Val，Ala或Thr；52位的Gln，Pro或Glu；53位的Ala或Thr；55位的Phe，Ser，或Pro；56位的Leu，Val或Ala；57位的Phe或Leu；58位的Tyr或His；60位的Met，Leu或Val；61位的Met或Ile；64位的Thr或Ile；69位的Ser或Thr；71位的Lys或Glu；72位的Asn或Asp；75位的Ala或Val；76位的Ala或Thr；77位的Trp或Leu；78位的Asp或Glu；79位的Glu或Gln；80位的Thr，Asp，Ser，或Arg；83位的Glu或Asp；84位的Lys或Glu；85位的Phe或Leu；86位的Tyr，Cys或Ser；87位的Ile或Thr；90位的Phe，Tyr，Asp或Asn；93位的Met或Leu；133位的Lys或Glu；140位的Ser或Ala；154位的Phe或Leu；160位的Lys或Glu；161位的Arg或Ser；和162位的Arg或Ser；所述位置相对SEQID NO：1进行编号。本发明还提供了包含这些多肽的融合蛋白质和偶联物，和编码这些多肽的分离的或重组的核酸。

一些本发明的多肽包含在亲本分子中的位置的取代，预测所述位置包含暴露于该分子表面例如，经计算其侧链的至少25％，诸如至少50％暴露于表面的氨基酸残基。一些本发明的所述多肽包括在一个和多个位置由氨基酸对不同氨基酸的取代，所述位置包括，但不限于包含具有大于25％分数可接近表面区(Accessible Surface Area)(ASA)的氨基酸残基的以下位置：位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，16，19，20，22，23，24，25，26，27，28，30，31，33，34，35，37，40，41，42，44，46，47，49，50，51，52，59，62，63，66，69，70，71，72，74，75，78，79，80，81，83，84，87，90，91，94，95，97，98，100，101，102，103，104，105，107，108，109，110，111，112，113，114，115，118，121，122，125，126，128，129，132，133，134，135，136，137，138，139，146，149，150，153，154，157，159，160，161，162，163，164，165，和166，相对于SEQ ID NO：1-15，47，或53任一项(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ IDNO：53)。一些本发明的所述多肽包括在一个和多个位置上氨基酸被取代位不同的氨基酸，所述位置包括，但不限于，包含具有大于50％分数ASA的氨基酸残基的以下位置：位置2，3，4，5，6，7，8，9，12，13，16，19，25，27，28，31，33，34，35，37，41，44，46，47，49，50，66，71，75，78，79，80，83，84，87，90，91，94，95，101，102，103，105，107，108，109，110，111，114，115，118，121，122，125，126，129，132，133，135，138，150，160，162，163，164，165，和166，所述位置为相对于SEQ ID NO：1-15，47或53之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)的位置。

一些本发明的多肽包括一种或多种以下取代，所述取代能将半胱氨酸残基导入具有大于25％分数ASA的位置：D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，G10C，R12C，R13C，M16C，A19C，Q20C，R22C，R23C，I24C，S25C，L26C，F27C，S28C，L30C，K31C，R33C，H34C，D35C，R37C，Q40C，E41C，E42C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，V51C，Q52C，E59C，Q62C，Q63C，N66C，S69C，T70C，K71C，N72C，S74C，A75C，D78C，E79C，T80C，L81C，E83C，K84C，I87C，F90C，Q91C，N94C，D95C，E97C，A98C，V100C，M101C，Q102C，E103C，V104C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，M112C，N113C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，T128C，L129C，T132C，K133C，K134C，K135C，Y136C，S137C，P138C，Al46C，M149C，R150C，S153C，F154C，N157C，Q159C，K160C，R161C，L162C，R163C，R164C，K165C和E166C(或相对于SEQ ID NO：1的等效位置)，或其组合。

一些本发明的多肽包括一种或多种以下取代，所述取代能将赖氨酸残基导入具有大于25％分数ASA的位置：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，G10K，R12K，R13K，M16K，A19K，Q20K，R22K，R23K，I24K，S25K，L26K，F27K，S28K，L30K，R33K，H34K，D35K，R37K，Q40K，E41K，E42K，D44K，N46K，H47K，Q49K，V51K，Q52K，E59K，Q62K，Q63K，N66K，S69K，T70K，N72K，S74K，A75K，D78K，E79K，T80K，L81K，E83K，I87K，F90K，Q91K，N94K，D95K，E97K，A98K，V100K，M101K，Q102K，E103K，V104K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，M112K，N113K，V114K，D115K，L118K，R121K，Q125K，R126K，T128K，L129K，T132K，Y136K，S137K，P138K，A146K，M149K，R150K，S153K，F154K，N157K，Q159K，R161K，L162K，R163K，R164K，和E166K(或相对于SEQ ID NO：1的等效位置)，或其组合。

一些本发明的多肽包括用不同氨基酸残基对氨基酸残基的一或多种取代，或氨基酸残基的一或多种缺失，其从任何本发明的多肽中去除一个或多个赖氨酸，例如，K31，K50，K71，K84，K122，K133，K134，K135，K160，和/或K165(相对于SEQ ID NO：1)，所述本发明的多肽诸如SEQ IDNO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一，例如，SEQ ID NO：1-15，47或53之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：47，或SEQ ID NO：53)。可被任何其它氨基酸取代而被去除的一个或多个赖氨酸残基可用Arg(R)或Gln(Q)取代，或可被缺失。一些所述多肽包含取代K31R+K122R；K31R+K133R；K122R+K133R；或K31R+K122R+K133R。其它示例性取代包括K71E；K84E；K133E/G；和K160E。

一些本发明的多肽包括从本发明的任何多肽中去除一个或多个组氨酸例如，H7，H11，H34，和/或H47(相对于SEQ ID NO：1)的取代或缺失，所述本发明的多肽诸如SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一，例如，SEQID NO：1-15，47或53之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)。可被任何其它氨基酸取代而被去除的一个或多个组氨酸残基可用Arg(R)或Gln(Q)取代，或可被缺失。一些所述多肽包括取代H34Q；H47Q；或H34Q+H47Q。

一些本发明的多肽包含氨基酸对不同氨基酸的取代，氨基酸的缺失，或氨基酸的插入，其消除或破坏了N连接的糖基化位点N72 S73 S74(相对于SEQ ID NO：1)的空间排布。消除该位点可用多种方式完成，例如通过缺失N72或用N72取代不同氨基酸，用Pro取代Ser73，用Ser，Thr，或Cys以外的氨基酸取代Ser74，或在73和74之间插入Ser，Thr，或Cys以外的氨基酸残基。例如，一些所述多肽包含取代N72D。

一些本发明的多肽包含一个或多个氨基酸取代，缺失或插入，其可去除一个或多个碱性残基或一个或多个碱性残基对(诸如，Arg-Arg，Arg-Lys，Lys-Arg，Lys-Lys)以便，例如，将潜在蛋白酶敏感位点的存在最小化，或在一些情况下，去除对胺反应性偶联(例如PEG化)试剂具有潜在反应性的位点。例如，去除C末端附近的二元序列可通过去除一个或多个Lys160，Arg161，Arg163，Arg164，和Lys165(相对于SEQ ID NO：1)。例如可缺失，或用Lys或Arg以外的任何氨基酸取代一个或多个欲去除的Lys或Arg。一些本发明的所述多肽包含一个或多个Lys160，Arg161，和Arg164对Lys或Arg以外的氨基酸的取代，例如，取代Lys160Glu；Arg161Ser/Cys；和Arg164Ser/Cys中的一个或多个。一些所述多肽可选地或另外包含一个或多个Lys160，Arg161，Arg163，Arg164，和Lys165的缺失，这可经由单个缺失(例如，K165^*)或大于一个的成组缺失，包括经由C末端截短(例如，K165^*-E166^*)进行。

本发明多肽的其它修饰包括下文和题目为“干扰素-α偶联物”的章节中所述的那些修饰。

应当理解虽然本文提供的实施例和对亲本多肽的修饰是相对于序列SEQ ID NO：1而言的(或相对于一些其它具体序列而言)，所公开的修饰还可在本文所述本发明的任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-15和SEQ IDNO：44-104和其变体)的等效氨基酸位置上进行。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代H47C应被理解为对应于SEQ ID NO：5中的Q47C，等等。

下表提供了本发明一些干扰素-α多肽的序列。为了清楚地描述，所述序列相对于SEQ ID NO：3(表1)或SEQ ID NO：12(表2)进行显示。一些所述多肽显示干扰素-α活性，诸如抗病毒活性，T_H1分化活性和/或抗增殖活性。

表1

多肽序列(相对于SEQ ID NO：3)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：3+E133K，A140S	B9x11	SEQ IDNO：1
SEQ ID NO：3+H47Q，E133K，A140S	B9x12	SEQ IDNO：2
			SEQ ID NO：3	B9x14，B9x14CHO2	SEQ IDNO：3
SEQ ID NO：3+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	B9x15	SEQ IDNO：4
			SEQ ID NO：3+H47Q	B9x16	SEQ IDNO：5
SEQ ID NO：3+V51T，F55S，L56V，Y58H	B9x17	SEQ IDNO：6
			SEQ ID NO：3+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H	B9x18	SEQ IDNO：7
SEQ ID NO：3+F154L，K160E，R161S，R164S	B9x14C2a	SEQ IDNO：44
			SEQ ID NO：3+E166EC	B9x14CHOl	SEQ IDNO：45
SEQ ID NO：3+N72D	B9x14CHO3	SEQ IDNO：46
			SEQ ID NO：3+N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4，B9x14EC4	SEQ IDNO：47
SEQ ID NO：3+N72D，K160E，R161C，R164S	B9x14CHO5，B9x14EC5	SEQ IDNO：48
			SEQ ID NO：3+N72D，K160E，R161S，R164C	B9x14CHO6，B9x14EC3	SEQ IDNO：49

多肽序列(相对于SEQ ID NO：3)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：3+H47Q，V51A，F55S，L56V，F57L，Y58H，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	14Ep01	SEQ IDNO：50
SEQ ID NO：3+M61I，N72D，E83D，M93L，M101T， T109I，P110A，V114E，F154L，K160E，R161S，R164S	14Ep02	SEQ IDNO：51
			SEQ ID NO：3+N72D，M101I，F154L，K160E，R161S，R164S	14Ep03	SEQ IDNO：52
SEQ ID NO：3+N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	14Ep04	SEQ IDNO：53
			SEQ ID NO：3+H47Q，V51A，F55S，L56V，F57L，Y58H，N72D，M101I，F154L，K160E，R161S，R164S	14Ep05	SEQ IDNO：54
SEQ ID NO：3+H47Q，V51A，F55S，L56V， F57L，Y58H，M61I，N72D，E83D，M93L，M101T， T109I，P110A，V114E，F154L，K160E，R161S，R164S	14EF	SEQ IDNO：55
			SEQ ID NO：3+K31C，N72D，F 154L，K160E，R161S，R164S	B9x14Ep04C31	SEQ IDNO：56
SEQ ID NO：3+K31C，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C31	SEQ IDNO：57
			SEQ ID NO：3+N46C，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C46	SEQ IDNO：58
SEQ ID NO：3+K71C，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C71	SEQ IDNO：59

多肽序列(相对于SEQ ID NO：3)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：3+N72D，A75C，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C75	SEQ IDNO：60
SEQ ID NO：3+N72D，E79C，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C79	SEQ IDNO：61
			SEQ ID NO：3+N72D，E107C，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C107	SEQ IDNO：62
SEQ ID NO：3+N72D，K122C，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C122	SEQ IDNO：63
			SEQ ID NO：3+N72D，K134C，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4C134	SEQ IDNO：64
SEQ ID NO：3+N72D，F154L，K160E，R161*-E166*	B9x14Ep04Δ161-166	SEQ IDNO：65
			SEQ ID NO：3+N72D，F154L，K160E，R161S，R164S，K165*-E166*	B9x14Ep04Δ165-166	SEQ IDNO：66
SEQ ID NO：3+Cl*-P4*，D44*，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S，K165*-E166*	B9x14Ep04Δ1-4D44*Δ165-166	SEQ IDNO：67
			SEQ ID NO：3+H34Q，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4NP1	SEQ IDNO：68
SEQ ID NO：3+H34Q，H47Q，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO4NP2	SEQ IDNO：69
			SEQ ID NO：3+K31R，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO8	SEQ IDNO：70
SEQ ID NO：3+K50R，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO9	SEQ IDNO：71
			SEQ ID NO：3+K71R，N72D，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO10	SEQ IDNO：72

多肽序列(相对于SEQ ID NO：3)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：3+N72D，K84R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO11	SEQ IDNO：73
SEQ ID NO：3+N72D，K122R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO12	SEQ IDNO：74
			SEQ ID NO：3+N72D，K134R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO13	SEQ IDNO：75
SEQ ID NO：3+N72D，K135R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO14	SEQ IDNO：76
			SEQ ID NO：3+N72D，K160E，R161S，R164S，K165R	B9x14CHO15	SEQ IDNO：77
SEQ ID NO：3+N72D，K122R，K135R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO16	SEQ IDNO：78
			SEQ ID NO：3+K31R，N72D，K135R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO17	SEQ IDNO：79
SEQ ID NO：3+K31R，N72D，K122R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO18	SEQ IDNO：80
			SEQ ID NO：3+K31R，H34Q，H47Q，N72D，K122R，K160E，R161S，R164S	B9x14CHO18NP2	SEQ IDNO：81
SEQ ID NO：3+K31R，H34Q，H47Q，N72D，K122R，K160E，R161S，R164S，K165*-E166*	B9×14CHO18NP2Δ165-166	SEQ IDNO：82

表2

多肽序列(相对于SEQ ID NO：12)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H	B9X21	SEQ IDNO：8
SEQ ID NO：12+V51T，F55S，L56V， Y58H	B9X22	SEQ IDNO：9
			SEQ ID NO：12+H47Q	B9X23	SEQ IDNO：10
SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	B9X24	SEQ IDNO：11
			SEQ ID NO：12	B9X25	SEQ IDNO：12
SEQ ID NO：12+V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	B9X26	SEQ IDNO：13
			SEQ ID NO：12+H47Q，E133K，A140S	B9X27	SEQ IDNO：14
SEQ ID NO：12+E133K，A140S	B9X28	SEQ IDNO：15
			SEQ ID NO：12+N72D	B9x25CHO1	SEQ  IDNO：83
SEQ ID NO：12+N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	B9x25CHO2，25Ep09，B9x25EC1	SEQ IDNO：84
			SEQ ID NO：12+N72D，F154L，K160E，R161C，R164S	B9x25CHO3，B9x25EC2	SEQ IDNO：85
SEQ ID NO：12+N72D，F154L，K160E，R161S，R164C	B9x25CHO4，B9x25EC3	SEQ IDNO：86
			SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D	25Ep01	SEQ IDNO：87

多肽序列(相对于SEQ ID NO：12)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：12+L17I，R22G，H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep02	SEQ IDNO：88
SEQ ID NO：12+D2N，P4S，S10N，H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep03	SEQ IDNO：89
			SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，L60M，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep04	SEQ IDNO：90
SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，N95D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep05	SEQ IDNO：91
			SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，E83D，M93L，N95D，I101T，V114E，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep06	SEQ IDNO：92
SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep07	SEQ IDNO：93
			SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep08	SEQ IDNO：94
SEQ ID NO：12+L17I，R22G，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep10	SEQ IDNO：95
			SEQ ID NO：12+D2N，P4S，S10N，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep11	SEQ IDNO：96

多肽序列(相对于SEQ ID NO：12)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：12+N72D，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep12	SEQ IDNO：97
SEQ ID NO：12+L17I，R22G，N72D，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep13	SEQ IDNO：98
			SEQ ID NO：12+D2N，P4S，S10N，N72D，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep14	SEQ IDNO：99
SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep15	SEQ IDNO：100
			SEQ ID NO：12+L17I，R22G，H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep16	SEQ IDNO：101
SEQ ID NO：12+D2N，P4S，S10N，H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25Ep17	SEQ IDNO：102
			SEQ ID NO：12+L17I，R22G，H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，L60M，N72D，E83D，M93L，N95D，I101T，V114E，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25EF1	SEQ IDNO：103

多肽序列(相对于SEQ ID NO：12)	克隆名称	SEQ ID
			SEQ ID NO：12+D2N，P4S，S10N，H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，L60M，N72D，E83D，M93L，N95D，I101T，V114E，R125Q，F154L，K160E，R161S，R164S	25EF2	SEQ IDNO：104

变体

另一方面，本发明提供了分离的和重组的多肽，其是亲本干扰素-α多肽的变体，该变体包含与亲本多肽序列在至少一个氨基酸位置中不同的序列，其中变体序列包括下组中的一种或多种残基：47位的His，51位的Val，55位的Phe，56位的Leu，58位的Tyr，133位的Lys，和140位的Ser，所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。在一些情况下，亲本干扰素-α多肽序列是天然存在的干扰素-α序列(诸如，huIFN-α2b(SEQ ID NO：32)，huIFN-α2a(23位＝Lys的SEQ ID NO：32)，huIFN-α2c(34位＝Arg的SEQ IDNO：32)，huIFN-α8b(SEQ ID NO：33)，huIFN-α8a(98位＝Val，99位＝Leu，100位＝Cys，和101位＝Asp的SEQ ID NO：33)，huIFN-α8c(161位＝Asp且162-166位氨基酸缺失的SEQ ID NO：33)，huIFN-α14a(SEQ ID NO：39)，huIFN-α14c(152位＝Leu的SEQ ID NO：39)，或任何其它天然存在的人干扰素α多肽的序列，诸如图2和4中所示(SEQ ID NO：31-42)和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)所列，如上)。在一些情况下，亲本干扰素-α多肽序列是非天然存在的(即，合成的)干扰素-α的序列，诸如IFN-αCon1(SEQ ID NO：43)。在一些情况下，要进行修饰的亲本多肽自身是本发明的多肽，诸如，SEQ IDNO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一。在一些情况下，该变体序列与亲本多肽序列在1-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)，例如在1-14个氨基酸位置，在1-12个氨基酸位置，在1-10个氨基酸位置，在1-8个氨基酸位置，在1-6个氨基酸位置，在1-5个氨基酸位置，在1-4个氨基酸位置，在1-3个氨基酸位置，或在1-2个氨基酸位置中存在不同。一些所述变体表现出干扰素-α活性。本发明还提供了包含这些变体的融合蛋白质和偶联物，以及编码这些变体的分离的或重组的核酸。

序列变化

如上所述，本发明的多肽包括含有这样的序列的多肽，所述序列与SEQID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一，诸如SEQ ID NO：1-15，47或53之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQID NO：47，或SEQ ID NO：53)在0-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在0-16个位置，0-15个位置，0-14个位置，在0-13个位置，在0-12个位置，在0-11个位置，在0-10个位置，在0-9个位置，在0-8个位置，在0-7个位置，在0-6个位置，在0-5个位置，在0-4个位置，在0-3个位置，在0-2个位置，或0-1个位置中不同。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。

例如，一些本发明的所述多肽包含长度约为150个氨基酸，诸如约151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，或165个氨基酸的序列，对应相对于亲本多肽序列(例如，SEQ ID NO：1-15之一)的1-16个氨基酸的缺失。在一些情况下，从C末端去除1-11个氨基酸，例如，1-10，诸如1-7，例如1-5，诸如1-3个氨基酸，即多肽与亲本多肽序列之一(例如，SEQ ID NO：1-15，47或53)相比，前者在C末端截短了1-11个氨基酸残基(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11个氨基酸残基)，诸如1-10，1-7个，例如，1-5或1-3个氨基酸残基。可选或此外，一些所述多肽是与亲本多肽序列(诸如，SEQ ID NO：1-15，47，或53)相比在N末端截短1-4个氨基酸残基(例如1，2，3，或4个氨基酸残基)，例如，从N末端去除1-4，1-3，1-2或1个氨基酸残基。一些所述多肽还包括位于N末端的甲硫氨酸。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。

例如，一些本发明的所述多肽包括这样的序列，其含有相对于SEQ IDNO：1-15，47，或53之一的0-16个氨基酸取代(例如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸取代)，诸如0-14或0-12或0-10或0-8或0-6或0-5或0-4或0-3或0-2或0-1个氨基酸取代。在一些情况下，一个或多个氨基酸取代根据，例如取代基团(诸如，保守性取代基团)，诸如下文所述之一来实施。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。

一些本发明的多肽包含这样的序列，其含有相对于SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)的0-16个氨基酸取代，例如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸取代，诸如0-14或0-12或0-10或0-8或0-6或0-5或0-4或0-3或0-2或0-1个氨基酸取代，其中至少一个所述取代导入包含非多肽部分的连接基团的氨基酸残基。实例包括导入一个或多个N-糖基化位点，或导入一个或多个半胱氨酸残基或赖氨酸残基，如上面和题目为“干扰素-α偶联物”的章节中所述。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。

一些本发明的多肽包括这样的序列，其含有相对于SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)的0-16个氨基酸取代或缺失或插入，诸如0-14或0-12或0-10或0-8或0-6或0-5或0-4或0-3或0-2或0-1个氨基酸的取代、缺失或插入(或其组合)，其中至少一个所述取代或缺失从亲本多肽序列中去除氨基酸残基，所述亲本多肽序列包括非多肽部分的连接基团，或在氨基酸插入的情况下破坏了所述连接基团所需残基的空间排布(例如，氨基酸的插入破坏了N-糖基化N-X-S/T基序)。实例包括从亲本多肽序列N-糖基化位点的去除，或赖氨酸，组氨酸，或半胱氨酸的去除，如上文和题目为“干扰素-α偶联物”的章节中所述。一些所述多肽表现出干扰素-α活性。

作为非限制性的实例，本发明的多肽可含有序列SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3在总共最多16个位置中不同的序列(其可以是氨基酸取代，缺失，和/或插入的组合，包括上述的那些)。在一些情况下，没有、部分或全部所述取代是根据下文确定的取代基团的取代。

根据本发明的氨基酸取代可包括、但不限于一个或多个保守性氨基酸取代。提供功能上相似氨基酸的保守性取代表是本领域众所周知的。下表(表3)中提供了一个实例，表中列出了包含氨基酸的六个示例性基团，所述氨基酸可被认为互为“保守性取代”。

表3

保守取代基团

1	丙氨酸(A)    甘氨酸(G)   丝氨酸(S)  苏氨酸(T)
		2	门冬氨酸(D)  谷氨酸(E)
3	天冬酰胺(N)  谷氨酰胺(Q)
		4	精氨酸(R)    赖氨酸(K)   组氨酸(H)
5	异亮氨酸(I)  亮氨酸(L)   甲硫氨酸(M)  缬氨酸(V)
		6	苯丙氨酸(F)  酪氨酸(Y)   色氨酸(W)

可推定氨基酸的其它取代基团。例如，氨基酸可根据相似的功能或化学结构或组成进行分类(例如，酸性，碱性，脂肪族，芳香族，含硫的)。例如，脂肪族的组包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。包含被认为互为保守取代的氨基酸的其它类别包括：芳香族：苯丙氨酸(F)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Gln或Q)。对于其它氨基酸组，还可参见Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman和Company。本文的多肽序列列表，联合上述取代基团，提供了所有保守性取代的多肽序列的明确列表。

序列百分同一性

一方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，其各自包含这样的序列，该序列具有与SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104之一，例如与SEQ IDNO：1-15，47或53之一(诸如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53)至少90％序列同一性(例如，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％氨基酸序列同一性)。在一些情况下，所述多肽表现出干扰素-α活性。在一些情况下，所述多肽序列在一个或多个氨基酸位置，例如，在最多16个位置(诸如，1-16个位置，1-15个位置，1-14个位置，1-13个位置，1-12个位置，1-11个位置，1-10个位置，1-9个位置，1-8个位置，1-7个位置，1-6个位置，1-5个位置，1-4个位置，1-3个位置，或1-2个位置)中与SEQ ID NO：1-15或44-104之一，例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：47或SEQ ID NO：53不同。作为实例，根据本发明可被取代为其它氨基酸的一些位置包括，但不限于，位置47，51，52，53，54，55，56，57，58，60，61，64，69，71，72，75，76，77，78，79，80，83，84，85，86，87，90，93，133，140，154，160，161，和162中的一个或多个，所述位置相对于SEQ ID NO：1-15或44-104之一。在一些情况下，该序列包括以下的一种或多种氨基酸：47位的His或Gln；51位的Val，Ala或Thr；52位的Gln，Pro或Glu；53位的Ala或Thr；55位的Phe，Ser，或Pro；56位的Leu，Val或Ala；57位的Phe或Leu；58位的Tyr或His；60位的Met，Leu或Val；61位的Met或Ile；64位的Thr或Ile；69位的Ser或Thr；71位的Lys或Glu；72位的Asn或Asp；75位的Ala或Val；76位的Ala或Thr；77位的Trp或Leu；78位的Asp或Glu；79位的Glu或Gln；80位的Thr，Asp，Ser，或Arg；83位的Glu或Asp；84位的Lys或Glu；85位的Phe或Leu；86位的Tyr，Cys或Ser；87位的Ile或Thr；90位的Phe，Tyr，Asp或Asn；93位的Met或Leu；133位的Lys或Glu；140位的Ser或Ala；154位的Phe或Leu；160位的Lys或Glu；161位的Arg或Ser；和162位的Arg或Ser；所述位置相对SEQ ID NO：1进行编号。本发明序列中的其它取代在上文和题目为“干扰素-α偶联物”的章节中得到描述。本发明还提供了包含所述多肽的融合蛋白质，包含所述多肽的偶联物，和编码所述多肽的分离的或重组的核酸。

另一方面，本发明提供了具有与SEQ ID NO：16-30中的一个或多个序列至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高百分序列同一性的核酸。一些所述核酸编码如本文中所述表现出干扰素-α活性的多肽。

一种序列(多肽或核酸)与另一序列的相似程度提供了两个序列相似结构和功能特性的指示。因此，在本发明的上下文中，具有与任何给定示例序列相似的序列的那些序列是本发明的特征。具体，具有下述百分序列同一性的序列是本发明的特征。

可以使用多种测定序列关系的方法，包括人工比对和计算机辅助的序列比对以及分析。多种用于执行序列比对的计算机程序是可得到的，或可以由专业技术人员制得。

如上所述，本发明中使用的核酸和多肽的序列无需是相同的，而可以与本发明的多肽或本发明的核酸的相应序列基本相同。例如，可对本发明的多肽实施多种改变，诸如一个或多个氨基酸插入，缺失，和/或取代，其可为保守或非保守的，包括这样的情况，例如所述改变可为所述多肽的诸如治疗或预防用途或给药或诊断应用提供一些优势。还可对本发明的核酸实施多种改变，诸如，一个或多个核酸的一个或多个密码子中的一种或多种取代，以便具体密码子编码相同或不同氨基酸，导致沉默变异(如本文所定义的)或非沉默变异，或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失。核酸也可被修饰为包含使其在表达系统(例如，细菌或哺乳动物)中最优表达的一个或多个密码子，若有需要，所述一个或多个密码子仍然编码相同氨基酸。所述核酸改变可为其治疗或预防用途或给药或诊断应用提供一些优势。核酸和多肽可用多种方式进行修饰，只要其包含与本发明的各个核酸或多肽中的序列基本相同的序列(如下面的定义)即可。

在两个或多个核酸或多肽序列的情况中，术语“相同的”或“同一性”是指当比较或比对两个或多个序列的最大相似性时，所述序列是相同的或具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，如利用下文所述的序列比对算法或通过观察(visual inspection)所测定。

受试序列与参照(即查询)序列的“百分比序列同一性(％同一性)”是指，受试序列在比较长度上，具有与查询序列一定百分比的同一性(即，对于多肽序列以氨基酸-对-氨基酸(amino acid-by-amico acid)为基础，或对于多核苷酸序列以核苷酸-对-核苷酸为基础)。

受试序列与查询序列的百分序列同一性计算如下。首先，采用具体的比对参数，以序列比较算法确定两序列的最佳比对。该最佳比对的测定可以用计算机实施，或可以人工计算，如下所述。然后，在比较长度中比较两个最佳比对的序列，并测定最佳比对中两个序列出现相同残基的位置的数目，由此提供了匹配位置的数目。然后用匹配位置的数目除以比较长度(除非另有说明，其为查询序列的长度)中的位置总数，然后将结果乘以100，得出受试序列对查询序列的百分序列同一性。

关于多肽序列，通常将一个序列作为“查询序列”(例如，本发明的多肽序列)，相对于该序列比较对一个或多个其它序列，即，“受试序列”(例如，存在于序列数据库中的序列)。序列比较算法使用指定的比对参数来测定查询序列和受试序列之间的最佳比对。当将比较查询序列与序列数据库例如GENBANK_(Genetic Sequence Data Bank；U.S.Department of Healthand Human Services)或GENESEQ_(Thomson Derwent；also available asDGENE_on STN)时，通常仅将查询序列和比对参数输入计算机；对于具体数目的受试序列，将返回查询序列和各受试序列之间的最佳比对。

当使用确定的参数(即，确定的氨基酸取代矩阵，缺口存在罚分(也称为缺口开放罚分)和缺口延伸罚分)对两个多肽序列进行比对时(以便取得该序列对的最高可能相似性得分)，这两个多肽序列是“最佳比对的”。BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(22)：10915-10919)通常被用作多肽序列比对算法(诸如下面描述的BLASTP)中的默认评分取代矩阵。为在一个被对比的序列中导入单个氨基酸缺口，加上缺口存在罚分，对于缺口中的各个残基位置，加上缺口延伸罚分。除非另有说明，在本文中采用的比对参数是：BLOSUM62评分矩阵，缺口存在罚分＝11，和缺口延伸罚分＝1。通过各序列在对比开始和结束(例如对比窗口)处的氨基酸位置，以及任选地通过在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口，以便取得最高可能相似性得分，来确定比对得分。

虽然两个或多个序列之间最佳比对可以人工测定(如下所述)，该过程可通过如下过程而得以简化：通过使用计算机执行的比对算法诸如

BLAST_(National Library ofMedicine)，例如，对于多肽序列的BLASTP和对于核酸序列的BLASTN(Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述，并通过不同来源诸如National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)使得公众可得。在使用计算机化的BLAST界面时，如果存在使用“低复杂性滤器(low complexity filter)”的选项，应将该选项关掉(即，无滤器)。

图3显示了本发明的多肽(B9x14，SEQ ID NO：3)与人IFN-α14a(也已知是LeIF H，Goeddel等，(1981)Nature 290：20-26；SEQ ID NO：39)的比对，后者是利用查询序列SEQ ID NO：3在GENBANK和GENESEQ数据库中采用BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分11，缺口延伸罚分1进行BLASTP搜索得到最接近相关的序列。这两个序列在166个氨基酸的长度有18个氨基酸位置不同(即，SEQ ID NO：39与SEQ ID NO：3有18个氨基酸位置不同)；而且，SEQ ID NO：39与SEQ ID NO：3具有89％的相同性，因为((166-18)/166)×100＝89。

图5显示了本发明的其它多肽(B9x25，SEQ ID NO：12)与人IFN-α14a(SEQ ID NO：39)的比对，后者是利用查询序列SEQ ID NO：12在GENBANK和GENESEQ数据库中采用上述具体参数进行BLASTP搜索得到最接近相关的序列。SEQ ID NO：39与SEQ ID NO：12在166个氨基酸的长度中有20个氨基酸位置不同；而且，SEQ ID NO：39与SEQ ID NO：3具有88％相同性，因为((166-20)/166)×100＝88。

两个多肽序列之间的最佳比对也可以通过BLASTP算法的人工计算(即，不用计算机帮助)，使用与上述具体的比对参数相同的参数(矩阵＝BLOSUM62，缺口开放罚分＝11，和缺口延伸罚分＝1)进行测定。开始，两个序列开始通过观察进行比对。然后如下计算初始比对得分：对于比对的各个位置(即，对于每对被比对的残基)，根据BLOSUM62矩阵赋予数值(图6)。在比对中对每对残基所赋的值的总和是初始比对得分。如果被比对的两个序列高度相似，该初始比对通常提供了最高可能比对得分。具有最高可能比对得分的比对是根据使用的比对参数的最佳比对。图7A显示了两个序列的比对得分的示例性计算，“查询”序列，在此处被鉴定为SEQ ID NO：3(上)的残基29-50，和“受试”序列，在此处被鉴定为SEQ ID NO：5(下)的残基30-52。通过观察比对序列，并且通过BLOSUM62矩阵对每对被比对的氨基酸所赋的数值显示在所述比对中的各位置下方(为了帮助观察，在比对中每个相同的氨基酸对用黑体字显示)。在这个实例中，该初始比对提供了最高可能比对得分(每个被比对的位置下方所示数值的和)；这两个序列的任何其它比对(有或没有缺口)，将得到较低的比对得分。

在一些情况下，通过在比对中引入一个或多个缺口可获得较高的比对得分。每当在比对中引入缺口时，给定缺口开放罚分，此外评估该缺口内每个残基位置的另外的缺口延伸罚分。因此，使用上述比对参数(包括缺口开放罚分＝11和缺口延伸罚分＝1)，比对中一个残基的缺口符合赋予缺口的值-(11+(1×1))＝-12；三个残基的缺口符合赋予缺口的值-(11+(3×1))＝-14，等等。对于在比对中引入的各缺口，重复所述计算。图7B和图7C显示了一个实例，说明无论缺口罚分为何值，在比对中引入缺口如何得到较高的比对得分。图7B显示了SEQ ID NO：3(上，查询)的残基29-50和SEQ IDNO：32(下，受试)的残基30-50通过目测得到的初始对比，其初始比对得分为67。图7C显示了SEQ ID NO：32中一个残基缺口对比对得分影响；尽管缺口罚分为-12，两个序列的总比对得分增加到88。在这个实例中，图7C中所示比对提供了最高可能比对得分，因此是这两个序列的最佳比对；这两个序列的任何其它比对(有或没有缺口)将得到较低的比对得分。

应当理解，上述序列比对计算的实例(使用相对短的序列)仅以说明的目的提供；实际上，采用的比对参数(BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分＝11，和缺口延伸罚分＝1)对于85个或更长的氨基酸多肽序列是最理想的。NCBI网站为其它长度的序列(适用于计算机辅助的以及人工比对计算，使用如上述相同的步骤)提供了下列比对参数。长度为50-85个氨基酸的序列，最佳的参数是BLOSUM80矩阵(Henikoff和Henikoff，supra)，缺口开放罚分＝10，和缺口延伸罚分＝1。对于长度为35-50个氨基酸的序列，最佳的参数是PAM70矩阵(Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.&Orcutt，B.C.(1978)″A model ofevolutionary change in proteins.″In Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，suppl.3，M.O.Dayhoff(ed.)，pp.345-352，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC.)缺口开放罚分＝10，和缺口延伸罚分＝1。长度少于35个氨基酸的序列，最佳的参数是PAM30矩阵(Dayhoff，M.O.，如上)，缺口开放罚分＝9，和缺口延伸罚分＝1。

序列一经最佳对比，通过计算最佳的比对中包含相同残基对的位置数来计算受试序列相对于查询序列的百分比同一性，用其除以比较长度(除非另有说明，是查询序列中残基的数目)中残基的数目，然后用所得数值乘以100。参考图7中所示实例，在各个实例中，指定为查询序列的序列长度为22个氨基酸。参考图7A的比对，在查询序列(上)与受试序列(下)的最佳的比对中，20个被比对的氨基酸残基对(黑体字显示)是相同的。因此，该具体受试序列具有与查询序列(20/22)×100＝91.1％的同一性。在图7C中显示的比对中，在最佳的比对中有18对氨基酸残基(黑体字显示)是相同的；因此该具体受试序列具有与查询序列(18/22)×100＝81.8％的同一性。

当应用于多肽时，术语“基本上的同一性”(或“基本上相同的”)通常是指，当使用上述适当的参数、采用BLASTP算法(人工或通过计算机)两个氨基酸序列(即查询序列和受试序列)为最佳比对时，受试序列具有与查询序列至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高百分比的氨基酸序列同一性。在一些情况下，基本上的同一性存在与至少约100个氨基酸残基，诸如，至少约110，120，125，130，135，140，145，150，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，或166个氨基酸残基的比较长度。

相似地，如在两个核酸序列的上下文中使用的，术语基本上的同一性(或基本上相同)是指当采用适当的下述参数、使用BLASTN算法(人工或通过计算机)为两个核酸序列(即查询序列和受试序列)为最佳比对时，受试序列具有与查询序列至少约60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高百分比的核酸序列同一性。用于核酸序列比对的参数是：匹配奖分1，错配罚分-3，缺口存在罚分5，缺口延伸罚分2(取代矩阵不用于BLASTN算法中)。在一些情况下，基本上的同一性存在与至少约300个核苷酸，诸如，至少大约330，360，375，390，405，420，435，450，465，480，483，486，489，492，495，或498个核苷酸的比较长度。

其它方面

本发明的任何多肽可以作为较大多肽序列例如融合蛋白而存在，诸如在加入一个或多个结构域或亚序列以稳定或检测或纯化多肽的情况下存在。多肽纯化亚序列可包含，例如，表位标记，FLAG标记，多组氨酸序列，GST融合物，或本领域已知的任何其它检测/纯化亚序列或“标记”。这些其它区域或亚序列对本发明多肽活性的影响很小或没有影响，或可以通过后合成处理步骤，诸如通过用蛋白酶包括内蛋白(intein)等处理而被去除。

任何本发明的多肽也可以包含一个或多个经过修饰的氨基酸。经过修饰的氨基酸可以是，例如，糖基化的氨基酸，PEG化的氨基酸，法尼基化的氨基酸，乙酰化的氨基酸，生物素化的氨基酸，与脂质部分偶联的氨基酸，或与有机衍生试剂偶联的氨基酸。存在经修饰的氨基酸有益于，例如，(a)增长多肽血清半寿期和/或体内半寿期的功能，(b)减少多肽抗原性，(c)提高多肽保存稳定性，或(d)提高生物利用度，例如增加AUC_sc。例如，氨基酸在重组制备期间例如在共翻译时或翻译后进行修饰(例如，哺乳动物细胞中表达期间N-X-S/T基序上的N-连接糖基化)或用合成方法进行修饰。这方面在本文中题目为“干扰素-α偶联物”的章节中被更详细地描述。

本发明还提供了一种组合物，其包含至少一种本发明的多肽，和赋形剂或载体。一方面，该组合物包含分离的或重组的多肽以及载体或赋形剂，所述多肽包含在0-16个氨基酸位置(诸如在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中与SEQ ID NO：1-15和SEQID NO：44-104之一(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53)之一不同的氨基酸序列。该组合物可以是包含可药用赋形剂或载体的组合物。示例性组合物和赋形剂和载体如下述。

制备多肽

上文描述了生产和分离本发明多肽的重组方法。除了重组生产以外，可通过使用固相技术的直接肽合成来生产多肽(参见Stewart等(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co，San Francisco；Merrifield，J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。可使用人工技术或通过自动化来进行肽合成。例如，根据厂商提供的说明使用Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer，Foster City， Calif.)即可进行自动合成。例如，可以分别化学合成亚序列，并使用化学方法将它们组合在一起以提供全长肽或其片段。可选地，所述序列可从专门制备多肽的任何公司定购。更为通常地，本发明的多肽可通过表达编码核酸和回收多肽来制备，例如下述。

还包括制备本发明多肽的方法。一种所述方法包括，在细胞群体中导入本发明所述的任何核酸(其与有效产生编码多肽的调节序列可操作地相连)，在培养基中培养细胞以表达该多肽，和从细胞或培养基中分离所述多肽。可使用足以促进被细胞摄取(转染)和/或多肽表达的量的核酸。可通过本文所述任何递送方法将该核酸导入所述细胞中，所述方法包括，例如，注射，基因枪，被动摄取等。核酸可以是载体(诸如重组表达载体包括DNA质粒载体，或本文所述任何载体)的一部分。核酸或包含本发明的核酸的载体可按本文上述进行制备和配制。所述核酸或表达载体可在体内导入哺乳动物细胞群，或选定的哺乳动物细胞(例如，肿瘤细胞)可自哺乳动物取出，并将所述核酸表达载体以足以导致所编码多肽被摄取和表达的量在体外导入所述细胞中。或者，核酸或包含本发明核酸的载体采用在体外培养的细胞进行制备。一方面，制备本发明多肽的方法包括将重组表达载体导入细胞群中，所述重组表达载体包含本文所述本发明的任何核酸，其量和配制将可导致载体的摄取和所编码多肽的表达；通过本文所述任何导入/递送方式将该表达载体施用于哺乳动物体内；和从该哺乳动物或从该哺乳动物的副产品中分离所述多肽。

抗体

在本发明的另一方面，使用本发明的多肽(或其抗原性片段)生产抗体，所述抗体具有例如诊断，预防和治疗用途，例如与所述多肽及其片段的活性，分布和表达相关。通过本领域众所周知的方法可以产生针对本发明多肽的抗体。所述抗体包括但不限于：多克隆，单克隆，嵌合的，人源化的，单链抗体，Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。对治疗或预防用途而言，抗体例如阻断受体结合的抗体是具体优选的。

用于诱导抗体的多肽无需具有生物活性；然而，所述多肽或肽必须具备抗原性。用于诱导具体抗体的肽可具有由至少约10个氨基酸，优选至少约15或20个氨基酸或至少25或30个氨基酸组成的氨基酸序列。多肽的短片段可与另一种蛋白质，如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)融合，并产生抗嵌合分子抗体。

产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，很多抗体是可以得到的。参见例如Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；and Harlow and Lane(1989)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，NY；Stites等(编)Basic and ClinicalImmunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中提及的参考文献；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2d ed.)Academic Press，New York，NY；以及Kohler和Milstein(1975)Nature256：495-497。其它适当的抗体制备技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库，参见Huse等(1989)Science 246：1275-1281；和Ward等(1989)Nature 341：544-546。具体的单克隆和多克隆抗体及抗血清通常以至少约为0.1μM，优选至少约为0.01μM或更好，最常见并优选为0.001μM或更好的K_D结合。

制备嵌合(人源化)抗体的详细方法可见于美国专利5,482,856。有关人源化和其它抗体制备和改造技术的其它细节可参见Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering，2^nd Edition，Freeman and Company，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL atOxford Press，Oxford，England(McCafferty)，和Paul(1995)AntibodyEngineering Protocols，Humana Press，Towata，NJ(Paul)。

一方面，本发明提供了完全人源化的抗本发明多肽或其片段的抗体。在抗体被用作人患者的体内预防剂和/或治疗剂的应用中，人源化抗体特别合乎需要。人抗体的特征为由人免疫球蛋白序列组成。可以使用很多种方法生产本发明的人抗体(参见例如Larrick等，美国专利5,001,065以及Borrebaeck McCafferty与Paul，同上，综述)。一方面，起初在三元杂交瘤细胞中生产本发明的人抗体。然后将编码该抗体的基因克隆至其它细胞如非人哺乳动物细胞，并在其中表达。通过三元杂交瘤技术生产人抗体的一般方法描述于Ostberg等(1983)，Hybridoma 2：361367，Ostberg，美国专利4,634,664和Engelman等，美国专利4,634,666。通过此方法获得的产抗体细胞系被称为三元杂交瘤，因为它们是三个细胞即两个人型细胞和一个小鼠细胞的后代。已发现与制备自人细胞的普通杂交瘤相比，三元杂交瘤能更加稳定地生产抗体。

本说明书通篇给出本发明多肽的其它用途。

干扰素-α偶联物

另一方面，本发明涉及偶联物，所述偶联物包含表现出干扰素-α活性、含SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104任一项的氨基酸序列的多肽以及至少一个与多肽的连接基团相连的非多肽部分，诸如与多肽的连接基团相连的1-6，1-5，1-4，1-3，例如1或2个非多肽部分。应当理解所述偶联物也可表现出干扰素-α活性(诸如，抗病毒活性，T_H1分化活性，和/或抗增殖活性)。

另一方面，本发明涉及包含表现出干扰素-α活性的多肽的偶联物，所述多肽包含这样的氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：1-15或SEQ IDNO：44-104任一项(诸如，SEQ ID NO：1-15，47，或53之一)的氨基酸序列在至少一个氨基酸残基中不同，所述氨基酸残基选自包含非多肽部分的连接基团的被导入或去除的氨基酸残基。根据该方面被导入和/或去除的氨基酸残基的实例在下面的章节中将给出更详细的描述。应当理解偶联物自身也可表现出干扰素-α活性。

另一方面，偶联物包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1-15或SEQID NO：44-104任一项(诸如，SEQ ID NO：1-15，47，或53)的氨基酸序列在0-16个氨基酸位置(诸如在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在0-14个氨基酸位置，在0-12个氨基酸位置，在0-10个氨基酸位置，在0-8个氨基酸位置，在0-6个氨基酸位置，在0-5个氨基酸位置，在0-4个氨基酸位置，在0-3个氨基酸位置，在0-2个氨基酸位置，或在0-1个氨基酸位置中不同。在本发明的另一方面中，导入包含非多肽部分的连接基团的氨基酸残基(例如，通过用包含非多肽部分的连接基团的不同残基取代氨基酸残基，或通过添加包含用于偶联非多肽部分的连接基团的氨基酸残基)。

术语“偶联物”(或可互换的“多肽偶联物”或“偶联的多肽”)意指由一个或多个本发明的多肽共价连接到一个或多个非多肽部分上形成的异源(就组合物而言(in the sense ofcomposite))分子。术语“共价连接”的意思是多肽和非多肽部分直接彼此共价连接，或者通过诸如桥接(bridge)，间隔物(spacer)，或连接部分等的一个或多个间插部分(intervening moiety)间接彼此共价连接。优选的是，偶联的多肽在有关浓度和条件下是可溶的，即在诸如血液等生理学液体中是可溶的。本发明偶联的多肽的例子包括糖基化和/或PEG化多肽。对于偶联的多肽的多肽部分可使用术语“非偶联型多肽”。

术语“非多肽部分”意指能与多肽的连接基团偶联的分子。非肽部分的优选例子包括聚合物分子，亲脂性化合物，或有机衍生物，具体是聚合物分子或糖部分。应当理解非多肽部分经由多肽的连接基团而与该多肽连接。除非在与多肽连接的非多肽部分，诸如聚合物分子的数量被指明的情况，对与多肽连接的或本发明中使用的其它“非多肽部分”的每一个指称均应指与多肽连接的一个或多个非多肽部分。

术语“聚合物分子”定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中没有一个单体是氨基酸残基。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。

术语“糖部分”意指通过体内或体外糖基化，诸如N-或O-糖基化连接的碳水化合物分子。

“N-糖基化位点”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸。

“O-糖基化位点”是丝氨酸或苏氨酸残基的-OH基。

术语“连接基团”意指能偶联到诸如聚合物分子或糖部分的有关非多肽部分上的氨基酸残基基团。下表4中提供了有用的连接基团及一些相应

非多肽部分的非限制性实例。

表4有用的连接基团和相应非多肽部分的实例

连接基团	氨基酸	非多肽部分的实例	结合方法/活化的PEG	参考物
					-NH2	N末端，Lys	聚合物，例如PEG	mPEG-SPAmPEG2-NHSmPEG2-butryALD	Nektar Inc.2003产品目录
-COOH	C末端，Asp，Glu	聚合物，例如PEG糖部分	mPEG-Hz体外偶联	Nektar Inc.2003产品目录
					-SH	Cys	聚合物，例如PEG，糖部分	mPEG-VSmPEG2-MAL体外偶联	Nektar Inc.2003产品目录；Delgado et al，CriticalReviews inTherapeuticDrug CarrierSystems9(3，4)：249-304(1992)
-OH	Ser，Thr，OH-，Lys	糖部分	体内O连接的糖基化
					-CONH2	Asn作为N-糖基化位点的一部分	糖部分	体内糖基化
芳香族残基	Phe，Tyr，Trp	糖部分	体外偶联
					-CONH2	Gln	糖部分	体外偶联	Yan和Wold，Biochemistry，1984，Jul 31；23(16)：3759-65

连接基团	氨基酸	非多肽部分的实例	结合方法/活化的PEG	参考物
					醛酮	氧化的糖	聚合物，例如PEG，PEG-酰肼	PEG化	Andresz等，1978，Makromol.Chem.179：301；WO92/16555，WO00/23114
胍	Arg	糖部分	体外偶联	Lundblad和Noyes，ChemicalReagents forProteinModification，CRC Press Inc.Boca Raton，FI
					咪唑环	His	糖部分	体外偶联	与胍相同

对于体内N-糖基化而言，术语“连接基团”以非常规的方式使用，指组成N-糖基化位点(具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，且最优选苏氨酸)的氨基酸残基。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是糖部分在糖基化期间所连接的残基，但除非存在N-糖基化位点的其它氨基酸残基，否则将不能实现该连接。因此，当非多肽部分是糖部分，且偶联是通过N-糖基化实现时，与本发明多肽的氨基酸序列改变关联使用的术语“含有非多肽部分连接基团的氨基酸残基”应理解为，组成N-糖基化位点的一个，两个或所有氨基酸残基将以这样的方式改变，即将功能性N-糖基化位点引入氨基酸序列或从所述序列中去掉该位点，或在所述氨基酸序列中保留了功能性N-糖基化位点(例如，通过用苏氨酸残基取代作为部分N-糖基化位点的丝氨酸残基，反之亦然)。

术语“引入”(即，“引入的”氨基酸残基，氨基酸残基的“引入”)主要是指现有氨基酸残基被取代为另一氨基酸残基，但也可指插入其它的氨基酸残基。

术语“去除”(即，“去除的”氨基酸残基，“氨基酸残基的去除”)主要是指待去除的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，但也指待去除的氨基酸残基的缺失(没有取代)。

术语“含有非多肽部分连接基团的氨基酸残基”是与非多肽部分结合的氨基酸残基(对于引入的氨基酸残基而言)，或可与该非多肽部分结合的氨基酸残基(对于去除的氨基酸残基而言)。

术语“功能性体内半寿期”使用其通常的含义，即多肽在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽的活性为最初活性的50％的时间。功能性体内半寿期可在受试动物，诸如大鼠，小鼠，兔，犬或猴中测定。优选地，功能性体内半寿期在非人灵长类，诸如猴中测定。此外，可对测定已通过静脉内或皮下施用的样品的功能性体内半寿期。

作为测定功能性体内半寿期的可选方式，可测定“血清半寿期”，即，50％的多肽在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半寿期的测定常常比功能性体内半寿期的测定简单，并且血清半寿期的量级通常可以很好地指示功能性体内半寿期的量级。血清半寿期的其它可替换术语包括“血浆半寿期”、“循环半寿期”、“血清清除”、“血浆清除”和“清除半寿期”。血清半寿期可按照上述与功能性体内半寿期测定相关的内容进行测定。

术语“血清”使用其通常的含义，即不含纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆。

涉及功能性体内半寿期或血清半寿期的术语“增加”用于指，本发明的偶联物的相关半寿期相对于参照分子的所述半寿期而言有统计学上显著的增加，所述参照分子诸如野生型干扰素-α，例如，人干扰素-α，诸如SEQID NO：31-SEQ ID NO：42之一(或如本文和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)，如上所述的其它huIFN-α序列)或相应的非偶联型的多肽。因此，本发明的兴趣偶联物包括与上述参照分子相比，其功能性体内半寿期或血清半寿期增加的偶联物。

术语“AUCsc”或“皮下给药时的曲线下面积”用其常规含义，即血清干扰素-α活性-时间曲线以下的面积，这里所述的偶联分子经皮下给药受试动物。一旦测定了实验干扰素-α活性-时间点，就可利用计算机程序，诸如GraphPad Prism 3.01常规计算AUCsc。

涉及AUC_sc的术语“增加”用于指，当静脉给药并且在可比条件下测定时，本发明偶联物的曲线下面积相对于参照分子的所述面积有统计学显著的增加，所述参照分子诸如野生型干扰素-α，例如人干扰素-α，诸如SEQID NO：31-SEQ ID NO：42之一(或如本文和/或Allen G.和Diaz M.O.(1996)，如上所述的其它huIFN-α序列)，或相应非偶联型多肽。显然，本发明偶联物与参照分子所用的干扰素-α活性量应该相同。结果是，为了直接比较不同的干扰素-α分子，可将AUC_sc值标准化，即它们可表示为AUC_sc/施用剂量。

术语“T_max，sc”用于指血清干扰素-α活性-时间曲线中，观察到血清中最高水平干扰素-α活性的时间。

应当理解虽然本文提供的实施例和对亲本多肽的修饰是相对于序列SEQ ID NO：1而言的，所公开的修饰还可在本文所述本发明的任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-15和SEQ ID NO：44-104和其变体)的等效氨基酸位置进行。

通过去除和/或引入包含偶联非多肽部分的连接基团的氨基酸残基，可以特异性地改造多肽，以便使得该分子更易于与所选非多肽部分偶联，以便最优化偶联模式(例如确保干扰素-α分子的表面非多肽部分的最优分布，由此例如有效地保护(shield)表位和多肽的其它表面部分而不会显著地破坏其功能)。例如，通过引入连接基团，干扰素-α多肽中与非多肽部分所结合的具体氨基酸残基的含量改变，由此实现更有效、特异和/或广泛的偶联。通过去除一个或多个连接基团，可以避免与其中该偶联是不利的部分多肽中的非多肽部分发生偶联，例如与位于多肽功能位点上或附近的氨基酸残基(因为在所述位点的偶联会导致合成的偶联物的干扰素-α活性失活或降低，这是由于受体识别被破坏)。更进一步，去除位于其它连接基团附近的连接基团是有利的。

应当理解，包含非多肽部分的连接基团的氨基酸残基(无论被去除或是引入)基于非多肽部分的性质选出且，在一些情况下基于使用的偶联方法。例如，当非多肽部分是聚合物分子时，诸如聚乙二醇或聚烯基氧化物衍生的分子，能作为连接基团发挥功能的氨基酸残基可选自半胱氨酸，赖氨酸(和/或多肽的N末端氨基)，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸或精氨酸。当非多肽部分是糖部分时，连接基团是体内或体外N-糖基化位点或O-糖基化位点，优选N-糖基化位点。

在一些情况下，当非多肽部分的连接基团要引入到干扰素-α多肽或从干扰素-α多肽去除时，要被修饰的干扰素-α多肽的位置可如下方便地选择：

被修饰的位置可以位于干扰素-α多肽的表面，诸如被一种氨基酸残基占据的位置，所述氨基酸残基大于25％的侧链暴露于溶剂，诸如其大于50％的侧链暴露于溶剂。以人干扰素-α2a分子3D结构的分析为基础鉴定所述位置，如在本文“材料和方法”章节中所述。

可选地或另外地，以干扰素-α蛋白序列家族的分析(诸如图2和图4中的比对中所示)为基础，鉴定要被修饰的位置。为了下列实例的目的，图2的比对最上面一行中所示的SEQ ID NO：1可被认为是待修饰的亲本干扰素-α，而在其余比对中的人干扰素-α序列被认为是家族的其它成员。例如，在亲本序列中待修饰的位置可能这样的位置，该位置在一个或多个除亲本干扰素-α以外的家族成员中，(a)被包含相关连接基团的氨基酸残基占据(当该氨基酸残基被引入亲本序列时)或(b)在亲本干扰素-α中，但不在一个或多个家族其它成员中时，被包含相关连接基团的氨基酸残基占据(当这样的氨基酸残基从亲本序列被去除时)。

为了测定连接基团的最佳分布，以干扰素-α多肽的3D结构为基础，计算位于干扰素-α分子表面的氨基酸残基间的距离。更具体地，包含所述连接基团的氨基酸残基的CB间的距离，或测定一个氨基酸残基的官能团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)和包含连接基团的另一氨基酸残基的CB间的距离。在甘氨酸的情况中，用CA代替CB。在本发明偶联物的干扰素-α多肽部分中，为了避免或减少异源偶联并提供连接基团的均匀分布，例如为了表位保护的目的，任何所述距离可大于8_，诸如大于10_。

此外，在本发明偶联物的干扰素-α多肽部分中，在一些情况下，位于干扰素-α的受体结合部位或其附近的连接基团被去除，诸如通过包含所述基团的氨基酸残基的取代。在一些情况下，包含非多肽部分的连接基团的氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸，不常被引入到干扰素α分子的受体结合部位或附近。

修饰干扰素-α多肽的其它方式是通过与非多肽部分的偶联，保护并由此修饰或破坏或灭活存在于亲本干扰素-α中的表位。干扰素-α多肽的表位可使用本领域已知方法鉴定，也称为表位定位(epitope mapping)，参见例如Romagnoli等，J.Biol Chem.，1999，380(5)：553-9，DeLisser HM，Methods MolBiol，1999，96：11-20，Van de Water等，Clin Immunol Immunopathol，1997，85(3)：229-35，Saint-Remy JM，Toxicology，1997，119(1)：77-81，和Lane DP和Stephen CW，Curr Opin Immunol，1993，5(2)：268-71。一种方法是建立噬菌体展示文库，其表达例如，9氨基酸残基的任意寡肽。通过免疫沉淀纯化来自特异性抗血清的抗人干扰素-αIgG1抗体，通过免疫印迹识别活性噬菌体。通过对纯化的活性噬菌体DNA的序列测定，然后将该序列定位于干扰素-α的3D结构，可以测定寡肽的序列。可选地，依照美国专利5,041,376描述的方法可以鉴定表位。由此鉴定的该结构上的区构成表位，其可被选出作为用于引入偶联非多肽部分的连接基团的靶区。优选地，干扰素-α的至少一个表位，诸如两个，三个或四个表位可被根据本发明的非多肽部分保护。因此，在一个方面中，与野生型人干扰素-α(包括任何商业上可以得到的干扰素-α)相比，本发明的偶联物具有至少一个受到保护的表位。这可以通过将非多肽部分的连接基团引入至位于给定表位邻近的位置(即在初始序列中4个氨基酸残基之内或在三级序列中约10_之内)来实现。在CB(在甘氨酸的情况下为CA)之间测定10_。以下章节中描述了所述具体引入。

在去除连接基团的情况下，包括所述基团并占据上述位置的相关氨基酸残基可被不包含用于偶联目的非多肽部分的连接基团的不同氨基酸残基取代，或可被缺失。N-糖基化基团的去除也可通过插入或去除基序N-X-S/T/C中的氨基酸残基而实现。

在引入连接基团的情况下，将包含所述基团的氨基酸残基引入所述位置中，诸如通过取代占据所述位置的氨基酸残基。

可用于偶联并存在于干扰素-α多肽中的连接基团的准确数目依赖于需要通过偶联来实现的效果。例如，欲得到的效果例如依赖于偶联的性质和程度(例如非多肽部分的鉴定，需要或可能与多肽偶联的非多肽部分的数量，其应被偶联或应避免所述偶联的情况等)。例如，如果需要降低的免疫原性，连接基团的数量(和位置)应足以保护大多数或全部表位。这通常在保护较大比例的干扰素-α多肽时实现。表位的有效保护通常在可用于偶联的连接基团的总数为1-6个连接基团，例如，1-5个，诸如1-3个，诸如1，2，或3个连接基团时得以实现。

功能性体内半寿期依赖于偶联物的分子量，提供增加的半寿期所需的连接基团的数量，由此依赖于目的非多肽部分的分子量。一些所述偶联物包含1-6，例如，1-5，诸如1-3，例如1，2，或3个非多肽部分，其各自的MW为约2-40kDa，诸如约2kDa，约5kDa，约12kDa，约15kDa，约20kDa，约30kDa，或约40kDa。

在本发明的偶联物中，一些、大多数、和基本上全部可偶联的连接基团可被相关的非多肽部分占据。

本发明的偶联物可表现出一种或多种以下增强的特性：

例如，与人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：31-42，SEQ IDNO：32+R23K的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型的多肽相比，所述偶联物表现出降低的免疫原性，例如与非偶联型的多肽或人干扰素-α相比，降低了至少10％，诸如降低了至少25％，诸如降低了至少50％，例如降低了至少75％。

另一方面，偶联物可表现出与来自用人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：31-42，SEQ ID NO：32+R23K的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)所述的任何其它huIFN-α)或与相应非偶联型的多肽所治疗患者的中和抗体的反应降低或无反应，例如中和降低至少10％，诸如至少25％，诸如至少50％，例如至少75％。

在本发明的另一方面，与参照分子诸如人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：31-42，SEQ ID NO：32+R23K的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型多肽相比，所述偶联物可表现出增加的体内半寿期和/或增加的血清半寿期。具体优选的偶联物是这样的偶联物，所述偶联物的功能性体内半寿期(或血清半寿期)与所述参照分子的功能性体内半寿期(或血清半寿期)之间的比率为至少1.25，诸如至少1.50，诸如至少1.75，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8。如上所述，半寿期可在受试动物诸如大鼠或猴中方便地测定，且基于静脉内或皮下给药。

另一方面，与参照分子诸如人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ IDNO：31-42，SEQ ID NO：32+R23K的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型多肽相比，所述偶联物可表现出增加的生物利用度。例如，与参照分子诸如人干扰素-α或相应的非偶联型多肽相比，偶联物可表现出增高的AUC_sc。因此，示例性偶联物这样的偶联物，当经皮下施用时，具体是经皮下施用于受试动物诸如大鼠或猴时，所述偶联物的AUC_sc与所述参照分子的AUC_sc之间的比率为至少1.25，诸如至少1.5，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5或至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9或至少10，诸如至少12，诸如至少14，例如至少16，至少18或至少20。类似地，当经皮下施用时，具体是经皮下施用于受试动物诸如大鼠或猴时，本发明的一些偶联物是这样的偶联物，所述偶联物的T_max与所述参照分子诸如人干扰素-α或相应的非偶联型多肽的T_max之间的比率为至少1.2，诸如至少1.4，例如至少1.6，诸如至少1.8，诸如至少2，例如至少2.5，诸如至少3，诸如至少4，例如至少5，诸如至少6，诸如至少7，例如至少8，诸如至少9，诸如至少10。

在一些情况下，本发明偶联物的抗病毒活性量级(magnitude)与人干扰素-α(诸如在本文中被确定为SEQ ID NO：31-42，SEQ ID NO：32+R23K的任何多肽，或本文和/或如上文Allen G.和Diaz M.O.(1996)所述的任何其它huIFN-α)或相应的非偶联型多肽的所述活性相比降低(例如降低至少约75％，至少约50％，至少约25％，至少约10％)或增加(例如增加至少约10％)或是大约相等(例如在约+/-10％或约+/-5％之内)。在一些情况下，与本发明偶联物的抗增殖活性相比，抗病毒活性的程度(degree)可有所变化，由此可高于，低于或大约等于人干扰素-α或相应非偶联型多肽的程度。

本发明的偶联物，其中非多肽部分与半胱氨酸残基结合

另一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现出干扰素-α活性且包括至少一个非多肽部分，该非多肽部分与至少一个干扰素-α半胱氨酸残基偶联，其氨基酸序列与亲本干扰素-α多肽的氨基酸序列有0-16个氨基酸位置中不同，所述亲本干扰素-α多肽诸如包含SEQ ID NO：1-15或44-104之一(诸如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：47或SEQ ID NO：53之一)的氨基酸序列的干扰素-α多肽，其中将至少一个半胱氨酸残基诸如通过取代或插入而被引入至亲本干扰素-α中被暴露于该分子表面的氨基酸残基所占据的位置，所述暴露于亲本干扰素-α表面的氨基酸残基为优选其至少25％，诸如至少50％的侧链暴露于表面的氨基酸残基。通常，偶联物包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与例如，SEQID NO：1-15，47或53任一项的氨基酸序列在1-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在1-14个氨基酸位置，在1-12个氨基酸位置，在1-10个氨基酸位置，在1-8个氨基酸位置，在1-6个氨基酸位置，在1-5个氨基酸位置，在1-4个氨基酸位置，在1-3个氨基酸位置或在1-2个氨基酸位置中存在不同。

一些本发明的偶联物包括这样的多肽序列，该多肽序列包含一种或多种以下取代(相对于SEQ ID NO：1)，其将半胱氨酸残基引入选自下组的位置，据预测所述位置暴露于该分子表面且具有超过25％分数ASA：D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，G10C，R12C，R13C，M16C，A19C，Q20C，R22C，R23C，I24C，S25C，L26C，F27C，S28C，L30C，K31C，R33C，H34C，D35C，R37C，Q40C，E41C，E42C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，V51C，Q52C，E59C，Q62C，Q63C，N66C，S69C，T70C，K71C，N72C，S74C，A75C，D78C，E79C，T80C，L81C，E83C，K84C，I87C，F90C，Q91C，N94C，D95C，E97C，A98C，V100C，M101C，Q102C，E103C，V104C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，M112C，N113C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，T128C，L129C，T132C，K133C，K134C，K135C，Y136C，S137C，P138C，A146C，M149C，R150C，S153C，F154C，N157C，Q159C，K160C，R161C，L162C，R163C，R164C，K165C和E166C，所述氨基酸残基位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，在上述位置之中，一个或多个位于47，51和133位的氨基酸残基不被半胱氨酸取代。

例如，一些本发明所述偶联物包括这样的多肽序列，该多肽序列包含一种或多种以下取代(相对于SEQ ID NO：1)，其将半胱氨酸残基引入选自下组的位置，预测所述位置暴露于该分子表面且具有超过50％分数ASA：D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，R12C，R13C，M16C，A19C，S25C，F27C，S28C，K31C，R33C，H34C，D35C，R37C，E41C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，N66C，K71C，A75C，D78C，E79C，T80C，E83C，K84C，I87C，F90C，Q91C，N94C，D95C，M101C，Q102C，E103C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，Q125C，R126C，L129C，T132C，K133C，K135C，P138C，R150C，K160C，L162C，R163C，R164C，K165C和E166C，所述氨基酸残基位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，一个或两个位于47和133位的氨基酸残基不被半胱氨酸取代。

如上所述，在一些情况下，优选将半胱氨酸残基引入干扰素-α的潜在受体结合位点的外部，即29-40，79-96，和124-141位的外部，相对于SEQID NO：1对位置进行编号。因此，在一些情况下，一个或多个半胱氨酸取代选自D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，G10C，R12C，R13C，M16C，A19C，Q20C，R22C，R23C，I24C，S25C，L26C，F27C，S28C，E41C，E42C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，V51C，Q52C，E59C，Q62C，Q63C，N66C，S69C，T70C，K71C，N72C，S74C，A75C，E97C，A98C，V100C，M101C，Q102C，E103C，V104C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，M112C，N113C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，A146C，M149C，R150C，S153C，F154C，N157C，Q159C，K160C，R161C，L162C，R163C，R164C，K165C和E166C(据预测暴露于分子表面并具有超过25％分数ASA，且不构成部分推定结合位点的残基)组成的组，所述位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，一个或所有两个位于47和51位的氨基酸残基不被半胱氨酸取代。

在其它方面中，半胱氨酸取代选自D2C，L3C，P4C，Q5C，T6C，H7C，S8C，L9C，R12C，R13C，M16C，A19C，S25C，F27C，S28C，E41C，D44C，N46C，H47C，Q49C，K50C，N66C，K71C，A75C，M101C，Q102C，E103C，G105C，E107C，E108C，T109C，P110C，L111C，V114C，D115C，L118C，R121C，K122C，R150C，K160C，L162C，R163C，R164C，K165C和E166C(预测暴露于分子表面并具有超过50％分数ASA，且不构成部分推定结合位点的残基)组成的组，所述位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，47位不被半胱氨酸取代。

一些本发明所述偶联物包括这样的多肽序列，其包含一个或多个选自以下取代组成的组：S25C，S28C，L30C，K31C，N46C，K71C，S74C，A75C，E79C，E107C，E108C，T132C，K133C，P138C和K135C，所述位置相对于SEQ ID NO：1。

另一方面，通过取代(例如，Q159C，K160C，R161C，L162C，R163C，R164C，K165C或E166C，相对于SEQ ID NO：1)或通过插入(例如，E166EC，在此处也称为167C)将一个或多个半胱氨酸残基引入至C末端或靠近C末端。应当理解，半胱氨酸残基也可通过取代或插入而被引入至本文所述干扰素-α分子的C末端截短的片段中。

在一些情况下，为了避免两个或多个引入的半胱氨酸残基之间形成二硫桥，仅引入单个半胱氨酸残基。

在干扰素-α中，在1/99位和29/139位的半胱氨酸之间形成二硫键。二硫键29/139对生物活性是必要的，而减少1/99键不会显著影响生物学活性(Beilharz M.W.等，(1986)J.InterferonRes.6(6)：677-685)。因此，在本发明的另一方面中，优选通过取代去除C1或C99之一，例如C1S或C99S，从而保留可用于与非多肽部分偶联的其它半胱氨酸残基。

在本发明的该方面中涉及的非多肽部分包含聚合物分子，诸如在题目为“与聚合物分子偶联”的章节中描述的任何分子，诸如PEG或mPEG。包含半胱氨酸的多肽和聚合物分子之间的偶联可以用任何适当的方法完成，例如题目为“与聚合物分子偶联”的章节中所述，例如使用所述章节描述的一步法或逐步法。PEG化干扰素-α多肽的示例性方法是采用半胱氨酸反应性PEG将PEG与半胱氨酸残基共价连接。许多具有不同基团(例如正吡啶基-二硫化物(orthopyridyl-disulfide)(OPSS)，马来酰亚胺(maleimide)(MAL)和乙烯基砜(vinylsulfone)(VS))的高特异性，半胱氨酸反应性PEG以及大小不同的线性或分枝PEG(例如，2-40kDa，诸如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa，或40kDa)可购得，例如获自NektarTherapeutics Inc.，Huntsville，AL，USA，或SunBio，Anyang City，South Korea。

应当理解，虽然在本文中对亲本多肽修饰的实例通常相对于序列SEQID NO：1(或相对于一些其它特定序列)给出，所公开的修饰还可在本文所述本发明任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-15和SEQ ID NO：44-104及其变体)的等效氨基酸位置实施。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代H47C被认为对应于SEQ ID NO：5中的Q47C，等等。

本发明的偶联物，其中非多肽部分与赖氨酸残基结合

另一方面，本发明涉及这样的偶联物，其表现干扰素-α活性并包含至少一个非多肽部分，所述非多肽部分与干扰素-α多肽的至少一个赖氨酸残基，和/或N末端氨基偶联，其包含选自SEQ ID NO：1-15和44-104的序列，或包含与SEQ ID NO：1-15或44-104之一(诸如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53之一)在0-16个氨基酸位置(诸如在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在0-14个氨基酸位置中，0-12个氨基酸位置中，0-10个氨基酸位置中，0-8个氨基酸位置中，0-6个氨基酸位置中，0-5个氨基酸位置中，0-4个氨基酸位置中，0-3个氨基酸位置中，0-2个氨基酸位置中或0-1个氨基酸位置中不同的序列。根据该方面，一些偶联物包含至少一个去除的赖氨酸残基和/或至少一个去除的组氨酸残基，和/或至少一个引入的赖氨酸残基。

一些本发明的偶联物包括用不同氨基酸残基对氨基酸残基的取代，或氨基酸残基的缺失，其从任何本发明的多肽中去除一个或多个赖氨酸，例如，K31，K50，K71，K84，K122，K133，K134，K135，K160，和/或K165(相对于SEQ ID NO：1)的多肽序列，所述本发明的多肽例如为，SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQID NO：53之一。要被去除的一个或多个赖氨酸残基可被任何其它氨基酸取代，可被Arg(R)或Gln(Q)取代，或被缺失。一些所述偶联物包括取代K31R+K122R；K31R+K133R；K122R+K133R；或K31R+K122R+K133R。其它的示例性取代包括K71E；K84E；K133E/G；和K160E。

在使用胺反应性偶联化学时，避免或将与组氨酸残基偶联的可能性最小化是有益的。因此，一些本发明的偶联物包括一种多肽序列，该多肽序列含有从任何本发明的多肽中去除一个或多个组氨酸例如，H7，H11，H34，和/或H47(相对于SEQ ID NO：1)的取代或缺失，所述本发明的多肽例如为，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53之一。要被去除的一个或多个组氨酸残基可以被任何其它氨基酸取代，可被Arg(R)或Gln(Q)取代，或被缺失。一些所述偶联物包含取代H34Q；H47Q；或H34Q+H47Q。

可选地，或此外，一些本发明的偶联物包括含有修饰的多肽序列，所述修饰将赖氨酸引入亲本序列(例如，SEQ ID NO：1-15，47，或53之一)中被暴露于分子表面的氨基酸残基占据的位置上，所述氨基酸残基例如至少25％、诸如至少50％的侧链暴露于表面。一些所述偶联物包括含有一个或多个选自下组的取代(相对于SEQ ID NO：1)的多肽序列，其将赖氨酸残基引入选自下组的位置，预测所述位置暴露于分子表面并具有超过25％分数ASA：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，G10K，R12K，R13K，M16K，A19K，Q20K，R22K，R23K，I24K，S25K，L26K，F27K，S28K，L30K，R33K，H34K，D35K，R37K，Q40K，E41K，E42K，D44K，N46K，H47K，Q49K，V51K，Q52K，E59K，Q62K，Q63K，N66K，S69K，T70K，N72K，S74K，A75K，D78K，E79K，T80K，L81K，E83K，I87K，F90K，Q91K，N94K，D95K，E97K，A98K，V100K，M101K，Q102K，E103K，V104K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，M112K，N113K，V114K，D115K，L118K，R121K，Q125K，R126K，T128K，L129K，T132K，Y136K，S137K，P138K，A146K，M149K，R150K，S153K，F154K，N157K，Q159K，R161K，L162K，R163K，R164K，或E166K，所述氨基酸残基位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，在上述位置之中，一个或多个位于47，51，52，和154位的氨基酸残基不被赖氨酸取代。

一些本发明所述偶联物包括含有一个或多个选自下组的取代(相对于SEQ ID NO：1)的多肽序列，其将赖氨酸残基引入选自下组的位置，预测所述位置暴露于分子表面并具有超过50％分数ASA：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，R12K，R13K，M16K，A19K，S25K，F27K，S28K，R33K，H34K，D35K，R37K，E41K，D44K，N46K，H47K，Q49K，N66K，A75K，D78K，E79K，T80K，E83K，I87K，F90K，Q91K，N94K，D95K，M101K，Q102K，E103K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，V114K，D115K，L118K，R121K，Q125K，R126K，L129K，T132K，P138K，R150K，L162K，R163K，R164K和E166K，所述氨基酸残基位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，在上述位置之中，47位不被赖氨酸取代。

如上所述，在一些情况下，优选将赖氨酸残基引入干扰素-α的推定受体结合位点的外部，即29-40，79-96，和124-141位的外部，所述位置相对于SEQ ID NO：1进行编号。因此，在一些情况下，一个或多个赖氨酸取代选自D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，G10K，R12K，R13K，M16K，A19K，Q20K，R22K，R23K，I24K，S25K，L26K，F27K，S28K，E41K，E42K，D44K，N46K，H47K，Q49K，V51K，Q52K，E59K，Q62K，Q63K，N66K，S69K，T70K，N72K，S74K，A75K，E97K，A98K，V100K，M101K，Q102K，E103K，V104K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，M112K，N113K，V114K，D115K，L118K，R121K，A146K，M149K，R150K，S153K，F154K，N157K，Q159K，R161K，L162K，R163K，R164K，和E166K(具有超过25％的侧链暴露于表面且不构成部分推定结合位点的残基)组成的组，所述位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，一个或两个位于47，51和154位的氨基酸残基不被赖氨酸取代。

在一些情况下，一个或多个赖氨酸取代选自：D2K，L3K，P4K，Q5K，T6K，H7K，S8K，L9K，R12K，R13K，M16K，A19K，S25K，F27K，S28K，E41K，D44K，N46K，H47K，Q49K，N66K，A75K，M101K，Q102K，E103K，G105K，E107K，E108K，T109K，P110K，L111K，V114K，D115K，L118K，R121K，R150K，L162K，R163K，R164K或E166K(具有超过50％的侧链暴露于表面且不构成部分推定结合位点的残基)组成的组，所述位置相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，47位不被赖氨酸取代。

在本发明的该方面中预期的非肽部分包含聚合物分子，诸如在题目为“与聚合物分子偶联”的章节中描述的任何分子，诸如PEG或mPEG。包含赖氨酸的多肽与聚合物分子之间的偶联可以用任何适当的方法完成，例如题目为“与聚合物分子偶联”的章节中所述，例如使用所述章节描述的一步法或逐步法。PEG化干扰素-α多肽的示例性方法是采用赖氨酸反应性PEG将PEG与半胱氨酸残基共价连接。许多高特异性，赖氨酸反应性PEG(诸如例如，琥珀酰亚胺基并嗲酯(SPA)，琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，和醛(例如，ButyrALD))和不同大小的线性或分枝PEG(例如，2-40kDa，诸如2kDa，5kDa，12kDa，15kDa，20kDa，30kDa，或40kDa)可购得，例如获自Nektar Therapeutics Inc.，Huntsville，AL，USA，或SunBio，Anyang City，South Korea。

应当理解，虽然在本文中对亲本多肽修饰的实例通常相对于序列SEQID NO：1(或相对于一些其它特定序列)给出，所公开的修饰还可在本文所述本发明任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-15和SEQ ID NO：44-104和其变体)的等效氨基酸位置实施。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代H47K被认为对应于SEQ ID NO：5中的Q47K，等等。

本发明的偶联物，其中的非多肽部分是糖部分

另一方面，本发明涉及表现出干扰素-α活性且包含至少一个与干扰素-α多肽偶联的糖部分的偶联物，所述干扰素-α多肽的氨基酸序列与亲本干扰素-多肽，诸如SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：44-104的任一项(诸如SEQID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：53之一)在1-16个氨基酸位置中不同，其中至少一个糖基化位点、优选体内N-糖基化位点已被引入(优选被取代)至亲本干扰素-α多肽中被暴露于分子表面的氨基酸残基占据的位置，所述暴露于分子表面的氨基酸残基为例如其至少25％，诸如至少50％的侧链暴露于表面。通常，该偶联物包含这样的氨基酸序列，其与例如SEQ ID NO：1-15，47，或53之一的氨基酸序列在1-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在1-14个氨基酸位置，在1-12个氨基酸位置，在1-10个氨基酸位置，在1-8个氨基酸位置，在1-6个氨基酸位置，在1-5个氨基酸位置，在1-4个氨基酸位置，在1-3个氨基酸位置或在1-2个氨基酸位置中不同。

采用如下方式引入N糖基化位点，即将所述位点的N-残基(Asn)定位于指定位置上。类似地，引入O糖基化位点以便使构成所述位点的S(Ser)或T(Thr)残基定位于所述位置。应当理解，当术语“其至少25％(或50％)的侧链暴露于表面”的使用与引入体内N糖基化位点相关时，该术语是指氨基酸侧链在与糖部分实际连接的位置处的表面可接近性。在多种情况下，必须在相对于与糖部分实际连接的天冬酰胺残基+2的位置中引入丝氨酸或苏氨酸残基，且使这些位置(引入丝氨酸或苏氨酸处)被包埋，即其少于25％(或50％)的侧链暴露于分子表面。

本发明的一些偶联物包含这样的多肽序列，该多肽序列包含一种或多种选自下组以下取代(相对于SEQ ID NO：1)，其将N-糖基化位点引入据预测暴露于分子表面并具有超过25％分数ASA的位置：D2N+P4S/T，L3N+Q5S/T，P4Q，P4Q+T6S，Q5N+H7S/T，T6N，T6N+S8T，H7N+L9S/T，S8N+G10S/T，L9N+H11S/T，G10N+R12S/T，R12N，R12N+T14S，R13N+M15S/T，M16N+L18S/T，A19N+M21S/T，Q20N+R22S/T，R22N+I24S/T，R23N，R23N+S25T，I24N+L26S/T，S25N+F27S/T，L26N，L26N+S28T，S28N+L30S/T，L30N+D32S/T，K31N+R33S/T，R33N+D35S/T，H34N+F36S/T，D35N+R37S/T，R37N+P39S/T，Q40N+E42S/T，E41N+F43S/T，E42N+D44S/T，D44N+N46S/T，F48S/T，H47N+Q49S/T，Q49N+V51S/T，K50N+Q52S/T，V51N+A53S/T，Q52N+I54S/T，E59N+M61S/T，Q62N，Q62N+T64S，Q63N+F65S/T，F68S/T，S69N+K71S/T，T70N+N72S/T，K71N，K71N+S73T，S74T，S74N+A76S/T，A75N+W77S/T，D78N，D78N+T80S，E79N+L81S/T，T80N+L82S/T，L81N+E83S/T，E83N+F85S/T，K84N+Y86S/T，I87N+L89S/T，F90N+Q92S/T，Q91N+M93S/T，L96S/T，D95N+E97S/T，E97N+C99S/T，A98N+V100S/T，V100N+Q102S/T，M101N+E103S/T，Q102N+V104S/T，E103N+G105S/T，V104N+V106S/T，G105N+E107S/T，E107，E107N+T109S，E108N+P110S/T，L111N+N113S/T，M112N+V114S/T，N113N+D115S/T，V114N，V114N+S116T，D115N+I117S/T，L118N+V120S/T，R121N+Y123S/T，K122N+F124S/T，Q125N+I127S/T，R126N，R126N+T128S，T128N+Y130S/T，L129N+L131S/T，T132N+K134S/T，K133N+K135S/T，K134N+Y136S/T，K135N，K135N+S137T，Y136N+P138S/T，P138N，P138N+S140T，A146N+I148S/T，M149N，M149N+S151T，R150N+F152S/T，S153N，S153N+S155T，F154N+F156S/T，Q159S/T，K160N+L162S/T，R161N+R163S/T，L162N+R164S/T，R163N+K165S/T和R164N+E166S/T，相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，在上述位置中，一个或多个位于47，51，133和140位的氨基酸残基不存在上述修饰。S/T表示取代为丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。

本发明的一些偶联物包含这样的多肽序列，该多肽序列包含一种或多种选自下组的取代(相对于SEQ ID NO：1)，其将N-糖基化位点引入据预测暴露于分子表面并具有超过50％分数ASA的位置：D2N+P4S/T，L3N+Q5S/T，P4Q，P4Q+T6S，Q5N+H7S/T，T6N，T6N+S8T，H7N+L9S/T，S8N+G10S/T，L9N+H11S/T，R12N，R12N+T14S，R13N+M15S/T，M16N+L18S/T，A19N+M21S/T，S25N+F27S/T，S28N+L30S/T，R33N+D35S/T，H34N+F36S/T，D35N+R37S/T，R37N+P39S/T，E41N+F43S/T，D44N+N46S/T，F48S/T，H47N+Q49S/T，Q49N+V51S/T，K50N+Q52S/T，F68S/T，K71N，K71N+S73T，A75N+W77S/T，D78N，D78N+T80S，E79N+L81S/T，T80N+L82S/T，E83N+F85S/T，K84N+Y86S/T，I87N+L89S/T，F90N+Q92S/T，Q91N+M93S/T，L96S/T，D95N+E97S/T，M101N+E103S/T，Q102N+V104S/T，E103N+G105S/T，G105N+E107S/T，E107，E107N+T109S，E108N+P110S/T，L111N+N113S/T，V114N，V114N+S116T，D115N+I117S/T，L118N+V120S/T，R121N+Y123S/T，K122N+F124S/T，Q125N+I127S/T，R126N，R126N+T128S，L129N+L131S/T，T132N+K134S/T，K133N+K135S/T，K135N，K135N+S137T，P138N，P138N+S140T，R150N+F152S/T，K160N+L162S/T，L162N+R164S/T，R163N+K165S/T和R164N+E166S/T，相对于SEQ ID NO：1。在一些情况下，在上述位置中，一个或多个位于47，51，133和140位的氨基酸残基不存在上述修饰。S/T表示取代为丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。

在一些情况下，优选将N-糖基化位点引入干扰素-α的推定受体结合位点的外部，即29-40，79-96，和124-141位的外部，所述位置相对于SEQ IDNO：1进行编号。因此，导致一个或多个N-糖基化位点被引入的取代可包括以下的一种或多种：D2N+P4S/T，L3N+Q5S/T，P4Q，P4Q+T6S，Q5N+H7S/T，T6N，T6N+S8T，H7N+L9S/T，S8N+G10S/T，L9N+H11S/T，G10N+R12S/T，R12N，R12N+T14S，R13N+M15S/T，M16N+L18S/T，A19N+M21S/T，Q20N+R22S/T，R22N+I24S/T，R23N，R23N+S25T，I24N+L26S/T，S25N+F27S/T，L26N，L26N+S28T，S28N+L30S/T，E41N+F43S/T，E42N+D44S/T，D44N+N46S/T，F48S/T，H47N+Q49S/T，Q49N+V51S/T，K50N+Q52S/T，V51N+A53S/T，Q52N+I54S/T，E59N+M61S/T，Q62N，Q62N+T64S，Q63N+F65S/T，F68S/T，S69N+K71S/T，T70N+N72S/T，K71N，K71N+S73T，S74T，S74N+A76S/T，A75N+W77S/T，E97N+C99S/T，A98N+V100S/T，V100N+Q102S/T，M101N+E103S/T，Q102N+V104S/T，E103N+G105S/T，V104N+V106S/T，G105N+E107S/T，E107，E107N+T109S，E108N+P110S/T，L111N+N113S/T，M112N+V114S/T，N113N+D115S/T，V114N，V114N+S116T，D115N+I117S/T，L118N+V120S/T，R121N+Y123S/T，K122N+F124S/T，A146N+I148S/T，M149N，M149N+S151T，R150N+F152S/T，S153N，S153N+S155T，F154N+F156S/T，Q159S/T，K160N+L162S/T，R161N+R163S/T，L162N+R164S/T，R163N+K165S/T和R164N+E166S/T(超过25％的侧链暴露于表面且不构成部分推定结合位点的残基)。在一些情况下，在上述位置中，一个或两个位于47和51位的氨基酸残基不存在上述修饰。S/T表示取代为丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。

在一些情况下，所述取代选自：D2N+P4S/T，L3N+Q5S/T，P4Q，P4Q+T6S，Q5N+H7S/T，T6N，T6N+S8T，H7N+L9S/T，S8N+G10S/T，L9N+H11S/T，R12N，R12N+T14S，R13N+M15S/T，M16N+L18S/T，A19N+M21S/T，S25N+F27S/T，S28N+L30S/T，E41N+F43S/T，D44N+N46S/T，F48S/T，H47N+Q49S/T，Q49N+V51S/T，K50N+Q52S/T，F68S/T，K71N，K71N+S73T，A75N+W77S/T，M101N+E103S/T，Q102N+V104S/T，E103N+G105S/T，G105N+E107S/T，E107，E107N+T109S，E108N+P110S/T，L111N+N113S/T，V114N，V114N+S116T，D115N+I117S/T，L118N+V120S/T，R121N+Y123S/T，K122N+F124S/T，R150N+F152S/T，K160N+L162S/T，L162N+R164S/T，R163N+K165S/T和R164N+E166S/T(具有超过50％的侧链暴露于表面且不构成部分推定结合位点的残基)。在一些情况下，在上述位置中，一个或两个位于47和51位的氨基酸残基不存在上述修饰。S/T表示取代为丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。

为了有效利用引入的N糖基化位点，所需的是选择约125个N末端氨基酸残基之内，诸如约100个N末端氨基酸残基之内，例如75个N末端氨基酸残基之内或50个N末端氨基酸残基之内的任何上述取代。

当本发明偶联物的干扰素-α多肽部分被糖基化时，其可包含单个引入的体内糖基化位点，诸如单个引入的体内N糖基化位点。然而，为了有效保护亲本多肽表面上存在的表位，所需的是所述多肽包含一个以上的体内糖基化位点，诸如2-5个体内糖基化位点，例如2，3，4，或5个体内糖基化位点。

应当理解，虽然在本文中对亲本多肽修饰的实例通常相对于序列SEQID NO：1(或相对于一些其它特定序列)给出，所公开的修饰还可在本文所述本发明任何其它多肽(包括SEQ ID NO：2-15和SEQ ID NO：44-104和其变体)的等效氨基酸位置实施。因此，作为实例，相对于SEQ ID NO：1的取代H47N+Q49S/T被认为对应于SEQ ID NO：5中的Q47N+Q49S/T，等等。

本发明的偶联物的非多肽部分

如上文所述，本发明偶联物的非多肽部分优选选自聚合物分子，亲脂化合物，糖部分(例如通过体内糖基化)和有机衍生试剂。所有这些试剂可赋予该偶联物的多肽部分所需的特性，诸如降低的免疫原性，增加的功能性体内半寿期，增加的血清半寿期，增加的生物利用度和/或增加AUC_sc。偶联物的多肽部分一般仅偶联一种类型的非多肽部分，但也可偶联两种或多种不同类型的非多肽部分，例如偶联聚合物分子和糖部分等。与两个或多个不同非多肽部分的偶联可同时或依次进行。非多肽部分/多个部分的选择具体依赖于需要通过偶联实现的效果。例如，发现糖部分具体适用于降低免疫原性，而聚合物分子诸如PEG具体适用于增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期。采用聚合物分子和糖部分的组合可增强免疫原性的降低以及功能性体内或血清半寿期的增加。

在以下章节“与亲脂化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与糖部分的偶联”和“与有机衍生试剂的偶联”中，描述与具体类型的非多肽部分的偶联。

与亲脂化合物的偶联

为了与亲脂化合物偶联，以下多肽基团可发挥连接基团的功能：多肽的N末端或C末端，氨基酸残基Ser，Thr或Tyr的羟基，Lys的ε-氨基，Cys的巯基或Asp和Glu的羧基。所述多肽和亲脂化合物可直接或者通过使用接头互相偶联。亲脂化合物可以是天然化合物，例如饱和或不饱和脂肪酸，脂肪酸二酮，萜烯(terpene)，前列腺素，维生素，类胡萝卜素或类固醇，或者是合成的化合物，例如具有一个或多个烷基、芳香基、链烯基或其它多个不饱和化合物的碳素酸(carbon acid)、醇、胺和磺酸。所述多肽和亲脂化合物之间任选通过接头的偶联可按照本领域已知的方法进行，例如，Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，纽约，1976和在WO 96/12505中所述。

与聚合物分子的偶联

与多肽偶联的聚合物分子可以是任意合适的聚合物分子，诸如天然或合成的同聚物或杂聚物，一般具有的分子量范围是约300-100,000Da，例如约1000-50,000Da，更优选约1000-40,000Da。更具体地，聚合物分子，诸如PEG具体是mPEG，通常具有约2，5，10，12，15，20，30，40或50kDa的分子量，尤其是约5kDa，约10kDa，约12kDa，约15kDa，约20kDa，约30kDa或约40kDa的分子量。PEG分子可以是支化的(例如，mPEG2)，或可以是非支化的(即，线性的)。

当与本文中聚合物分子有关时，术语“约”是指大约的平均分子量且反映出这样的事实，给定聚合物制备物中通常有一定的分子量分布。

同聚物的例子包括多元醇(即poly-OH)，多胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)。杂聚物是一种聚合物，它包含一个或多个不同的偶联基团，诸如羟基和胺基。

合适的聚合物分子的例子包括选自下组的聚合物分子：聚环氧烷(polyalkylene oxide)(PAO)，包括聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，支化的PEG(branched PEG)，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)(PVA)，聚羧酸酯(poly-carboxylate)，聚乙烯吡咯烷酮(poly-(vinylpyrolidone))，聚亚乙基-共-马来酸酐(polyethylene-co-maleic acidanhydride)，聚苯乙烯-共-马来酸酐(polystyrene-co-malic acid anhydride)，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖(carboxymethyl-dextran)，或者适合于降低免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的任何其它生物聚合物。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的，无毒，无抗原性，无免疫原性的，具有不同水溶性特性，且容易从活生物体排泄掉。

PEG是优选的待用聚合物分子，因为它与例如，诸如葡聚糖等的多糖相比仅具有较少的能交联的反应基团。具体来说，单功能性PEG，例如单甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethylene glycol)(mPEG)是令人感兴趣的，因为其偶联的化学反应相对简单(仅一个反应基团可用于与多肽上的连接基团偶联)。因此，消除了交联的风险，所得的多肽偶联物均一性更好且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。

为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，聚合物分子的羟基末端基团必须以活化形式提供，即，具有反应性官能团(该基团的例子包括伯胺基团，酰肼(HZ)，巯基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)，羧甲基化琥珀酰亚胺(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，醛，硝基苯碳酸酯(NPC)，和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子是商业上可获得的，例如从Shearwater Polymer，lnc.，Huntsville，AL，USA；PolyMASCPharmaceuticals plc，UK；或SunBio Corporation，Anyang City，South Korea获得。另外，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法活化，例如按WO90/13540公开的方法。用于本发明的活化的线性或支化聚合物分子的具体例子在Nektar Therapeutics，Inc.2003年产品目录(“Nektar MoleculeEngineering：Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”，将其引入此处作为参考)中描述。活化的PEG聚合物的具体例子包括下列线性PEG：NHS-PEG，SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及支化PEG，例如PEG2-NHS，PEG2-MAL，和在US5,932,462和US 5,643,575中公开的那些分子，将这两篇文献引入此处作为参考。另外，本文作为参考文献引用的下列文献公开了有用的聚合物分子和/或PEG连接的化学性质：US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439，508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921,131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809996，US 5,629,384，WO96/41813，WO 96/07670，US 5,473,034，US 5,516,673，EP 605963，US5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。

多肽与活化的聚合物分子的偶联经过使用任何常规方法进行，例如按下列文献所述的方法(它们也描述了用于活化聚合物分子的合适方法)：Harris和Zalipsky，编辑，聚(乙二醇)化学和生物学应用，AZC，华盛顿；R.F.Taylor，(1991)，“蛋白质的固定化，基础和应用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白质偶联和交联的化学”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定化的亲和配体技术”，学术出版社，纽约)。

对于半胱氨酸残基的PEG化，通常要在PEG化之前将多肽与还原剂诸如二硫苏糖醇(DDT)反应。随后通过任何常规方法，诸如通过脱盐去除还原剂。PEG与半胱氨酸的偶联通常在以下条件实施：适宜的缓冲液中，pH 6-9，温度4℃-25℃，时间大约为16小时。用于偶联半胱氨酸残基的活化PEG聚合物的实例包括以下线性和支化PEG：乙烯砜-PEG(PEG-VS)，诸如乙烯砜-mPEG(mPEG-VS)；邻吡啶基-二硫-PEG(PEG-OPSS)，诸如邻吡啶基-二硫-mPEG(mPEG-OPSS)；和马来酰亚胺-PEG(PEG-MAL)，诸如马来酰亚胺-mPEG(mPEG-MAL)和支化马来酰亚胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。

赖氨酸的PEG化通常采用PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(例如，mPEG-NHS或mPEG2-NHS)，或酯诸如PEG琥珀酰亚胺丙酸酯(例如，mPEG-SPA)或PEG琥珀酰亚胺丁酸酯(例如，mPEG-SBA)。如果混合等摩尔量的PEG和蛋白质，可将一个或多个PEG可在30分钟内、pH 8-9.5、室温连接至蛋白质。通常PEG与蛋白质氨基的摩尔比率是1-5-1即可满足。升高pH可提高反应速率，而降低pH则减低反应速率。这些强反应性酯可在生理pH条件下发生偶联，但低反应性衍生物通常需要较高pH。如果使用不稳定的蛋白质，则还可采用低温。在低温条件，可采用较长的反应时间。

N末端氨基酸的α-氨基(～7.6 to 8.0)和赖氨酸的ε-氨基(～10)的pKa差异可促进N末端PEG化。N末端氨基的PEG化通常采用PEG-醛(诸如mPEG-丙醛或mPEG-丁醛)，其具有对胺的更高的选择性，因此与组氨酸的咪唑基团的反应的可能性较低；此外，用于赖氨酸偶联的PEG试剂(诸如mPEG-SPA或mPEG-SBA)还可用于N末端胺的偶联。PEG-醛与N末端氨基的偶联通常如下实施：在适宜的缓冲液(诸如，100mM醋酸钠或100mM二磷酸钠缓冲液与20mM氰基硼氢化钠)中pH～5.0，于约4℃-25℃的温度过夜。可用的N末端PEG化方法和化学还公开于美国专利5,985,265和美国专利6,077,939中，其均引入此处作为参考。

通常，线性PEG或mPEG聚合物的分子量为约5kDa，约10kDa，约12kDa，约15kDa，约20kDa，或约30kDa。支化PEG(PEG2或mPEG2)聚合物通常具有的分子量为约10kDa，约20kDa，或约40kDa。在一些情况下，可使用较高分子量的支化PEG2试剂，诸如20kDa或40kDa PEG2，例如包括用于赖氨酸PEG化的mPEG2-NHS，用于半胱氨酸PEG化的mPEG2-MAL，或用于N末端PEG化的MPEG2-醛(所有试剂均获自NektarTherapeutics，Inc，Huntsville AL)。PEG2化合物的支化结构导致相对大的分子体积，因此很少有连接的分子(或，一个连接的分子)可赋予PEG化分子的所需特性。

技术人员将明白所用的活化方法和/或偶联化学依赖于干扰素-α多肽的连接基团以及聚合物的官能团(例如，是氨基，羟基，羧基，醛或巯基)。PEG化可针对与多肽上所有可获得的连接基团(即暴露于多肽表面的连接基团)的偶联或者可针对具体连接基团，例如半胱氨酸残基，赖氨酸残基，或N-末端氨基(US 5,985,265)。另外，偶联可用一步法或者以逐步方式实现(例如按WO 99/55377所述)。

在一些情况下，在意图使尽可能多的聚合物连接基团与聚合物分子反应的条件下进行聚合物的偶联。这可通过使与多肽相关聚合物的摩尔数适宜地过量实现。通常，活化型聚合物分子与多肽的摩尔比是1000-1，诸如200-1，优选100-1。然而，在一些情况下，该比率可更低，诸如最低至约50-1，10-1或5-1。然而，也可使用等摩尔比率。

本发明还涉及通过接头偶联聚合物分子与多肽。合适的接头是技术人员熟知的。优选的例子是氰尿酰氯(cyanuric chloride)(Abuchowski等，(1977)，生物学化学杂志，252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer等，(1986)，高分子科学和高分子化学杂志，编辑，24，375-378)。

偶联后，按照本领域已知的方法，例如，通过向反应混合物中加入伯胺封闭残余的活化型聚合物分子，并通过合适的方法去除所得的失活型聚合物分子。

可使用糖苷与干扰素-α的氨基酸残基的共价体外偶联来修饰或增加糖组分的数目或特性。根据使用的偶联方式，糖类可连于a)精氨酸和组氨酸(Lundblad和Noyes，Chemical Reagents for Protein Modification，CRC PressInc.Boca Raton，FI)，b)游离羧基(例如C末端氨基酸残基，天冬酰胺或谷氨酰胺的游离羧基)，c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基，d)游离羟基，例如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，e)芳香族残基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基或者f)谷氨酰胺的酰胺基。这些氨基酸残基组成糖部分的连接基团的例子，可在本发明偶联物的干扰素-α多肽中引入和/或去除所述残基。体外偶联的合适方法在例如，WO 87/05330和Aplin等，CRC生物化学的重点回顾，第259-306页，1981中描述。糖部分或PEG与蛋白质和肽结合的Gln-残基的体外偶联可通过转谷氨酰胺酶(TGases)实现，例如，按Sato等，1996，生物化学，35，13072-13080或在EP 725 145中所述。

与糖部分的偶联

为了实现通过引入一个或多个体内糖基化位点修饰的干扰素-α多肽(见“本发明的偶联物，其中非多肽部分是糖部分”章节)的体内糖基化，将编码该偶联物的多肽部分的核苷酸序列插入糖基化型(glycosylating)真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)，昆虫，哺乳动物细胞，来自转基因植物细胞或来自转基因动物。另外，当在基因治疗中使用编码本发明的偶联物的多肽部分或本发明多肽的核苷酸序列时可在人体内实现糖基化。在一个方面中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞，BHK或者HEK细胞，例如HEK293，或昆虫细胞，例如SF9细胞，或者酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母(Pichia pastoris)或者任何其它合适的糖基化型宿主，例如如下所述。任选，通过体内糖基化连接到干扰素-α多肽的糖部分可通过使用糖基转移酶，例如，使用Neose，Horsham，PA，USA上市的GlycoAdvance^TM技术进一步修饰。从而可以增加，例如表达后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化以及CHO细胞的体内糖基化。

与有机衍生试剂的偶联

干扰素-α多肽的共价修饰可通过将多肽的连接基团与有机衍生试剂反应来进行。合适的衍生试剂和方法是本领域熟知的。例如，最常见的半胱氨酰残基与α-卤代乙酸(和相应的胺)，诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应以产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴三氟丙酮(bromotrifiuoroacetone)，α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸(α-bromo-β-(4-imidozoyl)propionic acid)，氯乙酰基磷酸酯(chloroacetylphosphate)，N-烷基马来酰亚胺(N-alkylmaleimides)，3-硝基-2-吡啶基二硫化物(3-nitro-2-pyridyl disulfide)，甲基2-吡啶基二硫化物(methyl 2-pyridyldisulfide)，对氯汞基苯甲酸(p-chloromercuribenzoate)，2-氯汞基-4-硝基酚(2-chloromercuri-4-nitrophenol)，或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole)反应而得以衍生化。组氨酰残基经过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0反应而得以衍生化，因为该试剂对组氨酸侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴化物(Para-bromophenacyl bromide)也是有用的；反应优选在0.1M卡可酸钠(sodium cacodylate)中在pH 6.0下进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯(imidoesters)，例如甲基吡啶亚酰胺(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)；O-甲基异脲(O-methylisourea)；2，4-戊二酮(2，4-pentanedione)；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。精氨酰残基通过与苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮和茚三酮中的一种或数种常规试剂反应得以修饰。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团具有高pKa。另外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应可选择性修饰羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R′是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide)或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(4-azonia-4，4-dimethylpentyl)carbodiimide)。另外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。

功能性位点的封闭

因为过量聚合物偶联可导致与聚合物偶联的干扰素-α多肽活性丧失，故此去掉位于功能性位点的连接基团或者通过在偶联前封闭功能性位点是有益的。后一种策略组成本发明的其它方面(第一种策略在上文举例说明，例如通过去掉靠近功能性位点的赖氨酸残基来进行)。更具体的说，根据第二种策略，干扰素-α多肽和非多肽部分之间的偶联在多肽的功能性位点被能与多肽功能性位点结合的辅助分子封闭的条件下进行。可选，辅助分子是特异性识别多肽的功能性位点的分子，例如受体，具体是I型干扰素受体。另外，辅助分子可以是抗体，具体是识别干扰素-α多肽的单克隆抗体。具体地说，辅助分子可以是中和型单克隆抗体。

实现偶联前使得多肽与辅助分子相互作用。这样保证多肽的功能性位点被保护或保护且随后不被诸如聚合物等的非多肽部分衍生化。其从辅助分子洗脱后，可回收具有至少部分受保护的功能性位点的非多肽部分与多肽之间的偶联物。

随后，具有已被封闭的功能性位点的多肽与聚合物，亲脂化合物，糖部分，有机衍生试剂或任意其它化合物以正常方式偶联，例如，按标题为“与……偶联”的上述章节所述进行。

无论用于防止多肽的功能性位点发生偶联的辅助分子的性质如何，都需要该辅助分子不含或仅包含很少用于连接所选非多肽部分的连接基团，其在该分子的一部分中，其中与所述基团的偶联将妨碍已偶联的多肽从辅助分子脱附。因此，可获得与多肽未受保护的部分中存在的连接基团的选择性偶联，且可以再将辅助分子用于偶联的重复循环中。例如，如果非多肽部分是聚合物分子诸如PEG，其具有赖氨酸或N末端氨基酸残基的ε氨基作为连接基团，则需要辅助分子基本上不含可结合的ε氨基，优选不含任何ε氨基。因此，在一些情况下，辅助分子是能结合多肽的功能性位点的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽不含用于偶联所选非多肽部分的任何可偶联的连接基团。

在另一方面中，辅助分子首先共价连接到诸如柱填充材料，例如交联葡聚糖或琼脂糖珠的固相或者表面例如反应器表面。随后，将多肽上样到携带辅助分子的柱材料上且按照本领域已知的方法进行偶联，例如，按标题为“与……偶联”的上述章节所述进行。该方法允许通过洗脱从辅助分子分离多肽偶联物。在不导致多肽偶联物大量降解的物理化学条件下以常规技术洗脱该多肽偶联物。含有多肽偶联物的液相从与辅助分子保持共价连接的固相分离。分离可用其它方式实现：例如，用可被特异性结合剂(例如链霉抗生物素蛋白)识别的第二分子(例如生物素)衍生化该辅助分子。特异性结合剂可连接到固相上，从而允许通过第二辅助固相柱而从辅助分子-第二分子复合物中分离多肽偶联物，所述柱在随后洗脱时滞留辅助分子-第二分子复合物而不是多肽偶联物。可用任何合适的方式从辅助分子释放多肽偶联物。通过提供辅助分子从其结合的干扰素-α功能性位点解离的条件实现去保护。例如，偶联聚合物的抗体与抗独特型抗体间的复合物可通过将pH调到酸性或碱性pH来解离。

标记的干扰素-α肽的偶联

另一方面，干扰素-α多肽以具有标记的融合蛋白被表达，即一般由1-30个，例如1-20或1-15或1-10或1-5个氨基酸残基(例如加至多肽的N末端或C末端)组成的氨基酸序列或肽链。除了允许快速且容易的纯化外，标记是实现标记的多肽与非多肽部分之间的偶联的一种常规工具。具体地说，标记可用于在通过标记固定化经标记的多肽的微量滴定板或其它载体例如顺磁珠(paramagnetic bead)中实现偶联。在例如微量滴定板中与标记的多肽偶联的优势在于标记的多肽可直接分离自液体培养基而在微量滴定板中固定化(原则上不需任何纯化)和进行偶联。因此，减少了加工步骤(从表达到偶联)的总数。另外，标记可充当间隔分子以保证提高待偶联的固定化多肽的可用性。标记的多肽可与本文公开的任意非多肽部分偶联，例如，诸如于PEG的聚合物分子偶联。

使用的特异性标记特性(identity)并不重要，只要该标记能与多肽一起表达且能被固定化在合适的表面或载体材料上。许多合适的标记是商业上可获得的，例如从丹麦，Unizyme实验室获得。针对所述标记的抗体可从商业获得，例如从ADI，Aves Lab和Research Diagnostics获得。

本发明的多核苷酸

本发明提供了分离的或重组的核酸(本文也称为多核苷酸)，统称为“本发明的核酸(或多核苷酸)”，其编码本发明的多肽。本发明的多核苷酸可用于多种用途。如上所述，多核苷酸可用于制备本发明的多肽。此外，本发明的多核苷酸可掺入用于基因治疗，DNA疫苗接种和免疫治疗的表达载体中，如下更详细的描述。

一方面，本发明提供了分离的或重组的核酸，其各包含选自以下的多核苷酸序列：(a)选自SEQ ID NO：16-30的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；(b)编码选自SEQ ID NO：1-15或44-104之一的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列。

本发明还提供了分离的或重组的核酸，其各自包含编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含在0-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在0-16个位置，0-15个位置，0-14个位置，在0-13个位置，在0-12个位置，在0-11个位置，在0-10个位置，在0-9个位置，在0-8个位置，在0-7个位置，在0-6个位置，在0-5个位置，在0-4个位置，在0-3个位置，在0-2个位置，或0-1个位置中与SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104任一项(例如，SEQID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：53之一)不同的序列。在一些情况下，所编码的多肽表现出干扰素-α活性。

本发明还提供了分离的或重组的核酸，其各自包含编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含具有与SEQ ID NO：1-15或SEQ ID NO：44-104任一项(诸如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：47或SEQ ID NO：53之一)具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高氨基酸序列同一性的序列。在一些情况下，所编码的多肽表现出干扰素-α活性。

本发明还提供了分离的或重组的核酸，其各自包含编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽是亲本干扰素-α多肽的变体，所编码的变体包含与该亲本干扰素-α多肽序列在至少一个氨基酸位置中存在不同的序列，其中变体序列包含以下残基中的一种或多种：47位的His，51位的Val，55位的Phe，56位的Leu，58位的Tyr，133位的Lys或140位的Ser，所述位置相对SEQID NO：1进行编号。在一些情况下，该亲本干扰素-α多肽序列是天然存在的人干扰素-α的序列(诸如SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：42的任一项，或SEQ IDNO：32+R23K，或本文所述其它huIFN-α序列和/或如Allen G.和Diaz M.O.(1996)中所述，如上)，或是非天然存在的(即合成的)干扰素-α的序列，诸如IFN-αCon1(SEQ ID NO：43)。在一些情况下，该变体序列与亲本多肽序列在1-16个氨基酸位置(诸如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸位置)中，例如在1-10个氨基酸位置，在1-5个氨基酸位置，或在1-3个氨基酸位置中存在不同。在一些情况下，该变体表现出干扰素-α活性。

另一方面，本发明提供了分离的或重组的核酸，其各自包含在高严谨条件下与SEQ ID NO：16-30之一的基本上全长序列杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码表现出干扰素α活性的多肽。

其它方面

本发明的任何核酸(包括上述那些核酸)可编码包含至少一种其它氨基酸序列的融合蛋白质，例如，分泌/局域化(localization)序列，用于增溶或固定多肽的序列(例如，为了细胞表面展示)，用于检测和/或纯化多肽的序列(例如，多肽纯化序列，诸如表位标记，聚组氨基序列等)。另一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明核酸的细胞。所述细胞可以表达由本发明核酸编码的一种或多种多肽。

本发明还提供了包含本发明任何核酸的载体。所述载体可包含质粒，粘粒，噬菌体，病毒，或病毒片段。所述载体可包含表达载体，如有需要，核酸可操作地连接于启动子，包括此处或以下描述的。此外，另一方面，本发明提供了包含赋形剂或载体和至少一种本发明的任何核酸，或载体，细胞，或包含所述核酸的宿主的组合物。所述组合物可以是药学组合物，赋形剂或载体可以是可药用的赋形剂或载体。

本发明还包括包含两种或多种本发明的核酸，或其片段(例如，作为重组底物)的组合物。该组合物可包含重组核酸的文库，其中文库包含至少2种，至少3种，至少5种，至少10种，至少20种，至少50种，或至少100种或更多种上述核酸。所述核酸可任选地克隆至表达载体中，来提供表达文库。

本发明的核酸及其片段，以及包含所述多核苷酸的载体可与适宜的载体，诸如药用载体联用而用于治疗性或预防性用途。所述组合物包含治疗上和/或预防上有效量的化合物，以及可药用的载体或赋形剂。所述载体或赋形剂包括(但不限于)盐水，缓冲的盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合。配制方式应与给药模式相适应。施用核酸，多肽和蛋白质的方法是本领域众所周知的，并在下文中进一步讨论。

本发明还包括通过用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一种或多种本发明的核酸(在上述一些重组形式中进行)而产生的组合物；以及通过用机械方式(例如超声处理，涡旋等)片段化或剪切一种或多种本发明的核酸而产生的组合物，该组合物也可提供在上述方法用于重组的底物。本发明还提供了通过切割至少一种本发明的核酸而产生的组合物。所述剪切包括机械性，化学性，和酶切割，酶切割包括用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶的切割。

本发明还包括通过在核糖核苷酸-或三磷酸脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide triphosphate)和核酸聚合酶的存在下保温一种或多种片段化的核酸组而产生的组合物。所得组合物形成重组混合物，可用于上述多种重组形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶，DNA聚合酶或RNA-指导导的DNA聚合酶(例如“逆转录酶”)；聚合酶可以是例如热稳定的DNA聚合酶(例如VENT，TAQ等)。

类似地，含有多组对应于一种以上本发明核酸的寡核苷酸的组合物也可用作重组底物，并且也是本发明的特征。为了方便起见，将这些经片段化，经剪切的或寡核苷酸合成的混合物称为片段化的核酸组。

本发明还提供了编码多肽的分离的或重组的核酸，所述多肽表现出干扰素-α活性，其通过突变或重组至少一种本发明的核酸产生。

制备多核苷酸

可根据已知的合成方法，通过标准的固相方法制备本发明的多核苷酸，寡核苷酸，和核酸片段。一般说来，单独合成长约100个核苷酸碱基的片段，然后(通过例如酶促或化学连接法，或聚合酶介导的重组方法)将它们连接起来，以形成基本上任何所需的连续序列。例如，本发明的多核苷酸和寡核苷酸可通过化学合成制备，其使用Beaucage等，(1981)四面体通讯22：1859-69所述的经典亚磷酰胺法，或Matthes等，(1984)EMBO J，3：801-05所述的方法(例如，这些方法一般在自动合成方法中实施)。根据亚磷酰胺法，在例如自动化的DNA合成仪中合成寡核苷酸，然后进行纯化，退火，连接，并克隆入适当的载体。

另外，基本上任何核酸都可从多个商家中的任何一家订购得到，诸如Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和很多其它的公司。类似地，肽和抗体也可从多个商家中的任何一家订购得到，例如Celtek Peptides(Nashville，TN)；Washington Biotechnology，Inc.(Baltimore MD)；Global Peptide Services(Ft.Collin CO)和很多其它的公司。

也可通过使用寡核苷酸探针筛选cDNA文库(例如通过如常规重复序列重组法中那样通过重组同源核酸而产生的文库)得到本发明的特定多核苷酸，其中所述寡核苷酸探针能与编码干扰素α多肽及其片段的多核苷酸杂交或PCR-扩增编码干扰素α多肽及其片段的多核苷酸。筛选和分离cDNA克隆的方法是本领域技术人员众所周知的。该技术描述于例如：Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymol.Vol.152，Acad.Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)；Sambrook，如上，和CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，如上。一些本发明的多核苷酸可通过改变(例如通过诱变，重复序列重组(例如改组)，或寡核苷酸重组)天然存在的序列而获得。在其它情况下，所述多核苷酸可在silico中制备或通过寡核苷酸重组方法，按其中所引用的参考文献所述进行制备。

如本文所详述，本发明的多核苷酸包括编码本发明多肽的多核苷酸序列，与这些多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，和在至少严谨条件下与本文定义的序列杂交的多核苷酸。编码序列是指编码具体多肽或所述多肽的域，区，或片段的多核苷酸序列。编码序列可编码(编码)表现出如上述干扰素α活性的本发明的多肽。本发明的多核苷酸可以是RNA的形式，或者是DNA的形式，包括mRNA，cRNA，合成RNA和DNA，和cDNA。多核苷酸可以是双链或单链，如果是单链，则可以是编码型链或非-编码型(反义，互补)链。本发明的多核苷酸包括本发明多肽的编码序列的(i)分离形式，(ii)与其它编码序列联合以编码例如融合蛋白，前-蛋白质，前原-蛋白质(prepro-protein)等，(iii)与能在适宜宿主中有效表达编码序列的非-编码型序列，如启动子，终止元件，或5’和/或3’非翻译区域联合，和/或(iv)在载体、细胞或宿主环境中，其中编码序列是异源基因。

本发明多核苷酸还可见于与核酸常见组合形式的联合形式中，包括存在载体，缓冲液，佐剂，赋形剂等时，如本领域技术人员所已知的。多核苷酸片段通常包含至少约200个核苷酸碱基，诸如至少约250，300，350，400，450，460，470，或更多个碱基。本发明的多核苷酸的核苷酸片段可在高严谨条件下与本文所述多核苷酸序列杂交和/或编码具有本发明多肽的至少一种特性的氨基酸序列。

修饰的编码序列

本领域技术人员应懂得，修饰编码序列以增强其在具体宿主中的表达是有利的。遗传密码是丰余的，它具有64个可能的密码子，但大多数生物偏好使用这些密码子中的一部分(subset)。在物种中最常使用的密码子被称为最佳密码子，那些不常使用的密码子被分为稀有或不常用密码子(例见Zhang S.P.等(1991)基因105：61-72)。可取代密码子以反映宿主的优选密码子使用情况，该方法被称为“密码子最优化”或“物种密码子偏向(speciescodon bias)的控制”。

可以制备出含有具体原核或真核宿主所偏好的密码子(参见Murray，E.等(1989)核酸研究17：477-508)的修饰的编码序列，例如使与未经最优化的序列所产生的转录物相比，能提高翻译速率，或产生具有所需特性如较长半寿期的重组RNA转录物。也可以修饰翻译终止密码子以反映出宿主的偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的优选终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶植物的优选终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌(E.coli)优选使用UAA作为终止密码子(Dalphin M.E.等(1996)核酸研究24：216-218)。

为了多种原因，可对本发明的多核苷酸序列进行改造以改变本发明的编码序列，所述改变包括但不限于：修饰基因产物的克隆，加工和/或表达的改变。例如，可使用本领域众所周知的技术，例如定点诱变引入改变，以插入新的限制性位点，改变糖基化模式，引入或去除连接基团(例如，用于聚乙二醇化或其它结合)，改变密码子的偏好，引入拼接位点等。

沉默变异

因为遗传密码的简并性，大量功能性相同的核酸编码任何给定多肽。例如，下述密码子表(表5)显示了密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，和CGU均编码氨基酸精氨酸。因此，在核酸序列中编码精氨酸的密码子的每个位置上，密码子可被改变为任何上述相应的密码子而不会改变所编码的多肽。所述核苷酸变异为“沉默变异”。应当理解RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。

表5

密码子表

氨基酸	密码子
		丙氨酸    Ala   A半胱氨酸  Cys   C门冬氨酸  Asp   D谷氨酸    Glu   E苯丙氨酸  Phe   F甘氨酸    Gly   G组氨酸    His   H异亮氨酸  Ile   I赖氨酸    Lys   K亮氨酸    Leu   L甲硫氨酸  Met   M天冬酰胺  Asn   N脯氨酸    Pro   P谷氨酰胺  Gln   Q精氨酸    Arg   R丝氨酸    Ser   S苏氨酸    Thr   T缬氨酸    Val   V色氨酸    Trp   W酪氨酸    Tyr   Y	GCA   GCC  GCG  GCUUGC   UGUGAC   GAUGAA   GAGUUC   UUUGGA   GGC  GGG  GGUCAC   CAUAUA   AUC  AUUAAA   AAGUUA   UUG  CUA  CUC  CUGUUAUGAAC   AAUCCA   CCC  CCG  CCUCAA   CAGAGA   AGG  CGA  CGC  CGGGUAGC   AGU  UCA  UCC  UCGCUACA   ACC  ACG  ACUGUA   GUC  GUG  GUUUGGUAC   UAU

本领域技术人员应懂得：由于遗传密码的简并性，可产生很多种编码本发明多肽的核酸序列，其中的一些与本文清楚公开的核酸序列有最小序列同源性。本领域技术人员会认识到：可通过标准技术修饰核酸中的每一个密码子(除了AUG和UGC，其通常分别是甲硫氨酸和色氨酸唯一的密码子)以编码功能相同的多肽。因此，编码多肽的核酸的每一种沉默变异可见于任何所述序列。本发明提供了编码本发明多肽的核酸序列的任何可能变异，它们可通过选择基于可能的密码子选择的组合而产生。根据编码本发明多肽的核酸序列所用的标准三联体(密码子)遗传密码(如表5所示)制备这些组合。通过考虑序列以及遗传密码，具体提供并描述了本文每一种核酸的所有上述变异体。本领域技术人员完全能够产生本文所列序列的任何沉默取代。

应用多核苷酸

本发明的多核苷酸具有多种用途，例如，本发明多肽的重组制备(即表达)，其通常通过包含编码所述多肽或其片段的序列的质粒表达载体的表达来进行；作为治疗剂；作为预防剂；作为诊断工具；作为免疫原；作为佐剂；作为诊断存在互补或部分互补核酸(包括检测野生型干扰素-α核酸)的诊断性探针，作为进一步反应的底物，所述反应例如重复序列重组反应或制备新和/或改良变体的突变反应等。

载体、启动子和表达系统

本发明还包括重组构建体，其含有一种或多种本文所宽泛描述的核酸序列。所述构建体包括载体，例如质粒，粘粒，噬菌体，病毒，细菌人工染色体(BAC)，酵母人工染色体(YAC)等，其中以正向或反向插入了本发明的核酸序列。在一些情况下，构建体还含有调节序列，包括例如与该核酸序列可操作连接的启动子。大量适当的载体和启动子是本领域技术人员已知的，也可以购得。

描述本文所用分子生物学技术，包括载体、启动子的利用和很多其它相关论题的普通教科书包括Berger，如上；Sambrook(1989)，如上，和Ausubel，如上。足以教导熟练技术人员进行体外扩增方法，包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)，例如为了产生本发明的同源核酸的技术的实例可参见例如Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)，美国专利4,683,202；1997年7月28日公开的美国专利4,683,195；PCR方法：方法和应用指南(Innis等编)Academic出版公司，San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim &Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；NIH研究杂志(1991)3，81-94；Kwoh等，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86，1173-1177；Guatelli等，(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA 87，1874-1878；Lomell等，(1989)临床化学杂志，35，1826-1831；Landegren等，(1988)科学241，1077-1080；Van Brunt(1990)生物技术8，291-294；Wu和Wallace(1989)Gene 4，560-569；Barringer等，(1990)Gene 89，117-122以及Sooknanan和Malek(1995)生物技术13：563-564。克隆经体外扩增的核酸的改良方法描述于Wallace等，美国专利5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改良方法简述于Cheng等，(1994)自然369：684-685和其中的参考文献，其中产生了长至40kb的PCR扩增子。本领域技术人员应懂得：实质上使用逆转录酶和聚合酶可将任何RNA转变为适于限制性消化，PCR扩展和测序的双链DNA。参见Ausubel，Sambrook和Berger，同上。

本发明还涉及由本发明的载体转导的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的多肽。用本发明的载体对宿主细胞进行基因改造(即转导，转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。经改造的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基经修饰而适于活化启动子，选择转化子或扩增基因。如温度，pH等的培养条件与被选择用于表达的宿主细胞先前所用的相同，它们对于本领域技术人员而言是显而易见的，也可参见本文提及的参考文献，包括例如Freshney(1994)动物细胞培养，基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约和其中提及的参考文献。

也可在非-动物细胞，如植物，酵母，真菌，细菌等中生产本发明的多肽。除了Sambrook，Berger和Ausubel外，有关细胞培养的详细资料可参见Payne等，(1992)液体系统的植物细胞和组织培养，John Wiley & Sons，Inc.纽约，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)植物细胞，组织和器官培养；基本方法，Springer实验室手册，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)，微生物培养基手册(1993)，CRC出版社，Boca Raton，FL。

可将本发明的多核苷酸和其片段包含在多个表达载体的任一个中以表达多肽。所述载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA，病毒DNA，如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和很多其它病毒之组合的载体。可以使用任何能将遗传物质转导至细胞，并且当需要复制时可以复制并在相关宿主中能存活的载体。

表达载体中的核酸序列与适当的转录控制序列(启动子)可操作相连以介导mRNA合成。所述启动子的例子包括：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子，噬菌体λPL启动子和其它已知能控制原核或真核细胞或其病毒中的基因表达的启动子。表达载体还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包括用于扩增表达的适当序列。另外，表达载体还任选含有一种或多种选择标记基因以提供表型性状，用于选择经转化的宿主细胞，如针对真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或针对大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

可使用含有编码本发明多肽的适宜DNA序列，以及适当启动子或控制序列的载体转化适当宿主，以使宿主表达多肽。适当表达宿主的例子包括：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，如CHO，COS，BHK，HEK293或Bowes黑素瘤；植物细胞等。应理解不是所有细胞或细胞系都需要能够产生完全功能性的本发明的多肽或其片段；例如，可在细菌或其它表达系统中产生多肽的抗原性片段。本发明并不受所用宿主细胞的限制。

在细菌系统中，可根据多肽或其片段的预期用途来选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽或其片段以诱导抗体时，则需要能指导高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体。所述载体包括但不限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中核苷酸编码序列被连接至载体中，与氨基末端的Met序列和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基位于同一读码框内，从而产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke & Schuster(1989)生物化学杂志264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)等。

类似地，在酵母酿酒酵母中，可使用多种含有组成型或诱导型启动子，如α因子，醇氧化酶和PGH的载体来生产本发明的多肽。有关评述可参见Ausubel等，(同上)和Grant等，(1987；酶学方法153：516-544)。

在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种表达系统，如基于病毒的系统。当使用腺病毒作为表达载体时，任选将编码序列连接至腺病毒转录/翻译复合物中，所述复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。插入病毒基因组中非必需的E1或E3区域会导致在被感染的宿主细胞中表达本发明多肽的存活病毒能(Logan和Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。另外，可使用转录增强子，如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子来增强哺乳动物宿主细胞中的表达。宿主细胞、培养基、表达系统和制备方法包括已知用于克隆和表达多种哺乳动物干扰素-α(例如，人干扰素-α)的那些内容。

其它表达元件

具体的起始信号有助于本发明多核苷酸编码序列和/或其片段的有效翻译。这些信号包括例如ATG起始密码子和邻接的序列。当将编码序列，其起始密码子和上游序列被插入适当表达载体时，无需其它的翻译控制信号。然而，当仅插入编码序列(如成熟蛋白质的编码序列)或其部分时，必须提供外源转录控制信号，包括ATG起始密码子。另外，起始密码子必须位于正确的读码框内以确保完整插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可以是不同的来源，可以是天然的和合成的。通过包含适于所用细胞系统的增强子，可以增强表达效力(Scharf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-62；Bittner等(1987)酶学方法，153：516-544)。

分泌/定位序列

本发明编码多肽的多核苷酸也可以与编码分泌/定位序列的核酸发生融合例如框内融合，从而将多肽表达靶向至所需的细胞区室，膜或细胞器，或者介导多肽分泌至周质间隙或细胞培养基中。所述序列是本领域技术人员已知的，其包括分泌前导肽，细胞器靶向序列(例如核定位序列，ER滞留信号，线粒体转位序列，叶绿体转位序列)，膜定位/锚着(anchor)序列(如终止转移序列，GPI锚着序列)等。

表达宿主

在其它方面中，本发明涉及含有任何上述核酸、载体或本发明的构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞，酵母细胞或植物细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。通过磷酸钙转染，DEAE-Dextran介导的转染，电穿孔，基因或疫苗枪、注射或其它用于体内、离体或体外方法的普通技术(Davis，L.，Dibner，M和Battey，I.(1986)基本分子生物学方法)，可将构建体引入宿主细胞。

任选根据细胞调节插入序列的表达或按所需方式加工经表达的蛋白质的能力来选择宿主细胞株。蛋白质的所述修饰包括但不限于：乙酰基化，羧基化，糖基化，磷酸化，脂质化和酰基化。裂解蛋白质的“前”或“前原”形式的翻译后加工对于正确插入，折叠和/或行使功能是重要的。对于这种翻译后的活性而言，诸如CHO，HeLa，BHK，MDCK，293，WI38等的不同宿主细胞具有具体的细胞器和特征性的机制，可选择所述宿主细胞以确保正确修饰和加工引入的外源蛋白质。

稳定的表达可用于长期，高产地生产重组蛋白质，。例如，可使用表达载体转导能稳定表达本发明多肽的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。引入载体之后，使细胞在加料的培养基中培养1至2天，然后转移至选择培养基中。选择性标记的目的是赋予抗性以进行选择，它的存在允许对可成功表达所引入序列的细胞的培养和回收。例如，使用适于所述细胞类型的组织培养技术可使被稳定转化的细胞的抗性群(resistant clump)增殖。

任选在适于表达并从细胞培养物中回收编码蛋白质的条件下，培养被编码本发明多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞。根据所用序列和/或载体的不同，由重组细胞产生的蛋白质或其片段可被分泌，与膜结合或包含在细胞内。本领域技术人员应懂得：可设计含有编码本发明多肽的多核苷酸的表达载体，所述载体具有指导成熟多肽通过原核或真核细胞膜的分泌的信号序列。

其它序列

本发明的多核苷酸任选地包含与标记序列(例如便于纯化所编码多肽的序列)在框内融合的编码序列。所述纯化亚序列包括但不限于：允许在固定化的金属上纯化的金属螯合肽如组氨酸-色氨酸组件(module)，与谷胱甘肽结合的序列(如GST)，血凝素(HA)标记(对应于流感病毒血凝素蛋白的表位；Wilson，I.等(1984)细胞37：767)，麦芽糖结合蛋白序列，FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中所用的FLAG表位等。在纯化结构域和多肽序列之间包含可被蛋白酶裂解的多肽接头序列有利于纯化。

例如，可用于本文所述组合物和方法中的一种表达载体提供了融合蛋白的表达，所述融合蛋白含有与多聚组氨酸区域融合的本发明多肽，它们之间被肠激酶裂解位点隔开。组氨酸残基促进在IMIAC(固定化金属离子亲和层析，如Porath等(1992)蛋白质的表达和纯化3：263-281)上纯化，而肠激酶裂解位点提供了从多组氨酸区域分离出所需多肽的方法。pGEX载体(Promega；Madison，WI)可被任选地用于将外源多肽表达成与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶性的，通过吸附至配体-琼脂糖珠(例如，当与GST融合时为谷胱甘肽-琼脂糖)，接着在游离配体的存在下进行洗脱，可以容易地从裂解的细胞中纯化出融合蛋白。

本文所述组合物和方法的其它构建体用于蛋白质，及其编码核酸，例如包括与Ig分子，例如，人IgG Fc(“可结晶片段(fragment crystallizable)”或片段补体结合(fragment complement binding))铰链，CH2区和CH3区(和编码它们的核苷酸序列)融合的本文所述本发明的多肽(或其一个或多个片段)。Fc是抗体的一部分，负责结合细胞上的抗体受体和补体的C1q组分。这些融合蛋白质或其片段及其编码核酸任选地可用于预防性和/或治疗性药物或作为诊断工具(同样参见，例如，Challita-Eid，P.，(1998)J Immunol160：3419-3426；Sturmhoefel，K.，(1999)Cancer Res 59：4964-4972).

多肽生产和回收

转导适当的宿主株并将宿主株培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(例如温度转变或化学试剂诱导)诱导选定的启动子，将细胞再培养一段时间。一般通过离心收集细胞，用物理或化学方法破坏细胞，保留所得粗提取物以进行进一步纯化。可通过任何便利的方法破坏表达蛋白质所用的真核或细菌细胞，包括反复冻融，超声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂或其它方法，所述方法是本领域技术人员众所周知的。

如上所述，很多篇参考文献可用于培养和生产很多种细胞，包括源自细菌，植物，动物(具体是哺乳动物)和古细菌的细胞。参见例如Sambrook，Ausubel和Berger(同上)，以及Freshney(1994)动物细胞培养，基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约和其中提及的参考文献，Doyle和Griffiths(1997)哺乳动物细胞培养：基本技术，John Wiley和Sons，纽约；Humason(1979)动物组织技术，第4版，W.H.Freeman和Company；和Ricciardelli等(1989)体外细胞发育生物学，25：1016-1024。关于植物细胞培养和再生，可参见Payne等(1992)液体系统中的植物细胞和组织培养，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)植物细胞，组织和器官培养；基本方法，Springer实验室手册，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)和植物分子生物学(1993)R.R.D.Croy编，Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K.ISBN 0 12 198370 6。细胞培养基通常可参见Atlas和Parks(编)微生物培养基手册(1993)CRC出版社，Boca Raton，FL。有关细胞培养的其它资料可参见商家提供的文献，例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的生命科学研究，细胞培养目录(“Sigma-LSRCCC”)，和例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的植物培养目录和增补本(“Sigma-PCCS”)。

也可通过本领域众所周知的多种方法中的任一种，从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析(如使用本文所述的任何标记系统)，羟基磷灰石层析和凝集素层析。需要时，在完成成熟蛋白质或其片段的构型时，可以利用蛋白质重折叠步骤。最终，在最后的纯化步骤中可以使用高效液相层析(HPLC)。除了上文提及的参考文献外，多种纯化方法是本领域众所周知的，包括例如Sandana(1997)蛋白质的生物分离，Academic出版公司；和Bollag等(1996)蛋白质方法，第2版，Wiley-Liss，纽约；Walker(1996)蛋白质方法手册，Humana出版社，NJ，Harris和Angal(1990)蛋白质纯化应用：操作方法，牛津IRL出版社，牛津，英国；Harris和Angal，蛋白质纯化方法：操作方法，牛津IRL出版社，牛津，英国；Scopes(1993)蛋白质纯化：原理和实践，第3版，SpringerVerlag，纽约；Janson和Ryden(1998)蛋白质纯化：原理，高分辨率的方法和应用，第2版，Wiley-VCH，纽约；和Walker(1998)CD-ROM版的蛋白质方法，Humana出版社，NJ。

体外表达系统

也可使用本发明的多核苷酸，利用无细胞转录/翻译系统生产本发明的多肽。几种这样的系统可以购得。体外转录和翻译方法的一般性指南可参见Tymms(1995)体外转录和翻译方法：分子生物学方法，第37卷，GarlandPublishing，纽约。

体内用途和应用

编码本发明多肽的多核苷酸，或该多核苷酸的互补序列(包括例如，反义或核酶分子)任选地施用于细胞以便完成治疗上有用的过程或表达治疗上有用的产物。这些体内应用，包括基因治疗，包括多种技术，通过这些技术可改变细胞中的基因表达。例如，所述方法包括引入基因，其用于表达例如在治疗性和/或预防性上有用的多肽诸如本发明的多肽。

体外多肽表达

使用本领域技术人员众所周知的技术，编码本发明多肽的多核苷酸特别适用于体内治疗应用。例如，用至少一种本发明的多核苷酸(DNA或RNA)或/和其它编码例如至少一种抗原、细胞因子、其它共刺激分子，佐剂等的多核苷酸等对所培养的细胞在离体条件下进行改造，然后将经改造的细胞返回至患者体内。也可在体内对细胞进行改造，以便在体内表达一种或多种多肽，所述多肽包括本发明的多肽和/或抗原性肽。

已知多种病毒载体适于生物体的体内转导和表达。所述载体包括逆转录病毒载体(参见Miller(1992)最新微生物学和免疫学论题158：l-24；Salmons和Gunzburg(1993)人类基因治疗4：129-141；Miller等(1994)酶学方法217：581-599)和腺-伴随病毒载体(参见Carter(1992)最新生物技术观点3：533-539；Muzcyzka(1992)最新微生物学和免疫学论题158：97-129)。可以使用的其它病毒载体包括腺病毒载体，疱疹病毒载体和新培斯病毒载体，一般描述于例如Jolly(1994)癌症基因治疗1：51-64；Latchman(1994)分子生物技术2：179-195；和Johanning等(1995)核酸研究23：1495-1501。

一方面，可使用痘病毒载体。用编码本发明的多肽(诸如eIL-2多肽)的多核苷酸序列转染痘病毒载体，且所述痘病毒载体可用于需要改善免疫反应，诸如增加或改善T细胞增殖的预防性，治疗性和诊断性的应用中。参见例如，Berencsi等，J Infect Dis(2001)183(8)：1171-9；Rosenwirth等，Vaccine 2001 Feb 8；19(13-14)：1661-70；Kittlesen等，J Immunol(2000)164(8)：4204-11；Brown等，Gene Ther 20007(19)：1680-9；Kanesa-thasan等，Vaccine(2000)19(4-5)：483-91；Sten(2000)Drug 60(2)：249-71中所公开的病毒载体。包含所述载体和可接受赋形剂的组合物也是本发明的特征。

基因治疗和基因疫苗提供了多种方法用于抵抗慢性传染病(例如HIV感染，病毒性肝炎)，以及非-传染性疾病，包括癌症和一些形式的先天性缺陷，如酶缺陷，所述方法可使用本发明的多核苷酸，包括，例如，包含所述多核苷酸的载体和细胞。已使用了数种方法在体内，离体和体外条件下将本发明的核酸引入细胞，所述方法可使用本发明的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。这些方法包括：基于脂质体的基因传递(liposome basedgene delivery)(Debs和Zhu(1993)WO 93/24640和美国专利5,641,662；Mannino和Gould-Fogerite(1988)生物技术6(7)：682-691；Rose，美国专利5,279,833；Brigham(1991)WO 91/06309；和Felgner等(1987)Proc.NatlAcad.Sci.USA 84：7413-7414)；Brigham等(1989)美国医学科学杂志298：278-281；Nabel等(1990)科学249：1285-1288；Hazinski等(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol 4：206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.NatlAcad.Sci.(USA)84：7851-7855)；腺病毒载体介导的基因传递(adenoviralvector mediated gene delivery)，例如用于治疗癌症(参见例如Chen等(1994)Proc.Natl Acad.Sci.USA 91：3054-3057；Tong等(1996)Gynecol.Oncol.61：175-179；Clayman等(1995)癌症研究5：1-6；O′Malley等(1995)癌症研究55：1080-1085；Hwang等(1995)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.13：7-16；Haddada等(1995)最新微生物学和免疫学论题199(Pt.3)：297-306；Addison等(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA 92：8522-8526；Colak等(1995)脑研究691：76-82；Crystal(1995)科学270：404-410；Elshami等(1996)人类基因治疗7：141-148；Vincent等(1996)神经外科杂志85：648-654)，和很多其它的。另外，已使用复制-缺陷型逆转录病毒载体，其含有治疗性的多核苷酸序列作为逆转录病毒基因组的一部分，其中具体应提及简单的MuLV载体，参见例如Miller等(1990)分子细胞生物学10：4239(1990)；Kolberg(1992)NIH研究杂志4：43，和Cornetta等(1991)人类基因治疗2：215)。另外，还使用了与配体-特异性的，基于阳离子的转运系统相偶联的核酸转运(Wu和Wu(1988)生物化学杂志263：14621-14624)。也已描述了裸露的DNA表达载体(Nabel等(1990)，同上；Wolff等(1990)科学247：1465-1468)。通常，通过将编码本发明多肽核酸掺入适当载体，可以使这些方法适应于本发明。

描述基因治疗方法，通过将本发明的核酸引入患者而适应于本发明的普通教科书包括：Robbins(1996)基因治疗方法，Humana出版社，NJ，和Joyner(1993)基因靶向：操作方法，IRL出版社，牛津，英国。

反义技术

除了表达本发明的核酸作为基因替代核酸外，一旦或当细胞中不再需要表达所述核酸时，所述核酸还可用于有义和反义地抑制表达，例如下调本发明核酸的表达。类似地，也可使用本发明的核酸，或其亚序列或反义序列阻断天然存在的同源性核酸的表达。多种有义和反义技术是本领域已知的，例如可参见Nellen(1997)反义技术：操作方法，IRL出版社，牛津大学，牛津，英国和Agrawal(1996)反义治疗剂Humana出版社，NJ和其中提及的参考文献。

用作探针

本文还预期了一般具有至少12个碱基，优选至少15个碱基，更优选至少20，至少30或至少50个碱基的多核苷酸(本文也称之为寡核苷酸)的用途，所述多核苷酸能在至少高度严谨的条件下与本发明的多核苷酸，或其片段杂交。根据上述文献中所述的方法，所述多核苷酸可用作探针，引物，有义和反义试剂等。

核酸杂交

当核酸相互结合(一般在溶液中进行)时即为“杂交”。核酸杂交是由于多种已确定的物理-化学力，如氢键，溶剂排斥，碱基堆积等。有关核酸杂交的详尽指导可参见Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交，第I部分，第2章，“杂交原理和核酸探针受试策略综述”，以及Ausubel，同上。Hames和Higgins(1995)基因探针1，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(Hames和Higgins 1)和Hames与Higgins(1995)基因探针2，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(Hames和Higgins2)提供了有关合成、标记、检测和定量DNA和RNA包括寡核苷酸的细节。

两种核酸序列基本上同一的指标是两种分子在至少严谨条件下彼此杂交。术语“特异性杂交”是指当序列存在于(例如，总细胞)DNA或RNA复合混合物中时，在严谨条件下，分子仅于具体核苷酸序列结合，形成双链，或杂交。“基本上结合”是指探针核酸和靶核酸之间的互补杂交，且包含可通过降低杂交介质的严谨度以便实现靶多核苷酸序列所需检测而进行调节的较小错配。

在核酸杂交实验，如Southern和Northern杂交的上下文中“严谨杂交洗涤条件”和“严谨杂交条件”取决于序列，在不同的环境参数下也是不同的。有关核酸杂交的详尽指导可参见Tijssen(1993)，同上和Hames和Higgins 1与Hames和Higgins 2，同上。

为了本发明的目的，通常将“高度严谨的”杂交和洗涤条件选定为在确定的离子强度和pH下比具体序列的热解链温度(T_m)低约5℃或更低(如下文所述，也可以用相当的术语描述高度严谨的条件)。T_m是50％的受试序列与精确匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。换言之，T_m是核酸双链体在给定条件下其50％发生变性的温度，该温度可代表对核酸杂合体稳定性的直接测定。因此，T_m相当于从螺旋到随机卷曲的转变中点所对应的温度；对于长的核苷酸序列片段而言，它取决于长度，核苷酸组成和离子强度。一般而言，在“严谨条件”下，探针将与其靶序列杂交，而不与其它序列杂交。“非常严谨的条件”被选定为与具体探针的T_m相等。

杂交之后，可通过一系列的洗涤去除未杂交的核酸物质，可根据所需结果调整洗涤的严谨度。低严谨度的洗涤条件(例如使用较高的盐浓度和较低的温度)增加敏感性，但可产生非特异性杂交信号和较强的背景信号。较高严谨度的条件(例如使用较低的盐浓度和接近杂交温度的较高温度)能降低背景信号，一般仅留下特异性信号。参见Rapley，R和Walker，J.M编，分子生物学方法手册(Humana出版公司1998)(下文称之为“Rapley和Walker”)，其全文列入本文作为参考。

使用公式(1)可估计DNA-DNA双链体的T_m：

T_m(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是单价阳离子(通常是Na+)的重量摩尔浓度，(％G+C)是鸟苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲酰胺的百分比，n是杂合体的核苷酸碱基数目(即长度)，参见Rapley和Walker，同上。

采用公式(2)可估计RNA-DNA双链体的T_m：

T_m(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)²-0.56(％f)-820/n，其中M是单价阳离子(通常是Na+)的重量摩尔浓度，(％G+C)是鸟苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲酰胺的百分比，n是杂合体的核苷酸碱基数目(即长度)，同上。等式1和2一般仅对长于100-200个核苷酸的杂合双链体准确，同上。

可按下式估计短于50个核苷酸的核酸序列的T_m：

T_m(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，

其中A(腺嘌呤)，C，T(胸腺嘧啶)和G是相应核苷酸的数目。

在Southern或Northern印迹中的滤膜上使具有100个以上互补残基的互补核酸杂交的严谨杂交条件例子是：在含1mg肝素的50％福尔马林中，42℃杂交过夜。严谨洗涤条件的例子是：0.2×SSC，65℃洗涤15分钟(有关SSC缓冲液的描述可参见Sambrook，同上)。经常先用低严谨度的洗涤然后以高严谨度的洗涤，去除背景探针信号。低严谨度洗涤的例子是2xSSC，40℃洗涤15分钟。高严谨度洗涤的例子是0.15M NaCl，72℃洗涤15分钟。双链体例如超过100个核苷酸的中等严谨度洗涤的例子是1xSSC，45℃洗涤15分钟。对于双链体(例如，大于100个核苷酸)的低严谨洗涤的实例是4-6xSSC，40℃15分钟。对于短探针(例如，约10个-50个核苷酸)而言，严谨条件通常包括，盐浓度小于约1.0M Na⁺离子，通常是约0.01-1.0M Na⁺离子浓度(或其它盐)，pH 7.0-8.3，和温度通常至少约30℃.严谨条件还可通过加入去稳定剂诸如甲酰胺而实现。

通常，在具体的杂交受试中，如果利用不相关探针时观察到2.5×-5×(或更高)的信号噪声比，则表明检测到特异性杂交。在本发明的上下文中，检测到两个序列之间至少严谨的杂交则表明：与例如本文序列表中提供的本发明的核酸相比具有相对较高的结构相似性或同源性。

如上所述，将“高度严谨的”条件选定为比具体序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(T_m)低约5℃或更低。可在高度严谨的条件下鉴定与感兴趣的核苷酸序列(例如“探针”)密切相关或相同的靶序列。较低严谨度的条件适用于互补性较差的序列，参见例如Raoley和Walker，同上。

可使用比较性杂交(comparative hybridization)来鉴定本发明的核酸，这种比较性杂交法是区分本发明核酸的优选方法。在本发明的上下文中，检测到两个序列之间高度严谨的杂交表明：与例如本文序列表中提供的核酸相比具有相对较高的结构相似性/同源性。两个核苷酸序列之间高度严谨的杂交表明了比通过严谨杂交条件检测到的更高的结构、核苷酸碱基组成、排列或顺序的相似性或同源性水平。具体是，在本发明的上下文中，检测到高度严谨的杂交表明：与例如本文序列表中提供的核酸相比具有较高的结构相似性或结构同源性(例如核苷酸结构，碱基组成，排列或顺序)。例如，需要鉴定能在严谨条件下与本文所例举的核酸杂交的受试核酸。

因此，对严谨条件的一个衡量标准是：能在高度严谨的条件(或很严谨的条件，或超-高度严谨的杂交条件，或超-超-高度严谨的杂交条件)下，与本发明所列核酸(例如核酸序列SEQ ID NO：16-30，及其互补多核苷酸序列)之一杂交。对任何受试核酸而言，都可凭经验容易地确定严谨条件(包括例如高度严谨，超-高度严谨或超-超-高度严谨的杂交条件)和洗涤条件。

例如，在确定高度严谨的杂交和洗涤条件时，可逐渐提高杂交和洗涤条件(例如通过在杂交或洗涤过程中升高温度，降低盐浓度，提高去污剂浓度和/或提高有机溶剂如福尔马林的浓度)，直至达到一套选定的标准。例如，逐渐提高杂交和洗涤条件，直至探针(包含一种或多种选自SEQ ID NO：16-30的核酸序列，和其互补多核苷酸序列)能结合精确匹配的互补靶(该靶核酸同样含有一种或多种选自SEQ ID NO：16-30及其互补多核苷酸序列的核酸序列)，此时的信号噪声为所述探针与不匹配的靶杂交时的相应数值的至少2.5×，任选5×于或更高倍。此时，不匹配的靶是对应于已知α干扰素核酸序列(例如递交本申请时，如GenBank^TM的公共数据库中存在的α干扰素核酸序列)的核酸。

在如下情况下可以说受试核酸与探针核酸特异性杂交：当受试核酸与探针核酸的杂交程度为探针与精确匹配的互补靶的杂交程度的至少1/2，即信号噪声比探针与所述靶在一定条件下杂交时的至少1/2时，其中在所述杂交的条件下，精确匹配的探针与精确匹配的互补靶结合，其信号噪声为该探针与任何不匹配的靶核酸诸如上述已知的干扰素-α核酸序列杂交时所观测到的相应数值的至少约2.5倍-10倍，一般5倍-10倍。对于一些所述核酸而言，选择严谨条件以便使与编码寡核苷酸精确互补的寡核苷酸与该编码寡核苷酸杂交时的信号噪声比与完全互补性寡核苷酸与对应于上述已知干扰素-α序列的对照核酸杂交时的信号噪声比相比高至少5倍。

超-高度严谨的杂交和洗涤条件是如下所述的条件，其中提高杂交和洗涤条件的严谨度，直至探针与精确匹配的互补靶核酸结合的信号噪声比为该探针与任何不匹配的靶核酸诸如上述已知的干扰素-α核酸序列杂交时所观测到的相应数值的至少10倍。如果靶核酸能在这种条件下与探针杂交，且信号噪声比为至少为精确匹配的互补靶核酸的1/2，即可以说该靶核酸与探针能在超-高度严谨的条件下结合。

类似地，通过逐渐提高相关杂交受试的杂交和/或洗涤条件，可以确定甚至更高的严谨水平。例如，那些其中杂交和洗涤条件的严谨度被提高直至探针与精确匹配的互补靶核酸结合的信号噪声比为探针与任何不匹配的靶核酸诸如上述已知的干扰素-α核酸序列杂交时所观测到的相应数值的至少10倍，20倍，50倍，100倍或500倍或更高倍。如果靶核酸能在这种条件下与探针杂交，且信号噪声比为精确匹配的互补靶核酸的至少1/2，即可以说该靶核酸与探针能在超-超-高度严谨的条件下结合。

能在高度，超-高度和超-超-高度严谨条件下与SEQ ID NO：16-30所示核酸杂交的靶核酸是本发明的特征。所述核酸的例子包括与给定核酸序列相比，具有一个或一些沉默或保守核酸取代的核酸。

用于序列重组的底物和形式

本发明的多核苷酸和其片段除除可用于标准克隆方法(例如，Ausubel，Berger和Sambrook所述)中，可任选地被用作任何多种重组和重复序列重组反应的底物，例如制备编码具有所需特性的多肽的其它多核苷酸的用途之外，。多种所述反应是已知的，包括发明人和其工作伙伴所发展的那些反应。

用于产生和鉴定具有一种或多种本文所述特性的分子的多种多样性生成方法(diversity generating protocol)可从现有技术中获得，并在现有技术中得到描述。该方法可分开，和/或联合使用以制备核酸或一组核酸的一种或多种变体，以及所编码多肽的变体。独立地或全体地，这些方法提供了生成多样化核酸和核酸组(包括，例如核酸文库)的稳定的(robust)，广泛适用的方式，所述核酸和核酸组例如可用于具有新的和/或改进特性的核酸，蛋白质，通路，细胞和/或生物体改造或快速进化。虽然在确保描述清楚性的过程中会进行区别和分类，应当理解所述技术通常不是相互排斥的。事实上，所述多种方法可单独或联合(平行或依次)使用以评估多样性序列序列变体。

本文所述任何多样性生成方法的结果可以是产生一种或多种核酸，其可从中选出或筛选出具有或显示所需特性的核酸，或编码具有或赋予所需特性的蛋白质。通过对本文所述或本领域技术人员可得到的一种或多种方法的多样化之后，可根据所需活性或特性对制备的任何核酸进行选择，该所需活性或特性例如对干扰素-α受体改变的结合亲和力，改变的抗病毒或抗增殖活性，诱导T_H1分化的改变的能力，诱导或抑制细胞因子产生的改变的能力。其可包括通过本领域的任何测定法和此处或以下实施例章节所述本发明的测定法鉴定可检测的任何活性，例如，以自动化或可自动化的形式。在实施者的判断下，可评估所述相关(或甚至不相关的)特性(平行或依次)。

在下列出版物和其中引用的参考文献中描述了多种用于产生经修饰的、编码本文多肽的核酸序列的多样性生成方法：Soong，N.et al.(2000)“Molecular breeding of viruses”Nat Genet 25(4)：436-439；Stemmer，et al.(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties”TumorTargeting 4：1-4；Ness et al.(1999)“DNA Shuffling of subgenomic sequences ofsubtilisin”Nature Biotechnology 17：893-896；Chang et al.(1999)“Evolution ofa cytokine using DNA fmily shuffling”Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull and Stemmer(1999)“Protein evolution by molecular breeding”Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians et al.(1999)“Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNAfamily shuffling”Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri et a1.(1998)“DNAshuffling of a family of genes from diverse species accelerates directedevolution”Nature 391：288-291；Crameri et al.(1997)“Molecular evolution of anarsenate detoxification pathway by DNA shuffling，”Nature Biotechnology15：436-438；Zhang et al.(1997)“Directed evolution of an effective fucosidasefrom a galactosidase by DNA shuffling and screening”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten et al.(1997)“Applications of DNA Shuffling toPharmaceuticals and Vaccines”Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri et al.(1996)“Construction and evolution of antibody-phage libraries byDNA shuffling”Nature Medicine 2：100-103；Crameri et al.(1996)“Improvedgreen fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”NatureBiotechnology 14：315-319；Gates et al.(1996)“Affinity selective isolation ofligands from peptide libraries through display on a lac repressor′headpiecedimer′”Joumal of Molecular Biology 255：373-386；Stemmer(1996)“SexualPCR and Assembly PCR”In：The Encyclopedia of Molecular Biology.VCHPublishers，New York.pp.447-457；Crameri and Stemmer(1995)“Combinatorialmultiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant andwildtype cassettes”BioTechniques 18：194-195；Stemmer et al.，(1995)“Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers ofoligodeoxy-ribonucleotides”Gene，164：49-53；Stemmer(1995)“The Evolutionof Molecular Computation”Science 270：1510；Stemmer(1995)“SearchingSequence Space”Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolutionof a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370：389-391；and Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitrorecombination for molecular evolution.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751。

本文所使用的术语“改组”是指非同一性序列间的重组，在一些情况下，改组可包括借助同源重组或借助非同源重组的，诸如借助cre/lox和/或flp/frt系统的交换。改组可通过采用多种不同的形式来实施，所述形式包括例如，体外和体内改组形式，in silico改组形式，使用双链或单链模板的改组形式，基于引物的改组形式，基于核酸片段化的改组形式，和寡核苷酸介导的改组形式，所有这些均基于非同一性序列间的重组事件，在本文以下内容将给出更详细的描述或参考，以及其它相似的基于重组的形式。

产生多样性的诱变方法包括例如定点诱变(Ling et al.(1997)“Approaches to DNA mutagenesis：an overview”Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale et al.(1996)“Oligonucleotide-directed random mutagenesis usingthe phosphorothioate method”Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith(1985)“Invitro mutagenesis”Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein & Shortle(1985)“Strategies and applications of in Vitro mutagenesis”Science 229：1193-1201；Carter(1986)“Site-directed mutagenesis”Biochem.J.237：1-7；and Kunkel(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”in NucleicAcids & Molecular Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；利用含尿嘧啶模板的诱变(Kunkel(1985)“Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel et al.(1987)“Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection”Methods in Enzymol.154，367-382；and Bass et al.(1988)“Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities”Science  242：240-245)；寡核苷酸介导的诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)(Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller & Smith(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficientand general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment”Nucleic Acids Res.10：6487-6500；Zoller & Smith(l983)“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors”Methods in Enzymol.100：468-500；and Zoller & Smith(1987)“Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template”Methods inEnzymol.154：329-350)；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(phosphorothioate-modified DNA mutagenesis)(Taylor et al.(1985)“The useof phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA”Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor et al.(1985)“The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye & Eckstein(1986)“Inhibition of restriction endonuclease Nci Icleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayerset al.(1988)“Y-T Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Acids Res.16：791-802；and Sayerset al.(1988)“Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA byreaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res.16：803-814)；使用缺口双链体DNA的诱变(mutagenesisusing gapped duplex DNA)(Kramer et al.(1984)“The gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed mutation construction”Nucl.Acids Res.12：9441-9456；Kramer & Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directed construction of mutations Via gapped duplex DNA”154：350-367；Kramer et al.(1988)“Improved enzymatic in vitro reactions in thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction ofmutations”Nucl.Acids Res.16：7207；and Fritz et al.(1988)“Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro”Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。

其它适当的方法包括点错配修复(point mismatch repair)(Kramer等(1984)″Point Mismatch Repai，″Cell 38：879-887)，使用修复-缺损宿主株的诱变(mutagenesis using repair-deficient host strain)(Carter等(1985)″Improved oligonucleotidesite-directed mutagenesis using M13 vectors，″Nucl.Acids Res.13：4431-4443；和Carter(1987)″Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13vectors，″Results Probl.Cell Differ.154：382-403)，缺失诱变(deletionmutagenesis)(Eghtedarzadeh & Henikoff(1986)″Use of oligonucleotides togenerate large deletions，″Nucl.Acids Res.14：5115)，限制性-选择和限制性-选择与限制性-纯化(restriction-selection and restriction-purification)(Wells等(1986)″Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition stateof subtilisin，″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，通过总基因合成进行诱变(mutagenesis by total gene synthesis)(Nambiar等(1984)″Total synthesisand cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein，″Science 223：1299-1301；Sakamar和Khorana(1988)″Total synthesis and expression of agene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-bindingprotein(transducing)，″Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells等(1985)″Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutationsat defined sites，″Gene 34：315323；和Grundstrom等(1985)″Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis，″Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双链断裂修复(double-strand breakrepair)(Mandecki(1986)″Oligonucleotide-directed double-strand break repair inplasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，″Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，83：7177-7181)。有关多种上述方法的其它细节可参见：Methods in Enzymology，Vol.154，其中还描述了对多种诱变方法中麻烦的问题的有用控制。

有关多样性生成方法的其它细节可见于下列美国专利，PCT公开和申请和EP申请：Stemmer的美国专利5,605,793(1997年2月25日)，“体外重组法”；Stemmer等的美国专利5,811,238(1998年9月22日)，“通过重复选择和重组产生具有所需特征的多核苷酸的方法”；Stemmer等的美国专利5,830,721(1998年11月3日)，“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变”；Stemmer的美国专利5,834,252(1998年11月10日)，“末端互补的聚合酶反应”；Minshull的美国专利5,837,458(1998年11月17日)，“细胞和代谢工程的方法和组合物”；WO 95/22625，Stemmer和Crameri，“通过随机片段化和重新装配进行诱变”；WO 96/33207，Stemmer和Lipschutz，“末端互补的聚合酶链反应”；WO 97/20078，Stemmer和Crameri，“通过重复选择和重组产生具有所需特征的多核苷酸的方法”；WO 97/35966，Minshull和Stemmer，“细胞和代谢工程的方法和组合物”；WO 99/41402，Punnonen等，“基因疫苗载体的靶向”；WO 99/41383，Punnonen等，“抗原文库免疫”；WO99/41369，Punnonen等，“基因疫苗载体工程”；WO 99/41368，Punnonen等，“基因疫苗免疫调制特性的最优化”；EP 752008，Stemmer和Crameri，“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变”；EP 0932670，Stemmer，“通过回归序列重组改变细胞DNA摄入”；WO 99/23107，Stemmer等，“通过病毒基因组改组修饰病毒嗜性和宿主范围”；WO 99/21979，Apt等，“人乳头瘤病毒载体”；WO 98/31837，Del Cardayre等，“通过回归序列重组改变整个细胞和生物体”；WO 98/27230，Patten和Stemmer，“多肽工程的方法和组合物”；EP 0946755，Patten和Stemmer，“多肽工程的方法和组合物”；和WO 98/13487，Stemmer等，“通过回归序列改组和选择最优化基因治疗的方法”；WO 00/00632，“产生高度多样性文库的方法”；WO 00/09679，“获得经体外重组的多核苷酸序列库的方法和所得序列”；WO 98/42832，Arnold等，“使用随机或确定的引物重组多核苷酸序列”；WO 99/29902，Arnold等，“产生多核苷酸和多肽序列的方法”；WO 98/41653，Vind，“构建DNA文库的体外方法”；WO 98/41622，Borchert等，“使用DNA改组构建文库的方法”；和WO 98/42727，Pati和Zarling，“使用同源重组改变序列”。WO00/18906，Patten等，“Shuffling of Codon-Altered Genes”；WO 00/04190，del Cardayre等，“Evolution of Whole Cells and Oanisms by RecursiveRecombination”；WO 00/42561，Crameri等，“Oligonucleotide Mediated NucleicAcid Recombination”；WO 00/42559，Selifonov和Stemmer“Methods ofPopulating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations”；WO00/42560，Selifbnov等，“Methods for Making Character Strings，Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics”；PCT/US00/26708，Welch等，“Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesisfor Synthetic Shuffiing”；和PCT/US01/06775“Single-Stranded Nucleic AcidTemplate-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation”，Affholter。

数种不同的常见种类的序列修饰方法，诸如突变，重组等可用于本发明，并例如在上述和下述的参考文件中说明。以下举例说明了用于本发明中多样性生成的优选形式的一些不同类型，包括例如，基于具体重组的多样性生成方式。

核酸可通过上述参考文件中所述多种技术之一在体外重组，所述技术包括例如，待重组的核酸的DNAse消化，然后是核酸的连接和/或PCR再组装。例如，可使用有性PCR诱变(sexual PCR mutagenesis)，其中首先进行DNA分子的随机(或伪随机，或甚至非随机)片段化，然后基于序列相似性，在DNA分子与不同但相关的DNA序列之间进行体外重组，通过在聚合酶链式反应中的扩增进行交换体(crossover)的固定。该方法和多种方法变体见上述一些上述参考文件中，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751中。

相似地，核酸可在体内重复重组，例如，通过使细胞中的核酸间发生重组。上述参考文件中列出了多种所述体内重组形式。所述形式任选地提供了兴趣核酸间的直接重组，或提供了包含兴趣核酸的载体，病毒，质粒等间的重组，以及其它形式。关于所述方法的细节可见于上述参考文件中。

还可使用全基因组重组法，其中细胞或其它生物体的完整基因组被重组，任选包括掺加具有所需文库成分(例如对应于本发明途径的基因)的基因组重组混合物。这些方法具有多种用途，包括其中靶基因的鉴定是未知的那些方法。所述方法的细节可见于，例如，Cardayre等的WO 98/31837，“Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive SequenceRecombination”；和例如，del Cardayre等的PCT/US99/15972，以及题目为“Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive SequenceRecombination”中。

还可使用合成重组法，其中在PCR或连接反应中合成并再组装对应于兴趣靶的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括对应于一个以上亲代核酸的寡核苷酸，从而产生新的重组核酸。可通过标准的核苷酸添加法，或通过例如三-核苷酸合成法制备寡核苷酸。关于所述方法的细节可见于上述参考文件，例如包括，Crameri等的WO 00/42561，“Olgonucleotide Mediated Nucleic AcidRecombination”；Welch等的PCT/US00/26708，“Use of Codon-VariedOligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling”；Selifonov等的WO00/42560，“Methods for Making Character Strings，Polynucleotides andPolypeptides Having Desired Characteristics”；和Selifonov和Stemmer的WO00/42559，“Methods of Populating Data Structures for Use in EvolutionarySimulations”。

可实施in silico重组法，其中在计算机中使用遗传学算法，以重组对应于同源(或甚至非-同源)核酸的序列串(string)。通过合成对应于经重组的序列的核酸，例如联用寡核苷酸合成/基因重装配技术，而将所得经重组的序列串任选地转变为核酸。该方法可产生随机的，部分随机的或经设计的变体。关于in silico重组(包括在计算机系统中使用遗传学算法，遗传操作者(genetic operator)等，联合相应核酸(和/或蛋白质)的生成，以及经设计的核酸和/或蛋白质(例如，基于交叉位点选择)的组合以及经设计的，伪随机或随机重组方法的描述可见于Selifonov等的WO 00/42560，“Methods forMaking Character Strings，Polynucleotides and Polypeptides Having DesiredCharacteristics”以及Selifonov和Stemmer的WO 00/42559，“Methods ofPopulating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations”。关于in silico重组法的大量细节可见于这些申请中。该方法一般可适用于本发明以便提供in silico分子重组和/或相应核酸或蛋白质的生成。

可以相似地使用评估天然多样性的多种方法，例如，通过多种核酸或核酸片段与单链模板的杂交，然后聚合和/或连接以再生成全长序列，任选地随后降解模板并回收得到的修饰核酸。在一种使用单链模板的方法中，使源自基因组文库的片段群体与对应于相反链的部分，或经常是约全长的ssDNA或RNA退火。由该群体装配复杂的嵌合基因是由以下过程来介导的：基于核酶去除未杂交的片段末端，聚合化以补平这些片段之间的缺口，随后进行单链连接。亲代多核苷酸链可通过以下过程去除：消化(如果是RNA或含有尿嘧啶)，在变性条件下进行磁分离(如果以有助于这种分离的方式进行标记)或其它可以使用的分离/纯化方法。或者，任选将亲代链与嵌合链一起纯化，在随后的筛选并加工步骤中被去除。关于该方法的其它细节可见于，例如，Affholter的“Single-Stranded Nucleic Acid Template-MediatedRecombination and Nucleic Acid Fragment Isolation”，PCT/US01/06775中。

在其它方法中，单链分子被转化为双链DNA(dsDNA)，然后通过配体介导结合将dsDNA分子结合至固体支持物上。在分离未结合的DNA之后，所选的DNA分子从支持物上释放并被引入适宜的宿主细胞中来产生富集与探针杂交的序列的文库。以该方式制备的文库提供了用于采用本文所述任何方法进一步多样化所需的底物。

任何前述一般重组形式可用反复实施(例如，突变/重组或其它多样性生成方法的一个或多个循环，任选随后进行一种或多种选择方法)以生成更多样的重组核酸组。

也建议采用多核苷酸链终止法来进行诱变(参见例如，Short的美国专利序号5,965,408，“Method of DNA reassembly by interrupting synthesis”，和上述参考文献)，并可用于本发明。在此方法中，在存在或缺乏基因特异性引物时，使对应于一种或多种共享序列相似性区域的基因的双链DNA混合并变性。然后使单链多核苷酸退火，并在聚合酶和链终止试剂(如紫外线，γ或X射线照射；溴化乙锭或其它嵌入剂；DNA结合蛋白，如单链结合蛋白，转录激活因子或组蛋白；多环芳烃；三价铬或三价铬盐；或由快速热循环介导的短缩的聚合作用(abbreviated polymerization mediated by rapidthermocycling)等)的存在下保温，导致部分双链体分子产生。然后在接下来的多轮复制或部分复制中使所述部分双链体分子(例如含有部分延伸的链)变性并重新退火，导致产生共享不同程度的序列相似性并且相对于最初的DNA分子群体而言为多样化的多核苷酸。任选地，该产物或该产物的部分集合，可在该过程的一个或多个阶段被扩增。通过链终止方法(诸如上述的)制备的多核苷酸是适用于任何其它所述重组形式的底物。

还可以使用Ostermeier等(1999)″A combinatorial approach to hybridenzymes independent of DNA homology″Nature Biotech.17：1205中命名为“用于产生杂合酶的增量截短”(“ITCHY”)中所述的重组方法在核酸或核酸群中产生多样性。该方法可用于生成初始变体文库，所述变体可任选地作为一种或多种体外或体内重组方法的底物。同样参见Ostermeier，(1999)“Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：3562-67；Ostermeier，(1999)，“Incremental Truncation asa Strategy in the Engineering of new Biocatalysts，”Biological和MedicinalChemistry.7：2139-44.

导致各核苷酸或连续或非连续核苷酸群改变的突变方法可有利地用于引入核苷酸多样性。多种诱变方法可见于上述参考文件中；关于诱变方法的其它详细描述如下述，其也可用于本发明。例如，易错(error-prone)PCR可用于生成核酸变体。使用该技术，在DNA聚合酶的复制可信度较低的条件下进行PCR，使得沿着全长PCR产物可获得高频率的点突变。这种技术的例子可参见上述参考文献，例见Leung等(1989)Technique 1：11-15和Caldwell等(1992)PCR Methods Applic.2：28-33。类似地，在涉及由小DNA片段的混合物装配PCR产物的方法中，可以使用组装(assembly)PCR。可以平行地在相同反应混合物中进行多个不同的PCR反应，用一个反应的产物引发另一个反应的产物。

在兴趣核酸序列中引入位点-特异性突变的方法中可以使用寡核苷酸介导的诱变(oligonucleotide directed mutagenesis)。这种技术的例子可参见上述参考文献，例如Reidhaar-Olson等(1988)Science，241：53-57。类似地，盒式诱变可用于用合成的寡核苷酸盒替代双链DNA分子的小区域的方法中，所述寡核苷酸盒不同于天然序列。该寡核苷酸可含有例如完整的和/或部分随机化的天然序列。

可以使用反复总体诱变(recursive ensemble mutagenesis)，其中使用蛋白质诱变算法产生表型相关的突变体的多种群体，所述群体成员的氨基酸序列有所不同。该方法使用反馈机制监测连续多轮组合盒式诱变。该方法的例子见于Arkin & Youvan(1992)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：7811-7815。可以使用指数型总体诱变(exponential ensemble mutagenesis)以产生具有高百分比的独特、功能性突变体的组合文库。兴趣序列中的一小组残基被平行地随机化，以鉴定出每个有所变化的位置处导致产生功能性蛋白质的氨基酸。这种方法的例子可参见Delegrave & Youvan(1993)BiotechnologyResearch 11：1548-1552。

体内诱变可用于在任何克隆的兴趣DNA中产生随机突变的方法，所述方法通过在例如大肠杆菌菌株中增殖所述DNA来进行，所述菌株携带一个或多个DNA修复途径中的突变。相对于野生型亲代而言，这些“增变株”具有较高的随机突变率。在其中一个菌株中增殖所述DNA最终将在该DNA内产生随机突变。所述方法可见于上述参考文件。

在基因组如细菌，真菌，动物或植物基因组中引入多样性的其它方法可以与上述和/或参照方法联合使用。例如，除了上述方法外，还建议使用能产生适于被转化入多个物种的核酸多聚体的技术(参见例如Schellenberger的美国专利5,756,316和上述参考文献)。用彼此趋异的(例如由天然多样性造成衍生或通过使用定点诱变，易错PCR，经诱变性细菌菌株传代等)基因组成的这种嵌合多聚体转化适当宿主，可以提供核酸多样性来源以使DNA多样化，例如，通过如上述的体内重组方法。

或者，可将共享部分序列相似性区域的多种单体多核苷酸转化至宿主种类中，并由宿主细胞在体内进行重组。可以使用接下来的多轮细胞分裂产生文库，所述文库的成员含有单一，同源的单体多核苷酸群体或集合(poo1)。或者，可通过标准技术例如，PCR和/或克隆回收单体核酸，并以上述任何重组形式包括回归重组形式进行重组。

生成多物种表达文库的方法已被公开(除上述参考文件外，参见例如，Peterson等，(1998)，美国专利序号5,783,431“METHODS FORGENERATING和SCREENING NEW METABOLIC PATHWAYS”，和Thompson等，(1998)美国专利序号5,824,485，METHODS FORGENERATING和SCREENING新的METABOLIC PATHWAYS)且其用于鉴定蛋白质的兴趣活性的用途已公开(除上述参考文件外，参见Short(1999)美国专利序号5,958,672“PROTEIN ACTIVITY SCREENING OF CLONESHAVING DNA FROM UNCULTIVATED MICROORGANISMS”)。一般说来，多物种表达文库包含来自多个物种或菌株的cDNA或基因组序列，所述序列在表达盒中与适当的调节序列可操作相连。任选将cDNA和/或基因组序列随机连接以进一步增加多样性。载体可以是适于转化不止一种宿主生物体(如细菌种类、真核细胞)并在其中表达的穿梭载体。在一些情况下，通过预先选择编码兴趣蛋白质，或与兴趣核酸杂交的序列而使文库具有偏倚性。任何此类文库都可成为本文所述任何方法的底物。

上述方法已经很大程度地涉及增加核酸和/或所编码蛋白质的多样性。然而，在多种情况下，并非所有多样性(例如，功能性)是可用的，并可仅有助于增加必须被筛选或选择的变体的背景以鉴定少数适宜变体。在一些应用中，在多样化(例如，通过基于重组的诱变方法)之前需要预先选择或预先筛选文库(例如扩增的文库，基因组文库，cDNA文库，标准化文库等)或其它底物核酸，或者使底物偏向于编码功能性产物的核酸。例如，在对抗体进行改造时，可以在通过任何所述方法进行操作之前，利用体内重组事件使多样性生成法偏向于具有功能性抗原结合位点的抗体。例如，在根据本文所述任何方法进行多样化之前，可以扩增得自B细胞cDNA文库的重组CDR，并将其组装至框架区域(例如，Jirholt等，(1998)“Exploiting sequencespace：shuffing in vivo formed complementarity determining regions into amaster framework”Gene 215：471)。

文库可以偏向编码具有所需活性的蛋白质的核酸。例如，从文库中鉴定出显示具体活性的克隆之后，可使用任何已知的引入DNA变化的方法诱变克隆。然后筛选含有经诱变的同系物的文库中所需活性，所述活性可以与最初的具体活性相同或不同。所述方法的一个实例可见于Short(1999)美国专利序号5,939,250，“PRODUCTION OF ENZYMES HAVING DESIREDACTIVITIES BY MUTAGENESIS”。可通过本领域已知的任何方法鉴定所需活性。例如，WO99/10539提到：通过混合来自基因文库的提取物以及得自代谢旺盛细胞的组分，并鉴定表现出所需活性的组合，即可筛选基因文库。也有人提出(例如WO98/58085)：通过将具有生物活性的底物插入文库样品，并使用荧光分析仪，例如流式细胞仪，CCD，荧光计或分光光度计检测对应于具有所需活性之产物的生物活性荧光，即可鉴定出具有所需活性的克隆。

文库也可偏向具有具体特征的核酸，例如与选定的核酸探针杂交的核酸。例如，申请WO99/10539提出：可以按下述方法从基因组DNA序列中鉴定出编码所需活性(例如酶活性，如脂酶，酯酶，蛋白酶，糖苷酶，糖基转移酶，磷酸酶，激酶，加氧酶，过氧化物酶，水解酶，水合酶，腈水解酶(nitrilase)，转氨酶，酰胺酶或酰基转移酶)的多核苷酸。使基因组DNA群体中的单链DNA分子同与配体-偶联的探针杂交。基因组DNA可得自经培养或未经培养的微生物，或得自环境样品。或者，基因组DNA可得自多细胞生物或来源于其的组织。可以直接由捕获中所用的杂交探针进行第二链的合成，其中所述探针预先可以从捕获介质上释放也可以不释放，或者也可通过本领域已知的多种其它策略合成第二链。或者，可以使分离的单链基因组DNA群体片段化，而不进行进一步的克隆，并将它们直接用于例如基于-重组的方法，所述方法使用单链模板，如上述。

产生核酸和多肽的“非-随机”方法描述于Short“Non-StochasticGeneration of Genetic Vaccines和Enzymes”，WO 00/46344中。包括所述非-随机多核苷酸重组装(non-stochastic polynucleotide reassembly)以及位点饱和的诱变(site-saturation mutagenesis)的此类方法也可用于本发明。以及本文所述的合成连接多核苷酸重装配法也可用于本发明。使用添加或简并寡核苷酸的随机或半-随机诱变也被公开于，例如，Arkin和Youvan(1992)″Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids forsemi-random mutagenesis″Biotechnology 10：297-300；Reidhaar-Olson，(1991)″Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotidecassettes″Methods Enzymol.208：564-86；Lim和Sauer(1991)″The role ofinternal packing interactions in determining the structure和stability of a protein″J.Mol.Biol.219：359-76；Breyer和Sauer(1989)″Mutational analysis of the finespecificity of binding of monoclonal antibody 51F to lambda repressor″J.Biol.Chem.264：13355-60)；和″Walk-Through Mutagenesis″(Crea，R；美国专利5,830,650和5,798,208，和EP专利0527809B1中。

应当理解适用于在多样化之前富集文库的任何上述技术也可被用于筛选通过多样性生成方法制备的产物或产物文库。

用于诱变，文库构建和其它多样性生成方法的试剂盒也是可以商购的。例如，试剂盒可购自例如，Stratagene(如QuickChange^TM定点诱变试剂盒；和Chameleon^TM双链，定点诱变试剂盒)，Bio/Can Scientific，Bio-Rad(例如使用上述Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.，Clonetech Laboratories，DNATechnologies，Epicentre Technologies(如5prime 3prime试剂盒)；Genpak Inc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs，PharmaciaBiotech，Promega Corp.，Quantum Biotechnologies，Amersham International plc(例如使用上述Eckstein法)和Anglian Biotechnology Ltd(例如使用上述Carter/Winter法)。

上述参考文件提供了多种突变形式，包括重组，反复重组，反复突变，和与其它诱变形式的组合和重组，以及该形式的多种修饰。无论所使用的多样性生成形式如何，本发明的核酸可被重组(彼此，或与相关(或甚至不相关)序列)以制备多种重组核酸组(包括例如，同源性核酸组)以及相应多肽。

通过单独或组合使用上述任何形式将本发明的一种或多种多核苷酸与一种或多种其它核酸重组而产生的重组核酸也构成本发明的一部分。一种或多种其它核酸可包括本发明的另一种多核苷酸；任选地，或者，或另外，一种或多种其它核酸可包括例如编码天然干扰素-α或其亚序列，或任何同源的干扰素-α序列或其亚序列(例如GenBank或其它可获得的文献中描述的)的核酸，或者例如任何其它同源或非同源的核酸或其片段(上述具体重组形式，具体是用合成法或in silico方法进行的重组不需要用于重组的同源性)。

治疗用途

多种干扰素-α多肽和干扰素-α偶联物已被批准用于治疗病毒疾病诸如慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎并处于临床研究中。因此，本发明涉及包含一种或多种本发明的多肽或偶联物的组合物(即，“本发明的组合物”)用于治疗所述疾病的用途。

丙型肝炎病毒

在本发明的一个方面中，提供了治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的方法，包括对患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HCV感染患者的组合物，其包括一种或多种本发明的多肽或偶联物和可药用的载体或赋形剂。诊断为HCV感染的患者包括其血液中显示HCV RNA的和/或血清中显示抗HCV抗体的患者。

包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α多肽的HCV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α多肽是例如ROFERON_A(干扰素α-2a，重组；Hoffmann-La Roche Inc.)，INTRON_A(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)，和INFERGEN_(干扰素α-1；InterMune，Inc.)。ROFERON或INTRON A治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是3百万IU(大约15微克(mcg))每周三次，皮下注射，例如，24-48周。INFERGEN治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是9mcg每周三次，皮下注射，例如，24-48周。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学以及患者的体型和健康)，多肽可采用比上述更低的剂量(例如，约2，3，4，5，6，7，或8mcg)和/或更低的频率(诸如每周一次或每周两次)进行施用。

同样地，包含本发明的偶联物的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α偶联物的HCV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α偶联物例如为，PEGASYS_(Peg干扰素α-2a；Hoffmann-LaRoche，Inc.)或PEG-INTRON_(peg干扰素α-2b；Schering Corporation)。PEGASYS治疗慢性HCV的示例性推荐剂量方案是180mcg每周一次，皮下注射，例如，24-48周。根据多种因素(包括但不限于本发明的偶联物的分子量，活性和药代动力学以及患者的体型和健康)，偶联物可采用比上述更低的剂量(例如，约25，50，75，100，125，或150mcg)和/或更低的频率(诸如每10日一次，或每两周一次)进行施用。

在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。例如，本发明的多肽或偶联物可与抗病毒药诸如Ribavirin(其商品名为COPEGUS_(Hoffmann-La Roche，Inc)和REBETOL_(ScheringCorporation))联合施用。

本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性(诸如，被治疗的丙型肝炎病毒的基因型)，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称为“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症，剂量，给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型，年龄，和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。

治疗有效性可通过以下方法确定：采用本领域已知的方法，例如通过使用基于PCR的定量检测，诸如COBAS AMPLICOR_HCV Test，v2.0或COBAS AMPIICOR HCV MONITOR_Test，v2.0(均获自Roche Diagnostics)监测病毒RNA水平，通过检测病毒载量，例如通过测定血清或血浆中的病毒滴度或水平。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是这样的量，其足以实现在治疗过程中，与治疗前的病毒载量(对于慢性HCV患者，其一般是10⁵-10⁷拷贝HCV RNA/ml)相比，将病毒载量降低至少2对数单位，至少3对数单位，至少4对数单位，至少5对数单位，至少6对数单位或至少7对数单位。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒载量降至基本上不可检测的水平，例如，小于约500拷贝/ml血清或小于约100拷贝/ml血清的量。本发明包括降低感染了HCV的患者血清中HCV RNA水平的方法，其包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的HCVRNA水平相对，所述组合物的量能有效降低HCV RNA水平。

通过检测指示HCV感染伴随症状例如肝损伤的参数可以可选地或另外地测定治疗效果。例如，血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平可采用标准测定法进行检测。一般而言，ALT水平小于约50国际单位/ml(IU/ml)血清被认为是正常的。较高的ALT水平可作为存在肝损伤的指征。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是能在具有高于正常ALT水平的患者中将ALT水平有效降至小于约50IU/ml血清的量。因此，本发明包括降低HCV感染的患者的血清ALT水平的方法，所述患者表现出起始ALT水平高于50IU/ml，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，所述组合物的量能有效地将ALT水平降至小于约50IU/ml。

乙型肝炎病毒

另一方面，本发明提供了治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染患者的方法，包括对患者施用有效量的本发明的组合物，该组合物包括一种或多种本发明的多肽或偶联物。本发明还提供了用于治疗HBV感染患者的组合物，其包括一种或多种本发明的多肽或偶联物以及可药用的载体或赋形剂。

诊断为HBV感染的患者包括血清中表现出可检测的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。慢性HBV感染还可进一步分类为“复制型”或“非复制型”。在复制型感染中，患者通常具有相对高的病毒DNA血清浓度和可检测的HbeAg，其是HBV前核心基因的可选经加工的蛋白，其在高病毒复制的条件下合成。然而，在具有前核心基因突变的罕见HBV株中，复制型感染可在不存在可见的血清HbeAg时出现。慢性乙型肝炎和复制型感染患者与无HbeAg的患者相比，通常具有较差的预后且发生肝硬化和/或肝细胞癌的可能性较高。在非复制型感染中，肝中的病毒复制速率低，血清HBV DNA浓度一般低且检测不到肝炎Be抗原(HBeAg)。

包含本发明多肽的组合物的施用剂量和频率通常与采用临床批准的干扰素-α多肽的HBV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α多肽是例如INTRON_A(干扰素α-2b，重组；Schering Corporation)。INTRON A治疗成年人中慢性HBV的示例性推荐剂量方案是30-35百万IU每周，皮下或肌内注射，或以5百万IU每日(qd)或以10百万IU每周三次(tiw)，16周。根据多种因素(包括但不限于本发明多肽的活性和药代动力学，以及患者的体型和健康)，本发明的多肽可采用比上述更低的剂量(例如，约5，10，15，20，或25百万IU每周)和/或更低的频率(诸如每周一次或每周两次)进行施用。

同样地，包含本发明的偶联物的组合物的施用剂量和频率通常与采用目前处于临床受试中的干扰素-α偶联物的HBV治疗方案中所使用的相似，所述临床批准的干扰素-α偶联物例如为，PEGASYS_(Peg干扰素α-2a；Hoffmann-La Roche，Inc.)。PEGASYS治疗慢性HBV的示例性推荐剂量方案是90mcg-270mcg，每周注射一次，总共24周。根据多种因素(包括但不限于本发明的偶联物的分子量，活性和药代动力学以及患者的体型和健康)，偶联物可采用比上述更低的剂量(例如，约25，50，75，100，125，150或200mcg)和/或更低的频率(诸如每10日一次，或每两周一次)进行施用。

在一些情况下，本发明的多肽或偶联物联合一种或多种其它治疗剂进行施用。例如，本发明的多肽或偶联物可与抗病毒药诸如拉米夫定(lamivudine)称为3TC)，其商品名为Epivir-HBV_(GlaxoSmithKline)，或阿德福韦二匹伏酯(adefovir dipivoxil)，其商品名为Hepsera_(Gilead Sciences)联合施用。

本发明的多肽或偶联物的精确施用量和频率应依赖于多种因素诸如多肽或偶联物的比活性和药代动力学特性，以及需要治疗的病症的特性(诸如，在HBV感染的情况下，感染是否是复制型或非复制型)，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般情况下，剂量应能预防或减轻要治疗症状的严重度或扩散。所述剂量可称“有效的”或“治疗上有效的”量。对本领域技术人员显而易见的是本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量要依赖于(尤其是)要治疗的病症，剂量，给药方案，多肽或偶联物或组合物是单独或与其它治疗剂联合施用，血清半寿期和多肽，偶联物或组合物的其它药代动力学特性，以及患者的体型，年龄，和一般健康状况。本领域技术人员采用已知技术可确定给药剂量和频率。

可采用本领域已知的方法，例如通过检测病毒载量，例如血清或血浆中的病毒DNA的水平测定治疗效果。检测HBV DNA水平的方法包括基于PCR的定量检测，诸如COBAS AMPLICOR_HCV Test，v2.0或COBASAMPLICOR HCV MONITOR_Test，v2.0(均获自Roche Diagnostics)。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将病毒DNA降至，例如小于约500,000拷贝/ml血清或小于约100,000拷贝/ml血清或小于约10,000拷贝/ml血清，或至基本上不可检测的水平(例如，小于约1000拷贝/ml血清，小于约500拷贝/ml血清，或小于约200拷贝/ml血清)的量。本发明包括降低HBV感染患者血清中HBV RNA水平的方法，其包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前存在的HBV DNA水平相对，所述组合物的量能有效降低HBV DNA水平。

通过检测HBV复制的其它血清标记物，诸如HBeAg可以可选地或另外地测定治疗效果。在一些情况下，本发明的组合物的有效量是将HbeAg降至基本上不可检测的水平的量。本发明包括降低感染了HBV的患者的血清HBeAg水平的方法，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前的HbeAg水平相比，所述组合物的量能有效减低HBeAg水平。

如上所述，指示HBV感染的其它血清标记是HBsAg。因此，通过检测血清中HBsAg的水平可以可选地或另外地测定治疗效果。在一些情况下，在一些情况下，本发明的组合物的有效量是足以将HBsAg降至基本上不可检测的水平的量。本发明包括降低HBV感染的患者的血清HBsAg水平的方法，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，与治疗开始前的HBsAg水平相比，所述组合物的量能有效减低HBsAg水平。

通过检测指示HBV感染伴随症状例如肝损伤的参数可以可选地或另外地测定治疗效果。例如，血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平可采用标准测定法进行检测。一般而言，ALT水平小于约50国际单位/ml(IU/ml)血清被认为是正常的。较高的ALT水平可作为存在肝损伤的指征。在一些情况下，在一些情况下，本发明的组合物的有效量是能在具有高于正常ALT水平的患者中将ALT水平有效降至小于约50IU/ml血清的量。因此，本发明包括降低HBV感染的患者的血清ALT水平的方法，所述患者表现出起始ALT水平高于50IU/ml，所述方法包括对患者施用本发明的组合物，所述组合物的量能有效地将ALT水平降至小于约50IU/ml。

制剂和给药途径

本发明的多肽或偶联物的治疗性制剂通常在包括一种或多种可药用的载体或赋形剂的组合物中施用。所述组合物可采用本领域本身已知的方法进行制备，从而导致具有足够的贮存稳定性并适宜施用于人类或动物的多肽药物。

剂型

本发明的多肽或偶联物可以是其盐形式和/或在其盐形式中。适宜的盐包括(但不限于)碱金属或碱土金属，诸如钠，钾，钙和镁的盐，以及锌盐。这些盐或复合物可具有晶体和/或无定形结构。

 赋形剂

“可药用”是指载体或赋形剂的施用剂量和浓度不会在其所给药患者中导致任何不良作用。所述可药用的载体和赋形剂是本领域众所周知的(参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishing Company(1990)；Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides和Proteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000)).

药物的混合

本发明的药物组合物可单独或与其它治疗剂联合施用。例如，利巴韦林目前与IFN-α共同施用，并已显示出可以增高HCV治疗的效果。正在开发针对病毒靶(病毒蛋白酶，病毒聚合酶，病毒复制复合物的组装)和宿主靶(病毒加工需要的宿主蛋白酶，病毒靶磷酸化需要的宿主激酶诸如NS5A和有效利用病毒IRES的宿主因子的抑制剂)的多种小分子。可共同施用其它细胞因子，诸如IL-12，IL-23，IL-27，或IFN-γ。这些药剂可被掺入作为相同药物组合物的部分或可与本发明的多肽或偶联物分开施用(同时或或根据其它治疗方案)。此外，本发明的多肽，偶联物或药物组合物可用作其它治疗的佐剂。

患者

用于本发明目的的“患者”包括人和其它哺乳动物。因此所述方法适用于人类治疗和兽医应用。

组合物类型和给药途径

包含本发明的多肽或偶联物的药物组合物可被制成多种形式，例如液体，凝胶，冻干，或压缩固体。优选的形式应根据要治疗的具体病症且对本领域技术人员而言是显而易见的。

本发明的制剂的给药可用多种方法实施，所述方法包括，但不限于，口服，经皮下，经静脉内，经脑内，经鼻内，经皮，经腹膜内，经肌内，经肺内，经阴道，经直肠，经眼内，或其它可接受的方式。虽然弹丸推注是可接受的，所述制剂可通过输注连续地施用，其采用本领域众所周知的技术诸如泵(例如，皮下渗透泵)或植入)。在一些情况下，所述制剂可采用溶液或喷雾剂直接施用。

非胃肠道给药剂(Parenterals)

药物组合物的实例是设计成非肠道给药的溶液剂。尽管在很多情况下，药物溶液剂可以以适用于立即使用的液体制剂形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。

在非胃肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，如通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合来制备，赋形剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。

缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围中。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸-钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸-钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)盐缓冲剂(如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。

加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸甲酯(methylparaben)、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物、苯亚甲基卤化物(如苯亚甲基氯化物、溴化物或碘化物)、氯化六甲季铵(hexamethoniumchloride)、羟苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)如甲酯或丙酯、儿茶酚(catechol)、间苯二酚(resorcinol)、环己醇和3-戊醇。

可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以其它组分的相对量计算。

稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖(trehalose)、水苏糖(stachyose)、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇，甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸(thiocticacid)、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖(raffinose)，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。

可以存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽来避免搅拌诱导的聚集，其也允许配方剂暴露于剪切表面应力而没有引起多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic_多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温20、吐温80等)。

其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)和共溶剂。

活性组分也可以被包裹在制备的微囊中，例如通过coascervation技术或通过界面聚合(interfacial polymerization)制备的，例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在胶体状药物释放体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂(microemulsion)、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包裹在大乳剂(macroemulsion)中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公开了这些技术。

在本发明的一个方面中，组合物是液体组合物，诸如含水组合物，且包含下式的磺烷基醚环糊精(sulfoalkyl ether cyclodextrin)衍生物

其中

n是4，5或6；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，和R₉各自独立地是，-O-或-O-(C₂-C₆烷基)-SO₃-基团，其中至少一个R₁，R₂或R₃独立地为-O-(C₂-C₆烷基)-SO₃-基团；而S₁，S₂，S₃，S₄，S₅，S₆，S₇，S₈，和S₉各自独立地是可药用的阳离子，包括H⁺。

应当注意的是，当n＝4时，磺烷基醚环糊精还可被称为α-磺烷基醚环糊精。以相似的方式，但n＝5时，可使用术语β-磺烷基醚环糊精而当n＝6时，磺烷基醚环糊精还可被称为γ-磺烷基醚环糊精。

在其它实施方案中，n是5或6。在优选实施方案中，n＝6。

而在其它实施方案中，R₁，R₂或R₃独立地选自-OCH₂CH₂CH₂SO₃-，-OCH₂CH₂CH₂CH₂SO₃-或-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂SO₃-。最优选地，R₁，R₂或R₃独立地是-OCH₂CH₂CH₂CH₂SO₃-。

在其它实施方案中，S₁，S₂，S₃，S₄，S₅，S₆，S₇，S₈，和S₉各自独立地是可药用的阳离子，其选自H⁺，碱金属(例如Li⁺，a⁺，K⁺)，碱土金属(例如，Ca⁺²，Mg⁺²)，铵离子和胺阳离子诸如(C₁-C₆)烷基胺，哌啶，吡嗪，(C₁-C₆)烷醇胺或(C₄-C₈)环烷醇胺的阳离子。最优选地，S₁，S₂，S₃，S₄，S₅，S₆，S₇，S₈，和S₉各自独立地是可药用的阳离子，其选自H⁺，Li⁺，Na⁺或K⁺，具体是Na⁺。

磺烷基醚环糊精可包括1-18个磺烷基(当n＝4时)，1-21个磺烷基(当n＝5时)或1-21个(当n＝6时)。在本发明优选的实施方案中，n＝5且磺烷基醚衍生物平均包含，2-20个磺烷基(尤其是磺丁基)，诸如3-10个磺烷基(尤其是磺丁基)，更优选4-9个磺烷基(尤其是磺丁基)，更优选5-9个磺烷基(尤其是磺丁基)，诸如6-8个磺烷基(尤其是磺丁基)，例如7个磺烷基(尤其是磺丁基)。

在一些情况下，磺烷基醚环糊精衍生物是β-环糊精磺丁基醚(即n＝5)的盐，具体是钠盐，其平均包含7个磺丁基。该磺烷基醚环糊精衍生物还被命名为SBE7-β-CD且可以作为Captisol_(Cydex，Overland Park，Kansas)获得。

术语“C₁-C₆烷基”表示具有1-6个碳原子的支化的或直链烷基。常见的C₁-C₆烷基包括(但不限于)甲基乙基，n-丙基，异-丙基，n-丁基，异-丁基，仲-丁基，叔-丁基，n-戊基，异-戊基，n-己基和异-己基。

术语“C₂-C₆烷基”表示具有2-6个碳原子的分枝或直链烷基。典型的C₂-C₆烷基包括(但不限于)乙基，n-丙基，异-丙基，n-丁基，异-丁基，仲-丁基，叔-丁基，n-戊基，异-戊基，n-己基和异-己基。

关于本文所述多肽和磺烷基醚环糊精衍生物的组合物的进一步细节可见于WO 03/002152，尤其是题目为“磺烷基醚环糊精衍生物”的章节，37-49页，该文件引入此处作为参考。用于体内施用的胃肠外制剂必须是无菌的。其可通过，例如经过过滤膜的过滤而便易地获得。

持续释放制剂

持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物半渗透材料、具有合适形式如膜或微囊的材料。持续释放材料的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基甲丙烯酸酯(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚(乙烯醇))、聚交酯(polylactide)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease_技术或Lupron Depot_(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如长达或超过100天，一些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。包囊化的多肽长时间保留在体内时，它们因暴露于37℃潮湿的环境而变性或聚集，导致丧失生物活性并且其免疫原性可能改变。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基，从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物型组合物来达到稳定。

口服给药

对于口服用药，药用组合物可以是固体或液体形式，例如，以胶囊，片剂，悬液，乳剂或溶液的形式。药用组合物优选制备为含有给定量活性成分的剂量单位的形式。用于人或其它哺乳动物的合适的每日剂量可根据病人的疾病以及其它因素大幅度变化，但本领域的技术人员可使用常规方法测定。

口服用药的固体剂型可包括胶囊，片剂，栓剂，粉末和颗粒。在该固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖，乳糖或淀粉混合。该剂型也可包括，如正常实践中的添加物质，例如润滑剂如硬脂酸镁。对于胶囊，片剂和丸剂，剂型也可包括缓冲剂。片剂和九剂还可具有肠衣。

多肽或偶联物可与诸如乳糖，蔗糖，淀粉粉末，链烷酸的纤维素酯，硬脂酸，滑石，硬脂酸镁，氧化镁，磷酸和硫酸的钠和钙盐，阿拉伯胶，明胶，藻酸钠，聚乙烯-吡咯烷，和/或聚乙烯醇的佐剂混合，并作成片剂或包成胶囊用于常规用药。可选地，它们可溶于盐水，水，聚乙二醇，丙二醇，乙醇，油类(例如玉米油，花生油，棉籽油或芝麻油)，黄芪胶(tragacanthgum)，和/或各种缓冲液中。其它佐剂和用药方式是制药领域熟知的。载体或稀释剂可包括时间延迟材料(time delay material)，例如单独或与石蜡一起的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本领域熟知的其它材料。

可对药用组合物进行诸如灭菌的常规制药操作和/或药用组合物可含有常规佐剂，例如防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，缓冲液，填充物，等，例如，如在本文别处所述。

口服用药的液体剂型可包括可药用的乳剂，溶液，悬液，糖浆和酏剂，其含有诸如水等本领域常用惰性稀释剂。该组合物也可包括佐剂，例如润湿剂，甜味剂，调味剂和香味剂。

肺部递送

适合于喷射或者超声喷雾器的配制剂一般包含以，例如每mL溶液大约0.01到25mg偶联物，优选大约0.1到10mg/mL的浓度溶于水中的多肽或偶联物。配制剂也可包括缓冲液和简单糖类(例如，用于蛋白质稳定化和渗透压调节)，和/或浓度范围从0.1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的缓冲液的例子是乙酸钠，柠檬酸盐和甘氨酸。优选的是，缓冲液具有适合于将溶液调到pH为3至9范围的组成成分(composition)和摩尔浓度(molarity)。一般来说，从1mM到50mM的缓冲液摩尔浓度适合于该目的。可使用的糖类的例子是乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范围是配制剂重量的1％到10％。

喷雾配制剂也可含有表面活性剂以降低或防止在形成气溶胶时由溶液的雾化引起的表面诱导的蛋白质聚集。可使用各种常规表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范围一般为配制剂重量的0.001％和4％之间。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯(polyoxyethylene sorbitanmonooleate)。

具体配制剂和产生合适分散的本发明的液体颗粒的方法在WO94/20069，US 5,915,378，US 5,960,792，US 5,957,124，US 5,934,272，US5,915,378，US 5,855,564，US 5,826,570和US 5,522,385中描述，在此引用以供参考。

用于带有剂量刻度的吸入器装置的配制剂一般包含磨碎的(finelydivided)粉末。该粉末可通过冻干并然后磨制液体偶联物配制剂来生产且也可含有稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)。一般来说，加入超过0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要可向该制剂中加入一种或多种糖或糖醇。其例子包括乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制剂中的该偶联物的量的范围从大约0.01到200％(w/w)，优选从大约1到50％。然后冻干该配制剂并磨制成所需的颗粒大小。

然后将合适大小的颗粒借助于表面活性剂悬浮于推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如含氯氟烃，氢氯氟碳，氢氟碳，或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。然后将该混合物装入递送装置中。适用于本发明的商业上可获得的计量型吸入器(metered inhaler)例子是由GlaxoInc.，Research Triangle Park，NC，USA生产的Ventolin计量型吸入器。

用于粉末吸入器的配制剂包含含有偶联物的磨碎的干粉且也可包括膨胀剂，例如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇，其含量可帮助粉末从装置中散布，例如，占配制剂重量的50％到90％。粉末的颗粒在肺中应具有相当于一种颗粒的空气动力学特性，所述颗粒密度大约1g/cm2、中值直径小于10微米，优选在0.5和5微米之间，最优选在1.5和3.5微米之间。根据本文的教导适用的粉末吸入器的例子是由Fisons Corp.，Bedford，MA，USA生产的Spinhaler粉末吸入器。

以US 5,997,848，US 5,993,783，US 5,985,248，US 5,976,574，US5,922,354，US 5,785,049和US 5,654,007公开的方法可产生和/或递送这些装置中的粉末。

设计用于治疗产品的肺部递送的机械装置包括但不限于喷雾器，计量型吸入器，和粉末吸入器，所有这些都是本领域的技术人员所熟悉的。适用于本发明实践的商业上可获得的装置的具体例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，MO，USA生产的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products，Englewood，CO，USA生产的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc.，ResearchTriangle Park，NC，USA生产的Ventolin计量型吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，MA，USA生产的Spinhaler粉末吸入器；Inhale Therapeutic Systems，Inc.，San Carlos，CA，USA的“静置云(standing cloud)”装置；Alkermes，Cambridge，MA，USA生产的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，CA，USA生产的AERx肺部药物递送系统。

试剂盒

本发明还提供了包括本发明的多肽、偶联物、多核苷酸、表达载体、细胞、方法、组合物，系统和装置的试剂盒。本发明的试剂盒任选包括至少一种以下本发明的内容：(1)本文所述的装置，系统，系统组件或装置组件；(2)包括本发明的多肽或偶联物或多核苷酸的至少一种试剂盒组分；编码本发明多肽的质粒表达载体；表达本发明多肽的细胞；或包含至少一种任何所述组分的组合物；(3)实施本文所述任何方法(包括治疗性或预防性方法)的说明，使用(2)中确定的任何组分或所述组分的任何组合的说明，和/或操作本文所述任何装置、系统或组分的说明；(4)放置保持所述至少一种所述组分或组合的容器；和(5)包装材料。

另一方面，本发明提供了本文所述的任何装置，组件，组合物或试剂盒用于实施本文所述的任何方法或测定法的用途，和/或任何装置或试剂盒用于实施本文所述的任何测定法或方法的用途。

实施例

以下实施例用以举例说明本发明，而并非以任何形式限制本发明的精神和范围。

材料和方法

I.确定表面可及的残基

可接近表面区(ASA)

用计算机程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(_1983 Yale University)计算该结构中各原子的可接近表面区(ASA)。该方法一般使用1.4_大小的探针且可将可接近表面区(ASA)定义为由探针中心形成的区域。在该计算前，从坐标系中去除所有水分子，氢原子和与该蛋白质不直接相关的其它原子。

侧链的分数ASA

通过用侧链中该原子的ASA总和除以代表延伸ALA-x-ALA三肽中该残基类型的侧链原子ASA值来计算侧链原子的分数ASA。参见Hubbard，Campbell & Thomton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在该实施例中，将CA原子视为甘氨酸残基侧链的一部分但不视为其余残基的一部分。下表用作侧链的标准100％ASA(表6)：

Ala	69.23	_2		Leu	140.76	_2
							Arg	200.35	_2		Lys	162.50	_2
Asn	106.25	_2		Met	156.08	_2
							Asp	102.06	_2		Phe	163.90	_2
Cys	96.69	_2		Pro	119.65	_2
							Gln	140.58	_2		Ser	78.16	_2
Glu	134.61	_2		Thr	101.67	_2
							Gly	32.28	_2		Trp	210.89	_2
His	147.00	_2		Tyr	176.61	_2
							Ile	137.91	_2		Val	114.14	_2

在该结构中未检测到的残基定义为100％暴露，因为其被认为位于弹性区域。在分析NMR结构系统的情况下，使用总体平均ASA值。

当不可获得三维结构时表面暴露残基的测定：

当无不可获得三维结构或如果该结构描述不详细而不足以确定表面可接近性时(例如如果仅已知CA原子的位置)，表面可接近性可从如下构建的序列比对中推断出：

A：如果结构已知但描述不详细而不足以确定表面可接近性时：

采用可从Molecular Simulations，Inc.获得的MODELER程序，将详细度较低的结构与该序列家族的已知结构进行基于结构的序列比对。

B：如果结构未知：

将序列与预先确定的序列比对进行比对，包括该序列家族的已知结构的序列，其可采用程序ClustalW的“图谱/结构对比”选项制备(Thompson，(1994)Nucleic Research 22：4673-4680)。

通过A或B所得的序列比对中，序列中位于与至少一个具有已知结构的其它序列中暴露的残基等效的位置上的待分析残基被确定为暴露的。暴露程度为其它序列中等效残基的最大值。在待分析的序列为插入的情况下(即其它序列中无等效残基)，该残基被确定为完全暴露，因为其最可能位于转角/环区。在存在详细度低的结构的情况下，该结构中未检测到的那些残基被确定为完全暴露，因为其被认为位于柔性区域。

测定原子间的距离：

使用分子图形软件，例如获自Molecular Simulations，Inc的InsightII_98.0测定原子间的距离。

II.蛋白质的表达和纯化

A.从CHO细胞的表达和纯化

一些本发明的多肽在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制备，所述细胞稳定转染并用G418选择以构建克隆性细胞系。编码本发明多肽的核酸被克隆至CHO表达载体中，置于SRα启动子的控制下(Takebe，Y.，(1988)Mol Cell Biol.8(1)：466-72)且与编码N末端前导肽的序列以及任选C末端附加表位置于同一读框内。

1.选择表达IFN-α多肽的稳定亚克隆：

材料：

培养基：含有G418，FBS和青霉素，链霉素和谷氨酰胺[PSG]的DMEM-F12(Gibco/Invitrogen)；

1xPBS(Gibco/Invitrogen)；

胰蛋白酶/EDTA

抗E-Tag抗体-HRP偶联物(Amersham BioSciences)

ECL Plus Western印迹检测试剂(Amersham BioSciences)

步骤：在用G418选择的条件下，在含有FBS和青霉素的DMEM/F-12培养基中生成稳定转化体。将细胞分装至含有50ml选择培养基的T175瓶中，然后在CO₂孵箱中，于37℃培养～24小时或直至细胞达到80％满底。通过PBS洗涤，然后加入2.5ml胰蛋白酶/EDTA和于37℃培养3-5分钟，收获细胞。通过在Beckman型台上离心机以1000g离心30分钟来收集并回收细胞。细胞在PBS中洗涤一次，然后在含有1％FBS的3ml PBS中重悬。测定细胞密度然后用PBS/FBS调至1×10⁶细胞/ml。对于各IFNα多肽，将细胞在DakoCytomation MoFlo分选器中分入包含200ml选择培养基的2-5个96孔板中。将培养板在37℃孵箱中培养10-14日以便使经分选的细胞生长。首先通过点印迹分析选择、随后采用抗-E标记抗体-HRP偶联物和化学发光检测通过Western印迹分析进行验证来选出高水平表达每种IFNα多肽的两个亚克隆。

2.蛋白质表达：

材料：

DMEM-F12培养基(Gibco/Invitrogen)

Ultra CHO培养基(BioWhittaker)

CHO III A培养基(Gibco/Invitrogen)

Ex-Cyte生长增强培养基补充剂(Serologicals Proteins)

ITSA(胰岛素，运铁蛋白，用于贴壁培养的硒补充剂；Gibco/Invitrogen)青霉素/链霉素(P/S)

FBS，PBS，胰蛋白酶

步骤：

第1日：将来自一个T-175瓶的细胞转移至一个摇瓶(1700cm²)的10％FBS和1xP/S的300ml DMEM-F12中，然后在37℃CO₂孵箱中生长。

第3日：将培养液换为300ml新鲜DMEM-F12-FBS-P/S。

第5日：将培养液换为含有1/1000Ex-Cyte和P/S的300ml Ultra CHO。

第7日：用300ml CHO III A+P/S制备培养液替换培养液。

在第8，9和10日收集上清。将上清置于Beckman Coulter Allegra 6R台顶离心机(bench top centrufuge)内以2000g离心20分钟，然后用0.2μPESbottle top sterile filter过滤，保存于4℃以备纯化。

3.蛋白质纯化：

一些本发明的多肽被表达为包含位于C末端的13个氨基酸E-tag序列的融合蛋白质。所述多肽用E-tag亲和层析柱进行纯化，如下。

材料：重组噬菌体抗体系统纯化组件(Recombinant Phage AntibodySystem Purification Module)(Amersham BioSciences，货号17-1362-01)。纯化试剂盒包含直径16mm×高25mm(5ml柱床体积)的抗E-Tag柱和相关缓冲液。

步骤：采用2800xg离心20分钟并联用0.2μPES BOTTLE TOP FILTERMODULE过滤使得从摇瓶中的CHO-HK1细胞收集的上清澄清化。将上清以150cm/h(5ml/分钟)加载于用RPAS结合缓冲液平衡的E-标记柱上。用5CV(柱体积)的结合缓冲液洗柱，然后用RPAS洗脱缓冲液以75cm/h(2.5ml/分钟)洗脱蛋白质。洗脱级分用0.05体积的1M Tris-CL pH 8.0中和，透析入PBS，浓缩至0.1-1.5mg/ml并等分冷冻保存于-80℃。在含有0.5％BSA的PBS中将用于测定的样品配制成50μg/ml，然后等分冷冻保存于-80℃。通过SDS-PAGE，然后通过采用获自INVITROGEN的材料，试剂和操作步骤进行考马斯染色，从而对样品进行常规分析。通过BCA测定，采用IFN-α标准(其浓度已通过氨基酸分子进行证实)常规测定蛋白质浓度。

B.从大肠杆菌中的表达和纯化

一些本发明的多肽在作为包涵体的大肠杆菌中制备，其按下述纯化和再折叠。

1.大肠杆菌表达构建体

修饰编码多肽B9x14(SEQ ID NO：3)的核酸序列(SEQ ID NO：18)以便通过替换位于34-39位核苷酸的稀有Arg-Arg密码子对(rare Arg-Arg codonpair)AGGAGG，和位于64-69位核苷酸的AGGAGA(其各具有大肠杆菌中优选的Arg-Arg密码子对CGTCGC)来增强大肠杆菌中的表达。也可将甲硫氨酸密码子(ATG)加至编码序列的5’末端。将修饰的序列置于pET-42载体(Novagen)中具有卡那霉素选择标记的T7启动子的控制下。

2.蛋白质表达

采用标准方法将包含干扰素编码序列的载体转化至BL21(DE3)大肠杆菌菌株中，然后铺于包含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板上，然后于37℃保温。18-24小时后，选取三个单独的克隆，将其转入包括含有50μg/ml卡那霉素的5ml 2xYT的管中，于37℃保温过夜。用过夜培养物接种2组包括含有50μg/ml卡那霉素的100ml 2xYT的瓶。于OD₆₀₀监测培养物在37℃的生长。于OD₆₀₀ 0.5-0.8用1mM IPTG在37℃诱导所述培养物3小时。采用SDS-PAGE通过在SDS样品缓冲液中溶解沉淀的细胞来分析IPTG诱导的培养物的表达。

3.包涵体的分离和再折叠

在PBS中以10ml PBS/克细胞湿重重悬融化的细胞。在APV 1000匀浆器中，以10,000psi、使细胞通过匀浆器三次而将细胞裂解。将裂解物以8000g离心30分钟，以便使包涵体(IB)沉淀。通过在含有1％TritonX-100的PBS中重悬将IB洗涤两次。在8M脲，50mM Tris-Cl，200m NaCl，1mM EDTA，1％TritonX-100，pH 8.0和不含TritonX-100相同缓冲液中将IB再洗涤一次，最后用水洗涤。经洗涤的IB在8M盐酸胍，50mM Tris-Cl，pH 8.0，200mMNaCl，1mM EDTA中重悬。

通过使8M胍溶解的IB以100μg/ml的蛋白质浓度溶于冷却的(4℃)再折叠缓冲液(50mM Tris-Cl，0.8M精氨酸，20mM NaCl，1mM EDTA，2mM谷胱甘肽和1mM氧化谷胱甘肽，pH 8.0)中对其进行再折叠。于4℃再折叠48小时。再折叠的干扰素样品用40x体积的50mM Tris-Cl，50mM NaCl，1mM EDTA透析，将其加载于Q-Sepharose HP柱(Amersham Biosciences)中，然后用50-600mM NaCl梯度洗脱。集合峰值级分，然后用50mM Tris-Cl，150mM NaCl进行透析。在PBS+0.5％BSA中将用于测定的样品配制成5μg/ml和20μg/ml，然后冷冻保存于-80℃。通过BCA测定，采用IFN-α标准物(其浓度已通过氨基酸分析进行证实)常规测定蛋白质浓度。

III.活性测定

A.EMCV-HuH7抗病毒活性测定

以下提供了本发明的干扰素-α多肽和偶联物的抗病毒活性的示例性测定法。该测定法是基于细胞的剂量响应测定法，用于评估药物的抗病毒效力，其有时被称为“保护免受细胞病变效应”(或PCPE)测定法。简言之，用药物保温细胞，然后暴露于病毒。在不存在药物时，暴露于病毒的细胞死亡。随着药物浓度的增加，细胞存活的比率增加。通过估计代谢率可直接(例如，通过可视计数)或间接地检测存活细胞的数量。例如，代谢染料诸如MTT或WST-1可被用作细胞存活的间接检测。存活细胞代谢所述染料而生成代谢产物，该产物可通过分光光度法(光密度)进行定量。

材料：

细胞：

HuH7细胞：人肝瘤细胞系(Michael Lai医生惠赠，USC-外科，LosAngeles，CA)。HuH7细胞系最初是在J.Sato医生(Okayama大学医学院)的实验室中从患有良好分化的肝细胞癌的57岁日本男性中建立的。该细胞系的乙型肝炎表面抗原阴性。

VERO细胞：非洲绿猴肾细胞系(ATCC#CCL-81)

L-929细胞：鼠成纤维细胞系(ATCC#CCL-1)

病毒：

脑心肌炎病毒(EMCV)：组织培养适应株(ATCC#VR-129B)。高滴度病毒原液通过在VERO细胞中传代在内部制备。

完全培养基：

Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Gibco货号11965-092)

10％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)

1x青霉素-链霉素(PS，Gibco货号15140-122)

简化的(reduced)血清培养基：

Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM，Gibco货号11965-092)

2％胎牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)

1x青霉素-链霉素(PS，Gibco货号15140-122)

胰蛋白酶/EDTA(Gibco货号25300-054)

WST-1(Roche；货号1 644 807)

将HuH7细胞在5％CO₂孵箱中，于37℃保持在完全培养基中。用胰蛋白酶收集细胞并每周两次在满底时于T175瓶中分成终密度1-2×10⁶细胞每25ml。测定的前一天，用胰蛋白酶处理细胞然后以4.5×10⁶细胞每25ml的密度接种于新T175瓶中以便确保在测定前所述细胞处于对数期。

步骤：

在VERO细胞中扩增高效价的EMCV病毒原液。通过HuH7单层细胞的EMCV病毒杀伤曲线测定95％的细胞被杀死的致死浓度(LC₉₅)。简言之，在第一日将HuH7细胞以6×10⁴细胞/孔铺于96孔微量滴定板。在DMEM+2％FBS中以10个稀释点按将1∶3连续稀释所述病毒，然后在第二日将其加至细胞。转染后24小时，通过四唑盐代谢测定法WST-1(Roche)来测定细胞存活。HuH7-EMCV测定法所测定的LC₉₅对应于0.034的MOI(PFU/细胞)。通过L929细胞的标准噬菌斑测定法测定病毒原液的效价。

在测定的第一日，用胰蛋白酶收集对数期HuH7细胞，在简化的血清培养基中重悬然后通过离心浓缩。细胞沉淀物(对应于5个T175瓶的细胞)在10ml简化的血清培养基中重悬，经40微米尼龙细胞滤器(Nylon cellstrainer)过滤然后用血细胞仪(hemocytometer)s计数。通过锥虫蓝染色排除法测定细胞生存力。细胞在简化的血清培养基中重悬至终密度为6×10⁵细胞/ml将100μl稀释的细胞加入96孔测定板的各孔中(6×10⁴细胞/孔)，然后将测定板在湿性5％CO2孵箱中于37℃培养4小时。

采用剂量响应分析测定“参照”干扰素α和本发明的干扰素-α多肽(也称为“受试样品”)的效价。每板中通常存在一种受试样品和一种参照IFN-α，各具有IFN-α处理的/EMCV攻击的细胞的三条重复型曲线和单独用IFN-α处理的细胞的两条重复型曲线。测定后者作为IFN-α对HuH7细胞的潜在抗增殖效应的对照。参照IFN-α的剂量响应曲线通常由100ng/ml-0.05ng/ml的8个三倍稀释度组成。对于IFN-α实验样品，所述三倍稀释度通常为5ng/ml-0.002ng/ml。各自包含用病毒处理且无IFN-α处理的细胞以及仅包含细胞的八个孔也作为对照。

采用简化的血清培养基制备IFN-α稀释液。将100μl稀释的IFN-α制品转移至测定板中。然后将测定板在湿性5％CO₂孵箱中于37℃保温12小时。

在第二日，用EMC病毒攻击细胞。从测定板的各孔中吸出培养液。在DMEM+2％FBS中以1∶5400稀释EMCV原液。将100μl稀释的病毒(相当于0.034病毒颗粒/细胞)加入各孔中。然后将细胞在湿性5％CO₂孵箱中于37℃与病毒一同保温24小时。

在第三日，通过WST-1对各孔中存活细胞的数量进行定量。从测定板的各孔中吸出培养液。在简化的血清培养基中以1∶20稀释WST-1试剂，将100μl稀释的WST-1试剂加入各孔中然后将细胞在湿性5％CO₂孵箱中于37℃培养60分钟。通过在读板器上检测450nm的OD来对各孔中存活细胞的数量进行定量。

分析：

采用以下公式计算IFN-α参照物和受试样品的抗病毒效能：

抗病毒效能＝(存活细胞_C+I+V-存活细胞_C+V)/(存活细胞_C+I-存活细胞_C+V)^*100％

其中C+V＝HuH7细胞+EMCV，C+I＝HuH7细胞+IFN-α，而C+I+V＝HuH7细胞+IFN-α+EMCV

采用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.)通过非线性回归分析剂量响应曲线。将以下公式用于曲线拟合：

$Y=\mathrm{Bottom}+\frac{(\mathrm{Top}-\mathrm{Bottom})}{1+{10}^{(\mathrm{LogEC}50-X)\·\mathrm{HillSlope}}}$

其中Bottom是位于底部平台(bottom plateau)的Y值；Top是位于顶部平台(top plateau)的Y值，LogEC50是当反应在Bottom和Top中间的X值。将Levenberg-Marquardt法用作优化算法。

B.T_H1分化测定法

以下提供了干扰素-α多肽和本发明的偶联物的T_H1分化活性的示例性测定法。

测定步骤：

在测定起始日，在斯坦福血库(Stanford Blood Bank)收集从500ml血中制备的包含粒细胞和红细胞的人血沉棕黄层(Human buffy coat)(25-30ml)，于室温保存。将各血沉棕黄层小心地转移至T75瓶中，然后用PBS稀释至100ml。对于各血沉棕黄层，将13ml Histopaque/Ficoll(Sigma H8889)移液至四个50ml的离心管中，然后在Histopaque/Ficoll顶部小心地覆盖25ml稀释的血液样品而不破坏其界面。然后将所述管离心(20℃，2500rpm)20分钟。采用3ml塑料移液管，将顶部血浆移至单核细胞层，然后将PBMC转移至两个50ml锥形管(将来自2个Histopaque/Ficoll/血沉棕黄层管的细胞置于一个管中)。然后用PBS将PBMC稀释至50ml/管，然后离心(20℃，1000rpm)10分钟以便去除血小板。去除PBS后，混合PBMC和剩余的RBC以防止聚集。加入5ml RBC裂解缓冲液(氯化铵缓冲液)，然后将两个管的细胞合并至一个管。将各管(现在包含来自从一个供体分离的总PBMC和RBC)在室温保温10分钟。通过用细胞过滤器(70um，Falcon货号2350)过滤细胞去除可能的血细胞凝块。加入PBS至总体积为50ml，然后离心(20℃，1000rpm)10分钟。最后采用血细胞计数器计数细胞数目。

然后，对各个PBMC制品的一部分进行预染并通过FACS分析以选择初始Th0细胞百分数大于15％的PBMC制品。2ml PBMC用20ul FITC偶联的抗人CD45RA(Pharmigen，货号555488)，20μl Cy-铬偶联的抗人CD4(Pharmigen，货号555348)，10μl PE-偶联的抗人CD8(Pharmigen，货号555367)，10μl PE-偶联的抗人CD14(Pharmigen，货号555398)，和10μl PE-偶联的抗人CD20(Pharmigen，货号555623)进行染色，然后在冰上保温45分钟。用PBS洗涤细胞，在1ml PBS中重悬，然后用40μm细胞过滤器(Falcon，货号2340)过滤。通过FACS定量初始T_H0细胞(CD4和CD45RA阳性而CD8，CD14，CD20阴性)的百分数，然后选择含有超过15％初始T_H0细胞的PBMC进行测定。

选择的PBMC制品用800μl FITC偶联的抗人CD45RA，800μl Cy-铬偶联的抗人CD4，500μl PE-偶联的抗人CD8，200μl PE-偶联的抗人CD14，和200μl PE-偶联的抗人CD20进行染色，然后在冰上保温60分钟。用PBS洗涤细胞，加入PI，用20ml/ml PBS稀释细胞，然后用40μm细胞过滤器过滤。该细胞是通过FACS分选的，将1×10⁴初始T_H0细胞(CD4和CD45RA阳性而CD8、CD14、CD20阴性)通过MOFLO转移至96孔圆底板的各孔中，所述孔中包含160μl DMEM加青霉素-链霉素加2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清(Hyclone货号SH30071.03)。

在每孔中加入20μl Dynabeads CD3/CD28T细胞膨胀剂(Dynal，货号111.32)。在受试前校准Dynabeads的刺激效应以避免批与批之间的差异。然后，在测定板中加入20μl/孔的蛋白质样品。通常，IL-4和IL-12标准物(获自R&D Systems)的浓度范围是0.04pg/ml-10ng/ml，而IFN-α受试样品和IFN-α参照样品的浓度范围是0.76pg/ml-200ng/ml。

在湿化的5％CO₂孵箱中于37℃保温所述细胞7日。从各孔收集上清，通过定量IFN-γ的含量、采用标准ELISA来测定T_H1扩增程度。

分析：

反应＝IFN-γ浓度，pg/ml。

将以下公式用于曲线拟合：

$Y=\mathrm{Bottom}+\frac{(\mathrm{Top}-\mathrm{Bottom})}{1+{10}^{(\mathrm{LogEC}50-X)\·\mathrm{HillSlope}}}$

变量Bottom是位于底部平台的Y值；Top是位于顶部平台的Y值，LogEC50是当反应在Bottom和Top中间时的X值。将Levenberg-Marquardt法用作优化算法。

C.Daudi抗增殖测定法

以下提供了干扰素-α多肽和本发明的偶联物抗增殖活性的示例性测定法。

细胞系保持：

于37℃在湿化的5％CO₂孵箱中，将混悬液中生长的Daudi Burkitt淋巴瘤细胞保持在T175组织培养瓶中(包含50ml培养基(RPMI+10％肽牛血清(FBS，Hyclone货号SH30071.03)+1x青霉素-链霉素(PS，Gibco货号15140-122)+2mM谷氨酰胺)。当满底时，将细胞以1∶10分离。

测定步骤.

将Daudi细胞旋转沉降并用1xPBS洗涤。将细胞数量调整为10⁵细胞/ml。在96孔圆底测定板的每个孔中加入80μl培养基，然后将100μl细胞转移至各孔(10⁴细胞/孔)。

利用培养基在稀释板中制备11个稀释度的IFN-α参照物和IFN-α受试样品(200ng/ml-0.2pg/ml(4倍稀释度)。然后将20μl稀释的IFN-α制品转移至测定板。

在湿化的5％CO₂孵箱中于37℃培养细胞。48小时后，在每孔中加入1μCi甲基-³H胸苷(Amersham Pharmacia，货号TRK758)，然后在湿化的5％CO₂孵箱中于37℃保温24小时。次日收集细胞，然后测定胸苷的掺入。

分析：

采用以下公式计算IFN-α参考物和样品的EC₅₀：

$Y=\mathrm{Bottom}+\frac{(\mathrm{Top}-\mathrm{Bottom})}{1+{10}^{(\mathrm{LogEC}50-X)\·\mathrm{HillSlope}}}$

其中Bottom是位于底部平台的Y值；Top是位于顶部平台的Y值，LogEC50是当反应在Bottom和Top中间的X值。将Levenberg-Marquardt法用作优化算法。

实施例1：测定干扰素-α的表面可及残基

人干扰素-α2a残基的表面暴露：

根据Klaus等，J.Mol.Biol.，274：661-675(1997)报道的人干扰素-α2a的24NMR结构，计算侧链的分数ASA。以下使用的序列编号基于人干扰素-α2a蛋白质的成熟序列(在本文中被鉴定为SEQ ID NO：32+R23K)。应当注意该结构包含两个分别包含Cys1-Cys98和Cys29-Cys138的二硫桥。通过计算ASA和分数ASA并取24个结构的平均值，对于(focusing on)侧链的ASA，以下残基被测定为具有大于25％分数ASA：D2，L3，P4，Q5，T6，H7，S8，L9，G10，R12，R13，M16，A19，Q20，R22，K23，I24，S25，L26，F27，S28，L30，K31，R33，H34，D35，G37，Q40，E41，E42，G44，N45，Q46，Q48，K49，A50，E51，E58，Q61，Q62，N65，S68，T69，K70，D71，S73，A74，D77，E78，T79，L80，D82，K83，T86，Y89，Q90，N93，D94，E96，A97，V99，I100，Q101，G102，V103，G104，T106，E107，T108，P109，L110，M111，K112，E113，D114，L117，R120，K121，Q124，R125，T127，L128，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，P137，C138，A145，M148，R149，S152，L153，N156，Q158，E159，S160，L161，R162，S163，K164或E 165，所述位置相对于在本文中被鉴定为SEQID NO：32+R23K的干扰素-α2a序列编号。

以下残基被测定为其侧链平均具有大于50％分数ASA：D2，L3，P4，Q5，T6，H7，S8，L9，R12，R13，M16，A19，S25，F27，S28，K31，R33，H34，D35，G37，E41，G44，N45，Q46，Q48，K49，N65，K70，A74，D77，E78，T79，D82，K83，T86，Y89，Q90，N93，D94，I100，Q101，G102，G104，T106，E107，T108，P109，L110，E113，D114，L117，R120，K121，Q124，R125，L128，K131，E132，K134，P137，R149，E159，L161，R162，S163，K164和E165，所述位置相对于在本文中被鉴定为SEQID NO：32+R23K的干扰素-α2a序列编号。

与SEQ ID NO：1相应的残基的表面暴露：

由于在很多干扰素α序列(包括所有已知人干扰素α序列(除IFN-α2亚型外)和本发明的具体多肽)中，一个氨基酸在人干扰素-α2亚型(例如，干扰素-α2b(SEQ ID NO：32)和干扰素-α2a(SEQ ID NO：32+R23K))第44位后的插入，所述表面暴露的残基的位置编号相对于hIFNα2b(SEQ ID NO：32)所示序列的编号将在例如比对图2中所示序列中的第44位以后产生一个残基的位移。

根据上述分析，以下位置(相对于SEQ ID NO：1编号)被认为包含这样的氨基酸残基，其具有大于25％分数ASA：位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，16，19，20，22，23，24，25，26，27，28，30，31，33，34，35，37，40，41，42，44，46，47，49，50，51，52，59，62，63，66，69，70，71，72，74，75，78，79，80，81，83，84，87，90，91，94，95，97，98，100，101，102，103，104，105，107，108，109，110，111，112，113，114，115，118，121，122，125，126，128，129，132，133，134，135，136，137，138，139，146，149，150，153，154，157，159，160，161，162，163，164，165，和166。

同样地，以下位置(同样相对于SEQ ID NO：1编号)被认为包含这样的氨基酸残基，所述残基的侧链具有平均大于50％分数ASA：2，3，4，5，6，7，8，9，12，13，16，19，25，27，28，31，33，34，35，37，41，44，46，47，49，50，66，71，75，78，79，80，83，84，87，90，91，94，95，101，102，103，105，107，108，109，110，111，114，115，118，121，122，125，126，129，132，133，135，138，150，160，162，163，164，165，和166。

实施例2干扰素-α多肽的抗病毒活性

慢性HCV感染患者的起始病毒载量为10⁴-10⁷拷贝的HCV RNA/ml。通过用IFN-α治疗，病毒载量特征性地历经两个不同的对数线性衰减期，这反映了两种不同的机制(图1B)。病毒载量在大约第一个两日中出现首次下降，其被认为是由于感染的肝细胞响应干扰素-α治疗而导致的病毒生成速率降低。

HCV造成的主要技术挑战是该病毒不能在体外生长，仅仅最近能在驯顺的动物模型中进行培养。然而，一些能在体外复制的病毒被认为可用作HCV病毒复制的替代品。认为可预测体内HCV抗病毒活性的体外替代测定法包括上述测定法，其通过在人肝来源的细胞系HuH-7中使用EMC RNA病毒(EMCV)来检测受试分子保护T细胞使其免受病毒感染的致细胞病变效应的能力。

本发明的一些IFN-α多肽的抗病毒活性按上文材料和方法的章节中所述EMCV/HuH-7抗病毒测定法中进行测定。一些本发明的多肽表现出大约等于或高于参照分子例如huIFN-α2b(SEQ ID NO：32)或huIFN-α2a(SEQID NO：32+R23K)的抗病毒活性，如本发明多肽的EC₅₀(在测定中产生半数最大保护性反应的样品浓度)大约等于或低于参照分子EC₅₀所证实。一些本发明的所述多肽表现出比参照分子的抗病毒活性高至少约1.5倍，至少约2倍，至少约4倍，至少约5倍，或至少约10倍的抗病毒活性(如该多肽的EC₅₀分别比参照分子的EC₅₀低约0.66x或更低，约0.5x或更低，约0.25x或更低，约0.2x或更低，或约0.1x或更低所证实的)。

下表7显示了本发明的若干示例性IFN-α多肽的相对抗病毒活性，与在相同条件下测定的IFN-αCon1和人IFN-α2b相比较，表示为相对于huIFN-α2b的抗病毒活性(EC₅₀huIFN-α2b/EC₅₀样品)。

表7

样品名称	序列	相对于huIFNα-2b的抗病毒活性
			B9x14	SEQ IDNO：3	＝10
B9x25	SEQ ID NO：12	＝10
			B9x16	SEQ ID NO：3+H47Q	＝10
B9x28	SEQ ID NO：12+E133K.A140S	＝10
			B9x23	SEQ ID NO：12+H47Q	＝10
B9x18	SEQ ID NO：3+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H	＝10

样品名称	序列	相对于huIFNα-2b的抗病毒活性
			B9x22	SEQ ID NO：12+V51T，F55S，L56V，Y58H	＝10
B9x11	SEQ ID NO：3+E133K.A140S	＝10
			B9x17	SEQ ID NO：3+V51T，F55S，L56V，Y58H	＝10
B9x27	SEQ ID NO：12+H47Q，E133K，A140S	＝10
			B9x12	SEQ ID NO：3+H47Q，E133K，A140S	＝10
B9x21	SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H	＝10
			B9x26	SEQ ID NO：12+V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	＝5
B9x24	SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	＝5
			B9x15	SEQ ID NO：3+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	＝5
25Ep05	SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，N72D，N95D，F154L，K160E，R161S，R164S	＝2.5
			IFN α-Con1	SEQ ID NO：43	～2
huIFNα-2b	SEQ ID NO：32	1

实施例3干扰素-α多肽的T_H1分化活性

慢性HCV感染患者的起始病毒载量为10⁴-10⁷拷贝HCV RNA/ml。通过用IFN-α治疗，病毒载量特征性地历经两个不同的对数线性衰减期，这反映了两种不同的机制(图1)。病毒载量在第一个两日中出现首次下降，其被认为是由于感染的肝细胞响应干扰素-α治疗而导致的病毒生成速率降低。其在大约两日后达到新的稳定状态，此时可观测到病毒清除率的第二，速度较低的快速对数线性期。该第二期通常被认为是由抗原特异性T细胞导致的对被感染肝细胞的杀伤。IFN-α治疗被认为通过刺激抗原特异性T细胞分化为T_H1细胞而在该生物反应中发挥关键性作用。

不受具体理论的限制，可以认为刺激T_H0细胞分化为T_H1细胞的能力增强的干扰素-α表现出更强(robust)的病毒清除第二期，因此具有增强的病毒清除效力。基于该起作用的(working)假设，实施测定法来检测干扰素-α对从供血者分离的chushi T_H0细胞的T_H1分化活性。

本发明一些IFN-α多肽的T_H1分化活性按上面材料和方法章节中所述进行测定。一些本发明的所述多肽表现出大约等于参照分子例如huIFN-α2b(SEQ ID NO：32)或huIFN-α2a(SEQ ID NO：32+R23K)的T_H1分化活性，如本发明多肽的EC₅₀(在测定中产生半数最大干扰素-γ产量的浓度)大约等于参照分子EC₅₀所证实的。一些本发明的多肽表现出的T_H1分化活性高于参照分子的T_H1分化活性，如本发明多肽EC₅₀低于参照分子的EC₅₀所证实的。

实施例4干扰素-α多肽的抗增殖活性

IFN-α可抑制多种细胞类型的增殖，虽然该抗增殖作用通常在高于抗病毒反应所需的剂量下发生。Daudi细胞是人来源的EVB所转化的B细胞系，其对IFN-α敏感。该IFN-α反应性细胞系可用作本发明的IFN-α的抗增殖作用的探针。此外，高剂量的IFN-α对巨核细胞和嗜中性细胞的抗增殖活性被认为可分别促使血小板减少(thrombocytopenia)、和中性粒细胞减少(neutropenia)。Daudi抗增殖测定可用作对这些其它淋巴细胞类型的抗增殖作用的替代测定法。

本发明的一些IFN-α多肽的抗增殖活性按上面材料和方法章节中所述进行测定。一些本发明的多肽表现出与参照分子诸如huIFN-α2b(SEQ IDNO：32)或huIFN-α2a(SEQ ID NO：32+R23K)的抗增殖活性大约相同的抗增殖活性，如多肽的EC₅₀(在测定中产生半数最大胸苷掺入的浓度)大约等于参照分子的EC₅₀所证实的。一些本发明的多肽表现出的抗增殖活性大约等于或大于参照分子的抗增殖活性，如本发明多肽的EC₅₀大约等于或低于(例如，约0.75倍，约0.5倍，或约0.25倍)参照分子的EC₅₀所示的。一些本发明的多肽表现出的抗增殖活性大约等于或小于参照分子的抗增殖活性，如本发明多肽的EC₅₀大约等于或高于参照分子的EC₅₀所证实的。一些本发明的所述多肽表现出的抗增殖活性比参照分子的抗增殖活性低约0.75倍或更低，约0.66倍或更低，约0.5倍或更低，约0.25倍或更低，约0.2倍或更低，或约0.1倍或更低(如本发明多肽的EC₅₀分别比参照分子的EC₅₀高至少约1.3倍，至少约1.5倍，至少约2倍，至少约4倍，至少约5倍，或至少约10倍所证实的)；所述本发明的多肽仍然表现出可检测的抗增殖活性。

下表8显示了本发明的若干示例性多肽的相对抗增殖活性，其与在相同条件下测定的人IFN-α2b和IFN-αCon1相比较，并表示为相对于huIFN-α2b的抗增殖活性(EC₅₀huIFN-α2b/EC₅₀样品)。

表8

样品名称	序列	相对于huIFNα-2b的抗增殖活性
			B9x14	SEQ ID NO：3	＝0.5
B9x25	SEQ ID NO：12	＝0.5
			B9x16	SEQ ID NO：3+H47Q	＝0.25
B9x23	SEQ ID NO：12+H47Q	＝0.5
			B9x18	SEQ ID NO：3+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H	＝0.25
B9x22	SEQ ID NO：12+V51T，F55S，L56V，Y58H	＝0.5
			B9x17	SEQ ID NO：3+V51T，F55S，L56V，Y58H	＝0.5
B9x27	SEQ ID NO：12+H47Q，E133K，A140S	＝0.25

样品名称	序列	相对于huIFNα-2b的抗增殖活性
			B9x21	SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H	＝0.5
B9x26	SEQ ID NO：12+V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	＝O.25
			B9x24	SEQ ID NO：12+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	＝0.25
B9x15	SEQ ID NO：3+H47Q，V51T，F55S，L56V，Y58H，E133K，A140S	＝0.25
			IFNα-Con1	SEQ ID NO：43	～1.5
huIFNα-2b	SEQ ID NO：32	1

实施例5：干扰素-α多肽的PEG化

下文提供了制备本发明的偶联物的示例性步骤。

Cys-PEG化

包含游离半胱氨酸的本发明多肽(例如，包含位于164位的半胱氨酸的B9x14CHO6(SEQ ID NO：49))可以是如下半胱氨酸-PEG化的。该多肽首先用等摩尔浓度的TCEP(三羧乙基膦(Triscarboxyethylphosphine))在50mMMES，100mM NaCl，pH 6.0中，于4℃、30分钟进行部分还原。然后被还原的多肽与过量四倍摩尔量的mPEG-MAL试剂(具有PEG部分诸如20kDa或30kDa线性mPEG，或40kDa支化mPEG2)在相同条件下，于4℃反应1小时。将PEG化反应混合物加样至用50mM MES，pH 6.0，100mM NaCl平衡的SP-Sepharose HP柱。在10CV(柱体积)洗涤步骤后，用0-600mM NaCl的梯度来对PEG化和未PEG化的级分进行分级。收集级分然后通过SDS-PAGE分析等分试样。集合包含单PEGF化种类(monoPEGylated species)的级分，对其配制以便进行上述干扰素-α活性测定。

Lys-PEG化

采用基于Foser，(2003)Protein Expression & Purification 30：78-87所述的方法可完成赖氨酸-PEG化。简言之，将多肽与mPEG-NHS试剂(诸如，20kDa或30kDa线性mPEG，或40kDa支化mPEG2)以多肽∶PEG(摩尔比1∶3)在50mM硼酸盐缓冲液中，于pH 9.0、4℃反应2小时。采用SP-SepharoseHP通过阳离子交换色谱分离偶联物。集合包含单PEGF化种类的级分，进行配制以便进行上述干扰素-α活性测定，然后可进一步通过氨基酸分析和/或MALDI-TOF质谱法进行定性。

N末端PEG化

采用mPEG-丁醛或mPEG-NHS(其中之一具有PEG部分诸如20kDa或30kDa线性mPEG，或40kDa支化mPEG2)的N末端PEG化在以下条件下进行：4℃，用过量5倍摩尔量的PEG试剂：多肽，在50mM MES，pH 5.5，100mM NaCl，或在50mM醋酸钠，pH 5.5，100mM NaCl中实施4-8小时。与mPEG-丁醛的反应还包括20mM氰基硼氢化钠。采用50mM MES，pH 5.5中100-600mM NaCl梯度，通过利用在50mM MES pH 5.5，100mM NaCl中平衡的SP-Sepharose HP进行色谱法来分离偶联物。集合包含单PEGF化种类的级分，进行配制以便实施上述干扰素-α活性测定。

实施例6：体内测定

检测本发明的多肽或偶联物的半寿期

按文献中记载的多种方法检测生物学或血清半寿期。例如，可采用ELISA法测定生物学半寿期来检测在例如皮下或肌内施用后干扰素-α的血清水平。使用ELISA法检测皮下施用的干扰素-α的药代动力学在例如Rostaing等，(1998)，J.Am.Soc.Nephrol.9(12)：2344-48中描述。Merimsky等，(1991)，Cancer Chemother.Pharmacol.27(5)；406-8描述了测定肌内施用的干扰素-α的血清水平。

测定体外免疫原性

本发明的多肽或偶联物的降低的免疫原性可通过使用ELISA法测定，所述ELISA法检测分子相对于参照分子或制剂(一般是已知的干扰素-α蛋白质)的免疫反应性。该ELISA法基于来自用参照蛋白质治疗的患者的抗体。当本发明的多肽或偶联物在该测定中的反应在统计学上显著低于参照分子或制剂的所述反应时，前者免疫原性被认为是降低的。

尽管为了阐明和理解的目的，已经较详细地描述了上述发明，但本领域技术人员通过阅读此公开内容可以清楚地知道：对形式和细节的多种改变并不背离本发明真正的范围。应当理解的是本文所述的实施例和实施方案仅作为例举说明的目的，且本领域技术人员应能理解其中的多种修饰和改变，而且其被包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。例如，可以以多种组合方式使用上文所述的所有技术，方法，组合物，装置和系统。为了所有的目的，本申请中提及的所有出版物，专利，专利申请或其它文件都全文列入本文作为参考，就象每个单独的出版物，专利，专利申请或其它文件为了所有目的被单独地提到需列入本文作为参考一样。

序列表

<110>马克西根公司(Maxygen，Inc.)

<120>干扰素-α多肽和偶联物

<130>0269wo310

<150>US 60/502,560

<151>2003-09-12

<150>US 60/427,612

<151>2002-11-18

<160>104

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x11

<400>1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x12

<400>2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                   70                 75                   80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                  110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列B9x14

<220>

<223>干扰素α

<400>3

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>4

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x15

<400>4

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

         35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Phe His Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>5

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x16

<400>5

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>6

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x17

<400>6

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Phe His Glu Met Met Gln Gln Thr

     50                 55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                  125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>7

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x18

<400>7

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Phe His Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

    100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>8

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x21

<400>8

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                   60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>9

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α B9x22

<400>9

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

1               5                   10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>10

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x23

<400>10

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Ash Leu

               85                   90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>11

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x24

<400>11

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>12

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25

<400>12

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Ash Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>13

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x26

<400>13

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

1                5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>14

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x27

<400>14

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>15

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x28

<400>15

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>16

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x11编码序列

<400>16

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca cttccagaag gttcaagcta tcttcctttt ctatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacaaaga agaagtatag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>17

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x12编码序列

<400>17

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gttcaagcta tcttcctttt ctatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacaaaga agaagtatag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>18

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14编码序列

<400>18

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca cttccagaag gttcaagcta tcttcctttt ctatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>19

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x15编码序列

<400>19

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca gttccagaag actcaagcta tctctgtctt ccatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacaaaga agaagtatag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>20

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x16编码序列

<400>20

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gttcaagcta tcttcctttt ctatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>21

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x17编码序列

<400>21

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca cttccagaag actcaagcta tctctgtctt ccatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>22

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x18编码序列

<400>22

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt cacaggagga ccatgatgct cctggcacaa 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgtctg aaggacagac atgacttcag atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca gttccagaag actcaagcta tctctgtctt ccatgagatg 180

atgcagcaga ccttcaacct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga atgacctgga agcctgcgtg 300

atgcaggagg ttggagtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact ttcaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>23

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x21编码序列

<400>23

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca gttccagaag actcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>24

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x22编码序列

<400>24

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca cttccagaag actcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>25

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x23编码序列

<400>25

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca gttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>26

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x24编码序列

<400>26

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca gttccagaag actcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>27

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25编码序列

<400>27

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca cttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>28

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x26编码序列

<400>28

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca cttccagaag actcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>29

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x27编码序列

<400>29

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca gttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>30

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x28编码序列

<400>30

tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgagt aacaggagga ctctgatgct catggcacaa 60

atgaggagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgatttcgg attccccgag 120

gaggagtttg atggccacca cttccagaag gttcaagcca tcttccttct ctatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaaa aattctacat tgaacttttc cagcaaatga ataacctgga agcatgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagattgcc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360

aggaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacaaaga agaaatacag cccttgttcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaagga ggaaggaa                                               498

<210>31

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-1a

<400>31

Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>32

<211>165

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-2b

<400>32

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

        35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                 55                 60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

           165

<210>33

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-4b

<400>33

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp

                165

<210>34

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-5

<400>34

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1                   5                  10                  15

Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Ash Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Asp Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ala Asn Leu Gln Glu

    145             150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>35

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-6

<400>35

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                 25                   30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Val Ala Trp Asp Glu Arg

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Trp Val Gly Gly Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>36

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-7a

<400>36

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys

145                 150                 155                 160

Gly Leu Arg Arg Lys Asp

                165

<210>37

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-8b

<400>37

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

   50                   55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met

            100                 105                 110

Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Lys Ser Lys Glu

                165

<210>38

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-l0a

<400>38

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                   40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp

                165

<210>39

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-14a

<400>39

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp

                165

<210>40

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-16

<400>40

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Gly Leu Arg Arg Lys Asp

                165

<210>41

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-17b

<400>41

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Ile Leu Arg Arg Lys Asp

                165

<210>42

<211>166

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>成熟huIFN α-21

<400>42

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>43

<211>167

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α-Con1

<400>43

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

 1               5                  10                  15

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu lys

            20                  25                  30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

        115                 120                 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

    130                 135                 140

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>44

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14C2a

<400>44

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Ash Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                  110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>45

<211>167

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO1

<400>45

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu Cys

                165

<210>46

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO3

<400>46

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>47

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4

<400>47

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

               165

<210>48

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO5

<400>48

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 13                  140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Cys Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>49

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO6

<400>49

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr GlU Met Met Gln Gln Thr

     50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Cys Lys Glu

                165

<210>50

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α14Ep01

<400>50

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>51

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α14Ep02

<400>51

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Ash Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>52

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α14Ep03

<400>52

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 13                  140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                155                  160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>53

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α14Ep04

<400>53

 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

  1               5                  10                  15

 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

         35                  40                  45

 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

     50                  55                  60

 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

 65                  70                  75                  80

 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Ash Asp Leu

                 85                  90                  95

 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

             100                 105                 110

 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

         115                 120                 125

 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

     130                 135                 140

 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Ash Leu Gln Glu

 145                 150                 155                 160

 Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                 165

<210>54

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α14Ep05

<400>54

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Ash Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>55

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α14EF

<400>55

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

           100                  105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>56

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14EP04C31

<400>56

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Cys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>57

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C31

<400>57

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1                5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Cys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>58

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C46

<400>58

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Cys His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>59

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C71

<400>59

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Cys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>60

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x 14CHO4C75

<400>60

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                   25                 30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Cys Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

   130                  135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>61

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C79

<400>61

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

       35                   40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Cys Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>62

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C107

<400>62

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Cys Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

               165

<210>63

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C122

<400>63

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Avsn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Cys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

         115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>64

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4C134

<400>64

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Cys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>65

<211>160

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14Ep04(161-166

<400>65

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Ash Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

<210>66

<211>164

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14Ep04(165-166

<400>66

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser

<210>67

<211>159

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14Ep04(1-4D44*(161-166

<400>67

Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met Leu Leu Ala Gln

 1               5                  10                  15

Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe

            20                  25                  30

Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn His Phe Gln Lys Val Gln Ala

        35                  40                  45

Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser

    50                  55                  60

Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Glu Lys Phe

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met

                85                  90                  95

Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile

            100                 105                 110

Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu

        115                 120                 125

Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met

    130                 135                 140

Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Ash Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser

145                 150                 155

<210>68

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO4NP1

<400>68

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg Gln Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                   40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

       115                  120                  125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>69

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素α B9x14CHO4NP2

<400>69

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg Gln Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                l65

<210>70

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO8

<400>70

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Arg Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>71

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO9

<400>71

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Arg Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>72

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO10

<400>72

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Arg Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>73

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO11

<400>73

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                   25                    30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Arg Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>74

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO12

<400>74

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Ash Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

 Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                 165

<210>75

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO13

<400>75

 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

  1               5                  10                  15

 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

 Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

         35                  40                  45

 Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

     50                  55                  60

 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

 65                  70                  75                  80

 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Ash Asp Leu

                 85                  90                  95

 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

             100                 105                 110

 Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

         115                 120                 125

 Leu Tyr Leu Thr Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

     130                 135                 140

 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

 145                 150                 155                 160

 Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                 165

<210>76

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO14

<400>76

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

       35                   40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Arg Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>77

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO15

<400>77

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Arg Glu

                165

<210>78

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO16

<400>78

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Arg Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>79

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO17

<400>79

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Arg Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Arg Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Sver Leu Arg Ser Lys Glu

                 165

<210>80

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO18

<400>80

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Arg Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                150                 155                  160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>81

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO18NP2

<400>81

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Arg Asp

            20                  25                  30

Arg Gln Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                   40                 45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>82

<211>164

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x14CHO18NP2(165-166

<400>82

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly His Arg Arg Thr Met Met

 1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Arg Asp

            20                  25                  30

Arg Gln Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Phe Tyr Glu Met Met Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

 Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Arg Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser

<210>83

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25CHO1

<400>83

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                      15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                   30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>84

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25CHO2

<400>84

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>85

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25CHO3

<400>85

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Cys Leu Arg Ser Lys Glu

               165

<210>86

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25CHO4

<400>86

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Cys Lys Glu

                165

<210>87

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep01

<400>87

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

    115                 120                 125

 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Ash Leu Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                         165

<210>88

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep02

<400>88

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                 25                 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>89

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep03

<400>89

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  l0                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

 65                  70                   75                 80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>90

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep04

<400>90

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>91

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep05

<400>91

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>92

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep06

<400>92

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>93

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep07

<400>93

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

    85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>94

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep08

<400>94

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                   95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Ash Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>95

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep10

<400>95

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>96

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep11

<400>96

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>97

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep12

<400>97

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>98

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep13

<400>98

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                 55                 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                 70                  75                   80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>99

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep14

<400>99

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His His Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Val Gln Ala Ile Phe Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                  110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

        130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>100

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep15

<400>100

 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

 Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

             100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>101

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep16

<400>101

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

       115                  120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>102

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25Ep17

<400>102

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asn Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>103

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25EF1

<400>103

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ser Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                  15

Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

            100                 105                 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>104

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>干扰素αB9x25EF2

<400>104

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

 1               5                  10                 15

Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                   30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe

        35                  40                  45

Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr

    50                  55                  60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu

                85                  90                   95

Glu  Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met

             100                 105                 110

vAsn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

        115                  120                  125

Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

    130                 135                 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

                165

Claims (40)

1.一种分离的或重组的多肽，其包含与选自SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15之一的序列在0-16个氨基酸位置中不同的序列，所述多肽表现出抗病毒活性。

2.权利要求1的多肽，其包含与SEQ ID NO：3在0-16个氨基酸位置中不同的序列。

3.权利要求2的多肽，其包含与SEQ ID NO：3在0-8个氨基酸位置中不同的序列。

4.权利要求1的多肽，其包含与SEQ ID NO：12在0-16个氨基酸位置中不同的序列。

5.权利要求4的多肽，其包含与SEQ ID NO：12在0-8个氨基酸位置中不同的序列。

6.权利要求1的多肽，其中所述多肽的抗病毒活性等于或大于huIFN-α2b或huIFN-α2a的抗病毒活性。

7.权利要求6的多肽，其中所述多肽的抗病毒活性比huIFN-α2b或huIFN-α2a的抗病毒活性大至少两倍。

8.权利要求1的多肽，其中所述多肽所表现出的抗病毒活性/抗增殖活性比率比huIFN-α2b或huIFN-α2a所表现出的抗病毒活性/抗增殖活性比率大至少两倍。

9.权利要求8的多肽，其中所述多肽所表现出的抗病毒活性/抗增殖活性比率比huIFN-α2b或huIFN-α2a所表现出的抗病毒活性/抗增殖活性比率大至少四倍。

10.一种偶联物，其包含

(a)权利要求1的多肽；和

(b)与该多肽的连接基团共价连接的非多肽部分。

11.权利要求10的偶联物，其包含至少两种非多肽部分。

12.权利要求10的偶联物，其包含与半胱氨酸残基共价连接的非多肽部分。

13.权利要求10的偶联物，其包含与赖氨酸残基或与N末端氨基共价连接的非多肽部分。

14.权利要求10的偶联物，其包含与赖氨酸残基共价连接的非多肽部分。

15.权利要求10的偶联物，其包含与N末端氨基共价连接的非多肽部分。

16.权利要求10的偶联物，其包含与赖氨酸残基连接的非多肽部分以及与N末端氨基连接的非多肽部分。

17.权利要求10的偶联物，其中所述非多肽部分是聚合物。

18.权利要求17的偶联物，其中所述聚合物是聚乙二醇。

19.权利要求10的偶联物，其中所述非多肽部分是糖。

20.权利要求19的偶联物，其中所述糖连接于N-糖基化位点。

21.一种组合物，其包含权利要求1的多肽以及可药用的赋形剂。

22.一种组合物，其包含权利要求25的偶联物以及可药用的赋形剂。

23.一种分离的或重组的核酸，其包含编码权利要求1的多肽的多核苷酸序列。

24.一种宿主细胞，其包含权利要求23的核酸。

25.一种载体，其包含权利要求23的核酸。

26.权利要求25的载体，其中所述载体包含质粒，粘粒，噬菌体，病毒，或病毒片段。

27.权利要求26的载体，其是表达载体，包含与启动子可操作地连接的核酸。

28.一种宿主细胞，其包含权利要求27的载体。

29.一种组合物，其包含权利要求23的核酸以及赋形剂。

30.制备权利要求1的多肽的方法，该方法包括：

提供包含宿主细胞的培养物，所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含与核酸可操作地连接的启动子，所述核酸包含编码所述多肽的多核苷酸序列，

在允许该多肽表达的条件下培养所述培养物，回收该多肽。

31.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是糖基化型宿主细胞或细菌宿主细胞。

32.一种制备偶联物的方法，所述方法包括

(i)提供权利要求1的多肽，和

(ii)将至少一种非多肽部分与所述多肽的连接基团相连，其中得到的偶联物表现出抗病毒活性。

33.权利要求32的方法，其中提供多肽的步骤包括：提供包含宿主细胞的培养物，所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含与核酸可操作地连接的启动子，所述核酸包含编码所述多肽的多核苷酸序列，

在允许该多肽表达的条件下培养所述培养物，回收该多肽。

34.权利要求33的方法，其中所述宿主细胞是糖基化型宿主细胞或细菌宿主细胞。

35.一种抑制感染了病毒的细胞中病毒复制的方法，所述方法包括：对所述细胞施用能有效抑制细胞中病毒复制的量的权利要求1所述多肽或权利要求10所述偶联物，由此抑制所述细胞中的病毒复制。

36.一种降低感染了病毒的细胞中病毒拷贝数的方法，所述方法包括：对所述细胞施用能有效降低细胞中病毒拷贝数的量的权利要求1所述多肽或权利要求10所述偶联物，由此降低所述细胞中的病毒拷贝数。

37.权利要求1的多肽或权利要求10的偶联物，其用作药物。

38.权利要求1的多肽或权利要求10的偶联物在制备用于抑制感染了病毒的细胞中该病毒复制的药物中的用途。

39.权利要求1的多肽或权利要求10的偶联物在制备用于降低感染了病毒的细胞中该病毒拷贝数的药物中的用途。

40.根据权利要求37-40的用途，其中所述病毒是HCV或HBV。

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