CN1257186C - 干扰素γ多肽变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有干扰素γ(IFNG)活性的新的干扰素γ多肽变体，其制备方法，含有该多肽变体的药物组合物及其在疾病治疗中的用途，尤其是在治疗间质性肺疾病，如自发性肺纤维化中的用途。这些新的多肽变体与huIFNG的氨基酸序列或其片段相比，全都包含S99T取代。该突变导致第97位的天然N-糖基化位点得到显著更好的利用。优选地，所述变体包含其它修饰，例如，当皮下给药时可增加所述变体的AUC。

Description

干扰素γ多肽变体
发明领域
本发明涉及具有干扰素γ(IFNG)活性的新的干扰素γ多肽变体，其制备方法，含有该多肽变体的药物组合物及其在疾病治疗中的用途，尤其是在治疗间质性肺疾病，如自发性肺纤维化中的用途。
发明背景
干扰素-γ(IFNG)是由T-淋巴细胞和天然杀伤细胞产生的一种细胞因子且以两个非共价结合的多肽亚基的同型二聚体存在。每一二聚体的成熟形式含有143个氨基酸残基(SEQ ID NO 2所示)，其前体形式包括166个氨基酸残基的信号序列(SEQ ID NO 1所示)。
各亚基具有两个潜在的N-糖基化位点(Aggarwal等，人类细胞因子，Blackwell科学出版社，1992)在位置25和97。根据糖基化的程度，二聚体形式的IFNG分子量是34-50kDa(Farrar等，免疫学年鉴，1993，11：571-611)。
Gray等(自然，298：859-863，1982)，Taya等(EMBO J.1：953-958，1982)，Devos等(核酸研究，10：2487-2501，1982)和Rinderknecht等(生物学化学杂志，259：6790-6797，1984)及在EP 77670，EP 89676和EP 110044中已报导了野生型人IFNG(huIFNG)的一级序列。Ealick等(科学，252：698-702，1991)报导了huIFNG的三维结构。
已报导了IFNG亚基多肽的各种天然存在的或突变的形式，包括一种包含Cys-Tyr-Cys N-末端氨基酸序列(相对于SEQ ID NO 17的位置(-3)-(-1))的形式，一种包含N-末端甲硫氨酸(相对于SEQ ID NO 17的位置-1)的形式，和含有127-134氨基酸残基的各种C-末端截短形式。已知可从C-末端缺失1-15个氨基酸残基而不破坏该分子的IFNG活性。而且，Pan等(欧洲生物化学杂志，166：145-149，1987)已描述了huIFNG C-末端的异质性。
Slodowski等(欧洲生物学化学杂志，202：1133-1140，1991)，Luk等(生物学化学杂志，265：13314-13319，1990)，Seelig等，(生物化学，27：1981-1987，1988)，Trousdale等(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，26：1244-1251，1985)，和在EP 146354中报导了HuIFNG突变蛋白。Nishi等(生物化学杂志，97：153-159，1985)报导了天然huIFNG变体。
US 6,046,034公开了插入4对半胱氨酸残基使得二硫键形成且因此以同型二聚体的形式稳定IFNG变体的耐热重组huIFNG(rhuIFNG)变体。
WO 92/08737公开了在野生型人IFNG的全长(残基1-143)或部分(残基1-132)氨基酸序列的N末端含有添加的甲硫氨酸的IFNG变体。EP 219 781公开了含有氨基酸残基3-124(SEQ ID NO 17中)的部分huIFNG序列。US4,832,959公开了含有氨基酸序列的残基1-127，5-146和5-127的部分huIFNG序列，该序列与SEQ ID NO 2相比具有3个添加的N-末端氨基酸残基(CYC)。US 5,004,689公开了编码无3个N-末端氨基酸残基CYC的huIFNG的DNA序列及其在大肠杆菌中的表达。EP 446582公开了大肠杆菌产生的不含N-末端甲硫氨酸的rhuIFNG。US 6,120,762公开了含有其残基95-134(相对于SEQ ID NO 18)的huIFNG肽片段。
Wang等(Sci.Sin.B 24：1076-1084，1994)报导了rhuIFNG的高水平表达。
Curling等(生物化学杂志，272：333-337，1990)和Hooker等，(干扰素和细胞因子研究杂志，1998，18：287-295)报导了rhuIFNG中的糖基化变体。
Kita等(Drug Des.Deliv.，6：157-167，1990)，和在EP 236987和US5109120中报导了rhuIFNG的聚合物修饰。
WO 92/22310报导了干扰素，特别是huIFNG的脱唾液酸糖蛋白偶联物的衍生物。
IFNG融合蛋白已有描述。例如，EP 237019公开了具有表现出干扰素β活性的区域和一个表现出IFNG活性的区域的单链多肽。
EP 0 158 198公开了具有表现出IFNG活性的区域和表现出IL-2活性的区域的单链多肽。一些文献描述了单链二聚体IFNG蛋白质，例如Landar等(分子生物学杂志，2000，299：169-179)。
WO 99/02710公开了单链多肽，其中的一个例子是IFNG。
WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的PEG连接的变体，其中，位于多肽特定区域的一个非必需氨基酸残基被一个半胱氨酸残基取代。IFNG作为生长激素超家族成员的一个例子被提及，但没有详细讨论其修饰。
已有建议将IFNG用于治疗间质性肺疾病(也称为间质性肺纤维症(IPF))(Ziesche等(新英格兰医学杂志，341：1264-1269，1999和胸科，110：增刊：25S，1996)和EP 795332)，为此可将IFNG与脱氢皮质甾醇结合使用。除了IPF外，肉芽肿性疾病(Bolinger等，临床药物学，1992，11：834-850)，某些分支杆菌感染(新英格兰医学杂志，330：1348-1355，1994)，肾癌(泌尿学杂志，152：841-845，1994)，石骨症(新英格兰医学杂志，332：1594-1599，1995)，硬皮病(风湿病学杂志，23：654-658，1996)，乙型肝炎(肝胃肠学，45：2282-2294，1998)，丙型肝炎(国际肝学通信，6：264-273，1997)，脓毒性休克(自然医学，3：678-681，1997)和类风湿性关节炎也可用IFNG治疗。
作为药用化合物，rhuIFNG被用于，例如抵抗某些病毒感染和肿瘤取得了一定的成功。rhuIFNG通常经过肠胃外使用，优选通过皮下，注射使用。7小时后发现最大血清浓度，血浆半寿期是在静脉注射给药后30分钟。因此用rhuIFNG进行有效治疗需要经常注射。主要的有害作用包括发烧，寒战，出汗，头痛，肌痛和嗜睡。这些效应与注射rhuIFNG相联系且在注射后第一个小时内观察到。罕见的副作用是局部疼痛和红斑，肝脏酶升高，可逆的粒细胞和血小板减少症及心脏毒性。
WO 01/36001公开了新的IFNG偶联物，它包含与IFNG多肽相连的非多肽组分，其中所述的IFNG多肽通过引入和/或删除针对上述非多肽组分(如PEG)的连接位点和糖基化位点而被修饰。
众所周知，当N-糖基化分子(如IFNG)在糖基化宿主中产生时，并非所有潜在的糖基化位点都被利用。这意味着常常获得具有不同程度的体内N-糖基化的蛋白混合物，导致必需随后进行纯化。而且，分离具有不同的糖基化程度的相同蛋白常常是耗时且棘手的。现在意外发现，通过取代体内N-糖基化位点(无论所述体内N-糖基化位点是IFNG中的天然位点还是如WO 01/36001所述的引入的体内N-糖基化位点)附近的一或多个氨基酸残基，有可能促进对完整糖基化IFNG分子的分级分离。尤其是发现，将hIFNG中第97，98和99位的天然N-糖基化位点N-Y-S替换为N-Y-T，大大促进对完整糖基化IFNG分子的分级分离。
发明简述
因此，本发明第一方面涉及干扰素γ多肽变体，其具有IFNG活性，并具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列([S99T]huIFNG)，或其具有IFNG活性的片段。
本发明另一方面涉及SEQ ID NO：1的变体，包括SEQ ID NO：1的片段(如SEQ ID NO：2-16)的变体，其中所述变体包含至少一个另外的修饰并表现出IFNG活性。
本发明还有一方面涉及编码本发明变体多肽的核苷酸序列。
本发明还有一方面涉及包含本发明核苷酸序列的表达载体，以及包含恩发明核苷酸序列或本发明表达载体的糖基化宿主细胞。
本发明还涉及包含本发明多肽变体的药物组合物，以及本发明多肽变体或本发明药物组合物的医药用途。
本发明还有一方面涉及本发明多肽变体或本发明药物组合物在制备治疗间质性肺疾病的药物中的用途。
类似地，本发明还涉及治疗或预防间质性肺疾病的方法，所述方法包括对有相应需要的哺乳动物，尤其是人类，施用有效量的本发明多肽变体或本发明药物组合物。
本发明还有一方面涉及IFNG多肽变体的群体，或涉及包含IFNG多肽变体的群体的组合物，其中所述群体包含至少70％的本发明IFNG多肽变体。
本发明另一方面涉及增加亲本IFNG多肽的体内N-糖基化程度的方法，所述亲本IFNG多肽包含至少一个具有氨基酸序列N-X-S的体内N-糖基化位点，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，所述方法包括将所述N-X-S氨基酸序列中的丝氨酸残基用苏氨酸残基取代，以获得IFNG变体。
本发明还有一方面涉及制备本发明IFNG多肽变体的方法，该方法包括：
(a)培养糖基化宿主细胞，该细胞包含编码本发明IFNG多肽变体的核苷酸序列，所用的培养条件有利于所述多肽变体的表达；
(b)任选地，使所述多肽变体与一种非多肽组分在体外有利于进行偶联的条件下反应；以及
(c)回收所述多肽变体。
本发明的其它方面可从以下描述中明显看出。
附图说明
图1是rhuIFNG的经优化的糖基化变体Western印迹的结果。左侧Western印迹：泳道1：标准品，泳道2：Actimmune，泳道3：rhuIFNG，泳道4：[E38N]rhuIFNG。中部Western印迹：泳道1：标准品，泳道2：rhuIFNG，泳道3：[E38N+S40T]rhuIFNG。右侧Western印迹：泳道1：标准品，泳道2：rhuIFNG，泳道3：[S99T]rhuIFNG，泳道4：[E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
图2显示对大鼠皮下给药后，血清-时间曲线中的IFNG活性。●：Actimmune，■：rhuIFNG，▲：[E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
所有化合物施用相同的剂量(1.15×107AU/kg)。
图3显示对大鼠皮下给药后，血清-时间曲线中的IFNG活性。●：[N16C+S99T]rhuIFNG(与5 kDa mPEG相连)，■：[N16C+S99T]rhuIFNG(与10kDa mPEG相连)，▲：[E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
[E38N+S40T+S99T]变体的给药剂量为1.15×107AU/kg，而两种PEG化变体的给药剂量为4.6×106AU/kg。
发明详述
定义
在本申请和发明的说明书中使用了下列定义：
术语“偶联物”(或可互换的“偶联的多肽”)意指由一个或多个多肽共价连接到一个或多个非多肽组分上形成的杂合的(指复合或嵌合的意义)分子。术语共价连接的意思是多肽和非多肽组分直接共价连接到另一组分上，或者通过诸如桥，间隔，或连接组分等一个或多个间插组分间接共价连接到另一组分上。优选的是，偶联物在有关浓度和条件下是可溶的，即在诸如血液等生理学液体中是可溶的。本发明的偶联多肽的例子包括糖基化和/或PEG连接的多肽。对于偶联物的多肽部分可使用术语“未偶联的多肽”。
术语“非多肽组分”意指能偶联到IFNG多肽的连接基团上的分子。该分子的优选例子包括聚合物分子，亲脂性化合物，糖组分或有机衍生物。当在本发明的偶联物环境中使用时应理解非多肽组分通过多肽的连接基团连接到偶联物的多肽部分上。
术语“聚合物分子”定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中没有一个单体是氨基酸残基，除非该聚合物是人白蛋白或另一高丰度血浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。
术语“糖组分”意指通过体内或体外糖基化，例如N-或O-糖基化连接的碳水化合物分子。
“N-糖基化位点”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸。“O-糖基化位点”是丝氨酸或苏氨酸残基的-OH基。
术语“连接基团”意指能偶联到诸如聚合物分子或糖组分的有关非多肽组分上的氨基酸残基基团。有用的连接基团及其匹配的非多肽组分从下表中是显而易见的。
连接基团 氨基酸 非多肽组分的实例 偶联方法/-活化的PEG 参考文献
-NH2 N末端，Lys，His，Arg 聚合物，例如PEG，带酰胺基或亚胺基 mPEG-SPATresylatedmPEG Shearwater Inc.Delgado et al.，Critical reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9(3，4)：249-304(1992)
-COOH C末端，Asp，Glu 聚合物，例如PEG，带酯或酰胺基寡糖组分 mPEG-Hz体外偶联 Shearwater Inc.
-SH Cys 聚合物，例如PEG，带二硫键，马来酰亚胺或乙烯砜基团寡糖组分 PEG-乙烯砜PEG-马来酰亚胺体外偶联 Shearwater Inc.Delgado et al.，Critical reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9(3，4)：249-304(1992)
-OH Ser，Thr，-OH，Lys 寡糖组分具有酯，乙醚，氨基甲酸酯，碳酸盐的PEG 体内O-连接的糖基化
-CONH2 Asn作为N糖基化位点的一部分 寡糖组分聚合物，例如PEG 体内N糖基化
芳香族残基 Phe，Tyr，Trp 寡糖组分 体外偶联
-CONH2 Gln 寡糖组分 体外偶联 Yan和Wold，Biochemistry，1984，Jul 31；23(16)：3759-65
醛酮 氧化的寡糖 聚合物，例如PEG，PEG-酰肼 PEG化 Andresz et al.，1978，Makromol. Chem. 179：301，WO92/16555，WO02/23114
胍 Arg 寡糖组分 体外偶联 Lundblad和Noyes，ChemicalReagents for ProteinModification，CRC Press Inc.，Florida，USA
咪唑环 His 寡糖组分 体外偶联 与胍相同
对于体内N-糖基化而言，术语“连接基团”以非传统的方式使用，指组成N-糖基化位点(具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，且最优选苏氨酸)的氨基酸残基。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是糖基化期间连接糖组分的残基，但除非存在N-糖基化位点的其它氨基酸残基，否则将不能实现该连接。因此，当非多肽组分是糖组分，且偶联是通过N-糖基化实现时，与IFNG多肽的氨基酸序列改变相联使用的术语“含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基”应理解为，组成N-糖基化位点的一个，两个或所有氨基酸残基以这样的方式改变，即将功能性N-糖基化位点引入氨基酸序列或从所述序列中去掉该位点，或在所述氨基酸序列中保留了一个功能性N-糖基化位点(例如，通过用苏氨酸残基取代作为N-糖基化位点一部分的丝氨酸残基，反之亦然)。
氨基酸的命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按蛋白数据库(PDB)(www.pdb.org)的定义来用，这些名称是根据IUPAC命名法命名的(IUPAC Nomenclature和Symbolism for Amino Acids和Peptides(residue names，atom names etc.)，Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)，并在Eur.J.Biochem.152，1(1985)中对它们进行更正。术语“氨基酸残基”表示包含在下组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
在本文中氨基酸残基的编号从不含信号肽的[S99T]huIFNG(即SEQ IDNO1)的N-末端开始，或相当于从不含信号肽的huIFNG(即SEQ ID NO 17)的N-末端开始。
用于鉴定氨基酸位置/取代的术语举例说明如下：G18表示SEQ ID NO.1或17所示氨基酸序列中第18位的氨基酸。G18N表示第18位的Gly残基被Asn取代。多重取代用“+”表示，如G18N+S20T表示一种氨基酸序列，其中第18位的Gly残基被Asn取代，且第20位的Ser残基被Thr取代。备选取代可用“/”表示，如G18S/T表示以下各个取代：G18S和G18T。缺失以星号表示。例如，G18*表示第18位的Gly缺失。插入如下表示：在第18位的Gly残基之后插入一个Ser残基，表示为G18GS。取代和插入的组合如下表示：第18位的Gly残基被Ser残基取代，且在第18位之后插入Ala残基，表示为G18SA。
术语“核苷酸序列”意指两个或多个核苷酸分子的连续链。核苷酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成的，合成来源，或其任意组合的核苷酸序列。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”一般指体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如，如US 4,683,195所述。一般来说，PCR方法涉及使用能与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物进行引物延伸合成的重复循环。
“细胞”，“宿主细胞”，“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换使用且所有这些术语应理解为包括细胞生长或培养产生的后代。
“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA引入细胞的过程。
“可操作地连接”指通过酶连接或者互相之间的构型使得可行使序列的正常功能的方式将两个或多个核苷酸序列共价连接。例如，如果编码前序列或分泌先导序列的核苷酸序列作为参与多肽分泌的前蛋白表达则它与多肽的核苷酸序列可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录则它与编码序列可操作地连接；如果核糖体结合位点的位置有助于翻译，则它与编码序列可操作地连接。一般来说，“可操作地连接”意味着连接的核苷酸序列是连续的，且对于分泌的先导序列而言是连续的且在阅读相(reading phase)中。经过在方便的限制性位点连接来实现该连接。如果不存在该位点，那么可结合标准重组DNA方法使用合成寡核苷酸连接物或接头。
术语“修饰”在本文中包括取代，插入和缺失。
术语“突变”和“取代”在本文中可互换使用。
术语“引入”首先是指现有氨基酸残基的取代，但也可指插入其它的氨基酸残基。
术语“去掉”首先是指被去掉的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，但也指缺失(没有取代)去掉的氨基酸残基。
术语“含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基”是与非多肽组分结合的氨基酸残基(对于引入的氨基酸残基而言)，或曾经与之结合的氨基酸残基(对于除去的氨基酸残基而言)。
术语“一个区别”或“区别于”与特定修饰连用时，是指允许除制定的氨基酸区别以外还存在其它的区别。因此，除了本文中公开的旨在优化糖基化位点的利用或者除去和/或引入带有非多肽组分连接基团的氨基酸残基的一些改变以外，必要时，IFNG多肽变体可包含与上述改变无关的其他修饰。这可能包括，例如，C-末端截短一或多个氨基酸残基，N-和/或C-末端添加一或多个额外的残基，例如，在N-末端添加一个Met残基，在N-末端添加氨基酸序列Cys-Tyr-Cys，以及“保守氨基酸取代”，即，在具有相似特性的氨基酸组团内进行的取代，所述组团如小分子氨基酸，酸性氨基酸，极性氨基酸，碱性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸。本发明保守取代的实例具体可选自下表。
    1 丙氨酸(A)   丝氨酸(S)  苏氨酸(T)
    2 天冬氨酸(D)   谷氨酸(E)
    3 天冬酰胺(N)   谷氨酰胺(Q)
    4 精氨酸(R)   赖氨酸(K)
5 异亮氨酸(I)   亮氨酸(L)  甲硫氨酸(M) 缬氨酸(V)
    6 苯丙氨酸(F)   酪氨酸(Y)  色氨酸(W)
术语“至少一个”用于非多肽组分，氨基酸残基，取代等情况时，是指一或多个。
术语“AUCsc”或“皮下给药的曲线下面积”用其常规含义，即血清-时间曲线中IFNG活性以下的面积，这里所述的IFNG多肽变体为皮下给药，具体是在大鼠中皮下给药。一旦通过实验测定了IFNG活性-时间点，就可利用计算机程序，如GraphPad Prism 3.01，常规计算AUCsc。
术语“功能性体内半寿期”使用其通常的含义，即多肽在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽的活性为最初活性的50％的时间。
作为功能性体内半寿期测定法的备选方法，可测定“血清半寿期”，即，50％的多肽或偶联物分子在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半寿期的测定常常比功能性体内半寿期的测定简单，并且血清半寿期的大小通常可以很好地说明功能性体内半寿期大小。血清半寿期的其它可替换术语包括“血浆半寿期”、“循环半寿期”、“血清清除”、“血浆清除”和“清除半寿期”。血清半寿期可按照常规方法在大鼠中测定，参见本文材料和方法章节。重要的是应注意：本文中，给定的IFNG多肽变体的“血清半寿期”必须用静脉(iv)给药的样品来测定。
术语“血清”使用其通常的含义，即不含纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆。
多肽一般通过网状内皮系统(RES)、肾、脾或肝中一个或多个的作用，或通过特异或非特异的蛋白水解作用而清除。术语“肾清除”使用其通常的含义，即发生在肾的任何清除，例如，通过肾小球过滤、肾小管排泄或在肾小管细胞中的降解来完成。通常，肾清除取决于多肽的物理特性，包括分子量、大小(相对于肾小球过滤的截留值而言)、对称性、形状/刚性和电荷，与之相连的糖链，以及该多肽的细胞性受体的存在。肾清除的截留值一般认为是分子量约67kDa。肾清除可通过任何合适的试验来测定，如已建立的体内试验。例如，可将标记(如，放射标记或荧光标记)的偶联多肽给予患者，并测定所收集的患者尿液中的标记物活性来测定肾清除。肾清除的减少可经过与参照分子，如huIFNG，[S99T]huIFNG或Actimmune进行比较而确定。将要保留的功能通常选自抗病毒活性、抗增殖活性，免疫调节活性或IFNG受体结合活性。
涉及功能性体内半寿期或血清半寿期的术语“增加”用于指，IFNG变体当静脉给药并且在可比条件下测定时，相应半寿期相对于参照分子有统计学显著的增加，所述参照分子如糖基化huIFNG(SEQ ID NO：17)，糖基化[S99T]huIFNG(SEQ ID NO：1)或Actimmune(SEQ ID NO：34，产于大肠杆菌中)。因此，有兴趣的IFNG多肽变体是，与上述参照分子相比，功能性体内半寿期或血清半寿期增加的变体。
更具体地，所需IFNG变体是这样的变体，当静脉给药，尤其当在大鼠中静脉给药时，它们与huIFNG或[S99T]huIFNG在糖基化形式时血清半寿期(或功能性体内半寿期)的比率至少为1.25，更优选至少1.5，如至少1.75，例如至少2，更优选至少3，如至少4，例如至少5。
有兴趣的IFNG变体的其它实例是这样的变体，当静脉给药，尤其当在大鼠中静脉给药时，它们与Actimmune(SEQ ID NO：34，产于大肠杆菌中)的血清半寿期(或功能性体内半寿期)之比至少为2，优选至少为3，如至少为4，例如至少为5，还优选至少为6，如至少为7，例如至少为8，最优选至少为9，如至少为10。
涉及AUCsc的术语“增加”用于指，当静脉给药并且在可比条件下测定时，本发明IFNG变体的曲线下面积相对于参照分子的面积有统计学显著的增加，所述参照分子如糖基化huIFNG(SEQ ID NO：17)，糖基化[S99T]huIFNG(SEQ ID NO：1)或Actimmune(SEQ ID NO：34，产于大肠杆菌中)。因此，优选的IFNG变体是，与上述参照分子相比，AUCsc增加的变体。显然，施用本发明IFNG变体的IFNG活性水平应该与施用参照分子的相同。结果是，为了直接比较不同的IFNG分子，可将AUCsc值标准化，即它们可表示为AUCsc/施用剂量。
特别优选的IFNG变体是这样的变体，它们与糖基化huIFNG或糖基化[S99T]huIFNG的AUCsc之比至少为1.25，更优选至少1.5，如至少2，更优选至少3，如至少4，例如至少5或至少6，更优选至少7，如至少8，例如至少9或至少10，最优选至少12，如至少14，例如至少16，至少18或至少20，尤其当在大鼠中(皮下)给药时。
特别优选的IFNG变体的其它实例是这样的变体，它们与Actimmune(SEQ ID NO：34，产于大肠杆菌中)的AUCsc之比至少为100，更优选至少为150，如至少为200，例如至少为250，还优选至少为300，如至少为400，例如至少为500，最优选至少为750，如至少为1000，例如至少1500或至少2000，尤其当在大鼠中静脉给药时。
术语“Tmax，sc”用于指IFNG活性的血清-时间曲线中，观察到血清中最高水平IFNG活性的时间。本发明优选的IFNG变体是这样的变体，它们与Actimmune或与糖基化huIFNG相比，Tmax，sc增加。更具体地，所述优选的变体的Tmax，sc(大鼠皮下给药以后测定)至少为200分钟，如至少为250分钟，例如至少为300分钟，更优选至少为350分钟，如至少为400分钟。
术语“降低的免疫原性”是指本发明的IFNG多肽变体比在相当条件下测定的参照分子，例如huIFNG或Actimmune产生可测定的更低的免疫反应。免疫应答可以是细胞或抗体介导的反应(参见，例如，Roitt：基础免疫学(第8版，Blackwell)，可得到免疫原性的进一步定义)。一般情况下，抗体的反应性降低表明免疫原性降低。免疫原性降低可通过应用本领域已知的任何合适的方法，如体内或体外方法来测定。
本文中术语“糖基化增加”，“体内N-糖基化程度增加”或“N-糖基化程度增加”是指所连接的糖分子的水平增加，这通常是对糖基化位点的利用增加的结果。众所周知(Hooker等，1998，J.Interferon和Cytokine Res.18，287-295；Sarenva等，1995，Biochem J.，308，9-14)，当huIFNG在CHO细胞中表达时，仅约50％的IFNG分子利用全部两种糖基化位点，约40％利用一种糖基化位点(1N)，约10％未被糖基化(ON)。体内N-糖基化程度的增加可通过本领域任何合适的方法，如SDS-PAGE来测定。测定增加的糖基化作用的一个便利试验是本文中材料和方法部分的“测定增加的糖基化”章节所述。
本文中术语“IFNG多肽变体群”或“包含本发明IFNG多肽的同质群体的组合物”是指包含至少两种有不同成都糖基化的IFNG多肽的组合物。正如所理解的那样，本发明提供了获得IFNG多肽群体的手段(means)，其中所述群体中不断增多的IFNG分子被彻底糖基化。
因此，本发明还涉及本发明IFNG多肽的同质群体(即这样一个群体，其中大多是IFNG多肽都彻底糖基化)或包含本发明IFNG多肽的同质群体的组合物。例如，所述IFNG多肽群体可能包含至少70％的本发明IFNG多肽，优选至少75％，如至少80％，例如至少85％，更优选至少90％，如至少95％，例如至少96％，还更优选至少97％，如至少98％，例如至少99％。
术语“表现出IFNG活性”是指多肽具有天然huIFNG或rhuIFNG的一种或多种功能，包括体外或体内测定的结合IFNG受体的能力和通过huIFNG与其受体结合而导致信号转导的能力(即体外或体内生物活性)。Aguet等(Cell，55：273-280，1988)和Calderon等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4837-4841，1988)描述了IFNG受体。一个适于检验IFNG活性的试验是本文中的“初步试验”。利用本文所述的“初步试验”时，“表现出IFNG活性”的多肽的比活性为rhuIFNG的至少5％。应该理解，由于具体修饰的不同(例如所述变体是否PEG化)，活性可以在一个较宽的范围内。因此，相对于rhuIFNG的比活性可以低至5％或者高至150％。例如，所述比活性可以是rhuIFNG的10％(例如10-125％)，如至少15％(例如15-125％)，如至少20％(如20-125％)，至少25％(例如25-125％)，至少30％(例如30-125％)，至少35％(例如35-125％)，至少40％(例如40-125％)，至少45％(例如45-125％)，至少50％(例如50-125％)，至少55％(例如55-125％)，至少60％(例如60-125％)，至少65％(例如65-125％)，至少70％(例如70-125％)，至少75％(例如75-125％)，至少80％(例如80-125％)或至少90％(例如90-110％)。
“IFNG多肽”是表现出IFNG活性的多肽，即，术语“IFNG多肽”用于指任何IFNG分子(无论该分子是huIFNG，其截短型，或其变体)，只要该IFNG分子表现出本文所述的IFNG活性。术语“IFNG多肽”在本文中按需要用于表示单体或二聚体形式的多肽。例如，当表示具体的取代时，它们通常表示huIFNG多肽单体的取代。当涉及本发明IFNG分子时，一般是二聚体形式(且因此，例如，包含两个按所述修饰的IFNG多肽单体)。IFNG多肽的二聚体形式可通过两个单体的正常结合来提供，或者以单链二聚体IFNG多肽的形式来提供。
术语“亲本”是指根据本发明改进了糖基化位点的IFNG多肽。通过本发明进行修饰的亲本多肽可以是任何IFNG多肽，并因此可以源自任何来源，例如非人哺乳动物来源，但优选亲本多肽是具有氨基酸序列SEQ IDNO：17或其片段的huIFNG多肽。
“片段”是全长IFNG多肽序列中表现IFNG活性的一部分(例如，全长huIFNG多肽的一种片段如SEQ ID NO：17所示，全长[S99T]huIFNG多肽变体的一种片段如SEQ ID NO：1所示)，例如其C-末端或N-末端截短型。IFNG多肽变体片段的具体实例包括，C-末端截短1-15个氨基酸残基的[S99T]huIFNG，例如截短1个氨基酸残基(SEQ ED NO：2)，2个氨基酸残基(SEQ ID NO：3)，3个氨基酸残基(SEQ ID NO：4)，4个氨基酸残基(SEQ IDNO：5)，5个氨基酸残基(SEQ ID NO：6)，6个氨基酸残基(SEQ ID NO：7)，7个氨基酸残基(SEQ ID NO：8)，8个氨基酸残基(SEQ DD NO：9)，9个氨基酸残基(SEQ ID NO：10)，10个氨基酸残基(SEQ ID NO：11)，11个氨基酸残基(SEQ ID NO：12)，12个氨基酸残基(SEQ ID NO：13)，13个氨基酸残基(SEQID NO：14)，14个氨基酸残基(SEQ ID NO：15)或15个氨基酸残基(SEQ IDNO：16)，和/或N-末端截短1-3个氨基酸残基的[S99T]huIFNG。huIFNG片段的具体实例包括，C-末端截短1-15个氨基酸残基的huIFNG，例如截短1个氨基酸残基(SEQ ID NO：19)，2个氨基酸残基(SEQ ID NO：20)，3个氨基酸残基(SEQ ID NO：21)，4个氨基酸残基(SEQ ID NO：22)，5个氨基酸残基(SEQ ID NO：23)，6个氨基酸残基(SEQ ID NO：24)，7个氨基酸残基(SEQ IDNO：25)，8个氨基酸残基(SEQ ID NO：26)，9个氨基酸残基(SEQ ID NO：27)，10个氨基酸残基(SEQ ID NO：28)，11个氨基酸残基(SEQ ID NO：29)，12个氨基酸残基(SEQ ID NO：30)，13个氨基酸残基(SEQ ID NO：31)，14个氨基酸残基(SEQ ID NO：32)或15个氨基酸残基(SEQ ID NO：33)，和/或N-末端截短1-3个氨基酸残基的huIFNG。
如上所述，IFNG多肽变体除了S99T取代以外，还可包含至少一个另外的修饰，只要该变体表现出IFNG活性，即所述变体可以是[S99T]huIFNG的变体，或[S99T]huIFNG的片段的变体。这类变体的具体实例包括引入和/或去除了氨基酸残基、包含非多肽组分连接基团的变体。[S99T] huIFNG(及其片段)的变体的其它实例包括以上“背景技术”章节中所述的变体，例如包括N-末端添加了的Cys-Tyr-Cys或添加了Met的[S99T]huIFNG，以及US6,046,034中公开的半胱氨酸修饰的变体。
一般情况下，本发明的变体由核苷酸序列编码，该核苷酸序列与亲本IFNG多肽的编码序列相比，已经按照本发明进行了修饰。
但并不总是如此，因为所述变体多肽可以在翻译后加工过程中进行C-末端或N-末端截短，例如在细胞中、表达介质中、纯化期间等被蛋白酶从C-末端或N-末端裂解，导致所得变体多肽为最初产生的变体多肽的截短型(例如，尽管最初产生的是全长变体，但由于对该全长变体多肽的翻译后加工，可以获得C-末端截短的变体多肽)。在这种情况下，术语“亲本”应理解为将要按照本发明进行修饰的截短形式。
“变体”是一种多肽，它与其亲本多肽(正常情况下是SEQ ID NO：17或其截短型，如SEQ ID NOS：19-33所示)具有一个或多个氨基酸残基的区别，一般是1-15个氨基酸残基(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸残基)的区别，例如1-10个氨基酸残基，1-5个氨基酸残基，或1-3个氨基酸残基。
术语“功能性位点”是指IFNG的功能或功效所必需的或者与之相关的一个或多个氨基酸残基。该氨基酸残基“位于”功能性位点。功能性位点可用本领域已知的方法测定且优选经过分析与诸如IFNG受体的相关受体复合的多肽结构来鉴定。
术语“huIFNG”是指野生型人IFNG的具有氨基酸序列SEQ ID NO：17的成熟形式。
术语“rhuIFNG”是指通过重组手段制备的、野生型人IFNG的具有氨基酸序列SEQ ID NO：17的成熟形式。
术语“[S99T]huIFNG”是指野生型人IFNG中第99位的丝氨酸残基已经被苏氨酸残基取代了的成熟形式(见SEQ ID NO：1)。
本文中术语“糖基化huIFNG”是指所述huIFNG多肽中能使其糖基化的细胞中产生，并因此在其天然N-糖基化位点(SEQ ID NO：17的第25和97位)被糖基化。
类似地，术语“糖基化huIFNG变体”是指所述IFNG多肽变体中能使其糖基化的细胞中产生。
本文中术语“Actimmune”是指IFNG的140个氨基酸的形式(Actimmune在C-末端截短了4个氨基酸并且在N-末端包括一个Met残基)(见SEQ ID NO：34)，它通过使遗传工程化大肠杆菌发酵而获得。关于Actimmune的进一步信息见www.actimmune.Com。
本发明的干扰素γ多肽变体
具有优化的体内糖基化位点的本发明IFNG变体
如上文所述，意外发现，通过将huIFNG(或其片段)第99位的丝氨酸残基替换为苏氨酸残基，可以使huIFNG第97位的天然N-糖基化位点的糖基化增多，即可使彻底糖基化或基本上彻底糖基化的IFNG分子所占比例增加。图1显示，衬底糖基化的IFNG多肽的显著增加是可以实现的。在[S99T]huIFNG(SEQ ID NO：1)多肽变体的情况中可以观察到，培养基中收获的这种多肽变体约90％利用了全部两种N-糖基化位点，而培养基中收获的rhuIFNG多肽仅有约60％被彻底糖基化。
相应地，本发明一个方面涉及表现出IFNG活性并具有氨基酸序列SEQID NO：1的IFNG多肽变体(即[S99T]huIFNG)，或其具有IFNG活性的片段。
如上文所述，已知huIFNG的C-末端截短形式与huIFNG相比，仍保留活性，在有些情况下甚至还增强活性。因此，本发明一个优选实施方案中，本发明的IFNG多肽变体是SEQ ID NO：1的片段，该片段在C-末端截短了1-15个氨基酸残基，通常在C-末端截短1-10个氨基酸残基。SEQ ID NO：1的这类C-末端截短形式的具体实例参见SEQ ID NOS：2-16。本发明这一实施方案中的IFNG多肽片段具有IFNG活性。
应理解，这方面的糖基化IFNG多肽变体应在糖基化宿主细胞中重组表达，优选哺乳动物宿主细胞，如在“与糖组分的偶联”一节中提到的那些细胞。
如上文所解释的，rhuIFNG在CHO细胞中时，所表达的IFNG多肽群体中仅约50-60％被彻底糖基化。因此，本发明IFNG多肽变体的主要优点之一是对第97位的体内糖基化位点的高度利用，这导致获得相对于huIFNG更均一的群体。由于该更均一的群体，包含这样的IFNG多肽变体群体的组合物(如收获在培养基中的)无需象rhuIFNG那样进行繁琐而耗时的纯化。
因此，本发明另一方面涉及IFNG多肽变体的群体，或包含IFNG多肽变体群体的组合物，其中所述群体包含至少约70％的本发明IFNG多肽变体。优选所述组合物包含至少75％，更优选至少80％，还更优选至少85％，如至少约90％的本发明IFNG多肽变体。
更尤其，本发明涉及IFNG多肽变体的群体，或包含IFNG多肽变体群体的组合物，其中所述群体包含至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，还更优选至少85％，如至少约90％的具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的本发明IFNG多肽变体。
类似地，本发明还涉及IFNG多肽变体的群体，或包含IFNG多肽变体群体的组合物，其中所述群体包含至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，还更优选至少85％，如至少约90％的具有选自下组的氨基酸序列的本发明IFNG多肽变体：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQBD NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。
除了上文提到的、优化rhuIFNG中第97位的体内糖基化位点所需的S99T突变，还可优化已引入SEQ ID NO：1或其片段(例如，为了增加血清半寿期和/或增加AUCsc)的其它体内糖基化位点。一般情况下，所述体内糖基化位点为N-糖基化位点，但本发明也涉及O-糖基化位点。所述优化可通过在靠近糖基化位点(尤其靠近体内糖基化位点)的位置进行修饰(优选取代)而实现。通常，这样的体内N-糖基化位点是引入的体内N-糖基化位点。适于引入体内N-糖基化位点的合适位置可参见WO 01/36001，并将在下文描述。
“靠近”糖基化位点的氨基酸残基通常位于位置-4，-3，-2，-1，+1，+2，+3或+4(相对于与糖相连的糖基化位点的氨基酸残基而言)，优选位置-1，+1，或+3，尤其位置+1或+3。靠近体内N-糖基化位点(具有序列N-X-S/T/C)的氨基酸残基可以位于位置-4，-3，-2，-1，+1，+2，+3或+4(相对于N-残基而言)。
当相对于N-残基而言的位置+2被修饰时，应理解仅有限量的修饰有可能发生，因为为了维持/引入体内N-糖基化位点，该位置的氨基酸残基必需是Ser，Thr或Cys。
在本发明特别优选的实施方案中，在相对于N-残基而言的位置+2进行的修饰是取代，其中目标氨基酸残基被Thr残基取代。但如果该氨基酸残基已经是Thr残基，通常并不优选或必需在该位置进行任何取代。当X被修饰，X应不是Pro，优选不是Trp，Asp，Glu或Leu。被引入的氨基酸残基优选选自Phe，Asn，Gln，Tyr，Val，Ala，Met，Ile，Lys，Gly，Arg，Thr，His，Cys或Ser，更优选Ala，Met，Ile，Lys，Gly，Arg，Thr，His，Cys或Ser，尤其Ala或Ser。
当相对于N-残基而言的位置+3被修饰时，将要引入的氨基酸残基优选选自His，Asp，Ala，Met，Asn，Thr，Arg，Ser或Cys，更优选Thr，Arg，Ser或Cys。当X残基是Ser残基时，特别优选上述修饰。
因此，在天然体内N-糖基化方面，第97位的N-糖基化位点可以通过在选自下组的位点进行修饰(如取代)而被进一步优化：E93，K94，L95，T96，Y98，V100或T101(即，相对N97而言的位置-4，-3，-2，-1，+1，+3或+4)。在SEQID NO：1(或其片段)的第98位进行取代的具体实例包括Y98F，Y98N，Y98Q，Y98V，Y98A，Y98M，Y98I，Y98K，Y98 G，Y98R，Y98T，Y98H，Y98C或Y98S，优选Y98A，Y98M，Y98I，Y98K，Y98G，Y98R，Y98T，Y98H，Y98C或Y98S，尤其Y98S。在SEQ ID NO：1(或其片段)的第100位进行取代的具体实例包括V100H，V100D，V100A，V100M，V100N，V100T，V100R，V100S，或V100C，尤其V100T，V100R，V100S或V100C。
类似地，第25位的体内N-糖基化位点可以通过在选自下组的位点进行修饰(如取代)而被进一步优化：D21，V22，A23，D24，G26，L28或F29(即，相对于N25而言的位置-4，-3，-2，-1，+1，+3或+4)。在SEQ ID NO：1(或其片段)的第26位进行取代的具体实例包括G26F，G26N，G26Y，G26Q，G26V，G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C或G26S，优选G26A，G26M，G26I，G26K，G26R，G26T，G26H，G26C或G26S，更优选G26A或G26S，尤其G26A。在SEQ ID NO：1(或其片段)的第28位进行取代的具体实例包括G28H，G28D，G28A，G28M，G28N，G28T，G28R，G28S，或G28S，尤其G28A，G28T，G28R，G28S或G28C。
显然，上述与优化位置97的糖基化相关的任何修饰可以与上述与优化位置25的糖基化相关的任何修饰组合。
AUCsc增加和/或血清半寿期增加的本发明IFNG变体
本发明另一方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的IFNG多肽变体，所述变体具有IFNG活性。
本发明还涉及IFNG多肽片段的变体，它具有选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQID NO：16，其中所述变体具有IFNG活性。
因此，所述变体与SEQ ID NOS：1-16相比包含至少一个进一步的修饰。
为了避免过多破坏[S99T]huIFNG多肽变体(或其片段)的结构和功能，按照本发明修饰的氨基酸残基的总数一般不超过15个。通常，IFNG多肽变体相对于氨基酸序列SEQ ID NO 1有1-10个修饰，例如1-8，2-8，1-5，1-3或2-5个修饰。优选所述修饰为取代。应理解，类似的考虑对于具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的IFNG多肽变体的片段的变体也是适用的。因此，当所述变体是SEQ ID NOS：2-16中任一种序列的变体时，这样的变体与SEQ ID NOS：2-16所示的相关氨基酸序列相比，常常有不到15处修饰，通常1-10处修饰，例如1-8，2-8，1-5，1-3或2-5个修饰。优选所述修饰是取代。
因此，正常情况下IFNG多肽变体(即除了S99T取代以外还包含至少一个修饰的变体)包含下述氨基酸序列，该序列与氨基酸序列SEQ ID NO：1(或其片段)有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸残基不同。
在本发明一个优选是实施方案中，所述IFNG变体(进一步)引入和/或除去至少一个氨基酸残基，该残基含有非多肽组分的连接基团。
通过除去或引入包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，有可能使该多肽进行特别适应，以便制备出更易于与所选非多肽组分进行偶联的分子，从而优化偶联模式(如确保非多肽组分在IFNG多肽变体表面的优化分布)，并因此获得具有IFNG活性的新偶联分子，此分子具有另外一或多种比基于huIFNG或rhuIFNG的现有分子改进的特性。例如，通过引入连接基团，IFNG多肽变体可强化或改变与相关非多肽组分结合的特异性氨基酸残基的含量，从而获得更有效、更专一和/或更广泛的偶联。通过除去一或多个连接基团，有可能在多肽上与非多肽组分偶联有不利后果的部位避免这样的偶联，所述部位如该多肽的功能性位点或其附近的氨基酸残基(因为在这样的位点进行偶联可能导致所得偶联多肽由于受体识别能力受损而失活或IFNG活性减弱)。此外，将靠近另一连接基团的连接基团除去可能有利于避免与这种基团发生不均一性偶联。在优选实施方案中，IFNG多肽的不止一个氨基酸残基被改变，例如所述改变涉及除去或引入带有所选非多肽组分的连接基团的氨基酸残基。该实施方案特别优选，因为它有可能特异性设计IFNG多肽变体，从而获得与非多肽组分的优化偶联。
除了引入和/或除去氨基酸残基，所述多肽变体还可包含不改变带有非多肽组分连接基团的氨基酸残基的引入和/或去除的其它修饰，如取代。这类修饰的实例包括保守氨基酸取代和/或将Cys-Tyr-Cys或Met引入N-末端。
可用于偶联的以及出现在二聚化IFNG多肽变体中的连接基团的确切数目取决于偶联所要达到的效果。而所要达到的效果取决于，例如偶联的性质和程度(例如，非多肽组分的同一性，在应进行偶联或应避免偶联的情况中希望或可能与多肽偶联的非多肽组分的数量，等)。
应理解，带有非多肽组分连接基团的氨基酸残基，无论是被除去还是被引入，对它的选择都基于所选非多肽组分的特性，并且在大多数情况中，基于所用的偶联方法。例如，当非多肽组分是聚合物分子如聚乙二醇-衍生的或聚环氧乙烷验收的分子时，能作为连接基团的氨基酸残基选自半胱氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或精氨酸。特别优选半胱氨酸。当非多肽组分是糖组分时，连接基团例如是体内糖基化位点，优选N-糖基化位点。
每当在具有氨基酸序列SEQ ID NO：1(或其片段)的IFNG多肽中引入或除去非多肽组分的连接基团时，需修饰的多肽位置按如下进行适当选择：
该位置优选位于IFNG多肽的表面，更优选该位置由有至少25％的侧链暴露于溶剂(优选至少50％的侧链暴露于溶剂的氨基酸残基占据，该氨基酸残基)，如基于二聚化IFNG的三维结构或模型所测定的那样，该结构或模型任选进一步包含一个或两个IFNG受体分子。这样的位置列于本文实施例1中。
另外感兴趣的是修饰亲本IFNG的任意23个C-末端氨基酸残基(尤其通过引入含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基)，因为据信这样的残基位于IFNG多肽的表面。
另外，优选对IFNG多肽环区的一或多个氨基酸残基进行修饰，因为这些环区中的大多数氨基酸残基都暴露在表面且离功能性位点足够远，远到引入非多肽组分(如聚合物分子，尤其PEG分子)和/或N-糖基化位点不会影响该分子的功能。这样的环区可以通过观察huIFNG的三维结构来确定。组成所述环区的氨基酸残基是残基N16-K37(A-B环)，F60-S65(B-C环)，N83-S84(C-D环)和Y98 L103(D-E环)。
组成IFNG受体结合位点的氨基酸残基是Q1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119(见本文实施例2)。通常优选不将一个非多肽组分的多个连接基团(如额外的N-糖基化位点和/或半胱氨酸残基)引入该分子的这一位点。
为了测定连接基团的优化分布，根据IFNG二聚体多肽的三维结构计算位于IFNG多肽表面的氨基酸残基之间的距离。更具体地，测定含有所述连接基团的氨基酸残基的CB之间的距离，或者测定其中一个氨基酸残基的官能团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)与含有连接基团的另一氨基酸残基的CB之间的距离。在甘氨酸的情况中，用CA代替CB。在本发明的IFNG多肽部分中，任何所述的距离优选超过8，特别是超过10，以避免或减少不均一性偶联。
另外，IFNG多肽变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1(或其片段)的区别在于，除去了组成表位的一部分的一个或多个氨基酸残基，优选通过取代含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基来除去，以便破坏或灭活该表位。通过使用本领域已知的方法，也称为表位定位法，可鉴定[S99T]huIFNGhuIFNG或rhuIFNG的表位，参见，例如Romagnoli et al.，Biol Chem，1999，380(5)：553-9，DeLisser EN，Methods Mol Biol，1999，96：11-20，Van de Water et al.，Clin Immunol Immunopathol，1997，85(3)：229-35，Saint-Remy JM，Toxicology，1997，119(1)：77-81，and Lane DP和Stephen CW Curr Opin Immunol，1993，5(2)：268-71。一种方法是建立表达例如9个氨基酸残基的随机寡肽的噬菌体展示文库。通过免疫沉淀法从抗[S99T]huIFNG，huIFNG或rhuIFNG的特异性抗血清纯化IgGl抗体，通过免疫印迹鉴定反应性噬菌体。通过测定纯化的反应性噬菌体的DNA序列，可测定寡肽的序列，随后在IFNG的三维结构上定位该序列。由此鉴定的该结构上的区域构成表位，然后可选择该表位作为导入非多肽组分的连接基团的靶区域。
功能性体内半寿期和血清半寿期取决于，例如，多肽变体的分子量，而使半寿期增加所需的连接基团数目取决于所选非多肽组分的分子量。在一个实施方案中，经Laemmli，U.K.，Nature Vol 227(1970)，p680-85所述的SDS-PAGE测定，本发明的IFNG多肽变体具有至少67kDa的分子量，尤其至少70kDa。IFNG的分子量范围是大约34-50kDa，因此还需要约20-40kDa以获得所需的效果。这可以，例如，由2-4个10kDa的PEG分子或组合额外的体内糖基化位点和额外的PEG分子来提供，如本文其它部分所述。
优选本发明的偶联的IFNG多肽变体有1-10个(额外的)非多肽组分，如1-8，2-8，1-5，1-3或2-5个(额外的)非多肽组分。通常，偶联的变体有1-3个(额外的)非多肽组分，如1，2或3个(额外的)非多肽组分。
如上所述，在生理条件下，huIFNG为二聚体多肽。所述多肽通常是同型二聚体形式(例如，通过与按本文所述制备的两个IFNG多肽分子结合来制备)。然而，如果需要，IFNG多肽变体可以以单链形式提供，其中两个IFNG多肽单体可通过肽键或肽接头连接。以单链形式提供IFNG多肽变体的优势在于，其中的两个IFNG多肽可以不同，这种不同有利于，例如，允许多肽的不对称诱变。例如，从其中一个单体的受体结合位点去掉PEG化位点，但保留另一个单体的位点。这样一来，PEG化后，一个单体具有完整的受体结合位点，而另一个被彻底PEG化(且因此提供显著增大的分子量)。
非多肽组分是糖组分时的本发明IFNG变体
在本发明的优选实施方案中，SEQ ID NO：1(或其片段)所示IFNG变体至少引入和/或除去至少一个糖基化位点。优选该糖基化位点为体内糖基化位点，即非多肽组分是糖组分，例如O-连接的或N-连接的糖组分，优选N-连接的糖组分。
在本发明一个感兴趣的实施方案中，所述变体引入至少一个糖基化位点，尤其一个体内N-糖基化位点。优选引入的糖基化位点通过取代而引入。
例如，可将体内N-糖基化位点引入SEQ ID NO：1(或其片段)所示IFNG多肽中的一个位置，所述多肽有暴露在表面的氨基酸残基，优先该氨基酸残基有至少25％的侧链暴露于表面，尤其至少50％的侧链暴露于表面。对这类位置的测定详见本文实施例1。
引入N-糖基化位点，所用的引入方式使该位点的N-残基位于所述位置中。类似地，引入O-糖基化位点，使组成该位点的S或T残基位于所述位置中。应理解，术语“至少25％(或至少50％)的侧链暴露在表面”当与体内N-糖基化位点的引入联用时，它表示实际上与糖组分连接的位置中氨基酸侧链的表面可接近特性。在很多情况下，必须在相对于实际上与糖组分相连的天冬酰胺残基而言为+2的位置上引入丝氨酸或苏氨酸残基(当然，除非此位置已被丝氨酸或苏氨酸残基占据)，这些引入了丝氨酸或苏氨酸残基的位置可以被掩盖，即它有不到25％的侧链暴露在表面。
另外，为了保证有效糖基化，优选体内糖基化位点，特别是N-糖基化位点的N残基或O-糖基化位点的S或T残基位于IFNG多肽的118个N-末端氨基酸残基内，更优选在97个N-末端氨基酸残基内。另外更优选的是，体内糖基化位点引入的位置是只需要一个突变就可产生该位点的位置(即，产生功能性糖基化位点所需的任何其它氨基酸残基已存在于该分子中)。
例如，导致在暴露于IFNG多肽表面并被有至少25％的侧链暴露于该表面的氨基酸残基占据的位置引入另一N-糖基化位点的取代包括：Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，S40N+R42S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，D63N，D63N+S65T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，Q67N，Q67N+S69T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/，K80N+F82S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，E119N，E119N+S121T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N或R140N+S142T，所示的取代相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相对于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS：2-16的相关片段)。S/T表示取代为丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。
导致在暴露于IFNG多肽(其具有至少50％的侧链暴露于表面(在具有受体分子的结构中))表面的位置导入另一N-糖基化位点的取代包括：P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40S，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，D62N+Q64S/T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，K94N，K94N+T96S，T1O1N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，F136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相对于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS：2-16的相关片段)。S/T表示取代为丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。
导入一个N-糖基化位点时仅需要一个氨基酸突变的那些取代包括K12S/T，G18S/T，G18N，K37S/T，E38N，M45N，I49N，K61S/T，D63N，Q67N，V70N，K80S/T，F82N，N85S/T，K87S/T，K94N，Q106S/T，E119N，A124N，K130N和R140N，尤其K12S/T，G18N，G18S/T，K37S/T，E38N，K61S/T，D63N，Q67N，K80S/T，N85S/T，K94N，Q106S/T，A124N，K130N，和R140N(具有超过25％的侧链暴露于表面(在不含受体分子的结构中)的位置)，或更优选G18N，E38N，D63N，Q67N，K94N，S99N，A124N，K130N和R140N(在不含受体分子的结构中具有超过50％的侧链暴露于表面)。
通常，不优选将N-糖基化位点引入构成受体结合位点的区域中(除了在特殊情况下，参见题为“受体亲和力降低了的变体”)。相应地，通常不应实施突变Q1N+P3S/T，E9N+L11S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E119N或E119N+S121T，除非希望受体亲和力降低。
本发明特别优选的变体包括SEQ ID NO：1(或其具有氨基酸序列SEQID NOS：2-16的片段)，其中所述变体具有IFNG活性并包含至少一个选自下组的取代：K12S，K12T，G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S或Q106T，更优选选自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N或Q106T，还更优选选自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T或N85T，尤其E38N+S40T。
在本发明另一感兴趣的实施方案中，SEQ ID NO：1(或其具有氨基酸序列SEQ ID NOS：2-16的片段)包含至少两个引入的糖基化位点，尤其至少两个引入的N-糖基化位点。导致引入至少两个N-糖基化位点的至少两个修饰(尤其取代)优选选自K12S，K12T， G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S或Q106T，更优选选自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N或Q106T，还更优选选自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T或N85T。产生变体(其包含至少两个额外的N-糖基化位点)的这类取代的具体实例包括：K12T+G18T，K12T+E38N+S40T，K12T+K61T，K12T+N85T，G18T+E38N+S40T，G18T+K61T，G18T+N85T，E38N+S40T+K61T，E38N+S40T+N85T和K61T+N85T。
从上面所列的取代中，优选选择位于118个N-末端氨基酸残基内的取代，特别是位于97个N-末端氨基酸残基内的取代。
本发明的IFNG多肽变体每个单体可含有单个体内糖基化位点(与SEQID NO：1或其片段相比)。然而，为了变成足够大小以增加血清半寿期，通常需要该多肽包含不止一个额外的体内N-糖基化位点，特别是2-7个或2-5个额外的体内N-糖基化位点，例如2，3，4，5，6或7个体内N-糖基化位点。这样的体内N-糖基化位点优选通过上文所列的一或多个取代来引入。
此外，应理解，上述任一种修饰可与“具有优化的体内糖基化位点的本发明IFNG变体”一节所公开的任何修饰组合，尤其与取代G26A组合。
本发明的IFNG变体，其中非多肽组分是具有半胱氨酸作为连接基团的 分子
在另一优选实施方案中，SEQ ID NO：1(或其片段)所示本发明IFNG变体包含至少两个引入的半胱氨酸残基。例如，可将半胱氨酸残基引入具有SEQ ID NO：1(或其片段)且有暴露在表面的氨基酸残基的IFNG多肽中。优选所述暴露在表面的氨基酸残基有至少25％的侧链暴露在表面，尤其至少50％的侧链暴露在表面。对这类位置的确定详见本文实施例1。
例如，导致在暴露于IFNG多肽表面并被有至少25％的侧链暴露于该表面的氨基酸残基占据的位置(在具有受体分子的结构中)引入一个半胱氨酸残基的取代包括：Q1C，D2C，P3C，K6C，E9C，N10C，K13C，Y14C，N16C，G18C，H19C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，N35C，K37C，E38C，E39C，S40C，K55C，K58C，N59C，K61C，D62C，D63C，Q64C，S65C，Q67C，K68C，E71C，T72C，K74C，E75C，N78C，V79C，K80C，N83C，S84C，N85C，K86C，K87C，D90C，E93C，K94C，T101C，D102C，L103C，N104C或E119C，所示的取代相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相对于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS：2-16的相关片段)。
导致在暴露于IFNG多肽表面并被有至少50％的侧链暴露于该表面的氨基酸残基占据的位置(在具有受体分子的结构中)引入一个半胱氨酸残基的取代包括：P3C，K6C，N10C，K13C，N16C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，K37C，E38C，E39C，K55C，K58C，N59C，D62C，Q64C，S65C，K68C，E71C，E75C，N83C，S84C，K86C，K87C，K94C，T1O1C，D102C，L103C或N104C，所示的取代相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的[S99T]huIFNG(或相对于其具有氨基酸序列SEQ ID NOS：2-16的相关片段)。
通常，不优选将半胱氨酸残基引入构成受体结合位点的区域中(并随后将该半胱氨酸残基与非多肽组分连接)(除了在特殊情况下，参见题为“受体亲和力降低了的变体”)。相应地，通常不应实施突变Q1C，E9C，G18C，H19C，D21C，G26C，K34C，K37C和E119C，除非希望降低受体亲和力。
更优选所述半胱氨酸残基通过选自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C或A124C的取代来引入。
在本发明另一感兴趣的实施方案中，SEQ ID NO：1(或其具有氨基酸序列SEQ ID NOS：2-16的片段)包含至少两个引入的半胱氨酸残基。导致引入至少两个半胱氨酸残基的至少两个修饰(尤其取代)优选选自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C或A124C。产生变体(其包含至少两个引入的半胱氨酸残基)的这类取代的具体实例包括：N10C+N16C，N10C+E38C，N10C+N59C，N10C+N83C，N10C+K94C，N10C+N104C，N10C+A124C，N16C+E38C，N16C+N59C，N16C+N83C，N16C+K94C，N16C+N104C，N16C+A124C，E38C+N59C，E38C+N83C，E38C+K94C，E38C+N104C，E38N+A124C，N59C+N83C，N59C+K94C，N59C+N104C，N59C+A124C，N83C+K94C，N83C+K94C，N83C+N104C，N83C+A124C，K94C+N104C，K94C+A124C和N104C+A124C。
可以理解，优选使引入的半胱氨酸残基与非多肽组分(PEG或更优选mPEG)偶联。含半胱氨酸的多肽变体与聚合物分子的偶联可用任何适当的方式实现，如“与聚合物分子的偶联”一节所述的方式，例如该节所述的一步法或逐步的方式。使IFNG多肽变体PEG化的优选方法是，用半胱氨酸反应性PEG使PEG与半胱氨酸残基共价连接。目前市场上已有多种带有不同基团的高特异性、半胱氨酸反应性PEG(如，正吡啶基-二硫化物，马来酰亚胺和乙烯砜)和大小不同的PEG(2-20kDa，如5kDa，10kDa，12kDa或15kDa)，例如Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL，USA的产品。
应理解，上述任一种修饰可与“具有优化的体内糖基化位点的本发明IFNG变体”一节所公开的任何修饰组合，尤其与取代G26A组合。
本发明的IFNG变体，其中第一种非多肽组分是糖组分，第二种非多肽 组分是具有半胱氨酸残基作为连接基团的分子
在优选实施方案中，SEQ ID NO：1(或其片段)所示的本发明IFNG变体包含至少一个引入的N-糖基化位点和至少一个引入的半管氨酸残基。所述变体可通过选择前两节中所述、分别适于引入N-糖基化位点和半胱氨酸残基的残基来制备。但在本发明一个优选实施方案中，所述变体包含选自以下的取代：K12T+N16C，K12T+E38C，K12T+N59C，K12T+N83C，K12T+K94C，K12T+N104C，K12T+A124C，G18T+N10C，G18T+E38C，G18T+N59C，G18T+N83C，G18T+K94C，G18T+N104C，G18T+A124C，E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C，E38N+S40T+N104C，E38N+S40T+A124C，K61T+N10C，K61T+N16C，K61T+E38C，K61T+N83C，K61T+K94C，K61T+N104C，K61T+A124C，N85T+N10C，N85T+N16C，N85T+E38C，N85T+N59C，N85T+K94C，N85T+N104C，N85T+A124C，K94N+N10C，K94N+N16C，K94N+E38C，K94N+N59C，K94N+N83C，K94N+N104C，K94N+A124C，Q106T+N10C，Q106T+N16C，Q106T+E38C，Q106T+N59C，Q106T+N83C，Q106T+K94C或Q106T+A124C，更优选选自E38N+S40T+N10C，E38N+S40T+N16C，E38N+S40T+N59C，E38N+S40T+N83C，E38N+S40T+K94C或E38N+S40T+N104C。
可以理解，优选使引入的半胱氨酸残基与非多肽组分(PEG或更优选mPEG)偶联。含半胱氨酸的多肽变体与聚合物分子的偶联可用任何适当的方式实现，如，“与聚合物分子的偶联”一节所述的方式，例如该节所述的一步法或逐步的方式。适当的聚合物是VS-mPEG或OPSS-mPEG。
此外，应理解，上述任一种修饰可与“具有优化的体内糖基化位点的本发明IFNG变体”一节所公开的任何修饰组合，尤其与取代G26A组合。
具有降低的受体亲和力的IFNG变体
增加IFNG多肽的血清半寿期的一种方法是减少受体介导的内化作用并因此降低受体介导的清除。
受体介导的内化作用取决于IFNG二聚体与IFNG受体复合物的亲和力，因此预计，与IFNG受体复合物的亲和力降低了的IFNG变体被内化并因此被清除的程度减弱。
IFNG二聚体与其受体复合物的亲和力可通过在IFNG多肽的受体结合位点进行一或多个修饰(尤其取代)而降低。构成受体结合位点的氨基酸残基见本文实施例2。有可能实施的一类取代是保守的氨基酸取代。在另一实施方案中，所述取代导致引入N-糖基化位点。
故，在一个特别优选的实施方案中，SEQ ID NO：1(或其片段)所示本发明IFNG变体在受体结合位点(如本文所述)包含至少一个修饰，如取代。更具体地，IFNG多肽在所述受体结合位点包含至少一个能产生体内N-糖基化位点的修饰，如取代。例如，所述取代选自Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，Y4N+K6S/T，V5N+E7S/T，E9N+L11S/T，K12N+Y14S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，V22N+D24S/T，D24N+G26S/T，G26N+L28S/T，L30N+I32S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，K108N+I110S/T，H111N+L113S/T，E112N+I114S/T，I114N+V116S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N或E119N+S121T，优选选自Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，E9N+L11S/T，K12N+Y14S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，H111N+L113S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N或E119N+S121T(将N-糖基化位点引入包含下述氨基酸残基的位置，该氨基酸残基有至少25％的侧链暴露在表面)，更优选选自Q1N+P3S/T，D2N+Y4S/T，E9N+L11S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，S20N+V22S/T，D21N+A23S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，Q115N+M117S/T，A118N+L120S/T，E119N或E119N+S121T(将N-糖基化位点引入包含下述氨基酸残基的位置，该氨基酸残基有至少50％的侧链暴露在表面)，还更优选选自Q1N+P3T，D2N+Y4T，E9N+L11T，G18N+S20T，H19N+D21T，S20N+V22T，D21N+A23T，K34N+W36T，K37N+E39T，Q115N+M117T，A118N+L120T或E119N+S121T，最优选选自G18N+S20T，H19N+D21T，D21N+A23T或E119N+S121T，尤其D21N+A23T。
所述变体被认为与huIFNG或Actimmune相比受体亲和力降低。受体亲和力可通过任何合适的试验和本领域已知的试验来测定。适于测定受体结合亲和力的一种试验是Michiels et al.Int.J.Biochem.Cell Biol.30：505-516(1998)所述的BIAcore试验。通过利用上述试验，被认为可用于本发明目的的IFNG变体是这样的IFNG变体，其结合亲和力(Kd)是糖基化[S99T]huIFNG或Actimmune的Kd值的1-95％。例如，IFNG多肽的Kd值是糖基化[S99T]huIFNG或Actimmune的Kd值的1-75％或1-50％，如1-25％，例如1-20％或甚至低至1-15％，1-10％或1-5％。
通常，当在，例如，本文所述“初步试验”中检测时，这种降低了受体亲和力的IFNG变体具有减弱的IFNG活性。例如，这种IFNG多肽变体具有Actimunne或rhuIFNG的比活性的1-95％，例如1-75％，如1-50％，例如1-20％或1-10％。
如上所述，这样的IFNG变体被认为由于受体介导的清除而导致其血清半寿期增加。因此，本发明这一方面的IFNG多肽变体被认为符合前文对增加的血清半寿期的定义中关于增加的血清半寿期的要求。
显然，导致受体结合亲和力的上述任一种修饰可与本文公开的任一种其它修饰组合，尤其与在下述章节中提到的修饰组合：“具有优化的N-糖基化位点的本发明IFNG变体”，“本发明的IFNG变体，其中的非多肽组分是具有半脱氨酸残基作为连接基团的分子”以及“本发明的IFNG变体，其中第一种非多肽组分是糖组分，第二种非多肽组分是具有半胱氨酸残基作为连接基团的分子”，如与G26A，E38N+S40T及其组合的组合。
偶联方法
非多肽组分
如上所述，本发明偶联物的非多肽组分优选选自聚合物分子、亲脂性化合物、糖组分(通过体内糖基化的方式)和有机衍生剂。所有这些物质都可为IFNG多肽变体提供所需特性，特别是增加AUCSC，增加血清半寿期和/或减弱免疫原性。所述多肽变体通常仅与一种类型的非多肽组分偶联，但也可以与两种或多种不同类型的非多肽组分偶联，例如，与聚合物分子和糖组分偶联，与亲脂性基团和糖组分偶联，与有机衍生剂和糖组分偶联，与亲脂性基团和聚合物分子偶联，等。当与两种不同类型的非多肽组分偶联时，优选糖组分和聚合物组分。在下列章节“与亲脂化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与糖组分的偶联”如“与有机衍生剂的偶联”中描述与各种类型非多肽组分的偶联。
与亲脂化合物的偶联
多肽和亲脂化合物可直接或者通过使用接头互相偶联。亲脂化合物可以是天然化合物，例如饱和或不饱和脂肪酸，脂肪酸二酮，萜烯，前列腺素，维生素，类胡萝卜素或类固醇，或者是合成化合物，例如具有一个或多个烷基，芳香基，链烯基或其他多个不饱和化合物的羧酸，醇，胺和磺酸。多肽和亲脂化合物之间任选通过接头的偶联可按照本领域已知的方法进行，例如，Bodanszky在肽的合成，John Wiley，纽约，1976和在WO96/12505中所述。
与聚合物分子的偶联
与多肽变体偶联的聚合物分子可以是任意合适的聚合物分子，例如天然或合成同型聚合物或杂聚物，一般具有的分子量范围是300-100,000Da或1000-50,000Da，如2000-40,000Da或2000-30,000Da，例如2000-20,000Da，2000-10,000或10005000Da。更优选，所述聚合物分子，如PEG，尤其mPEG通常的分子量约为2，5，10，12，15，20，30，40或50kDa，尤其约5kDa，约10kDa，约12kDa，约15kDa或约20kDa。
本文中提到聚合物分子时的“约”是指近似平均分子量，它反映了在给定的聚合物制剂中通常有一定程度的分子量分布的事实。
均聚物的实例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。杂聚物是含不同偶联基团(如羟基和氨基)的聚合物。
合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，或任何其它适于减小免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的生物聚合物。聚合物分子的另一实例是人白蛋白或另一丰富的血浆蛋白。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、无毒的、无抗原性的、无免疫原性的，具有各种水溶性特性并易于从活的生物中分泌。
PEG是优选的聚合物分子，因为其与，例如多糖如葡聚糖相比仅仅具有极少量的能交联的反应基团。特别感兴趣的是单功能PEG，如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因为它的偶联化学相对简单(仅仅一个反应基团可用于与多糖上的连接基团偶联)。因此，消除了交联的风险，所得的偶联型多肽变体均一性更好且聚合物分子与该多肽的反应更易于控制。
为了实现聚合物分子与多肽变体的共价连接，聚合物分子的羟基末端基团必须以活化形式提供，即，具有反应性官能团(该基团的例子包括伯胺基团，酰肼(HZ)，巯基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)，羧甲基化琥珀酰亚胺(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，醛，硝基苯碳酸酯(NPC)，和 tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子是商业上可获得的，例如从Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA获得。另外，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法活化，例如按WO 90/13540公开的方法。用于本发明的活化的线性或分支聚合物分子的具体例子在ShearwaterPolymer，Inc.1997和2000年产品目录(用于研究和制药的功能化生物相容性聚合物，聚乙二醇和衍生物，本文引用以供参考)中描述。活化的PEG聚合物的具体例子包括下列线性PEGs：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分支PEGs，例如PEG2-NHS和在US 5,932,462和US 5,643,575中公开的那些分子，本文引用这两篇文献以供参考。另外，本文作为参考文献引用的下列文献公开了有用的聚合物分子和/或PEG连接的化学性质：US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439,508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921,131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US 5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154316。
特别优选与半胱氨酸残基偶联的活化型PEG聚合物分子的具体实例，包括以下线性PEG：乙烯砜-PEG(VS-PEG)，优选乙烯砜-mPEG(VS-mPEG)；马来酰亚胺-PEG(MAL-PEG)，优选马来酰亚胺-mPEG(MAL-mPEG)以及正吡啶基-二硫化物-PEG(OPSS-PEG)，优选正吡啶基-二硫化物-mPEG(OPSS-mPEG)。所述PEG或mPEG聚合物的大小通常约5kDa，约10kD，约12kDa或约20kDa。
多肽变体与活化的聚合物分子的偶联可用任何常规方法进行，例如，按下列参考文献所述(所述参考文献中也描述了活化聚合物分子的适宜方法)进行：R.F.Taylor，(1991)，“Protein immobilisation.Fundamental和applications”，Marcel Dekker，N.Y；S.S.Wong，(1992)，“Chemistry of Protein Conjugation和Crosslinking”，CRC Press，Boca Raton；G T.Hermanson等，(1993)，“Immobilized Affinity Ligand Techhiques”，Academic Press，N.Y)。为了使半胱氨酸残基PEG化(见上文)，所述IFNG通常先用还原剂，如二硫苏糖醇(DDT)处理，然后再进行PEG化。还原剂随后通过任何常规方法，如脱盐法除去。PEG与半胱氨酸通常在合适的缓冲液中，在pH 6-9、4-25℃保持最多16小时而发生偶联。
技术人员知道，将要使用的活化方法和/或偶联化学取决于所述多肽的连接基团(以上已给出实例)以及聚合物的功能基(例如，是胺、羟基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀酰亚胺，马来酰亚胺，vinysulfone或卤代醋酸盐)。PEG化可涉及与多肽上的所有可利用的连接基团(即，暴露于多肽表面的连接基团)偶联，或可与一个或多个特定的连接基团如，N-末端胺基直接偶联(如US 5,985,265所述)。而且，偶联可以在一步中完成或以多步方式来完成(如，WO 99/55377所述)。
应理解，PEG化作用可设计为，使所得分子在连接的PEG分子的数目、这些分子的大小和形式(如，线性还是分支)，以及多肽分子的连接诶位点各方面最佳。例如，可根据需达到的效果来选择所使用的聚合物的分子量。。例如，如果偶联的首要目的是实现具有高分子量的偶联(例如，以便降低肾脏清除率)，通常需要偶联尽可能少的高分子量的聚合物分子以获得所需分子量。当需要高度屏蔽表位时，可通过使用足够多数量的低分子量聚合物(例如，具有大约5,000Da的分子量)以有效屏蔽该多肽的所有或大多数表位来获得。例如，可使用2-8个，例如3-6个该聚合物。
仅与蛋白质上的单个连接基团偶联时(如US 5,985,265中所述)，优选线性或分支的聚合物分子具有高分子量，例如，大约20kDa。
一般来说，在能使聚合物的所有可利用的连接基团与聚合物分子反应的条件下进行聚合物偶联。典型的是，活化型聚合物分子与多肽的摩尔比是1000-1，特别是200-1，优选100-1，例如10-1或5-1以便获得最佳反应。然而，也可使用等摩尔比率。
根据本发明还包括通过接头偶联聚合物分子与多肽。合适的接头是技术人员熟知的。优选的例子是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物学化学杂志，252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer等，(1986)，高分子科学和高分子化学杂志，编辑，  24，375-378)。
偶联后，按照本领域已知的方法，例如，通过向反应混合物中加入伯胺以封闭残余的活化型聚合物分子，并通过合适的方法去除所得的失活型聚合物分子。
与糖组分的偶联
糖组分的偶联可在体内或者体外发生。为了实现经过修饰已导入一个或多个体内糖基化位点(见“本发明的偶联物，其中非多肽组分是糖组分”部分)的具有IFNG活性的多肽的体内糖基化，将编码偶联物的多肽部分的核苷酸序列插入糖基化的真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)，昆虫或动物细胞或者选自转基因植物细胞。另外，当在基因治疗中使用编码本发明的偶联物的多肽部分或本发明的多肽的核苷酸序列时可在人体内实现糖基化。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞，BHK或者HEK细胞，例如HEK293，或昆虫细胞，例如SF9细胞，或者酵母细胞，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichiapastoris或者任何其他合适的糖基化宿主，例如，如下所述。任选的是，经过体内糖基化连接到IFNG多肽上的糖组分可通过使用糖基转移酶，例如，使用Neose，Horsham，PA，USA上市的glycoAdvanceTM技术进一步修饰。从而可以增加，例如表达后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化和CHO细胞的体内糖基化。
可使用糖苷与IFNG多肽的氨基酸残基的共价体外偶联来修饰或增加糖组分的数目或特性。根据使用的偶联方式，糖类可连接到a)精氨酸和组氨酸上，b)游离羧基上，c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基上，d)游离羟基，例如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或羟脯氨酸的游离羟基上，e)芳香族残基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基上或者f)谷氨酰胺的酰胺基上。这些氨基酸残基组成糖组分的连接基团的例子，可在本发明的偶联物的IFNG多肽中导入和/或去掉该残基。体外偶联的合适方法在例如，WO 87/05330和Aplin等，CRC生物化学的重点回顾，第259-306页，1981中描述。糖组分或PEG与蛋白质和肽结合的Gln-残基的体外偶联可通过转谷氨酰胺酶(TGases)实现，例如，按Sato等，1996，生物化学，35，13072-13080或在EP 725145中所述。
与有机衍生试剂的偶联
IFNG多肽变体的共价修饰可通过使多肽的连接基团与有机衍生试剂反应来进行。合适的衍生剂和方法在本领域中是已知的。例如，半胱氨酰基残基最常与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应，产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可与以下物质反应而衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。组氨酰基残基通过与二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0反应进行衍生，因为该试剂相对特异于组氨酰基侧链。对溴苯甲酰甲基溴化物也有效；该反应优选在pH6.0的0.1M卡可酸钠中反应。赖氨酰基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生具有使赖氨酰基残基的电荷逆转的作用。适于使含α-氨基的残基衍生的其它试剂包括亚氨基酯如甲基吡啶亚酰胺(methylpicolinimidate)、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氢硼化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。精氨酰基残基通过与一种或多种常规试剂的反应来修饰，所述试剂包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生要求反应在碱性条件下进行，因为胍功能基的pKa较高。此外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应来进行选择性修饰，其中R和R′是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰基和谷氨酰基通过与铵离子反应转化为天冬酰酰胺基(asparaginyl)和谷氨酰酰胺基(glutaminyl)。
功能性位点的封闭
已有报道：过多的聚合物偶联可导致与聚合物偶联的多肽丧失活性。该问题可通过例如，去掉位于功能性位点的连接基团或者通过在偶联前封闭功能性位点而消除。在后的策略组成本发明的其他实施方案，第一种策略在上文举例说明，例如方法是去掉靠近功能性位点的赖氨酸残基和/或在不干扰功能性位点的位置引入半胱氨酸残基和/或体内糖基化位点。
更具体的说，根据第二种策略，多肽变体和非多肽组分之间的偶联在能与IFNG多肽变体的功能性位点结合的辅助分子封闭该多肽变体的功能性位点的条件下进行。优选的，辅助分子是特异性识别多肽变体的功能性位点的分子，例如受体。或者，辅助分子可以是抗体，特别是识别该多肽变体的单克隆抗体。具体地说，辅助分子可以是具有中和作用的单克隆抗体。
然后，在实现偶联前使多肽变体与辅助分子相互作用。这样保证多肽变体的功能性位点被屏蔽或保护且随后不能被诸如聚合物等非多肽组分衍生化。其从辅助分子洗脱后，可回收非多肽组分和多肽变体之间的偶联物，其至少具有部分地保守的功能性位点。
随后，具有已封闭的功能性位点的多肽与聚合物，亲脂化合物，糖组分，有机衍生试剂或任意其他化合物以正常方式偶联，例如，按标题为“与….偶联”的上述部分所述进行。
在另一实施方案中，辅助分子首先共价偶联到诸如柱填充材料，例如交联葡聚糖或琼脂糖珠的固相上，或者表面上，例如反应器表面。随后，将多肽上样到携带辅助分子的柱材料上且按照本领域已知的方法进行偶联，例如，按标题为“与....偶联”的上述部分所述进行。该方法允许通过洗脱从辅助分子分离多肽偶联物。在不导致多肽偶联物大量降解的物理化学条件下以常规技术洗脱该多肽偶联物。含有多肽偶联物的液相从辅助分子保持共价连接在其上的固相上分离。分离可用其他方式实现：例如，用可被特异性结合剂(例如链霉抗生物素蛋白)识别的第二分子(例如生物素)衍生化辅助分子。特异性结合剂可连接到固相上，从而允许通过在随后洗脱时滞留辅助分子-第二分子复合物而不是多肽偶联物的第二辅助分子固相柱中过柱从辅助分子-第二分子复合物中分离多肽偶联物。可用任何合适的方式从辅助分子释放多肽偶联物。通过提供辅助分子从其结合的IFNG功能性位点解离的条件实现去保护。例如，偶联聚合物的抗体与抗独特型抗体之间的复合物可通过将pH调到酸性或碱性pH来解离。
经标记的多肽变体的偶联
在另一实施方案中，IFNG多肽变体可以表达为与标记物的融合蛋白，即通常由1-30，如1-20个氨基酸残基构成的氨基酸序列或肽段。除了能快速和容易地进行纯化，标记物是完成标记多肽和非多肽组分之间偶联的便利工具。特别是，标记物可用于在微滴定板或其它载体如顺磁珠上完成偶联，这样标记的多肽可通过标记物来固定。在，例如，微滴定板上与标记的多肽偶联的优点是，标记的多肽可从培养肉汤直接固定到微滴定板上(原则上不经任何纯化)并进行偶联。因此，可减少操作步骤(从表达到偶联)的总数。而且，标记物可起间隔臂分子的作用以确保使固定的多肽更易于偶联。使用标记多肽进行的偶联可以是与本文中公开的任何非多肽组分的偶联，如与聚合物分子如PEG的偶联。
使用何种具体标记物不是关键，只要该标记物能与多肽一起表达并且能固定在适宜的表面或载体物质上即可。许多适宜的标记物可通过商业渠道获得，例如，可购于Unizyme Laboratories，丹麦。例如，所述标记物可以是下列任一序列：
His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO：35)
Met-Lys-His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO：36)
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His(SEQ ID NO：37)
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln(SEQ IDNO：38)
(都可从丹麦，Unizyme实验室获得)或下列任一序列：
EQKLI SEEDL(SEQ ID NO：39)(描述于Mol.Cell.Biol.5：3610-16，1985的C-端标记物)
DYKDDDDK(SEQ ID NO：40)(C-或N-端标记物)
YPYDVPDYA(SFQ ID NO：41)
抗上述标记物的抗体通常可通过商业渠道获得，例如购于ADI，AvesLab和Research Diagnostics。
随后可用市售酶从多肽上将标记物切离。
制备本发明IFNG多肽变体的方法
以本领域已知的任何合适的方法可生产IFNG多肽变体，任选以糖基化形式生产。该方法包括构建编码该多肽的核苷酸序列并在合适的转化或转染的宿主细胞中表达该序列。然而，尽管效率不高，经过化学合成或化学合成的组合或者化学合成与重组DNA技术的组合也可生产本发明的多肽。
编码IFNG多肽变体(单体或单链形式)的本发明的核苷酸序列可如下构建：分离或合成编码亲本IFNG(例如具有氨基酸序列SEQ ID NO 17或其片段的huIFNG)的核苷酸序列，然后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即插入或取代)或缺失(即去掉或取代)。
按照熟知的方法，参见例如，Mark等，“人成纤维细胞干扰素基因的定点诱变”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，第5662-66页(1984)；和US4,588,585的方法经过定点诱变可常规修饰核苷酸序列。
或者，经过化学合成可制备核苷酸序列，例如，经过使用寡核苷酸合成仪，其中根据目的多肽的氨基酸序列设计寡核苷酸，且优选选择那些在生产该重组多肽的宿主细胞中有利的密码子。例如，经过PCR，连接或者连接链反应(LCR)可合成和组装编码目的多肽之部分的一些小寡核苷酸。单个寡核苷酸一般含有用于互补组装的5’或3’突出端。
一旦组装(经过合成，定点诱变或另一方法)，编码多肽的核苷酸序列可插入重组载体且与在所需转化宿主细胞中表达IFNG所必需的调控序列可操作地连接。
当然应明白为了表达编码本文所述的IFNG多肽变体的核苷酸序列，并不是所有的载体和表达调控序列都能同样较好地发挥功能。也不是所有的宿主用同一表达系统都能同样较好地发挥功能。然而，本领域的技术人员在这些载体，表达调控序列和宿主中不需过多的实验就可作出选择。例如，在选择载体时，必须考虑到宿主，因为载体必须在宿主中复制或者能整合进染色体中。还应考虑载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力，和由该载体编码的任何其他蛋白质，例如抗生素标记的表达。在表达调控序列的选择中，也应考虑各种因素。这些包括，例如，序列的相对长度，其调控能力，其与编码多肽的核苷酸序列的相容性，特别是要考虑到潜在的二级结构。宿主的选择应考虑到其与选定载体的相容性，该核苷酸序列编码的产物的毒性，其分泌特征，其正确折叠多肽的能力，其发酵或培养要求，和该核苷酸序列编码的产物的纯化简便性。
重组载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒。作为选择，载体是引入宿主细胞时整合进宿主细胞基因组且与其整合进的染色体一起复制的载体。
该载体优选是一种表达载体，其中编码IFNG多肽变体的核苷酸序列可操作地连接到该核苷酸序列转录所需的其他片段上。该载体一般从质粒或病毒DNA衍生。本文提及的用于在宿主细胞中表达的许多合适的表达载体是商业上可获得的或在文献中描述的。用于真核宿主的有用的表达载体包括，例如，含有来自SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。具体载体是，例如，pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jola，CA，USA)。用于细菌宿主的有用表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(两者都来自Novagen Inc.，WI，USA)，广谱宿主范围的质粒，例如RP4，噬菌体DNAs，例如，λ噬菌体的众多衍生物，如NM989，和其他DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。酵母细胞的有用的表达载体包括2μ质粒及其衍生物，POT1载体(US4,931,373)，在(Okkels，纽约科学院年报，782，202-207，1996)中所述的pJSO37载体和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。用于昆虫细胞的有用的载体包括pVL941，pBG311(Cate等，“牛和人Mullerian抑制物质基因的分离和在动物细胞中表达人基因”，细胞，45，第685-98页(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(两者都可从Invitrogen获得)。
用于本发明的其他载体包括允许编码IFNG多肽变体的核苷酸序列以拷贝数扩增的那些载体。这些可扩增的载体是本领域熟知的。它们包括，例如，能经过DHFR扩增(参见，例如Kaufman，美国专利号4,470,461，Kaufman和Sharp，“模块二氢叶酸还原酶cDNA基因的构建：用于有效表达的信号分析”，分子细胞生物学，2，第1304-19页(1982))和谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增(参见，例如，US 5,122,464和EP 338,841)被扩增的载体。
重组载体可进一步包含能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。该序列的一个例子(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起点。当宿主细胞是酵母细胞时，能使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP 1-3和复制起点。
载体也可包含选择标记，例如其产物补充宿主细胞缺陷的基因，例如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)的TPI基因(P.R.Russell，基因，40，1985，第125-130页所述)，或者，提供对药物，例如氨苄青霉素，卡那霉素，四环素，氯霉素，新霉素，潮霉素，或氨甲蝶呤抗性的基因。对于丝状真菌，选择标记包括 amdS，pyrG,arcB， niaD， sC。
本文定义的术语“调控序列”包括表达IFNG多肽变体必须的或者有利的所有元件。各调控序列可以是天然的或者相对于编码该多肽的核酸序列是外源的。该调控序列包括，但不限于前导序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，启动子，增强子或上游活化序列，信号肽序列，和转录终止子。最少，调控序列包括启动子。
本发明可使用各种各样的表达调控序列。这种有用的表达调控序列包括与上述表达载体的结构基因相联系的表达调控序列以及已知控制原核或真核细胞或其病毒基因表达的任意序列，及其各种组合。
用于指导哺乳动物细胞中的转录的合适的调控序列的例子包括SV40和腺病毒的早期和晚期启动子，例如，腺病毒2主要晚期启动子，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子，人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)，人延伸因子1α(EF-1α)启动子，果蝇属最小型热休克蛋白70启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，人遍在蛋白质C(UbC)启动子，人生长激素终止子，SV40或腺病毒Elb区域多聚腺苷化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.，分子生物学杂志，1987年8月20日；196(4)：947-50)。
为了提高在哺乳动物细胞中的表达，可将合成的内含子插入编码IFNG多肽变体的核苷酸序列的5’非翻译区。合成内含子的例子是来自质粒pCI-Neo(可从Promega Corporation，WI，USA获得)的合成内含子。
用于指导在昆虫细胞中转录的合适的调控序列的例子包括多角体蛋白启动子，P10启动子，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动子，杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟-早期基因启动子，和SV40多聚腺苷化序列。
用于酵母宿主细胞的合适调控序列的例子包括酵母α-交配系统的启动子，酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子，来自酵母糖酵解基因或乙醇脱氢酶基因的启动子，ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。
用于丝状真菌宿主细胞的合适的调控序列的例子包括ADH3启动子和终止子，来自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶，黑色曲霉(A.niger)α-淀粉酶，黑色曲霉或构巢曲霉(A.nidulans)葡糖淀粉酶，构巢曲霉乙酰胺酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂酶基因的启动子，TPI1终止子和ADH3终止子。
用于细菌宿主细胞的合适的调控序列的例子包括lac系统，trp系统，TAC或TRC系统的启动子，λ噬菌体的主要启动子区域。
本发明的核苷酸序列，不论是以定点诱变，合成还是以其它方法制备，都可以包含或者不含编码信号肽的核苷酸序列。当多肽需要从表达它的细胞中分泌时存在信号肽。如果存在的话，该信号肽应是可被选择表达该多肽的细胞识别的信号肽。信号肽可以是与该多肽同源的(例如一般与huIFNG相联)或异源的(即来自不同于huIFNG的另一来源)或者可以与宿主细胞是同源的或异源的，即从该宿主细胞正常表达的信号肽或一般不从该宿主细胞表达的信号肽。因此，信号肽可以是原核的，例如来自诸如大肠杆菌的细菌，或者可以是真核的，例如来自哺乳动物，或昆虫或酵母细胞。
信号肽是否存在依赖于，例如用于生产该多肽的表达宿主细胞，所要表达的蛋白质(是细胞内还是细胞外蛋白)和是否需要获得分泌。为了用于丝状真菌，信号肽可方便地来自于编码曲霉属种类淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码米赫根毛霉脂酶或蛋白酶或者Humicola lanuginosa脂酶的基因。信号肽优选来自编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸稳定淀粉酶，或者黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。为了用于昆虫细胞，信号肽可方便地来自于昆虫基因(参见WO 90/05783)，例如鳞翅目昆虫的烟草天蛾(Manduca sexta)脂动激素前体(参见US 5,023,328)，蜜蜂的蜂毒肽(Invitrogen)，蜕皮甾类UDP葡萄糖基转移酶(egt)(Murphy等，蛋白质表达和纯化，4，349-357(1993))或人胰腺脂酶(hpl)(酶学方法，284，第262-272页，1997)。
用于哺乳动物细胞的优选信号肽是huIFNG的信号肽或鼠Igκ轻链信号肽(Coloma，M(1992)，免疫学方法杂志，152：89-104)。为了用于酵母细胞，已发现合适的信号肽是来自啤酒糖酵母α-因子的信号肽(参见US 4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见O.Hagenbuchle等，自然，289，1981，第643-646页)，修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等，细胞，48，1987，第887-897页)，酵母 BAR1信号肽(参见WO 87/02670)，和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等，酵母6，1990，第127-137页)。
可以使用任何合适的宿主产生本发明的多肽或本发明偶联物的多肽部分，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系、以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、假单孢菌属或链霉菌属，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌菌株。将载体引入细菌宿主细胞可通过，例如，原生质体转化(参见如Chang和Cohen，1979，Molecular GeneralGenetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或偶联(参见如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)来进行。
合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌株，如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉，镰刀菌属或木霉菌属。真菌细胞可以通过涉及以下的过程转化：原生质体形成、原生质体转化和细胞壁通过本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适方法。在Malardier等人1989，Gene 78：147-156和WO96/00787中描述了转化镰刀菌属的合适方法。合适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌株(如酿酒酵母)、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica)、汉逊酵母属(如多形汉逊酵母)、或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics和Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology153：163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：1920；以及由Clontech Laboratories，  Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母转化系统试剂盒的产品手册)中所述的方法来转化。
适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌株(如酿酒酵母)、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica)、汉逊酵母属(如多形汉逊酵母)、或Yarrowia。用异源性DNA转化酵母细胞并从中生产异源性多肽的方法由Clontech实验室公司，Palo Alto，CA，USA(在YeastmakerTM酵母转化系统试剂盒的产品说明中)，和由Reeves等，FEMSMicrobiology Letters，99，(1992)193-198，Manivasakam和Schiestl，NucleicAcids Research，1993，Vol.21，No.18，第4414-4415页和Ganeva等，FEMSMicrobiology Letters 121(1994)159-164公开。
合适的昆虫宿主细胞的例子包括鳞翅目细胞系，例如草地贪夜蛾(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾细胞(High Five)(US 5,077,214)。昆虫细胞的转化和异源性多肽在其中的生产可按Invitrogen所述进行。
合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)，绿猴细胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)，COS 7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(例如NS/O)，幼小仓鼠肾(BHK)细胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)，和人细胞(例如，HEK 293(ATCC CRL-1573))，以及组织培养物中的植物细胞。其它合适的细胞系是本领域已知的且可从公共保藏单位获得，例如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。另外，可修饰诸如CHO细胞的哺乳动物细胞以表达唾液酸转移酶，例如，1，6-唾液酸转移酶，例如，按US 5,047,335所述，以便提高IFNG多肽变体的糖基化。
将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000进行的转染方法。这些方法在本领域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA中所述。哺乳动物细胞的培养按建立的方法进行，例如参见Animal Cell Biotechnology，Methods和Protocols，Nigel Jenkins编，1999，Human Press Inc，Totowa，NewJersey，USA和Harrison MA和Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997。
为了产生糖基化多肽，优选使用真核宿主细胞，例如上述类型的真核宿主细胞。
在本发明的生产方法中，用本领域已知的方法在适于生产多肽变体的营养培养基中培养细胞。例如，细胞可以在实验室中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、成批、补料分批或固态发酵)或在合适培养基和允许表达和/或分离所述多肽变体的条件下进行工业发酵。培养在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法来进行。合适的培养基可商购或可以按公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中所述的)。如果多肽变体分泌在营养培养基中，该多肽变体可从培养基中直接回收。如果多肽变体不被分泌，可从细胞裂解物中回收。
可通过本领域已知的方法来回收所得多肽变体。例如，可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀，从营养培养基中回收多肽变体。
所述多肽变体可以用本领域已知的各种方法，包括但不限于，色谱法(例如，离子交换，亲和，疏水，色谱聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦)，不同溶解性(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE，或提取(参见，例如，Protein Purfication，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCHPublishers，New York，1989)来纯化。表现出IFNG活性的多肽的具体纯化方法在EP 110044和未审日本专利申请186995/84中公开。
IFNG多肽变体的生物学活性可用本领域已知的任何合适的方法测定。该测定法包括对抗病毒活性的抗体中和，对蛋白激酶，寡聚腺苷酸2，5-A合成酶或磷酸二酯酶活性的诱导，如EP 41313 B1所述。该测定法还包括免疫调制测定法(参见，例如，US4,753,795)，生长抑制测定法，和测量与表达干扰素受体的细胞的结合。具体测定法在本文材料和方法部分描述。
药物组合物及其用途
本发明还涉及治疗或预防疾病，尤其炎症性疾病的改进方法，所述疾病，例如间质性肺疾病，如自发性肺纤维化；也包括肉芽肿疾病；癌症，尤其卵巢癌；感染，如肺非典型分枝杆菌感染；骨疾病(例如，骨代谢病，如恶性骨硬化病)；自身免疫病，如类风湿性关节炎；以及其它疾病，如多重耐药性结核；隐球菌性脑膜炎；囊性纤维化和肝纤维化，尤其继发于丙型肝炎的肝纤维化，所述方法包括对有相应需要的哺乳动物，尤其人类，施用有效量的本发明多肽变体或本发明组合物；最主要的优势是以较小频率的低侵入性用药实现更加有效的治疗，而且还可能降低与治疗性活性化合物发生免疫反应的危险。
本发明的分子优选在包含可药用载体或赋形剂的组合物中用药。在上下文中，“可药用”意指在给药的患者中不引起任何不想要或有害的作用的载体或赋形剂。这类可药用载体和赋形剂在本领域中是已知的(参见，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishing Company[1990]；Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides和Proteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis[2000]；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press[2000])。
本发明的分子可“以其原本的形式”和/或以其盐的形式使用。合适的盐包括但不限于，与碱金属或碱土金属，例如钠，钾，钙和镁的盐以及例如锌形成的盐。这些盐或复合物可以以结晶和/或无定形的结构存在。。
本发明的偶联物以大约相似于在用诸如Actimmune等已知的IFNG商业制剂实施的疗法中所用的剂量或者按EP 795332中限定的剂量用药。用药的精确剂量依赖于具体情况。一般来说，该剂量应能够防止或减轻所要治疗的症状或适应征的严重性或传播。对本领域的技术人员而言显而易见的是本发明的偶联物或组合物的有效量依赖于，特别是疾病，剂量，用药计划，多肽或偶联物或组合物是单独还是与其它治疗剂结合用药，组合物的血清半寿期，和病人的总体健康状态。
本发明还涉及本发明IFNG多肽变体，或本发明药物组合物，作为药物的用途。
本发明还涉及，i)本发明IFNG多肽变体或ii)本发明药物组合物，在制备药物，药物组合物或组配药盒的用途，所述药物，药物组合物或组配药盒用于治疗间质性肺疾病，尤其自发性肺纤维化；癌症，尤其卵巢癌；感染，如肺非典型分枝杆菌感染；骨疾病(例如，骨代谢病，如恶性骨硬化病)；肉芽肿疾病；自身免疫病，如类风湿性关节炎；多重耐药性结核；隐球菌性脑膜炎；囊性纤维化和肝纤维化，尤其继发于丙型肝炎的肝纤维化。最优选所述疾病是间质性肺疾病，尤其自发性肺纤维化。
本发明还公开了运送所述分子或制剂(任选还含有糖皮质激素)的改进方法(means)。
优选的剂量是每千克病人体重每剂量的多肽成分为1-4微克，更优选2-3微克。优选的剂量是每千克病人体重每剂量100-350微克，更优选100-150微克糖皮质激素。
本发明还涉及适用于治疗间质性肺疾病的组配药盒，它包括含有上述活性成分i)或ii)的第一药物组合物和含有至少一种糖皮质激素的第二药物组合物，每种组合物任选与可药用载体和/或赋形剂一起。
本发明的变体可用熟知的方法配制成药物组合物。合适的配制剂由E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences和US 5,183,746描述。
药物组合物可配制成各种形式，包括液体，胶体，冻干品，粉末，压缩固体，或任何其它合适形式。优选的形式依赖于所治疗的具体适应征且对本领域的技术人员而言是显而易见的。
药物组合物可通过口服，皮下，静脉内，大脑内，鼻内，经皮肤，腹膜内，肌肉内，肺内，阴道内，直肠，眼内或任何其它可接受的方式，例如使用PowderJect或ProLease技术来施用。尽管使用本领域熟知的技术，例如泵或植入进行大丸药注射是可接受的，但该配制剂可通过输注连续用药。在某些情况下配制剂可作为溶液或喷雾剂直接应用。优选的用药方式依赖于所治疗的具体适应征且对本领域的技术人员而言是显而易见的。
可结合其它治疗剂施用本发明的药物组合物。这些试剂可作为同一药物组合物的部分掺入或者可同时或按照任何其它可接受的治疗程序与本发明的多肽或偶联物分开用药。另外，本发明的多肽变体或药物组合物可作为其它治疗的辅助手段。特别是EP 795332所述与糖皮质激素的组合。
在另一方面，本发明涉及治疗具有抗huIFNG或rhuIFNG的循环抗体的哺乳动物的方法，该方法包括施用具有IFNG生物活性且不与所述抗体反应的化合物。该化合物优选是本文所述的偶联物且哺乳动物优选是人类。所要治疗的哺乳动物可患有IFNG用作治疗剂的任何上述疾病。另外，本发明涉及制备用于治疗具有抗huIFNG或rhuIFNG循环抗体的哺乳动物的药物产品的方法，其中具有IFNG生物活性且不与其反应的化合物配制成可注射的或其它合适的配制剂。术语“循环抗体”是指在哺乳动物中相应于用任何商业上可获得的IFNG制剂进行治疗而形成的自体抗体。
本发明还涉及编码本发明IFNG多肽变体的核苷酸序列在基因治疗应用中的用途。具体地说，令人感兴趣的是使用编码上文标题为“非多肽组分是糖组分时的本发明IFNG变体”一节所述的IFNG多肽变体的核苷酸序列。多肽变体的糖基化因此在基因治疗的过程中，即在人体中表达该核苷酸序列后实现。
涉及的基因治疗应用包括治疗预期该多肽可提供有效治疗的那些疾病。
使用基因疗法的IFNG变体的局部递送可针对目标区域提供治疗剂，从而避免与非特异性用药有关的潜在毒性问题。
体外和体内基因治疗方法都是所涉及的。
向确定的细胞群体转移潜在的治疗性基因的一些方法是已知的。对于进一步的参考文献，可参见例如，Mulligan，“The Basic Science Of GeneTherapy”，Science，260，第926-31页(1993)。这些方法包括：
直接基因转移，例如按Wolff等，“Direct Gene transfer Into MouseMuscle In vivo”，Science 247，第1465-68页(1990)所述；
脂质体介导的DNA转移，例如按Caplen等，“Liposome-mediated CFTRGene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”，NatureMed.，3，第39-46页(1995)；Crystal，“The Gene As A Drug”，Nature Med.，1，第15-17(1995)；Gao和Huang，“A Novel Cationic Liposome Reagent ForEfficient Transfection of Mammalian Cells”，Biochem.Biophys Res.Comm.，179，第280-85页(1991)所述；
逆转录病毒介导的DNA转移，例如按Kay等，“In vivo Gene Therapy ofHemophilia B：Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs”，Science，262，第117-19页(1993)；Anderson，“Human Gene Therapy”，Science，256，第808-13页(1992)所述；
DNA病毒介导的DNA转移。这种DNA病毒包括腺病毒(优选基于Ad-2或Ad-5的载体)，疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)，和细小病毒属(优选基于“缺陷型”或非自主型细小病毒的载体，更优选基于腺伴随病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。参见例如，Ali等，“The Use Of DNAViruses as Vectors for Gene Therapy”，Gene Therapy，1，第367-84页(1994)；US 4,797,368，和US 5,139,941。
非胃肠道给药剂(Parentals)
药物组合物的实例是设计成非胃肠道给药的溶液。尽管在很多情况下，药物溶液配制剂可以以适用于立即使用的液体形式提供，但所述非胃肠道配制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如无菌注射用水或无菌生理盐水溶液重新配制。
在非胃肠道给药的情况下，它们被制成冻干的配制剂或水溶液的形式，方法是根据需要，将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合，赋形剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子表面活性剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐(gluconate)缓冲剂(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
可以加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸(paraben)甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯亚甲基鎓卤化物(如苯亚甲基鎓氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以相对其它组分的量计算。
稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘附的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。
可以存在非离子表面活性剂或去污剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽以避免搅拌诱导的聚集，其也允许配制剂暴露于剪切表面压力而不导致多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(Tween20、Tween80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
活性组分也可以被包裹在通过，例如coascervation技术或通过界面聚合所制备的微囊，如羟甲基纤维素、明胶或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，包裹在胶体状药物运送体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包裹在大乳剂中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公开了这些技术。
体内给药所使用的非胃肠道制剂必须是无菌的。该过程可通过，例如，除菌滤膜的过滤而轻易完成。
在本发明一个优选实施方案中，所述药物组合物包含i)本发明的IFNG变体，ii)缓冲剂，尤其有机酸的盐，它能将稳定pH在5.0-6.5，iii)稳定剂，尤其有机糖或糖醇，iv)非离子表面活性剂，和v)无菌水。更具体地，缓冲剂选自乙酸盐，琥珀酸盐，和柠檬酸盐；稳定剂为甘露醇或山梨醇，非离子表面活性剂为Tween-20或Tween-80。优选药物组合物不包括任何防腐剂。
持续释放制剂
持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物的半渗透基质、具有合适形式如膜或微囊的基质。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技术或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能长时间释放分子如长达或超过100天，某些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。当包囊中的多肽长时间保留在体内时，它们因在37℃潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致生物活性丧失并且可能改变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基、将酸性溶液冻干、控制湿度、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物基质组合物来达到稳定。
口服用药
对于口服用药，药物组合物可以是固体或液体形式，例如，以胶囊，片剂，悬液，乳剂或溶液的形式。药物组合物优选以含有给定量活性成分的剂量单位的形式制备。用于人或其它哺乳动物的合适的每日剂量可根据病人的情况和其它因素大幅度变化，但本领域的技术人员可使用常规方法测定。
口服用药的固体剂型可包括胶囊，片剂，栓剂，粉末和颗粒。在该固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖，乳糖或淀粉混合。该剂型也可包括，如正常实践中的添加物质，例如润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊，片剂和丸剂，剂型也可包括缓冲剂。片剂和丸剂还可用肠衣制备。
所述变体可与诸如乳糖，蔗糖，淀粉粉末，链烷酸的纤维素酯，硬脂酸，滑石，硬脂酸镁，氧化镁，磷酸和硫酸的钠和钙盐，阿拉伯胶，明胶，藻酸钠，聚乙烯-吡咯烷，和/或聚乙烯醇的佐剂混合，并作成片剂或包成胶囊用于常规用药。作为选择，它们可溶于盐水，水，聚乙二醇，丙二醇，乙醇，油类(例如玉米油，花生油，棉子油或芝麻油)，黄芪胶，和/或各种缓冲液中。其它佐剂和用药方式是制药领域熟知的。载体或稀释剂可包括时间延迟材料，例如单独或与蜡一起的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本领域熟知的其它材料。
可对药物组合物进行诸如灭菌的常规制药操作和/或药物组合物可含有常规佐剂，例如防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，缓冲液，填充物，等，例如，如在本文别处所述。
口服用药的液体剂型可包括含有诸如水的本领域常用的惰性稀释剂的可药用乳剂，溶液，悬液，糖浆和酏剂。该组合物也可佐剂，例如润湿剂，甜味剂，调味剂和香味剂。
局部用药
适用于局部用药的配制剂包括适合于穿透皮肤的液态或半液态制剂(例如，擦剂，洗剂，软膏，乳膏，或糊剂)和适合于眼，耳或者鼻给药的滴剂。
肺部递送
适合于用喷射或者超声喷雾器使用的配制剂一般包含溶于水的多肽变体，它的浓度为，例如每mL溶液大约0.01到25mg变体，优选大约0.1到10mg/mL。配制剂也可包括缓冲剂和简单糖类(例如，用于蛋白质稳定化和渗透压调节)，和/或浓度范围从0.1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的缓冲剂的例子是乙酸钠，柠檬酸盐和甘氨酸。优选缓冲剂具有适合于将溶液调到pH为3至9范围的组成成分和摩尔浓度。一般来说，从1mM到50mM的缓冲剂摩尔浓度适合于该目的。可使用的糖类的例子是乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范围是配制剂重量的1％到10％。
喷雾配制剂也可含有表面活性剂以降低或防止在形成气溶胶时由溶液的雾化引起的表面诱导的蛋白质聚集。可使用各种常规表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范围一般为配制剂重量的0.001％和4％之间。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯。
具体配制剂和产生合适分散的本发明的液体颗粒的方法在WO94/20069，US 5,915,378，US 5,960,792，US 5,957,124，US 5,934,272，US 5,915,378，US 5,855,564，US 5,826,570和US 5,522,385中描述，在此引用以供参考。
与带有剂量刻度的吸入器装置一起使用的配制剂一般包含精细区分的粉末。该粉末可通过冻干并然后磨制液体偶联物配制剂来生产且也可含有稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)。一般来说，加入超过0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要可向制剂中加入一种或多种糖或糖醇。其例子包括乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制剂中的该偶联物的量的范围从大约0.01到200％(w/w)，优选从大约1到50％。然后冻干该配制剂并磨制成所需的颗粒大小。
然后将合适大小的颗粒借助于表面活性剂悬浮于推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如氯氟碳，氢氯氟碳，氢氟碳，或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。然后将该混合物装入递送装置中。适用于本发明的商业上可获得的测定剂量的吸入器例子是由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C生产的Ventolin测定剂量的吸入器。
用于粉末吸入器的配制剂包含含有偶联物的精细区分的干粉且也可包括膨胀剂，例如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇，其含量可帮助粉末从装置中散布，例如，占配制剂重量的50％到90％。粉末的颗粒在肺中应具有空气动力学特性，相应于具有大约1g/cm2密度的颗粒，具有小于10微米的平均直径，优选在0.5和5微米之间，最优选在1.5和3.5微米之间。根据本文的教导适用的粉末吸入器的例子是由Fisons Corp.，Bedford，Mass生产的Spinhaler粉末吸入器。
以US 5,997,848，US 5,993,783，US 5,985,248，US 5,976574，US 5,922,354，US 5,785,049和US 5,654,007公开的方法可产生和/或递送这些装置中的粉末。
设计用于治疗产品的肺部递送的机械装置包括但不限于喷雾器，测定剂量的吸入器，和粉末吸入器，所有这些都是本领域的技术人员所熟悉的。适用于本发明实践的商业上可获得的装置的具体例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生产的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生产的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，North Carolina生产的Ventolin测定剂量的吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts生产的Spinhaler粉末吸入器；Inhale TherapeuticSystems，Inc.，San Carlos，California的“standing cloud”装置；Alkermes，Cambridge，Massachusetts生产的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，California生产的AERx肺部药物递送系统。
在下面实施例中进一步描述本发明。该实施例不应以任何方式理解为对本说明书和权利要求书范围的限制。
材料和方法
材料
CHO-K1细胞(获自美国典型培养物保藏中心(ATCC #CCL-61))。
HeLa细胞(获自美国典型培养物保藏中心(ATCC #CCL-2))。
ISRE-Luc获自Stratagene，La Jolla USA。
pCDNA 3.1/hygro获自Invitrogen，Carlsbad USA。
限制酶和聚合酶获自New England Biolabs Inc.，Beverly，USA。
DMEM培养基：Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)，10％胎牛血清和潮霉素B获自Life Technologies A/S，Copenhagen，Denmark。
LucLite底物获自Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands。
TopCount发光仪获自Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands。
生物素化多克隆抗-任IFNG抗体BAF285获自 R & D Systems Inc.，Minneapolis，USA。
辣根过氧化物酶偶联型链亲和素P0397获自DAKO，Copenhagen，Denmark。
TMB印迹试剂获自KEM-EN-TEC，Copenhagen，Denmark。
方法
干扰素试验概述
以前已经公开了：IFNG与HeLa细胞上的IFNG受体相互作用并激活该受体。其结果是，在含有干扰素刺激应答元件(ISRE)的启动子处激活转录。因此通过在HeLa细胞中使用与萤光素酶报告基因偶联的ISRE(ISRE-luc)可筛选干扰素受体的激动剂。
初步试验(primary assay)
用ISRE-Luc和pCDNA 3.1/hygro共转染HeLa细胞，通过在含有潮霉素B的DMEM培养基中进行选择可建立转化灶(细胞克隆)。在存在或不存在IFNG的条件下筛选细胞克隆的萤光素酶活性。显示出刺激与未刺激的萤光素酶活性比率最高的那些克隆用于进一步的试验。
为了筛选多肽变体，在96孔培养板中接种15,000个细胞/孔并在DMEM培养基中保温过夜。在第二天以各种浓度向细胞中加入多肽变体以及已知的标准品。用Actimmune作为“已知的标准品”；将一小瓶Actimmune用DMEM，5％FBS稀释至300IU/ml，贮存于-80℃备用。
平板在37℃、5％CO2气体环境中培养6小时。随后向各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands)。密封平板并在TopCount发光仪(Packard)中以SPC(单光子计数)方式测量发光。
每个平板含有与IFNG一起保温的孔作为受刺激的对照，含有正常培养基的另一些孔作为未刺激对照。用刺激的和未刺激的萤光素酶活性的比率作为IFNG活性和实验间误差的内在标准。计算每一份IFNG样品相对于Actimmune标准品的单位(unit)数，表示为AU。
测定糖基化程度的增加
为了测定IFNG变体单体糖基化的不同程度，在标准条件下进行SDSPAGE凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素膜上。按照标准程序进行Western印迹，用生物素化多克隆抗人IFNG抗体(BAF285，来自R & D Systems)作为第一抗体，用辣根过氧化物酶偶联的链亲和素(P0397来自DAKO)作为第二抗体，然后用TMB印迹试剂(KEM-EN-TEC，Copenhagen，Denmark)染色。糖基化程度不同的IFNG变体单体的分布可通过目测已被染色的膜来确定。
测定AUCsc
AUCsc通过以200μl大丸剂的形式将等量(基于活性)的本发明IFNG多肽变体皮下给与大鼠来测定。
在这些实验中，使用体重220-260g的雌性Sprag-Dawley大鼠。IFNG多肽用琥珀酸钠(720mg/l)，甘露醇40g/l，polysorbat 20(100mg/l)，pH 6.0配制。
皮下给药之前，从尾静脉取一份血样，以便确保不会检测出背景IFNG活性。给药后，于10min，20min，40min，60min，120min，240min，480min，720min，1440min，1620min，1920min和2880min(有时也包括3600min)时从尾静脉取血样。将血样室温静置20min，使其凝固，然后室温5000g离心20min，制得血清。然后分离出血清，-80℃贮存，以备用上述“初步试验”测定IFNG活性。应注意，当测定PK研究的大鼠血清样品中的单位(unit)数时，将Actimmune标准品用DMEM，5％FBS和5％大鼠血清稀释。
然后将血清中单位(AU/ml)的数量对时间(min)作图，用GraphPad Prism3.01计算AUCsc。
对糖基化huIFNG和/或Actimmune进行类似的实验，以便评估本发明IFNG多肽变体与糖基化huIFNG和/或Actimmune相比的AUCsc的增加。
血清半寿期
血清半寿期通过以200μl大丸剂的形式将等量(基于活性)的本发明IFNG多肽变体皮下给与大鼠来测定。
在这些实验中，使用体重220-260g的雌性Sprag-Dawley大鼠。IFNG多肽用琥珀酸钠(720mg/l)，甘露醇40g/l，polysorbat 20(100mg/l)，pH 6.0配制。
皮下给药之前，从尾静脉取一份血样，以便确保不会检测出背景IFNG活性。给药后，于5min，10min，20min，40min，60min，120min，240min，480min，720min，1440min，1620min，1920min和2880min时从尾静脉取血样。将血样室温静置20min，使其凝固，然后室温5000g离心20min，制得血清。然后分离出血清，-80℃贮存，以备用上述“初步试验”测定IFNG活性。应注意，当测定PK研究的大鼠血清样品中的单位数时，将Actimmune标准品用DMEM，5％FBS和5％大鼠血清稀释。
然后将血清中单位(AU/ml)的数量对时间(min)作图，用WinNonLin Pro3.3计算血清半寿期。
对糖基化huIFNG和/或Actimmune进行类似的实验，以便评估本发明IFNG多肽变体与糖基化huIFNG和/或Actimmune相比的血清半寿期的增加。
暴露于表面的氨基酸残基的鉴定
结构
利用X-射线晶体学测定的huIFNG的实验性3D结构见Ealick等，Science 252：698-702(1991)的报道，其中指出了IFNG同型二聚体的C-α轨迹(trace)。Walter等，Nature 376：230-235(1995)报道了与两个可溶性IFNG受体分子复合的IFNG同型二聚体的结构。该结构的座标从未公开过。Thiel等，Structure 8：927-936(2000)报道了与两个可溶性IFNG受体分子复合的IFNG同型二聚体的结构，在该结构中第三个受体分子不与IFNG同型二聚体发生相互作用。
可接近的表面区域(ASA)
用计算机程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)计算该结构中各原子的可接近的表面区域(ASA)。该方法一般使用1.4的探针大小，并将可接近的表面区域(ASA)定义为由探针中心形成的区域。计算前，从坐标系(coordinateset)中去掉与该蛋白质不直接相关的所有水分子，氢原子和其它原子。
侧链的分部(fractional)ASA
侧链原子的分部ASA通过用侧链中原子的ASA总和除以延伸的ALA-x-ALA三肽中代表该残基类型的侧链原子的ASA值来计算。参见Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.：220，507-530。在该实例中，将CA原子视为甘氨酸残基而非其它残基的侧链的一部分。下列值作为侧链的标准100％ ASA来用：
  AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIle   69.23200.35106.25102.0696.69140.58134.6132.28147.00137.91   222222222     LeuLysMetPheProSerThrTrpTrrVal   140.76162.50156.08163.90119.6578.16101.67210.89176.61114.14   222222222
该结构中未探测到的残基被定义为100％暴露，因为可以认为这些残基位于弹性区域。
测定原子间的距离：
原子间的距离使用分子图形软件，例如InsightII v.98.0，MSI INC测定。
测定受体结合位点：
受体结合位点定义为所有下述残基，它们能通过受体结合而改变它们的可接近的表面区域。这通过至少两种ASA计算来测定：一种在配体/受体复合物的分离(isolated)的配体上，一种在完整的配体/受体复合物上。
实施例
实施例1-确定暴露在表面的氨基酸残基
所用X-线结构是IFNG同型二聚体与两分子可溶性IFNG受体复合的结构，在该结构中具有不与IFNG同型二聚体发生相互作用的第三个IFNG受体分子，参见Thiel et.al.Structure 8：927-936(2000)。所述结构由这样的IFNG同型二聚体组成，其中的两个分子yong A和B标记。为了进行构建，将另一个甲硫氨酸置于被M0标记的IFNG序列之前，并在该序列的C-末端截短10个残基(所构建的分子中，Q133是最后一个残基)。在本实施例的所有计算中，将M0从该结构中去掉。两个IFNG单体在残基120之后的结构具有极弱的电子密度，进行对残基进行建模(modeled)，直至残基T126。因此，在进行本实施例的计算之前，残基S121-T126已从该结构中除去。标有C和D的两个受体片段直接作用于IFNG同型二聚体，标有E的第三个受体分子不与IFNG同型二聚体接触，也不包括在这些计算中。
表面暴露：
对不含M0和S121-T126的分子A和B的同型二聚体进行分部ASA计算，结果在至少一个单体中下列残基有超过25％的侧链暴露在表面：Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K12，K13，Y14，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，H111，Q115，A118和E119。
在至少一个单体中下列残基有超过50％的侧链暴露在表面：Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，Q115，A118，E119。
对分子A和B(都不含M0和S 121-T126且包括受体分子C和D)的同型二聚体进行分部ASA计算，结果在至少一个单体中下列残基有超过25％的侧链暴露在表面：Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，Y14，N16，G18，H19，D21，N25，G26，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，E119。
在至少一个单体中下列残基有超过50％的侧链暴露于表面：P3，K6，N10，K13，N16，D21，N25，G26，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103和N104。
所有上述位置都是本发明修饰所针对的靶。
比较这两列残基发现，通过受体结合，从所述超过25％侧链的ASA列中去掉了K12，S20，A23，D24，T27，H111，Q115和A118，从所述超过50％侧链的ASA列中去掉了Q1，D2，E9，G18，H19，S20，A23，D24，T27，Q115，A118和E119。
该结构中未测定的残基，即残基S121，P122，A123，A124，K125，T126，G127，K128，R129，K130，R131，S132，Q133，M134，L135，F136，R137，G138，R139，R140，A141，S142，Q143，都按完全暴露在表面来处理。这些残基也组成本发明引入连接基团时的不同靶(或者可将其视为属于暴露在表面的氨基酸残基，例如具有超过25％或超过50％的暴露侧链)。
实施例2-确定受体结合位点：
按上述进行ASA计算发现，在上述复合物的至少一个单体中，IFNG分子的下列残基与在分离的二聚体上的计算结果相比具有减少的ASA：Q1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119。
实施例3-设计能以经过优化的密码子使用模式表达IFNG的表达盒
GenBank登录号为X13274的DNA序列包含编码成熟huIFNG及其天然信号肽的全长cDNA，对该DNA序列进行修饰以便帮助在CHO细胞中进行高效表达。对huIFNG核苷酸序列的密码子进行修饰，方法是使密码子的应用偏向常用于人(homo sapiens)的密码子。随后在该序列中的某些核苷酸用其它核苷酸取代以便引入DNA限制性核酸内切酶的识别位点。设计引物以便合成该基因。
通过一步PCR将引物装配成合成基因，其中用到Platinum Pfx-聚合酶试剂盒(Life Technologies)和标准三步PCR循环参数。经装配的基因通过使用相同条件的PCR进行扩增，它具有SEQ ID NO：42所示的序列。将合成的基因克隆进pcDNA3.1/hygro(InVitrogen)的BamHI和XbaI位点之间，得到pIGY-22。
利用Lipofectaim2000(Life Technologies)作为转染试剂将pIGY-22转染至CHO K1细胞中。24小时后收获培养基，用ELISA分析IFNG活性和浓度。用上述初步试验测得活性为1.4×107AU/ml。
实施例4-定点诱变
制备糖基化变体
为了将突变引入IFNG中，设计寡核苷酸，以便能通过传统的两步PCR法将由PCR产生的改变引入表达质粒(pIGY-22)中。
用到两种载体引物以及特异性突变引物：
ADJ013：5′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3′(反义下游载体引物)(SEQID NO：43)和ADJ014：5′-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3′(SEQ ID NO：44)(正义上游载体引物)。
S99T变体通过传统的两步PCR法制备，其以ADJ013和ADJ014为载体引物，以ADJ093(5′-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3′)(SEQ ID NO：45)和ADJ094(5′-AAGCTGACCAATTACACCGTGACAGACCTGAAC-3′)(SEQ ID NO：46)为突变引物，并以pIGY-22为模板。用BamHI和Xbal将447bp的PCR产物亚克隆至pcDNA3.1/Hygro(In Vitrogen)中，得到质粒pIGY-48。
用Lipofectaim2000(Life Technologies)作为转染试剂，将pIGY-48转染至CHO K1细胞中。24小时后收获培养基，分析IFNG活性。通过本文所述初步试验测出以下活性：5.1×106AU/ml。
E38N+S40T+S99T变体通过传统的两步PCR法制备，其以ADJ013和ADJ014为载体引物，以ADJ091(5′-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3′)(SEQ ID NO：47)和ADJ092(5′-AATTGGAAGAACGAGACC GATCGGAAGATCATG-3′)(SEQ ID NO：48)为突变引物，并以pIGY-48为模板。用BamHI和Xbal将447bp的PCR产物亚克隆至pcDNA3.1/Hygro(InVitrogen)中，得到质粒pIGY-54。
用Lipofectaim2000(Life Technologies)作为转染试剂，将pIGY-54转染至CHO K1细胞中。24小时后收获培养基，分析IFNG活性。通过本文所述初步试验测出以下活性：1.3×107AU/ml。
用类似于上述的标准技术制备出多种全长IFNG糖基化变体。这些变体汇编于下表1中。
制备C-末端截短的IFNG变体
有一种C-末端截短型IFNG变体在紧接Leu135的密码子的下游有一个终止密码子，它如下制备：以pIGY-22，pIGY-48和pIGY-54为模板进行一步PCR，然后用BamHI和XbaI将PCR产物亚克隆至pcDNA3.1/Hygro(InVitrogen)中。用于构建这些变体的引物是：ADJ014(见上文，上游)和5′-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT-3′(SEQ ID NO：49)(下游)。将所得质粒称为pIGY-72(野生型IFNG在Leu135之后的部分被截掉)，pIGY-73(S99T变体在Leu135之后的部分被截掉)和pIGY-74(E38N+S40T+S99T在Leu35之后的部分被截掉)。
制备含有半胱氨酸的IFNG变体
含有半胱氨酸残基的IFNG变体用Stratagene′s QuikChange′XL定点诱变试剂盒按照厂家说明进行制备。用pIGY-48作为模板得到7种IFNG变体，每种包含一个引入的半胱氨酸：N10C+S99T，N16C+S99T，E38C+S99T，N59C+S99T，N83C+S99T，K94C+S99T和S99T+N104C。类似地，用pIGY-54作为模板得到6种IFNG变体，每种包含一个引入的半胱氨酸：N10C+E38N+S40T+S99T，N16C+E38N+S40T+S99T，E38N+S40T+N59C+S99T，E38N+S40T+N83C+S99T，E38N+S40T+K94C+S99T和E38N+S40T+S99T+N104C。
实施例5-含有半胱氨酸的变体的PEG化
所有缓冲液在使用前去离子化。蛋白浓度通过测量A280来评估。
利用OPSS偶联化学进行PEG化
将1.3mg/ml的IFNG变体N16C+S99T(全长)在5mM琥珀酸钠，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH 6.0中的溶液7.2ml，与300μl 0.5M DTT室温孵育30分钟，使它还原。使IFNG变体脱盐，方法是将3个2.5ml等份用缓冲液A(50mM磷酸钠，1mM EDTA，pH8.1)加载NAP25凝胶过滤柱(Pharmacia)。每个等份洗脱为3.5ml。
将mPEG-OPSS(10KDa)溶于缓冲液A中至浓度为2mg/ml，将其以等量加入经还原并脱盐的IFNG变体中，于室温温和振荡孵育60min。
将11ml反应混合物用Vivaspin20柱(VivaScience)浓缩为1-6ml，剩余的mPEG用经过缓冲液A平衡的Sephacryl S-100柱(Pharmacia)经凝胶过滤除去。
将PEG化IFNG变体用Vivaspin 6柱(VivaScience)在5mM琥珀酸钠，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中渗滤。纯化的PEG化IFNG变体比活性为1.3×106AU/mg，如本文的初步试验所测(为相应的未PEG化IFNG变体比活性的15％)。
利用MAL偶联化学进行PEG化
将1.5mg/ml的IFNG变体N59C+S99T(全长)在5mM琥珀酸钠，4％甘露醇，0.01％Tween 20，pH6.0中的溶液1.6ml，与64μl 0.5M DTT室温孵育30分钟，使它还原。用缓冲液A(50mM磷酸钠，1mM EDTA，pH8.1)在NAP25凝胶过滤柱(Pharmacia)上使IFNG变体脱盐。每个等份洗脱为3.5ml。
将mPEG-MAL(5kDa)溶于缓冲液A中至浓度为0.5mg/ml，将其以等量加入经还原并脱盐的IFNG变体中，于室温温和振荡孵育120min。
添加硫酸铵至浓度为0.9M，将这种PEG化IFNG变体加载至已用缓冲液B(20mM磷酸钠，0.9M硫酸铵，pH6.6)平衡的1ml Resource苯基柱(Pharmacia)上。用5个柱体积的缓冲液B洗柱，然后用0-50％线性梯度的缓冲液C(20mM磷酸钠，pH6.6)以30个柱体积洗脱被结合的PEG化IFNG变体。PEG化IFNG变体在0.6M硫酸铵左右被洗脱。
将含有PEG化IFNG变体的级分汇总，在5mM琥珀酸钠，4％甘露醇，0.01％ Tween 20，pH6.0中用Vivaspin20柱(VivaScience)进行渗滤。纯化后的PEG化IFNG变体的比活性为2.4×106AU/mg，如本文的初步试验所测(为相应的未PEG化IFNG变体比活性的15％)。
实施例6-IFNG和IFNG变体在哺乳动物细胞中的表达
为了瞬时表达IFNG，细胞在培养基中生长至95％铺满，所述培养基为Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷氨酰胺，15mM Hepes，吡哆醇-HCl(Life Technologies目录号31330-038)，其中含有1∶10的胎牛血清(Bio Whittaker目录号02-701F)、1∶100的青霉素和链霉素(Bio Whittaker目录号17-602E)。将编码IFNG的质粒用Lipofectaim2000(Life Technologies)按照厂家说明转染至细胞中。24小时后收获培养基，分析IFNG活性。另外，为了定量所利用的糖基化位点的相对数量，用收获的培养基进行Western印迹。
表达IFNG的稳定克隆如下制备：用编码IFNG的质粒转染CHO K1细胞，然后将这些细胞在含0.36mg/ml潮霉素的培养基中孵育。分离出稳定转染的细胞，用有限稀释法进行亚克隆。产生高水平IFNG的克隆通过ELISA鉴定。
实施例7-大规模制备
将表达IFNG或变体的稳定细胞系在1700cm2滚瓶(Corning，#431200)中的培养基中培养至铺满，所述培养基为Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷氨酰胺，15mM Hepes，吡哆醇-HCl(Life Technologies目录号31330-038)，其中含有1∶10的胎牛血清(Bio Whittaker目录号02-701F)、1∶100的青霉素和链霉素(Bio Whittaker目录号17-602E)。然后将培养基换成含有L-谷氨酰胺的300ml UltraCHO(Bio Whittaker目录号12-724Q)，并向其中添加1∶500的EX-CYTE VLE(Serological Proteins Inc.#81-129)、1∶100的青霉素和链霉素(Bio Whittaker目录号17-602E)。培养48小时后，将培养基换成含有相同添加物的新鲜UltraCHO。再培养48小时后，将培养基换成Dulbecco′s MEM/Nut.-mix F-12(Ham)L-谷氨酰胺，吡哆醇-HCl(LifeTechnologies目录号21041-025)，其中添加1∶100的ITS-A(Gibco/BRL＝51300-044)，1∶500的EX-CYTE VLE(Serological Proteins Inc.#81-129)和1∶100的青霉素和链霉素(Bio Whittaker目录号17-602E)。然后每隔24小时收获培养基，并代之以具有相同添加物的新鲜无血清培养基。将收集的培养基滤过0.22μm滤膜以便除去细胞。
实施例8-纯化
过滤物经显微过滤(0.22μm)，然后用Millipore TFF系统超滤至约为1/15体积。在同一系统中，将该浓缩物用10mM Tris，pH7.6进行渗滤。加入硫酸铵至浓度为1.7M，搅拌后，通过在Sorvall离心机中用GS3转子以8000rpm离心25分钟而将沉淀除去。
将上清加载至已用10mM Tris，1.7M硫酸铵，pH7.6平衡的25mlPhenyl High Performance(Pharmacia)柱中。然后用3个柱体积的10mM Tris，1.7M硫酸钠，pH7.6洗柱，再用经过10个柱体积渐变至100％ 10mM Tris，pH7.6的线性梯度洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。将富含IFNG变体的级分汇总，通过在10mM Tris，pH9.0中用Vivaflow200系统(VivaScience)以分子量截流值10,000Da进行渗滤而更换缓冲液。
然后将IFNG变体加载至已用10mM Tris，pH9.0平衡的18mlQ-sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱中。然后用3个柱体积的10mM Tris，pH9.0洗柱，再用经过15个柱体积由0％至100％线性梯度的10mM Tris，0.5MNaCl，pH9.0洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。将富含IFNG变体的级分汇总，通过在10mM磷酸钠，pH7.0中用VivaSpin20柱(VivaScience)以分子量截流值10,000Da进行渗滤而更换缓冲液。
然后将IFNG变体加载至已用10mM磷酸钠，pH7.0平衡的8ml CHT陶瓷羟基磷灰石柱(Biorad)中。然后用5个柱体积的10mM磷酸钠，pH7.0洗柱，再用经过30个柱体积由0％至60％线性梯度的500mM磷酸钠，pH7.0洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。将富含IFNG变体的级分汇总，用VivaSpin20柱(VivaScience)在5mM琥珀酸钠，4％甘露醇，pH6.0中更换缓冲液，随后添加Tween 20至浓度为0.01％。将该IFNG变体过滤除菌，保存在-80℃。
也可以按照下述纯化方案对IFNG变体进行纯化：
过滤物经显微过滤(0.22μm)，然后用Millipore TFF系统超滤至约1/15体积。在同一系统中，将该浓缩物用10mM Tris，pH7.6进行渗滤，然后将pH调至9.0，并将沉淀通过显微过滤除去。
将样品加载至已用10mM Tris，pH9.0平衡的Q-sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱中。然后用3个柱体积的10mM Tris，pH9.0洗柱，再用经过15个柱体积由0％至100％线性梯度的10mM Tris，0.5M NaCl，pH9.0洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。将富含IFNG变体的级分汇总，将pH调至7.6。加硫酸铵至1.5M，搅拌后，通过离心除去沉淀。
然后将IFNG变体加载至已用10mM Tris，1.5M硫酸铵，pH7.6平衡的Phenyl Sepharose High Performance(Pharmacia)柱中。然后用3个柱体积的10mM Tris，1.5M硫酸铵，pH7.6洗柱，再用经过10个柱体积渐变至100％的10mM Tris，pH 7.6线性梯度洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。将富含IFNG变体的级分汇总，并将硫酸铵调整至1.7M。
然后将IFNG变体加载至已用10mM磷酸钠，1.7M硫酸铵，pH7.6平衡的Butyl Sepharose柱中。然后用10mM磷酸钠，1.7M硫酸铵，pH7.6洗柱，再用10mM磷酸钠，pH6.5洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。
将富含IFNG变体的级分汇总，加载至已用10mM磷酸钠，pH6.5平衡的羟基磷灰石柱中。用5个柱体积的10mM磷酸钠，pH6.5洗柱，再用经过30个柱体积由0％至100％的500mM磷酸钠，pH6.5线性梯度洗脱已被结合的IFNG变体。使流出物以及洗脱的IFNG变体分级分离。
将含IFNG变体的级分汇总，将缓冲液更换为含有5mM琥珀酸钠，4％甘露醇，pH6.0的缓冲液。随后添加Tween 20至浓度为0.01％。将该IFNG变体过滤除菌，保存在-80℃。
实施例9-变体和PEG化变体的活性
用上述“初步实验”测出以下活性数据(瞬时转染后)：
突变 活性(AU/ml) 相对于全长wt活性的％
野生型(全长)S99T(全长)E38N(全长)E38N+S40T(全长)E38N+S40T+S99T(全长)E38N+K61T(全长)E38N+K61T+S99T(全长)N10C+S99T(全长)N16C+S99T(全长)E38C+S99T(全长)S99T+N104C(全长)N10C+E38N+S40T+S99T(全长)N16C+E38N+S40T+S99T(全长)E38N+S40T+N59C+S99T(全长)E38N+S40T+N83C+S99T(全长)E38N+S40T+K94C+S99T(全长)E38N+S40T+S99T+N104C(全长)野生型(截短型)S99T(截短型)E38N+S40T+S99T(截短型)  1.4×1075.1×1061.4×1079.9×1061.3×1071.2×1071.4×1062.5×1061.1×1071.0×1075.0×1061.5×1063.7×1061.1×1077.2×1059.4×1052.3×1066.3×1063.5×1064.0×106     -36％100％71％93％86％10％18％79％71％36％11％26％79％5％7％16％45％25％29％
表1：全长型和截短型rhuIFNG多肽变体瞬时转染后的活性用上述“初步实验”测出以下活性数据(纯化后)：
突变     比活性(AU/mg) 全长wt活性的％
野生型(全长)S99T(全长)E38N+S40T+S99T(全长)N10C+S99T(全长)N16C+S99T(全长)N16C+S99T(全长+10kDa mPEG)E38C+S99T(全长)N59C+S99T(全长)N59C+S99T(全长+5kDa mPEG)S99T+N104C(全长) 2.1×1072.2×1071.4×1073.8×1062.3×1061.3×1063.4×1066.3×1062.4×1063.5×106     -105％67％18％11％6％16％30％11％17％
表2：全长rhuIFNG多肽变体纯化后的活性
测定多个PEG化变体的活性，具体是将PEG化产物与经历相同的PEG化过程(见实施例5)、但实际上未向反应介质中添加PEG的样品进行比较。结果汇编在以下表3中：
突变 相对于经历“PEG化过程”的未PEG化产物的活性(％)
N10C+S99T(全长+5kDa mPEG)N16C+S99T(全长+5kDa mPEG)E38C+S99T(全长+10kDa mPEG)1)S99T+N104C(全长+5kDa mPEG)     23594142
表3：全长rhuIFNG多肽的PEG化变体的活性
1)利用了ODSS偶联化学。所有其它PEG化变体利用了MAL偶联化学。
应强调，表1所示活性数据反映了比活性和CHO-K1细胞中表达水平的组合。因此可以得出结论，所有变体与rhuIFNG相比，显示出相当的表达水平/比活性。
如表2所示，所有半胱氨酸变体与rhuIFNG相比，显示降低的比活性，而含有E38N，S40T和/或S99T突变的变体保留了与rhuIFNG相当的比活性。当半胱氨酸变体与5或10kDa的PEG连接后，发现比活性进一步降低2-3倍(表3)。不受任何具体理论限制，推测比活性的降低可归因于偶联的PEG基团造成的空间阻碍导致受体结合降低。
实施例10-评估对N-糖基化位点的利用
为了定量所利用的糖基化位点的相对数量，用收获的培养基进行western印迹(见图1)。估计野生型rhuIFNG(全长)约有50％利用了全部两个糖基化位点(2N)，约有40％利用了其中一个糖基化位点(1N)，约有10％未被糖基化(0N)。这些数据与此前由Hooker et al.，1998，J.Interferon and CytokineRes.18，287-295和Sarenva et al.，1995，Biochem J.，308，9-14公开的一致。
如图1所示，S99T变体(全长)比相应野生型显著更有效地利用其两个糖基化位点。估计S99T变体约有90％利用了全部两个糖基化位点(2N)，约有7％利用了其中一个糖基化位点(1N)，约有3％未被糖基化(0N)。
还可从图1看出，变体E38N+S40T(全长)对引入第38位的糖基化位点的利用显著好于未优化的变体E38N(全长)对它的利用。
这些数据清楚表明，不管糖基化位点是天然的还是引入的，对这些位点的更好利用，都可以通过在相对于天冬酰胺残基而言的位置+2引入苏氨酸残基而不是丝氨酸残基来实现。
实施例11-药代动力学研究
大鼠皮下给药的AUC(AUCsc)如前文针对多种IFNG变体所述进行测定。结果汇总在表4和图2，图3。
变体 AUCsc/剂(minxg)/ml AUCsc，变体AUCsc，Actimmune   AUCsc，变体AUCsc，全长，wt     Tmax，sc(min)
ActimmunerhuIFNG(全长)E38N+S40T+S99T1)N16C+S99T2)N16C+S99T3) 0.3-0.415-24111-19237114 -37-80277-64092-123285-380  0.013-0.027-4.6-131.5-2.54.8-7.6     43362-446308-374247249
表4：大鼠皮下给药的药代动力学数据
1)全长
2)全长，5kDa mPEG与引入的半胱氨酸残基相连
3)全长，10kDa mPEG与引入的半胱氨酸残基相连
从图2，图3和表4可明显看出，当皮下给药时，所述变体(包括PEG化变体)与rhuIFNG相比，尤其与市售Actimmune相比，具有显著更高的AUC。根据图3所示，还应注意，两种PEG化变体的给药剂量比[E38N+S40T+S99T]变体减少2.5倍。
显然，这开创了一种可能性，即施用更低剂量，从而减小副作用，和/或使实现活性所需的给药次数比目前的更少，从而改善患者的顺应性。
                             序列表
<110>马克西根控股公司(Maxygen Holdings)
<120>干扰素γ多肽变体
<130>231wo410-INFG变体
<140>
<141>
<160>49
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>143
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：[S99T]huIFNG
<400>1
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
    130                 135             140
<210>2
<211>142
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>2
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser
    130                 135                 140
<210>3
<211>141
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>3
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala
    130                 135                 140
<210>4
<211>140
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>4
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg
    130                 135                 140
<210>5
<211>139
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>5
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                      30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg
    130                 135
<210>6
<211>138
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>6
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
    115                     120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly
    130                 135
<210>7
<211>137
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>7
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
    130                 135
<210>8
<211>136
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>8
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe
    130                 135
<210>9
<211>135
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>9
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
    50                   55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu
    130                 135
<210>10
<211>134
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>10
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met
    130
<210>11
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>11
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                  125
Arg Lys Arg Ser Gln
    130
<210>12
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>12
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser
    130
<210>13
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>13
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg
    130
<210>14
<211>130
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>14
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys
    130
<210>15
<211>129
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>15
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg
<210>16
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的[S99T]huIFNG
<400>16
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Thr Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
<210>17
<211>143
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                   8
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
    130                 135                 140
<210>18
<211>166
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
             20                  25                  30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
         35                  40                  45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
     50                  55                  60
Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
 65                  70                  75                  80
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
                 85                  90                  95
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
            100                 105                 110
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
       115                 120                  125
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
   130                  135                 140
Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
145                 150                 155                 160
Gly Arg Arg Ala Ser Gln
                165
<210>19
<211>142
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>19
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser
    130                 135                 140
<210>20
<211>141
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>20
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala
    130                 135                 140
<210>21
<211>140
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>21
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg
    130                 135             140
<210>22
<211>139
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>22
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
         85                          90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg
    130                 135
<210>23
<211>138
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>23
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly
    130                 135
<210>24
<211>137
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>24
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
    130                 135
<210>25
<211>136
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>25
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65              70                      75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe
    130                 135
<210>26
<211>135
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>26
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu
    130                 135
<210>27
<211>134
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>27
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met
    130
<210>28
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>28
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln
    130
<210>29
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>29
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser
    130
<210>30
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>30
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg
    130
<210>31
<211>130
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>31
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys
    130
<210>32
<211>129
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>32
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg
<210>33
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C末端被截短的huIFNG
<400>33
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
  1               5                  10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
             20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
         35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
     50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
 65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                 85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
<210>34
<211>140
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Actimmune(r)
<400>34
Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe
  1               5                  10                  15
Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly
             20                  25                  30
Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser
         35                  40                  45
Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp
     50                  55                  60
Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val
 65                  70                  75                  80
Lys Phe Phe Asn Ser Ash Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu
                 85                  90                  95
Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His
            100                 105                 110
Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
        115                 120                 125
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg
   130                  135                140
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>35
His His His His His His
  1               5
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>36
Met Lys His His His His His His
  1               5
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>37
Met Lys His His Ala His His Gln His His
  1               5              10
<210>38
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>38
Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln
  1               5              10
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>39
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
  1               5              10
<210>40
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>40
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
  1               5
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：标记
<400>41
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
  1               5
<210>42
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于使干扰素γ在CHO细胞中优化表达的表达盒
<400>42
atgaagtaca caagctatat cctggccttt cagctgtgca tcgtgctggg ctccctgggc 60
tgctattgcc aggaccctta cgtgaaggag gccgagaacc tgaagaagta ctttaacgcc 120
ggccacagcg atgtggccga caatggcaca ctgtttctgg gcatcctgaa gaattggaag 180
gaggagagcg atcggaagat catgcagtcc cagatcgtgt ccttctattt caagctgttt 240
aagaatttca aggacgatca gtccatccag aagtccgtgg agaccatcaa ggaggacatg 300
aacgtgaagt ttttcaatag caataagaag aagagagacg atttcgagaa gctgaccaat 360
tactccgtga cagacctgaa cgtgcagaga aaggccatcc acgagctgat ccaggtgatg 420
gccgagctgt cccccgccgc caagaccggc aagagaaaga gaagccagat gctgttcaga 480
ggcagacggg ccagccag                                               498
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>43
gatggctggc aactagaag    19
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>44
tgtacggtgg gaggtctat    19
<210>45
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>45
gttcaggtct gtcacgctgt aattggtcag ctt    33
<210>46
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>46
aagctgacca attacaccgt gacagacctg aac     33
<210>47
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>47
catgatcttc cgatcggtct cgttcttcca att     33
<210>48
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>48
aattggaaga acgagaccga tcggaagatc atg    33
<210>49
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>49
gagtctagat tacagcatct ggcttctctt         30

Claims (51)

1.具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的干扰素γS99T多肽变体或其在C末端截短1-15个氨基酸残基后所得的片段，其中所述多肽变体或其片段具有干扰素γ活性。
2.权利要求1的多肽变体，其中所述多肽变体具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽变体，其中所述多肽变体是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的片段，它在C-末端除去了1-15个氨基酸残基。
4.权利要求3的多肽变体，其中所述在C末端除去了1-15个氨基酸残基后所得的片段具有选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
5.权利要求1-4之一的多肽变体，其中所述多肽变体被糖基化。
6.权利要求5的多肽变体，其中所述多肽变体在第97位被N-糖基化。
7.权利要求5的多肽变体，其中所述多肽变体在第25位被N-糖基化。
8.权利要求5的多肽变体，其中所述多肽变体在第25和97位被N-糖基化。
9.具有干扰素γ活性并且相对于SEQ ID NO：1而言包含1-10个残基修饰的干扰素γS99T多肽变体，或其具有干扰素γ活性的羧基端截短型片段，其中所述修饰选自由取代、插入和缺失组成的组中。
10.权利要求9的多肽变体，其中所述多肽变体相对于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列而言包含1-10个残基修饰。
11.权利要求9的多肽变体，其中所述多肽变体相对于羧基端截短型片段包含1-10个残基修饰，其中所述羧基端截短型片段具有选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ BD NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ B NO：11，SEQID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
12.权利要求11的多肽变体，其中所述多肽变体与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列相比，包含1-10个修饰。
13.权利要求9-12之一的多肽变体，其中所述多肽变体包含至少一个引入的和/或至少一个除去的氨基酸残基，所述氨基酸残基包含对应于非多肽组分的连接基团。
14.权利要求13的多肽变体，其中所述多肽变体包含至少一个引入的糖基化位点。
15.权利要求14的多肽变体，其中所述糖基化位点为N-糖基化位点。
16.权利要求15的多肽变体，其中所述N-糖基化位点被引入这样一个位置，该位置包含具有至少25％其侧链暴露在表面的氨基酸残基。
17.权利要求16的多肽变体，其中所述N-糖基化位点被引入这样一个位置，该位置包含具有至少50％其侧链暴露在表面的氨基酸残基。
18.权利要求15-17之一的多肽变体，其中所述N-糖基化位点通过取代而引入。
19.权利要求18的多肽变体，其中所述取代选自K12S，K12T，G18S，G18T，E38N，E38N+S40T，K61S，K61T，N85S，N85T，K94N，Q106S或Q106T。
20.权利要求19的多肽变体，其中所述取代选自K12T，G18T，E38N+S40T，K61T，N85T，K94N或Q106T。
21.权利要求20的多肽变体，其中所述取代是E38N+S40T。
22.权利要求13的多肽变体，其中所述多肽变体包含至少一个引入的半胱氨酸残基。
23.权利要求22的多肽变体，其中所述半胱氨酸残基被引入这样一个位置，该位置包含具有至少25％其侧链暴露在表面的氨基酸残基。
24.权利要求23的多肽变体，其中所述半胱氨酸残基被引入这样一个位置，该位置包含具有至少50％其侧链暴露在表面的氨基酸残基。
25.权利要求22-24之一的多肽变体，其中所述半胱氨酸残基通过取代而引入。
26.权利要求25的多肽变体，其中所述取代选自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C，N104C或A124C。
27.权利要求22-26之一的多肽变体，其中所述半胱氨酸残基与非多肽组分共价相连。
28.权利要求27的多肽变体，其中所述非多肽组分是聚合物分子。
29.权利要求28的多肽变体，其中所述聚合物分子是线性或支链聚乙二醇。
30.权利要求9的多肽变体，其中所述多肽包含至少一个引入的N-糖基化位点和至少一个引入的半胱氨酸残基。
31.权利要求30的多肽变体，其中所述N-糖基化位点被引入权利要求16-21任一项所述的位置，而所述半胱氨酸残基被引入权利要求23-26任一项所述的位置。
32.一种多核苷酸，它编码权利要求1-31之一的多肽变体。
33.一种表达载体，它包含权利要求32的多核苷酸。
34.一种糖基化宿主细胞，它包含权利要求32的多核苷酸或权利要求33的表达载体。
35.权利要求34的宿主细胞，它是CHO细胞或BHK细胞。
36.一种药物组合物，它包含权利要求1-31之一的多肽变体和可药用的稀释剂，载体或辅助剂。
37.权利要求1-31之一的多肽变体或权利要求36的药物组合物在制备用于治疗间质性肺疾病的药物中的用途。
38.权利要求37的用途，其中所述间质性肺疾病是自发性肺纤维化。
39.制备权利要求1-31之一的干扰素γ多肽变体的方法，该方法包括
(a)培养糖基化宿主细胞，该细胞含有编码权利要求1-31之一所述干扰素γ多肽变体的核苷酸序列，所用培养条件有利于该多肽变体的表达；
(b)任选使所述多肽变体与非多肽组分在有利于发生偶联的条件下进行体外反应；和
(c)回收所述多肽变体。
40.权利要求9-12和14-21之一的多肽变体，其中所述多肽变体被糖基化。
41.权利要求40的多肽变体，其中所述多肽变体在第97位被N-糖基化。
42.权利要求40的多肽变体，其中所述多肽变体在第25位被N-糖基化。
43.权利要求40的多肽变体，其中所述多肽变体在第25和97位被N-糖基化。
44.权利要求40的多肽变体，其中所述多肽变体包含E38N取代并在第38位被N-糖基化。
45.权利要求44的多肽变体，其中所述多肽变体还包含S40T取代。
46.权利要求44的多肽变体，其中所述多肽变体进一步在第97位被N-糖基化。
47.权利要求46的多肽变体，其中所述多肽变体进一步在第25位被N-糖基化。
48.权利要求45的多肽变体，其中所述多肽变体进一步在第97位被N-糖基化。
49.权利要求48的多肽变体，其中所述多肽变体进一步在第25位被N-糖基化。
50.权利要求3的多肽变体，是在羧基端通过除去11个氨基酸残基而截短的形式。
51.权利要求9的多肽变体，是在羧基端通过除去11个氨基酸残基而截短的形式。
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