CN1501815A - 新的干扰素β-样分子 - Google Patents

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T��ɳķ����
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Abstract

一种显示干扰素β活性并含有至少一个与干扰素β多肽共价连接的第一非多肽部分的偶联物，该偶联物的氨基酸序列区别于野生型人干扰素β的序列之处是，至少一个引入的和至少一个去除的氨基酸残基含有所述第一非多肽部分的连接基团。所述第一非多肽部分可以是聚合物分子或糖部分。所述偶联物在治疗中特别有用。

Description

新的干扰素β-样分子
                         发明领域
本发明涉及新的干扰素β偶联物、制备所述偶联物的方法及所述偶联物在治疗特别是多发性硬化症治疗中的应用。
                         发明背景
干扰素是以抗病毒、抗增殖和免疫调节活性为特征的重要的细胞因子。这些活性构成在许多疾病包括肝炎、各种癌和多发性硬化中所观察到的临床作用的基础。干扰素分为I型和II型。干扰素β属于I型干扰素，I型还包括干扰素α、τ和ω，其中干扰素γ是唯一已知的不同的II型干扰素。
人干扰素β是由166个氨基酸残基组成的分子量为22kDa的调节多肽。它可以由身体中的大多数细胞特别是成纤维细胞产生，作为对病毒感染或接触其他生物制剂的反应。它与多体形式的细胞表面受体结合，并且所产生的受体结合导致一系列细胞内事件，这些事件导致干扰素β诱导基因的表达，后者产生分类为抗病毒、抗增殖和免疫调节的作用。
Taniguchi在Gene 10：11-15，1980中和在EP 83069，EP 41313和US4686191中报道了人干扰素β的氨基酸序列。
已分别报道了人和鼠干扰素β的结晶结构(Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：11813-11818，1997，J.Mol.Biol.253：187-207，1995)。它们在Cell Mol. LifeSci.54：1203-1206，1998中被评论。
已报道了干扰素β的相对新的蛋白质工程变体(WO 9525170，WO9848018，US 5545723，US 4914033，EP 260350，US 4588585，US 4769233，Steward等人，DNA Vol 6 no 2 1987 pp.119-128，Runkel等人，1998，Jour.Biol.Chem.273，No.14，pp.8003-8008)。
已报道了干扰素β的在CHO细胞中的表达(US 4966843，US 5376567和US 5795779)。
Redlich等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.88，pp.4040-4044，1991中公开了抗合成肽抗体的免疫反应性，所述合成肽相当于具有突变C17S的重组人干扰素β的肽链。
已报道了具有特定糖基化模式的干扰素β分子及其制备方法(EP 287075和EP 539300)。
各种参考中都公开了通过聚合物偶联或糖基化来修饰多肽。已报道了天然干扰素或其C17S变体的聚合物修饰(EP 229108，US 5382657，EP593868，US 4917888和WO 99/55377)。US 4,904,584中公开了PEG化赖氨酸减少的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已经被删除或者用任何其它氨基酸残基代替。WO 99/67291中公开了将蛋白质与PEG偶联的方法，其中蛋白质上至少一个氨基酸残基被删除并且蛋白质与PEG在足以实现与蛋白质偶联的条件下接触。WO 99/03887中公开了PEG化多肽变体属于生长激素超家族，其中位于多肽特定区域的半胱氨酸已经被非必需氨基酸取代。干扰素β作为属于生长激素超家族多肽的一个实例被提到。WO 00/23114中公开了糖基化和PEG化干扰素β。WO 00/23472中公开了干扰素β融合蛋白。WO 00/26354中公开了制备变应原性已降低的糖基化多肽变体的方法，与相应的亲本多肽相比，所述糖基化多肽变体至少包含一个额外的糖基化位点。US 5,218,092中公开了修饰粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽，使得与天然多肽相比引入至少一个额外的烃链。干扰素β作为很多据说可按照US5,218,092中所描述的技术修饰的多肽的一个实例被提到。
干扰素β的商品化制剂以商品名Betaseron(也称作干扰素β1b，它是非糖基化的，用重组细菌细胞制备，具有N-端蛋氨酸残基缺失和C17S突变)、AvonexTM和Rebit(也称作干扰素β1a，它是糖基化的，用重组哺乳动物细胞制备)销售，用于患有多发性硬化疾病病人的治疗，已显示可有效降低恶化速度，并且与安慰剂治疗的病人相比，更多的病人在较长的一段时间保持不恶化。此外，劳动能力丧失的累计率降低(Neurol.51：682-689，1998)。
Pharmaceut.Res.15：641-649，1998中描述了干扰素β1a和干扰素β1b的结构和功能的比较。
干扰素β是第一个治疗性干预，结果显示可延迟多发性硬化，即中枢神经系统复发性和进行性炎性变性疾病的进展。然而，其作用机理大部分尚不清楚。似乎干扰素β具有抑制白细胞增殖和抗原提呈的作用。此外，干扰素β可调节针对抗炎表现型的细胞因子的产生。最后，干扰素β可通过抑制T-细胞基质金属蛋白酶的活性来减少T-细胞的迁移。这些活性可能解释MS中干扰素β的机理(Neurol.51：682-689，1998)。
另外，干扰素β可用于治疗骨肉瘤、基底细胞癌、子宫颈发育异常、神经胶质瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、何杰金氏病、乳腺癌、黑素瘤和病毒性感染如乳头瘤病毒、病毒性肝炎、生殖器疱疹、带状疱疹、疱疹性角膜炎、单纯性疱疹、病毒性脑炎、巨细胞病毒肺炎和鼻病毒。
各种副作用都是由使用现有干扰素β制剂所引起的，包括注射位点反应、发烧、寒战、肌痛、关节痛和其它流感样症状(Clin.Therapeutics，19：883-893，1997)。
另外6-40％的病人产生干扰素β的中和抗体(Int.Arch.Allergy Immunol.118：368-371，1999)。已显示，干扰素β中和抗体的产生减小了对干扰素β的生物学反应，并且有引起治疗作用减小的趋势(Neurol.50：1266-1272，1998)。中和抗体也可能阻碍干扰素β在其它疾病的治疗中的功用(Immunol.Immuther.39：263-268，1994)。
由于现有干扰素β产品副作用大，它们与频繁注射的关系，所产生的中和抗体具有阻碍干扰素β预期治疗作用的危险和可能获得更多的最佳治疗性干扰素β水平并同时提高治疗作用，因此，显而易见地需要改善的干扰素β-样分子。
                           本发明简述
本申请公开了改善的干扰素β分子，它提供一个或多个上述预期的作用。尤其公开了偶联物，它们具有干扰素β活性并且包含至少一个通过共价键连接到干扰素β多肽上的非多肽部分，所述β多肽包含与具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的天然型人干扰素β不同的氨基酸序列，其区别在于至少引入或除去一个氨基酸残基，且该残基带有与所述非多肽部分的连接基团。本发明偶联物与人干扰素β相比具有许多改善的特性，包括免疫原性降低，功能性体内半衰期增加、血浆半衰期增加，和/或生物利用度增加。所以，本发明偶联物提供许多超过现有干扰素β化合物的好处，包括注射间期长，副作用少，和/或由于抗体减少而功效增加。而且，通过使用本发明偶联物可以获得较高剂量的活性蛋白并因此获得更有效的治疗反应。此外，本发明偶联物已证明可显著减少使用下文所定义的现有干扰素β产品治疗的病人血清的交叉反应性。
一方面，本发明涉及偶联物，它们显示干扰素β活性并且包含至少一个通过共价键连接到干扰素β多肽上的第一非多肽部分，其氨基酸序列与人类野生型干扰β的序列区别在于至少引入一个氨基酸残基并至少除去一个氨基本残基，所述残基含有与所述第一非多肽部分连接的基团。
另一方面，本发明涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含至少一个连接到干扰素β多肽的至少一个赖氨酸残基上的第一非多肽部分，其氨基酸序列与天然型人干扰素β区别在于引入和/或除去至少一个赖氨酸残基。
另一方面，本发明涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含至少一个连接到干扰素β多肽的至少一个半胱氨酸残基上的第一非多肽部分，其氨基酸序列的不同在于在天然型人干扰素β表面暴露的一个氨基酸位置处至少引入一个半胱氨酸残基。
另一方面，本发明涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含至少一个具有酸性基团作为连接基的第一非多肽部分，该部分连接到干扰素β多肽的至少一个天门冬氨酸或谷氨酸残基上，其氨基酸序列与天然型人干扰素β不同在至少引入和/或除去一个天门冬氨酸或谷氨酸残基。
另一方面，本发明涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含通过共价键连接到干扰素β多肽上的至少一个聚合物分子和至少一个糖部分，其氨基酸序列与天然型人干扰素β不同在
a)、至少引入和/或除去一个包含聚合物分子连接基的氨基酸残基，和
b)、至少引入和/或除去一个包含糖部分连接基的氨基酸残基，前提条件是当聚合物分子的连接基为半胱氨酸残基，并且糖部分为N-连接的糖部分时，半胱氨酸残基不以破坏N-糖基化位点的方式插入。
另一方面，本发明涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含干扰素β多肽，其氨基酸序列与天然人干扰素β不同在于至少引入一个糖基化位点，所述偶联物进一步包含至少一个连接到所引入的糖基化位点上的未PEG化的糖部分。
另一方面，本发明涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含干扰素β多肽，其氨基酸序列不同于野生型人干扰素β在于在野生型人干扰素β表面暴露的一个氨基酸位置处已通过引入或除去构成糖基化位点一部分的氨基酸残基来引入或除去糖基化位点。
本发明还涉及偶联物，它显示干扰素β活性并包含与干扰素β多肽共价连接的糖部分，其氨基酸序列在至少一个糖基化位点不同于野生型人干扰素β。
本发明也涉及制备用于本发明的偶联物或干扰素β多肽的方式和方法，包括编码该多肽的核苷酸序列和表达载体，以及制备该多肽或偶联物的方法。
最后，本发明涉及含有本发明偶联物的治疗组合物，用于治疗的本发明的偶联物或组合物，偶联物或组合物在治疗或在制备治疗疾病的药物中的用途。
                            附图简述
图1举例说明本发明偶联物的抗病毒活性。
图2是由实施例8制备的干扰素β产物的产量。
                            发明详述
本申请引用了很多文献号。这些文献全部被引入本文供参考。
定义
在本申请和本发明的全文中，使用下列定义的概念：
术语“偶联物”(或可互换为“偶联的多肽”)表示由一个或多个多肽与一个或多个非多肽部分共价连接而形成的杂合(复合或嵌合的意思)分子。术语共价连接意指多肽和非多肽部分相互直接共价结合，或者使用多肽中存在的连接基团相互经一个或多个间隔部分，如一个或多个桥、间隔臂或连接部分间接共价结合。优选地，偶联物在有关浓度和条件下是可溶的，如在生理液体如血液中是可溶的。本发明偶联多肽的实施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。术语“非偶联多肽”是偶联物的多肽部分。
术语“非多肽部分”表示能够与本发明多肽的连接基团偶联的分子。此类分子的优选实例包括聚合物分子、糖部分、亲脂性化合物或有机衍生剂。在本文中用于本发明的偶联物时，应理解为非多肽部分通过多肽连接基团连接到偶联物的多肽部分上。
术语“聚合物分子”被定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中所述单体无一是氨基酸残基，除非聚合物是人白蛋白或另一种富含的血浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换。该术语涵盖经体外糖基化连接的碳水化合物分子，所述体外糖基化即体外进行的合成性糖基化，其通常包括碳水化合物分子与多肽连接基团共价连接，任选使用交联剂。体内糖基化如N-或O-糖基化(下文作进一步描述)连接的碳水化合物分子在本文中称作“糖部分”。除指明偶联物中部分非多肽部分如聚合物分子或糖部分的数目外，偶联物中所含或本发明其它部分所指的“非多肽部分”表示偶联物中的一个或多个非肽部分，如聚合物分子或糖部分。
术语“连接基团”表示多肽上能够与相关非多肽部分偶联的氨基酸残基。例如，对于聚合物特别是PEG来说，偶联常用的连接基团是赖氨酸的ε氨基或N-末端氨基。其它聚合物连接基团包括游离羧酸基团(如，C-末端氨基酸残基或天门冬氨酸或谷氨酸残基的游离羧酸基团)，适当活化的羰基、氧化的碳水化合物部分和巯基部分。
对于体内N-糖基化来说，术语“连接基团”以非常规方式用于表示构成N-糖基化位点的氨基酸残基(序列为N-X’-S/T/C-X”，其中X’是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基，X”是可以与X’相同或者不同的任何氨基酸残基并且优选不同于脯氨酸，N是天冬酰胺并且S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸并且最优选苏氨酸)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基在糖基化中与糖部分连接，但这种连接不能完成，除非存在N-糖基化位点的其它氨基酸残基。因此，非多肽部分是N-连接的糖部分时，亲本多肽氨基酸序列改变中使用的术语“含有针对非多肽部分的连接基团的氨基酸残基”被理解为构成N-糖基化位点的氨基酸残基被改变，改变方式是功能性的N-糖基化位点被引入氨基酸序列或从所述序列除去。对于“O-糖基化位点”来说，连接基团是丝氨酸或苏氨酸残基的OH-基。
具体突变中使用的术语“一个区别”或“不同于”允许有另外的不同，其存在于与特定氨基酸差异不同的位点。例如，除了去除和/或引入含有对非多肽部分的连接基团的氨基酸残基之外，干扰素β多肽可包含与引入和/或去除此类氨基酸残基不相关的其它取代。针对非多肽部分、氨基酸残基、取代等使用的术语“至少一个”意指一个或多个。本文中的术语“突变”和“取代”可互换使用。
在本申请中，氨基酸命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按Protein DataBank(PDB)( www.pdb.org)的定义来使用，此定义基于IUPAC命名法(IUPAC命名法以及氨基酸和肽的符号(残基命名、原子命名等)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘误Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。CA有时称作Cα，CB称作Cβ。术语“氨基酸残基”表示包含在下组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、蛋氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)。用于鉴定氨基酸位置/取代的术语学举例说明如下：C17(表示SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中#17位被半胱氨酸残基占据)、C17S(表示17位半胱氨酸残基被丝氨酸置换)。本文所用氨基酸残基编号与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列对应。“Mldel”用来表示占据1位的蛋氨酸残基被去除。多个取代“+”来表示，如R71N+D73T/S表示一种氨基酸序列，其中71位精氨酸残基被天冬酰胺取代，73位天冬氨酸残基被苏氨酸或丝氨酸残基(优选苏氨酸残基)取代。本文使用T/S给出的取代表示T或者S残基，优选T残基。
术语“核苷酸序列”表示两个或多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其任意组合。
术语“干扰素β蛋白序列家族”以其常规的意思来使用，即表示一组具有足够的氨基酸序列同源性从而能允许使用如CLUSTALW程序进行序列排列的多肽。例如，可从PFAM家族，4.0版获得干扰素β序列家族或者可通过使用合适的计算机程序如CLUSTALW 1.74版和默认参数来制备(Thompson等人，1994，CLUSTAL W：通过序列权重分配、位点特异性缺口罚分和权重矩阵的选择来提高渐进多个序列排列的敏感性，Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680)。
术语“聚合酶链反应”或“PCR”通常指一种用于体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如，按美国专利4683195描述的方法。一般来说，PCR方法包括使用能够与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物来使引物延伸合成反应反复循环。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养”在本文中可互换使用并且这些使用都应当理解为包括因细胞生长或培养而产生后代。“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA引入细胞的方法。
“可操作连接的”指两个或多个核苷酸序列通过酶促连接等方式共价连接在彼此相应的构象中，使序列正常行使功能。例如，编码前序列或分泌引导区的核苷酸序列如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，则被连接到该多肽的核苷酸序列上；启动子或增强子如果能响多肽的转录，则与编码序列可操作连接；核糖体的结合位点如果处在促进翻译的位置则与编码序列可操作连接。总之，“可操作连接的”意指被连接的核苷酸序列是邻接的，并且在分泌引导区的情况下，是邻接的而且在阅读状态下。连接在方便的限制性位点来完成。如果不存在此类位点，那么使用合成性寡核苷酸接头或衔接子和标准的重组DNA方法。
术语“引入”主要指取代已有的氨基酸残基，但也指插入另外的氨基酸残基。术语“去除”主要指将被去除的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，但也指删去(而没有取代)将被去除的的氨基酸残基。
与给出的物质联用的术语“免疫原性”打算表示物质诱导免疫系统反应的能力。免疫反应可以是细胞或抗体介导的反应(参见，如，Roitt：EssentialImmunnology(8th Edition，Blackwell)for further definition of immunogenicity)。免疫原性可通过任何本领域已知的方法来测定，如在体内或体外，例如使用在下文材料和方法节中描述的体外免疫原性试验方法。术语“减小免疫原性”打算表示本发明的偶联物或多肽产生可测量的比参照分子(如野生型人干扰素β(如，Rebif或Avonex)，或野生型人干扰素β的变种如Betaseron，在相当的条件下测定)低的免疫反应。本文参照物为可商购干扰素β产品(即，Betaseron、Avonex和Rebif)时，应当理解为配制的产品或产品的干扰素β多肽部分(合适时)。一般来说，减小的抗体反应性(如，与商购干扰素β产品所治疗的病人血清中抗体的反应性)是减小的免疫原性的指标。
术语“功能性体内半衰期”使用其通常的意思，即保留多肽或偶联物的特定功能的50％所需的时间(如，多肽或偶联物在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽或偶联物的活性为起始值的50％的时间)。作为测定功能性体内半衰期的另一种方法，可测定“血清半衰期”，即，清除前血浆或血液中50％多肽或偶联物分子循环的时间。血清半衰期的测定常常比测定功能性体内半衰期简单并且血清半衰期的值通常是功能性体内半衰期值的好指标。血清半衰期的其它可替换术语包括“血浆半衰期”、“循环半衰期”、“血清清除率”、“血浆清除率”和“清除半衰期”。保留的功能通常选自抗病毒、抗增殖、免疫调节或受体结合活性。功能性体内半衰期和血清半衰期可通过本领域中已知的任何合适的方法来测定，测定方法在下文材料和方法节作进一步讨论。
多肽或偶联物通常经网状内皮系统(RES)、肾、脾或肝中一个或多个的作用，或者通过特异性或非特异性蛋白水解来清除。发生在肾的清除也可称作“肾清除”，并且如，通过小球过滤、小管排泄或小管消除来完成。通常来说，清除取决于偶联物的物理特性，包括分子量、大小(直径)(相对于小球过滤的截留值)、电荷、对称性、形状/刚性、结合的碳水化合物链和细胞上蛋白质受体的存在。分子量大约为67kDa被认为是肾清除的重要截留值。
减小的肾清除可通过任何合适的测定方法来建立，如已建立的体内测定方法。一般来说，肾清除通过将标记的(如，放射标记的或荧光标记的)多肽偶联物给予患者并测定收集的患者尿液中的标记活性来测定。减小的肾清除是在相当的条件下与相应非偶联多肽或非偶联的相应野生型多肽或商购干扰素β产品进行比较而测定。
功能性体内半衰期或血清半衰期中使用的术语“增加”用于表示在相当的条件下测定，偶联物或多肽的相应半衰期与参照分子如未偶联的野生型人干扰素β(如，Avonex或Rebif)或未偶联的人干扰素β变体(如，Betaseron)相比具有统计学上显著意义的增加。
术语“减小的免疫原性和/或增加的功能性体内半衰期和/或增加的血清半衰期”被理解为涵盖任何一种、两种或所有这些特性。优选地，本发明的偶联物或多肽具有至少两种或这些特性，即减小的免疫原性和增加的功能性体内半衰期，减小的免疫原性和增加的血清半衰期或增加的功能性体内半衰期和增加的血清半衰期。最优选地，本发明偶联物或多肽具有所有特性。
术语“显示干扰素β活性”打算表示多肽或偶联物具有天然干扰素β的一或多种功能，所述干扰素特别是可以在糖基化宿主细胞中表达的具有SEQID NO2所示氨基酸序列(它是成熟序列)的人野生型干扰素β，或任意的商购干扰素β产品。这些功能包括结合干扰素受体的能力，所述受体能够结合干扰素β并且启动细胞内来自受体的信号传递，特别是由受体亚单位IFNAR-2和IFNAR-1构成的I型干扰素受体(Domanski等人，The Journal of BiologicalChemistry，Vol.273，No.6，pp3144-3147，1988，Mogensen等人，Journal ofInterferon and Cytokine Research，19：1069-1098，1999)，和抗病毒、抗增殖或免疫调节活性(可使用本领域已知的测定方法来测定(如下文公开的引证文献中描述的方法))。干扰素β活性可通过下文材料和方法节中例举的本领域已知的方法来测定。
多肽或偶联物“显示”或“具有”  干扰素β活性被认为，当它展示可测量的功能，如可测量的受体结合和刺激活性(如，通过材料和方法节中描述的一级或二级测定方法测定的)时具有这种活性。显示干扰素β活性的多肽在本文中也可称为“干扰素β分子”或“干扰素β多肽”。术语“干扰素β多肽”在本文中主要用于本发明的修饰多肽(其已引入或除去相应非多肽部分的连接基团)。
术语“亲本干扰素β”打算表示将按照本发明改进的起始分子。尽管亲本干扰素β可以是任何来源，如脊椎动物或哺乳动物来源(如，在WO00/23472中定义的任何来源)，但亲本干扰素β优选是具有SEQ ID NO2的野生型人干扰素β或其变体。“变体”是多肽，它有一个或多个氨基酸残基区别于亲本多肽，通常有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。野生型人干扰素β的实例包括Avonex或Rebif的多肽部分。亲本干扰素β变体的例子是Betaseron。另外，亲本干扰素β多肽可以包含一种氨基酸序列，它是干扰素β和另一种同源多肽如干扰素α的杂合分子，任选含有一个或多个另外的引入该杂合分子的取代。这种杂合分子可以包含一种氨基酸序列，它在超过10个氨基酸残基上不同于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。为了用于本发明，杂合分子显示干扰素β活性(如，按本文材料和方法节中所述的二级测定方法测定的)。
本发明多肽或偶联物中使用的术语“功能性位点”打算表示干扰素β的功能或性能必需的或有关的一个或多个氨基酸残基，并因此“位于”该功能性位点。功能性位点可以是受体结合位点并且可通过本领域已知方法来测定，优选通过与相关受体如由IFNAR-1和IFNAR-2构成的I型干扰素受体复合来分析该多肽的结构。
本发明的偶联物
如上所述，本发明首先涉及显示干扰素β活性的并且含有至少一个与干扰素β多肽共价结合的第一非多肽部分的偶联物，其氨基酸序列在包含了所述第一非多肽部分的连接基团的至少一个引入的和至少一个去除的氨基酸残基上不同于野生型人干扰素β。
通过去除和/或引入含有所述非多肽部分的一个连接基团的氨基酸残基，可以对多肽进行特别地修饰以便产生更易于与所选非多肽部分偶联的分子，以便使偶联模式最佳化(如，确保非多肽部分最佳分布在干扰素β分子表面并因此如有效地掩盖多肽的表位和其它表面部分而不会明显损害其功能)。例如，通过引入连接基团，使干扰素β多肽中与相关非多肽部分结合的特定氨基酸残基的含量增加或改变，因此获得更有效的特异的和/或广泛的偶联物。通过去除一个或多个连接基团，可以避免多肽部分中非多肽部分的偶联(这种偶联是不利的)，如，与位于或邻近多肽功能性位点的氨基酸残基偶联(因为在此位置的偶联可导致所得偶联物失去或减小干扰素β的活性，其原因是损害了受体的识别)。而且，去除邻近另一连接基团的连接基团以避免与这类基团的异源偶联可能是有利的。
会理解含有非多肽部分的连接基团的氨基酸残基(或去除或引入)基于非多肽部分的性质来选择，并且多数情况下基于所使用的偶联方法来选择。例如，非多肽部分是聚合物分子如聚乙二醇或聚环氧烷衍生的分子时，能够作为连接基团发挥功能的氨基酸残基可以选自赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。非多肽部分是糖部分时，连接基团是体内糖基化位点，优选N-糖基化位点。
按本发明引入或从干扰素β多肽去除非多肽部分的连接基团时，将被修饰的干扰素β多肽的位点可方便地如下选择：
位点优选位于干扰素β多肽的表面，更优选被有25％以上的侧链暴露于溶剂的氨基酸残基占据，优选该残基的侧链有50％以上暴露于溶剂中。按照本文方法节中所述的人干扰素β分子的3D结构分析方法来确定此类位点。
另外，被修饰的位点基于干扰素β蛋白序列家族的分析来确定。更具体来说，在该家族的一或多个成员而非亲本干扰素β中，被修饰的位点可以是一个由含有相关连接基团的氨基酸残基(此氨基酸残基是被引入的)占据的，在亲本干扰素β，而非该家族的一或多个其它成员中，被修饰的位点是一个由含有相关连接基团的氨基酸残基(此氨基酸残基是被去除的)占据的。
为了决定连接基团的最佳分布，干扰素β分子表面氨基酸残基之间的距离基于干扰素β多肽的3D结构来计算。更具体来说，测定含有所述连接基团的氨基酸残基的CB之间的距离，或一个氨基酸残基的功能基(赖氨酸的NZ、天冬氨酸的CG、谷氨酸的CD、半胱氨酸的SG)和含有连接基团的另一个氨基酸残基的CB之间的距离。在甘氨酸的情况下，使用CA代替CB。在本发明的干扰素β多肽部分中，任何所述距离优选大于8，特别是大于10以便避免或减小异源偶联。
而且，在本发明偶联物的干扰素β多肽部分中，位于干扰素β受体结合位点的连接基团优选被去除，优选通过包含此基团的氨基酸残基的取代来去除。
更常用的修饰干扰素β多肽的方法是掩盖，并因此通过与非多肽部分偶联而破坏或者灭活亲本干扰素β中存在的表位。人干扰素β的表位可以通过使用本领域已知的方法来识别，所述方法也称作表位作图，例如参见Romagnoli等人，J.Biol Chem，1999，380(5)：553-9，DeLisser HM，Methods MolBiol，1999，96：11-20，Van de Water等人，Clin Immunol Immunopathol，1997，85(3)：229-35，Saint-Remy JM，Toxicology，1997，119(1)：77-81，和Lane DP andStephen CW，Curr Opin Immunol，1993，5(2)：268-71。一种方法是建立一个表达随机寡肽，例如9氨基酸残基的噬菌体展示库。人干扰素β特异性抗血清中的IgG1抗体通过免疫沉淀法纯化并且反应性噬菌体通过免疫印迹法识别。通过对纯化的反应性噬菌体进行DNA测序，可测定该寡肽的序列，然后将该寡肽序列定位在干扰素β的3D-结构上。或者，表位可按照US5,041,376中所描述的方法鉴定。由此鉴定的结构区构成可选作引入非多肽部分的连接基团靶区域的表位。优选地，人重组干扰素β(任选包含C17S突变)的至少一个表位，如两个、三个或四个表位被本发明非多肽部分掩盖。因此，在一个具体实例中，与任选包含C17S突变的野生型人干扰素β，包括任何干扰素β商品相比，本发明偶联物至少具有一个掩盖的表位。优选地，本发明偶联物包含被修饰以便于掩盖位于氨基酸残基Q49和/或F111附近的表位的多肽。这一点可通过将非多肽部分的连接基团引入位于Q49和/或F111附近(即在一级序列的4个氨基酸残基内或者在三级序列的大约10内)的位点进行。所述10距离在CB之间(在甘氨酸情况下在CA之间)测定。所述特异性引入在下列部分中描述。
在去除连接基团的情况下，包含所述基团并占据上述位点的相关氨基酸残基优选地用不同的不包含所述非多肽部分的连接基团的氨基酸残基取代。
在引入连接基团的情况下，将包含所述基团的氨基酸残基引入所述位点，优选地通过取代占据所述位点的氨基酸残基进行。
可用于偶联并存在于干扰素β多肽中的连接基团的确切数目依赖于需要通过偶联获得的作用。例如，所获作用依赖于偶联的性质和程度(例如非多肽部分的识别，需要或可能与多肽偶联的非多肽的数目，应该在什么地方偶联或应该避免在什么地方偶联等)。例如，如果需要降低免疫原性，连接基团的数目(和位置)应该足以掩盖大部分或所有的表位。这通常在当干扰素β多肽的绝大部分被掩盖时获得。通常当用于偶联的连接基团总数在1-10个，特别是2-8个，如3-7个时可有效地掩盖表位。
功能性体内半衰期依赖于偶联物的分子量，延长半衰期所需连接基团的数目因此依赖于所述非多肽部分的分子量。在一个具体实例中，当通过Laemmli，U.K.，Nature Vol 227(1970).P680-85中的SDS-PAGE测定时，本发明偶联物具有至少67kDa，特别是至少70kDa的分子量。干扰素β具有大约20kDa的分子量，因此，为获得所需要的作用，另外需要大约50kDa。例如，这可通过5个10kDa的PEG分子或本文所描述的其它方法提供。
为了避免人干扰素β亲本的结构和功能太多地破坏，按照本发明方法改变的氨基酸残基(与SEQ ID NO2所示氨基酸序列相比)的总数通常不超过15个。优选地，干扰素β多肽包含一种氨基酸序列，它与SEQ ID NO2所示氨基酸序列有1-15个氨基酸，如1-8或2-8个氨基酸残基不同，例如有1-5或2-5个氨基酸残基与SEQ ID NO2所示氨基酸序列不同。因此，通常干扰素β多肽包含与SEQ ID NO2所示氨基酸序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基不同的氨基酸序列。优选地，上述数目表示引入或者去除含有相关非多肽部分的连接基团的氨基酸残基的总数目，或表示引入和去除含有此基团的氨基酸残基的总数目。
在本发明的偶联物中，优选所有可偶联的连接基团的至少约50％，如至少约80％并且优选所有这些基团被相关非多肽部分占据。因此，在优选的实施方案中，本发明的偶联物包含如，1-10个非多肽部分，如2-8或3-6个。
本发明的偶联物具有一个或多个下列改进的特性：
与野生型人干扰素β(如，Avonex或Rebif)或Betaseron相比免疫原性减小，如，减小至少25％，如至少50％，并且更优选至少75％。
与野生型人干扰素β(如，Avonex或Rebif)或Betaseron相比功能性体内半衰期增加和/或血清半衰期增加。
与来自野生型人干扰素β(如，Avonex或Rebif)或Betaseron处理的病人中的中和抗体的反应减小或没有反应，如至少减小中和作用的25％，如至少50％，并且优选至少75％。
本发明偶联物的抗病毒活性值可能不是关键的，并因此与野生型人干扰素β(如，Avonex或Rebif)或Betaseron相比，被减小(如，高达75％)或被增加(如至少5％)或相等。
而且，与本发明偶联物的抗增殖活性相比，抗病毒活性的程度是可以改变的，并因此比野生型人干扰素β高、低或相等。
本发明的偶联物，其中非多肽部分是具有赖氨酸作为连接基团的分子
在优选的实施方案中，第一非多肽部分具有赖氨酸作为连接基团，并因此干扰素β多肽含有在至少一个引入的和/或至少一个去除的赖氨酸残基上不同于野生型人干扰素β的氨基酸序列。尽管非多肽部分可以是任何与赖氨酸残基如其ε-氨基结合的，如聚合物分子、亲脂性基团、有机衍生剂或碳水化合物部分，但优选在以“与聚合物分子的偶联”为标题的章节中所述的任何聚合物分子，特别是分支或线性PEG或聚环氧烷。最优选地，聚合物分子是PEG并且用于偶联的活化分子是来自Shearwater Polymers，Inc.的SS-PEG、NPC-PEG、aldehyd-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC；来自Enzon，Inc.的SC-PEG；US5880255的描述的tresylated mPEG或氧羰基-氧-N-二羧基酰亚胺-PEG(US5122614)。一般来说，与赖氨酸残基偶联时，非多肽部分的分子量约为5或10kDa。
在一个实施方案中，干扰素β多肽的氨基酸序列在至少一个去除的赖氨酸残基如1-5个去除的赖氨酸残基，特别是1-4或1-3个去除的赖氨酸残基上不同于人野生型干扰素β。被去除，优选通过置换而被去除的赖氨酸残基选自K19、K33、K45、K52、K99、K105、K108、K115、K123、K134和K136。赖氨酸残基可被任何其它氨基酸残基置换，但优选被精氨酸或谷氨酰胺残基置换以便产生最少的结构差别。特别是，多肽部分中K19、K45、K52和/或K123，优选K19、K45和/或K123被另一任何其它氨基酸残基，优选精氨酸或谷氨酰胺置换。例如，本发明偶联物中干扰素β多肽部分包含选自下列的氨基酸取代的组合：
K19R+K45R+K123R；
K19Q+K45R+K123R；
K19R+K45Q+K123R；
K19R+K45R+K123Q；
K19Q+K45Q+K123R；
K19R+K45Q+K123Q；
K19Q+K45R+K123Q；
K19Q+K45Q+K123Q；
K45R+K123R；
K45Q+K123R；
K45Q+K123Q；
K45R+K123Q；
K19R+K123R；
K19Q+K123R；
K19R+K123Q；
K19Q+K123Q；
K19R+K45R；
K19Q+K45R；
K19R+K45Q；或
K19Q+K45Q。
除上述列表所示的氨基酸取代之外，所述多肽部分可含有至少一个选自下组的取代：K33R、K33Q、K52R、K25Q、K99R、K99Q、K105R、K105Q、K108R、K108Q、K115R、K115Q、K134R、K134Q、K136R和K136Q，如至少一个下列取代：
K52R+K134R；
K99R+K136R；
K33R+K105R+K136R；
K52R+K108R+K134R；
K99R+K115R+K136R；
K19R+K33R+K45R+K123R；
K19R+K45R+K52R+K123R；
K19R+K33R+K45R+K52R+K123R；或
K19R+K45R+K52R+K99R+K123R.
在另一实施方案中，干扰素β多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO2所示序列在于，通过取代至少一个在亲本干扰素β分子上由暴露于表面的氨基酸残基所占据的位置处的氨基酸而引入一个赖氨酸残基，优选地，暴露的氨基酸残基具有至少25％，如至少50％的侧链暴露于表面。优选地，被取代的氨基酸残基选自SEQ ID NO2中的                                N4，F8，L9，R11，S12，F15，Q16，Q18，L20，W22，Q23，G26，R27，L28，E29，Y30，L32，R35，M36，N37，D39，P41，E42，E43，L47，Q48，Q49，T58，Q64，N65，F67，A68，R71，Q72，D73，S75，S76，G78，N80，E81，I83，E85，N86，A89，N90，Y92，H93，H97，T100，L102，E103，L106，E107，E109，D110，F111，R113，G114，L116，M117，L120，H121，R124，G127，R128，L130，H131，E137，Y138，H140，I145，R147，V148，E149，R152，Y155，F156，N158，R159，G162，Y163，R165和N166
更优选地，干扰素β多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO2所示氨基酸序列之处在于，赖氨酸残基已通过取代至少一个占据下列位置的氨基酸残基而被引入，所述位置选自：N4、F8、L9、R11、S12、G26、R27、E29、R35、N37、D39、E42、L47、Q48、Q49、A68、R71、Q72、D73、S75、G78、N80、E85、N86、A89、Y92、H93、D110、F111、R113、L116、H121、R124、G127、R128、R147、V148、Y155、N158、R159、G162和R165，甚至更优选地选自N4、R11、G26、R27、Q48、Q49、R71、D73、S75、N80、E85、A89、Y92、H93、F111、R113、L116、R124、G127、R128、Y155、N158和G162，最优选地选自R11、Q49、R71、S75、N80、E85、A89、H93、F111、R113、L116和Y155，最优选Q49和F111。
根据该实施方案，干扰素β多肽在上述一个或多个位置，特别是1-15个，如1-8个或1-5个，优选至少两个位置，如2-8个或2-5个位置中包含赖氨酸取代。
在另一个实施方案中，偶联物的干扰素β多肽部分的氨基酸序列在至少一个去除的和至少一个引入的赖氨酸残基，如1-5个或2-5个去除的赖氨酸残基和1-5个或2-5个引入的赖氨酸残基上不同。会理解被去除和引入的赖氨酸残基优选选自本节描述的那些。
根据本发明的实施方案，可偶联的赖氨酸残基的总数优选在1-10，如2-8或3-7个的范围中。
例如，本实施方案中偶联物的干扰素β多肽部分可以包含至少一个下列取代：R11K、Q48K、Q49K、R71K、S75K、N80K、E85K、A89K、H93K、F111K、R113K、L116K和Y155K；更优选R11K、Q49K、R71K、S75K、N80K、E85K、A89K、H93K、F111K、R113K、L116K和Y155K，以及至少一个下列取代：K19R/Q、K33R/Q、K45R/Q、K52R/Q、K99R/Q、K105R/Q、K108R/Q、K115R/Q、K123R/Q、K134R/Q和K136R/Q，其中R/Q表示取代为R或Q残基，优选取代为R残基。更优选地，干扰素β多肽包含至少一个下列取代：R11K、Q49K、R71K、S75K、N80K、E85K、A89K、H93K、F111K、R113K、L116K和Y155K，特别是Q49K、F111K和/或N80K，以及至少一个下列取代：K19、K45、K52和/或K123，优选取代为R或Q残基。具体来说，干扰素β多肽包含Q49K、F111K和N80K中至少一个的取代和上文赖氨酸残基的去除中所述的至少一个取代。例如，干扰素β多肽可包含下列取代：
Y+Z+K19R+K45R+K123R；
Y+Z+K19Q+K45R+K123R；
Y+Z+K19R+K45Q+K123R；
Y+Z+K19R+K45R+K123Q；
Y+Z+K19Q+K45Q+K123R；
Y+Z+K19R+K45Q+K123Q；
Y+Z+K19Q+K45R+K123Q；
Y+Z+K19Q+K45Q+K123Q；
Y+Z+K45R+K123R；
Y+Z+K45Q+K123R；
Y+Z+K45Q+K123Q；
Y+Z+K45R+K123Q；
Y+Z+K19R+K123R；
Y+Z+K19Q+K123R；
Y+Z+K19R+K123Q；
Y+Z+K19Q+K123Q；
Y+Z+K19R+K45R；
Y+Z+K19Q+K45R；
Y+Z+K19R+K45Q；或
Y+Z+K19Q+K45Q，
其中Y选自Q49K、F111K、N80K、Q49K+F11K、Q49K+N80K、F111K+N80K和Q49K+F111K+N80K并且Z不存在或含有至少一个选自下列的取代：K33R、K33Q、K52R、K52Q、K99R、K99Q、K105R、K105Q、K108R、K108Q、K115R、K115Q、K134R、K134Q、K136R和K136Q。优选地，干扰素β多肽包含下列取代Y+Z+K19R+K45Q+K123R，其中Y和Z定义同上。
更具体来说，本发明实施方案中，干扰素β多肽可包含一个下列取代：
K19R+K45R+F111K+K123R；
K19R+K45R+Q49K+F111K+K123R；
K19R+K45R+Q49K+K123R；
K19R+K45R+F111K；
K19R+K45R+Q49K+F111K；
K19R+Q49K+K123R；
K19R+Q49K+F111K+K123R；
K45Q+F111K+K123Q；
K45R+Q49K+K123R；或
K45R+Q49K+F111K+K123R。
特别是在非糖基化宿主如大肠杆菌中表达时，干扰素β多肽可含有取代N80K或C17S+N80K，可以与K19R/Q、K45R/Q、K52R/Q或K123R/Q中的一或多个组合。干扰素β多肽在非糖基化宿主细胞中表达时，特别优选N80K取代，因为N80是人干扰素β固有糖基化位点的组成部分并且在此位置上的偶联可以模拟天然糖基化作用。
而且，优选根据该方面的偶联物包含至少两个第一非多肽部分，如2-8个部分。
本发明偶联物，其中非多肽部分与半胱氨酸残基结合
再一方面，本发明涉及显示干扰素β活性的偶联物，其包含至少一个与干扰素β多肽的至少一个半胱氨酸残基偶联的第一非多肽，其氨基酸序列不同于野生型人干扰素β之处在于，至少一个半胱氨酸残基已被引入，优选通过取代引入由暴露于分子表面的氨基酸残基占据的亲本干扰素β分子的位置，优选其侧链有至少25％，如至少50％暴露于表面。例如，氨基酸残基选自SEQ ID NO2的F8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、L20、W22、L28、L32、M36、P41、T58、Q64、N65、F67、I83、E85、N86、A89、N90、Y92、H93、H97、T100、L102、E103、L106、M117、L120、H121、R124、G127、R128、L130、H131、H140、I145、R147、V148、E149、R152、Y155和F156。
另外，取代优选在苏氨酸或丝氨酸占据的位点进行。例如，此位置选自S2、S12、S13、T58、S74、S75、S76、T77、T82、T100、T112、S118、S119、S139、T144和T161，更优选S2、S12、S13、S74、S75、S76、T77、T82、T100、T112、S118、S119、S139和T114(侧链表面暴露)，进一步优选S2、S12、S75、S76、T82、T100、S119和S139(至少25％的侧链暴露)，并且甚至更优选S12、S75、T82和T100(至少50％的侧链暴露)。
上述苏氨酸或丝氨酸取代中，优选丝氨酸取代。因此，在更优选的实施方案中，所述位置选自S2、S12、S13、S74、S75、S76、S118、S119和S139，更优选S2、S12、S13、S74、S75、S76、S118、S119和S139，甚至更优选S2、S12、S75、S76、S119和S139，并且进一步优选S12和S75。
在一个实施方案中，仅一个半胱氨酸残基被引入干扰素β多肽以避免在两个或多个引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。在该连接中，存在于野生型人干扰素β中的C17可被去除，优选通过取代，特别是用S或A取代。在另一实施方案中，两个或多个半胱氨酸残基被引入，如2-6个或2-4个半胱氨酸残基。优选地，本发明该实施方案的偶联物中干扰素β多肽部分包含L47C、Q48C、Q49C、D110C、F111C或R113C突变，特别是仅仅一个这样的突变，可以与C17S突变组合。而且，干扰素β多肽可包含C17S+N80C取代。
尽管使用给出的偶联方法时，本发明该方面的第一非多肽部分可以是任何以半胱氨酸作为连接基团的分子(如碳水化合物部分、亲脂性基团或有机衍生剂)，但优选非多肽部分是聚合物分子。聚合物分子可以是以“与聚合物分子的偶联”为标题的章节中描述的任何分子，但优选选自线性或分支的聚乙二醇或聚环氧烷。最优选地，聚合物分子是VS-PEG。多肽和聚合物之间的偶联可以任何合适的方式来完成，如以“与聚合物分子的偶联”为标题的章节中描述的，例如使用一步法或在所述章节中所涉及的多步法。干扰素β多肽仅包含一个可偶联的半胱氨酸残基时，优选与具有至少20kDa分子量的第一非多肽部分偶联，或者是直接偶联或者是通过低分子量聚合物间接偶联(按W099/55377所公开的方法)。偶联物包含两个或多个第一非多肽部分时，它们各自的分子量通常为5或10kDa。
本发明的偶联物，其中非多肽部分与酸基团结合
再一方面，本发明涉及显示干扰素β活性的偶联物，其含有至少一个具有酸基团作为连接基团的第一非多肽部分，所述的非多肽部分与干扰素β多肽中的至少一个天冬氨酸残基或一个谷氨酸残基偶联，所述干扰素β多肽的氨基酸序列不同于野生型人干扰素β在于分别至少引入一个和/或至少去除一个天冬氨酸或谷氨酸残基。相关的氨基酸残基可被引入由表面暴露的氨基酸残基占据的任何位点，优选由侧链表面暴露超过25％的氨基酸残基占据的位点。优选地，天冬氨酸残基或谷氨酸残基取代了占据选自下列位置的至少一个氨基酸残基：N4、L5、L6、F8、L9、Q10、R11、S12、S13、F15、Q16、Q18、K19、L20、W22、Q23、L24、N25、G26、R27、Y30、M36、Q46、Q48、Q49、I66、F67、A68、I69、F70、R71、S75、T82、I83、L87、A89、N90、V91、Y92、H93、Q94、I95、N96、H97、K108、F111、L116、L120、K123、R124、Y126、G127、R128、L130、H131、Y132、K134、A135、H140、T144、R147、Y155、F156、N158、R159、G162、Y163和R165。
更优选地，所述位置选自N4、L5、F8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、K19、W22、Q23、G26、R27、Y30、M36、Q46、Q48、Q49、A68、R71、S75、T82、A89、N90、Y92、H93、N96、H97、K108、F111、L116、L120、K123、R124、G127、R128、L130、H131、K134、A135、H140、Y155、N158、R159、G162、Y163和R165，如选自N4、L5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、Q23、R27、Y30、M36、Q46、Q48、Q49、R71、S75、T82、A89、Y92、H93、K108、F111、L116、K123、R124、G127、H131、K134、A135、Y155和R165，更优选选自N4、L5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、Q23、R27、Y30、Q46、Q48、Q49、S75、T82、A89、Y92、H93、K108、F111、L116、R124、G127、H131、K134、Y155和R165，如选自L5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、Q23、Q48、Q49、Y92、H93、R124、G127、H131和Y155，甚至更优选选自S12、Q16、K19、Q23、Q48、Q49、Y92、H93、R124、G127、H131和Y155，如选自S12、Q16、K19、Q23、Q48、Y92、H93、R124、G127、H131和Y155，特别是选自S12、Q16、K19、Q23、Q48、H93和H131，特别优选选自S12、Q16、K19、Q48、H93、H131，并且最优选选自Q16和Q48。
而且，为了获得足够数目的非多肽部分，优选引入至少两个天冬氨酸残基或至少两个谷氨酸残基，优选在选自上文所列的任何两个位置。也优选该方面的偶联物包含至少两个第一非多肽部分。
在去除氨基酸残基的情况下，干扰素β多肽的氨基酸序列在至少一个去除的天冬氨酸或谷氨酸残基，如1-5个去除的残基，特别是1-4个或1-3个去除的天冬氨酸或谷氨酸残基上不同于人野生型干扰素β。优选通过置换去除的残基选自D34、D39、D54、D73、D110、E29、E42、E43、E53、E61、E81、E85、E103、E104、E107、E109、E137和E149。天冬氨酸或谷氨酸残基可用任何其它氨基酸残基来置换，但优选被精氨酸或谷氨酰胺残基置换。第一非多肽部分可以是具有这种特性的任何非多肽部分，目前优选非多肽部分是聚合物分子或具有作为连接基团的酸基团的有机衍生剂，特别是聚合物分子如PEG，并且按Sakane和Pardridge在Pharmceutical Research，Vol.14，No.8，1997，pp1085-1091中描述的方法来制备偶联物。一般来说，与酸基团偶联时，非多肽部分的分子量约为5或10kDa。
含有第二非多肽部分的本发明偶联物
除了第一非多肽部分(如前节所述)之外，本发明偶联物可包含与第一非多肽部分不同类型的第二个多肽部分。优选地，在第一非多肽部分是如聚合物分子如PEG的任何上述偶联物中，第二非多肽部分是糖部分，特别是N-连接的糖部分。尽管第二非多肽部分可以与人干扰素β的天然糖基化位点如N80所限定的N-连接的糖基化位点连接，但一般来说有利的是在干扰素β多肽中引入至少一个另外的糖基化位点。此位点是如上节“本发明的偶联物，其中非多肽部分是糖部分”中所述的。而且，在至少一个另外的糖基化位点被引入的情况下，可通过去除如下所述的现有糖基化位点来完成。
可以理解的是，为了获得结合第一和第二非多肽部分的最佳分布，可以修饰干扰素β多肽的第一和第二非多肽部分中连接基团的数目和分布，以便第一非多肽部分去除至少一个连接基团和第二非多肽部分引入至少一个连接基团或反过来也是这样。例如，干扰素β多肽包含至少两个(如2-5)第一非多肽部分的去除的连接基团和至少一个(如1-5)第二非多肽部分的引入的连接基团或反过来也是这样。例如，干扰素β多肽中第一非多肽部分去除至少两个连接基团，如2-5个，且第二非多肽部分导入至少一个(如1-5个)连接基团，反之亦然。特别感兴趣的是第一非多肽部分是具有赖氨酸作为连接基团的聚合物分子如PEG并且第二非多肽部分是N-连接的糖部分的偶联物。
更具体来说，本发明的偶联物可以是显示干扰素β活性的一种偶联物，其包含至少一个聚合物分子，优选PEG和至少一个与干扰素β多肽共价结合的糖部分，其氨基酸序列在下列方面不同于野生型人干扰素β：
a)至少引入和/或去除一个包含与聚合物分子结合的基团的氨基酸残基；和
b)至少引入和/或去除一个体内糖基化位点，特别是N-糖基化位点，
条件是结合聚合物分子的基团是半胱氨酸残基，并且糖部分是N-连接的糖部分时，半胱氨酸的插入方式不会导致N-糖基化位点的破坏。WO99/03887建议半胱氨酸残基可被引入干扰素β的天然N-糖基化位点。
在具体的实施方案中，干扰素β多肽包含一个以下系列的突变：
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T；或
K19R+K45R+Q49N+Q51T+K123R。
本发明的偶联物，其中非多肽部分是糖部分
本发明偶联物有至少一个糖部分与体内糖基化位点特别是N-糖基化位点结合时，结合位点是野生型人干扰素βN80位的天然N-糖基化位点，即由氨基酸残基N80、E81、T82和I83限定的位点，或者引入干扰素β多肽中的新的体内糖基化位点。体内糖基化位点可以是O-糖基化位点，但优选是N-糖基化位点。
更具体来说，本发明一方面涉及显示干扰素β活性的偶联物，其包含干扰素β多肽，其氨基酸序列在至少一个引入的糖基化位点上不同于野生型人干扰素β，偶联物进一步包含至少一个与引入的糖基化位点结合的非PEG化的糖部分。
本发明的另一方面涉及显示干扰素β活性的偶联物，其包含干扰素β多肽，其氨基酸序列因引入或去除糖基化位点而不同于野生型干扰素β，条件是如果仅仅去除糖基化位点(并因此没有引入糖基化位点)，干扰素β多肽不包含一个或多个下列取代：N80C、E81C或T82C。后一类取代在WO99/03887中提到。
例如，体内糖基化位点被引入亲本干扰素β分子中由暴露于分子表面的氨基酸残基占据的位置，优选超过25％的侧链暴露于溶剂，特别是超过50％的侧链暴露于溶剂(在本文方法节中鉴定了这些位点)。引入N-糖基化位点，使所述位点的N-残基位于所述位点。类似地，引入O-糖基化位点使构成此位点的S或T残基位于所述位点。而且，为了确保有效的糖基化，优选体内糖基化位点，特别是N-糖基化位点的N残基或O-糖基化位点的S或T残基位于干扰素β多肽的最初141个氨基酸残基内，更优选在最初116个氨基酸残基内。更优选体内糖基化位点被引入仅仅需要一个突变以产生该位点的位置(即，产生功能糖基化位点所需的任何其它氨基酸残基已经存在于分子中)。
导致在干扰素β分子表面暴露并被超过25％侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位点引入另一N-糖基化位点的取代包括：S2N+N4S/T，L6S/T，L5N+G7S/T，F8N+Q10S/T，L9N+R11S/T，R11N，R11N+S13T，S12N+N14S/T，F15N+C17S/T，Q16N+Q18S/T，Q18N+L20S/T，K19N+L21S/T，W22N+L24S/T，Q23N+H25S/T，G26N+L28S/T，R27N+E29S/T，L28S+Y30S/T，Y30N+L32S/T，L32N+D34S/T，K33N+R35S/T，R35N+N37S/T，M36N+F38S/T，D39S/T，D39N+P41S/T，E42N+I44S/T，Q43N+K45S/T，K45N+L47S/T，Q46N+Q48S/T，L47N+Q49T/S，Q48N+F50S/T，Q49N+Q51S/T，Q51N+E53S/T，K52N+D54S/T，L57N+I59S/T，Q64N+I66S/T，A68N+F70S/T，R71N+D73S/T，Q72N，Q72N+S74T，D73N，D73N+S75T，S75N+T77S，S75N，S76N+G78S/T，E81N+I83S/T，T82N+V84S/T，E85N+L87S/T，L88S/T，A89N+V91S/T，Y92S/T，Y92N+Q94S/T，H93N+I95S/T，L98S/T，H97N+K99S/T，K99N+V101S/T，T100N+L102S/T，E103N+K105S/T，E104N+L106S/T，K105N+E107S/T，E107N+E109S/T，K108N+D110S/T，E109N+F111S/T，D110N+T112S，D110N，F111N+R113S/T，R113N+K115S/T，G114N+L116S/T，K115N+M117S/T，L116N，L116N+S118T，S119N+H212S/T，L120N+L122S/T，H121N+K123S/T，K123N+Y125S/T，R124N+Y126S/T，G127N+I129S/T，R128N+L130S/T，L130N+Y132S/T，H131N+L133S/T，K134N+K136S/T，A135N+E137S/T，K136N+Y138S/T，E137N，Y138N+H140S/T，H140N+A142S/T，V148N+I150S/T，R152N+F154S/T，Y155N+I157S/T，L160S/T，R159N+T161S，R159N，G162N+L164S/T，和Y163N+R165S/T。
导致在具有超过50％侧链暴露于表面的干扰素β分子表面暴露的位点引入另一N-糖基化位点的取代包括：L6S/T，L5N+G7S/T，F8N+Q10S/T，L9N+R11S/T，S12N+N14S/T，F15N+C17S/T，Q16N+Q18S/T，K19N+L21S/T，W22N+L24S/T，Q23N+H25S/T，G26N+L28S/T，R27N+E29S/T，Y30N+L32S/T，K33N+R35S/T，R35N+N37S/T，M36N+F38S/T，D39S/T，D39N+P41S/T，E42N+I44S/T，Q46N+Q48S/T，Q48N+F50S/T，Q49N+Q51S/T，Q51N+E53S/T，K52N+D54S/T，L57N+I59S/T，R71N+D73S/T，D73N，D73N+S75T，S75N+T77S，S75N，S76N+G78S/T，E81N+I83S/T，T82N+V84S/T，E85N+L87S/T，A89N+V91S/T，Y92S/T，Y92N+Q94S/T，H93N+I95S/T，T100N+L102S/T，E103N+K105S/T，E104N+L106S/T，E107N+E109S/T，K108N+D110S/T，D110N+T112S，D110N，F111N+R113S/T，R113N+K115S/T，L116N，L116N+S118T，K123N+Y125S/T，R124N+Y126S/T，G127N+I129S/T，H131N+L133S/T，K134N+K136S/T，A135N+E137S/T，E137N，V148N+I150S/T，和Y155N+I157S/T。
上文所列取代中，优选在141个N-末端氨基酸残基特别是116个N-末端氨基酸残基中引入N残基。
仅仅通过一个氨基酸取代引入N-糖基化位点的取代包括：L6S/T、R11N、D39S/T、Q72N、D73N、S75N、L88S/T、Y92S/T、L98S/T、D110N、L116N、E137N、R159N和L160S/T。其中优选的取代选自L6S/T、R11N、D39S/T、Q72N、D73N、S75N、L88S/T、Y92S/T、L98S/T、D110N和L116N，更优选选自L6S/T、D39S/T、D73N、S75N、L88S/T、D110N、L116N和E137N；并且最优选选自L6S/T、D39S/T、D73N、S75N、L88S/T、D110N和L116N。
本发明最优选的干扰素β多肽包括至少一个下列取代：
S2N+N4T/S，L9N+R11T/S，R11N，S12N+N14T/S，F15N+C17S/T，Q16N+Q18T/S，K19N+L21T/S，Q23N+H25T/S，G26N+L28T/S，R27N+E29T/S，L28N+Y30T/S，D39T/S，K45N+L47T/S，Q46N+Q48T/S，Q48N+F50T/S，Q49N+Q51T/S，Q51N+E53T/S，R71N+D73T/S，Q72N，D73N，S75N，S76N+G78T/S，L88T/S，Y92T/S，N93N+I95T/S，L98T/S，E103N+K105T/S，E104N+L106T/S，E107N+E109T/S，K108N+D110T/S，D110N，F111N+R113T/S或L116N，更优选包括至少一个下列取代：S2N+N4T，L9N+R11T，49N+Q51T或F111N+R113T或R71N+D73T，特别是49N+Q51T或F111N+R113T或R71N+D73T。例如，干扰素β多肽包含至少一个以下取代组合：
Q49N+Q51T+F111N+R113T；
Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+R113T；
S2N+N4T+F111N+R113T；
S2N+N4T+Q49N+Q51T；
S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T；
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T；
S2N+N4T+L9N+R11T+F111N+R113T；
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T；
L9N+R11T+Q49N+Q51T；
L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T；或
L9N+R11T+F111N+R113T
会理解为了引入功能性体内糖基化位点，在N-残基和S/T残基之间的氨基酸残基与脯氨酸不同。通常，其间的氨基酸残基将是占据SEQ ID NO2所示氨基酸序列中相关位置的残基。例如，在包含取代Q49N+Q51S的多肽中，位置50是在其间的位置。
本发明偶联物的干扰素β多肽部分可以含有单一的体内糖基化位点。然而，为了使亲本多肽表面存在的表位充分掩盖，通常理想的是多肽含有一个以上的体内糖基化位点，特别是2-7个体内糖基化位点如2、3、4、5、6或7个糖基化位点。因此，干扰素β多肽可含有一个另外的糖基化位点，或者可含有2、3、4、5、6、7或更多个引入的体内糖基化位点，优选通过任何上文列表中所述的一个或多个取代引入。
如上所述，除了一个或多个引入的糖基化位点之外，已有的糖基化位点可从干扰素β多肽中去除。例如，用于引入一个糖基化位点的任何上文所列取代可以与去除人野生型干扰素β的天然N-糖基化位点的取代组合。例如，第一非多肽具有K，C，D，E中的一个作为连接基团时，干扰素β多肽可含有N80取代，如N80K/C/D/E取代中的一个。例如，干扰素β多肽可含有与N80K/C/D/E组合的至少一个下列取代：S2N+N4T/S，L9N+R11T/S，R11N，S12N+N14T/S，F15N+C17S/T，Q16N+Q18T/S，K19N+L21T/S，Q23N+H25T/S，G26N+L28T/S，R27N+E29T/S，L28N+Y30T/S，D39T/S，K45N+L47T/S，Q46N+Q48T/S，Q48N+F50T/S，Q49N+Q51T/S，Q51N+E53T/S，R71N+D73T/S，Q72N，D73N，S75N，S76N+G78T/S，L88T/S，Y92T/S，N93N+I95T/S，L98T/S，E103N+K105T/S，E104N+L106T/S，E107N+E109T/S，K108N+D110T/S，D110N，F111N+R113T/S，或L116N
更具体来说，干扰素β多肽可含有与N80K/C/D/E组合的取代：Q49N+Q51T或F111N+R113T或R71N+D73T，特别是Q49N+Q51T+F111N+R113T或Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+R113T。
在本节中公开的已引入和/或去除至少一个糖基化位点的任何糖基化变体，如含有Q48N+F50T/S、Q48N+F50T/S+F111N+R113T/S、Q49N+Q51T/S、F111N+R113T/S或Q49N+Q51T/S+F111N+R113T/S取代的变体还可与聚合物分子，如PEG，或者任何其它非多肽部分偶联。为此，偶联可通过使用已经存在于干扰素β多肽中的连接基团来完成或者可引入和/或去除可用于偶联的连接基团，特别是总数1-6，尤其是3-4或1、2、3、4、5或6个连接基团。优选地，在干扰素β多肽含有两个糖基化位点的本发明偶联物中，选择非多肽部分的数目和分子量使经非多肽部分增加的总分子量在20-40kDa的范围中，特别是约20kDa或30kDa。
尤其，糖基化的变体可通过赖氨酸连接基团与非多肽部分偶联，并且例如，亲本多肽的一个或多个赖氨酸残基可通过标题为“本发明偶联物，其中非多肽部分为具有赖氨酸连接基团的分子”的章节中所述的任何取代，特别是取代K19R+K45R+K123R去除。或者例如，赖氨酸残基可通过在所述章中所述的任何取代，特别是取代R71K引入。因此，本发明的一个特定偶联物为包含糖基化干扰素β多肽的偶联物，其中所述糖基化干扰素β多肽包含进一步与PEG偶联的突变Q49N+Q51T+F111N+R113T+K19R+K45R+K123R或Q49N+Q51T+F111N+R113T+K19R+K45R+K123R+R71K。所述偶联物的糖基化多肽部分优选在CHO细胞中制备，纯化后，使用如Shearwater Polymers，Inc.的SS-PEG，NPC-PEG，aldehyd-PEG，mPEG-SPA，mPEG-SCM，mPEG-BTC，Enzon，Inc.的SC-PEG，US5,880,255中所描述的tresylated mPEG或氧羰基-氧-N-二羧基酰亚胺-PEG(US5,122,614)。
或者，为了通过赖氨酸基团PEG化，该具体实例中的糖基化偶联物可通过标题为“本发明偶联物，其中非多肽部分为具有半胱氨酸连接基团的分子”的章节中所述的半胱氨酸基团而PEG化(例如，为实现该目的，干扰素β多肽可至少包含突变N80C，R71C和C17S中的一个)，通过标题为“本发明的偶联物，其中非多肽部分与酸基团结合”的章节中所述的酸基团或通过其它适宜的基团PEG化。
本发明其它偶联物
为了引入或去除包含用于所选非多肽部分的连接基团的氨基酸残基(如上标题为“本发明偶联物……”任何章节所述)，偶联物的干扰素β部分可包含其它取代。优选的实例为M1、C17、N18或V101中任何残基的取代，例如，一个或多个下列取代：C17S；N80K/C/D/E；V101Y/W/F/，H；M1的缺失；或M1K。当干扰素β多肽表达为带有标签，例如His-14标签的形式时，M1K的取代是特别令人感兴趣的，其中所述标签将在纯化和/或偶联后通过DAP(二氨基肽酶)去除。
本发明偶联物的非多肽部分
如上所述，本发明偶联物的非多肽部分优选地选自聚合物分子、亲脂性化合物、糖部分(通过体内糖基化的方式)和有机衍化剂。所有这些物质都可为偶联物的多肽部分提供所需性质，特别是降低免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或增加血清半衰期。偶联物的多肽部分可以仅与一种类型的非多肽部分偶联，但也可以与两种或多种不同类型的非多肽部分偶联，例如，与聚合物分子和糖部分偶联，与亲脂性基团和糖部分偶联，与有机衍化剂和糖部分偶联，与亲脂性基团和聚合物分子偶联等。与两种或多种不同类型的非多肽部分偶联可同时或按顺序进行。例如，非多肽部分的选择可依赖于需要通过偶联获得的效应。例如，已发现，糖部分特别适用于降低免疫原性，而聚合物分子如PEG特别适用于增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期。利用聚合物分子作为第一非多肽部分并利用糖部分作为第二非多肽部分可导致免疫原性降低和功能性体内半衰期或血清半衰期增加。
制备本发明偶联物的方法
在下列章节“与亲脂性化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与糖部分的偶联”和“与有机衍化剂的偶联”中描述与各指定类型非多肽的偶联。
与亲脂性化合物的偶联
为了与亲脂性化合物偶联，下列多肽基团可发挥连接基团的作用：多肽的N-端或C-端、氨基酸残基Ser、Thr或Tyr的羟基、Lys的ε-氨基、Cys的SH基或Asp和Glu的羧基。多肽和亲脂性化合物可以直接或通过使用接头彼此偶联。亲脂性化合物可以是天然的化合物如饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺素、维生素、类胡萝卜素或甾体激素，或者合成的化合物如碳酸、醇、胺和具有一个或多个烷基-、芳基-、链烯基-的磺酸或其它多元不饱和的化合物。可按本领域已知的方法，如按Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505所述的方法来进行多肽和亲脂性化合物之间的偶联(任选通过接头来连接)。
与聚合物分子偶联
与多肽偶联的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或杂聚物，通常分子量范围为300-100000Da，如300-20000Da，更优选为500-10000Da，甚至更优选的范围为500-5000Da。
均聚物的实例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。杂聚物是包含一个或多个不同的偶联基团，如羟基基团和胺基基团的聚合物。
合适聚合物分子的实例包括选自下列聚合物的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基萄聚糖或任何其它适于减小免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期的生物聚合物。聚合物分子的另一实例是人白蛋白或另一富含胞浆的蛋白质。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、无毒的、无抗原性的、无免疫原性的，具有各种水溶性特性并易于从活的生物中分泌。
PEG是优选的被使用的聚合物分子，因为与，例如多糖如葡聚糖等相比仅仅具有少量的能够交联的反应基团。特别感兴趣的是单功能PEG，如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因为其偶联的化学相对简单(仅仅一个反应基团可用于与多糖上的连接基团偶联)。因此，交联的危险被消除，所得多肽偶联物更均匀并且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。
为了使聚合物分子与多肽共价结合，聚合物分子的羟基末端基团必须为活化形式，即具有反应性功能基团(其实例包括伯胺基团、酰肼(HZ)、巯基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当激活的聚合物分子有商品例如可得自ShearwaterPolymer，Inc.，Huntsville，AL，USA。或者，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法，例如，如WO 90/13540中所述激活。本发明中所使用的激活的线性或支化聚合物分子的特定实例描述于Shearwater Polymers，Inc.1997和2000 Catalogs(Functionalized Biocompatible Polymers for Research andpharmaceuticals，Polyethylene Glycol and Derivatives，引入本文供参考)。激活的PEG聚合物的特定实例包括下列线性PEGs：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG)，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，和支链PEG如PEG2-NHS和US 5,932,462和US 5,643,575中所描述的那些，将两参考引入本文供参考。此外，引入本文供参考的下列出版物中公开了有用的聚合物分子和/或PEG化化学过程：
                     US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO95/11924，WO95/1 3090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO95/06058，EP 439 508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，US5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。
多肽和激活的聚合物分子的偶联可通过使用任何常规方法，例如，如下列参考所述(所述参考中也描述了激活聚合物分子的适宜方法)进行：Harrisand Zalipsky，eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Application，AZC，Washington；R.F.Taylor，(1991)，“Protein immobilisation.Fundamentaland applications”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“Chemistry ofProtein Conjugation and Crosslinking”，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson et al.，(1993)，“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press，N.Y.)。技术人员会知道根据干扰素β多肽的连接基团以及聚合物的功能基(例如，是氨基、羟基、羧基、醛或巯基)来使用激活方法和/或偶联化学。PEG化可以与多肽上的所有可利用的基团(即，暴露于多肽表面的连接基团)直接进行偶联或可以与特定的连接基团如，N-末端氨基直接偶联(US5985265)。而且，偶联可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)来完成。
会理解PEG化方法应设计为能产生在结合的PEG分子数目、这些分子的大小和形式(如，是线性的还是分支的)，以及在多肽分子中结合这些分子的位置各方面最佳的分子。例如，可以根据需要完成的效果来选择所使用的聚合物的分子量。例如，如果偶联的主要目的是产生具有高分子量的偶联物(如，减小肾的清除)，通常理想的是偶联尽可能少的高分子量聚合物分子以获得所需分子量。当需要高度掩盖表位时，可通过使用足够数量的低分子量聚合物(如，分子量约为5000Da)来获得，这样可有效地掩盖多肽所有的或大部分的表位。例如，可使用2-8，如3-6个这样的聚合物。
仅与蛋白质上一个连接基团偶联(US5985265所述的)时，有利的是线性或分支的聚合物具有高分子量，如，约20kDa。
一般来说，聚合物的偶联在有助于聚合物所有可利用的连接基团与聚合物分子反应的条件下进行。典型地，激活的聚合物分子与多肽的摩尔比为1000-1，特别是200-1，优选100-1，如10-1或5-1，以便获得最佳反应。然而，也可使用等摩尔比。
本发明也打算通过接头来将聚合物分子与多肽偶联。合适的接头是技术人员公知的。优选的实例是氰尿酰氯(Abuchowski等人(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶联后，按本领域已知的方法如通过将伯胺加入到反应混合物中而封闭残留的活化聚合物分子，并通过合适的方法除去所产生的失活的聚合物分子。
碳水化合物部分与干扰素β的氨基酸残基在体外的共价偶联可用于修饰或增加碳水化合物取代基的数目或轮廓。根据所使用的偶联方式，碳水化合物可与a)精氨酸和组氨酸(Lundblad和Noyes，Chemical Reagents for ProteinModification，CRC Press Inc.Boca Raton，FI)，b)游离的羧基基团(如，C-末端氨基酸残基，天冬氨酸或谷氨酸)，c)游离的巯基如半胱氨酸巯基，d)游离的羟基如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或羟基脯氨酸的羟基，e)芳香族残基如苯丙氨酸或色氨酸的或f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些氨基酸残基构成可用于碳水化合物部分的连接基团的实例，可将它们引入干扰素β和/或从干扰素β多肽中除去。在WO87/05330和Aplin等人的CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中描述了体外偶联的合适方法。碳水化合物部分或PEG与蛋白质结合型和肽结合型Gln-残基的体外偶联也可以通过谷氨酰胺转移酶(TG酶)来进行，如按Sato等人，1996 Biochemistry 35，13072-13080或EP725145所述方法来进行。
与糖部分的偶联
为了完成干扰素β多肽(已引入一个或多个糖基化部分(参见“本发明偶联物，其中非多肽部分是糖部分”节))的体内糖基化，编码偶联物多肽部分的核苷酸序列必须被插入的糖基化的真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)、昆虫、哺乳动物细胞，选自转基因植物细胞或选自转基因动物。而且，在基因治疗中使用编码本发明偶联物中多肽部分的或本发明多肽的核苷酸序列时，可在人体中完成糖基化。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞、BHK细胞或HEK细胞，如HEK293，或昆虫细胞，如SF9细胞，或者酵母细胞如酿酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)、毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或任何其它合适的糖基化宿主，例如下文进一步描述的。任选通过体内糖基化与干扰素β多肽结合的糖部分进一步通过使用糖基转移酶，如使用由Neose，Horsham，PA，USA市售的glycoAdvanceTM技术来修饰。因此，例如，在CHO细胞中表达并体内糖基化后增加糖基化干扰素β多肽的唾液酸化(sialyation)是可能的。
与有机衍生剂的偶联
干扰素β多肽的共价修饰可通过多肽的连接基团与有机衍生剂反应来进行。合适的衍生剂和方法在本领域中是公知的。例如，半胱氨酰基残基常常与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可与溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反应进行衍生。组氨酰基残基通过与二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0下反应进行衍生，因为该试剂较特异于组氨酰基侧链。对溴苯甲酰甲基溴化物可用于衍生；该反应优选在0.1M卡可酸钠中于pH6.0下进行反应。赖氨酰基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生具有使赖氨酰基残基的电荷逆转的作用。衍生含α-氨基的残基的其它合适的试剂包括亚氨基酯如methyl picolinimidate、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氢硼化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。精氨酰基残基通过与一种或多种常规试剂的反应来修饰，所述试剂包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生要求反应在碱性条件下进行，因为胍功能基具有高的pKa。而且，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基或C-末端氨基酸残基)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应来进行选择性地修饰，其中R和R’是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰基和谷氨酰基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。
功能性位点的封闭
已经报道聚合物的过度偶联可导致与聚合物偶联的干扰素β多肽活性丧失。该问题可通过如去除位于功能性位点的连接基团或在偶联前封闭功能性位点而消除。后一种策略构成本发明进一步的技术方案(前一种策略在上文中进行了举例说明，如通过去除邻近功能性位点的赖氨酸残基)。更具体来说，按照第二种策略，干扰素β多肽和非多肽部分之间的偶联是在多肽功能性位点用能够结合多肽功能性位点的辅助分子封闭的条件下进行的。优选地，辅助分子能特异性识别多肽功能性位点，如受体，特别是I型干扰素受体。另外，辅助分子可以是抗体，特别是识别干扰素β多肽的单克隆抗体。特别是，辅助分子可以是中和性单克隆抗体。
可使多肽在偶联之前与辅助分子相互作用。这确保多肽的功能性位点被掩盖或保护并因此而不能被非多肽部分如聚合物衍生。从辅助分子洗脱后，非多肽部分和多肽之间的偶联可用至少部分保留的功能性位点来恢复。
具有被封闭的功能性位点的多肽与聚合物、亲脂性化合物、有机衍生剂或任何其它化合物的随后偶联以常规方式进行，如按上文“与……偶联”的章节中所述的方法进行。
不考虑用于掩盖偶联物中多肽功能性位点的辅助分子的性质，理想的是辅助分子不含或仅仅含有少量的与分子中指定非多肽部分结合的基团，其中与这些基团的偶联将阻止偶联的多肽从辅助分子上解吸。因此，可与多肽非掩盖部分中存在的连接基团选择性偶联并且辅助分子可反复用于重复偶联。例如，如果非多肽部分是聚合物分子如PEG这种具有赖氨酸ε氨基或N-末端氨基酸残基作为连接基团的分子时，理想的是辅助分子基本上不含可偶联的ε氨基，优选不含任何ε氨基。因此，在优选的实施方案中，辅助分子是能够与多肽功能性位点结合的蛋白质或肽，该蛋白质或肽不含任何与指定非多肽部分可偶联的连接基团。
在进一步的实施方案中，辅助分子首先与固相如柱填充材料，如Sephadex或琼脂糖珠，或表面，如反应容器共价连接。然后，将多肽装于载有辅助分子的柱材料上并按本领域已知的方法进行偶联，如按上文“与……偶联”的章节中所述的方法进行。该方法允许多肽偶联物通过洗脱从辅助分子上分离。多肽偶联物在不导致多肽偶联物实质性降解的理化条件下通过常规技术进行洗脱。含有多肽偶联物的流动相从固相上分离而辅助分子仍然共价连接。分离可以其它方式来完成。例如，辅助分子可用第二种可通过特异性结合剂(如，链霉抗生物素)来识别的分子(如生物素)来衍生。特异性结合剂可以与固相连接并因此允许通过流经第二分子-固相柱，并随后洗脱辅助分子-第二分子复合体，而非多肽偶联物，可使多肽偶联物与辅助分子-第二分子复合体分离。多肽偶联物以任何合适的方式从辅助分子上释放。可通过提供的条件完成脱保护，其中辅助分子从其结合的干扰素β的功能性位点上分离。例如，与聚合物偶联的抗体和抗独特型抗体之间的复合物可通过将pH调节到酸性或碱性pH来分离。
标记的干扰素β多肽的偶联
在另外的实施方案中，干扰素β多肽作为汇合蛋白(与标记物的，即通常由1-30，如1-20或1-15或1-10个氨基酸残基构成的氨基酸序列或肽段)来表达。除了允许快速和容易地进行纯化，标记物是完成标记多肽和非多肽部分之间偶联的常用工具。特别是，标记物可用于在微滴定板或其它载体如顺磁珠上完成偶联，这样标记的多肽可通过标记物来固定。在微滴定板上与标记的多肽偶联具有以下优点，标记的多肽可从培养肉汤直接固定在微滴定板上(原则上不经任何纯化)并进行偶联。因此，可减少操作步骤的总数(从表达到偶联)。而且，标记物可起间隔臂分子的作用以确保更易于使固定的多肽偶联。使用标记多肽进行的偶联可以是与本文中公开的任何非多肽部分的偶联，如与聚合物分子如PEG的偶联。
识别使用的特定标记物不是关键，只要该标记物能够与多肽一起表达并且能够固定在适宜的表面或载体物质上即可。许多适宜的标记物可通过商业渠道获得，例如，可购于Unizyme Laboratories，Denmark。例如，所述标记物可以是任一下列序列：
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
(用于提供所述标记物的载体购于Unizyme Laboratories，Denmark)
或任一下列序列：
EQKLI SEEDL(描述于Mol.Cell.Biol.5：3610-16，1985的C-端标记物)
DYKDDDDK(C-或N-端标记物)
YPYDVPDYA
抗上述标记物的抗体通常可通过商业渠道获得，例如购于ADI，AvesLab和Research Diagnostics。
下文的材料和方法章节中提供了利用标记的多肽进行PEG化的常规方法。
随后从多肽上切割标记物可通过市售酶进行。
本发明的多肽
本发明另一方面通常涉及本文所描述的新的干扰素β多肽，它与人天然干扰素β相比具有至少一个引入和/或至少一个去除的非多肽部分连接基团。该新的多肽是制备本发明偶联物的重要中间体化合物。另外，所述多肽本身可能具有重要的的特性。
所述多肽的实例包括那些包含一定氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列中与天然人干扰素β不同在于至少一个选自下列的氨基酸残基：N4，F8，L9，Q10，R11，S13，L24，N25，G26，L28，E29，N37，F38，Q48，Q49，Q64，N65，I66，F67，A68，I69，F70，R71，Q72，D73，S74，S75，S76，T77，G78，W79，N80，E81，T82，I83，V84，L87，L88，A89，N90，V91，Y92，H93，Q94，D110，F111，T112，R113，R128，H140，T144，I145，R147，V148，L151，R152，F154，Y155，N158和N166由选自K，R，D，E，C和N的不同氨基酸残基代替。上述氨基酸残基暴露于人干扰素β分子的表面，这通过人干扰素β的已知(solved)3D结构来证明。通过置换，将一个或多个具有用于非多肽部分的K、R、D、E、C或N连接基团，特别是聚合物连接基团，或具有易于通过碳水化合物部分改性的氨基酸残基的这些残基引入人干扰素β。所得改性的人干扰素β是一种用于制备干扰素β偶联物的合适的起始化合物，所述偶联物与未改性的人干扰素β分子相比具有改进的特性。
再一方面，本发明涉及一种干扰素β多肽，它含有不同于野生型人干扰素β的氨基酸序列，该不同在于至少一个选自下列位点的氨基酸残基被赖氨酸残基置换：N4、F8、L9、Q10、R11、S12、S13、L24、N25、G26、L28、E29、N37、F38、D39、Q48、Q49、Q64、N65、I66、F67、A68、I69、F70、R71、Q72、D73、S74、S75、S76、T77、G78、W79、N80、E81、T82、I83、V84、E85、L87、L88、A89、N90、V91、Y92、H93、Q94、D110、F111、T112、R113、R128、H140、T144、I145、R147、V148、L151、R152、F154、Y155、N158、G162和N166，条件是该多肽不同于具有下列取代的野生型人干扰素β的氨基酸序列：D54N+E85K+V91I+V101M并且不同于干扰素β和干扰素α的杂合分子，杂合的结果是39位具有赖氨酸。在Stewart等人的DNA Vol6 no2 1987 p119-128中公开了第一个被放弃的多肽，发现它是失活的，在US4769233中公开了第二个被放弃的多肽，是为了改善干扰素β的生物活性而构建的。这两种被放弃的多肽没有被制备或者描述为适用于制备具有减小的免疫原性和/或延长的功能性体内半衰期和/或血清半衰期的干扰素β偶联物的中间体。
进一步的实例包括以一个或多个选自下列位置的取代而不同于SEQ IDNO2氨基酸序列的干扰素β多肽：N4K、F15K、Q16K、R27K、R35K、D39K、Q49K、E85K、A89K、E103K、E109K、R124K、E137K和R159K，条件是取代是R27K时，该多肽不同于具有R27K+E43K取代的野生型人干扰素β的氨基酸序列。在Stewart等人的DNA Vol6 no2 1987 p119-128中公开了被放弃的多肽，发现其活性低。在结构-功能关系的研究中制备了该多肽但没有提及作为制备改善的干扰素β偶联物分子的可能的中间产物。例如，该干扰素β多肽包含不同于SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中包含取代R27K和至少一个不同于E43K的另外的取代，或者取代R35K和至少一个另外的取代，条件是该多肽具有不同于用下列取代修饰的野生型人干扰素β的氨基酸序列：G7E+S12N+C17Y+R35K。在Stewart等人的DNA Vol6 no2 1987p119-128中公开了一种被放弃的多肽，其具有与其抗病毒活性相比对Daudi细胞的持久抗增殖活性，但与野生型干扰素β相比减小了总体活性。该被放弃的多肽不是为了减小免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期而制备的，只是为了进行干扰素β结构-功能关系的研究而制备的。
除了任意上述取代外，本发明多肽另外还可以包含C17S取代和/或M1缺失或者M1K取代。而且，本发明多肽可以含有不同于SEQ ID NO 2的氨基酸序列，其不同在于去除(优选通过取代)至少一个选自K19、K33、K45、K52、K99、K105、K108、K115、K123、K134和K136的赖氨酸残基。赖氨酸残基可用任何其它氨基酸残基来置换，但优选用精氨酸或谷氨酸来置换。具体来说，本发明多肽可以是K45、K52和/或K123已被另一氨基酸残基置换的那些多肽，但优选被精氨酸或谷氨酸残基置换。而且，该多肽可以与标记物一起表达，如上文“标记的干扰素β多肽的偶联”章节中描述的方法。
本发明干扰素β多肽的另一实例包括含有不同于野生型人干扰素β氨基酸序列的多肽，其不同在于至少一个选自下列位置的赖氨酸残基被任意的其它氨基酸残基置换：K19、K33、K45、K52、K99、K105、K108、K115、K123、K134和K136，条件是干扰素β多肽不同于干扰素β与干扰素α的杂合体，因为杂交分子的45位为苯丙氨酸。优选地，至少K19、K45、K52和/或K123被置换。尽管根据本发明可以去除赖氨酸基团，但优选用任何其它氨基酸残基置换，更优选用精氨酸或谷氨酸置换。一般来说，本发明的多肽包含1-15氨基酸残基不同于上文所述的SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸序列。本发明多肽的实例选自那些包含在至少下列取代中不同于SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽：
R27K+R159K；
R27K+K45R+R159K；
R27K+Q49K+E85K+A89K；
R27K+K45R+Q49K+E85K+A89K；
R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K；
R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K；
N4K+R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K；
N4K+R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K；
R27K+K123R+R159K；
R27K+K45R+K123R+R159K；
R27K+Q49K+E85K+A89K+K123R；
R27K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R；
R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K+K123R；
R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R；
N4K+R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K+K123R；和
N4K+R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R。
会理解本文所公开的本发明任何多肽都可用于制备本发明的偶联物，即与本文公开的任何非多肽部分共价偶联。具体来说，本发明的多肽在糖基化微生物中表达时，该多肽可以糖基化形式来提供。
制备用于本发明所述用途的干扰素β多肽的方法
本发明的多肽或本发明偶联物的多肽部分(任选为糖基化形式)可通过本领域已知的任何合适的方法来制备。这些方法包括构建编码该多肽的核苷酸序列并在合适的转化或转染宿主中表达该序列。然而，可通过化学合成方法或化学合成方法的组合或者化学合成方法和重组DNA技术的组合来产生本发明的多肽，但效率很低。
编码干扰素β多肽的本发明核苷酸序列可通过分离或合成编码亲本干扰素β，例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核苷酸序列来构建，然后改变核苷酸序列以引入(即插入或取代)或消除(即去除或取代)相关氨基酸残基。
核苷酸序列可通过公知方法经定点诱变方便地进行修饰，如参见Mark等人“Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.5662-66(1984)；和US4588585。
另外，核苷酸序列可通过化学合成来制备，例如通过使用寡核苷酸合成仪，其中基于所需多肽的氨基酸序列来设计寡核苷酸，并且优选选择那些有利于生产重组多肽的宿主细胞的密码子。例如，编码所需多肽一部分的几种小分子寡核苷酸可通过PCR、连接或连接酶链反应(LCR)来合成和装配。各个寡核苷酸通常含有5’或3’突出端用于互补装配。
一旦装配(通过合成、定点诱变或另一方法)后，立即将编码干扰素β多肽的核苷酸序列插入重组载体中并可与干扰素β在所需转化宿主细胞中表达必需的控制序列可操作地连接。
当然，可以理解不是所有载体和表达控制序列都具有同样良好的表达本文所述多肽变体的核苷酸序列的功能。不是所有宿主能使相同的表达系统发挥同样优良的功能。然而，本领域技术人员不用进行实验就可以对这些载体、表达控制序列和宿主作出选择。例如，在选择载体时必须考虑宿主，因为载体必须在其中复制或能够整合到染色体中。载体拷贝数、控制拷贝数的能力以及载体编码的任何其它蛋白质如抗生素标记物的表达也应被考虑。在选择表达控制序列时，各种因素也应被考虑。这些包括如较长的序列、其控制能力以及与编码多肽的核苷酸序列的相容性，特别是在考虑潜在的二级结构时。通过考虑其与所选载体的相容性、通过考虑核苷酸序列编码的产品的毒性、分泌特性和正确折叠多肽的能力、它们的发酵和培养要求和核苷酸序列编码产品纯化的难易来选择宿主。
重组载体可以是自动复制的载体，即载体作为染色体外实体存在，其复制独立于染色体复制，例如质粒。另外，引入宿主细胞时，载体可整合到宿主细胞基因组中并且与其整合的染色体一起复制。
载体优选是表达载体，其中编码本发明多肽的核苷酸序列可与核苷酸序列转录所需的另外的片断可操作地连接。载体通常由质粒或病毒DNA衍生。用于在本文所述宿主细胞中表达的各种合适的表达载体是可商购的或在文献描述的。可用于真核宿主的表达载体包括如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。具体的载体如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，LaJola，CA，USA)。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒包括pB322，pET3a和pET12a(都来自Novagen Inc.，WI，USA)，较宽宿主范围的质粒，如RP4，噬菌体DNA，例如噬菌体λ的各种衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物，POT1载体(US4,931,373)，pJSO37载体(描述于Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用于昆虫细胞的表达载体包括pVL941，pBG311(Cate等人，“Isolation of Bovine and Human Genes forMullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In AnimalCells”，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都来自Invitrogen)。
本发明中使用的其它载体包括允许编码多肽变体的核苷酸序列扩增多个拷贝的那些载体。这种可扩增的载体是本领域公知的。例如，它们包括能够通过DHFR扩增的载体(例如参见Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufman and Sharp，“Construction Of A Modular Dihydrofolate ReductasecDNA Gene：Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression”，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和可通过谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增的载体(例如参见US 5,122,464和EP338,841)。
重组载体可进一步包含能够使所述载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。此序列的一个例子(宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起始点。当宿主细胞是酵母细胞时，能够使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP1-3和复制起始点。
载体也可含有能选择的标记，如基因，其产物补充宿主细胞的缺损，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(R.Russell，Gene 40，1985，pp.125-130)，或者赋予对药物如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。对于丝状真菌来说，能选择的标记包括 amds、pyrG、arcB、 niaD、 sC。
术语“控制序列”在本文中包括对本发明多肽表达必需的或有利的所有成分。每个控制序列对编码多肽的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子。
本发明可以使用各种各样的表达控制序列。这些可使用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相连的表达控制序列以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的任何序列及其各种组合。
哺乳动物细胞中与转录相关的合适控制序列的实例包括SV40和腺病毒的早期或晚期启动子，如腺病毒2的主要晚期启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子、人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、人延伸因子1α(EF-1α)启动子、果蝇最小热休克蛋白70启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人遍在蛋白C(UbC)启动子、人生长激素终止子、SV40或腺病毒Elb区聚腺苷酸化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)：947-50)。
为了改善在哺乳动物细胞中的表达，可以将合成的内含子插入编码所述多肽的核苷酸序列的5’未翻译区。合成内含子的实例是来自质粒pCI-Neo的合成内含子(购自Promega Corporation，WI，USA)。
昆虫细胞中指导转录的合适控制序列的实例包括多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动子、杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟早期基因启动子和SV40聚腺苷酸化序列。
在酵母宿主细胞中使用的合适控制序列的实例包括酵母α交配系统的启动子、酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子、来自酵母糖酵解基因或乙醇脱氢酶基因的启动子、ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。
在丝状真菌宿主细胞中使用的合适控制序列的实例包括ADH3启动子和终止子、由编码米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶、黑曲霉α淀粉酶、黑曲霉或构巢曲霉(A.Nidulans)葡糖淀粉酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的启动子、TPI1终止子和ADH3终止子。
在细菌宿主细胞中使用的合适控制序列的实例包括lac系统、trp系统、TAC或TRC系统的启动子和噬菌体λ的主要启动子区域。
编码干扰素β多肽的本发明核苷酸序列(通过定点诱变、合成或其它方法制备)可以包括也可以不包括编码信号肽的核苷酸序列。多肽从表达该多肽的细胞中分泌时，存在信号肽。如果存在，此信号肽应当由选来用于表达多肽的细胞识别。信号肽可以与多肽同源(如，通常与人干扰素β相连)或异源(即，来自于除人干扰素β之外的另一来源)或者可以与宿主细胞同源或异源，即是由宿主细胞正常表达的信号肽或是由宿主细胞非正常表达的。因此，信号肽可以是原核的如由细菌如大肠杆菌衍生的，或真核的，如由哺乳动物或昆虫或酵母细胞衍生的。
信号肽的存在或不存在如取决于用于多肽生产的表达宿主细胞、被表达的蛋白质(是细胞内的还是细胞外的蛋白质)和是不是需要分泌。为了在丝状真菌中使用，信号肽可以由编码曲霉属菌株的淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便衍生。信号肽优选由编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因衍生。为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以由昆虫基因方便地衍生(参见WO90/05783)，如鳞翅目Manduca sexta脂动激素前体(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蜕皮甾类UDP葡糖基转移酶(glucosyltransferase)(egt)(Murphy等人，ProteinExpression and Purification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods inEnzymology 284，pp.262-272，1997)。
哺乳动物细胞中使用的优选信号肽是下文实施例所示人干扰素β的或鼠Igk轻链信号肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 152：89-104)。为了在酵母细胞中使用，发现合适的信号肽是酿酒酵母α-因子信号肽(参见US4870008)、鼠唾液淀粉酶信号肽(参见O.Hagenbuchle等人，Nature 289，1981，pp.643-646)、改性的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)。
可以使用任何合适的宿主产生干扰素β多肽，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、假单孢菌属或链霉菌属或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌菌株。载体可引入细菌宿主细胞，例如可通过原生质体转化(参见如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见如Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或偶联(参见如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)来进行。
合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌株，如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉，镰刀菌属或木霉菌属。真菌细胞可以转化，转化过程涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁通过本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适方法。在Malardier等人1989，Gene 78：147-156和WO96/00787中描述了转化镰刀菌属的合适方法。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in EnzymologyVolume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等人1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1920中所述的方法来转化。
合适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌株，如酿酒酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属，如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica、汉逊酵母属，如多形汉逊酵母或Yarrowia。下列文献中公开了用异源DNA转化酵母细胞并由此产生异源多肽的方法：Clontech Laboratories，Inc，PaloAlto，CA，USA(在YeastmakerTM Yeast Tranformation System Kit的生产方法中)和Reeves等人，FEMS Microbiology Letters 99(1992)193-198，Manivasakamand Schiestl，Nucleic Acids Research，1993，Vol.21，No.18，pp.4414-4415和Ganeva等人，FEMS Microbiology Letters 121(1994)159-164。
合适昆虫宿主细胞的实例包括鳞翅目细胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾细胞(High Five)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法转化昆虫细胞并在其中产生异源多肽。
合适哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、绿猴细胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(如，NS/O)、仓鼠幼鼠肾脏(BHK)细胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人细胞(如，HEK293(ATCCCRL-1573))，以及组织培养中的植物细胞。另外合适的细胞系在本领域中是已知的并可购自公开的保藏中心如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳动物细胞(如CHO细胞)可按US5047335所述方法进行改性来表达唾液酸转移酶，如，1，6-唾液酸转移酶，以便使干扰素β多肽的糖基化改进。
将外源性DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000的转染方法和Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，USA所述的使用FuGENE6的转染方法。这些方法在本领域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New york，USA中所述的。按建立的方法进行哺乳动物细胞的培养，例如在Animal CellBiotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins编，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques ofCell Culture，Cambridge University Press 1997中的公开的。
在本发明生产方法中，细胞用本领域已知的方法在适于生产多肽的营养培养基中培养。例如，细胞可以在实验室中通过振摇烧瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、成批、补料分批或固体状态发酵)或在合适培养基和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行工业发酵来发酵。培养在含有碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法来进行。合适的培养基可商购或可以按公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中所述的)。如果多肽分泌在营养培养基中，多肽可从培养基中直接回收。如果多肽不被分泌，可从细胞裂解物中回收。
可通过本领域已知的方法来回收所得多肽。例如，可通过常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基中回收多肽。
可通过本领域已知的各种方法包括但不限于层析(如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(如，制备性等电聚焦)、溶解度差异(如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，如Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)来纯化多肽。在下列文献中公开了纯化具有干扰素β活性的多肽的具体方法：US4289689、US4359389、US4172071、US4551271、US5244655、US4485017、US4257938和US4541952。一种具体的纯化方法基于免疫亲和纯化(参见，如Okamura等人，“Human Fibroblastoid Interferon：Immunosorbent ColumnChromatography and N-Terminal Amino Acid Sequence”，Biochem.，19，pp.3831-35(1980))。而且，纯化可基于IFNAR 1和/或IFNAR 2，特别是IFNAR2的使用。
干扰素β多肽的生物活性可通过本领域已知的任何合适的方法来测定。如EP41313B1所述，这些测定方法包括抗病毒活性的抗体中和作用、蛋白激酶的诱导作用、寡腺苷酸2，5-A合成酶或磷酸二酯酶活性。这些方法也包括免疫调节测定方法(如参见US4753795)、生长抑制测定方法和对表达干扰素受体的细胞的结合的测量方法。在下文材料和方法节中描述了本发明多肽或偶联物生物活性的具体测定方法。
本发明的细胞培养
另一方面，本发明还涉及细胞培养，包括a)用核苷酸序列转化的宿主细胞，该核苷酸序列编码具有干扰素β活性的多肽，和b)含有由所述核苷酸序列表达的所述多肽的培养基，该培养基中所述多肽的浓度为至少800000IU/ml培养基，优选800000-3500000IU/ml培养基。尽管显示干扰素α活性的多肽可以是野生型干扰素β，如人干扰素β或其变体(如干扰素β1a或1b)，但多肽优选如本文所述的干扰素β多肽。
再一方面，本发明涉及产生本文所述干扰素β多肽的方法，该方法包括：
(a)在培养基中培养能表达干扰素β多肽变体的细胞，使培养基中干扰素β多肽变体的浓度至少800000IU/ml培养基，特别是800000-3500000IU/ml培养基；和
(b)回收干扰素β多肽。
本发明的其它方法
再一方面，本发明涉及一种减小干扰素β多肽的免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期的方法，该方法包括将构成第一非多肽部分的连接基团的氨基酸残基引入暴露于不含此基团的蛋白质表面的位点和/或去除构成第一非多肽部分的连接基团的氨基酸残基并将所得修饰的多肽与第一非多肽部分偶联。
优选地，引入和/或去除的氨基酸残基是本申请所定义的。非多肽部分通常选自聚合物分子、糖部分、亲脂性基团和有机衍生剂。
再一方面，本发明涉及一种制备本发明偶联物的方法，其中将干扰素β多肽在可发生偶联的条件下与其将要偶联的非多肽部分反应，并回收偶联物。
本发明偶联物的药物组合物和使用
以一定剂量给予本发明的干扰素β多肽或偶联物，所述剂量大约与用人干扰素β如Avonex、Rebif和Betaseron治疗所采用的剂量平行或更高。给药的准确剂量取决于具体情况。一般来说，剂量应当能够防止或减小被治疗疾病或症状的严重性或扩散。对本领域技术人员显而易见的是本发明多肽、偶联物或组合物的有效量取决于疾病、剂量、给药时间表、多肽或偶联物或组合物是单独给药还是与其它治疗剂联合给药、组合物的血清半衰期和患者的总体健康状况。
本发明的多肽或偶联物可以以原形使用和/或以其盐的形式使用。合适的盐包括但不限于与碱金属或碱土金属如钠、钾、锂、钙和镁形成的盐，以及如锌盐。这些盐或复合物可作为晶体和/或无定形结构存在。
本发明的多肽或偶联物优选以组合物形式给药，其中包括可药用载体或赋形剂。“可药用”意指在给药的患者中不引起任何不利作用的载体或赋形剂。这些可药用载体和赋形剂在本领域中是公知的。
本发明的多肽或偶联物可通过公知方法配制成药物组合物。在US5183746、Remington’s Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin，18thedition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company[1990])、PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins(S.Frokjaer and L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis[2000])和Handbook of Pharmaceutical excipients，3rdedition(A.Kibble，Ed.，Pharmaceutical Press[2000])描述了合适的制剂。
本发明多肽或偶联物的药物组合物可以配制成各种剂型，包括液体制剂、凝胶制剂、冻干制剂、肺分散制剂，或任何其它适宜的剂型，例如压制的固体制剂。优选的剂型将依赖于所治疗的特定适应症并且是本领域任一技术人员显而易见的。
含本发明多肽或偶联物的药物组合物可以通过口服、静脉内、小脑内、肌肉内、腹膜内、真皮内、皮下、鼻内、肺内、通过吸入或以任何其它适宜的方式，例如用PowderJect或ProLease技术给予。优选的给药方式将依赖于所治疗的特定适应症并且将是本领域任一技术人员显而易见的。
非胃肠道给药剂(Parentals)
药物组合物的实例是设计成非肠道给药的溶液剂。尽管在很多情况下，药物溶液剂可以以适用于立即使用的液体制剂形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。
在非胃肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，如通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合来制备，赋形剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围中。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)盐缓冲剂(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸(paraben)甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物、苯亚甲基鎓卤化物(如苯亚甲基鎓氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以其它组分的相对量计算。
稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。
可以存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽来避免搅拌诱导的聚集，其也允许配方剂暴露于剪切表面压力而没有引起多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温20、吐温80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)和共溶剂。活性组分也可以被包裹在制备的微囊中，例如通过coascervation技术或通过界面聚合制备的，例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在胶体状药物释放体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包裹在大乳剂中。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(同上)中公开了这些技术。
体内给药所使用的非胃肠道制剂必须是灭菌的。该过程容易完成，例如，通过无菌滤膜来过滤。
持续释放制剂
持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物半渗透材料、具有合适形式如膜或微囊的材料。持续释放材料的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技术或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如长达或超过100天，某些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。包囊中的多肽长时间保留在体内时，它们因在37℃潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致丧失生物活性并且可能改变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基、冻干酸性溶液、控制含湿量、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物型组合物来达到稳定。
肺释放
适于与雾化剂(喷射或超声雾化剂)一起使用的偶联物制剂通常包含以每ml溶液大约0.01-25mg偶联物，优选大约0.1-10mg/ml的浓度溶于水中的偶联物。所述制剂也可以包含缓冲剂和简单的糖(例如用于稳定蛋白质和调节渗透压)，和/或0.1-10mg/ml浓度范围的人血清白蛋白。可使用的缓冲剂的实例为醋酸钠、枸橼酸钠和甘氨酸。优选地，所述缓冲剂将将含有适用于调节溶液的pH在3-9范围的组成和克分子浓度。通常，1mM-50mM的缓冲剂克分子浓度适用于该目的。可使用的糖的实例为乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖和木糖，通常用量为所述制剂重量的1％-10％范围。
所述雾化制剂也可以包含表面活性剂用于减少或防止在形成气雾剂时溶液雾化引起的蛋白质的表面诱导性聚集。可使用各种常规的表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。用量通常在所述配方剂重量的0.001-4％范围。本发明特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯。
产生适宜的本发明液体微粒分散体的特定制剂和方法描述于WO9420069、US 5915378、US 5960792、US5957124、US 5934272、US 5915378、US 5855564、US 5826570和US 5522385，所有文献引入本文供参考。
适用于本发明微粒的市售雾化器的三个实例为由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Mo.生产的Ultravent雾化器，由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生产的Acorn II雾化器和由Aradigm Corporation，Hayward，California生产的AERx肺药物释放系统。
用于与可计量剂量的吸入装置一起使用的偶联物制剂通常包括细粉。该粉剂可通过冻干，然后研磨液体偶联物制剂制备并且也可以包含稳定剂如人血清白蛋白(HAS)。典型地，加入超过0.5％(w/w)的HAS。因此，如果需要，可将一种或多种糖或糖醇加到所述制剂中。其实例包括乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、山梨糖、海藻糖、木糖醇和木糖，制剂中所加入的量可在本发明偶联物的大约0.01％-200％(w/w)范围，优选大约为1-50％。然后，将所述制剂冻干并研磨至所需粒度。
然后，将适宜大小的微粒在表面活性剂的辅助下悬浮在推进剂中。所述推进剂可以是适用于本发明目的的任何常规物质，如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。适宜的表面活性剂包括三油酸山梨糖醇酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。然后，将混合物装入释放装置中。适用于本发明的市售可计量剂量的吸入器的实例为由Glaxo Inc.，ResearchTriangle Park，N.C.生产的Ventolin可计量剂量吸入器。
所述与粉末吸入器一起使用的偶联物制剂将包括含有偶联物的极细干粉末并且也可以包含膨胀剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其促进粉末从装置中分散的量，例如为所述制剂重量的50％-90％。所述粉末微粒在肺中应该具有与直径中度值小于10微米，优选在0.5-5微米之间，最优选在1.5-3.5微米之间，密度大约为1g/cm2的微粒相当的气动性。
适用于本说明书的粉末吸入器的实例为Fisons Corp.，Bedford，Mass.生产的旋转吸入型(Spinhaler)粉末吸入器。
适用于这些装置的粉剂可通过文献中所公开的方法制备和/或释放，所述文献包括US 5997848、US 5993783、US5985248、US 5976574、US5922354、US 5785049和US 55654007。
包含本发明偶联物的药物组合物可以通许多设计用于治疗剂的肺释放的机械装置给予，所述装置包括但不限制于雾化器、可计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。
一些适用于本发明的市售装置的特定实例为由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生产的Ultravent雾化器，由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生产的Acorn II雾化器，由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，North Carolina生产的Ventolin可计量剂量吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造的旋转吸入型粉末吸入器；“持续雾化”装置，Inhale Therapeutic System，Inc.，San Carlos，California；由Alkermes，Cambridge，Massachusetts制造的AIR吸入器；和由Aradigm Corporation，Hayward，California制造的AERx肺部药物释放系统。
本发明的药物组合物可以与其它治疗剂联合给药。这些治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分混合在一起或可以与本发明的多肽或偶联物分别给药，同时或按任何其它可接受的治疗方案。另外，本发明的多肽、偶联物或药物组合物可用作其它治疗剂的佐剂。
因此，本发明提供治疗下列疾病中大多数类型的组合物和方法：病毒感染、癌症或肿瘤(如，乳腺癌、非小细胞肺癌)或血管生成性肿瘤、Chrohn’s疾病、溃疡性结肠炎、Guillain-Barre综合征、神经胶质瘤、原发肺纤维变性、异常细胞生长，或者提供用于任何合适动物，优选哺乳动物特别是人免疫调节的组合物和方法。具体来说，本发明的多肽、偶联物或组合物可用于治疗多发性硬化症(MS)，如通常识别的四种类型MS中的任何一种(良性的、复发缓解MS(RRMS)、原发进行性MS(PPMS)和继发进行性MS(SPMS))和单一症状型MS)、肝炎或疱疹感染(后者的治疗可以与IL-10治疗联合进行)。
另一方面，本发明涉及一种治疗具有抗干扰素β1a，如AvonexTM或Rebif或1b，如Betaseron循环抗体的哺乳动物的方法，该方法包括给予具有干扰素β生物活性并且减小与所述抗体的反应或不反应的化合物。所述化合物以有效量给予。化合物优选本文所述的偶联物并且哺乳动物优选是人。被治疗的哺乳动物可以遭受上文所列的可用干扰素β治疗的任何疾病。具体来说，本发明这方面感兴趣的是治疗多发性硬化(上文所列的任何类型)或癌症。而且，本发明涉及一种制备药物产品的方法，所述产品可用于治疗具有抗干扰素β1a，如AvonexTM或Rebif或1b，如Betaseron循环抗体的哺乳动物，其中将具有干扰素β生物活性并且不与所述抗体反应的化合物配制成可注射制剂或其它合适的制剂。术语“循环抗体”打算表示哺乳动物对任何商购干扰素β制剂(Rebif、Betaseron、Avonex)处理产生应答时形成的抗体，特别是中和抗体。
再一方面，本发明涉及一种对需要用至少具有干扰素β的部分疗效的药物组合物治疗的患者进行治疗的方法，该方法包括给予含有至少具有干扰素β的部分治疗活性的化合物的组合物，所述治疗与用干扰素β进行的治疗相比减小或去除了心理学副作用，其中所述化合物是具有干扰素β活性的多肽非多肽部分的非天然偶联物，特别是本发明的偶联物。
再一方面，本发明涉及一种用于对需要用至少具有干扰素β的部分疗效的化合物治疗的患者进行治疗的药物组合物，所述组合物含有干扰素β和非多肽部分的非天然产生的偶联物，所述治疗与用干扰素β进行的治疗相比还产生更少的心理学副作用。偶联物优选本发明的偶联物。
也关注编码本发明多肽的核苷酸序列在基因治疗中的应用。特别感兴趣的是按上文“经修饰用于掺入另外的糖基化位点的本发明糖基化多肽”章节中所述方法使用编码多肽的核苷酸序列。因此，在基因治疗过程中即核苷酸序列在人体内表达后完成多肽的糖基化。
关注的基因治疗包括治疗那些需要多肽因其抗病毒活性而提供疗效的疾病，例如，病毒疾病，包括肝炎如丙型肝炎，特别是HPV，或者其它对干扰素β产生反应的感染性疾病或对干扰素β敏感的感染因子。而且，本发明的偶联物或多肽可用于治疗慢性炎性脱髓鞘多神经根神经疾病和严重的坏死性皮肤损伤。也关注与任何MS型的治疗有关的基因治疗。类似地，本发明涉及免疫调节的基因治疗以及治疗那些需要干扰素β因其抗增殖活性而产生疗效的疾病，例如，肿瘤和癌症或其它以不必要细胞增殖为特征的疾病，如再狭窄。在WO95/25170中对这些基因治疗进行了进一步的描述。
使用基因治疗局部释放干扰素β可给靶区域提供治疗剂同时避免与非特异性给药相关的潜在毒性问题。
关注体外和体内基因治疗方法学。
将潜在的治疗基因转移到特定细胞群中的一些方法是已知的。可进一步参见如，Mulligan，“The Basic Science Of Gene Therapy”，Science，260，pp.926-31(1993)。这些方法包括：
直接的基因转移，如Wolff等人在“Direct Gene Transfer Into MouseMuscle In vivo”，Science 247，pp.1465-68(1990)中公开的；
脂质体介导的DNA转移，如，Caplen等人在“Liposome-mediated CFTRGene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”NatureMed.，3，pp.39-46(1995)中；Crystal在“The Gene As A Drug”，Nature Med.，1，pp.15-17(1995)中和Gao and Huang在“A Novel Cationic Liposome ReagentFor Efficient Transfection of Mammalian Cells”，Biochem.Biophys Res.Comm.，179，pp.280-85(1991)中公开的；
逆转录病毒介导的DNA转移，如，Kay等人在“In vivo Gene Therapy ofHemophilia B：Sustained Partial Corretion In Factor IX-Deficient Dogs”，Science，262，pp.117-19(1993)中，Anderson在“Human Gene Therapy”，Science，256，pp.808-13(1992)中公开的；
DNA病毒介导的DNA转移。这些DNA病毒包括腺病毒(优选基于Ad-2或Ad-5的载体)、疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)和微小病毒(优选基于“缺损”或非自主微小病毒的载体，更优选基于腺伴随病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。如参见，Ali等人“The Use Of DNA Viruses asVectors for Gene Therapy”，Gene Therapy，l，pp.367-84(1994)；US4797368和US5139941。
在下列实施例中进一步描述本发明。这些实施例应当理解为不以任何方式限定本说明书和权利要求的范围。
材料和方法
材料
HeLa细胞-(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC))
ISRE-Luc(Stratagene，La Jolla USA)
pCDNA 3.1/hygro(Invitrogen，Carlsbad USA)
pGL3基本载体(Promega)
人基因组DNA(Clone Tech，USA)
DMEM培养基：杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基(DMEM)，10％胎牛血清(购自Life Technologies A/S，Copenhagen，Denmark)
测定
干扰素测定概述
已经公开了干扰素β与HeLa细胞上的干扰素I型受体相互作用并激活后者。结果在含有干扰素刺激的应答元件(ISRE)的启动子处转录被激活。因此，通过使用放置在HeLa细胞中的ISRE偶联的萤光素酶报告基因(ISRE-luc)可以筛选干扰素受体的激动剂。
一级测定
HeLa细胞用ISRE-luc和pCDNA 3.1/hygro共同转染并通过在含有潮霉素B的DMEM培养基中选择来产生转化灶(细胞克隆)。在干扰素β存在或不存在下筛选细胞克隆的萤光素酶活性。对刺激型比非刺激型萤光素酶活性显示最高刺激比例的那些克隆用于进一步测定。
为了筛选突变蛋白，将15000细胞/孔接种在96孔培养板中并在DMEM培养基中保温培养过夜。第二天，将突变蛋白以及已知的标准物以各种浓度加到细胞中。该板在37℃、5％CO2空气环境下培养6小时。然后，将LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen The Netherlands)加到各孔中。将板密封并在TopCount发光光度计(Packard)上以SPC(单光子计数)方式测量发光。每个板都包含用干扰素β作为刺激对照培养的孔和其它作为非刺激对照的含有正常培养基的孔。刺激和非刺激萤光素酶活性的比作为突变蛋白活性和实验与实验之间误差的内标。
二级测定
目前，有18个非等位干扰素α基因和一个干扰素β基因。这些蛋白质显示重叠活性并因此对确保突变蛋白保留干扰素β的选择性和特异性是关键的。
β-R1基因通过干扰素β来激活而不是其它干扰素。因此β-R1的转录可作为干扰素β激活的第二个标志并用于证实突变蛋白保留干扰素β的活性。通过PCR从人基因组DNA中分离能驱动干扰素敏感转录的β-R1的300bp启动子片断(Rani.M.R.等人(1996)JBC271 22878-22884)并插入pGL3基本载体(Promega)中。在类似于上述一级测定的测定方法中使用所得β-R1：萤光素酶基因。已经描述所得β-R1：萤光素酶基因在星形细胞瘤细胞中显示对干扰素β的敏感性比对干扰素α高250倍(Rani.等人，在所引的书中)。
ELISA测定
IFN-β的浓度通过使用商购夹心免疫测定方法(PBL BiomedicalLaboratories，New Brunswick，NJ，USA)来定量。该试剂盒基于带有单克隆鼠抗IFN-β抗体的ELISA，所述抗体用于捕获和检测试验样品中的IFN-β。检测抗体与生物素偶联。
将浓度为10-0.25ng/ml的试验样品和重组人IFN-β标准物以0.1mL的量加到微滴定板中，所述板预先用捕获抗体包被。板在室温下培养1小时。在试剂盒稀释缓冲液中稀释样品和标准物。所述板在试剂盒缓冲液中洗涤并用0.1ml生物素化检测抗体在室温下培养1小时。再洗涤一次后，加入0.1ml的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶偶联物并在室温下培养1小时。
通过加入0.1ml四甲基联苯胺(TMB)底物色原使反应显色。将板室温避光培养15分钟并通过加入终止溶液终止反应。使用ELISA读数器在450nm处读出吸收度。
受体结合测定
本发明多肽或偶联物的受体结合能力使用题目为“Analysis Of IFN-β(Phe101)For Receptor Bindimg”(它基于Daudi或A549细胞)的WO95/25170中描述的测定方法来确定。基本上按Arduini等人，Protein Science，1999，vol.8，1867-1877所述方法或按本文实施例9所述方法可获得IFNAR1和IFNAR2的可溶性结构域。
另外，使用交联剂如购自Pierce，Rockford，IL，USA的二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)如下测定受体结合能力：
按制造商的说明在DSS存在或不存在下用可溶性IFNAR-2受体培养多肽或偶联物。通过SDS-PAGE分离样品并使用抗干扰素β或抗IFNAR2抗体进行蛋白质印迹。通过DSS存在下受体和干扰素β分子大小的增加表明功能性干扰素β多肽/偶联物：受体相互作用的存在。
而且，使用本发明的多肽或偶联物和两种受体亚单位(IFNAR-1和IFNAR-2)的交联测定方法可证实干扰素受体1的结合能力。这方面，已知仅仅在干扰素β：IFNAR-2复合物形成之后IFNAR-1才进行结合(Mogensen等人，Journal of Interferon and Cytokine Research，19：1069-1098，1999)。
干扰素β偶联物体外免疫原性试验
本发明偶联物或多肽免疫原性的减小通过使用ELISA方法来测定，该方法是测量偶联物或多肽相对于参考分子或制剂的免疫原性。参考分子或制剂通常是重组人干扰素β制剂如Avonex、Rebif或Bestaseron，或通过等同于制备这些产品的方法制备的另一重组人干扰素β制剂。ELISA方法基于来自用这些重组干扰素β制剂之一处理的病人的抗体。本发明偶联物或多肽在测定中比参考分子或制剂具有统计学显著性低应答时，认为免疫原性被减小。
测定免疫原性的另一方法是用类似Ross等人，J.Clin Invest.95，1974-78，1995所述的方法通过使用来自用干扰素β(即，任何商购干扰素β产品)处理的病人的血清来进行。在抗病毒中和作用生物测定中，减小的免疫原性导致与野生型IFN-β参考分子相比病人血清对本发明偶联物的抑制作用减小。而且，预计在生化IFN结合测定中，低免疫原性偶联物与病人IgG的结合程度比参考IFN-β分子更低。
在中和测定中，参考和偶联物分子以在抗病毒中和生物测定中产生大约80％病毒保护作用的浓度加入。IFN-β蛋白质以各种稀释度(以1∶20开始)与病人血清混合。
抗病毒活性
使用A549细胞(CCL185，American tissue culture collection)和脑心肌炎(EMC)病毒(VR-129B，American tissue culture collection)来进行抗病毒生物测定。
细胞以10000细胞/孔的浓度接种在96孔组织培养板中并在37℃、5％CO2空气环境中培养。在总量为100μl的含有胎牛血清和抗生素的DMEM培养基中以100-0.0001IU/mL浓度加入本发明多肽或偶联物。
24小时后，除去培养基并在各孔中加入0.1mL含有EMC病毒的新鲜培养基。以一定浓度加入EMC病毒，该浓度在不含IFN-β的细胞培养物中24小时后引起100％细胞死亡。
再过24小时后，使用WST-1测定方法测量多肽或偶联物的抗病毒效果。将0.01mL WST-1(WST-1细胞增殖剂，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)加到0.1mL培养物中并在37℃、5％CO2空气气氛中培养1/2-2小时。通过活细胞中的线粒体脱氢酶裂解WST-1四唑盐导致甲(formazan)形成，甲可通过测量450nm处的吸收度来定量。
干扰素刺激型应答元件(ISRE)测定中的中和活性
使用ISRE萤光素酶活性测定方法来分析抗干扰素β血清的干扰素β中和作用。
使用来自干扰素β处理病人或免疫动物的血清。血清以固定浓度(1∶20-1∶500稀释的(病人血清)或20-600ng/mL(动物血清))或者以1/20(病人血清)或600ng/mL(动物血清)开始5倍系列稀释的血清加入。在总体积为80μl DMEM培养基+10％FCS中，干扰素β以25.000IU/mL为起始浓度经5倍稀释或以固定浓度(0.1-10 IU/mL)加入。血清在37℃温度下与IFN-β一起培养1小时。
然后，将样品转移到含有HeLa细胞的96孔组织培养板中，所述细胞已用ISRE-Luc转染并在此之前于DMEM培养基上生长24小时(15000细胞/孔)。培养物在37℃、5％CO2中培养6小时。随后在各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen，The Netherlands)。将板密封并在TopCount发光光度计上以SPC(单光子计数)模式测量发光。
在固定量血清存在下滴定干扰素β时，中和作用按抑制倍数(FI)来定义，抑制倍数用EC50(w.血清)/EC50(w/o血清)来定量。如下确定干扰素β变体蛋白质的抗体中和作用的减小：
(1-FI变体/FI野生型)×100％
PEG-干扰素β偶联物的生物学半衰期的测量
按文献中描述的各种方法来测量生物学半衰期。Munafo等人(EuropeanJournal of Neurology 1998，vol 5，No2，pp187-193)描述了一种方法，其中使用ELISA方法检测皮下和肌肉内给予干扰素β后血清中的干扰素β浓度。
静脉给药后干扰素β血清浓度的快速降低对于评价干扰素β治疗的生物学反应是重要的。然而，考虑到本发明的偶联物静脉给药后有延长的血清半衰期，这使得通过如ELISA方法或通过一级筛选测定方法进行测量成为可能。
不同的药物动力学标记物(如，血清neupterin和β2微球蛋白)已经被研究(Clin Drug Invest(1999)18(1)：27-34)。这些同样可以很好地用于评价延长的生物学效应。这些试验也可以在合适的动物种如大鼠中进行。
评价干扰素β生物学作用如抗病毒、抗增殖和免疫调节作用的测定方法(如，在Annals of Neurology 1995 vol 37，No1，p7-15所述的)可以与本文所述的一级和二级筛选测定方法一起用于评价偶联物相对于野生型干扰素β的生物学效力。
最后，动物模型如常用的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型可用于证实本发明偶联物或多肽的效力。在EAE模型中用髓磷脂或髓磷脂衍生的蛋白质进行的免疫接种诱发了一种能模拟人体中多发性硬化症的主要炎症和神经学特征的疾病。EAE已经在小鼠、大鼠、兔和绒猴中使用(Cannella等人，PNAS，95，10100-5，1998，Zaprianova等人，Morfologiia，112，25-8，1997，Hassouna等人，J.Urology，130，806-10，1983，Genain&Hauser J.Mol.Med.75，187-97，1997)。其它模型包括Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)模型(Murray等人，J.Neurosci.18，7306-14，1998)将用于证实干扰素β偶联物的效力。
具有干扰素β活性的标记多肽在微滴定板中的PEG化
该方法包括：
用合适的标记物，如上文概述中例举的任何标记物表达干扰素β多肽。
将培养肉汤转移到能够固定标记多肽的微滴定板的一个或多个孔中，标记物为His-His-His-His-His-His(Casey等人，J.Immunol.Meth.，179，105(1995))时，使用购自QiaGen的Ni-NTA HisSorb微滴定板。
标记的多肽固定到微滴定板上之后，用适于结合和随后PEG化的缓冲剂洗涤各孔。
使用所选的活化PEG培养各孔。作为实例，使用来自ShearwaterPolymers的M-SPA-5000。应当将活化的PEG与多肽的摩尔比调节到最佳，但通常会大于10∶1，更优选大于100∶1。在室温下反应合适时间，通常约1小时后，通过去除活化的PEG溶液终止反应。通过与合适缓冲剂一起保温而从板上洗脱偶联的蛋白。合适的洗脱缓冲液可含有咪唑、过量的NTA或另一个螯合化合物。
合适时，测定偶联蛋白的生物学活性和免疫原性。
可任选使用本领域已知的方法，如使用二氨基肽酶将该标记物解离下来并用GCT(谷氨酰环化转移酶)将1-位的Gln转化为焦谷氨酰基，最后用PGAP(焦-谷氨酰基-氨肽酶)解离下来，产生了天然蛋白质。该方法包括金属螯合亲和层析的几个步骤。或者，标记的多肽可以被偶联。
受体结合型干扰素β多肽的PEG化
为了使干扰素β多肽以一定方式最佳PEG化，并保证参与受体识别的赖氨酸不被PEG化，已经开发了下列方法：
基本上按Arduini等人，Protein Science(1999)，vol 8：1867-1877所述方法或按实施例9的方法获得IFNAR1和IFNAR2的可溶性结构域。
在PBS缓冲液中于pH 7-9下形成由1∶1∶1化学计量的干扰素β多肽、IFNAR1可溶性结构域和IFNAR2可溶性结构域构成的三元复合物。干扰素β多肽的浓度大约为20μg/ml或1μM并且受体以等摩尔浓度存在。
以3个相应于5、20或100摩尔过量于干扰素β多肽的不同浓度加入来自Shearwater Polymers的M-SPA-5000。反应时间是在室温下30分钟。30分钟反应时间过后，将反应混合物的pH调节到pH2.0并将反应混合物上样至Vydac C18柱，基本上按Utsumi等人在J.Biochem.，vol 101，1199-1208(1987)中所述方法使用乙腈梯度液进行洗脱。或者或更优选地，可使用异丙醇梯度液。
使用本文所述的一级筛选测定方法分析馏分并在-80℃、含有1mg/mlHAS的PBS(pH7)中存贮由该方法获得的活化的PEG化的干扰素β多肽。
另外，对于上述方法来说，IFNAR2的可溶性结构域用作形成二元复合物的仅有受体成分。而且，IFNAR2可以在形成二元复合物之前按制造商的说明固定在合适的树脂(如，环氧化合物激活的Sepharose 6B)上。PEG化后，用0.1M Glycin，pH2缓冲液洗脱PEG化的干扰素β并在将pH调节到中性后按所述方法测量活性。
可及表面积(ASA)
使用计算机程序组(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(Copyright 1983 Yale University)计算结构中各个原子的可及表面积(ASA)。该方法通常使用1.4大小的探针并将可及表面积(ASA)定义为探针中心形成的面积。于该计算前，从坐标中去除所有水分子和所有氢原子，以及其它不与该蛋白质直接相连的原子。其它程序可用于计算ASA，如程序WhatIf G.Vriend，J.Mol.Graph.(1990)8，52-56，电购地址：http：//swift. emblheidelberg.de/servers2/(R.Rodriguez等人，CABIOS(1998)14，523-528)，使用Accessibility选项来计算可及分子表面。
侧链的部分(fractional)ASA
侧链原子的部分ASA通过侧链中原子的ASA总和除以延长的ALA-x-ALA三肽中残余类型侧链原子的ASA代表值来计算。参见Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在该例中，CA原子被看作甘氨酸残基侧链的一部分但不是保留的部分。下表表示侧链的100％ASA标准：
Ala    69.232
Arg    200.352
Asn    106.252
Asp    102.062
Cys    96.692
Gln    140.582
Glu    134.612
Gly    32.282
His    147.002
Ile    137.912
Leu    140.762
Lys    162.502
Met    156.082
Phe    163.902
Pro    119.652
Ser    78.162
Thr    101.672
Trp    210.892
Tyr    176.612
Val    114.142
测定表面暴露的氨基酸残基
分辨率为2.2(Karpusas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1997)94：11813-11818)的人干扰素β三维结晶结构可从Protein Data Bank(PDB)(Bernstein等人，J.Mol.Biol.(1977)，112，pp.535)以及从 http：//www.pdb.org/登 记号为1AU1的The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB处获得。该结晶结构含有两个独立的人干扰素β分子，在该实施例中使用A分子。
表面暴露：
使用上文所述WhatIf程序，发现下列残基上侧链原子的表面可及性为0(对Gly来说使用CA原子可及性)：G7、N14、C17、L21、I44、A55、A56、T58、I59、M62、L63、L98、L122、Y125、I129、L133、A142、W143、V146、I150、N153、I157、L160、T161和L164。
部分(fractional)表面暴露
为了进行进一步分析，需要改造(remodel)残基R71、R113、K115、L116、M117的侧链，这是由于立体碰撞的原因。改造用Modeler 98，MSI INC来进行。使用Access计算机程序计算改造后干扰素β分子(仅包括氨基酸残基，排除N-连接的糖部分)的部分ASA，得到下列以侧链的25％以上暴露于表面的残基：S2、N4、L5、F8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、K19、W22、Q23、G26、R27、L28、E29、Y30、L32、K33、R35、M36、N37、D39、E42、K45、Q46、L47、Q48、Q49、Q51、K52、Q64、A68、R71、Q72、D73、S75、S76、G78、N80、E81、T82、E85、N86、A89、Y92、H93、N96、H97、K99、T100、E103、E104、K105、E107、K108、E109、D110、F111、R113、G114、K115、L116、S119、L120、H121、K123、R124、G127、R128、L130、H131、K134、A135、K136、E137、Y138、S139、H140、V148、R152、Y155、N158、G162、Y163、R165和N166，且下列残基的侧链有50％以上暴露于表面：N4、L5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、G26、R27、E29、Y30、K33、R35、N37、D39、E42、Q46、Q48、Q49、Q51、K52、R71、D73、S75、G78、N80、E81、T82、E85、N86、A89、Y92、H93、K99、T100、E103、E104、E107、K108、D110、F111、L116、K123、R124、G127、H131、K134、E137、V148、Y155、R165和N166。
实施例1
设计用于在哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达干扰素β的表达盒
对GenBank登记号M28622(如SEQ ID NO1)，包括编码人干扰素β及其天然信号肽的全长cDNA的DNA序列进行修饰，以便促进在哺乳动物细胞中的高表达。首先，按Kozak共有序列来修饰ATG起始密码子周围区(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20：196(4)：947-50)，导致与ATG起始密码子上游共有序列有完美的匹配性。其次，天然人干扰素β的密码子通过使密码子的应用性向常在高表达型人基因中使用的密码子偏移来修饰。随后，序列中的某些核苷酸用其它核苷酸取代以便引入DNA限制性核酸内切酶的识别位点(这使得后续步骤中更易于修饰DNA序列)。设计引物以便合成基因：
CBProFpr1：
5’GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCGCCACCATGACCAACAAGTGCCTGCTCCAGA
TCGCCCTGCTCCTGT-3’，SEQ ID 3，
CBProFpr2：
5’ACAACCTGCTCGGCTTCCTGCAGAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGAAGCTCCT
GTGGCAGCTGAACGG-3’，SEQ ID 4，
CBProFpr3：
5’GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGA
CGCCGCTCTGACCATC-3’，SEQ ID 5，
CBProFpr4
5’TTCCGCCAGGACTCCAGCTCCACCGGTTGGAACGAGACCATCGTGGAGAACCTG
CTGGCCAACGTGTACC-3’，SEQ ID 6，
CBProFpr5
5’AGGAGAAGCTGGAGAAGGAGGACTTCACCCGCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGC
ACCTGAAGCGCTACTA-3’，SEQ ID 7，
CBProFpr6
5’GGAGTACAGCCACTGCGCCTGGACCATCGTACGCGTGGAGATCCTGCGCAACTT
CTACTTCATCAACCGC-3’，SEQ ID 8，
CBProFpr9
5’CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGTCAGGCGG
TTGATGAAGTAGAAGT-3’，SEQ ID 9，
CBProFpr10
5’AGGCGCAGTGGCTGTACTCCTTGGCCTTCAGGTAGTGCAGGATGCGGCCATAGT
AGCGCTTCAGGTGCAG-3’，SEQ ID 10，
CBProFpr11
5’CTCCTTCTCCAGCTTCTCCTCCAGCACGGTCTTCAGGTGGTTGATCTGGTGGTACA
CGTTGGCCAGCAGG-3’，SEQ ID 11，
CBProFpr12
5’GAGCTGGAGTCCTGGCGGAAGATGGCGAAGATGTTCTGCAGCATCTCGTAGATG
GTCAGAGCGGCGTCCT-3’，SEQ ID 12，
CBProFpr13
5’CCTCGGGGATGTCGAAGTTCATCCTGTCCTTCAGGCAGTACTCCAGGCGCCCGTTCAGCTGCCACAGGAG-3’，SEQ ID 13，
CBProFpr14
5’CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCGATAGGGCCGTGGTGCTGAAGCACAG
GAGCAGGGCGATCTGG-3’，SEQ ID 14，
装配引物以便通过使用铂Pfx-聚合酶试剂盒(Life Technologies)的一步PCR和标准三步PCR循环参数来合成基因。装配的基因使用相同条件经PCR扩增。
按上文所述的相同PCR条件但用下列引物取代引物CBProFpr1-14来合成编码N-末端延伸型人干扰素β的cDNA以便将纯化的TAG结合到干扰素β分子中：
CBProFpr7
5’CTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGTGCTTCAGCACCACGGCCCTATCGATGAAGC
ACCAGCACCAGCATC-3’，SEQ ID 15，
CBProFpr8
5’CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT
GGCTAGCGTTTAAAC-3’，SEQ ID 16，
CBProFpr15
5’CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCTGTTGGTGTTGATGTTGGTGCTGATGC
TGGTGCTGGTGCTTC-3’，SEQ ID 17，
CBProFpr16
5’AGCAGGGCGATCTGGAGCAGGCACTTGTTGGTCATGGTGGCGAAGCTTAAGTTT
AAACGCTAGCCAGCTT-3’，SEQ ID 18，
将合成的基因克隆到pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)中5’末端HindIII位点和3’端BamHI位点之间，得到pCBProF1和pCBProF2。
使用上述标准PCR条件和下列引物扩增来自pCI-Neo(Promega)的合成性内含子：
CBProFpr375’-CCGTCAGATCCTAGGCTAGCTTATTGCGGTAGTTTATCAC-3’，SEQID 19，
CBProFpr385’-GAGCTCGGTACCAAGCTTTTAAGAGCTGTAAT-3’，SEQ ID 20，
得到332bp PCR片断，用Nhel和HindIII切割，并插入质粒pCBProF1和pCBProF2的5’UTR中，得到pCBProF4和pCBProF5。
通过PCR扩增编码区的相关区域以改变各个氨基酸的密码子，使得可将序列中经PCR产生的改变通过传统充隆技术引入到表达质粒中。例如，使用引物：
Lys45arg-5’引物(NarI/KasI)：
5’GCTGAACGGGCGCCTGGAGTACTGCCTGAAGGACAGGATGAACTTCGACATCCC
CGAGGAA ATCCGCCAGCTGCAGC-3’，SEQ ID 21，
Lys45mut-3’引物(BsiWI)：5’TCTCCACGCGTACGATGGTCCAGGCGCAGTGGCTG-3’，
SEQ ID 22，
在横跨pCBProF1中1055到1243位的区域的PCR片断中引入K45R取代。PCR片断和pCBProF1都用NarI和BsiWI切割，它们都具有单一位点。纯化并连接PCR片断和pCBProF1的载体骨架，导致pCBProF1中Lys45密码子AAG用Arg密码子CGC取代。
还可用SOE(序列突出端延伸)PCR引入氨基酸取代。在SOE-PCR中，INFB分子中的N端部分和C端部分都在各自一级PCR中首先扩增。
在这些一级PCR中，合成中心互补引物以便使针对被取代氨基酸的密码子变为所需密码子。末端引物是分别限定INFβ分子中N-和C-端的标准引物。而且，末端引物提供能够随后克隆全长PCR产物的限制酶位点。因此，可用中心(无义)引物和N-末端(有义)引物在其中一种一级PCR中扩增INFβ编码区的N末端部分并且对于C末端部分也一样。一旦扩增后，N-和C-末端部分被装配到二级PCR中的全长产物中并克隆到上述修饰的pCDNA3.1/Hygro中。例如，使用下列引物引入能导致F111N和R113T取代的突变：
CBProF引物9有义)：
CACCACACTGGACTAGT GGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGTCAGGCGGTTG ATG
AAGTAGAAGT  (SEQ ID NO 23)，
CBProF引物231(反义)：
CATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC  (SEQ ID NO 24)，
CBProF引物230(有义)：
GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATG  (SEQ ID NO 25)，
CBProF引物42(反义)：
CACACTGGACTAGT AAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGC  (SEQ ID NO 26)，
而且，引入的突变体与表达质粒中的单一限制性核酸内切酶位点足够邻近时，使用包括单一PCR步骤和随后克隆的构建方法来构建变体基因。例如，使用下列PCR引物和CBProF引物9来引入取代K19R：
CBProFpr58：
GAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAGCTGAACG  (SEQ ID NO 27)，
随后使用限制性核酸内切酶位点BsiWI和BstBI来克隆PCR产物。
实施例2
人干扰素β在杆状病毒/昆虫细胞系统中的表达
为了在杆状病毒/昆虫细胞中表达合成的基因(编码携带在pCBProF1(如实施例1所述)中的人干扰素β)，用NheI和XhoI切割该基因并与转移载体pBlueBac4.5连接，该载体包括在从Invitrogen获得的MaxBac2.0转染试剂盒(San Diego，USA)中。试剂盒中包括的“MaxBac2.0转染和表达手册”描述了用于产生重组杆状病毒和在昆虫细胞中表达的所有方法。
简而言之，pBlueBac 4，5-干扰素βCBProF1与线性化AcMNPV DNA(Bac-N-Blue DNA)一起被转染到SF9细胞中。转染3天后，收获转染上清液并用适当病毒稀释液进行噬菌斑测定。7天后观察蓝色的显著噬菌斑并收集6个噬菌斑用于在6孔板中增殖。5天后，从各孔中收获2ml病毒上清液(P-1储备液)。从P1储备液中取出0.75ml并分离病毒基因组DNA。病毒基因组DNA用正向/反向引物在PCR反应中分析以便能够选择6个P-1储备液中的重组杆状病毒。在人干扰素β特异的ELISA(购自PBL BiomedicalLaboratories)中试验重组P-1储备液的小等份试样以便确证重组人干扰素β出现在上清中。
为了使选择的重组杆状病毒进行进一步增殖，将6×106SF9细胞接种在T-80培养烧瓶中并用200μl的P-1储备液感染。5天后，收获上清液(P-2储备液)并使用2ml P-2储备液感染在500ml Erlenmeyer烧瓶(Corning)中的100ml悬浮培养物(1×106SF9细胞/ml)。5天后，收获上清液(P-3储备液)并通过噬菌斑测定方法确定病毒滴度。
为了产生用于纯化的人干扰素β，从备用的悬浮培养物中收获1×109SF9细胞。在50ml有螺旋盖的试管中，用来自P-3储备液的重组杆状病毒感染SF9细胞15分钟(MOI＝2)。此后，将细胞离心沉降并在无血清培养基(Sf-900II SFM，Gibco BRL)中洗涤一次，转移到含有1L无血清培养基的2800ml Triple Baffle Fernbach Flask(Bellco)中。感染3天后，收获培养基上清液并纯化重组人干扰素β。
干扰素β分子的纯化
将发酵肉汤浓缩和/或在稀释到合适离子强度后将pH调节到大约4.5。合适是指离子强度低至可使干扰素β结合到已在4mM乙酸pH4.5(缓冲液A)中平衡的Mono S阳离子交换柱(Pharmacia)上。上样后，用3倍柱体积的缓冲液A洗涤，使用从缓冲液A到含有1M氯化钠的缓冲液A的线性梯度液洗脱干扰素β。另一种纯化可按纯化干扰素α的方法进行(AnalyticalBiochemistry 247，434-440(1997)，使用TSK-凝胶SP-5PW柱(Toso Haas))。
另外，His标记的干扰素β可使用IMAC(固相化金属亲和层析)按公知方法(如，UniZyme Laboratories，Denmark所述的)来纯化。
另一纯化方法是使用单克隆或多克隆抗体。将干扰素β发酵肉汤的pH调节到7并与0.5M氯化钠一起上样到带有重组人干扰素β的固相化单克隆抗体的柱上。上样前，该柱用如10mM Tris，0.5M NaCl，pH7(缓冲液B)平衡。上样后，该柱用3倍柱体积的缓冲液B洗涤并用合适缓冲液在低pH(如，pH2-3)下洗脱。
另外，如果干扰素β用如c-Myc肽(EQKLI SEEDL)标记，抗c-Myc肽的单克隆抗体可以类似方式使用。按制造商的说明使用CNBr-Sepharose(Pharmacia)将抗体固定在柱上。
如果需要，可将阳离子交换层析、IMAC和/或抗体层析组合来获得用于进一步试验的相关纯度。
上述柱中洗脱馏分的纯度、同一性、量和活性可使用本领域技术人员已知方法的组合来确定。这包括一种或多种下列方法或本领域技术人员已知的其它相关方法：上文所述的一级和二级测定方法、ELISA方法、SDS-PAGE、蛋白质印迹、IEF、HPLC、氨基酸测序、质谱分析和氨基酸分析。
纯化后，修饰的干扰素β多肽可与聚合物分子进行偶联，如按制造商说明与来自Shearwater Polymers的M-SPA-5000偶联。优选地，先封闭纯化的修饰型干扰素β多肽的受体识别位点，然后按本文材料和方法章节中所述的方法进行偶联。
实施例3
人干扰素β在HEK293细胞中的表达
为了在HEK293细胞(ATCC目录号CRL-1573)中表达合成的基因(编码携带在pCBProF1(如实施例1所述)中的人干扰素β)，该基因用两种引物PBR7(5’-CGCGGATCCATATGACCAACAAGTGCCTG-3’)(SEQ ID NO 28)和PBR2(5’-CGCGGATCCTTATCAGTTGCGCAG-3’)(SEQ ID NO 29)来进行PCR扩增并以正确的方向克隆到pcDNA3.1(-)(Invitrogen，USA)的BamHI位点，得到质粒pPR9。
为了转染HEK293细胞系，在T-25培养烧瓶中接种含10％FBS的DMEM培养基(Life Technologies，USA)中的50％铺满的培养物并培养过夜。使用FuGENE 6转染试剂(Roche，USA)，将pPR9转染到细胞中：在95μl无血清DMEM培养基中加入5μl FuGENE 6和1.7μl(2μg)pPR9并在室温下培养20分钟。然后，将转染复合物滴加到细胞上并将培养烧瓶放回培养箱中。第二天，将细胞用胰蛋白酶消化并接种到T-80培养烧瓶中，烧瓶中存在有DMEM培养基并含有10％FBS和500μg/ml遗传霉素(Life Technologies)。
铺满后，通过使用人干扰素β特异的ELISA确认一级转染池中正表达希望的蛋白质并且细胞通过有限稀释进行再克隆。通过这种方式鉴定出表达人干扰素β的高产HEK293克隆。
实施例4
干扰素β在CHO细胞中的高水平表达
稳定表达人干扰素β的细胞系CHO K1[p22]-E4(ATCC#CCL-61)以1∶10从汇合培养物传代并作为贴壁细胞在T-25烧瓶中于含血清培养基(MEMαw/核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(Gibco/BRL Cat#32571)、10％FCS(Gibco/BRLCat#10091)、青霉素和链霉素(Gibco/BRL Cat#15140-114))中繁殖直到汇合。然后，将培养基改变为不含血清的培养基(RenCyte CHO；MediCult Cat.#22600140)再培养24小时，然后加入5mM丁酸钠(Merck Cat#8.17500)。允许细胞表达干扰素β48小时，然后收获培养基。测定重复培养物中干扰素β的浓度为854797IU/ml(最低和最高95％可信区间分别为711134 IU/ml和1032012 IU/ml)。
在另一组试验中，稳定表达人干扰素β的细胞系CHO K1[p22]-E4以1∶10从汇合培养物传代并作为贴壁细胞于含血清培养基(MEMαw/核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(Gibco/BRL Cat#32571)、10％FCS(Gibco/BRLCat#10091)、青霉素和链霉素(Gibco/BRL Cat#15140-114))中繁殖直到汇合在一种10层细胞厂(NUNC#165250)中。然后，将培养基改变为不含血清的培养基：DMEM/F12(Gibco/BRL#11039-021)并加入1∶100 ITS-A(Gibco/BRL#51300-044)和1∶500 EX-CYTE VLE(Serological Proteins Inc.#81-129-1)和1∶100青霉素和链霉素(Gibco/BRL Cat#15140-114)再培养48小时，然后再加入5mM丁酸钠(Merck Cat#8.17500)。允许细胞表达干扰素β48小时，然后收获培养基。测定干扰素β的浓度为824791IU/ml(最低和最高95％可信区间分别为610956 IU/ml和1099722 IU/ml)。
据认为按上文所述任何方法，可以以同样高产量产生本发明的干扰素β多肽。
实施例5
构建和表达具有一个引入的糖基化位点的干扰素β
为了在hINF-β的111位插入一个外加的N-连接的糖基化位点，通过定点PCR诱变来改变编码hINF-β(实施例1中所述的)的合成基因(hinf-β)。使用BIO-X-ACT(Bioline，UK)和质粒PF050[hinf-β/pcDNA3.1(-)Hygro/Intro(pcDNA 3.1(-)Hygro(Invitrogen，USA)的一种衍生物)，其中已将来自pCI-neo(Promega，USA)的嵌合内含子插入该载体MCS中的BamHI和NheI位点之间]作为模板，用下列两个重叠引物对进行两个PCR反应：
                     [CB41(5’-
TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG-3’)(SEQ ID NO 30)/CB55(5’-
CGGCCATAGT
AGCGCTTCAGGTGCAGGGAGCTCATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC-3’)
(SEQ ID NO 31)和CB42(SEQ ID26)/CB86(5’-
GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTAC
TATGGCC G-3’)(SEQ ID NO 32)
导致分别产生446和184碱基对的两种片断。这两种片断用侧翼引物CB41和CB42在第三个PCR中装配。所得基因插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)Hygro/Intron中并通过DNA测序确证具有在hINF-β中导致取代F111N和R113T的正确碱基改变(质粒指定为PF085)。
为了检验[F111N和R113T]hINF-β变体的活性，使用Lipofectamine2000(Life Technologies，USA)作为转染剂将PF085转染到CHOK1细胞系(ATCC#CCL-61)中。24小时后，收获培养基并测定INF-β活性/浓度：
活性：56046IU/ml[一级测定]
ELISA：80ng/ml
比活性：7×108IU/mg
可见，[F111N和R113T]hINF-β变体具有非常高的比活性，约为野生型hINF-β比活性的两倍。
实施例6
构建和表达具有另一个引入的糖基化位点的干扰素β[Q49N+Q51T]
类似于实施例5，通过取代Q49N和Q51T将一个外加的N-连接的糖基化位点引入49位中。使用PF043(hinf-β/pcDNA3.1(Invitrogen，USA))作为模板，用下列两个重叠引物对进行两个PCR反应：
              [PBR7(SEQ ID NO 28)/PBR78(5’-
GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTCTGCAGCTG-3’)(SEQ ID NO 33)和PBR8(5’-
ATATATCCCAAGCTTTTATCAGITGCGCAGGTAGCCGGT-3’)(SEQ ID NO 34)/PBR77
(5’-CAGCAGCTGCAGAACTTCACCAAGGAGGACGCC-3’)(SEQ ID NO 35)
导致分别产生228和369bp的两种片断。这两种片断用侧翼引物PBR7和PBR8在第三个PCR中装配。所得基因插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)Hygro/Intron中并通过DNA测序确证具有导致[Q49N，Q51T]hINF-β的正确碱基改变(质粒指定为PF104)。
为了检验[Q49N+Q51T]hINF-β变体的活性，使用Lipofectamine2000(LifeTechnologies，USA)作为转染剂将PF104转染到CHO K1细胞系中。24小时后，收获培养基并测定INF-β活性/浓度：
活性：17639 IU/ml[一级测定]
ELISA：10ng/ml
比活性：1.7×109IU/mg
可见，[Q49N+Q51T]hINF-β变体具有非常高的比活性。这可能是由于ELISA中使用的单克隆抗体之一难以进行识别。
实施例7
构建和表达具有两个引入的糖基化位点的干扰素β
通过取代Q49N、Q51T、F111N和R113T，将实施例5和6描述的外加糖基化位点引入人干扰素β中。
使用PF085(实施例5所述的)作为模板，用下列两个重叠引物对进行两个PCR反应：[PBR89(5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)(SEQ ID NO 36)/PBR78(SEQ ID NO 33)和PBR8(SEQ ID NO 34)/PBR77(SEQ ID NO 35)，导致分别产生228和369bp的两种片断。
这两种片断用侧翼引物PBR89和PBR8在第三个PCR中装配。所得基因插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-)Hygro/Intron中并通过测序确证具有导致[Q49N，Q51T，F11N，R113T]hINF-β的正确碱基改变(质粒指定为PF123)。
使用Fugenge 6(Roche)作为转染剂将PF123转染到CHO K1细胞中。24小时后，收获培养基并测定INF-β活性/浓度：
活性：29401IU/ml[一级测定]
ELISA：14ng/ml
比活性：2.1×109IU/ml
可见，[Q49N+Q51T+F111N+R113T]hINF-β变体也具有高比活性。
使用DSS，在材料和方法章节中描述的受体结合测定中发现该变体具有受体结合活性。
实施例8
在滚瓶中产生[Q49N+Q51T+F111N+R113T]干扰素β糖基化变体
将产生[Q49N+Q51T+F111N+R113T]糖基化变体的CHOK1亚克隆(5/G-10)接种在2个滚瓶(Corning，USA)中，每个滚瓶具有1700cm2的扩展表面和200ml DMEM/F-12培养基(Life Technologies；Cat.#31330)，培养基中补充有10％FBS和青霉素/链霉素(P/S)。2天后，更换培养基。再过2天后，两个滚瓶近100％汇合，将培养基更换为300ml不含血清的补充有1/500 EX-CYTE(Serologicals Proteins；Cat.#81129N)和P/S的UltraCHO培养基(Bio Whittaker；Cat.#12-724)。在该培养基中培养细胞，促进产生更多的细胞，多于在含有血清的培养基生长的细胞数。2天后，更新培养基。再过2天，将培养基更换为生产培养基：DMEM/F-12培养基(Life Technologies；Cat.#21041)，其补充有1/100 ITSA(Life Technologies；Cat.#51300-044)[ITSA即为贴壁培养物补充胰岛素(1.0g/L)-运铁蛋白(0.55g/L)-硒(0.67mg/L)]、1/500EC-CYTE和P/S。在图2中，显示了产生过程，每天从每个滚瓶中收获300ml培养基。汇集从两个滚瓶中收获的培养基，然后测定培养基样品的干扰素β活性。
如图2所示，26天后终止产生过程。5天的滞后期后，[Q49N+Q51T+F111N+R113T]干扰素β变体介导的活性意想不到地增加并且在产生过程的剩余期，每天收获的干扰素β活性平均为2.4百万IU/ml×600ml＝1.440亿IU。共产生3.2×1010IU，其相应于160mg蛋白质(假设的比活性为2×108IU/ml)。
实施例9
干扰素β变体K19R+K45R+K123R的产生、纯化和PEG化
为了最终得到100ml含有干扰素β变体K19R+K45R+K123R的无血清培养基，在3个T-175烧瓶中接种COS-7细胞的DMEM(Life Technologies；Cat.#21969-035)溶液，其中补充有10％FBS加谷氨酰胺和青霉素/链霉素。转染当天(接近100％汇合)，用30ml新鲜培养基代替原有培养基保温4-5小时，然后转染。为了进行转染，将1890μl不含补充物的DMEM培养基等分到14ml聚丙烯管(Corning)中。210μl Fugene 6(Roche)直接加到培养基中并在室温下培养5分钟。在此期间，168μg质粒DNA([K19R，K45R，K123R]INF-β/pcDNA3.1(-)Hygro；PF#161)等分到另一14ml聚丙烯管中。培养5分钟后，Fugene 6混合物直接加到DNA溶液中并在室温下培养15分钟。培养后，约将700μl滴加到三种细胞培养的每一种中。
第二天，转染培养基用35ml不含血清的生产培养基代替。不含血清的培养基基于DMEM培养基(Life Technologies；Cat.#31053-028)，培养基中补充有谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、1％ITSA(Life Technologies；Cat.#51300-044)和0.2％Ex-Cyte(Serological Proteins；Cat.#81-129)。加入生产培养基之前，在不加添加剂的DMEM培养基中洗涤细胞层两次。
转染3天后，收获100ml不含血清的培养基用于干扰素β变体的纯化和PEG化。
将pH调节到6.8并用Milli Q水将导电性调节到＜10mS/cm。然后，将培养液成批吸附到1ml已用缓冲液A(20mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH7)预先平衡的SP550阳离子交换树脂(TosoHaas)中。颠覆旋转2小时后，允许树脂沉淀并转移到柱中。用5倍于柱体积的缓冲液A洗涤树脂并用2ml缓冲液B(20mM磷酸盐、800mM氯化钠，pH7)洗涤。洗脱液加入5％乙二醇后，在VivaSpin(截留值10kDa)上浓缩到500μl。将浓缩液调节到2ml最终体积时50mM磷酸盐、0.3M氯化钠、20％乙二醇，pH8并进一步浓缩到0.5ml。
按下列方法将最终浓缩液PEG化：在100μl的最终浓缩液中加入25μl在磷酸盐缓冲液pH8中新鲜制备的活化的mPEG-SPA(5000kDa，Shearwater，Alabama)，使活化的PEG最终浓度为0、5、10、25或50mg/ml。允许反应在室温下进行30分钟，然后加入50mM甘氨酸缓冲液终止反应。立即在-80℃下冷冻样品并按所述方法测量生物活性(一级测定方法)。对每一样品进行蛋白质印迹以便评价PEG化样品中存在的未反应干扰素β的量。
结果表明通过蛋白质印迹判断，25mg活化的PEG/ml时不存在未PEG化的干扰素β并且与对照样品(进行相同处理，但活化的PEG浓度为0mg/ml)相比，变体保留其生物活性的50％。
实施例10
可溶性IFNAR2的表达和纯化
使用PCR由HeLa细胞cDNA扩增编码IFNAR-1和IFNAR-2胞外结构域(分别为IFNAR1ec和IFNAR2ec)的cDNA，其中的引物相应于IFNAR-2胞外结构域的前10个氨基酸残基和后10个氨基酸残基(其核苷酸序列参见Novick等人，Cell，vol.77，pp391-400，1994)和IFNAR-1胞外结构域的前10个氨基酸残基和后10个氨基酸残基(其核苷酸序列参见Uze等人，Cell，vol.60，pp225-234，1990)。将这些cDNA亚克隆到pBlueBac4.5/V5-His-TOPO载体(Invitrogen)中并通过在Sf9细胞中同源重组、噬斑纯化和繁殖获得重组杆状病毒。Sf9细胞用重组杆状病毒来感染并且基本上按实施例2所述方法在所得细胞中进行表达。
用重组杆状病毒感染Sf9细胞2到3天后，在培养上清液中可见IFNAR1ec和IFNAR2ec蛋白。在干扰素拮抗剂测定中观察可溶性受体的活性。简而言之，在各种浓度的IFNARec上清液存在下用次最大剂量的人野生型干扰素β刺激含有ISRE元件的Hela细胞(按上文一级测定方法中所述的)。上清液的拮抗作用直接与所存在的可溶性受体的量成比例。
使用离子交换法和亲和层析从过滤的培养上清液中纯化IFNAR2ec。将IFNAR2ec阳性培养上清液的pH调节到7.5并上样至阴离子交换柱，使用500mM氯化钠洗脱结合的重组蛋白。然后使部分纯化的IFNAR2ec稀释并将pH调节到8.0，此后通过与TALOMTM金属亲和树脂结合并用咪唑洗脱来进一步纯化。最终的制品分装冷冻。按IFNAR2ec的纯化方法来纯化IFNAR1ec，只是用pH6.0的阳离子交换层析作为离子交换步骤。
实施例11
用可溶性IFNAR2纯化和PEG化干扰素β及其变体
按制造商说明(Amersham Pharmacia Biotech，Affinity Chromatography，Principles and Methods，18-1022-29，edition AB)使用如CNBr活化的Sepharose4B或EAH Sepharose 4B通过氨基或羧基来固定如实施例9所述获得的纯化的IFNAR2。最重要的是该偶联方法允许功能性IFNAR2被固定并经过偶联条件(pH、偶联缓冲剂、IFNAR2与活化材料的比等)的最佳化检验。另一关键参数是过量活化基团的封闭。随后，通过加入干扰素β来检验结合能力并测量临界点。
如下使用最佳固定的IFNAR2来纯化干扰素β。用缓冲液A(20mM磷酸盐，300mM氯化钠，pH7)平衡5ml柱，柱中每ml凝胶有1mg固定的IFNAR2。然后，在柱中装载2mg在缓冲液A中的干扰素β样品，用5倍于柱体积的缓冲液A进行洗涤。通过将2倍于柱体积的缓冲液B泵到柱上进行洗脱。收集1ml馏分并测定生物活性。最佳洗脱条件取决于固定方法，但洗脱条件的实例包括pH1.5-3(如，0.1M甘氨酸pH2.3在0.5M氯化钠中)、pH11.5-12，3.5M MgCl2、6M脲等。
实施例12
固定的IFNAR2用于干扰素β(变体)的PEG化
除了在实施例10中所述的用途外，固定的IFNAR2可用于使PEG化作用最佳化，其中避免了干扰素β或其变体与受体相互作用的部分的PEG化。
用缓冲液A(20mM磷酸盐，300mM氯化钠，pH7)平衡5ml柱，柱中每ml凝胶有1mg固定的IFNAR2。然后，在柱中装载2mg在缓冲液A中的干扰素β样品并用5倍于柱体积的缓冲液A进行洗涤。将活化的mPEG-SPA溶液(1-50mg/ml在缓冲液A中)泵到柱上并根据温度允许其反应15分钟到12小时，滞留时间和温度组合的一个优选范围是15-60分钟，10-20℃，另一个是30分钟-5小时，2-8℃。所述时间过后，通过将2倍于柱体积的缓冲液B泵到柱上进行洗脱。收集1ml馏分并使用一级筛选测定方法测定生物活性。最佳洗脱条件取决于固定方法，但洗脱条件的实例包括pH1.5-3(如，0.1M甘氨酸pH2.3在0.5M氯化钠中)、pH11.5-12，3.5M MgCl2、6M脲等。
实施例13
PEG化变体的抗病毒活性
使用抗病毒生物测定方法测定PEG化的干扰素β变体蛋白(K19R+K45R+K123R)。野生型和变体蛋白以10-0.0001IU/mL的浓度一式三份加到A549细胞中。
PEG化的干扰素β变体在3IU/ml浓度时显示对诱导细胞死亡的EMC病毒的总抑制作用，EC50为0.13IU/ml(图1)。野生型标准物对病毒的抑制作用的EC50为1.4IU/ml。
这些结果表明修饰的干扰素β多肽的PEG化产生具有全部抗病毒活性的偶联物。
实施例14
糖基化变体的抗体中和作用
使用ISRE中和测定方法测定野生型和糖基化的干扰素β变体蛋白(Q49N+Q51T+F111N+R113T)的抗体中和作用。干扰素β的野生型和变体蛋白(自12500IU/ml开始进行5倍稀释)与0、40和200ng/ml浓度的多克隆兔抗干扰素β抗体(PBL Biomedical Laboratories)一起进行培养。
在200ng/ml多克隆兔抗血清存在下，野生型干扰素β蛋白的活性减小11.8倍而糖基化干扰素β变体的活性仅仅减小3.0倍。因此，干扰素β变体的抗体识别程度仅比野生型的减小75％，参见下表1。这些结果表明在用野生型人干扰素β免疫的动物中产生的多克隆抗体对糖基化突变干扰素β的识别被大大地减小。因此，野生型人干扰素β中大部分免疫原性表位已经被变体分子中进行的修饰所去除/掩盖。
                                 表1
  抗体浓度(ng/ml)     蛋白质   EC50    抑制倍数   抗体中和作用的减小
  0     野生型   0.00039     -   -
    变体   0.00020     -   -
  40     野生型   0.00190     4.8   -
    变体   0.00020     1.0   79％
   200     野生型   0.00461     11.8   -
    变体   0.00059     3.0   75％
实施例15
构建和表达具有修饰的N-末端的干扰素β分子
按前面实施例中所述方法构建干扰素β的N-末端修饰的变体。
为了构建干扰素β变体，INFB S(-1)A+M1Q的表达质粒，使用下列引物：
CBProFpr110：
AAC TGG ATC CAG CCA CCA TGA CCA ACA AGT GCC TGC TCC AGA TCG CCC TGC TCC TGT GCT
TCA GCA CCA CGG CCC TAG CCC AGA GCT AC(SEQ ID NO37)和CBProFpr42(SEQ ID NO26)。
为了构建干扰素变体，INFβS(-1)AQ(表示(-1)位的S残基被A和Q残基取代)的表达质粒，使用下列引物：
CBProFpr109：
AAC TGG ATC CAG CCA CCA TGA CCA ACA AGT GCC TGC TCC AGA TCG CCC
TGC TCC TGT GCT TCA GCA CCA CGG CCC TAG CCC AGATGA GCT AC(SEQ IDNO 38)和CBProFpr42(SEQID NO 26)。
为了检验这些变体的活性，使用Lipofectamine2000(Life Technologies，USA)作为转染剂分别将质粒pF154和pF163转染到CHO K1细胞中。转染24小时后，收获上清液并按材料和方法章节描述的一级活性测定方法和ELISA进行测定。获得下列结果：
INFB S-1A+MIQ(pF154)：
                         活性：106410 IU/ml
                        ELISA：333ng/ml
                        比活性：3.2×108IU/mg
INFB S-1AQ(pF163)：
                        活性：90634 IU/ml
                        ELISA：193ng/ml
                        比活性：4.7×108IU/mg
这些分子的活性与野生型人干扰素β等效。
实施例16
制备PEG化的干扰素β变体
含突变Q49N+Q51T+K19R+K45R+K123R的重组人干扰素β多肽在50mM乙酸钠、35％乙二醇中的溶液pH5.5(0.3mg/ml)50μl与10μl 0.5M磷酸钠pH8.0和含有0.02mg/ml SPA-mPEG(N-琥珀酰亚胺基丙酸盐甲氧基聚乙二醇)的20μl 50mM磷酸钠，0.1M氯化钠，30％乙二醇，pH8.0混合。所述0.02mg/ml SPA-mPEG相当于SPA-mPEG比干扰素β过量10摩尔。
在室温下轻轻旋转半小时后，加入5μl 20mM甘氨酸，pH8.0使反应终止。此时，反应混合物中含有未修饰和PEG化形式的重组人干扰素β的混合物。
用一级筛选测定方法进行体外试验表明与未修饰的重组人干扰素β相比，PEG化的材料保留40％的活性。
在另一试验中，含突变Q49N+Q51T的重组人干扰素β多肽在50mM乙酸钠、35％乙二醇中的溶液pH5.5(0.14mg/ml)50μl与10μl 0.5M磷酸钠pH8.0和含有0.03mg/ml SPA-mPEG的20μl 50mM磷酸钠，0.1M氯化钠，30％乙二醇，pH8.0混合。所述SPA-mPEG的量相当于SPA-mPEG比干扰素β过量10摩尔。
在室温下轻轻旋转半小时后，加入5μl 20mM甘氨酸，pH8.0使反应终止。此时，反应混合物中含有未修饰和PEG化形式的重组人干扰素β的混合物。
用一级筛选测定方法进行体外试验表明与未修饰的重组人干扰素β相比，PEG化的材料保留20％的活性。
                               序列表
                               序列表
<110>马克西根公司(Maxygen ApS)
<120>新的干扰素β样分子
<130>2wo2
<140>
<141>
<160>38
<170>PatentIn 2.1版
<210>1
<211>840
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact  60
gttcgtgttg tcaacatgac caacaagtgt ctcctccaaa ttgctctcct gttgtgcttc  120
tccactacag ctctttccat gagctacaac ttgcttggat tcctacaaag aagcagcaat  180
tttcagtgtc agaagctcct gtggcaattg aatgggaggc ttgaatactg cctcaaggac  240
aggatgaact ttgacatccc tgaggagatt aagcagctgc agcagttcca gaaggaggac  300
gccgcattga ccatctatga gatgctccag aacatctttg ctattttcag acaagattca  360
tctagcactg gctggaatga gactattgtt gagaacctcc tggctaatgt ctatcatcag  420
ataaaccatc tgaagacagt cctggaagaa aaactggaga aagaagattt caccagggga  480
aaactcatga gcagtctgca cctgaaaaga tattatggga ggattctgca ttacctgaag  540
gccaaggagt acagtcactg tgcctggacc atagtcagag tggaaatcct aaggaacttt  600
tacttcatta acagacttac aggttacctc cgaaactgaa gatctcctag cctgtgcctc  660
tgggactgga caattgcttc aagcattctt caaccagcag atgctgttta agtgactgat  720
ggctaatgta ctgcatatga aaggacacta gaagattttg aaatttttat taaattatga  780
gttattttta tttatttaaa ttttattttg gaaaataaat tatttttggt gcaaaagtca  840
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
  1               5                  10                  15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
             20                  25                  30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
         35                  40                  45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
    50                   55                  60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
 65                  70                 75                   80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
                 85                  90                  95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
        115                 120                 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
    130                 135                 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
                165
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
ggctagcgtt taaacttaag cttcgccacc atgaccaaca agtgcctgct ccagatcgcc  60
ctgctcctgt                                                         70
<210>4
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
acaacctgct cggcttcctg cagaggagtt cgaacttcca gtgccagaag ctcctgtggc 60
agctgaacgg                                                        70
<210>5
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
gaacttcgac atccccgagg aaatcaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc 60
tctgaccatc                                                        70
<210>6
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
ttccgccagg actccagctc caccggttgg aacgagacca tcgtggagaa cctgctggcc 60
aacgtgtacc                                                        70
<210>7
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
aggagaagct ggagaaggag gacttcaccc gcggcaagct gatgagctcc ctgcacctga 60
agcgctacta                                                        70
<210>8
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
ggagtacagc  cactgcgcct  ggaccatcgt acgcgtggag atcctgcgca acttctactt 60
catcaaccgc                                                          70
<210>9
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
caccacactg gactagtgga tccttatcag ttgcgcaggt agccggtcag gcggttgatg 60
aagtagaagt                                                        70
<210>10
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
aggcgcagtg gctgtactcc ttggccttca ggtagtgcag gatgcggcca tagtagcgct   60
tcaggtgcag                                                          70
<210>11
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
ctccttctcc agcttctcct ccagcacggt cttcaggtgg ttgatctggt ggtacacgtt  60
ggccagcagg                                                         70
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
gagctggagt cctggcggaa gatggcgaag atgttctgca gcatctcgta gatggtcaga  60
gcggcgtcct                                                         70
<210>13
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>13
cctcggggat gtcgaagttc atcctgtcct tcaggcagta ctccaggcgc ccgttcagct  60
gccacaggag                                                         70
<210>14
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>14
caggaagccg agcaggttgt agctcatcga tagggccgtg gtgctgaagc acaggagcag  60
ggcgatctgg                                                         70
<210>15
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>15
ctgctccaga tcgccctgct cctgtgcttc agcaccacgg ccctatcgat gaagcaccag  60
caccagcatc                                                         70
<210>16
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>16
cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctggcta  60
gcgtttaaac                                                         70
<210>17
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>17
caggaagccg agcaggttgt agctcatctg ttggtgttga tgttggtgct gatgctggtg  60
ctggtgcttc                                                         70
<210>18
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>18
agcagggcga tctggagcag gcacttgttg gtcatggtgg cgaagcttaa gtttaaacgc  60
tagccagctt                                                         70
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>19
ccgtcagatc ctaggctagc ttattgcggt agtttatcac                       40
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>20
gagctcggta ccaagctttt aagagctgta at                               32
<210>21
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>21
gctgaacggg cgcctggagt actgcctgaa ggacaggatg aacttcgaca tccccgagga  60
aatccgccag ctgcagc                                                 77
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tctccacgcg tacgatggtc caggcgcagt ggctg                            35
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caccacactg gactagtgga tccttatcag ttgcgcaggt agccggtcag gcggttgatg 60
aagtagaagt                                                        70
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catcagcttg ccggtggtgt tgtcctcctt c                                31
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gaaggaggac aacaccaccg gcaagctgat g                               31
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cacactggac tagtaagctt ttatcagttg cgcaggtagc           40
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gaggagttcg aacttccagt gccagcgcct cctgtggcag ctgaacg    47
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cgcggatcca tatgaccaac aagtgcctg                         29
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cgcggatcct tatcagttgc gcag                              24
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tttaaactgg atccagccac catgaccaac aag                              33
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cggccatagt agcgcttcag gtgcagggag ctcatcagct tgccggtggt gttgtcctcc 60
ttc                                                               63
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gaaggaggac aacaccaccg gcaagctgat gagctccctg cacctgaagc gctactatgg 60
ccg                                                               63
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ggcgtcctcc ttggtgaagt tctgcagctg                                  30
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atatatccca agcttttatc agttgcgcag gtagccggt                        39
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cagctgcaga acttcaccaa ggaggacgcc                                   30
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cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg                              34
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aactggatcc agccaccatg accaacaagt gcctgctcca gatcgccctg ctcctgtgct  60
tcagcaccac ggccctagcc  cagagctac                                   89
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aactggatcc agccaccatg accaacaagt gcctgctcca gatcgccctg ctcctgtgct  60
tcagcaccac ggccctagcc cagatgagct ac                                92

Claims (60)

1、一种显示干扰素β活性并含有至少一个与干扰素β多肽共价连接的第一非多肽部分的偶联物，该偶联物的氨基酸序列与野生型人干扰素β的序列不同在于，该偶联物的序列中已引入至少一个并去除至少一个含有用于所述第一非多肽部分的连接基团的氨基酸残基。
2、权利要求1的偶联物，其中第一非多肽部分选自聚合物分子、亲脂性化合物、糖部分和有机衍生剂。
3、权利要求1或2的偶联物，其中第一非多肽部分为聚合物，优选线性或分支的聚乙二醇。
4、权利要求1-3中任一项的偶联物，其中第一非多肽部分选自以赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸残基作为连接基团的聚合物分子。
5、权利要求4的偶联物，其中第一非多肽部分是以赖氨酸作为连接基团的聚合物分子。
6、一种显示干扰素β活性并含有至少一个第一非多肽部分的偶联物，其中所述第一非多肽部分与干扰素β多肽上至少一个赖氨酸残基偶联，该偶联物的氨基酸序列与野生型人干扰素β的序列不同在于，该偶联物的序列中已引入至少一个和/或去除至少一个赖氨酸残基。
7、权利要求6的偶联物，其中去除的氨基酸残基选自K19、K33、K45、K52和K123，特别是K19、K33、K45、K123，最优选K19、K45和K123。
8、权利要求7的偶联物，其中赖氨酸残基被精氨酸或谷氨酰胺残基取代。
9、权利要求5-8中任一项的偶联物，其中干扰素β多肽含有下列中的一组突变：
K19R+K45R+K123R；
K19Q+K45R+K123R；
K19R+K45Q+K123R；
K19R+K45R+K123Q；
K19Q+K45Q+K123R；
K19R+K45Q+K123Q；
K19Q+K45R+K123Q；
K19Q+K45Q+K123Q；
K45R+K123R；
K45Q+K123R；
K45Q+K123Q；
K45R+K123Q；
K19R+K123R；
K19Q+K123R；
K19R+K123Q；
K19Q+K123Q；
K19R+K45R；
K19Q+K45R；
K19R+K45Q；
K19Q+45Q；
K52R+K134R；
K99R+K136R；
K33R+K105R+K136R；
K52R+K108R+K134R；
K99R+K115R+K136R；
K19R+K33R+K45R+K123R；
K19R+K45R+K52R+K123R；
K19R+K33R+K45R+K52R+K123R；或
K19R+K45R+K52R+K99R+K123R
10、权利要求5-9中任一项的偶联物，其中已引入一个赖氨酸残基，该残基所处位置在亲本干扰素β中由暴露于表面的氨基酸残基占据。
11、权利要求10的偶联物，其中干扰素β多肽含有至少一个选自下组的取代：N4K、R11K、G26K、R27K、Q48K、Q49K、R71K、D73K、S75K、E85K、A89K、Y92K、H93K、F111K、R113K、L116K、R124K、G127K和Y155K。
12、权利要求11的偶联物，其中所述取代选自Q49K和F111K。
13、权利要求5-12中任一项的偶联物，其包含至少两个被引入的赖氨酸残基。
14、权利要求10-13中任一项的偶联物，其中干扰素β多肽进一步含有至少一个被去除的赖氨酸残基，优选权利要求7-9中任一项所限定的类型。
15、权利要求14的偶联物，其含有下列中的一组突变：
K19R+K45R+F111K+K123R；
K19R+K45R+Q49K+F111K+K123R；
K19R+K45R+Q49K+K123R；
K19R+K45R+F111K；
K19R+K45R+Q49K+F111K；
K19R+Q49K+K123R；
K19R+Q49K+F111K+K123R；
K45Q+F111K+K123Q；
K45R+Q49K+K123R；或
K45R+O49K+F111K+K123R。
16、权利要求3-15中任一项的偶联物，其中所述聚合物分子选自SS-PEG、NPC-PEG、aldehyd-PEG、mPEG-SPA、PEG-SCM和mPEG-BTC。
17、一种显示干扰素β活性并含有至少一个第一非多肽部分的偶联物，其中所述第一非多肽部分与干扰素β多肽上至少一个赖氨酸残基偶联，该偶联物的氨基酸序列不同在于，在SEQ ID NO2中选自下列的位置上有至少一个引入的半胱氨酸残基：F8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、L20、W22、L28、L32、M36、P41、T58、Q64、N65、F67、I83、E85、N86、A89、N90、Y92、H93、H97、T100、L102、E103、L106、M117、L120、H121、R124、G127、R128、L130、H131、H140、I145、R147、V148、E149、R152、Y155和F156。
18、权利要求17的偶联物，其中干扰素β多肽进一步去除一个半胱氨酸残基，优选C17。
19、权利要求17或18的偶联物，其中干扰素β多肽含有C17S和/或N80C突变，优选C17S+N80C。
20、权利要求17-19中任一项的偶联物，其中所述第一非多肽部分是聚合物分子。
21、一种显示干扰素β活性并含有至少一个第一非多肽部分的偶联物，其中所述第一非多肽部分以酸性基团作为连接基团并与干扰素β多肽上至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基偶联，该偶联物的氨基酸序列与野生型人干扰素β的序列不同在于，该偶联物的序列中已至少引入一个和/或至少去除一个天冬氨酸或谷氨酸残基。
22、权利要求21的偶联物，其中至少一个氨基酸残基占据了在亲本干扰素β分子中由暴露于表面的氨基酸残基所占据的位置。
23、权利要求21或22的偶联物，其含有至少两个被引入的天冬氨酸或谷氨酸残基。
24、权利要求21-23中任一项的偶联物，其含有至少两个第一非多肽部分。
25、权利要求21-24中任一项的偶联物，其中所述第一非多肽部分是聚合物分子。
26、上述权利要求中任一项的偶联物，其包含第二非多肽部分。
27、权利要求26的偶联物，其中第二非多肽部分是糖部分，优选N-连接的糖部分。
28、权利要求27的方法，其中干扰素β多肽的氨基酸序列进一步引入至少一个和/或去除至少一个体内糖基化位点。
29、权利要求26-28中任一项的偶联物，其中所述多肽包含至少一个去除的氨基酸残基和至少一个引入的氨基酸残基，所述去除的残基含有用于第一非多肽部分的连接基团，所述引入的残基含有用于第二非多肽部分的连接基团。
30、权利要求29的偶联物，其中干扰素β多肽的氨基酸序列包含至少两个去除的氨基酸残基和至少一个引入的氨基酸残基，所述去除的残基含有用于第一非多肽部分的连接基团，所述引入的残基含有用于第二非多肽部分的连接基团。
31、权利要求28或30的偶联物，其中所述第一非多肽部分是以赖氨酸作为连接基团的聚合物分子。
32、一种显示干扰素β活性并含有与干扰素β多肽共价结合的至少一个聚合物分子和至少一个糖部分的偶联物，该偶联物的氨基酸序列在如下方面不同于野生型人干扰素β的序列：
a)至少一个引入的和/或至少一个去除的氨基酸残基，所述残基包含用于聚合物分子的连接基团，和
b)至少一个引入的和/或至少一个去除的氨基酸残基，所述残基包含用于糖部分的连接基团，
条件是当用于聚合物分子的连接基团为半胱氨酸残基且糖部分为N-连接的糖部分时，半胱氨酸残基的插入方式不破坏N-糖基化位点。
33、权利要求32的偶联物，其中聚合物分子以赖氨酸作为连接基团。
34、权利要求33的偶联物，其中所述多肽包含至少一个去除的氨基酸残基和至少一个引入的氨基酸残基，所述去除的残基含有用于第一非多肽部分的连接基团，所述引入的残基含有用于第二非多肽部分的连接基团。
35、权利要求26-34中任一项的偶联物，其中干扰素β多肽含有下列中的一组突变：
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R；
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T；或
K19R+K45R+Q49N+Q51T+K123R。
36、上述权利要求中任一项的偶联物，其中干扰素β多肽含有不能与非多肽部分偶联的修饰型N-末端。
37、一种显示干扰素β活性并包含干扰素β多肽的偶联物，该偶联物的氨基酸序列不同于野生型人干扰素β的序列之处在于，该偶联物的序列至少引入了一个糖基化位点，该偶联物进一步含有至少一个非PEG化糖部分，其与所引入的糖基化位点结合。
38、一种显示干扰素β活性并包含干扰素β多肽的偶联物，该偶联物的氨基酸序列不同于野生型人干扰素β的序列之处在于，该偶联物的序列中已经通过引入或除去构成糖基化位点的的一部分的氨基酸残基而引入或除去一个糖基化位点，其中所述构成糖基化位点的一部分的氨基酸残基所处的位置在野生型人干扰素β中由暴露于表面的氨基酸残基所占据。
39、权利要求37或38的偶联物，其中干扰素β多肽含有至少一个选自下组的突变：S2N+N4T，L9N+R11T，R11N，S12N+N14T，F15N+C16S，Q16N+Q18T，K19N+L21T，Q23N+H25T，G26N+L28T，R27N+E29T，L28N+Y30T，D39T，K45N+L47T，Q46N+Q48T，Q48N+F50T，Q49N+Q51T，Q51N+E53T，R71N+D73T，Q72N，D73N，S75N，S76N+G78T，L88T，Y92T，N93N+I95T，L98T，E103N+K105T，E104N+L106T，E107N+E109T，K108N+D110T，D110N，F111N+R113T和L116N。
40、权利要求39的偶联物，其中干扰素β多肽含有下列取代中的一组：Q49N+Q51T；Q49N+Q51T+F111N+R113T；或Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+R113T。
41、权利要求37-40中任一项的偶联物，其中所述氨基酸序列进一步在一个去除的糖基化位点，特别是一个去除的N-糖基化位点上不同。
42、一种显示干扰素β活性并含有与干扰素β多肽共价连接的糖部分的偶联物，该偶联物的氨基酸序列与野生型人干扰素β的序列区别在于，该偶联物的序列至少已去除一个糖基化位点。
43、权利要求41或42的偶联物，其中已通过N80C突变去除一个N-糖基化位点。
44、权利要求42或43的偶联物，其中干扰素β多肽包含至少一个如权利要求38所述的突变。
45、上述权利要求中任一项的偶联物，其中干扰素β多肽进一步在M1、C17、N80或V101位含有至少一个取代，尤其含有M1缺失、M1K或C17S取代中的一个。
46、一种核苷酸序列，其编码权利要求1-45中任一项的偶联物中的干扰素β多肽部分。
47、一种表达载体，其携有权利要求46的核苷酸序列。
48、一种宿主细胞，其包含权利要求46的核苷酸序列或权利要求47的表达载体。
49、权利要求48的宿主细胞，其为CHO、BHK、HEK293细胞或SF9细胞。
50、减小干扰素β多肽的免疫原性和/或增加其功能性体内半衰期和/或血清半衰期的方法，该方法包括将一个构成用于第一非多肽部分的连接基团的氨基酸残基引入不含此基团的蛋白中暴露于表面的位点，并去除一个构成用于第一非多肽部分的连接基团的氨基酸残基，然后使所得修饰型多肽与所述第一非多肽部分偶联。
51、权利要求50的方法，其中所述非多肽部分选自聚合物分子、糖部分、亲脂性基团和有机衍生剂。
52、制备权利要求1-45中任一项的偶联物的方法，其中干扰素β多肽在可进行偶联的条件下与被偶联分子进行反应，然后回收该偶联物。
53、一种药物组合物，其含有a)权利要求1-45中任一项的偶联物和b)可药用稀释剂、载体或辅料。
54、用权利要求1-45中任一项的偶联物或权利要求53的组合物治疗疾病，特别是多发性硬化症。
55、权利要求1-45中任一项的偶联物或权利要求53的组合物在治疗疾病，特别是多发性硬化症中的用途。
56、权利要求1-45中任一项的偶联物或权利要求53的组合物在制备治疗疾病，特别是多发性硬化症的药物中的应用。
57、一种治疗哺乳动物多发性硬化症的方法，该方法包括给予有效量的权利要求1-45中任一项的偶联物或权利要求53的组合物。
58、一种对具有抗干扰素β1a和/或1b循环抗体的哺乳动物进行治疗的方法，其中该方法用权利要求1-45中任一项的偶联物或权利要求53的药物组合物治疗该哺乳动物。
59、一种细胞培养物组合物，其包含a)用编码显示干扰素β活性之多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞和b)含有由所述核苷酸序列的表达所产生的所述多肽的培养基，所述培养物组合物可由所述宿主细胞分泌所述多肽直接获得，其中所述多肽的量为至少800,000IU/ml培养基，优选800,000-3,500,000IU/ml培养基。
60、权利要求59的细胞培养物，其中所述宿主细胞是权利要求48或49的宿主细胞。
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