CN1309423C - 干扰素γ偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表现出干扰素γ活性且含有与IFG多肽共价连接的至少一个第一非多肽组分的偶联物，该多肽含有的氨基酸序列与亲本IFNG多肽的区别在于导入了至少一个和/或去掉了至少一个含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基。该偶联物可用于治疗各种疾病。

Description

干扰素γ偶联物
                            发明领域
本发明涉及具有干扰素γ样活性的偶联物，其制备方法，含有该分子的药用组合物及其在疾病治疗中的用途。
                            发明背景
干扰素-γ(IFNG)是由T-淋巴细胞和天然杀伤细胞产生的一种细胞因子且以两个非共价结合的多肽亚基的同型二聚体存在。各二聚体的成熟形式含有143个氨基酸残基(SEQ ID NO 2所示)，其前体形式包括166个氨基酸残基的信号序列(SEQ ID NO 1所示)。
各亚基具有两个潜在的N-糖基化位点(Aggarwal等，人类细胞因子，Blackwell科学出版社，1992)在位置25和97。根据糖基化的程度，二聚体形式的IFNG分子量是34-50kDa(Farrar等，免疫学年鉴，1993，11：571-611)。
Gray等(自然，298：859-863，1982)，Taya等(EMBO J.1：953-958，1982)，Devos等(核酸研究，10：2487-2501，1982)和Rinderknecht等(生物学化学杂志，259：6790-6797，1984)及在EP 77670，EP 89676和EP 110044中已报导了野生型人IFNG(huIFNG)的一级序列。Ealick等(科学，252：698-702，1991)报导了huIFNG的三维结构。
已报导了IFNG亚基多肽的各种天然存在的或突变的形式，包括一种包含Cys-Tyr-Cys N-末端氨基酸序列(相对于SEQ ID NO 2的位置(-3)-(-1))的形式，一种包含N-末端甲硫氨酸(相对于SEQ ID NO 2的位置-1)的形式，和含有127-134氨基酸残基的各种C-末端截短形式。已知可从C-末端缺失1-15个氨基酸残基而不破坏该分子的IFNG活性。而且，Pan等(欧洲生物化学杂志，166：145-149，1987)已描述了huIFNG C-末端的异质性。
Slodowski等(欧洲生物学化学杂志，202：1133-1140，1991)，Luk等(生物学化学杂志，265：13314-13319，1990)，Seelig等，(生物化学，27：1981-1987，1988)，Trousdale等(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，26：1244-1251，1985)，和在EP 146354中报导了HuIFNG突变体。Nishi等(生物化学杂志，97：153-159，1985)报导了天然huIFNG变异体。
US 6,046,034公开了插入4对半胱氨酸残基使得二硫键形成且因此以同型二聚体的形式稳定IFNG变异体的耐热重组huIFNG(rhuIFNG)变异体。
WO 92/08737公开了在野生型人IFNG的全长(残基1-143)或部分(残基1-132)氨基酸序列的N末端含有添加的甲硫氨酸的IFNG变异体。EP 219 781公开了含有氨基酸残基3-124(SEQ ID NO 2中)的部分huIFNG序列。US 4,832,959公开了含有氨基酸序列的残基1-127，5-146和5-127的部分huIFNG序列，该序列与SEQ ID NO 2相比具有3个添加的N-末端氨基酸残基(CYC)。US 5,004,689公开了编码无3个N-末端氨基酸残基CYC的huIFNG的DNA序列及其在大肠杆菌中的表达。EP 446582公开了大肠杆菌产生的不含N-末端甲硫氨酸的rhuIFNG。US 6,120,762公开了含有其残基95-134(相对于SEQ ID NO 2)的huIFNG肽片断。
Wang等(Sci.Sin.B 24：1076-1084，1994)报导了rhuIFNG的高水平表达。
Curling等(生物化学杂志，272：333-337，1990)和Hooker等，(干扰素和细胞因子研究杂志，1998，18：287-295)报导了rhuIFNG中的糖基化变异体。
Kita等(Drug Des.Deliv.，6：157-167，1990)，和在EP 236987和US5109120中报导了rhuIFNG的聚合物修饰。
WO 92/22310报导了干扰素，特别是huIFNG的脱唾液酸糖蛋白偶联物的衍生物。
IFNG融合蛋白已有描述。例如，EP 237019公开了具有表现出干扰素β活性的区域和一个表现出IFNG活性的区域的单链多肽。
EP 158,198公开了具有表现出IFNG活性的区域和表现出IL-2活性的区域的单链多肽。一些文献描述了单链二聚体IFNG蛋白质，例如Landar等(分子生物学杂志，2000，299：169-179)。
WO 99/02710公开了单链多肽，其中的一个例子是IFNG。WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的PEG连接的变异体，其中，位于多肽特定区域的一个非必需氨基酸残基被一个半胱氨酸残基取代。IFNG作为生长激素超家族成员的一个例子被提及，但没有详细讨论其修饰。
已有建议将IFNG用于治疗间质性肺疾病(也称为间质性肺纤维症(IPF))(Ziesche等(新英格兰医学杂志，341：1264-1269，1999和胸科，110：增刊：25S，1996)和EP 795332)，为此可将IFNG与脱氢皮质甾醇结合使用。除了IPF外，肉芽肿性疾病(Bolinger等，临床药物学，1992，11：834-850)，某些分支杆菌感染(新英格兰医学杂志，330：1348-1355，1994)，肾癌(泌尿学杂志，152：841-845，1994)，石骨症(新英格兰医学杂志，332：1594-1599，1995)，硬皮病(风湿病学杂志，23：654-658，1996)，乙型肝炎(肝胃肠学，45：2282-2294，1998)，丙型肝炎(国际肝学通信，6：264-273，1997)，脓毒性休克(自然医学，3：678-681，1997)和类风湿性关节炎也可用IFNG治疗。
作为药用化合物，rhuIFNG被用于，例如抵抗某些病毒感染和肿瘤取得了一定的成功。rhuIFNG通常经过肠胃外使用，优选通过皮下，注射使用。7小时后发现最大血清浓度，血浆半寿期是在静脉注射给药后30分钟。因此用rhuIFNG进行有效治疗需要经常注射。主要的有害作用包括发烧，寒战，出汗，头痛，肌痛和嗜睡。这些效应与注射rhuIFNG相联系且在注射后第一个小时内观察到。罕见的副作用是局部疼痛和红斑，肝脏酶升高，可逆的粒细胞和血小板减少症及心脏毒性。
需要提供具有IFNG-活性的新分子，它在药物动力学，均一性，免疫原性和其它有害副作用方面与huIFNG或rhuIFNG相比具有改进的特性。
                        发明简述
本申请公开了提供一种或多种上述所需优点的改进的IFNG-样分子。在第一个方面，本发明涉及表现出IFNG活性且包含至少一个共价连接到IFNG多肽上的第一非多肽组分的偶联物，该多肽含有的氨基酸序列与亲本IFNG多肽区别在于导入了至少一个和/或去掉了至少一个含有非多肽组分的一个连接基团的氨基酸残基。该偶联物与huIFNG和rhuIFNG相比体内半寿期延长且任选与rhuIFNG相比引起的免疫反应降低。任选的是，这类分子在均一性分子的产生能力，对蛋白裂解的稳定性增强和/或生物有效性的提高方面也具有进一步改进的特性。
因此，本发明的偶联物提供了超过目前可获得的IFNG化合物的许多优点，包括注射或其它形式的给药之间的间隔期间更长，副作用更少，和/或由于抗体减少而增强了效力。另外，经过使用本发明的偶联物可获得更高剂量的活性蛋白且因此可获得更有效的治疗反应。
在另一方面，本发明涉及表现出IFNG活性且含有至少一个N-末端PEG连接的IFNG多肽的偶联物。IFNG多肽可以是huIFNG或本文所述的任意IFNG多肽。
在另一方面，本发明涉及制备本发明的偶联物的工具(means)和方法，包括核苷酸序列和表达载体以及制备多肽或偶联物的方法。
在另一方面，本发明涉及一种含有本发明的偶联物的治疗组合物，涉及用于治疗的本发明的偶联物或组合物，涉及偶联物或组合物在治疗或用于生产治疗疾病的药物中的用途。
最后，本发明涉及特定IFNG偶联物在生产药物中的用途，用于治疗间质性肺疾病，癌症，感染性和/或炎症性疾病的药用组合物或试剂盒的一部分(kit-of-parts)，且在间质性肺疾病的情况下，任选还与糖皮质激素联合使用。
                                发明详述
定义
在本申请和发明的说明书中使用了下列定义：
术语“偶联物”(或可互换的“偶联的多肽”)意指由一个或多个多肽共价连接到一个或多个非多肽组分上形成的杂合的(指复合或嵌合的意义)分子。术语共价连接的意思是多肽和非多肽组分直接共价连接到另一组分上，或者通过诸如桥，间隔，或连接组分等一个或多个间插组分间接共价连接到另一组分上。优选的是，偶联物在有关浓度和条件下是可溶的，即在诸如血液等生理学液体中是可溶的。本发明的偶联多肽的例子包括糖基化和/或PEG连接的多肽。对于偶联物的多肽部分可使用术语“未偶联的多肽”。
术语“非多肽组分”意指能偶联到IFNG多肽的连接基团上的分子。该分子的优选例子包括聚合物分子，亲脂性化合物，糖组分或有机衍生物。当在本发明的偶联物环境中使用时应理解非多肽组分通过多肽的连接基团连接到偶联物的多肽部分上。
术语“聚合物分子”定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中没有一个单体是氨基酸残基，除非该聚合物是人白蛋白或另一高丰度血浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换使用。术语“糖组分”意指通过体内或体外糖基化，例如N-或O-糖基化连接的碳水化合物分子。除非在偶联物中的诸如聚合物分子的非多肽组分的数目在每次提及时特别指出是在偶联物中所含的或者在本发明中使用的“一个非多肽组分”，否则应当是指偶联物中的一个或多个非多肽组分。
术语“连接基团”意指能偶联到诸如聚合物分子或糖组分的有关非多肽组分上的氨基酸残基基团。有用的连接基团及其匹配的非多肽组分从下表中是显而易见的。
  连接基团   氨基酸   非多肽组分的例子   偶联方法/活化的PEG   参考文献
  -NH2   N-末端，Lys   聚合物，例如PEG   mPEG-SPATresylatedmPEG   Shearwater公司，Delgado等，综述，见：治疗性药物载体系统，9(3，4)：249-304(1992)
  -COOH   C-末端，Asp，Glu   聚合物，例如PEG糖组分   mPEG-Hz体外偶联   Shearwater公司
  -SH   Cys   聚合物，例如PEG糖组分   PEG-乙烯砜PEG-马来酰亚胺体外偶联   Shearwater公司，Delgado等，综述，见：治疗性药物载体系统，9(3，4)：249-304(1992)
  -OH   Ser，Thr，OH-，Lys   糖组分   体内O-连接的糖基化
  -CONH2   Asn作为N-糖基化位点的部分   糖组分   体内糖基化
  芳香族残基   Phe，Tyr，Trp   糖组分   体外偶联
  -CONH2   Gln   糖组分   体外偶联   Yan和Wold，生物化学，1984年7月31日；23(16)：3759-65
  醛酮   氧化的糖类   聚合物，例如PEG，PEG-酰肼   PEG连接   Andresz等，1978，高分子化学，179：301；WO92/16555，WO00/23114
  胍基   Arg   糖组分   体外偶联   Lundblad和Noyes，用于蛋白质修饰的化学试剂，CRC出版公司，Boca Raton，FI
  咪唑环   His   糖组分   体外偶联   同胍基
对于体内N-糖基化，术语“连接基团”以非传统的方式使用，指组成N-糖基化位点的氨基酸残基(具有序列N-X′-S/T/C-X″，其中X′是除脯氨酸外的任意氨基酸残基，X″是可以与X′相同或不同且优选不同于脯氨酸的任意氨基酸残基，N是天冬酰胺且S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸，且最优选苏氨酸)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是糖基化期间连接糖组分的残基，但除非存在N-糖基化位点的其它氨基酸残基，否则将不能实现该连接。因此，当非多肽组分是糖组分且经过N-糖基化实现偶联时，与亲本多肽氨基酸序列改变相联使用的术语“含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基”应理解为组成N-糖基化位点的一个，两个或所有氨基酸残基以这样的方式改变，即将功能性N-糖基化位点导入氨基酸序列或从所述序列中去掉该位点。
在本申请中，氨基酸名称和原子名称(例如CA，CB，CD，CG，SG，NZ，N，O，C，等)按蛋白质数据库(PDB)(www.pdb.org)的定义使用，该数据库以IUPAC命名法(氨基酸和肽的IUPAC命名法和代号(残基名称，原子名称等)，欧洲生物化学杂志，138，9-37(1984))及其在欧洲生物化学杂志，152，1(1985)中的修正为基础。CA有时称为Cα，CB称为Cβ。术语“氨基酸残基”意指包含在由丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，组氨酸(His或H)，异亮氨酸(Ile或I)，赖氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，甲硫氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，丝氨酸(Ser或S)，苏氨酸(Thr或T)，缬氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)，和酪氨酸(Tyr或Y)残基组成的组中的一个氨基酸残基。在本文件中氨基酸残基的编号从无信号肽的huIFNG的N-末端开始(即SEQ ID NO 2)。鉴定氨基酸位置/取代所用的术语如下所述：N25(表示SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中位置#25是天冬酰胺)。N25C(表示位置25的Asp残基被Cys取代)。多个取代用“+”表示，例如，Q1N+P3T/S指在位置1用Asn取代Gln残基且在位置3用Thr或Ser，优选用Thr取代Pro残基的氨基酸序列。
术语“核苷酸序列”意指两个或多个核苷酸分子的连续链。核苷酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成的，合成来源，或其任意组合的核苷酸序列。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”一般指体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如，如US 4,683,195所述。一般来说，PCR方法涉及使用能与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物进行引物延伸合成的重复循环。
“细胞”，“宿主细胞”，“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换使用且所有这些术语应理解为包括细胞生长或培养产生的后代。“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA导入细胞的过程。
“可操作地连接”指通过酶连接或者互相之间的构型使得可行使序列的正常功能的方式将两个或多个核苷酸序列共价连接。例如，如果编码前序列或分泌先导序列的核苷酸序列作为参与多肽分泌的前蛋白表达则它与多肽的核苷酸序列可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录则它与编码序列可操作地连接；如果核糖体结合位点的位置有助于翻译，则它与编码序列可操作地连接。一般来说，“可操作地连接”意味着连接的核苷酸序列是连续的，且对于分泌的先导序列而言是连续的且在阅读相(reading phase)中。经过在方便的限制性位点连接来实现该连接。如果不存在该位点，那么可结合标准重组DNA方法使用合成寡核苷酸连接物或接头。
术语“导入”首先是指现有氨基酸残基的取代，但也可指插入其它的氨基酸残基。术语“去掉”首先是指被去掉的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，但也指缺失(没有取代)去掉的氨基酸残基。
术语“含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基”是指氨基酸残基是非多肽组分结合的(对于导入的氨基酸残基)或结合过的(对于去掉的氨基酸残基)氨基酸残基。
对本文所述的IFNG多肽的氨基酸序列使用的术语“一个区别”或“多个区别”是指允许存在其它的区别。因此，除了特定的氨基酸区别外，可突变不是这些特定氨基酸残基的其它氨基酸残基。
术语“功能性体内半寿期”以其正常含义使用，即50％的偶联物分子在被清除前在血浆或血流中循环的时间(也称为“血清半寿期”)，或保留50％的偶联物给定功能的时间。多肽或偶联物在正常情况下被网状内皮系统(RES)，肾脏，脾脏或肝脏的一种或多种作用，或者被特异性或非特异性蛋白裂解清除。正常情况下，清除依赖于大小(相对于肾小球过滤的截留值)，电荷，连接的糖链，和蛋白质细胞受体的存在。保留的功能正常情况下选自抗病毒，抗增生，免疫调节或IFNG受体结合活性。功能性体内半寿期可用在下文方法部分进一步讨论的本领域已知的任何合适的方法测定。
术语“功能性体内半寿期增加”用于指偶联物的功能性体内半寿期相对于在相当条件下测定的对照分子，例如huIFNG，任选以糖基化形式，例如，未偶联的huIFNG或rhuIFNG在统计学上显著增加。
与给定物质结合使用的术语“免疫原性”是指物质诱导来自人免疫系统的反应的能力。免疫反应可以是细胞或抗体介导的反应(参见，例如，Roitt：基础免疫学(第8版，Blackwell)，可得到免疫原性的进一步定义)。
术语“降低的免疫原性”是指本发明的偶联物比在相当条件下测定的对照分子，例如huIFNG或rhuIFNG产生可测定的更低的免疫反应。
术语“表现出IFNG活性”是指多肽具有天然IFNG，特别是huIFNG或rhuIFNG的一种或多种功能，包括体外或体内测定的结合IFNG受体的能力和引起huIFNG结合其受体时转导的信号转导的能力(即体外或体内生物活性)。Aguet等(细胞，55：273-280，1988)和Calderon等(美国国家科学院院报，85：4837-4841，1988)已描述了IFNG受体。“IFNG多肽”是表现出IFNG活性的多肽，本文按需要用于表示单体或二聚体形式的多肽。例如，当表示特定取代时，正常情况下它们表示IFNG多肽单体的取代。当作为本发明的偶联物的IFNG部分的对照时，一般是二聚体形式(且因此，例如，包含两个按所述修饰的IFNG多肽单体)。通过正常缔合两个单体或者以单链二聚体IFNG多肽的形式可提供IFNG多肽的二聚体形式。
本文所述的IFNG多肽可与huIFNG或rhuIFNG具有相同大小的体内或体外生物活性，或者更低或更高的活性，例如在相同条件下测量时具有1-100％的huIFNG或rhuIFNG的体内或体外生物活性，例如，具有1-25％或1-50％或25-100％或50-100％的huIFNG或rhuIFNG的活性。
术语“亲本IFNG”是指将要按照本发明进行修饰的分子。一般来说，亲本IFNG由核苷酸序列编码，该核苷酸序列可按本发明进行修饰使其编码本发明的偶联物的多肽部分。亲本IFNG一般是huIFNG或rhuIFNG或变异体或其片断。“变异体”是一种多肽，它与其亲本多肽具有一个或多个氨基酸残基的区别，一般是有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸残基的区别。片断是表现出IFNG活性的全长huIFNG序列的一部分，例如，其C-末端或N-末端截短的形式。
术语“功能性位点”是指IFNG的功能或功效所必需的或者与之相关的一个或多个氨基酸残基。该氨基酸残基“位于”功能性位点。功能性位点可用本领域已知的方法测定且优选经过分析与诸如IFNG受体的相关受体复合的多肽结构来鉴定。
本发明的偶联物
如上所述，在第一个方面，本发明涉及表现出IFNG活性且含有共价连接到IFNG多肽上的至少一个第一非多肽组分的偶联物，该多肽含有的氨基酸序列与亲本IFNG多肽区别在于导入了至少一个和/或去掉了至少一个含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基。
通过去掉或导入含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基，可特异性地修改多肽以便制备与选定非多肽组分偶联更敏感的分子，优化偶联方式(例如，保证非多肽组分在IFNG多肽表面的最佳分布)且因此获得表现出IFNG活性且与目前获得的基于huIFNG或rhuIFNG的分子相比改进了一种或多种特性的新偶联物分子。例如，经过导入连接基团，增强或改变了IFNG多肽与相关非多肽组分结合的特异性氨基酸残基的含量，从而实现更有效，更特异和/或更广泛的偶联。通过去掉一个或多个连接基团，可避免在多肽部分与非多肽组分形成不利的偶联，例如，偶联到位于或靠近多肽功能性位点的氨基酸残基上(因为在该位点的偶联可导致所得的偶联物由于损害了受体识别而失活或降低IFNG活性)。另外，去掉紧靠另一连接基团的一个连接基团以避免与该基团的不均一偶联也是具有优势的。在优选的实施方案中，改变IFNG多肽的一个以上的氨基酸残基，例如，改变包含去掉和导入含有选定非多肽组分的连接位点的氨基酸残基。据认为该实施方案的具体益处在于可特异性地设计IFNG多肽，以便获得与非多肽组分的最佳偶联。
除了去掉和/或导入氨基酸残基外，多肽可含有其它取代，该取代不涉及含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基的导入和/或去掉。
尽管按本发明修饰的亲本多肽可以是具有IFNG活性的任意多肽，且因此可以是任何来源，例如，非人哺乳动物来源所衍生的，但优选亲本多肽是具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的huIFNG或其变异体或片断。hIFNG变异体的例子在上文本发明的背景中描述，且包括，例如，具有N-末端添加CYC的huIFNG和US 6,046,034所述的半胱氨酸修饰的变异体。片断的具体例子是在上文本发明的背景部分公开的那些且包括C-末端截短1-15个氨基酸残基，例如截短1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15个氨基酸残基，和/或N-末端截短1-3个氨基酸残基的huIFNG。
应理解当亲本IFNG多肽是huIFNG的变异体或片断时，从该亲本制备的修饰的IFNG多肽包含该亲本的突变或截短。
另外，亲本IFNG多肽可以是IFNG多肽单体和另一同源性多肽之间的杂合分子，任选含有向该杂合分子导入的一个或多个其它的取代。该杂合体在上文本发明的背景部分描述。该杂合分子可含有的氨基酸序列与SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列有15个以上，例如10个以上的氨基酸残基的区别。为了在本发明中有用，杂合分子表现出IFNG活性。
可按类似于本文所述的方法修饰非人类的亲本IFNG’s，例如通过修饰与本文所述位置相应的非人类的亲本IFNG的位置(例如，从所述的IFNG与huIFNG的氨基酸序列的序列对比或三维结构测定)。
应理解含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基无论将被去掉或导入，均应根据选定的非多肽组分部分的特性来选择，在大多数情况下，根据所用的偶联方法来选择。例如，当非多肽组分是聚合物分子，例如聚乙二醇或聚环氧烷衍生的分子时，能用作连接基团的氨基酸残基可选自半胱氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，谷氨酸和精氨酸。当非多肽组分是糖组分时，连接基团是，例如体内糖基化位点，优选N-糖基化位点。
每当按照本发明向IFNG多肽导入或去掉非多肽组分的连接基团时，需修饰的多肽位置按如下进行适当选择：
该位置优选位于IFNG多肽的表面，且更优选占据该位置的氨基酸残基根据以其二聚体形式的IFNG三维结构或模型测定其侧链至少25％暴露于溶剂，优选其侧链至少50％暴露于溶剂，该结构或模型任选进一步包含一个或两个IFNG受体分子。该位置(例如，代表在含有或不含受体分子的模型中超过25％或超过50％的表面暴露)在本文的材料和方法部分列出。
另外感兴趣的是修饰亲本IFNG的任意23个C-末端氨基酸残基(经过导入和/或去掉含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基)，因为据信该残基位于IFNG多肽的表面。
另外，在本发明的偶联物的IFNG多肽部分中，优选去掉了位于IFNG的受体结合位点的连接基团，优选通过取代含有该基团的氨基酸残基来去掉。IFNG受体结合位点的氨基酸残基在下文的材料和方法部分鉴定。对于单链IFNG多肽，仅在一个单体的受体结合位点去掉连接基团就足够且因此可获得具有一个有活性的和一个失活的受体结合位点的单链IFNG多肽偶联物。
为了测定连接基团的最佳分布，根据IFNG二聚体多肽的三维结构计算位于IFNG多肽表面的氨基酸残基之间的距离。更具体的说，测定含有该连接基团的氨基酸残基的CB之间的距离，或者测定一个氨基酸残基的官能团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)与含有连接基团的另一氨基酸残基的CB之间的距离。对于甘氨酸，使用CA代替CB。在本发明的偶联物的IFNG多肽部分中，任何所述的距离优选超过8，特别是超过10以避免或减少不均一性偶联。
另外，IFNG多肽的氨基酸序列与亲本IFNG多肽的区别在于去掉了组成表位部分的一个或多个氨基酸残基，优选通过取代含有非多肽组分的连接基团的氨基酸残基，以便破坏或灭活表位。通过使用本领域已知的方法，也称为表位定位法，可鉴定huIFNG或rhuIFNG的表位，参见，例如Romagnoli等，生物化学，1999，380(5)：553-9，DeLisser HM，分子生物学方法，1999，96：11-20，Van de Water等，临床免疫学和免疫病理学，1997，85(3)：229-35，Saint-Remy JM，毒理学，1997，119(1)：77-81，以及Lane DP和Stephen CW，一般免疫学观点，1993，5(2)：268-71。一个方法是建立表达例如9个氨基酸残基的随机寡肽的噬菌体展示文库。通过免疫沉淀法从抗huIFNG或rhuIFNG的特异性抗血清纯化IgG1抗体且通过免疫印迹鉴定反应的噬菌体。通过测序纯化的反应噬菌体的DNA，可测定寡肽的序列，随后在IFNG的三维结构上定位该序列。由此鉴定的该结构上的区域构成表位，然后可选择该表位作为导入非多肽组分的连接基团的靶区域。
为了避免过多地破坏亲本IFNG分子的结构和功能，按照本发明改变的氨基酸残基的总数(与SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列相比)一般不超过15个。优选的是，IFNG多肽含有的氨基酸序列与SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列有1-15个氨基酸残基的区别，例如1-8或2-8个氨基酸残基的区别，例如与SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列有1-5或2-5个氨基酸残基的区别。因此，正常情况下IFNG多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列成熟部分有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸残基的区别。优选的是，上述数目代表导入的或者去掉的含有相关非多肽组分连接基团的氨基酸残基的总数，或者代表导入及去掉的含有该基团的氨基酸残基的总数。
偶联所需的且在二聚体形式的IFNG多肽中存在的连接基团的精确数目依赖于需要通过偶联来实现的效果。所得的效果依赖于，例如，偶联的特性和程度(例如，非多肽组分的特性，偶联到多肽上所需的或可能的非多肽组分的数目，应当进行的偶联或应当避免的偶联等)。
本发明的偶联物的IFNG多肽部分可以是截短的形式(例如，如上文所述相对于亲本IFNG多肽截短1-15个C-末端氨基酸残基，或截短1-3个N-末端氨基酸残基)。
功能性体内半寿期依赖于，例如，偶联物的分子量和提供延长半寿期所需的连接基团数目，因此依赖于所述非多肽组分的分子量。在一个实施方案中，本发明的偶联物具有至少67kDa的分子量，特别是按Laemmli，U.K.，自然，第227卷(1970)，p680-85所述通过SDS-PAGE测量为至少70kDa。IFNG的分子量范围是大约34-50kDa，因此需要另外的大约20-40kDa以获得所需的效果。例如，可通过2-4个10kDa的PEG分子或者按本文所述提供。
在本发明的偶联物中，优选至少大约50％的所有可偶联的连接基团，例如至少80％且优选所有这些基团被有关非多肽组分占据。因此，在优选的实施方案中，本发明的偶联物包含，例如，1-10个非多肽组分，如2-8个或3-6个。
如上所述，在生理学条件下，IFNG作为二聚体多肽存在。根据本发明，本发明的偶联物的IFNG多肽部分一般是同型二聚体形式(例如，通过缔合按本文所述制备的两个IFNG多肽分子来制备)。然而，如果需要，本发明的偶联物的IFNG多肽部分可以单链形式提供，其中两个IFNG多肽单体可通过肽键或肽接头连接。以单链形式提供IFNG多肽的优势在于两个组分IFNG多肽可以不同，这种不同有利于，例如，允许多肽的不对称诱变。例如，从一个单体的受体结合位点去掉PEG连接位点，但保留另一个单体的位点。因此，在PEG连接后，一个单体具有完整的受体结合位点，而另一个被充分PEG连接(且因此提供显著增大的分子量)。
优选的是，本发明的偶联物具有一个或多个下列改进的特性：1)与huIFNG或rhuIFNG相比增强了功能性体内半寿期，例如，增加了大约至少5倍，例如至少10倍或更高。2)与huIFNG或rhuIFNG相比降低了免疫原性，例如降低了至少25％，例如至少50％，且更优选至少75％。
非多肽组分是糖组分时的本发明偶联物
在本发明偶联物的优选实施方案中，第一非多肽组分是糖组分，例如O-连接的或N-连接的糖组分，且IFNG多肽包含至少一个去掉的和/或至少一个导入的体内糖基化位点。
例如，将体内糖基化位点导入相当于亲本IFNG多肽中被暴露于多肽表面的氨基酸残基占据的位置，优先该氨基酸残基具有超过25％的侧链暴露于溶剂中，特别是超过50％暴露于溶剂中(这些位置在本文的方法部分鉴定)。N-糖基化位点以这样的方式导入，即所述位点的N-残基位于所述位置。类似的是，导入O-糖基化位点以便组成该位点的S或T残基位于所述位置。另外，为了保证有效糖基化，优选体内糖基化位点，特别是N-糖基化位点的N残基或O-糖基化位点的S或T残基位于IFNG多肽的118个N-末端氨基酸残基内，更优选在93个N-末端氨基酸残基内。另外更优选的是，体内糖基化位点导入的位置是只需要一个突变就可产生该位点(即，产生功能性糖基化位点所需的任何其它氨基酸残基已存在于该分子中)。
例如，导致在暴露于IFNG多肽表面且被具有超过25％的侧链暴露于表面(在具有受体分子的结构中)的氨基酸残基占据的位置导入另一N-糖基化位点的取代包括：
Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，
K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，
D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，
K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，S40N+R42S/T，
K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，
D63N，D63N+S65T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，Q67N，Q67N+S69T，
K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，
E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/T，K80N+F82S/T，N85S/T，
S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，
E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，
D102N+N104S/T，L103N+V105S/T，Q106S/T，E119N，E119N+S121T，
P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，A124N+T126S，
K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，K128N+K130S/T，
R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，R131N+Q133S/T，
S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，L135N+R137S/T，
F136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，R139N+A141S/T，
R140N和R140N+S142T，所示的取代相对于具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的huIFNG。S/T表示取代成丝氨酸或苏氨酸残基，优选苏氨酸残基。
导致在暴露于IFNG多肽表面且具有超过50％的侧链暴露于表面(在具有受体分子的结构中)的位置导入另一N-糖基化位点的取代包括：
P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，
G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，
E38N+S40S/T，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，
D62N+Q64S/T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，
E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，
K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，
L103N+V105S/T，Q106S/T，P122N+A124S/T，A123N+K125S/T，A124N，
A124N+T126S，K125N+G127S/T，T126N+K128S/T，G127N+R129S/T，
K128N+K130S/T，R129N+R131S/T，K130N，K130N+S132T，
R131N+Q133S/T，S132N+M134S/T，Q133N+L135S/T，M134N+F136S/T，
L135N+R137S/T，F136N+G138S/T，R137N+R139S/T，G138N+R140S/T，
R139N+A141S/T，R140N和R140N+S142T，所示的取代相对于具有SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列的huIFNG。
导入一个N-糖基化位点时仅需要一个氨基酸突变的那些取代包括
K12S/T，G18S/T，G18N，K37S/T，E38N，M45N，I49N，K61S/T，D63N，
Q67N，V70N，K80S/T，F82N，N85S/T，K87S/T，K94N，S99N，Q106S/T，
E119N，A124N，K130N和R140N，特别是K12S/T，G18N，G18S/T，K37S/T，
E38N，K61S/T，D63N，Q67N，K80S/T，N85S/T，K94N，S99N，Q106S/T，
A124N，K130N，和R140N(具有超过25％的侧链暴露于表面(在不含受体分子的结构中)的位置)，或更优选G18N，E38N，D63N，Q67N，K94N，S99N，A124N，K130N和R140N(在不含受体分子的结构中具有超过50％的侧链暴露于表面)。
从上面所列的取代中，优选选择位于118个N-末端氨基酸残基内的取代，特别是位于93个N-末端氨基酸残基内的取代。
如上所述，除了一个或多个导入的糖基化位点，可从IFNG多肽去掉已有的糖基化位点。例如，导入糖基化位点的任意上述取代可与去掉huIFNG的任意两个天然N-糖基化位点的取代结合。例如，IFNG多肽可包含N25和/或N97的取代，例如，取代N25K/C/D/E和/或N97K/C/D/E的多肽，如果本发明的偶联物包含一个非多肽，则多肽具有相关K，C，D，E作为连接基团。
本发明的偶联物的IFNG多肽部分每个单体可含有单个体内糖基化位点。然而，为了变成足够大小以增加功能性体内半寿期，通常需要该多肽包含一个以上的体内糖基化位点，特别是2-7个体内糖基化位点，例如2，3，4，5，6或7个体内糖基化位点。因此，IFNG多肽的每个单体可包含一个增加的糖基化位点，或者可包含两个，三，四，五，六，七或更多个导入的体内糖基化位点，优选通过一个或多个任意上面所列的取代进行导入。
去掉和/或导入体外糖基化位点可按下面部分对于修饰IFNG多肽以导入和/或去掉聚合物连接位点所述实现。
本部分公开的具有导入和/或去掉至少一个糖基化位点的任意糖基化IFNG多肽可进一步偶联到第二非多肽组分上。例如，第二非多肽组分是聚合物分子，例如PEG，或者可以是任何其它非多肽组分。为达到该目的，通过使用已存在于IFNG多肽中的连接基团可实现该偶联，或者连接基团已被导入和/或去掉，特别是导致总共1-6个，特别是3-4个或者1，2，3，4，5，或6个连接基团可用于偶联。优选的是，在本发明的偶联物中，如果IFNG多肽含有两个糖基化位点，可选择非多肽组分的数目和分子量以便通过非多肽组分增加的总分子量范围为20-40kDa，特别是大约20kDa或30kDa。
具体来说，糖基化的IFNG多肽可偶联到具有半胱氨酸作为连接基团的聚合物上。为达到该目的，可向IFNG多肽中插入一个或多个半胱氨酸残基，例如，如标题为“本发明的偶联物，其中非多肽组分是具有半胱氨酸作为连接基团的分子”的部分所述。
任选或者此外，糖基化的IFNG多肽可偶联到具有赖氨酸作为连接基团的聚合物上。为达到该目的，例如，可通过按标题为“本发明的偶联物，其中非多肽组分是具有赖氨酸作为连接基团的分子”的部分所述的任意取代去掉亲本多肽的一个或多个赖氨酸残基。任选或者此外，例如通过在所述部分提及的任意取代可导入赖氨酸残基。
作为通过半胱氨酸或赖氨酸基团偶联聚合物的另一选择，可通过按标题为“本发明的偶联物，其中非多肽组分结合到酸性基团上”的部分所述的酸性基团，或者通过任何其它合适的基团实现偶联。
本发明的偶联物，其中第一非多肽组分是聚合物
在另一实施方案中，第一非多肽组分是聚合物，例如，在标题为“与聚合物分子的偶联”部分所述的任意聚合物，特别是线性的或分支的PEG分子，例如具有半胱氨酸，赖氨酸，天冬氨酸和谷氨酸作为连接基团的分子。该聚合物连接基团的导入和/或去掉在下面部分说明。根据该实施方案的偶联物的IFNG多肽部分可以是糖基化的多肽，例如，使用huIFNG的一个或两个天然N-糖基化位点或按相邻前一部分所述导入的糖基化位点。
本发明的偶联物，其中非多肽组分是具有半胱氨酸作为连接基团的分子
在优选的实施方案中，第一非多肽组分是具有半胱氨酸作为连接基团的聚合物且将至少一个半胱氨酸残基导入在野生型人类IFNG中被表面暴露的氨基酸残基占据的IFNG多肽的位置中。优选的是，按照在标题为“本发明的偶联物”部分提供的导入和/或去掉非多肽组分的连接基团的一般考虑因素导入半胱氨酸残基。例如，IFNG多肽可包括至少一个选自P3C，K6C，N10C，K13C，N16C，D21C，N25C，G26C，G31C，K34C，K37C，E38C，E39C，K55C，K58C，N59C，D62C，Q64C，S65C，K68C，E71C，E75C，N83C，S84C，K86C，K87C，K94C，N97C，S99C，T101C，D102C，L103C和N104C(导入半胱氨酸残基的位置被具有超过50％的侧链暴露于具有受体的结构表面的氨基酸残基占据)的取代。当IFNG多肽在诸如大肠杆菌的非糖基化宿主细胞中表达时，取代N25C和N97C特别有利，尤其是N25C+N97C，因为N25和N97组成huIFNG的内在糖基化位点的一部分。
另外或任选，根据该实施方案的IFNG多肽可包含在被huIFNG的氨基酸残基121-143的任意残基占据的位置导入至少一个半胱氨酸残基。
优选的是，根据该方面的偶联物的IFNG多肽每个单体包含总数为1-8个，例如2-6个Cys残基，例如1-3个Cys残基。
多肽和聚合物之间的偶联可以任意合适的方式实现，例如，按在标题为“与聚合物分子的偶联”部分所述，例如，使用在所述部分提及的一步法或逐步方式。当偶联物包含两个或多个第一非多肽组分时，正常情况下，这些组分的每个具有5或10kDa的分子量。合适的聚合物是VS-PEG。
本发明的偶联物，其中非多肽部分是具有赖氨酸作为连接基团的分子
根据该实施方案，非多肽是具有赖氨酸作为连接基团的聚合物，且对IFNG多肽的修饰是去掉了至少一个赖氨酸残基，该赖氨酸残基选自K6，K12，K13，K34，K37，K43，K55，K58，K61，K68，K74，K80，K86，K87，K88，K94，K108，K125，K128和K130，编号相对于SEQ ID NO 2作出。更优选的是，去掉至少一个选自K12，K34，K37，K108，K128和K130的赖氨酸残基。从而，可避免该残基的偶联。可用任何其它氨基酸残基取代赖氨酸残基，但优选用精氨酸或谷氨酰胺取代。
另外，可修饰IFNG多肽以导入一个或多个赖氨酸残基，特别是在被表面暴露的氨基酸残基占据的huIFNG的位置。优选的是，按照在标题为“本发明的偶联物”部分提供的导入和/或去掉非多肽组分的连接基团的一般考虑因素导入赖氨酸残基，特别是在被具有至少25％，例如至少50％的侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置(该位置在本文的材料和方法部分鉴定)。另外，经过取代SEQ ID NO 2的氨基酸残基121-143的任意残基可导入至少一个赖氨酸残基。作为选择，IFNG多肽可在至少一个下列位置含有赖氨酸，该位置选自SEQ ID NO 2的D2，E7，E9，H19，D21，D24，N25，E38，E39，D41，R42，D62，D63，E71，E75，D76，R89，D90，D91，E93，N97，R107，H111，E112，E119，R129，R131，R137，R139和R140(huIFNG中被N，R，D，E或H残基占据的位置)。
根据该实施方案，IFNG多肽的每个单体在一个或多个上述位置含有取代，特别是在1-15，例如1-8或2-8，优选在1-5或2-5个位置(赖氨酸残基的取代和/或导入)。例如，IFNG多肽可在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个上述位置含有取代。当IFNG多肽在诸如大肠杆菌的非糖基化宿主细胞中表达时，取代N25K和N97K特别有利，尤其是N25K+N97K，因为N25和N97组成huIFNG的部分内在糖基化位点。
例如，根据该实施方案的偶联物的IFNG多肽可包含至少一个用于导入赖氨酸残基的上述取代结合至少一个如上限定的去掉赖氨酸残基的取代(优选取代成R或Q)。例如，IFNG多肽含有下列取代N25K和N97K的至少一个结合取代K128R，K128Q，K130R和K130Q的至少一个。甚至更具体的说，IFNG多肽包含取代N25K+K128R，N25K+K130R，N25K+K128R+K130R，N97K+K128R，N97K+K130R，N97K+K128R+K130R，N25K+N97K+K128R+K130R，N25K+N97K+K128R和N25K+N97K+K130R。
尽管根据本发明该方面的偶联物的非多肽组分可以是任意分子，当使用给定的偶联方法时该分子具有赖氨酸作为连接基团(例如，糖组分，亲脂性基团或有机物衍生的试剂)，但优选非多肽组分是聚合物分子。聚合物分子可以是在标题为“聚合物分子的偶联”部分提及的任何分子，但优选选自线性或分支聚乙二醇或聚环氧烷。更优选的是，聚合物分子是来自Shearwater聚合物公司的SS-PEG，NPC-PEG，醛-PEG，mPEG-SPA，mPEG-SCM或mPEG-BTC，来自Enzon公司的SC-PEG，US 5,880,255中所述的 tresylatedmPEG或氧羰基-氧-N-二羧酰亚胺-PEG(US 5,122,614)。一般来说，为了与赖氨酸残基偶联，非多肽组分具有大约5或10kDa的分子量。
本发明的偶联物，其中非多肽组分与酸性基团结合
在另一实施方案中，本发明的偶联物的非多肽部分是具有酸性基团作为连接基团的分子，且IFNG多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列区别在于至少一个表面暴露的氨基酸残基被天冬氨酸残基或者谷氨酸残基取代，优选按照在标题为“本发明的偶联物”部分提供的一般考虑因素进行取代。
另外，可将Asp或Glu残基导入亲本IFNG多肽中被K，R，Q或N占据的位置。例如，可用Asp或Glu残基取代N25，N97，K125，K128，R129，K130和/或R131，更优选N25和/或N97，最优选N25+N97。
类似于前面部分所作的描述，可从例如，受体结合位点去掉一个或多个Asp或Glu残基，如果非多肽组分是与这些残基结合的组分。
尽管具有酸性基团作为连接基团的根据本发明该方面的偶联物的非多肽组分可以是具有该特性的任意非多肽组分，但目前优选非多肽组分是聚合物分子或有机衍生试剂，特别是聚合物分子，且偶联物按例如，Sakane和Pardridge，制药学研究，第14卷，第8期，1997，第1085-1091页所述制备。
本发明偶联物的非多肽组分
如上文所述，本发明偶联物的非多肽组分优选选自聚合物分子，亲脂化合物，糖组分(例如通过体内糖基化)和有机衍生试剂。所有这些试剂可赋予偶联物的多肽部分所需的特性，特别是增加功能性体内半寿期和/或降低免疫原性。偶联物的多肽部分一般仅偶联到一种类型的非多肽组分上，但也可偶联到两种或多种不同类型的非多肽组分上，例如，偶联到聚合物分子和糖组分上，偶联到亲脂基团和糖组分上，偶联到有机衍生试剂和糖组分上，偶联到亲脂基团和聚合物分子上等。偶联到两个或多个不同非多肽组分上可同时或依次进行。
制备本发明的偶联物的方法
在以下章节“与亲脂化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与糖组分的偶联”和“与有机衍生试剂的偶联”中，描述与具体类型的非多肽组分的偶联。
与亲脂化合物的偶联
多肽和亲脂化合物可直接或者通过使用接头互相偶联。亲脂化合物可以是天然化合物，例如饱和或不饱和脂肪酸，脂肪酸二酮，萜烯，前列腺素，维生素，类胡萝卜素或类固醇，或者是合成化合物，例如具有一个或多个烷基，芳香基，链烯基或其他多个不饱和化合物的羧酸，醇，胺和磺酸。多肽和亲脂化合物之间任选通过接头的偶联可按照本领域已知的方法进行，例如，Bodanszky在肽的合成，John Wiley，纽约，1976和在WO 96/12505中所述。
与聚合物分子的偶联
与多肽偶联的聚合物分子可以是任意合适的聚合物分子，例如天然或合成同型聚合物或杂聚物，一般具有的分子量范围是300-100,000Da，例如300-20,000Da，更优选500-10,000Da，甚至更优选500-5000Da。
同型聚合物的例子包括多元醇(即poly-OH)，多胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)。杂聚物是一种聚合物，它包含一个或多个不同的偶联基团，例如，羟基和胺基。
合适的聚合物分子的例子包括选自下列分子的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚亚乙基-共-马来酸酐，聚苯乙烯-共-马来酸酐，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，或者适合于降低免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的任何其他生物聚合物。聚合物分子的另一例子是人白蛋白或另一高丰度血浆蛋白。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的，无毒，无抗原性，无免疫原性的，具有不同水溶性特性，且容易从活生物体排泄掉。
PEG是优选的待用聚合物分子，因为它与例如，诸如葡聚糖等的多糖相比仅具有较少的能交联的反应基团。具体来说，单功能性PEG，例如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)是令人感兴趣的，因为其偶联化学相对简单(仅一个反应基团可用于与多肽上的连接基团偶联)。因此，消除了交联的风险，所得的多肽偶联物均一性更好且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。
为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，聚合物分子的羟基末端基团必须以活化形式提供，即，具有反应性官能团(该基团的例子包括伯胺基团，酰肼(HZ)，巯基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)，羧甲基化琥珀酰亚胺(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，醛，硝基苯碳酸酯(NPC)，和 tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子是商业上可获得的，例如从Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA获得。另外，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法活化，例如按WO 90/13540公开的方法。用于本发明的活化的线性或分支聚合物分子的具体例子在Shearwater Polymer，Inc.1997和2000年产品目录(用于研究和制药的功能化生物相容性聚合物，聚乙二醇和衍生物，本文引用以供参考)中描述。活化的PEG聚合物的具体例子包括下列线性PEGs：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分支PEGs，例如PEG2-NHS和在US 5,932,462和US 5,643,575中公开的那些分子，本文引用这两篇文献以供参考。另外，本文作为参考文献引用的下列文献公开了有用的聚合物分子和/或PEG连接的化学性质：US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO95/06058，EP 439,508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921,131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US 5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP 183 503和EP 154 316。
多肽与活化的聚合物分子的偶联经过使用任何常规方法进行，例如按下列文献所述的方法(它们也描述了用于聚合物分子活化的合适方法)：Harris和Zalipsky，编辑，聚(乙二醇)化学和生物学应用，AZC，华盛顿；R.F.Taylor，(1991)，“蛋白质的固定化，基础和应用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白质偶联和交联的化学”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定化的亲和配体技术”，学术出版社，纽约)。技术人员将明白所用的活化方法和/或偶联化学依赖于IFNG多肽的连接基团以及聚合物的官能团(例如，是氨基，羟基，羧基，醛或巯基)。PEG化可针对与多肽上所有可获得的连接基团(即暴露于多肽表面的连接基团)的偶联或者可针对特异性连接基团，例如N-末端氨基(US 5,985,265)。另外，偶联可用一步法或者以逐步方式实现(例如按WO 99/55377所述)。
应明白可设计PEG化以产生对于连接的PEG分子数目，该分子的大小和形式(例如，不论它们是线性的还是分支的)最佳的分子，且其中该分子与该多肽连接。例如，可根据所要达到的效果选择所用的聚合物的分子量。例如，如果偶联的首要目的是实现具有高分子量的偶联(例如，以便降低肾脏清除率)，通常需要偶联尽可能少的高分子量的聚合物分子以获得所需分子量。当需要高度屏蔽表位时，可通过使用足够多数量的低分子量聚合物(例如，具有大约5,000Da的分子量)以有效屏蔽该多肽的所有或大多数表位来获得。例如，可使用2-8个，例如3-6个该聚合物。
仅与蛋白质上的单个连接基团偶联时(如US 5,985,265中所述)，优选线性或分支的聚合物分子具有高分子量，例如，大约20kDa。
一般来说，在能使聚合物的所有可利用的连接基团与聚合物分子反应的条件下进行聚合物偶联。典型的是，活化型聚合物分子与多肽的摩尔比是1000-1，特别是200-1，优选100-1，例如10-1或5-1以便获得最佳反应。然而，也可使用等摩尔比率。
根据本发明还包括通过接头偶联聚合物分子与多肽。合适的接头是技术人员熟知的。优选的例子是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物学化学杂志，252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer等，(1986)，高分子科学和高分子化学杂志，编辑，24，375-378)。
偶联后，按照本领域已知的方法，例如，通过向反应混合物中加入伯胺封闭残余的活化型聚合物分子，并通过合适的方法去除所得的失活型聚合物分子。
与糖组分的偶联
糖组分的偶联可在体内或者体外发生。为了实现经过修饰以导入一个或多个体内糖基化位点(见“本发明的偶联物，其中非多肽组分是糖组分”部分)的具有IFNG活性的多肽的体内糖基化，将编码偶联物的多肽部分的核苷酸序列插入糖基化的真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)，昆虫或动物细胞或者选自转基因植物细胞。另外，当在基因治疗中使用编码本发明的偶联物的多肽部分或本发明的多肽的核苷酸序列时可在人体内实现糖基化。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞，BHK或者HEK细胞，例如HEK293，或昆虫细胞，例如SF9细胞，或者酵母细胞，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichiapastoris或者任何其他合适的糖基化宿主，例如，如下所述。任选的是，经过体内糖基化连接到IFNG多肽上的糖组分可通过使用糖基转移酶，例如，使用Neose，Horsham，PA，USA上市的glycoAdvanceTM技术进一步修饰。从而可以增加，例如表达后糖基化的IFNG多肽的唾液酸化和CHO细胞的体内糖基化。
可使用糖苷与IFNG的氨基酸残基的共价体外偶联来修饰或增加糖组分的数目或特性。根据使用的偶联方式，糖类可连接到a)精氨酸和组氨酸上，b)游离羧基上，c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基上，d)游离羟基，例如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或羟脯氨酸的游离羟基上，e)芳香族残基，例如苯丙氨酸或色氨酸的芳香基上或者f)谷氨酰胺的酰胺基上。这些氨基酸残基组成糖组分的连接基团的例子，可在本发明的偶联物的IFNG多肽中导入和/或去掉该残基。体外偶联的合适方法在例如，WO 87/05330和Aplin等，CRC生物化学的重点回顾，第259-306页，1981中描述。糖组分或PEG与蛋白质和肽结合的Gln-残基的体外偶联可通过转谷氨酰胺酶(TGases)实现，例如，按Sato等，1996，生物化学，35，13072-13080或在EP 725145中所述。
与有机衍生试剂的偶联
经过将多肽的连接基团与有机衍生试剂反应可进行IFNG多肽的共价修饰。合适的衍生试剂和方法是本领域熟知的。例如，最常见的半胱氨酰残基与α-卤代乙酸(和相应的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反应以产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴三氟丙酮，α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸，氯乙酰基磷酸酯，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，对氯汞基苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应衍生化。组氨酰残基经过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应衍生化，因为该试剂对组氨酸侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴化物也是有用的；反应优选在0.1M卡可酸钠中在pH6.0下进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有使赖氨酰残基的电荷逆转的效应。衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯(imidoesters)，例如甲基吡啶亚酰胺(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。精氨酰残基通过与苯基乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮和茚三酮的一种或几种常规试剂反应进行修饰。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团具有高pKa。另外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应可选择性修饰羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R′是不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。
功能性位点的封闭
已报道过多的聚合物偶联可导致偶联聚合物的多肽活性丧失。通过例如，去掉位于功能性位点的连接基团或者通过在偶联前封闭功能性位点消除该问题。后一种策略组成本发明的其他实施方案(第一种策略在上文举例说明，例如经过去掉靠近功能性位点的赖氨酸残基进行)。更具体的说，根据第二种策略，多肽和非多肽组分之间的偶联在能与多肽功能性位点结合的辅助分子封闭IFNG多肽的功能性位点的条件下进行。优选的是，辅助分子是特异性识别多肽的功能性位点的分子，例如受体。另外，辅助分子可以是抗体，特别是识别表现出IFNG活性的多肽的单克隆抗体。具体地说，辅助分子可以是中和单克隆抗体。
实现偶联前使得多肽与辅助分子相互作用。这样保证多肽的功能性位点被屏蔽或保护且随后不能被诸如聚合物的非多肽组分衍生化。其从辅助分子洗脱后，可回收具有至少部分保护的功能性位点的非多肽组分和多肽之间的偶联物。
随后，具有已封闭的功能性位点的多肽与聚合物，亲脂化合物，糖组分，有机衍生试剂或任意其他化合物以正常方式偶联，例如，按标题为“与....偶联”的上述部分所述进行。
在另一实施方案中，辅助分子首先共价偶联到诸如柱填充材料，例如交联葡聚糖或琼脂糖珠的固相上，或者表面上，例如反应器表面。随后，将多肽上样到携带辅助分子的柱材料上且按照本领域已知的方法进行偶联，例如，按标题为“与....偶联”的上述部分所述进行。该方法允许通过洗脱从辅助分子分离多肽偶联物。在不导致多肽偶联物大量降解的物理化学条件下以常规技术洗脱该多肽偶联物。含有多肽偶联物的液相从辅助分子保持其价连接在其上的固相上分离。分离可用其他方式实现：例如，用可被特异性结合剂(例如链霉抗生物素蛋白)识别的第二分子(例如生物素)衍生化辅助分子。特异性结合剂可连接到固相上，从而允许通过在随后洗脱时滞留辅助分子-第二分子复合物而不是多肽偶联物的第二辅助分子固相柱中过柱从辅助分子-第二分子复合物中分离多肽偶联物。可用任何合适的方式从辅助分子释放多肽偶联物。通过提供辅助分子从其结合的IFNG功能性位点解离的条件实现去保护。例如，偶联聚合物的抗体与抗独特型抗体之间的复合物可通过将pH调到酸性或碱性pH来解离。
标记多肽的偶联
在另一实施方案中，以具有标记，即一般由1-30个，例如1-20个氨基酸残基组成的一个氨基酸序列或肽链的融合蛋白表达IFNG多肽。除了允许快速和容易地纯化外，标记是实现标记的IFNG多肽与非多肽组分之间的偶联的一种常规工具。具体地说，标记可用于在通过标记固定化标记多肽的微量滴定板或其他载体，例如，顺磁珠上实现偶联。在例如微量滴定板中偶联标记的IFNG多肽的优势在于标记的多肽可直接分离于培养基在微量滴定板中固定化(原则上不需任何纯化)和进行偶联。因此，减少了加工步骤(从表达到偶联)的总数。另外，标记可充当间隔分子以保证提高用于偶联的固定化多肽的可用性。使用标记的多肽可偶联到本文公开的任意非多肽组分上，例如，偶联到诸如PEG的聚合物分子上。
使用的特异性标记的同一性并不重要，只要该标记能与多肽一起表达且能被固定化在合适的表面或载体材料上。许多合适的标记是商业上可获得的，例如从丹麦，Unizyme实验室获得。例如，标记可以是任意下列序列：
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln(都可从丹麦，Unizyme实验室获得)或者任意下列序列：
EQKLI SEEDL(分子细胞生物学，5：3610-16，1985中描述的C-末端标记)
DYKDDDDK(C-或N-末端标记)
YPYDVPDYA
抗上述标记的抗体是商业上可获得的，例如，从ADI，Aves Lab andResearch Diagnostics获得。
标记的多肽用于PEG连接的常规方法在下面材料和方法部分给出。
随后通过使用商业上可获得的酶可实现从多肽裂解标记。
本发明的多肽
在另一方面，本发明一般涉及本文公开的新型IFNG多肽。该新型多肽是制备本发明的偶联物的重要中间化合物。另外，该多肽本身具有令人感兴趣的特性。
例如，新型IFNG多肽包含至少一个在本申请前面部分更详细描述的对表面暴露的氨基酸残基K，R，D，E，C，S，T或N的取代。
制备IFNG多肽的方法
以本领域已知的任何合适的方法可生产IFNG多肽，任选以糖基化形式生产。该方法包括构建编码该多肽的核苷酸序列并在合适的转化或转染的宿主细胞中表达该序列。然而，尽管效率不高，经过化学合成或化学合成的组合或者化学合成与重组DNA技术的组合也可生产本发明的多肽。
经过分离或合成编码亲本IFNG，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的huIFNG的核苷酸序列，然后改变核苷酸序列以实现有关氨基酸残基的导入(即插入或取代)或缺失(即去掉或取代)可构建编码IFNG多肽(以单体或单链形式)的本发明的核苷酸序列。
按照熟知的方法，参见例如，Mark等，“人成纤维细胞干扰素基因的定点诱变”，美国国家科学院院报，81，第5662-66页(1984)；和US 4,588,585的方法经过定点诱变可常规修饰核苷酸序列。
或者，经过化学合成可制备核苷酸序列，例如，经过使用寡核苷酸合成仪，其中根据目的多肽的氨基酸序列设计寡核苷酸，且优选选择那些在生产该重组多肽的宿主细胞中有利的密码子。例如，经过PCR，连接或者连接链反应(LCR)可合成和组装编码目的多肽之部分的一些小寡核苷酸。单个寡核苷酸一般含有用于互补组装的5’或3’突出端。
一旦组装(经过合成，定点诱变或另一方法)，编码多肽的核苷酸序列可插入重组载体且与在所需转化宿主细胞中表达IFNG所必需的调控序列可操作地连接。
当然应明白为了表达编码本文所述的IFNG多肽的核苷酸序列，并不是所有的载体和表达调控序列都能同样较好地发挥功能。也不是所有的宿主用同一表达系统都能同样较好地发挥功能。然而，本领域的技术人员在这些载体，表达调控序列和宿主中不需过多的实验就可作出选择。例如，在选择载体时，必须考虑到宿主，因为载体必须在宿主中复制或者能整合进染色体中。还应考虑载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力，和由该载体编码的任何其他蛋白质，例如抗生素标记的表达。在表达调控序列的选择中，也应考虑各种因素。这些包括，例如，序列的相对长度，其调控能力，其与编码多肽的核苷酸序列的相容性，特别是要考虑到潜在的二级结构。宿主的选择应考虑到其与选定载体的相容性，该核苷酸序列编码的产物的毒性，其分泌特征，其正确折叠多肽的能力，其发酵或培养要求，和该核苷酸序列编码的产物的纯化简便性。
重组载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒。作为选择，载体是导入宿主细胞时整合进宿主细胞基因组且与其整合进的染色体一起复制的载体。
该载体优选是一种表达载体，其中编码IFNG多肽的核苷酸序列可操作地连接到该核苷酸序列转录所需的其他片断上。该载体一般从质粒或病毒DNA衍生。本文提及的用于在宿主细胞中表达的许多合适的表达载体是商业上可获得的或在文献中描述的。用于真核宿主的有用的表达载体包括，例如，含有来自SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。具体载体是，例如，pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jola，CA，USA)。用于细菌宿主的有用表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(两者都来自Novagen Inc.，WI，USA)，广谱宿主范围的质粒，例如RP4，噬菌体DNAs，例如，λ噬菌体的众多衍生物，如NM989，和其他DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。酵母细胞的有用的表达载体包括2μ质粒及其衍生物，POT1载体(US4,931,373)，在(Okkels，纽约科学院年报，782，202-207，1996)中所述的pJSO37载体和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。用于昆虫细胞的有用的载体包括pVL941，pBG311(Cate等，“牛和人Mullerian抑制物质基因的分离和在动物细胞中表达人基因”，细胞，45，第685-98页(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(两者都可从Invitrogen获得)。
用于本发明的其他载体包括允许编码IFNG多肽的核苷酸序列以拷贝数扩增的那些载体。这些可扩增的载体是本领域熟知的。它们包括，例如，能经过DHFR扩增(参见，例如Kaufman，美国专利号4,470,461，Kaufman和Sharp，“模块二氢叶酸还原酶cDNA基因的构建：用于有效表达的信号分析”，分子细胞生物学，2，第1304-19页(1982))和谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增(参见，例如，US 5,122,464和EP 338,841)被扩增的载体。
重组载体可进一步包含能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。该序列的一个例子(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起点。当宿主细胞是酵母细胞时，能使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ复制基因REP 1-3和复制起点。
载体也可包含一个选择标记，例如其产物补充宿主细胞缺陷的基因，例如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的TPI基因(P.R.Russell，基因，40，1985，第125-130页所述)，或者，提供对药物，例如氨苄青霉素，卡那霉素，四环素，氯霉素，新霉素，潮霉素，或氨甲蝶呤抗性的基因。对于丝状真菌，选择标记包括 amdS，pyrG，arcB， niaD， sC。
本文定义的术语“调控序列”包括表达IFNG多肽必须的或者有利的所有元件。各调控序列可以是天然的或者相对于编码该多肽的核酸序列是外源的。该调控序列包括，但不限于前导序列，多聚腺苷化序列，前肽序列，启动子，增强子或上游活化序列，信号肽序列，和转录终止子。最少，调控序列包括启动子。
本发明可使用各种各样的表达调控序列。这种有用的表达调控序列包括与上述表达载体的结构基因相联系的表达调控序列以及已知控制原核或真核细胞或其病毒基因表达的任意序列，及其各种组合。
用于指导哺乳动物细胞中的转录的合适的调控序列的例子包括SV40和腺病毒的早期和晚期启动子，例如，腺病毒2主要晚期启动子，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子，人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)，人延伸因子1α(EF-1α)启动子，果蝇属最小型热休克蛋白70启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，人遍在蛋白质C(UbC)启动子，人生长激素终止子，SV40或腺病毒Elb区域多聚腺苷化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.，分子生物学杂志，1987年8月20日；196(4)：947-50)。
为了提高在哺乳动物细胞中的表达，可将合成的内含子插入编码IFNG多肽的核苷酸序列的5’非翻译区。合成内含子的例子是来自质粒pCI-Neo(可从Promega Corporation，WI，USA获得)的合成内含子。
用于指导在昆虫细胞中转录的合适的调控序列的例子包括多角体蛋白启动子，P10启动子，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动子，杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟-早期基因启动子，和SV40多聚腺苷化序列。
用于酵母宿主细胞的合适调控序列的例子包括酵母α-交配系统的启动子，酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子，来自酵母糖酵解基因或乙醇脱氢酶基因的启动子，ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。
用于丝状真菌宿主细胞的合适的调控序列的例子包括ADH3启动子和终止子，来自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶，黑色曲霉(A.niger)α-淀粉酶，黑色曲霉或构巢曲霉(A.nidulans)葡糖淀粉酶，构巢曲霉乙酰胺酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂酶基因的启动子，TPI1终止子和ADH3终止子。
用于细菌宿主细胞的合适的调控序列的例子包括lac系统，trp系统，TAC或TRC系统的启动子，λ噬菌体的主要启动子区域。
本发明的核苷酸序列，不论是以定点诱变，合成还是以其它方法制备，都可以包含或者不含编码信号肽的核苷酸序列。当多肽需要从表达它的细胞中分泌时存在信号肽。如果存在的话，该信号肽应是可被选择表达该多肽的细胞识别的信号肽。信号肽可以是与该多肽同源的(例如一般与huIFNG相联)或异源的(即来自不同于huIFNG的另一来源)或者可以与宿主细胞是同源的或异源的，即从该宿主细胞正常表达的信号肽或一般不从该宿主细胞表达的信号肽。因此，信号肽可以是原核的，例如来自诸如大肠杆菌的细菌，或者可以是真核的，例如来自哺乳动物，或昆虫或酵母细胞。
信号肽是否存在依赖于，例如用于生产该多肽的表达宿主细胞，所要表达的蛋白质(是细胞内还是细胞外蛋白)和是否需要获得分泌。为了用于丝状真菌，信号肽可方便地来自于编码曲霉属种类淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码Rhizomucor miehei脂酶或蛋白酶或者Humicola lanuginosa脂酶的基因。信号肽优选来自编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸稳定淀粉酶，或者黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。为了用于昆虫细胞，信号肽可方便地来自于昆虫基因(参见WO 90/05783)，例如鳞翅目昆虫的烟草天蛾(Manduca sexta)脂动激素前体(参见US 5,023,328)，蜜蜂的蜂毒肽(Invitrogen)，蜕皮甾类UDP葡萄糖基转移酶(egt)(Murphy等，蛋白质表达和纯化，4，349-357(1993))或人胰腺脂酶(hpl)(酶学方法，284，第262-272页，1997)。
用于哺乳动物细胞的优选信号肽是huIFNG的信号肽或鼠Igκ轻链信号肽(Coloma，M(1992)，免疫学方法杂志，152：89-104)。为了用于酵母细胞，已发现合适的信号肽是来自啤酒糖酵母α-因子的信号肽(参见US 4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见O.Hagenbuchle等，自然，289，1981，第643-646页)，修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等，细胞，48，1987，第887-897页)，酵母 BAR1信号肽(参见WO 87/02670)，和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等，酵母6，1990，第127-137页)。
可使用任何合适的宿主来生产IFNG多肽，包括细菌，真菌(包括酵母)，植物，昆虫，哺乳动物，或其它合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的例子包括革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌属菌株，例如，短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌，假单胞菌属或链霉菌属，或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌的菌株。例如，经过原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学，168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，细菌学杂志，81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志，56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技术，6：742-751)，或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志，169：5771-5278)可实现将载体导入细菌宿主细胞。
合适的丝状真菌宿主细胞的例子包括曲霉属的菌株，例如米曲霉，黑色曲霉，或构巢曲霉，镰孢属或木霉属。经过包括原生质体形成，原生质体转化，和细胞壁再生的方法以本身已知的方式可转化真菌细胞。转化曲霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和US 5,679,543中描述。转化镰孢属种类的合适方法由Malardier等，1989，基因，78：147-156和WO 96/00787描述。使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编辑，酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法，第194卷，第182-187页，纽约学术出版公司；Ito等，1983，细菌学杂志，153：163；和Hinnen等，1978，美国国家科学院院报，75：1920所述的方法可转化酵母。
合适的酵母宿主细胞的例子包括酵母属菌株，例如，啤酒糖酵母，裂殖糖酵母属，克鲁维氏酵母属，毕赤氏酵母属，例如巴斯德毕赤氏酵母或P.Methanolica，汉逊氏酵母属，例如多形汉逊氏酵母，或者Yarrowia。用异源性DNA转化酵母细胞并从中生产异源性多肽的方法由Clontech实验室公司，Palo Alto，CA，USA(在YeastmakerTM酵母转化系统试剂盒的产品说明中)，和由Reeves等，FEMS Microbiology Letters，99，(1992)193-198，Manivasakam和Schiestl，Nucleic Acids Research，1993，Vol.21，No.18，第4414-4415页和Ganeva等，FEMS Microbiology Letters 121(1994)159-164公开。
合适的昆虫宿主细胞的例子包括鳞翅目细胞系，例如草地贪夜蛾(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾细胞(High Five)(US 5,077,214)。昆虫细胞的转化和异源性多肽在其中的生产可按Invitrogen所述进行。
合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，(例如CHO-K1；ATCC CCL-61)，绿猴细胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)，COS 7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(例如NS/O)，幼小仓鼠肾(BHK)细胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)，和人细胞(例如，HEK 293(ATCC CRL-1573))，以及组织培养物中的植物细胞。其它合适的细胞系是本领域已知的且可从公共保藏单位获得，例如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。另外，可修饰诸如CHO细胞的哺乳动物细胞以表达唾液酸转移酶，例如，1，6-唾液酸转移酶，例如，按US 5,047,335所述，以便提高IFNG多肽的糖基化。
将外源性DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染，电穿孔，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染，病毒载体和生命技术有限公司，Paisley，UK所述使用Lipofectamin 2000的转染方法。这些方法是本领域熟知的且由例如Ausbel等(编)，1996，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，USA进行了描述。哺乳动物细胞的培养按照已建立的方法进行，例如在(Animal Cell Biotechnology，Methods andProtocols，Nigel Jenkins编辑，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USAand Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture，CambridgeUniversity Press 1997)中公开的方法。
为了产生糖基化多肽，优选使用真核宿主细胞，例如上述类型的真核宿主细胞。
在本发明的生产方法中，在适合于生产该多肽的营养培养基中使用本领域已知的方法培养细胞。例如，可通过摇瓶培养，在实验室或工业发酵罐中在合适培养基中和在允许多肽表达和/或分离的条件下进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，流加，或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在含有碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从供应商获得或可根据公开的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌进营养培养基中，可直接从培养基回收该多肽。如果多肽不分泌，可从细胞裂解产物中回收。
可用本领域已知的方法回收所得的多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发，或沉淀从营养培养基回收该多肽。
所述多肽可以用本领域已知的各种方法，包括但不限于，色谱法(例如，离子交换，亲和，疏水，色谱聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦)，不同溶解性(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE，或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)来纯化。表现出IFNG活性的多肽的具体纯化方法在EP110044和未审日本专利申请号186995/84中公开。
可用本领域已知的任何合适的方法测定IFNG多肽的生物学活性。该测定法包括对抗病毒活性的抗体中和，对蛋白激酶，寡聚腺苷酸2，5-A合成酶或磷酸二酯酶活性的诱导，如EP 41313 B1所述。该测定法还包括免疫调制测定法(参见，例如，US4,753,795)，生长抑制测定法，和测量与表达干扰素受体的细胞的结合。具体测定法在本文材料和方法部分描述。
另外，本发明涉及治疗特别是间质肺疾病，但也包括肉芽肿疾病，癌症，感染，骨疾病(例如，骨代谢病，如恶性骨硬化病)和自体免疫疾病，如类风湿性关节炎的改进方法，主要优势在于用药次数和/或侵入性更小，治疗更有效，且任选与治疗活性化合物的免疫反应风险更低。
本发明的偶联物优选在包含药用上可接受的载体或赋形剂的组合物中用药。“药用上可接受的”是指载体或赋形剂在施用它的病人中不引起任何不幸效果。该药用上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的(Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjacr and L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis[2000]；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press[2000])。
本发明的偶联物可“照现在的样子”和/或以其盐形式使用。合适的盐包括但不限于，具有碱金属或碱土金属，例如钠，钾，钙和镁的盐以及例如锌盐。这些盐或复合物可作为结晶和/或无定形结构存在。
本发明的偶联物以大约相似于在用诸如Actimmune的IFNG的已知商业制剂的疗法中所用的或者按EP 795332中限定的剂量用药。用药的精确剂量依赖于具体情况。一般来说，该剂量应能够防止或减轻所要治疗的症状或适应征的严重性或传播。对本领域的技术人员而言显而易见的是本发明的偶联物或组合物的有效量依赖于，特别是疾病，剂量，用药计划，多肽或偶联物或组合物是单独还是与其它治疗剂结合用药，组合物的血清半寿期，和病人的总体健康状态。
本发明还涉及使用a)含有共价连接到IFNG多肽上的至少一个非多肽组分，IFNG多肽选自huIFNG，rhuIFNG或本文所述的IFNG多肽(即偶联物是本发明的偶联物)或b)本发明的药用组合物生产用于治疗间质肺疾病，癌症，感染，骨疾病(例如，骨代谢病，如恶性骨硬化病)和/或炎症性疾病，特别是间质肺疾病，更具体的说是特发性肺纤维变性的药物，药用组合物或分部的试剂盒。也可包括诸如强的松龙的糖皮质激素。优选的剂量是每千克病人体重每剂量的多肽成分为1-4微克，更优选2-3微克。优选的剂量是每千克病人体重每剂量100-350微克，更优选100-150微克糖皮质激素。
还公开了传递任选还含有糖皮质激素的分子或制剂的改进方法。
本发明还涉及适用于治疗间质肺疾病的分部的试剂盒，它包含含有上述活性成分a)或b)的第一药用组合物和含有至少一种糖皮质激素的第二药用组合物，每种组合物任选与药用上可接受的载体和/或赋形剂一起。
本发明的偶联物可用熟知的方法配制成药用组合物。合适的配制剂由E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences和US 5,183,746描述。
以包括液体，凝胶，冻干品，粉末，压缩固体，或任何其它合适形式的各种形式可配制药用组合物。优选的形式依赖于所治疗的具体适应征且对本领域的技术人员而言是显而易见的。
可通过口服，皮下，静脉内，大脑内，鼻内，经皮肤，腹膜内，肌肉内，肺内，阴道内，直肠，眼内或任何其它可接受的方式，例如使用PowderJect或ProLease技术施用该药用组合物。尽管使用本领域熟知的技术，例如泵或植入进行大丸药注射是可接受的，但该配制剂可通过输注连续用药。在某些情况下配制剂可作为溶液或喷雾剂直接应用。优选的用药方式依赖于所治疗的具体适应征且对本领域的技术人员而言是显而易见的。
可结合其它治疗剂施用本发明的药用组合物。这些试剂可作为同一药用组合物的部分掺入或者可同时或按照任何其它可接受的治疗程序与本发明的多肽或偶联物分开用药。另外，本发明的多肽，偶联物或药用组合物可用作其它疗法的附加。特别是考虑与EP 795332所述的糖皮质激素组合。
非胃肠道给药剂(Parentals)
药物组合物的实例是设计成非肠道给药的溶液剂。尽管在很多情况下，药物溶液剂可以以适用于立即使用的液体制剂形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。
在非胃肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，如通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合来制备，赋形剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围中。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)盐缓冲剂(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸(paraben)甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物、苯亚甲基卤化物(如苯亚甲基氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以其它组分的相对量计算。
稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。
可以存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽来避免搅拌诱导的聚集，其也允许配方剂暴露于剪切表面压力而没有引起多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温20、吐温80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)和共溶剂。活性组分也可以被包裹在制备的微囊中，例如通过coascervation技术或通过界面聚合制备的，例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在胶体状药物释放体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包裹在大乳剂中。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(同上)中公开了这些技术。
体内给药所使用的非胃肠道制剂必须是灭菌的。该过程容易完成，例如，通过无菌滤膜来过滤。
持续释放制剂
持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物半渗透材料、具有合适形式如膜或微囊的材料。持续释放材料的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技术或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如长达或超过100天，某些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。包囊中的多肽长时间保留在体内时，它们因在37℃潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致丧失生物活性并且可能改变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基、冻干酸性溶液、控制含湿量、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物型组合物来达到稳定。
口服用药
对于口服用药，药用组合物可以是固体或液体形式，例如，以胶囊，片剂，悬液，乳剂或溶液的形式。药用组合物优选以含有给定量活性成分的剂量单位的形式制备。用于人或其它哺乳动物的合适的每日剂量可根据病人的情况和其它因素大幅度变化，但本领域的技术人员可使用常规方法测定。
口服用药的固体剂型可包括胶囊，片剂，栓剂，粉末和颗粒。在该固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖，乳糖或淀粉混合。该剂型也可包括，如正常实践中的添加物质，例如润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊，片剂和丸剂，剂型也可包括缓冲剂。片剂和丸剂还可用肠衣制备。
偶联物可与诸如乳糖，蔗糖，淀粉粉末，链烷酸的纤维素酯，硬脂酸，滑石，硬脂酸镁，氧化镁，磷酸和硫酸的钠和钙盐，阿拉伯胶，明胶，藻酸钠，聚乙烯-吡咯烷，和/或聚乙烯醇的佐剂混合，并作成片剂或包成胶囊用于常规用药。作为选择，它们可溶于盐水，水，聚乙二醇，丙二醇，乙醇，油类(例如玉米油，花生油，棉子油或芝麻油)，黄芪胶，和/或各种缓冲液中。其它佐剂和用药方式是制药领域熟知的。载体或稀释剂可包括时间延迟材料，例如单独或与蜡一起的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者本领域熟知的其它材料。
可对药用组合物进行诸如灭菌的常规制药操作和/或药用组合物可含有常规佐剂，例如防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，缓冲液，填充物，等，例如，如在本文别处所述。
口服用药的液体剂型可包括含有诸如水的本领域常用的惰性稀释剂的药用上可接受的乳剂，溶液，悬液，糖浆和酏剂。该组合物也可佐剂，例如润湿剂，甜味剂，调味剂和香味剂。
局部用药
适用于局部用药的配制剂包括适合于穿透皮肤的液态或半液态制剂(例如，擦剂，洗剂，软膏，乳膏，或糊剂)和适合于眼，耳或者鼻给药的滴剂。
肺部递送
适合于用喷射或者超声喷雾器使用的配制剂一般包含以，例如每mL溶液大约0.01到25mg偶联物，优选大约0.1到10mg/mL的浓度溶于水中的多肽或偶联物。配制剂也可包括缓冲液和普通糖类(例如，用于蛋白质稳定化和渗透压调节)，和/或浓度范围从0.1到10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的缓冲液的例子是乙酸钠，柠檬酸盐和甘氨酸。优选的是，缓冲液具有适合于将溶液调到pH为3至9范围的组成成分和摩尔浓度。一般来说，从1mM到50mM的缓冲液摩尔浓度适合于该目的。可使用的糖类的例子是乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，和木糖，通常的含量范围是配制剂重量的1％到10％。
喷雾配制剂也可含有表面活性剂以降低或防止在形成气溶胶时由溶液的雾化引起的表面诱导的蛋白质聚集。可使用各种常规表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其含量范围一般为配制剂重量的0.001％和4％之间。用于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯。
具体配制剂和产生合适分散的本发明的液体颗粒的方法在WO94/20069，US 5,915,378，US 5,960,792，US 5,957,124，US 5,934,272，US 5,915,378，US 5,855,564，US 5,826,570和US 5,522,385中描述，在此引用以供参考。
与带有剂量刻度的吸入器装置一起使用的配制剂一般包含精细区分的粉末。该粉末可通过冻干并然后磨制液体偶联物配制剂来生产且也可含有稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)。一般来说，加入超过0.5％(w/w)的HAS。另外，如果需要可向制剂中加入一种或多种糖或糖醇。其例子包括乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，山梨糖，海藻糖，木糖醇，和木糖。加入配制剂中的该偶联物的量的范围从大约0.01到200％(w/w)，优选从大约1到50％。然后冻干该配制剂并磨制成所需的颗粒大小。
然后将合适大小的颗粒借助于表面活性剂悬浮于推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如含氯氟烃，hydrochlorofluorocarbon，hydrofluorocarbon，或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。然后将该混合物装入递送装置中。适用于本发明的商业上可获得的测定剂量的吸入器例子是由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C生产的Ventolin测定剂量的吸入器。
用于粉末吸入器的配制剂包含含有偶联物的精细区分的干粉且也可包括膨胀剂，例如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇，其含量可帮助粉末从装置中散布，例如，占配制剂重量的50％到90％。粉末的颗粒在肺中应具有空气动力学特性，相应于具有大约1g/cm2密度的颗粒，具有小于10微米的平均直径，优选在0.5和5微米之间，最优选在1.5和3.5微米之间。根据本文的教导适用的粉末吸入器的例子是由Fisons Corp.，Bedford，Mass生产的Spinhaler粉末吸入器。
以US 5,997,848，US 5,993,783，US 5,985,248，US 5,976574，US 5,922,354，US 5,785,049和US 5,654,007公开的方法可产生和/或递送这些装置中的粉末。
设计用于治疗产品的肺部递送的机械装置包括但不限于喷雾器，测定剂量的吸入器，和粉末吸入器，所有这些都是本领域的技术人员所熟悉的。适用于本发明实践的商业上可获得的装置的具体例子是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生产的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生产的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，North Carolina生产的Ventolin测定剂量的吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts生产的Spinhaler粉末吸入器；Inhale TherapeuticSystems，Inc.，San Carlos，California的“standing cloud”装置；Alkermes，Cambridge，Massachusetts生产的AIR吸入器；和Aradigm Corporation，Hayward，California生产的AERx肺部药物递送系统。
本发明提供了用于治疗细菌和病毒感染，癌症或肿瘤，间质肺疾病，例如特发性肺纤维变性，肉芽肿疾病，骨病(例如，骨代谢病，例如恶性骨硬化病)和自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎的组合物和方法。
在另一方面，本发明涉及治疗具有抗huIFNG或rhuIFNG的循环抗体的哺乳动物的方法，该方法包括施用具有IFNG生物活性且不与所述抗体反应的化合物。该化合物优选是本文所述的偶联物且哺乳动物优选是人类。所要治疗的哺乳动物可患有IFNG用作治疗剂的任何上述疾病。另外，本发明涉及制备用于治疗具有抗huIFNG或rhuIFNG循环抗体的哺乳动物的药物产品的方法，其中具有IFNG生物活性且不与其反应的化合物配制成可注射的或其它合适的配制剂。术语“循环抗体”是指在哺乳动物中相应于用任何商业上可获得的IFNG制剂进行治疗而形成的自体抗体。
另外还包含编码本发明的IFNG多肽的核苷酸序列在基因治疗应用中的用途。具体地说，令人感兴趣的是使用编码上文标题为“修饰掺入其它糖基化位点的本发明的糖基化多肽”的部分所述的IFNG多肽的核苷酸序列。因此在基因治疗的过程中，即在人体中表达该核苷酸序列后实现多肽的糖基化。
涉及的基因治疗应用包括治疗预期该多肽可提供有效治疗的那些疾病。
使用基因疗法的IFNG的局部递送可提供针对靶区域的治疗剂而避免与非特异性用药相联系的潜在毒性问题。
体外和体内基因治疗方法都是所涉及的。
向确定的细胞群体转移潜在的治疗性基因的一些方法是已知的。对于进一步的参考文献，可参见例如，Mulligan，“The Basic Science Of GeneTherapy”，Science，260，第926-31页(1993)。这些方法包括：
直接基因转移，例如按Wolff等，“Direct Gene transfer Into MouseMuscle In vivo”，Science 247，第1465-68页(1990)所述；
脂质体介导的DNA转移，例如按Caplen等，“Liposome-mediated CFTRGene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”，NatureMed.，3，第39-46页(1995)；Crystal，“The Gene As A Drug”，Nature Med.，1，第15-17(1995)；Gao and Huang，“A Novel Cationic Liposome Reagent ForEfficient Transfection of Mammalian Cells”，Biochem.Biophys Res.Comm.，179，第280-85页(1991)所述；
逆转录病毒介导的DNA转移，例如按Kay等，“In vivo Gene Therapy ofHemophilia B：Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs”，Science，262，第117-19页(1993)；Anderson，“Human Gene Therapy”，Science，256，第808-13页(1992)所述；
DNA病毒介导的DNA转移。这种DNA病毒包括腺病毒(优选基于Ad-2或Ad-5的载体)，疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)，和细小病毒属(优选基于“缺陷型”或非自主型细小病毒的载体，更优选基于腺伴随病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。参见例如，Ali等，“The Use OfDNA Viruses as Vectors for Gene Therapy”，Gene Therapy，1，第367-84页(1994)；US 4,797,368，和US 5,139,941。
在下面实施例中进一步描述本发明。该实施例不应以任何方式理解为对本说明书和权利要求书范围的限制。
材料和方法
试验
干扰素试验概述
以前已经公开了IFNG在HeLa细胞中与IFNG受体相互作用并激活该受体。随后，在含有干扰素刺激反应元件(ISRE)的启动子处激活转录。因此通过在HeLa细胞中使用与萤光素酶受体基因偶联的ISRE(ISRE-luc)可筛选干扰素受体的激动剂。
主要试验
用ISRE-Luc和pCDNA 3.1/hygro共转染HeLa细胞，经过在含有潮霉素B的DMEM培养基中选择可建立转化灶(细胞克隆)。在存在或不存在IFNG的条件下筛选细胞克隆的萤光素酶活性。显示出刺激与未刺激的萤光素酶活性比率最高的那些克隆用于进一步的试验。
为了筛选突变蛋白，在96孔培养板中接种15,000个细胞/孔并在DMEM培养基中培养过夜。在第二天以各种浓度向细胞中加入突变蛋白以及已知的标准品。平板在37℃下在5％CO2的空气中培养6小时。随后向各孔中加入LucLite底物(Packard Bioscience，Groningen The Netherlands)。密封平板并在TopCount发光计(Packard)中以SPC(单光子计数)方式测量发光。每个平板含有用IFNG培养的孔作为刺激对照且其它孔含有正常培养基作为未刺激对照。刺激的和未刺激的萤光素酶活性的比率用作突变蛋白活性和实验间误差的内在标准。
IFNG偶联物的功能性体内半寿期
按文献中所述的许多方式可实现生物学半寿期的测量。Rutenfranz等(J.Interferon Res.1990，vol.10，p.337-341)描述了一种方法，他们对8周龄的C57BL/6小鼠静脉内和肌肉内注射IFNG。通过使用Hep-2细胞和水疱性口炎病毒(VVS)在鼠血清中测定IFNG滴度的生物学试验测量生物学半寿期。作为选择，他们也使用ELISA检测血清中的IFNG水平。
作为选择，放射性标记的IFNG可用于研究IFNG的皮下吸收和局部分布。Croos和Roberts(J.Pharm.，1993，vol 45，p.606-609)在麻醉的雌性Spraque-Dawley大鼠中对125IFNG进行了试验。皮下给药后，收集血液和组织样品且通过γ-计数测定IFNG的量。
IFNG的PEG化
按US 5,109,120的实施例2所述可制备PEG化的rhuIFNG。同样，也可PEG化本文所述的修饰的IFNG多肽，例如携带突变N25K的多肽。所得的PEG-IFNG-N25K偶联物与rhuIFNG的偶联物相比另外还连接上一个PEG分子。
药用组合物的制备
按照本领域的技术人员熟知的方法以每小瓶容纳含50，100，200，300，400或500微克rhuIFNG或IFNG-N25K的偶联物的方式将本发明的有关纯化的偶联物配制成可注射的组合物，从而制备，例如用于治疗间质肺疾病的药用组合物。
表面暴露的氨基酸残基的鉴定
结构
以X-射线晶体学测定的huIFNG的实验三维结构已由：Ealick等，Science252：698-702(1991)报道，它报道了IFNG同型二聚体的C-α轨迹(trace)。Walter等，Nature 376：230-235(1995)报道了与两分子可溶性IFNG受体复合的IFNG同型二聚体的结构。该结构的座标从未公开过。Thiel等，Structure8：927-936(2000)报道了与两分子可溶性IFNG受体复合的IFNG同型二聚体的结构，在该结构中第三个受体分子不与IFNG同型二聚体发生相互作用。
方法
可接近的表面区域(ASA)
用计算机程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)计算该结构中各原子的可接近的表面区域(ASA)。该方法一般使用1.4的探针大小且将可接近的表面区域(ASA)定义为由探针中心形成的区域。计算前，从坐标系(coordinate set)中去掉与该蛋白质不直接相关的所有水分子，氢原子和其它原子。
侧链的分部ASA
通过用在延伸的ALA-x-ALA三肽中代表该残基类型侧链原子的ASA值除侧链中该原子的ASA总和来计算侧链原子的分部ASA。参见Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.：220，507-530。在该实施例中，将CA原子视为甘氨酸残基侧链的一部分但不视为其它残基的一部分。下表用作侧链的标准100％ASA：
Ala    69.23A2
Arg    200.35A2
Asn    106.25A2
Asp    102.06A2
Cys    96.69A2
Gln    140.58A2
Glu    134.61A2
Gly    32.28A2
His    147.00A2
Ile    137.91A2
Leu    140.76A2
Lys    162.50A2
Met    156.08A2
Phe    163.90A2
Pro    119.65A2
Ser    78.16A2
Thr    101.67A2
Trp    210.89A2
Tyr    176.61A2
Val    114.14A2
在该结构中未检测到的残基定义为100％暴露，因为据认为它们在弹性区域。
测定原子间的距离：
使用分子图形软件，例如InsightII v.98.0，MSI INC测定原子间的距离。
测定受体结合位点：
受体结合位点定义为能通过受体结合而改变它们的可接近的表面区域的所有残基。这通过至少两个ASA计算来测定：一个在配体/受体复合物的分离配体上，一个在完整的配体/受体复合物上。
结果
所用的X-射线结构是Thiel等，Structure 8：927-936(2000)报道的与两分子可溶性IFNG受体复合的IFNG同型-二聚体的结构且在该结构中第三个IFNG受体分子不与IFNG同型二聚体发生相互作用。该结构由IFNG同型二聚体组成，其中两个分子是标记的A和B。为达到构建目的，在标记M0的IFNG序列前放置另一个甲硫氨酸且该序列在C-末端截短10个残基(Q133是所构建的分子中的最后一个残基)。在该实施例的所有计算中从结构中去掉M0。两个IFNG单体的结构在残基120之后具有极弱的电子密度且各残基仅仅是模拟的(modeled)，直到残基T126。因此，在该实施例中计算前从该结构中去掉残基S121-T126。C和D标记的两个受体片断可与IFNG同型二聚体发生直接相互作用，E标记的第三受体分子与IFNG同型二聚体不接触且不包括在这些计算中。
表面暴露：
对不含M0和S121-T126的分子A和B的同型二聚体进行分部ASA计算，结果在至少一个单体中下列残基具有超过25％的其侧链暴露于表面：Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K12，K13，Y14，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，H111，Q115，A118和E119。
下面的残基在至少一个单体中具有超过50％的其侧链暴露于表面：Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，N16，G18，H19，S20，D21，A23，D24，N25，G26，T27，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，Q115，A118，E119。
对不含M0和S121-T126且包括受体分子C和D的分子A和B的同型二聚体进行分部ASA计算，结果在至少一个单体中下列残基具有超过25％的其侧链暴露于表面：Q1，D2，P3，K6，E9，N10，K13，Y14，N16，G18，H19，D21，N25，G26，G31，K34，N35，K37，E38，E39，S40，K55，K58，N59，K61，D62，D63，Q64，S65，Q67，K68，E71，T72，K74，E75，N78，V79，K80，N83，S84，N85，K86，K87，D90，E93，K94，N97，S99，T101，D102，L103，N104，E119。下面的残基在至少一个单体中具有超过50％的其侧链暴露于表面：P3，K6，N10，K13，N16，D21，N25，G26，G31，K34，K37，E38，E39，K55，K58，N59，D62，Q64，S65，K68，E71，E75，N83，S84，K86，K87，K94，N97，S99，T101，D102，L103和N104。
所有上述位置都是按照本发明进行修饰的靶。
比较两列残基发现，在受体结合时，从所述超过25％侧链的ASA列残基中去掉了K12，S20，A23，D24，T27，H111，Q115和A118，从所述超过50％侧链的ASA列残基中去掉了Q1，D2，E9，G18，H19，S20，A23，D24，T27，Q115，A118和E119。
该结构中未测定的残基按表面完全暴露处理，即残基S121，P122，A123，A124，K125，T126，G127，K128，R129，K130，R131，S132，Q133，M134，L135，F136，R137，G138，R139，R140，A141，S142，Q143。这些残基也组成根据本发明导入连接基团的不同靶(或者可认为属于表面暴露的氨基酸残基的基团，例如具有超过25％或超过50％暴露的侧链)。
受体结合位点：
按上述进行ASA计算发现，在复合物的至少一个单体中IFNG分子的下列残基与在分离的二聚体上的计算结果相比具有减少的ASA：Q1，D2，Y4，V5，E9，K12，G18，H19，S20，D21，V22，A23，D24，N25，G26，T27，L30，K34，K37，K108，H111，E112，I114，Q115，A118，E119。
实施例
实施例1
设计能在酵母和CHO细胞中表达IFNG的表达盒
GenBank登录号为X13274的DNA序列包含编码无其天然信号肽的成熟huIFNG的全长cDNA，对其进行修饰以便帮助在酵母细胞中进行高效表达。首先，导入一个MATa信号肽代替IFNG信号肽以便帮助分泌进酵母培养基中。其次，通过在密码子使用中采用偏向常用于酵母的密码子来修饰huIFNG核苷酸序列的密码子。随后在该序列中的某些核苷酸用其它核苷酸取代以便导入DNA限制性核酸内切酶的识别位点。设计引物以便合成该基因。使用Platinum Pfx-聚合酶试剂盒(Life Technologies)和标准三步PCR循环参数通过一步PCR将引物装配成合成基因。装配基因通过使用相同条件的PCR进行扩增，它具有SEQ ID NO 3所示的序列。
将合成基因克隆进pJSO37-lip(Okkels，J.S.(1996)Rec.DNA Biotech.III.，vol782，202-207)5’端的HindIII位点和3’端的XbaI位点之间，产生pIGY-1。
为了制备含有共价连接的单体IFNG多肽的单链构建体，制备下列三个构建体：
I)含有通过模拟人IgA1铰链区后的19残基接头肽连接的两个成熟全长huIFNG多肽的构建体(Lunn CA等，J.Biol.Chem.，267，17920-17924，1992)。使用下列引物通过PCR做到这点：
ADJ002  5′-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3′(SEQ ID NO 4)
ADJ003  5′-GCGGCCCTCTAGATTACT-3′(SEQ ID NO 5)
ADJ004  5′-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3′(SEQ ID NO 6)
ADJ007  5′-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGGAGTAGAAGGAACCGCTGTTTTAGCAGCTGGAGACAATT-3′(SEQ ID NO 7)
将该PCR片断克隆进pIGY-1的5’端ClaI和3’端XbaI之间，在SphI中装配两个单体(在连接区导入)。该构建体称为pIGY-2。
II)含有两个单体成熟全长huIFNG多肽而无接头的构建体。为此，使用下列引物进行PCR。
ADJ002  5′-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3′(SEQ ID NO 8)
ADJ003  5′-GCGGCCCTCTAGATTACT-3′(SEQ ID NO 9)
ADJ006  5′-TTTAGAGGTAGAAGAGCTTCTCAGCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3′(SEQ ID NO 10)
ADJ009  5′-AGCTTCTTTCACATATGGATCTTGCTGAGAAGCTCTTCTACGTCTAAA-3′(SEQ ID NO 11)
通过两步PCR组装PCR片断并克隆进pIGY-1的5’端ClaI和3’端XbaI之间，称为pIGY-3。
III)含有通过上述19残基肽接头共价连接的两个C-末端截短(最后11个氨基酸)的单体IFNG多肽的构建体。使用下列引物：
ADJ001  5′-TGCTCTAGACATCTGAGATCGWTTCTCTT TCC-3′(SEQID NO 12)
ADJ002  5′-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3′(SEQ ID NO 13)
ADJ004  5′-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3′(SEQ ID NO 14)
ADJ005  5′-ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGGAGTAGAAGGAACCGGCATCTGAGATCTTTTTCTCC-3′(SEQ ID NO 15)
将PCR片断克隆进pIGY-1的5’端ClaI和3’端XbaI之间，在SphI中装配两个单体(在连接区导入)。该构建体称为pIGY-4。
用于在CHO细胞中表达的构建体
为了在CHO细胞中表达IFNG，合成下列寡核苷酸以便将IFNG包括其信号肽克隆进pcDNA3.1/hygro(Invitrogen)中。
ADJ012  5′-CGCGGATCCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3′(SEQ ID NO 16)
为了在该表达载体中克隆IFNG，以pIGY-1作模板使用ADJ012和ADJ003经PCR扩增产生450bp的片断，该片断可克隆进pcDNA3.1/hygro的5’端BamHI和3’端XbaI之间，得到pIGY-5。
为了在IFNG中导入糖基化位点，设计寡核苷酸使得在表达质粒(pIGY-5)中通过传统的两步PCR来导入改变，随后克隆5’端BamHI和3’端XbaI之间的PCR片断。
因此，设计两个载体引物与特异性突变引物一起使用：
ADJ013  5′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3′(SEQ ID NO 17)(反义下游载体引物)
ADJ014  5′-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3′(SEQ ID NO 18)(有义上游载体引物)
针对不同的突变蛋白，设计下列引物。
K12T.
ADJ015  5′-AGCATTAAAATACTTCGTCAAGTTTTCAGC-3′(SEQ IDNO 19)
ADJ016  5′-GCTGAAAACTTGACGAAGTATTTTAATGCT-3′(SEQ IDNO 20)
G18T
ADJ017  5′-CACATCAGAATGAGTAGCATTAAAATA-3′(SEQ ID NO21)
ADJ018  5′-TATTTTAATGCTACTCATTCTGATGTG-3′(SEQ ID NO 22)
E38N
ADJ019  5′-CATAATTTTTCGATCGGATTCGTTTTTCC  AATTCTT-3′(SEQ ID NO 23)
ADJ020  5′-AAGAATTGGAAAAACGAATCCGATCGAAAAATTATG-3′(SEQ ID NO 24)
K61T
ADJ021  5′-AATAGACTGATCGTCTGTAAAGTTTTTAAA-3′(SEQ IDNO 25)
ADJ022  5′-TTTAAAAACTTTACAGACGATCAGTCTATT-3′(SEQ IDNO 26)
N85T
ADJ023  5′-TCTTTTCTTTTTAGTACTATTGAAAAACTT-3′(SEQ IDNO 27)
ADJ024  5′-AAGTTTTTCAATAGTACTAAAAAGAAAAGA-3′(SEQ IDNO 28)
K94N
ADJ025  5′-ATAATTAGTCAAATTTTCGAAGTCATG-3′(SEQ ID NO29)
ADJ026  5′-GATGACTTCGAAAATTTGACTAATTAT-3′(SEQ ID NO30)
S99N
ADJ027  5′-AATCAAGTCAGTAACGTTATAATTAGTCAA-3′(SEQ IDNO 31)
ADJ028  5′-TTGACTAATTATAACGTTACTGACTTGAAT-3′(SEQ IDNO 32)
Q106T
ADJ029  5′-ATGAATAGCTTTACTAGTCACATTCAAGTC-3′(SEQ IDNO 33)
ADJ030  5′-GACTTGAATGTGACTAGTAAAGCTATTCAT-3′(SEQ IDNO 34)
经过两步PCR和用BamHI和XbaI消化后，预期每对引物产生447bp的片断，该片断可在pIGY-5中克隆。
在CHO细胞中表达干扰素γ
通过使用Lipofectamine 2000(Life Technologies，USA)作为转染剂将上述构建体转染进CHO K1细胞系(ATCC#CCL-61)中。24小时后收获培养基并测定干扰素γ的活性和浓度。
                          序列表
<110>马克西根公司(Maxygen Aps)
<120>干扰素γ偶联物
<130>7wo
<160>34
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>人(Homo Sapiens)
<400>1
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
            20                  25                  30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
        35                  40                  45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
    50                  55                  60
Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65                  70                  75                  80
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
                85                  90                  95
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
            100                 105                 110
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
        115                 120                 125
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
    130                 135                 140
Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
145                 150                 155                 160
Gly Arg Arg Ala Ser Gln
                165
<210>2
<211>143
<212>PRT
<213>人(Homo Sapiens)
<400>2
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1               5                   10                  15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
            20                  25                  30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
        35                  40                  45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
    50                  55                  60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65                  70                  75                  80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
                85                  90                  95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
            100                 105                 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln
    130                 135                 140
<210>3
<211>375
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>3
tctgatgtgg ctgataatgg aactttgttc ttaggcattt tgaagaattg gaaagaag
aa     60
tctgatagaa aaattatgca gtctcaaatt gtgtcttttt acttcaaatt gtttaaaa
ac    120
tttaaagatg atcagtctat tcaaaagtct gtggaaacta ttaaggaaga tatgaatg
tg    180
aagtttttca attctaacaa aaagaaaaga gatgacttcg aaaagttgac taattatt
ct    240
gtgactgact tgaatgtgca aagaaaagct attcatgaat tgatccaagt gatggctg
aa    300
ttgtctccag ctgctaaaac aggaaagaga aaaagatctc agatgttgtt tagaggta
ga    360
agagcttctc agtaa
      375
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>4
ggtttgatat cgatggccaa
       20
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>5
gcggccctct agattact
       18
<210>6
<211>51
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>6
catctccgtc cactccgact ccatagcatg caagatccat atgtgaaaga a
       51
<210>7
<211>84
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>7
atcttgcatg ctatggagtc ggagtggacg gagatggagt tggcggagta gaaggaac
cg     60
ctgttttagc agctggagac aatt
       84
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>8
ggtttgatat cgatggccaa
       20
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>9
gcggccctct agattact
       18
<210>10
<211>48
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>10
tttagaggta gaagagcttc tcagcaagat ccatatgtga aagaagct
       48
<210>11
<211>48
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>11
agcttctttc acatatggat cttgctgaga agctcttcta cgtctaaa
     48
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>12
tgctctagac atctgagatc gttttctctt tcc
       33
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>13
ggtttgatat cgatggccaa
       20
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<211>51
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>14
catctccgtc cactccgact ccatagcatg caagatccat atgtgaaaga a
       51
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<211>81
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>15
atcttgcatg ctatggagtc ggagtggacg gagatggagt tggcggagta gaaggaac
cg     60
gcatctgaga tctttttctc c
       81
<210>16
<211>102
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>16
cgcggatcca tgaaatatac aagttatatc ttggcttttc agctctgcat cgttttgg
gt     60
tctcttggct gttactgcca agatccatat gtgaaagaag ct
      102
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<211>19
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>17
gatggctggc aactagaag
       19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>合成构建体
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tgtacggtgg gaggtctat
       19
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
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agcattaaaa tacttcgtca agttttcagc
       30
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
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gctgaaaact tgacgaagta ttttaatgct
       30
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<213>合成构建体
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       27
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>合成构建体
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tattttaatg ctactcattc tgatgtg
       27
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>23
cataattttt cgatcggatt cgtttttcca attctt
       36
<210>24
<211>36
<212>DNA
<213>合成构建体
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aagaattgga aaaacgaatc cgatcgaaaa attatg
       36
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>25
aatagactga tcgtctgtaa agtttttaaa
       30
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
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tttaaaaact ttacagacga tcagtctatt
       30
<210>27
<211>30
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<213>合成构建体
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tcttttcttt ttagtactat tgaaaaactt
       30
<210>28
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<213>合成构建体
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aagtttttca atagtactaa aaagaaaaga
       30
<210>29
<211>27
<212>DNA
<213>合成构建体
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ataattagtc aaattttcga agtcatg
       27
<210>30
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<213>合成构建体
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gatgacttcg aaaatttgac taattat
       27
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aatcaagtca gtaacgttat aattagtcaa
       30
<210>32
<211>30
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<213>合成构建体
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ttgactaatt ataacgttac tgacttgaat
       30
<210>33
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
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       30
<210>34
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<213>合成构建体
<400>34
gacttgaatg tgactagtaa agctattcat
       30

Claims (54)

1.一种偶联物，该偶联物表现出干扰素γ活性，并包含至少一个N-连接的糖基组分，该糖基组分共价连接到干扰素γ多肽的导入的N-糖基化位点上，其中：
a)所述干扰素γ多肽包含与SEQ ID NO：2所示的野生型人类干扰素γ序列有1-15个氨基酸残基区别的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2所示的野生型人类干扰素γ序列有1-15个氨基酸残基区别的氨基酸序列的C-末端被截短1-15个氨基酸残基的片段；和
b)导入的N-糖基化位点位于所述干扰素γ多肽的118个N-末端氨基酸残基内。
2.根据权利要求1的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点位于干扰素γ多肽的93个N-末端氨基酸残基内。
3.根据权利要求1的偶联物，其中所述多肽包含的序列与野生型人类干扰素γ的序列或其片断有1-8个氨基酸残基的区别。
4.根据权利要求2的偶联物，其中所述多肽包含的序列与野生型人类干扰素γ的序列或其片断有1-8个氨基酸残基的区别。
5.根据权利要求3的偶联物，其中所述多肽包含的序列与野生型人类干扰素γ的序列或其片断有1-5个氨基酸残基的区别。
6.根据权利要求4的偶联物，其中所述多肽包含的序列与野生型人类干扰素γ的序列或其片断有1-5个氨基酸残基的区别。
7.根据权利要求1的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
8.根据权利要求2的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
9.根据权利要求3的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
10.根据权利要求4的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
11.根据权利要求5的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
12.根据权利要求6的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
13.根据权利要求7的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
14.根据权利要求8的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
15.根据权利要求9的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
16.根据权利要求10的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
17.根据权利要求11的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
18根据权利要求12的偶联物，其中所述N-糖基化位点在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入。
19.根据权利要求1-18任一项的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点通过选自下列的取代导入：Q1N+P3S/T，P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，E9N+L11S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，Y14N+N16S/T，G18S/T，G18N，G18N+S20T，H19N+D21S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，S40N+R42S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，K61N+D63S/T，D62N+Q64S/T，D63N，D63N+S65T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，Q67N，Q67N+S69T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，T72N+K74S/T，K74N+D76S/T，E75N+M77S/T，K80S/T，V79N+F81S/T，K80N+F82S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K87S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，D90N+F92S/T，E93N+L95S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T或Q106S/T。
20.根据权利要求19的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点通过选自下列的取代导入：P3N+V5S/T，K6N+A8S/T，K12S/T，K13N+F15S/T，G18S/T，D21N+A23S/T，G26N+L28S/T，G31N+L33S/T，K34N+W36S/T，K37N+E39S/T，E38N，E38N+S40T，E39N+D41S/T，K55N+F57S/T，K58N+F60S/T，K61S/T，D62N+Q64S/T，Q64N+I66S/T，S65N+Q67S/T，K68N+V70S/T，E71N+I73S/T，E75N+M77S/T，N85S/T，S84N+K86S/T，K86N+K88S/T，K87N+R89S/T，K94N，K94N+T96S，S99N，S99N+T101S，T101N+L103S/T，D102N+N104S/T，L103N+V105S/T或Q106S/T。
21.根据权利要求2-18任一项的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点通过选自下列的取代导入：K12S/T，G18S/T，G18N，K37S/T，E38N，M45N，I49N，K61S/T，D63N，Q67N，V70N，K80S/T，F82N，N85S/T或K87S/T。
22.根据权利要求21的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点通过选自下列的取代导入：K12T，G18N，G18T，K37T，E38N，K61T，D63N，Q67N，K80T或N85T。
23.根据权利要求22的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点通过选自下列的取代导入：G18N，E38N，D63N或Q67N。
24.权利要求23的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点是通过E38N取代导入的。
25.根据权利要求20的偶联物，其中所述导入的N-糖基化位点通过取代E38N+S40T导入。
26.根据权利要求1-18、20、22-25任一项的偶联物，其中所述的氨基酸序列还包含至少一个导入的半胱氨酸残基。
27.根据权利要求19的偶联物，其中所述的氨基酸序列还包含至少一个导入的半胱氨酸残基。
28.根据权利要求21的偶联物，其中所述的氨基酸序列还包含至少一个导入的半胱氨酸残基。
29.根据权利要求26的偶联物，其中在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入该半胱氨酸残基。
30.根据权利要求27的偶联物，其中在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入该半胱氨酸残基。
31.根据权利要求28的偶联物，其中在被至少有25％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入该半胱氨酸残基。
32.根据权利要求29的偶联物，其中在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入该半胱氨酸残基。
33.根据权利要求30的偶联物，其中在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入该半胱氨酸残基。
34.根据权利要求31的偶联物，其中在被至少有50％的其侧链暴露于表面的氨基酸残基占据的位置导入该半胱氨酸残基。
35.根据权利要求32的偶联物，其中所述半胱氨酸残基通过选自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C或N104C的取代导入。
36.根据权利要求33的偶联物，其中所述半胱氨酸残基通过选自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C或N104C的取代导入。
37.根据权利要求34的偶联物，其中所述半胱氨酸残基通过选自N10C，N16C，E38C，N59C，N83C，K94C或N104C的取代导入。
38.根据权利要求26的偶联物，其中所述的半胱氨酸残基在氨基酸残基121-143的任何残基占据的位置被导入。
39.根据权利要求27-34任一项的偶联物，其中所述的半胱氨酸残基在氨基酸残基121-143的任何残基占据的位置被导入。
40.根据权利要求26的偶联物，其中非多肽组分与导入的半胱氨酸残基共价连接。
41.根据权利要求27-38任一项的偶联物，其中非多肽组分与导入的半胱氨酸残基共价连接。
42.根据权利要求39的偶联物，其中非多肽组分与导入的半胱氨酸残基共价连接。
43.根据权利要求40的偶联物，其中所述非多肽组分是聚合物分子。
44.根据权利要求41的偶联物，其中所述非多肽组分是聚合物分子。
45.根据权利要求42的偶联物，其中所述非多肽组分是聚合物分子。
46.根据权利要求43的偶联物，其中所述聚合物分子是线性的或分支的聚乙二醇。
47.根据权利要求44的偶联物，其中所述聚合物分子是线性的或分支的聚乙二醇。
48.根据权利要求45的偶联物，其中所述聚合物分子是线性的或分支的聚乙二醇。
49.权利要求1-18、20、22-25、27-38、40、42-48任一项的偶联物，其中所述片段是C-末端被截短11个氨基酸残基的片段。
50.权利要求19的偶联物，其中所述片段是C-末端被截短11个氨基酸残基的片段。
51.权利要求21的偶联物，其中所述片段是C-末端被截短11个氨基酸残基的片段。
52.权利要求26的偶联物，其中所述片段是C-末端被截短11个氨基酸残基的片段。
53.权利要求39的偶联物，其中所述片段是C-末端被截短11个氨基酸残基的片段。
54.权利要求41的偶联物，其中所述片段是C-末端被截短11个氨基酸残基的片段。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7306931B2 (en) * 2000-05-16 2007-12-11 Bolder Biotechnology, Inc. Method for refolding proteins containing free cysteine residues
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
CA2647314A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US8617531B2 (en) 2006-12-14 2013-12-31 Bolder Biotechnology, Inc. Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine
DK2101821T3 (da) 2006-12-15 2014-10-06 Baxter Healthcare Sa Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
HUE028056T2 (en) 2009-07-27 2016-11-28 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
JP5908401B2 (ja) * 2009-07-27 2016-04-26 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 血液凝固タンパク質複合体
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
EP0860442A1 (en) * 1990-05-25 1998-08-26 Genzyme Corporation Oligosaccharide oxazolines, oligosaccharide conjugates and methods of preparation thereof
WO1999003887A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096705A (en) 1981-10-19 1992-03-17 Genentech, Inc. Human immune interferon
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5582824A (en) 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
JPS58110548A (ja) 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
ZA831094B (en) 1982-02-22 1983-11-30 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
US5004689A (en) 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
IL68100A0 (en) 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4835256A (en) 1982-09-30 1989-05-30 New York University & Juridical Foundation Human gamma interferon polypeptide having glutamine as the ninth n-terminal amino acid
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4966843A (en) 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
WO1984002129A1 (en) 1982-11-22 1984-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd Human immune interferon protein and process for its preparation
JPH0740925B2 (ja) 1983-03-14 1995-05-10 協和醗酵工業株式会社 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド
US4604284A (en) 1983-09-20 1986-08-05 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous immune interferon fragment
JPH0788398B2 (ja) 1983-10-17 1995-09-27 サントリー株式会社 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法
MX9203641A (es) 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4758656A (en) 1983-12-26 1988-07-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel human interferon-gamma polypeptide derivative
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
DE3414831A1 (de) 1984-04-19 1985-10-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet
US4921698A (en) 1984-05-25 1990-05-01 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Polypeptide having gamma-interferon activity lacking amino acids coded by exon 4
JPS6124599A (ja) 1984-07-11 1986-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体
US4845196A (en) 1985-06-24 1989-07-04 G. D. Searle & Co. Modified interferon gammas
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
DE3536939A1 (de) 1985-10-17 1987-04-23 Hoechst Ag Biologisch aktive derivate des human-(gamma)-interferons, ihre herstellung und arzneimittel, die solche derivate enthalten
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5362490A (en) 1986-07-25 1994-11-08 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Human myelomonocyte interferon-gamma, and process for preparation and use thereof
GB8619725D0 (en) 1986-08-13 1986-09-24 Hoffmann La Roche Homogenous interferon fragments
JP2653061B2 (ja) 1986-12-27 1997-09-10 武田薬品工業株式会社 新規ポリペプチドおよびその製造法
US5157004A (en) 1986-12-27 1992-10-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Polypeptides and production thereof
US4944941A (en) 1987-08-07 1990-07-31 Genentech, Inc. Methods and compositions for the treatment of lung conditions
DE3730331A1 (de) 1987-09-10 1989-03-30 Basf Ag Neue polypeptide, verfahren zur herstellung, die vektoren dafuer und arzneimittel daraus
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5041376A (en) 1988-12-09 1991-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method for identifying or shielding functional sites or epitopes of proteins that enter the exocytotic pathway of eukaryotic cells, the mutant proteins so produced and genes encoding said mutant proteins
BG52073B2 (en) 1990-01-24 1996-04-30 Inst Molekuljarna Biolog Method for the preparation of recombinant human noncystein -interferon, free of n-end methionine
EP0546099B1 (en) 1990-08-31 1994-10-12 Schering Corporation Use of human Interferon gamma 4-134
DE4036856C1 (zh) 1990-11-19 1992-05-27 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
KR950014915B1 (ko) 1991-06-19 1995-12-18 주식회사녹십자 탈시알로당단백-포함화합물
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
JPH0770195A (ja) 1993-08-23 1995-03-14 Yutaka Mizushima 糖修飾インターフェロン
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5770191A (en) 1995-05-24 1998-06-23 University Of Florida Active C-terminal peptides of interferon--gamma and their use
DE19535853C2 (de) 1995-09-18 1999-04-01 Fraunhofer Ges Forschung Varianten des rekombinanten humanen Interferon-gamma, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP0795332B1 (en) 1996-03-14 2005-06-01 Mondobiotech Interferon SA Medical use of gamma-interferon in interstitial lung diseases
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
KR20020053064A (ko) 1999-09-28 2002-07-04 아마릴로 바이오싸이언시스, 인크 질병 치료를 위한 저용량의 ｉｆｎ-감마
CA2390292A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
EP0860442A1 (en) * 1990-05-25 1998-08-26 Genzyme Corporation Oligosaccharide oxazolines, oligosaccharide conjugates and methods of preparation thereof
WO1999003887A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins

Also Published As

Publication number Publication date
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