CN1694718A

CN1694718A - 修饰的无唾液酸－干扰素及其用途

Info

Publication number: CN1694718A
Application number: CN 03824900
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·P·巴克; 丹尼尔·K·波多尔斯基
Original assignee: General Hospital Corp; GI Co Inc
Current assignee: General Hospital Corp; GI Co Inc
Priority date: 2002-09-05
Filing date: 2003-09-03
Publication date: 2005-11-09

Abstract

本发明涉及制备修饰的无唾液酸－干扰素的方法以及使用所述干扰素治疗肝病的方法。通过加入水溶性聚合物修饰无唾液酸－干扰素，所述水溶性聚合物包括例如聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烃)，诸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亚甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，诸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油)，和聚(氧乙烯化葡萄糖)等。可被修饰并用于治疗肝病的无唾液酸－干扰素包括例如，无唾液酸－干扰素－α，－R，和－γ。

Description

修饰的无唾液酸-干扰素及其用途

技术领域

本发明涉及利用干扰素治疗肝病。

背景技术

干扰素是一类天然存在的蛋白，其最早是由于其预防病毒复制的能力而被发现的。其它研究确定，干扰素具有抗增生效应并可用于对抗一些类型的癌细胞。具体地说，包括干扰素-α，-β和-γ家族的成员在内的干扰素显示对许多病毒和肿瘤指征有临床效果，所述指征包括肝炎，毛细胞(hairycell)白血病，慢性骨髓源性白血病，黑素瘤，滤泡样淋巴瘤(follicularlymphoma)和慢性肉芽肿性疾病(chronic granulomatous disease)。

乙型肝炎(HBV)和丙型肝炎(HCV)病毒感染是全世界性的健康问题。超过350,000,000人感染有HBV，使得其成为全世界最常见的严重慢性病毒感染。此外，在全世界范围内，HBV是导致肝癌的首要病因。此外，全世界大约170,000,000人患有慢性HCV感染，包括美国的至少3,900,000人。HCV导致30％的终末期肝病和肝癌，并且是导致患者需要肝移植的主要疾病。然而，HBV和HCV的治疗选择的有效性很有限，其会很快丧失有效性，且通常难以被患者耐受。

在美国，原发性肝癌的发病率从1975到1995增加了71％，且被诊断患有肝癌的患者总数每年持续增加。在2002年，美国癌症协会估计在美国将确诊16,600例原发肝癌和胆管癌，并且14,100美国人将死于该疾病。

虽然干扰素是有功效的治疗性化合物，它们很快从患者体内清除，使得需要频繁给药以保持该化合物的治疗有效水平。此外，干扰素不靶向具体的组织，且由此需要相对高的系统浓度以便在靶位点达到治疗有效浓度。干扰素的这些性质增加了治疗导致的有害副作用出现的可能性。因此，需要将干扰素靶向疾病位点较长时间以使其效力最大化且副作用最小化。

发明概述

一方面，本发明涉及基本纯的修饰的哺乳动物(例如人)无唾液酸-干扰素，其与水溶性聚合物结合(conjugate)，所述水溶性聚合物的平均分子量为大约1,000-60,000道尔顿，1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，或35,001-60,000道尔顿。所述水溶性聚合物可以是线性的或分支的，并可内部交联。优选，所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烃)，诸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亚甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，诸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油，和聚(氧乙烯化葡萄糖)。本发明的无唾液酸-干扰素可在一个，两个，三个或更多个氨基酸残基上进行修饰。对于在一个以上的氨基酸残基上进行修饰的无唾液酸-干扰素，其可利用相同或不同的水溶性聚合物修饰。在所需的实施方案中，所述无唾液酸-干扰素在半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸，或谷氨酸残基；在C-末端羧基；或在N-末端胺基被修饰。在最优选的实施方案中，所述无唾液酸-干扰素在半胱氨酸或赖氨酸上修饰。适合药用的无唾液酸-干扰素包括，例如人无唾液酸-干扰素-α，无唾液酸-干扰素-β，和无唾液酸-干扰素-γ。本发明还提供了药物组合物，其含有修饰的哺乳动物无唾液酸-干扰素和可药用的赋型剂。

另一方面，本发明涉及通过给药有效量的药物组合物治疗患肝病的患者的方法，所述药物组合物包含修饰的哺乳动物(例如，人)无唾液酸-干扰素。适合于利用该方法治疗的肝病包括，例如病毒性肝炎(例如，乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒感染)，肝纤维化，和肝癌诸如弥漫型肝细胞癌(diffuse-typeheptocellular carcinoma)，发热型肝细胞癌(febrile-type heptocellularcarcinoma)，和淤胆型肝细胞癌，肝母细胞瘤，肝样腺癌，以及灶性结节样增生。在本发明该方面的所需实施方案肿，所述修饰的无唾液酸-干扰素是前述的任何一种。修饰的无唾液酸-干扰素的治疗有效量为例如，约0.025μg/kg到10.0μg/kg体重(例如，约0.025，0.035，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，或3.5μg/kg体重)。此外，所述治疗有效量可以是例如每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每隔一周一次或每月一次进行给药。

″干扰素″指高同源物种家族-已知为干扰素的特定蛋白，其可抑制病毒复制和细胞增生，并调节免疫反应，且基本上与干扰素-α，-β或-γ或其生物活性片段相同。评估干扰素的生物活性的方法是众所周知的(例如，Monkarsh等，Anal.Biochem.247：434-440，1997；Grace等，J.InterferonCytokine Res.21：1103-1115，2001；Bailon等，Bioconj.Chem.12：195-202，2001；Pepinsky等，J.Pharmacol.Exp.Therap.297：1059-66，2001)。人干扰素根据其细胞来源和分子结构而分成三类：干扰素-α(白细胞)，干扰素-β(纤维母细胞)，和干扰素-γ(淋巴细胞)。

″干扰素-α″是指含有与干扰素-α2成熟多肽(氨基酸24-188，登录号：P01563；SEQ ID NO：1)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白。因此干扰素-α包括干扰素-α2前体多肽(登录号：P01563；SEQ ID NO：1)以及保持成熟干扰素-α生物活性(例如，抗增生活性)的片段。该定义还包括干扰素-α2的变体形式，包括例如，干扰素-α2b(SEQ ID NO：1的R46K突变)和干扰素-α2c(SEQ ID NO：1的R57H突变)。干扰素-α2b是O-连接的糖蛋白。干扰素-α14c是N-连接的糖蛋白，其在Asn-72糖基化。天然干扰素可以Wellferon(Glaxo-SmithKline，Alferon(干扰素)，Sumiferon(Sumitomo)和Multiferon(Viragen)的商品名购得。非-糖基化的干扰素-α也可购得，包括例如重组干扰素-α2a，商品名为Roferon^-A(Roche)，重组干扰素-α2b，商品名为Intron^-A(Schering Ploμgh)，和重组干扰素-α2c，名为Berofor alpha2(Boehringer Ingelheim)。重组共有序列干扰素-con 1可以Infergen(Amgen)的名称获得。当然，在用于本发明的组合物和方法前，任何非-糖基化的干扰素必须用含有末端半乳糖残基的寡糖来糖基化。

″干扰素-β”是指含有与成熟干扰素-β多肽(氨基酸22-187，登录号：P01574；SEQ ID NO：2)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白。因此干扰素-β包括不包含单个肽的成熟干扰素-β蛋白，包含所述单个肽的干扰素-β前体多肽(登录号：P01574；SEQ ID NO：2)，以及其具有干扰素-β活性(例如，抗增生活性)的片段。干扰素-β是在成熟干扰素-β蛋白的Asn80上糖基化的糖蛋白。重组干扰素-β已经开发出来并可购得。干扰素-β1a可以Avonex^(Biogen)和Rebifg^(Serono)的商品名购得。干扰素-β1b可以Betaseron(Berlex)的商品名购得。

″干扰素-γ″是指含有与成熟干扰素-γ多肽(氨基酸21-166，登录号P01579；SEQ ID NO：3)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白。因此干扰素-γ蛋白包括，不包含单个肽的成熟干扰素-γ多肽，以及包含所述单个肽的干扰素-γ前体蛋白(登录号P01579；SEQ ID NO：3)，以及其具有干扰素-γ生物活性(例如，抗增生活性)的片段。干扰素-γ在Asn48糖基化，且在二聚体中于Asn120糖基化。可以Actimmune^(InterMune)的商品名购得干扰素-γ。

对于前述任何干扰素，其变体形式也可包含在它们的定义中，所述变体形式中所述干扰素多肽序列中的一种氨基酸被另一种替换而不丧失生物活性。一个实例为干扰素-α，-β，或-γ，其中的丝氨酸或苏氨酸残基被半胱氨酸残基替换，所述半胱氨酸残基随后用于将其它部分(例如PEG部分)结合于干扰素。在一种这样的实例中，干扰素分子中的半胱氨酸被取代，所述半胱氨酸在不干扰折叠的位置上并且至少部分暴露在所述分子的表面。

″无唾液酸-干扰素″是指缺乏存在于天然糖基化干扰素中的末端唾液酸基团的糖基化干扰素。去除所述末端唾液酸残基使得其下方的半乳糖部分暴露。无唾液酸糖蛋白受体识别的是所述末端半乳糖。优选，无唾液酸-干扰素含有存在于天然干扰素中的碳水化合物部分的至少50％，70％，80％，90％，或甚至95％。最优选，无唾液酸-干扰素仅缺乏末端唾液酸残基。无唾液酸-干扰素可通过从糖基化干扰素去除一或多个唾液酸残基来产生，所述糖基化干扰素例如干扰素-α，-β或-γ。所述去除可例如通过温和的酸水解，或用纯化的神经氨酸酶处理天然的糖基化干扰素来实现，所述糖基化干扰素例如干扰素-α，-β或-γ。对于含有一个以上糖链的干扰素，可使用具体的神经氨酸酶(唾液酸酶)实现选择性去唾液酸化。该定义具体排除的是完全去糖基化的干扰素，包括通常由原核细胞产生的干扰素和由真核细胞产生的干扰素并通过酶或化学方法进行去糖基化。当然，由于去除唾液酸残基的目的是产生在其寡糖链具有至少一个末端半乳糖残基的糖基化干扰素，可通过任何其他适合的方法对末端半乳糖残基进行改造，所述方法包括例如将寡糖共价结合于去糖基化的干扰素。

″修饰的无唾液酸-干扰素″是指与至少一种水溶性聚合物结合的无唾液酸-干扰素，其保持天然干扰素生物活性的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％(例如，抗增生或抗病毒活性)。

可与无唾液酸-干扰素结合的水溶性聚合物的实例包括聚烷基二醇，诸如聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烃)，诸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亚甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，诸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油)，和聚(氧乙烯化葡萄糖)。优选地，水溶性聚合物的平均分子量为大约100道尔顿-200,000道尔顿，例如，100-999，1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，35,001-60,000，60,001-100,000或100,001-200,000道尔顿。在更优选的实施方案中，水溶性聚合物的平均分子量为大约1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，35,001-60,000或60,001-100,000道尔顿。此外，该定义还包括利用本文所述方法活化的这些聚合物的形式。

所述修饰的无唾液酸-干扰素可被修饰，例如，通过在半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸残基；C-末端羧基；或N-末端胺基与聚合物共价结合。在其它优选实施方案中，修饰的无唾液酸-干扰素通过将水溶性聚合物与一个以上氨基酸残基结合来修饰。本领域技术人员可容易地确定将水溶性聚合物与无唾液酸-干扰素进行结合的最优选残基，并利用其确定所述聚合物的平均分子量，例如通过测定和比较修饰的无唾液酸-干扰素各位置异构体的相对抗病毒活性，抗增生活性，或生物分布/药物动力学确定。此外，数种异构体的组合可用于产生复合药物动力学图谱。例如，这些活性可通过利用本文所述抗病毒或抗增生实验来测定。

″聚乙二醇化无唾液酸-干扰素″是指与至少一种聚乙二醇(PEG)聚合物结合，的无唾液酸-干扰素，其保持天然干扰素的生物活性(例如，抗增生或抗病毒活性)的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。例如，PEG可以为单甲氧基PEG(mPEG)，且其可与无唾液酸-干扰素共价结合。优选，所述PEG是mPEG聚合物，其平均分子量为例如，约1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，或35,001-60,000道尔顿(例如，1,000，1,450，3,350，5,000，6,000，8,000，10,000，12,000，20,000，30,000，35,000，40,000，或60,000道尔顿)。在更优选的实施方案中，所述mPEG聚合物的平均分子量为，例如，约5,000，12,000，20,000或40,000道尔顿。所述PEG化的无唾液酸-干扰素可以例如，在干扰素的半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸，或谷氨酸残基；C-末端羧基；N-末端胺基发生PEG化。在其它优选实施方案中，PEG化无唾液酸-干扰素在一个以上的氨基酸残基PEG化。本领域技术人员可轻易确定无唾液酸-干扰素中最优选的可PEG化残基，且利用其确定PEG的平均分子量，例如通过测定和比较PEG化的无唾液酸干扰素各位置异构体的相对抗病毒活性，抗增生活性，或生物分布/药物动力学确定。此外，数种异构体的组合可用于产生复合药物动力学图谱。例如，这些活性可通过利用本文所述抗病毒或抗增生实验来测定。

″聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素″是指与至少一个各聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分子偶链的无唾液酸-干扰素，且其保持天然干扰素的生物活性(例如，抗增生或抗病毒活性)的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。PVP化的无唾液酸-干扰素可例如，在干扰素的半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸，或谷氨酸残基；C-末端羧基；N-末端胺基发生PVP化。在其它优选的实施方案中，PVP化无唾液酸-干扰素在一个以上的氨基酸残基发生PVP化。在具体有用的实施方案中，所述PVP聚合物的平均分子量为约17,000道尔顿。

本领域技术人员可轻易测定无唾液酸-干扰素中最优选的可PVP化残基以及PVP分子的数目，例如通过测定和比较PVP化的干扰素各位置异构体的相对抗病毒活性，抗增生活性，或生物分布/药物动力学确定。此外，数种异构体的组合可用于产生复合药物动力学图谱。例如，这些活性可通过利用本文所述抗病毒或抗增生实验来测定。

″肝病(hepatic disorder)″是指影响肝的组织或细胞的任何疾病。“肝病”的实例包括病毒性肝炎，肝癌，以及肝的纤维化。肝炎可通过例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒引起的肝的感染造成。乙型肝炎或丙型肝炎病毒的感染可由本领域技术人员利用标准方法测定，例如通过测定患者是否有抗肝炎病毒抗体或病毒RNA。

″肝癌″是指肝的组织或细胞发生异常增生的任何疾病。可引起肝癌的肝细胞包括胆管细胞、血管诸如门静脉的细胞、树突细胞或肝细胞。肝癌包括但不限于，肝细胞癌，诸如弥漫型肝细胞癌，发热型肝细胞癌，和淤胆型肝细胞癌，肝母细胞瘤，肝样腺癌，以及灶性结节样增生。此外，肝癌可以是肝炎病毒慢性感染的后果。

其肝癌表达无唾液酸糖蛋白受体的患者适合于通过修饰的无唾液酸-干扰素治疗；这些患者可通过使用本领域标准诊断方法确定(例如Burgess等，Hepatology 15：702-706，1992；Hirose等，Biochem.and Biophys.ResearchComm.287：675-681，2001；Hyodo等，Liver 13：80-5，1993；Trere等，Br.J.Cancer 81：404-8，1999)。

″抗肿瘤治疗(antineoplstic therapy)″是指用于部分或完全抑制肿瘤增生的医学方法或治疗。通常，抗肿瘤治疗包括从患者去除部分或所有肿瘤细胞的外科方法(例如肝切除)，放射治疗法和化学治疗法。可与本发明的无唾液酸-干扰素联合给药的具体有用的抗肿瘤化疗剂包括，例如烷基化剂，抗代谢物，亚硝基脲和植物生物碱。优选“抗肿瘤治疗”导致肿瘤增生降低例如，25％，50％，或75％。在更优选的实施方案中：“抗肿瘤治疗”导致肿瘤增生减少例如，80％，90％，95％，或甚至99％。可与修饰的无唾液酸-干扰素联用的抗肿瘤剂的实例在例如Wadler and Schwartz(Cancer Res.50：3473-3486，1990)中描述。

″抗病毒剂″是指破坏病毒或降低病毒在体内复制或扩散的能力的化合物。抗病毒剂的实例包括干扰素-α，-β，-γ，利巴韦林(1β-D呋喃核糖基(ribofuranosyl)-1H-1，2，4三唑3-甲酰胺)及其衍生物，以及合成的核苷酸类似物拉米夫定((顺-1-[2′-羟基甲基-5′-(1，3-氧硫杂茂烷基(oxathiolanyl))]胞嘧啶)及其类似物。此外，本领域技术人员理解如何利用标准方法(例如以下文献公开的方法：Monkarsh等，Analytical Biochemistry 247：434-440，1997；Bailon等，Bioconjμgate Chem.12：195-202，2001；and Grace等，J.of干扰素and Cytokine Research 21：1103-1115，2001)以及本文所述的方法测定试剂的抗病毒活性。优选，″抗病毒剂″造成病毒复制或扩散降低例如，至少10％，20％，30％，或50％。在更优选的实施方案中，抗病毒剂降低病毒的复制或扩散例如70％，80％，90％，95％，甚至99％。

″无唾液酸糖蛋白受体-表达型肝病”是指含有这样细胞的任何肝病，所述细胞表达可检测水平的无唾液酸糖蛋白受体蛋白(登录号：NP001662或P07307)或基本上与所述无唾液酸糖蛋白受体相同的蛋白，或核酸。可利用任何适宜的体内、离体或体外技术评估所述细胞的无唾液酸糖蛋白受体表达。例如在活检或手术切除过程中从患者取出的细胞可通过无唾液酸糖蛋白受体表达表征，所述表征可利用标准免疫组织化学方法，Northern或Western印迹技术或ELISA来进行。此外，本领域技术人员已知无唾液酸糖蛋白受体并且所述受体在例如Spiess等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6465-6469，1985)和Spiess等(J.Biol.Chem.260：1979-1982，1985)中描述。

“基本相同”是指与参比氨基酸或核酸序列具有至少75％，优选85％，更优选90％，最优选95％，或甚至99％相同的多肽或核酸。对于多肽，比较序列的长度通常为至少20个氨基酸，优选至少30个氨基酸，更优选至少40个氨基酸，且最优选50个氨基酸。对于核酸，比较序列的长度通常至少60个核苷酸，优选至少90个核苷酸，且最优选至少120个核苷酸。

通常利用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)，University of WisconsinBiotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705，BLAST，BESTFIT，GAP，或PILEUP/PRETTYBOX程序)测定序列同一性。这种软件通过将同源性程度赋予各种取代，缺失，和/或其它修饰而与相同或相似的序列匹配。保守性取代通常包括下列取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；精氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。

″有效量″是指抑制肿瘤生长或防止病毒在体内复制或扩散所需要的本发明化合物单独使用或联用的量。用于治疗肿瘤(即癌症)和病毒感染的实施本发明使用的活性化合物的治疗有效量取决于：给药方式、受治疗者的年龄、体重和总体健康。最后，医师将确定适宜的量和剂量方案。这种量通常称为“治疗有效”量。

修饰的无唾液酸-干扰素的“有效量”可以是，例如约0.0035μg到20μg/kg体重/天或0.010μg到140μg/kg体重/周。优选，“治疗有效量”为约0.025μg到10.0μg/kg，例如，约0.025，0.035，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，或9.0μg/kg体重，以每天一次，每隔一天一次，每周两次，每周一次的方式给药。此外，修饰的无唾液酸-干扰素的“治疗有效量”为例如约100pg/m²到100,000μg/m²，以每天一次，每隔一天一次，每周两次，每周一次，每隔一周一次，或每月一次的方式给药。在优选实施方案中，所述治疗有效量为约1,000，μg/m²到20,000μg/m²，例如，约1,000，1,500，4,000，或14,000llg/m²的修饰的无唾液酸-干扰素，以每天一次，每隔一天一次，每周两次，每周一次，每隔一周一次，或每月一次的方式给药。

″片段″是指基本上与参比蛋白或核酸相同的部分蛋白或核酸，其保持参比蛋白或核酸的生物活性(例如抗肿瘤活性或抗病毒活性)的至少50％或75％，更优选80％，90％，or 95％，或甚至99％，可通过使用本文所述抗病毒或抗肿瘤实验测定。

本发明的修饰的无唾液酸-干扰素在治疗疾病方面优于天然存在的干扰素许多优点。修饰(例如，PEG化或PVP化)的优点在于：增加溶解性，降低肾和免疫清除率，降低蛋白水解敏感性，以及降低免疫原性。如本文所述，无唾液酸-干扰素的修饰辅助降低所述化合物从身体清除的速率，从而增加该化合物的治疗有效性。由于修饰的化合物在体内存在的时间比其未修饰的对应物延长，可对患者给药较少的修饰化合物而达到相同的治疗效果。此外，所述修饰的无唾液酸-干扰素靶向肝，这可导致与给药未修饰的干扰素相关的以及对治疗不利的继发效应的出现减少。

此外，从干扰素去除唾液酸基团可暴露其末端半乳糖残基，且所述无唾液酸-干扰素由此可靶向任何表达无唾液酸糖蛋白受体的细胞。已显示在受纤维化，硬化或肝细胞癌影响的肝中，受体位点的总数从正常肝中的每个细胞140,000(+/-65,000)位点增加到每个细胞300,000(+/-125,000)个位点(Eisenberg等，J.Hepatol.13：305-309，1991)。根据这些发现，修饰的无唾液酸-干扰素可优选靶向肝。这种靶向可增加治疗性化合物在治疗位点的局部浓度，从而可降低有效治疗疾病所需的剂量。

因此，本发明的化合物的治疗有效性增强，这是由于治疗性化合物的储留以及对具体组织的靶向增加。

附图简要说明

图1是天然人干扰素-β结构的示意图解。还说明神经氨酸酶对天然人干扰素-β的常见双触(biantennary)复合型糖链的切割位点。缩写：Fuc，岩藻糖；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺；Man，甘露糖；Gal，半乳糖；NeuAc，N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。

图2A是人干扰素-α-2前体多肽(登录号：P01563)(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，包括信号肽(氨基酸1-23；黑体字)。成熟干扰素-α-2多肽(普通字体)延伸为氨基酸24-188。氨基酸129的加下划线的苏氨酸是O-连接的糖基化位点。

图2B是编码人干扰素-α-2前体多肽的mRNA的核酸序列(登录号：NM_000605)(SEQ ID NO：4)。所述编码序列从核酸69延伸到核酸635。起始和终止密码子加下划线。该核酸序列有数种变体形式，包括以下核酸变化：核酸位置205的A到G；核酸位置667的A到G；核酸位置909的C到T；和/或核酸位置949的A到G。

图3A是干扰素-β前体多肽的氨基酸序列(登录号：P01574)(SEQ IDNO：2)，包括信号肽(氨基酸1-21；黑体字)。所述成熟人干扰素-β多肽(普通自体)延伸为氨基酸22-187。在氨基酸位置101加下划线的天冬酰胺是O-连接的糖基化位点。人干扰素-β变体多肽含有氨基酸位置162的酪氨酸(C到Y)。

图3B是编码人干扰素-β前体多肽的mRNA的核酸序列(登录号：NM_002176)(SEQ ID NO：5)。所述编码序列延伸为核酸1-564。起始和终止密码子加下划线。该核酸序列有数种变体形式，包括以下核酸变化：核酸位置153的C到T，以及核酸位置228的C到T。

图4A是人干扰素-γ前体蛋白的氨基酸序列(登录号.：P01579)(SEQ IDNO：3)，包括信号肽(氨基酸1-20；黑体字)。所述成熟人干扰素-γ多肽(普通字体)延伸为氨基酸21-166。干扰素-γ前体蛋白中氨基酸位置48和120的加下划线的天冬酰胺是N-连接的糖基化位点(尽管Asn120是二聚体中唯一被糖基化的)。

图4B是编码人干扰素-γ前体蛋白的mRNA的核酸序列(NM_000619)(SEQ ID NO：6)。所述编码序列延伸为核酸109-609。起始和终止密码子加下划线。该核酸序列有数种变体形式，包括以下核酸变化：核酸624的A到G；核酸705的A到G；核酸732的A到T；核酸789的C到T；核酸986的C到T；以及核酸1148的A到G。

发明详细说明

本发明涉及修饰的无唾液酸-干扰素，例如聚乙二醇化无唾液酸-干扰素和聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素，以及使用这些化合物治疗肿瘤疾病和病毒感染的方法。修饰的无唾液酸-干扰素靶向表达无唾液酸糖蛋白受体以及干扰素受体的细胞。因此，这种化合物也可用于治疗表达这些受体的细胞的肿瘤或病毒感染；然而，所述化合物对表达两种受体的细胞治疗活性最佳。

从干扰素去除唾液酸基团可暴露其末端半乳糖残基，并且由此无唾液酸-干扰素可靶向任何表达无唾液酸糖蛋白受体的细胞。已显示患有纤维化，硬化或肝癌的肝中，受体位点总数从正常肝中的每个细胞140,000(+/-65,000)个位点增加到每个细胞300,000(+/-125,000)个位点(Eisenberg等，J.Hepatol.13：305-309，1991)。根据这些发现，修饰的无唾液酸-干扰素将优选靶向肝。这种靶向增加治疗性化合物在治疗位点的局部浓度，从而使得有效治疗疾病所需的剂量降低。因此，本发明的化合物由于治疗性化合物的储留延长且对具体组织的靶向增强而具有增强的治疗有效性。

本发明修饰的无唾液酸-干扰素在治疗疾病方面由于天然存在的干扰素形式而有许多优点。修饰(例如，PEG化或PVP化)的优点在于：增加溶解性，降低肾和免疫清除率，降低蛋白水解敏感性，以及降低免疫原性。如本文所述，无唾液酸-干扰素的修饰有助于降低所述化合物从身体清除的速率，从而增加该化合物的治疗有效性。由于修饰的化合物在体内存在的时间比其未修饰的形式延长，可对患者给药较少的修饰化合物。由于剂量减少，这可导致与给药修饰的干扰素相关的以及对治疗不利的继发效应的出现减少。

修饰的无唾液酸-干扰素治疗

和天然干扰素一样，修饰的无唾液酸-干扰素可用于治疗肝病，包括肝炎和一些癌症。例如，利用本发明所述方法，可通过将药物组合物给药哺乳动物来治疗该哺乳动物(例如人)中的乙型和丙型肝炎以及表达无唾液酸糖蛋白的肝癌，所述药物组合物包括治疗有效量的修饰的无唾液酸-干扰素(例如，修饰的无唾液酸-干扰素-α，修饰的无唾液酸-干扰素-β或修饰的无唾液酸-干扰素-γ)。

此外，修饰的无唾液酸-干扰素可与其它治疗方法联用，所述治疗方法诸如化疗，放射治疗，手术介入，以及给药其它抗病毒化合物。(这样的组合是本领域标准的并在例如Wadler等(Cancer Res.50：3473-86，1990)中描述)。例如，可将修饰的无唾液酸-干扰素与治疗有效量的利巴韦林(1β-D呋喃核糖基(ribofuranosyl)-1H-1，2，4三唑3-甲酰胺(carboxamide))或其衍生物联合给药以治疗病毒感染。另外，可将修饰的无唾液酸-干扰素与治疗有效量的拉米夫定(lamivudine)((顺-1-[2′-羟基甲基-5′-(1，3-氧硫杂茂烷基)]胞嘧啶)或其类似物联合给药以治疗病毒感染。

无唾液酸糖蛋白受体

无唾液酸糖蛋白受体是在肝细胞上以高密度(50,000到500,000位点/细胞)存在的跨膜蛋白并介导具有暴露的末端残基的细胞外糖蛋白的内化。该无唾液酸糖蛋白受体是低亲和性受体，且其对配体的亲和力随该配体上存在的半乳糖簇(cluster)的数目而变化(Lee等，J.Biol.Chem.258：199-202，1983)。该受体对具有两个半乳糖残基的簇(双触)的配体的亲合力(K_D～10^-6)低于对具有三个半乳糖残基的簇(三触)的配体(K_D～10^-8-10^-9)。

干扰素的递送

从任何天然干扰素去除唾液酸基团可暴露末端半乳糖残基(图1)，产生无唾液酸糖蛋白受体的识别位点。这种修饰使得无唾液酸-干扰素可选择性靶向表达无唾液酸糖蛋白受体的组织诸如肝等。此外，与无唾液酸糖蛋白受体的结合以及受体复合物内化很可能增加无唾液酸-干扰素活化细胞内干扰素-α/β受体库的能力。此外，将无唾液酸-干扰素靶向无唾液酸糖蛋白受体很可能增加无唾液酸-干扰素在细胞表面的局部浓度，从而增加该无唾液酸-干扰素与高亲和力干扰素-α/β受体的结合的可能性，所述受体在肝细胞上以低密度(100-5,000位点/细胞)存在。

细胞表面干扰素受体结合

此外，通过与无唾液酸糖蛋白受体结合来增加肝细胞表面的无唾液酸-干扰素局部浓度，使得无唾液酸-干扰素-α，-β或-γ很可能与干扰素-α/受体或干扰素-γ受体反应。将无唾液酸-干扰素从无唾液酸糖蛋白受体转移到干扰素-α/β受体或干扰素-γ受体很可能在对无唾液酸糖蛋白受体亲合力降低的无唾液酸-干扰素组合物中发生。所述无唾液酸糖蛋白受体对配体的亲合力随存在于该配体上的半乳糖簇数目而变化(Lee等，J.Biol.Chem.258：199-202，1983)。所述无唾液酸糖蛋白受体对双触(biantennary)配体的(K_D～10^-6)亲和力低于对三触(triantennary)配体的亲合力(K_D～10^-8-10^-9)。

本领域已知各种方法来产生具有不同比例的双触复合物的干扰素。例如，纤维母细胞产生的干扰素的双触复合物比例高于CHO细胞产生的该干扰素。具体地，人纤维母细胞产生的人无唾液酸-干扰素-β含有约82％的双触半乳糖-末端寡糖以及约18％的三触半乳糖-末端寡糖。

如果干扰素-β碳水化合物链的结构扩展(Karpusas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：11813-11818，1997)，干扰素-β很可能与无唾液酸糖蛋白受体和干扰素-α/β受体同时反应。因此大量无唾液酸糖蛋白受体可使无唾液酸-干扰素-β在细胞表面浓缩和其可能同时与较少量的干扰素-α/β受体反应。

细胞内干扰素受体结合

干扰素-α，-β或-γ与细胞内干扰素受体的结合很可能引发干扰素信号传递(signaling)。掺入脂质体的干扰素-α产生的活性明显高于游离干扰素-α，支持了干扰素不需要到达细胞表面即可显示活性这一假设。此外，配体与无唾液酸糖蛋白受体的结合激发了受体-配体复合物的内化，使得无唾液酸-干扰素可接近细胞内干扰素受体。

干扰素制备

通常，本发明的多肽，诸如干扰素-α(图2A)，-β(图3A)或-γ(图4A)可通过用全部或部分编码多肽的核酸分子转化适宜的宿主细胞例如真核细胞来制备，所述核酸分子诸如图2所示的干扰素-α编码的核酸，图3B所示的干扰素-β编码的核酸，图4B所示的干扰素-γ编码核酸或位于适当表达载体中的片段。

分子生物学领域技术人员将理解多种表达系统可用于提供所述重组蛋白。可产生真核干扰素肽表达系统，其中干扰素肽基因序列被导入质粒或其它载体，并随后用于转化活细胞。其中的干扰素肽cDNA含有以正确方向插入表达质粒的整个开放读框的构建体可用于蛋白表达。真核表达系统允许干扰素肽融合蛋白的表达和回收，其中所述干扰素肽与标记分子共价连接，从而易于鉴定和/或纯化。可在干扰素肽和标记分子之间改造酶或化学切割位点，使得所述标记可在纯化后被去除。

常见表达载体含有用于指导大量mRNA合成的启动子，所述mRNA对应携带质粒的细胞中所插入的干扰素肽核酸。它们也可包括真核或原核复制起点序列，使其可在宿主生物体内自主复制，编码使得含载体细胞可在其它毒性干扰素的存在的条件下被选出的遗传特性的序列，以及可增加合成mRNA的翻译效率的序列。稳定长期载体可利用调节元件例如病毒保持为游离复制实体(例如来自Epstein Barr病毒基因组的OriP序列)。还可产生所述载体整合到其基因组DNA的细胞系，且基因产物可以这种方式持续产生。

所用具体宿主细胞对本发明而言不是关键性的。本发明的多肽可在真核宿主(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，昆虫细胞例如Sf21细胞，或哺乳动物细胞例如，NIH 3T3，HeLa，CHO，COS细胞，或优选在纤维母细胞中)中制备。这种细胞可自多种来源获得(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA；也参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，2001)。转化或转染的方法以及表达载体的选择取决于所选宿主系统。转化和转染方法在例如Ausubel等(supra)；expression vehicles may be chosen fromthose provided，例如，in Cloning Vectors：A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等，1985，Supp.1987)中描述。

存在多种表达系统以制备本发明的多肽。例如可利用哺乳动物细胞表达干扰素多肽。稳定或瞬时细胞系克隆可利用干扰素肽表达载体进行，从而产生可溶形式的(截短的和标记的)干扰素多肽。适宜的细胞系包括，例如COS，HEK293T，CHO或NIH 3T3细胞系。适宜的载体包括但不限于，染色体，游离基因以及病毒来源的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离基因、插入元件、酵母染色体元件、病毒(诸如杆状病毒，乳多泡病毒，诸如SV40，痘苗病毒，腺病毒，鸡痘病毒，猪疱疹病毒1群(pseudorabies viruses)以及逆转录病毒的载体，以及来自其组合的载体。

一旦构建出适宜的表达载体，通过转化技术将其引入适宜的宿主细胞，所述技术诸如但不限于，磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖转染，电穿孔，显微注射，原生质融合或脂质体介导的转染。用本发明的载体转染的宿主细胞可包括(但不限于)酵母，真菌，昆虫细胞(利用例如杆状病毒载体在SF9昆虫细胞中进行表达)，或来自小鼠，人或其它动物的细胞。干扰素多肽的体外表达，融合，或克隆的DNA编码的多肽片段也可使用。分子生物学领域熟练技术人员将理解可利用多种表达系统和纯化系统来制备重组干扰素多肽及其片段。一些这样的系统在例如Ausubel等(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)，包含在本文中作为参考)中描述。

天然糖基化干扰素可从天然产生它的人细胞，或经改造而表达重组干扰素基因的转基因真核细胞分离。天然或重组制备干扰素的方法通常描述于美国专利：4,124,702，4,130,641，4,680,261，4,758,510，5,376,567，5,795,779，和5,827,694。另外，分离和纯化人干扰素可购得(例如，SigmaChemical Co.产品目录号I 2396，I 2271，I 1640，和I 6507)。

一旦本发明的重组多肽被表达，就可利用如亲和色谱法来分离。一个实例中，抗本发明多肽的抗体(例如通过本领域技术人员已知的标准技术制备的)可附着于柱上并用于分离所述重组多肽。在亲和色谱前可用标准方法对含多肽细胞进行裂解和分级(参见例如，Ausubel等，上文)。

一旦被分离，所述重组蛋白可根据需要被进一步纯化，例如通过高效液相色谱或其它色谱法(参见例如Fisher，Laboratory Techniques InBiochemistry And Molecular Biology，eds.，Work and Burdon，Elsevier，1980)。

本发明的多肽，特别是短肽片段，也可通过化学合成制备(例如通过Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984中所述方法)。

这些多肽表达和纯化的常见技术也可用于制备和分离具有上述干扰素生物活性的有用的肽片段以及类似物。

无唾液酸-干扰素制备

制备具有不同比例双触复合物的干扰素的各种方法是已知的。纤维母细胞产生的干扰素比中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的干扰素具有较高例如较高的双触复合物的比例。具体地，人纤维母细胞产生的人无唾液酸-干扰素-β含有约82％的双触半乳糖-末端寡糖以及约18％的三触半乳糖-末端寡糖。

无唾液酸-干扰素可通过从干扰素去除末端唾液酸残基来制备，所述干扰素是糖基化的并通常具有由于其从真核细胞产生而具有该残基(见例如美国专利4,184,917及其中引用的参考文献，和Kasama等，J.Interfer.Cyto.Res.15：407-415，1995)。末端唾液酸残基可通过例如温和的酸水解或用分离的纯化细菌或病毒神经氨酸酶处理天然糖基化干扰素而被去除，如Drzenieck等(Microbiol.Immunol.59：35，1972)所述。包括来自产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridinm perfringens)，鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)，Arthrobacter ureafaciens，和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的神经氨酸酶在内的纯化的神经氨酸酶可容易地自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)买到(产品目录号N 3642，N 5146，N 7771，N 5271，N 6514，N 7885，N2876，N 2904，N 3001，N 5631，N 2133，N 6021，N 5254，和N 4883)。

例如，为制备人无唾液酸-干扰素-β，在微量离心管中将附着于琼脂糖珠(beaded agarose)(约0.22单位)的20mg不溶性神经氨酸酶混悬于1ml蒸馏水中，并使其短暂水合。所述琼脂糖通过离心沉淀并用1ml乙酸钠缓冲液(pH5.5)洗涤三次，所述缓冲液含有154mM NaCl和9mM氯化钙，并将所述凝胶(约72ul)重悬浮于150μl乙酸钠缓冲液中。例如，可将糖基化的人干扰素-β(3×10⁶IU/小管，约0.15mg)悬浮于150μl乙酸钠缓冲液中。所述凝胶和干扰素-β随后被混合并在37C在旋转平台上温育3小时，并通过用0.2μm的滤膜进行离心过滤而将所述混合物与所述神经氨酸酶分离。可将所得无唾液酸-干扰素储存在-80℃较长时间。

另一制备无唾液酸-干扰素的示例方法包括用一个单位的Arthrobacterureafaciens-产生的神经氨酸酶消化天然人干扰素-β，所述消化在37℃、1ml 5mM甲酸(pH3.5)中进行3小时。水解后，所述无唾液酸-干扰素-β可在C18反相柱(例如，Zorbaxs PR-10)上用0.1％三氟乙酸中的乙腈线性梯度分离。其它制备无唾液酸-干扰素的方法通常描述于美国专利6,296,844(包含在本文中作为参考)。

制备聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素

聚乙二醇(PEG)是中性、水溶性、非毒性聚合物。(各种平均分子量的PEG可购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，且修饰成适合蛋白结合形式的PEG可得自Shearwater Corporation(Huntsville，AL)或Valentis，Inc.(Burlingame，CA.))。缺乏毒性可由PEG是FDA许可内部使用的少数合成聚合物之一反映出来，其可见于食品，化妆品，个人护理产品和药物。在含水介质中，长链样PEG分子大量水合，并迅速移动。所述迅速移动导致PEG清除(sweeping out)较大体积(其“排除体积(exclusion Volume))，并防止其它分子接近。实际上，PEG对于生物系统而言大部分是不可见的，并且通过移动结合的水分子显示。这一特性的一个结果即PEG是非免疫源性的。

为使聚合物分子与多肽共价结合，所述聚合物分子的羟基末端基团必须以活性形式提供，所述活性形式即具有反应性功能基团(其实例包括伯氨基，酰肼(HZ)，硫醇，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(succinimidylsuccinate)(SS)，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(succinimidyl succinamide)(SSA)，琥珀酰亚胺基丙酸酯(succinimidyl proprionate)(SPA)，琥珀酰亚胺基羧甲基化产物(succinimidy carboxymethylate)(SCM)，苯并三唑碳酸酯(benzotriazolecarbonate)(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，乙醛，碳酸硝基苯酯(NPC)，和tresylate(TRES))。适宜的活化的聚合物分子是可购得的，例如购自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Ala.USA。另外，所述聚合物分子可通过本领域已知的常规方法活化，例如WO 90/13540中公开的方法。

用于本发明的活化的线性或分支的聚合物分子的具体实例描述于Shearwater Polymers，Inc.1997 and 2000 Catalogs(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycoland Derivatives，包含在本文中作为参考)。活化的PEG聚合物的具体实例包括以下线性PEGs：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，以及NOR-PEG)，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，以及分支的PEG诸如PEG2-NHS和美国专利5,932,462和5,643,575描述的那些，其均在本文中作为参考。

可与无唾液酸-干扰素结合的PEG衍生物的实例包括以下衍生物：

(mPEG-丙醛(mPEG-ALD))

(mPEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯(mPEG-SPA))

(mPEG-琥珀酰亚氨基丁酸酯(mPEG-SBA))

(mPEG-马来酰亚胺(mPEG-MAL))

(mPEG-乙烯砜)

(mPEG-邻-吡啶基-二硫化物)

(mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS))

(mPEG2-马来酰亚胺(mPEG2-MAL))

此外，以下出版物(包含在本文作为参考)公开了有用的聚合物分子和/或PEG化的化合物：美国专利5,824,778，5,476,653，WO 97/32607，EP229,108，EP 402,378，美国专利4,902,502，5,281,698，5,122,614，5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 095/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，U.S.Pat.No.5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，U.S.Pat.No.5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，美国专利5,473,034，5,516,673，EP 605 963，美国专利5,382,657，EP 510 356，EP 400472，EP 183 503和EP 154 316。

所述多肽与活化的聚合物分子的结合利用任何常规方法进行，例如以下参考文件中所描述的方法(也描述了活化聚合物分子的适宜方法)：Harrisand Zalipsky，eds.，Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications，AZC，Washington；R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjμgation and Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y)。本领域技术人员应理解所用活化方法和/或结合化学方法取决于干扰素多肽的结合基团以及所述聚合物的功能基团(例如对于sulfydryl为氨基，羟基，羧基，醛)。PEG化可针对与多肽上所有可得结合基团(即暴露于所述多肽表面的这种结合基团)的结合，或者可针对特定的结合基团，例如N-末端氨基(美国专利5,985,265)。此外，所述结合可通过一步反应或逐步方式实现(例如，WO 99/55377中所述)。

可以和无唾液酸-干扰素结合的PEG包括平均分子量1,000-5,000，5,001-10,000，10,001-20,000，20,001-35,000，或35,001-60,000道尔顿(例如，3,350，5,000，8,000，10,000，12,000，20,000，30,000，35,000，40,000或60,000道尔顿)的PEG。低分子量PEG(例如，平均分子量为5000道尔顿的PEG)的靶位点相对非选择性的，这是由于较小的PEG可通过蛋白表面上其他难以接近的区域。另外，可利用高分子量PEG。这种高分子量PEG的分子量可达60,000道尔顿。高分子量PEG的键合化学稳定性增加，在需要位点特异性的PEG化时是有利的。具有分支结构的PEG衍生物的分子体积相对较大。因此，利用分支PEG衍生物可获得PEG结合的一些优点而无需多个结合位点。

无唾液酸-干扰素可在氨基酸序列中的多个不同残基发生PEG化，包括在干扰素的半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸残基；C-末端羧基；或N-末端氨基。例如，N末端前导序列(氨基酸1-23)被去除的无唾液酸-干扰素-α-2b可在图2A显示的黑体序列中的以下位置之一PEG化：半胱氨酸1，赖氨酸23，赖氨酸31，赖氨酸49，赖氨酸70，赖氨酸83，赖氨酸112，赖氨酸121，酪氨酸129，赖氨131，赖氨酸133，赖氨酸134，以及赖氨酸164。本发明的无唾液酸-干扰素可在一或多个位点与PEG聚合物结合。

PEG化反应可通过将温育纯化的无唾液酸-干扰素与PEG亲电衍生物(SC-PEG)或PEG的其它任何活化形式在pH6.5的100mM磷酸钠中保温，然后通过离子交换色谱分离反应产物而进行。这样的离子交换柱可以是SP-5PW强阳离子交换柱(21.5mm i.d.，长15cm，颗粒大小13μm，TosoHaas，Montgomeryville，PA)。所述柱可在pH5.8的10mM磷酸钠缓冲液中平衡，且PEG化的产物可利用百分比渐增的pH5.880mM磷酸钠缓冲液洗脱，并利用UV光在波长214nm进行检测。为浓缩所述分离的产物，可利用分子量截断(molecular mass cutoff)为10kDa的CENTRIPLUS-10微量浓缩柱(Amicon，Beverly，MA)。

另外，无唾液酸-干扰素可通过将摩尔比为1∶3的无唾液酸-干扰素和PEG的混合物在pH9.0的50mM硼酸钠缓冲液中保温而被PEG化。该混合物的终蛋白浓度为约5mg/ml。所述反应混合物可随后在4℃搅拌2小时，并通过用冰醋酸调节混合物pH到4.5来终止反应。为分离所需的反应产物，所述混合物可用水稀释10倍，并以线性速率1.3cm/min加样于用FractogelEMD CM 650(M)基于甲基丙烯酸酯的聚合物亲水色谱树脂充填的柱上，，所述柱已经用20mM乙酸钠(pH4.5)平衡。蛋白可以2mg/ml的浓度加样于柱上。所述柱可用平衡缓冲液洗涤以去除过量的PEG试剂和反应副产物。所需PEG化无唾液酸-干扰素可用平衡缓冲液中的200mM氯化钠从该柱洗脱。纯化的PEG产物可进一步浓缩并储存在4℃的含有20mM乙酸钠(pH5.0)和150mM氯化钠的无菌缓冲液中。

此外，位置异构体可通过以适宜该柱的流速(例如，对于21.5mm i.d.柱为6mL/min，对于7.5mm i.d.柱为1mL/min)通过用安装有SP-5PW强阳离子交换柱(例如，Toso Haas，21.5mm i.d.，15cm长，13μm颗粒大小或7.5mmi.d.，75mm长，10μm颗粒大小)的Waters Delta Prep 3000制备HPLC系统(Analytical Sales and Service，Mahwah，NJ)而被区分出来。这些柱可使用磷酸钠(pH5.8)浓度渐增的线性梯度，或pH渐增的线性梯度(4.3-6.4)，从0到100％磷酸氢二钾(pH6.4)。所述位置异构体可利用UV光在214nm或208nm的波长下检测。

制备其它修饰的无唾液酸-干扰素

除了上述的PEG化无唾液酸-干扰素，还可将其它水溶性聚合物结合于无唾液酸-干扰素。此外，单个干扰素可通过一种以上类型的水溶性聚合物来修饰。例如，可将干扰素与PEG和PVP聚合物结合。适宜的水溶性聚合物的实例包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚(氧化烯烃)，诸如聚(丙二醇)(PPG)，聚三亚甲基二醇(PTG)，和聚(氧乙烯化多元醇)，诸如聚(氧乙烯化山梨醇)，聚(氧乙烯化甘油)，和聚(氧乙烯化葡萄糖)。这种聚合物可购得，例如购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。此外，水溶性聚合物可在与无唾液酸-干扰素结合以前活化。

与蛋白结合前活化聚合物的技术是本领域已知的。例如，上述mPEG衍生物是PEG的活化形式。羟基的活化可利用三氯-s-三嗪(trichloro-s-triazine)(TsT；氰尿酸)进行。另外，羟基可通过胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺基-或碳酸对-硝基苯基酯活性酯来活化(参见，例如，Zalipsky等，Biotechnol.Appl.Biochem.15：100-114，1992)。此外，当含羟基聚合物首先与环式酸酐(例如琥珀酸或戊二酸(gluraric)酸酐)反应并随后在碳化二亚胺存在下将本发明的羧基修饰的产物与N-羟基琥珀酰亚胺偶联时，可实现活化。该反应产生琥珀酰亚氨基琥珀酸酯或戊二酸酯型活性酯(Abuchowski等，CancerBiochem.Biophys.7：175-186，1984)。活化也可通过将该聚合物与N，N′-羰基二咪唑(CDI)反应形成的咪唑基氨基甲酸酯中间体实现。CDI-活化的聚合物与蛋白的胺基反应形成稳定的N-烷基氨基甲酸酯连接，其与利用琥珀酰亚氨基碳酸酯化学法(succinimidyl carbonate chemistry)形成的相同(Beauchamp等，Anal.Biochem.131：25-33，1983)。

本文所述任何聚合物可与无唾液酸-干扰素结合。通常，聚合物可经过或不经过预先活化而与蛋白通过侧挂基团共价结合，所述侧挂基团存在于干扰素中或者是利用化学修饰或其它标准方法加入无唾液酸-干扰素中的。这种侧挂基团的实例包括伯氨基，羧基，芳香环和硫醇。将聚合物结合于无唾液酸-干扰素的可取基团包括例如，蛋白的赖氨酸残基中的游离氨基，以及N-末端氨基酸的α-氨基。

进行结合反应的聚合物-蛋白比取决于所述聚合物的性质(例如结构，大小，电荷和反应性)以及与该聚合物结合的亚基的性质。可通过常规实验确定所述比，例如通过改变该比并测定反应产物的生物活性(例如抗增生或抗病毒活性，如下一部分所述)以及结合稳定性。

修饰的无唾液酸-干扰素的生物活性分析

本领域许多标准方法可用于分析修饰的无唾液酸-干扰素诸如PEG化的无唾液酸-干扰素的抗病毒和抗增生活性(例如，Monkarsh等，AnalyticalBiochemistry 247：434-440，1997和Bailon等，Bioconjμgate Chem.12：195-202，2001中公开的方法)。例如，各种修饰的无唾液酸-干扰素异构体的抗病毒活性可在微量滴定板实验中测定，如Grace等(J.of Interferon and CytokineResearch 21：1103-1115，2001)所述。在这种实验中，易受病毒感染的哺乳动物细胞诸如Mardin-Darby牛肾细胞或人包皮纤维母细胞被病毒例如疱疹性口炎(vesicular stomatitis)病毒或脑心肌炎(encephalomyocarditis)病毒感染。修饰的无唾液酸-干扰素的相对效力可通过比较实验用修饰的无唾液酸-干扰素的剂量与对照干扰素(例如干扰素-α2a，无唾液酸-干扰素，或对照PEG化无唾液酸-干扰素)的剂量确定，所述实验用修饰的无唾液酸-干扰素的剂量可防止50％的感染细胞受到病毒细胞病变作用影响。

此外，可利用动物模型测定修饰的无唾液酸-干扰素的抗肿瘤活性。例如，可将癌细胞系诸如人肾A498或人肾ACHN细胞移植到无胸腺裸小鼠体内。具体地，将2×10⁶个细胞移植到所述小鼠背部皮下。3-6周内，所述细胞形成肿瘤，所述肿瘤体积为0.05-0.50立方厘米。所述小鼠可用实验剂量的修饰的无唾液酸-干扰每周治疗至少一次。所述治疗方案可持续4-5周。治疗后，可比较治疗组和对照组(例如接受干扰素-α2a或干扰素-β1a)的肿瘤体积改变，由此可评估修饰的无唾液酸-干扰素的相对抗肿瘤活性。

另一方面，修饰的无唾液酸-干扰素的抗增生活性可利用细胞培养实验测定。例如，保持在RMPI 1640中的固定悬浮培养物中的人Daudi细胞(Burkitt′s淋巴瘤)可用于所述实验，其中RMPI 1640中补充了15％胎牛血清和2mM谷氨酰胺(所有均购自Grand Island Biologicals，Grand Island，NY)。将2×10⁴个细胞加入微量滴定板(Costar，MA)的各孔的100μl培养基中。所述板可在37℃、5％CO2中保温72小时。收集前16小时，所述细胞用0.25mCi/孔的[³H]胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)冲击(pulse)。所述细胞可收集到玻璃滤膜上并在液闪计数仪中计数。随后比较修饰的无唾液酸-干扰素处理的和对照干扰素处理的细胞所得结果，以确定具体的修饰的无唾液酸-干扰素的相对抗增生活性以及抗肿瘤活性。可比较实验和对照细胞的其它生物活性，诸如2′-5′寡腺苷酸合成酶活性，血清neopterin水平，β2-微球蛋白表达，以及自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞测定公开于Grace等(J.干扰素Cytokine Res.21：1103-1115，2001)和Bailon等(Bioconjμgate Chem.12：195-202，2001)。

修饰的无唾液酸-干扰素的药物动力学和生物分布

修饰的无唾液酸-干扰素可利用本领域已知的方法通过其药物动力学和药效学特性表征。可分析药物动力学参数诸如C_max，T_max，t_1/2，AUC_(0-∞)，和清除率。此外，对病毒细胞病变作用的药效测定可与修饰的无唾液酸-干扰素血清浓度相关。这种方法的实例描述于，如Pepinsky等(J.Pharmacol.Exp.Ther.297：1059-1066，2001)和Bailon等(Bioconjμgate Chem.12：195-202，2001)中。此外，可评估放射性标记的无唾液酸-干扰素的组织分布以证实其靶向肝。

剂量

根据本发明的治疗方法，不意图限制修饰的无唾液酸-干扰素给药患者的具体给药方式，剂量或给药频率；本发明涉及所有给药方式，包括经肌肉内、静脉内、腹膜内、囊内、关节内、伤口内、皮下或任何可提供足以降低肿瘤细胞数目或防止病毒复制或扩散的剂量的给药方式。所述化合物可以单个剂量或多个剂量给药患者。当给药多个剂量时，所述剂量可间隔例如一天，两天，一周，两周，或一个月。例如PEG化的无唾液酸-干扰素可以每周给药一次，持续例如2，3，4，5，6，7，8，10，15，20，或更多周。应理解对于任何具体的患者，应根据个体需要和给药者或该组合物给药监督者的专业判断来随时间调节具体的给药方案。例如，如果低剂量不足以提供抗肿瘤或抗病毒活性，修饰的无唾液酸-干扰素的剂量可增加。反之，如果肿瘤或病毒感染已从患者体内清除，则可降低修饰的无唾液酸-干扰素的剂量。

虽然主治医师将最终决定适宜的量和给药方案，修饰的无唾液酸-干扰素，诸如aPEG化或PVP化的无唾液酸-干扰素的治疗有效量可以是，例如，约0.0035μg到20μg/kg体重/天或0.010μg到40μg/kg体重/周。优选所述治疗有效量为约0.025μg到10μg，例如，约0.025，0.035，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0或9.0μg/kg体重，每天一次，每隔一天一次，或每周两次给药。此外，所述治疗有效量可为约0.05，0.7，0.15，0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，或18.0μg/kg体重，每周一次，每隔一周一次，或每月一次给药。此外，修饰的无唾液酸-干扰素的治疗有效量可以是例如约100μg/m²到100,000μg/m²，以每隔一天一次，每周一次，或每隔一周一次给药。在优选的实施方案中，所述治疗有效量可以为约1000μg/m²到20,000g/m²，例如，约1000，1500，4000，或14,000μg/m²的修饰的无唾液酸-干扰素，以每天一次，每隔一天一次，每周两次，每周一次或每隔一周一次给药。

药物组合物的配制

给药修饰的无唾液酸-干扰素(例如，PEG化或PVP化的无唾液酸-干扰素)化合物可以采用任何适宜的方式，其中与其它组分联用的修饰的无唾液酸-干扰素的浓度在到达靶区域时具有抗病毒或抗肿瘤性质。所述化合物可以以任何适宜量包含在任何适宜载体物质中，其通常占组合物总重的1-95％。所述组合物通常为适宜胃肠外(例如皮下，静脉内，肌肉内，或腹膜内)给药途径的剂型。所述药物组合物可根据常规药物实践进行配制(参见例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed.A.R.Gennaro，Lippincott Williams & Wilkins，2000 and Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology，eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，NewYork)。

本发明的药物组合物可配制成在给药时或给药后预定的时间或期间立即释放活性化合物。后一种组合物形式通常已知为控释制剂，其包括(i)可在体内在较长时间内产生基本恒定浓度的修饰的无唾液酸-干扰素的制剂；(ii)在给定延迟时间之后在体内在较长时间内产生恒定浓度的修饰的无唾液酸-干扰素的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定有效的修饰的无唾液酸-干扰素水平、同时最小化与活性修饰的无唾液酸-干扰素物质的血浆水平波动(锯齿状动力模式)相关的不良副作用，在预定的时间中维持修饰的无唾液酸-干扰素作用的制剂；(iv)通过例如空间替代患病组织或器官附近或其中的控释组合物，定位修饰的无唾液酸-干扰素作用的制剂；(v)便于给药的制剂，例如可每周一次或每两周一次给药所述组合物；和(vi)通过使用载体或化学衍生物来将修饰的无唾液酸-干扰素递送到具体靶细胞类型从而靶向修饰的无唾液酸-干扰素作用的制剂。给药控释剂型的修饰的无唾液酸-干扰素对于在胃肠道中具有较窄的吸收窗或相对较短的生物半寿期的修饰的无唾液酸-干扰素而言是尤其优选的。

为获得其中目的化合物释放速率超过代谢速率的控释可采用多种策略。在一个实施例中，控释通过适当选择各种制剂参数和成分来获得，所述参数和成分包括，例如各种类型的控释组合物和包衣。因此，将修饰的无唾液酸-干扰素和适宜的赋型剂配制在药物组合物中，所述药物组合物在给药时以受控的方式释放修饰的无唾液酸-干扰素。实例包括单个或多个单位的片剂或胶囊组合物，油溶液，悬浮液，乳液，微胶囊，分子复合物，微球体，纳米微粒，贴剂和脂质体。

胃肠外组合物

所述药物组合物可通过注射，输注或植入(皮下，静脉内，肌肉内，腹膜内等)以剂量形式，制剂或通过适宜的递送载体或植入物经胃肠外给药，所述植入物可含有常规无毒可药用载体和佐剂。所述组合物的配制和制备是药物配制领域技术人员熟知的。制剂参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，上文。

胃肠外用组合物可以单位剂量形式(例如单剂量安瓿剂)提供或在含有数个剂量并可添加适当防腐剂(见下文)的小瓶中提供。所述组合物可以是溶液，悬浮液，乳液，输注装置或用于植入的递送装置，或其可以为干粉以便在使用前用水或其它适宜载体再配制。除了活性修饰的无唾液酸-干扰素以外，所述组合物可包含适宜的胃肠外可接受的载体和/或赋型剂。所述活性无唾液酸-干扰素可掺入微球体，微胶囊，纳米微粒，脂质体等以便控制释放。此外，所述组合物可包含混悬剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂，毒性调节剂和/或分散剂。

如上所述，本发明的药物组合物可以是适宜无菌注射的形式。为制备这种组合物，适宜的活性修饰的无唾液酸-干扰素可溶解或混悬于胃肠外可接受的液体载体中。可使用的可接受的载体和溶剂包括水，通过添加适宜量的盐酸，氢氧化钠或适宜的缓冲液调节到适宜pH的水，1，3-丁二醇，林格氏溶液，右旋糖溶液和等张氯化钠溶液。含水制剂也可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯或对-羟基苯甲酸正丙酯)。如果一种化合物在水中微溶，可加入增溶剂，或者所述溶剂可包含10-60％w/w的丙二醇等。

控释胃肠外组合物

控制胃肠外组合物可以是含水悬浮液，微球体，微胶囊，磁性微球，油溶液，油悬浮液或乳液。另一方面，所述活性修饰的无唾液酸-干扰素可掺入生物相容的载体，脂质体，纳米微粒，植入物或输注装置。

用于制备微球体和/或微胶囊的物质为，例如可生物降解的/可生物腐蚀的聚合物，诸如聚催乳素(polygalactin)，聚-(氰基丙烯酸异丁基酯)，聚(2-羟乙基-L谷氨酰胺)，聚(乳酸)，聚乙醇酸及其混合物。可用于配制控释胃肠外制剂的生物相容性载体是碳水化合物(葡聚糖)，蛋白(例如白蛋白)，脂蛋白或抗体。用于植入物中的物质可以是非-生物可降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如聚己内酮)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))或其组合物。

口服使用的固体剂型

口服使用的制剂包括含有活性成分以及非毒性可药用赋型剂的片剂，这种制剂是本领域技术人员已知的(例如，美国专利：5,817,307，5,824,300，5,830,456，5,846,526，5,882,640，5,910,304，6,036,949，6,036,949，6,372,218，在文中引用作为参考)。这些赋型剂可以是例如，惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖，山犁醇，糖，甘露糖，微晶纤维素，淀粉包括马铃薯淀粉，碳酸钙，氯化钠，乳糖，磷酸钙，硫酸钙，或磷酸钠)，造粒剂和崩解剂(例如纤维素衍生物包括微晶纤维素，淀粉包括马铃薯淀粉，交联羧甲基纤维素钠(croscarmellose sodium)，藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖，葡萄糖，山梨醇，阿拉伯胶，藻酸，藻酸钠，明胶，淀粉，预胶化淀粉，微晶纤维素，硅酸镁铝，羧甲基纤维基，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂，助流剂，和抗粘附剂(例如硬脂酸镁，硬脂酸锌，硬脂酸，硅石，氢化植物油或滑石)。其它可药用的赋型剂可为着色剂，调味剂，增塑剂，保湿剂，缓冲剂等。

所述片剂可以是无包被的或其可由已知技术包被，任选用于延缓在胃肠道中的分解和吸收，从而在长时间内提供持续的作用。所述包衣可适于以预定的方式释放所述活性修饰的无唾液酸-干扰素物质(例如为获得控释的制剂)，或其可适于在到达胃以后释放所述活性修饰的无唾液酸-干扰素物质(肠溶包衣)。所述包衣可以是糖包衣，膜包衣(例如基于羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素，甲基羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羧甲基纤维素，丙烯酸酯共聚物，聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或肠溶包衣(例如基于甲基丙烯酸共聚物，纤维素乙酸酞酸酯，羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯，polyvinylacetate phthalate、虫胶和/或乙基纤维素)。此外，可使用时间延迟物质例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。

固体片剂组合物可包括适合保护所述组合物防止其发生不良化学变化的包衣，(例如在释放所述活性修饰的无唾液酸-干扰素物质前的化学降解)。所述包衣可以类似方式用于固体剂型，如Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology(上文)所述。

所述两种修饰的无唾液酸-干扰素可一起混合在片剂中或可为分开的形式。在一个实施例中，第一修饰的无唾液酸-干扰素含在片剂内部，第二修饰的无唾液酸-干扰素位于其外部，使得在释放所述第一修饰的无唾液酸-干扰素前已经释放了大部分第二修饰的无唾液酸-干扰素。

口服使用制剂可以咀嚼片或硬的明胶胶囊存在，其中的活性成分与惰性固体稀释剂(例如马铃薯淀粉，乳糖，微晶纤维素，碳酸钙，磷酸钙或高岭土)混合；或者以软明胶胶囊存在，其中的活性成分与水或油介质，例如花生油，液体石蜡或橄榄油混合。粉剂和颗粒剂可利用上述用于片剂和胶囊的成分以常规方式利用混合器，流化床装置来制备。

控释口服剂型

口服用控释组合物可例如构建成通过控制活性修饰的无唾液酸-干扰素物质的溶解和/或扩散来释放所述活性修饰的无唾液酸-干扰素。

溶解或扩散控制释放可通过适宜包被化合物的片剂，胶囊，丸或颗粒状制剂，或通过将所述化合物掺入适宜基质来实现。控释包衣可包括一或多种上述包衣物质和/或例如，虫胶，蜂蜡，糖蜡，蓖麻蜡，巴西棕榈蜡，十八烷醇，甘油单硬脂酸，甘油二硬脂酸，甘油棕榈酰硬脂酸酯，乙基纤维素，丙烯酸树脂，dl-聚乳酸，纤维素乙酸丁酸酯、聚氯乙烯，聚乙酸乙烯酯，乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯，聚甲基丙烯酸酯，甲基甲基丙烯酸甲酯，2-羟基甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯水凝胶，1，3-丁二醇，乙二醇甲基丙烯酸酯，和/或聚乙二醇。在控释基质制剂中，所述基质物质也可包括，例如水合甲基纤维素，巴西棕榈蜡和十八烷醇，卡波普(carbopol)934，聚硅氧烷，甘油三硬脂酸酯，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯，聚氯乙烯，聚乙烯和/或卤化氟烷。

含有所述组合物中的一种或多种化合物的控释组合物也可为可漂浮的片剂或胶囊(即在口服给药时可在胃内容物上方漂浮一段时间的片剂或胶囊)。所述化合物的漂浮片剂可通过对所述修饰的无唾液酸-干扰素与赋型剂和20-75％w/w的水胶体的混合物进行颗粒化来制备，所述水胶体诸如羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，或羟丙基甲基纤维素。所得颗粒可压成片。一旦与胃液接触，所述片剂在其表面形成基本上不透水的胶体屏障。该凝胶屏障参与保持低于1的密度，从而使得所述片剂可漂浮在胃液中。

其它实施方案

本文引用的所有出版物和专利申请包含在本说明书中作为参考，就好像具体并单独指出的每篇出版物和专利申请都包含于本说明书中作为参考。尽管前述发明通过说明和举例进行详细描述以便于清楚理解，根据本发明的教导本领域技术人员显而易见的是可进行任何改变和改进而不偏离所附权利要求的精神和范围。

序列表

<110> 通用医疗公司

(The General Hospltal corporation)

<120> 修饰的无唾液酸-干扰素及其用途

<130> 50206/013WO3

<150> US 60/431,148

<151> 2002-12-05

<150> US 60/408,361

<151> 2002-09-05

<160> 6

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 188

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys

1 5 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu

20 25 30

Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser

35 40 45

Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu

50 55 60

Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His

65 70 75 80

Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr

100 105 110

Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

115 120 125

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys

130 135 140

Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro

145 150 155 160

Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu

165 170 175

Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu

180 185

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser

145 150 155 160

His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe TYr

165 170 175

Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

180 185

<210> 3

<211> 166

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu

1 5 10 15

Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu

20 25 30

Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp

50 55 60

Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

65 70 75 80

Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile

85 90 95

Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg

100 105 110

Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val

115 120 125

Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser

130 135 140

Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg

145 150 155 160

Gly Arg Arg Ala Ser Gln

165

<210> 4

<211> 1142

<212> DNA

<213> 人

<400> 4

gagaacctgg agcctaaggt ttaggctcac ccatttcaac cagtctagca gcatctgcaa 60

catctacaat ggccttgacc tttgctttac tggtggccct cctggtgctc agctgcaagt 120

caagctgctc tgtgggctgt gatctgcctc aaacccacag cctgggtagc aggaggacct 180

tgatgctcct ggcacagatg aggagaatct ctcttttctc ctgcttgaag gacagacatg 240

actttggatt tccccaggag gagtttggca accagttcca aaaggctgaa accatccctg 300

tcctccatga gatgatccag cagatcttca atctcttcag cacaaaggac tcatctgctg 360

cttgggatga gaccctccta gacaaattct acactgaact ctaccagcag ctgaatgacc 420

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caaacttgca agaaagttta agaagtaagg aatgaaaact ggttcaacat ggaaatgatt 660

ttcattgatt cgtatgccag ctcacctttt tatgatctgc catttcaaag actcatgttt 720

ctgctatgac catgacacga tttaaatctt ttcaaatgtt tttaggagta ttaatcaaca 780

ttgtattcag ctcttaaggc actagtccct tacagaggac catgctgact gatccattat 840

ctatttaaat atttttaaaa tattatttat ttaactattt ataaaacaac ttatttttgt 900

tcatattatg tcatgtgcac ctttgcacag tggttaatgt aataaaatgt gttctttgta 960

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tattctttaa aatgaaattc caagcctaat tgtgcaacct gattacagaa taactggtac 1080

acttcatttg tccatcaata ttatattcaa gatataagta aaaataaact ttctgtaaac 1140

ca 1142

<210> 5

<211> 757

<212> DNA

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<400> 5

atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60

tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120

ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 180

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tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300

aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360

acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gattttacca ggggaaaact catgagcagt 420

ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480

cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540

cttacaggtt acctccgaaa ctgaagatct cctagcctgt ccctctggga ctggacaatt 600

gcttcaagca ttcttcaacc agcagatgct gtttaagtga ctgatggcta atgtactgca 660

aatgaaagga cactagaaga ttttgaaatt tttattaaat tatgagttat ttttatttat 720

ttaaatttta ttttggaaaa taaattattt ttggtgc 757

<210> 6

<211> 1193

<212> DNA

<213> 人

<400> 6

tgaagatcag ctattagaag agaaagatca gttaagtcct ttggacctga tcagcttgat 60

acaagaacta ctgatttcaa cttctttggc ttaattctct cggaaacgat gaaatataca 120

agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag 180

gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat 240

gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac 300

agaaaaataa tgcagagcca aattgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa 360

gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt 420

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gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg 540

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tcccagtaat ggttgtcctg cctgcaatat ttgaatttta aatctaaatc tatttattaa 660

tatttaacat tatttatatg gggaatatat ttttagactc atcaatcaaa taagtattta 720

taatagcaac ttttgtgtaa tgaaaatgaa tatctattaa tatatgtatt atttataatt 780

cctatatcct gtgactgtct cacttaatcc tttgttttct gactaattag gcaaggctat 840

gtgattacaa ggctttatct caggggccaa ctaggcagcc aacctaagca agatcccatg 900

ggttgtgtgt ttatttcact tgatgataca atgaacactt ataagtgaag tgatactatc 960

cagttactgc cggtttgaaa atatgcctgc aatctgagcc agtgctttaa tggcatgtca 1020

gacagaactt gaatgtgtca ggtgaccctg atgaaaacat agcatctcag gagatttcat 1080

gcctggtgct tccaaatatt gttgacaact gtgactgtac ccaaatggaa agtaactcat 1140

ttgttaaaat tatcaatatc taatatatat gaataaagtg taagttcaca act 1193

Claims

1.修饰的无唾液酸-干扰素，其包含与水溶性聚合物结合的无唾液酸-干扰素，所述聚合物的平均分子量大约为1,000-60,000道尔顿。

2.权利要求1的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述水溶性聚合物的平均分子量大约10,000-20,000道尔顿。

3.权利要求1或2的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素

4.权利要求1-3任一的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素在半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸残基；在C-末端羧基；或在N-末端胺基聚乙二醇化。

5.权利要求1-3任一的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素在半胱氨酸残基聚乙二醇化。

6.权利要求1-3任一的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素在赖氨酸残基聚乙二醇化。

7.权利要求1或2的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素。

8.权利要求7的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素在半胱氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，精氨酸或谷氨酸残基；在C-末端羧基；或在N-末端胺基发生聚乙烯吡咯烷酮化。

9.权利要求7或8的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素在半胱氨酸残基聚乙烯吡咯烷酮化。

10.权利要求7或8的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素在赖氨酸残基聚乙烯吡咯烷酮化。

11.权利要求1-10任一的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素包含无唾液酸-干扰素-α，无唾液酸-干扰素-β，或无唾液酸-干扰素-γ。

12.权利要求11的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述无唾液酸-干扰素是人无唾液酸-干扰素。

13.权利要求1-11任一的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述无唾液酸-干扰素的多肽序列与成熟干扰素多肽序列相比包含另外的半胱氨酸残基。

14.权利要求13的修饰的无唾液酸-干扰素，其中所述半胱氨酸替换所述成熟干扰素多肽的苏氨酸或丝氨酸残基。

15.药物组合物，其包含权利要求1-14任一的无唾液酸-干扰素以及可药用的赋型剂。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述水溶性聚合物的平均分子量为大约1,000-60,000道尔顿。

17.权利要求15的药物组合物，其中所述水溶性聚合物的平均分子量为大约10,000-20,000道尔顿。

18.权利要求15-17任一的药物组合物，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素。

19.权利要求15-17任一的药物组合物，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素。

20.权利要求15-19任一的药物组合物，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素包括无唾液酸-干扰素-α，无唾液酸-干扰素-β，或无唾液酸-干扰素-γ。

21.权利要求15-20任一的药物组合物，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是修饰的人无唾液酸-干扰素。

22.治疗患有肝病的患者的方法，包括将治疗有效量的药物组合物给药所述患者，所述药物组合物包含与水溶性聚合物结合的哺乳动物无唾液酸-干扰素，所述水溶性聚合物的平均分子量为大约1,000-60,000道尔顿。

23.权利要求22的方法，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是聚乙二醇化的无唾液酸-干扰素。

24.权利要求22的方法，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素是聚乙烯吡咯烷酮化的无唾液酸-干扰素。

25.权利要求22-24任一的方法，其中所述肝病是病毒性肝炎，肝癌，或肝纤维化。

26.权利要求22-24任一的方法，其中所述患者感染了乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。

27.权利要求22-24任一的方法，其中所述肝病是弥漫型肝细胞癌，发热型肝细胞癌，和淤胆型肝细胞癌，肝母细胞瘤，肝样腺癌，以及灶性结节样增生。

28.权利要求22-27任一的方法，其中所述修饰的无唾液酸-干扰素包含无唾液酸-干扰素-α，无唾液酸-干扰素-β，或无唾液酸-干扰素-γ。

29.权利要求22-28任一的方法，其中所述无唾液酸-干扰素是人无唾液酸-干扰素。