CN101031323A

CN101031323A - Gm－csf部分与聚合物的缀合物

Info

Publication number: CN101031323A
Application number: CNA2005800311705A
Authority: CN
Inventors: M·J·博萨德; 张平
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-14
Publication date: 2007-09-05
Also published as: WO2006019950A2; AU2005275108B2; JP2008506704A; US20140044672A1; KR20070043852A; WO2006019950A3; ATE491475T1; ES2355642T3; CA2573262A1; DE602005025355D1; US20060036080A1; EP1768700A2; MX2007000568A; AU2005275108A1; CA2573262C; EP1768700B1; KR101330338B1

Abstract

本发明提供了粒－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)部分与一个或多个水溶性聚合物的缀合物。典型地，所述的水溶性聚合物是聚(乙二醇)或者其衍生物。本发明还提供了含有该缀合物的组合物，制备该缀合物的方法，和对患者给予含有该缀合物的该组合物的方法。

Description

GM-CSF部分与聚合物的缀合物

技术领域

[0001]本发明主要涉及包含GM-CSF部分(即，具有GM-CSF活性的部分)与聚合物的缀合物。此外，本发明还涉及(尤其是)含有该缀合物的组合物、合成该缀合物的方法，以及用于进行该缀合物给药的方法。

背景技术

[0002]人类造血系统的一个重要功能是替换各种白细胞(包括巨噬细胞、嗜中性细胞和嗜碱性细胞/肥大细胞)、红细胞(即，红血球)以及血凝块形成细胞(例如，巨核细胞/血小板)。这些专化细胞都是由位于骨髓内的造血前体细胞形成的。被称作“集落刺激因子”的专一性类激素糖蛋白，控制着这些造血前体细胞分化和成熟为众多专化血细胞的任一种。

[0003]一种这样的集落刺激因子是粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子或“GM-CSF”。顾名思义，这种集落刺激因子促进了白细胞(例如粒细胞和巨噬细胞)的增殖和分化，但是GM-CSF也能促进其它类型细胞的形成。随着细胞因子、免疫和炎性的刺激，大量不同类型的细胞(包括活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞)产生GM-CSF。天然的GM-CSF是一种127个氨基酸的糖蛋白，根据糖基化的程度可具有多种分子量。

[0004]在药理学方面，已经对癌症患者给予GM-CSF，以加速化疗期间被杀死的白细胞的替换。同理，为了加速白细胞的替换，已经对骨髓替换治疗的白血病患者给予这种集落刺激因子。已经提议其它的应用，例如加速伤口愈合。参见，例如，美国专利No.6,6899,351。

[0005]一种与当前GM-CSF治疗形式有关的缺点是用药的频率。因为GM-CSF治疗一般需要每天注射，患者厌恶这种治疗方案有关的不便和不适。与此同时，患者需要经常验血以确定白细胞计数(这需要拜访保健医生)，许多患者更喜欢麻烦少和/或涉及注射次数少的可替代疗法。

[0006]对于这些问题的一种解决方案是提供延长释放形式的GM-CSF。例如，美国专利No.5,942,253描述了GM-CSF的聚(乳酸-共-羟基乙酸)或者其它可生物降解聚合物的微球。然而，微球的形成是一个复杂的过程，需要若干合成步骤。因此，这种延长释放的方法具有理论上可以避免的复杂性。

[0007]已经有描述，PEG化或者聚(乙二醇)衍生物结合至蛋白质作为一种延长蛋白质体内半衰期的手段，籍此产生延长的药理学活性。例如，美国专利No.5,880,0255描述了一种GM-CSF与聚(乙二醇)的缀合物，其形成于与2，2，2-三氟乙磺酸酯衍生的分子量为5,000道尔顿的线性单甲氧基聚(乙二醇)的反应。

[0008]尽管具有上述的这种缀合物，仍然需要含有GM-CSF的其它缀合物，例如，分子量大于5,000道尔顿的聚合物，具有不同结构(如，分支和/或分叉结构)、不同结合位点、位点特异性或位点选择性结合位点等等的聚合物。

[0009]因此，本领域还需要另外的GM-CSF部分-聚合物缀合物。此外，本发明的一个或多个实施方案因此针对这些缀合物以及含有该缀合物的组合物，和如本文描述的相关方法，认为这些是新颖的并且现有技术完全无启示。

发明概述

[0010]因此，在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，该缀合物含有如下结构：

其中：POLY是一种水溶性聚合物；(a)为0或1；X¹，当存在时，是一含有一个或多个原子的间隔部分；R¹是有机基团；GM-CSF是GM-CSF部分。

[0011]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，该缀合物含有如下结构：

其中：POLY是一种水溶性聚合物；X是一含有一个或多个原子的间隔部分；(b)为0或数值为1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；(c)为0或数值为1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；R²各自独立地为H或者有机基团；R³各自独立地为H或者有机基团；并且GM-CSF是GM-CSF部分。

[0012]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，该缀合物含有GM-CSF部分，所述GM-CSF部分包括内部的胺直接或者通过含有一个或多个原子的间隔部分共价地结合至分支的水溶性聚合物。

[0013]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该组合物含有如本文提供的一种缀合物。

[0014]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该组合物含有(i)一种缀合物，该缀合物含有人GM-CSF，所述人GM-CSF直接或者通过含有一个或多个原子的间隔部分共价地结合至水溶性聚合物，其中，所述的水溶性聚合物具有大于5,000道尔顿的平均分子量，并规定，当该水溶性聚合物是分支的水溶性聚合物时，所述的分支水溶性聚合物不包括赖氨酸残基；和(ii)一种药学上可接受的赋形剂，其中，所述组合物中至少约85％缀合物具有总计一至二个聚合物结合至人GM-CSF。

[0015]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种用于将一种缀合物给药于患者的方法，该方法包括对患者给予如本文提供的药物组合物的步骤。

[0016]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种用于制备一种缀合物的方法，该方法包括在缀合条件下使GM-CSF部分与聚合试剂接触以产生如本文提供的缀合物和/或组合物。

附图简述

[0017]图1是实施例1中所述的缀合物溶液的SEC-HPLC分析色谱图。

[0018]图2是实施例1中所述的组合物的阴离子交换纯化色谱图。

[0019]图3显示了实施例1中所述的缀合物馏分的SDS-PAGE结果。

[0020]图4是实施例2中所述的缀合物溶液的SEC-HPLC分析色谱图。

[0021]图5是实施例3中所述的组合物的阴离子交换纯化色谱图。

[0022]图6是实施例4中所述的缀合物溶液的SEC-HPLC分析色谱图。

[0023]图7是实施例5中所述的缀合物溶液的SEC-HPLC分析色谱图。

[0024]图8是SEC-HPLC分析实施例6中所述的缀合物溶液而得到的色谱图。

发明详述

[0025]在详细描述本发明的一个或多个实施方案之前，应当理解，本发明不限于特定的聚合物、合成技术、GM-CSF部分等，它们是可以变化的。

[0026]应当注意的是，在此说明书和权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”、“某种(个)”包括了复数形式，除非上下文另外明确指示。因此，例如，“一种聚合物”包括一种聚合物以及两种或更多种相同或不同的聚合物；“一种药学上可接受的赋形剂”是指一种药学上可接受的赋形剂以及两种或更多种相同或不同的药学上可接受的赋形剂，等等。

[0027]在说明本发明和要求本发明的权利中，根据下面提供的定义来应用下列术语。

[0028]本文所用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是可以互换的。典型地，根据本发明所用的PEGs包括如下的结构：“-(OCH₂CH₂)_n-”，其中(n)为2至4000。如本文所用的，根据是否末端的氧被取代，PEG还包括“-CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-”和“-(OCH₂CH₂)_nO-。贯穿说明书和权利要求书，应当记住，术语“PEG”包括了具有各种末端或“封端”基团的结构。术语“PEG”也指一种包括大多数即大于50％的-OCH₂CH₂-或-CH₂CH₂O-重复亚单元的聚合物。在涉及特定的形式时，该PEG可以具有任意数目的多种分子量以及结构或几何形状如“分支”、“线性”、“分叉”、“多功能”等，下面将进行更详细地描述。

[0029]术语“封端”和“封末端”在本文可以互换使用，是指具有封端部分的聚合物的一种末端或者终端。典型地，即使非必要地，所述的封端部分包括羟基或C_1-20烷氧基，更优选C_1-10烷氧基以及进一步优选C_1-5烷氧基。因此，封端部分的例子包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)，以及芳基、杂芳基、环、杂环等等。应当记住的是，在聚合物中所述的“封端”部分可以包括末端单体的一个或多个原子(例如CH₃(OCH₂CH₂)_n-中的封端部分“甲氧基”)。此外，可以考虑上述物质的饱和、非饱和、取代和非取代的形式。另外，所述的封端基团也可以是硅烷。该封端基团还可有利地包括可检测的标记。当所述聚合物具有包含可检测标记的封端基团时，应用合适的检测器可测定该聚合物和/或该聚合物偶合的部分(例如，活性剂)的数量和/或位置。这些标记包括，但不限于，荧光剂、化学发光剂、酶标记中应用的部分、比色部分(例如，染料)、金属离子、放射性残基等等。合适的检测器包括光度计、薄膜、分光计等等。所述的封端基团还可有利地包括磷脂。当所述聚合物具有含磷脂的封端基团时，聚合物和得到的缀合物被赋予独特的性质。典型的磷脂包括，但不限于，选自被称为磷脂酰胆碱的磷脂类的那些。特定的磷脂包括，但不限于，选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山萮酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱，和卵磷脂。

[0030]本文所述的“非天然存在的”聚合物，是指在自然界中尚未全部发现的聚合物。但是，非天然存在的聚合物可含有已经天然存在的一个或多个单体或单体区段，只要自然界尚未发现全部的聚合物结构。

[0031]如“水溶性聚合物”中的术语“水溶性”是指在室温下能溶于水的任何聚合物。典型地，水溶性聚合物，在过滤后能够透射至少约75％、更优选至少约95％的被相同溶液透射的光。以重量为基础，水溶性聚合物优选至少约35％(按重量)可溶于水，更优选至少约50％(按重量)可溶于水，还更优选约70％(按重量)可溶于水，并更进一步优选至少约85％(按重量)可溶于水。尽管如此，最优选的是水溶性聚合物约95％(按重量)可溶于水或者可完全溶于水。

[0032]上下文中的水溶性聚合物如PEG的分子量，可以被表示为数均分子量或者重均分子量。除非另有说明，本文所有涉及的分子量都是指重均分子量。两种分子量即数均分子量和重均分子量的测定，都可以应用凝胶渗透色谱或其它液相色谱技术来检测。也可以应用其它的方法来测定分子量的值，如应用末端基团分析或依数性检测(例如，冰点降低、沸点提高或渗透压)来测定数均分子量，或者应用光散射技术、超速离心法或粘度测量法来确定重均分子量。本发明的聚合物通常是多分散的(即，所述聚合物的数均分子量与重均分子量不相等)，具有较低多分散性数值，优选小于约1.2，更优选小于约1.15，甚至更优选小于约1.10，还甚至更优选小于约1.05，最优选小于约1.03。如本文所使用的，有时引用一种具有重均分子量或数均分子量的水溶性聚合物；这种引用应当被理解为这种水溶性聚合物是从具有所述分子量的水溶性聚合物的组合物获得的。

[0033]当与特定官能团一起使用时，所用的术语“活性”或“活化的”是指反应性官能团易于与另一个分子的亲电体或亲核体反应。这与那些为了起反应需要强催化剂或非常不实用的反应条件的基团(即，“不起反应”或“惰性”基团)大不相同。

[0034]本文所用的术语“官能团”或其任意同义词是指包括了其保护形式以及非保护形式。

[0035]本文所用的术语“间隔部分”、“键”或“连接键”是指用来连接互联的部分如聚合物末端与GM-CSF部分或GM-CSF部分的亲电体或者亲核体的一个或多个原子。所述的间隔部分可以是水解条件下稳定的或者可以包括生理条件下可水解的或者可酶降解的键。

[0036]“烷基”是指长度通常为约1至15个原子的烃链。这种烃链优选地但非必要地为饱和的，并且可以是支链或直链，但通常优选直链。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等等。本文所用的“烷基”包括环烷基以及含烷基的环亚烷基。

[0037]“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基基团，而且可以是直链或支链。低级烷基的非限定性实例包括甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。

[0038]“环烷基”是指饱和或不饱和环形烃链，包括桥环、稠环或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子组成，更优选3至约8个碳原子。“环亚烷基”是指通过在环系统上的任意两个碳原子位置与烷基链键合而嵌入烷基链的环烷基基团。

[0039]“烷氧基”是指-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C_1-6烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基，等等)。

[0040]术语“取代”，如在“取代烷基”中的“取代”，是指用一个或多个非干涉性取代基取代的部分(例如，烷基基团)，所述非干涉性取代基例如，但不限于：烷基、C_3-8环烷基例如环丙基、环丁基等等；卤素，例如，氟代、氯代、溴代和碘代；氰基；烷氧基；低级苯基；取代的苯基；等等。“取代的芳基”是指具有一个或者多个非干涉性取代基的芳基。对于苯环上的取代，该取代基可以是任何取向(即，邻位、间位或者对位)。

[0041]“非干涉性取代基”是指这样一些基团，即当它们在分子中存在时，通常与分子内含有的其它官能团不起反应。

[0042]“芳基”是指一个或多个芳环，每个环为5或6个核心碳原子。芳基包括可以是稠合的如萘基、或者不稠合的如联苯的多重芳环。芳环也可以与一个或者多个环烃、杂芳基或杂环稠合或者不稠合。如本文所用的，“芳基”包括杂芳基和杂环。

[0043]“杂芳基”是指这样的芳基基团，即其含有一至四个杂原子，优选硫、氧或氮，或者它们的组合。杂芳环还可以与一个或多个环烃、杂环、芳基或杂芳环稠合。如本文所用的，“杂芳基”包括取代的杂芳基。

[0044]“杂环”或“杂环的”是指一个或多个5-12个原子(优选5-7个原子)的环，具有或不具有不饱和性或芳香性，并且具有至少一个环的原子不是碳原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。如本文所用的，“杂环”包括取代的杂环。

[0045]“取代的杂芳基”是指具有一个或多个非干涉性基团如取代基的杂芳基。

[0046]“取代的杂环”是指具有一个或多个形成于非干涉性取代基的支链的杂环。

[0047]如本文所用的，“有机基团”应当包括烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基。

[0048]“亲电体”和“亲电基团”是指一个离子或原子或数个原子，其可以是电离的，具有一个亲电的中心即寻找电子、能与亲核体反应的中心。

[0049]“亲核体”和“亲核基团”是指一个离子或原子或数个原子，其可以是电离的，具有一个亲核的中心即寻找亲电中心或能与亲电体反应的中心。

[0050]“水解条件下可降解的”或“可水解的”键或化学键是指在生理条件下与水发生反应(即被水解)的化学键。优选在pH 8、25℃条件下的水解半衰期小于约30分钟的化学键。化学键在水中的水解趋势不仅取决于连接两个给定原子的键的一般类型，也取决于该两个给定原子结合的取代基。适合的、水解条件下不稳定的或弱的键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。

[0051]“可酶降解的键”是指可以被一种或多种酶降解的键。

[0052]“水解条件下稳定的”键或化学键是指在水中基本稳定的化学键，通常为共价键，换言之，在生理条件下经过延长时间以可观测到的程度不经历水解。在水解条件下稳定的键实例包括，但不限于，如下：碳-碳键(例如，在脂肪链中)、醚、酰胺、尿烷等等。通常，水解条件下稳定的键是指生理条件下其水解速度表现为小于约1-2％/天。在多数标准的化学教科书中可以找到代表性化学键的水解速度。

[0053]“药学上可接受的赋形剂”是指任选地可以包括在组合物中并对于用药的患者不会引起显著性毒副作用的赋形剂。

[0054]本文所用的“治疗有效量”是指在血流或者靶组织中提供该缀合物(或者相应不缀合的GM-CSF部分)的所需水平而需要的聚合物-(GM-CSF)部分缀合物的量。准确的量取决于许多因素，例如，特定的GM-CSF部分、治疗组合物的组分和物理性质、计划的患者总数、给药模式、个体患者的考虑因素等等，而且是所属领域的人员容易确定的。

[0055]“多官能”是指聚合物自身具有三个或更多的官能团，其中所述的官能团可以是相同的或不同的。多官能聚合试剂通常包含约3-100个官能团，或3-50个官能团、或3-15个官能团、或3-10个官能团，或者在聚合物骨架内包含3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。

[0056]如本文所用的，术语“GM-CSF部分”是指具有GM-CSF活性的部分。GM-CSF部分也可具有至少一个适于与聚合试剂反应的亲电基团或亲核基团。GM-CSF部分是一种蛋白质，即含有一系列氨基酸组成的单体，任选地在一个或多个位置糖基化。此外，术语“GM-CSF部分”既包括缀合前的GM-CSF部分也包括缀合后的GM-CSF部分残基。如下面进行的更详细解释，本领域的普通技术人员可以确定任何已知的部分是否具有GM-CSF活性。含有对应于选自SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的序列的氨基酸序列的蛋白质是GM-CSF部分，以及与其基本上同源的蛋白质或多肽，和始于甲硫氨酰基残基的SEQID NO 1、2和3的任一者，在这两个实例中其生物特性能够产生GM-CSF活性。如本文所用的，术语“GM-CSF部分”包括故意修饰的蛋白质，例如，通过位点引导的诱变或者偶然的突变。术语“GM-CSF部分”也包括具有1至6个另外的糖基化位点的衍生物，在蛋白质的羧基末端上具有至少一个另外的氨基酸的衍生物(其中该另外的氨基酸包括至少一个糖基化位点)，以及具有包含至少一个糖基化位点的氨基酸序列的衍生物。

[0057]术语“基本上同源”是指，特定的个体序列，例如突变序列，通过一个或多个取代、缺失或添加而与参照序列不同，其净效应不会在参照序列和主题序列之间产生相反的功能相异性。就本发明的目的而言，具有大于百分之九十五同源性、等同生物特性(尽管可能不同程度的活性)和等同表达特征的序列被认为是基本上同源的。就确定同源性的目的而言，成熟序列的切断应当不予考虑。具有较少程度的同源性、可比的生物活性和等同生物表达特征的序列被认为是基本上等同的。本文所用的典型GM-CSF部分包括那些具有的序列基本上同源于选自SEQ ID NO：1、SEQ ED NO：2和SEQ ID NO：3的一个或多个序列的蛋白质。

[0058]术语“片段”是指这样的任何蛋白质或者多肽，即其具有保留一定程度GM-CSF活性的一部分GM-CSF部分的氨基酸序列。所述片段包括通过GM-CSF蛋白的蛋白水解降解或者通过现有技术的常规方法化学合成而产生的蛋白质或多肽。确定特定片段是否具有GM-CSF活性可由普通技术人员实施。本文描述了可用于证实这种活性的适当检测方法。

[0059]GM-CSF部分的“缺失变异体”是指其中GM-CSF部分的一个氨基酸残基已缺失并且该缺失氨基酸前后的氨基酸残基通过酰胺键(例外的实例为缺失的氨基酸残基位于所述肽或蛋白质的末端)连接的肽或蛋白质。缺失变异体包括只有一个氨基酸残基缺失的实例，以及两个氨基酸缺失、三个氨基酸缺失、四个氨基酸缺失的实例，等等。但是，每个缺失变异体都必须保留一定程度的GM-CSF活性。

[0060]GM-CSF部分的“取代变异体”是指其中GM-CSF部分的一个氨基酸残基已缺失并且一个不同的氨基酸取代之的肽或蛋白质。取代变异体包括只有一个氨基酸残基被取代的实例，以及两个氨基酸被取代、三个氨基酸被取代、四个氨基酸被取代的实例，等等。但是，每个取代变异体都必须具有一定程度的GM-CSF活性。

[0061]GM-CSF部分的“添加变异体”是指其中GM-CSF部分的一个氨基酸残基已被添加至氨基酸序列并且相邻的氨基酸残基通过酰胺键(例外的实例为添加的氨基酸残基位于所述肽或蛋白质的末端，其中只有一个酰胺键结合该被添加的氨基酸残基)结合至该被添加的氨基酸残基的肽或蛋白质。添加变异体包括只一个氨基酸残基被添加的实例，以及两个氨基酸被添加、三个氨基酸被添加、四个氨基酸被添加的实例，等等。但是，每个添加变异体都必须具有一定程度的GM-CSF活性。

[0062]术语“患者”是指患有或易患可通过给予活性剂(例如，缀合物)预防或治疗的病症的活生物体，并且包括人和动物。

[0063]“任选”或“任选地”是指随后所述的情况可以发生，也可以不发生，所以，该描述包括了所述情况发生的实例和所述情况没有发生的实例。

[0064]“基本上”(除非在别处特定上下文中明确地定义或者上下文中清楚地另外规定)是指几乎全部地或完全地，例如，满足如下的一种或多种：大于50％，等于或大于51％，等于或大于75％，等于或大于90％，等于或大于95％的状况。

[0065]除非上下文中清楚地另外规定，当术语“约”位于一数值之前时，应当将该数值理解为所述数值的平均数±10％。

[0066]所述肽中氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys为C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；及甘氨酸为Gly或G。

[0067]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，该缀合物含有GM-CSF部分，该部分直接地或者通过含有一个或多个原子的间隔部分共价结合至水溶性聚合物。本发明的缀合物具有一种或多种如下的特征。

[0068]GM-CSF部分

[0069]如前所述，术语“GM-CSF部分”应当包括缀合前的GM-CSF部分以及结合(直接地或通过间隔部分)至水溶性聚合物之后的GM-CSF部分。但是，应当理解的是，当GM-CSM部分被结合(直接地或通过间隔部分)至水溶性聚合物时，由于与至聚合物的键(或者结合至聚合物的间隔部分)相关的一个或多个共价键的存在，该GM-CSF部分稍有改变。通常，被结合至另一个分子的GM-CSF部分的这种些微改变形式被称为GM-CSF部分的“残基”。

[0070]GM-CSF部分可以获自非组合方法或组合方法，并且本发明对此无限制。

[0071]GM-CSF部分可以非组合方法获得。例如，GM-CSF可获自血源。特别是，可以应用本领域普通技术人员已知技术(例如，沉淀技术、离心技术、色谱技术)从人血浆或组织中分离。

[0072]GM-CSF部分可以获自重组方法。例如，编码人GM-CSF(优选GM-CSF部分)的cDNA已经被分离、定性和克隆至表达载体。参见，例如美国专利No.5,078,996和5,891,429，和Wong等(1985)“人GM-CSF：互补DNA的分子克隆和天然和重组蛋白质的纯化，”Science218：819，和Cantrell等(1985)“人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子的克隆、测序和表达，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，Vol.82：6250。可以应用在细菌(大肠埃希杆菌(Escherichia coli))、哺乳动物(例如，中国仓鼠卵细胞)和酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))表达系统中表达的GM-CSF部分。

[0073]一旦被表达，内源性的人GM-CSF是一种分子量约22,000道尔顿的单体糖蛋白。本发明提供了被表达的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。本文优选地用作GM-CSF部分的是任意数量的人GM-CSF的氨基酸序列。在各种表达系统中，已产生了至少三种不同的人GM-CSF蛋白：沙格司亭；莫拉司亭；瑞拉司亭；和依格司亭。沙格司亭是在酿酒酵母中表达的，与内源性的人GM-CSF相比在23位上具有亮氨酸的氨基酸取代(SEQ ID NO：2)，并且是O-糖基化的。莫拉司亭是在大肠埃希杆菌表达的并且是非糖基化的。瑞格司亭是在仓鼠卵细胞(CHO)中产生的并且是完全糖基化的。这些蛋白质的甲硫氨酰基型也被考虑到，其中甲硫氨酸(methione)残基在全部氨基酸序列之前。除非特别注明，如本文所提供的氨基酸残基的数字位置分配都是基于SEQ ID NO：1。

[0074]可以简述用于制备GM-CSF部分(无论是人GM-CSF或者是具有GM-CSF活性的不同蛋白质)的典型重组方法。这些方法包括构建编码想要的多肽或片段的核酸，克隆该核酸至表达载体，转化宿主细胞(例如，植物，诸如大肠埃希杆菌的细菌，诸如酿酒酵母的酵母，或者诸如中国仓鼠卵细胞或幼仓鼠肾脏细胞的哺乳动物细胞)，以及表达该核酸以产生想要的多肽或片段。所述的表达可以通过外源性表达(当宿主细胞天然地含有想要的遗传编码时)或者通过内源性表达而发生。对于本领域的普通技术人员而言，在体外和在原核和真核宿主细胞中产生和表达重组多肽的方法是已知的。参见，例如，美国专利No.4,868,122。

[0075]为了便于鉴定和纯化重组的多肽，用于编码抗原表位标记的核酸序列或其它亲和性结合序列可以被插入或者与该编码序列一起添加至框架内，籍此产生融合蛋白，其含有想要的多肽或适于结合的多肽。通过首次使含有融合蛋白的混合物经由装有针对融合蛋白中抗原表位标记或其它结合序列的结合部分(例如，抗体)的亲和柱，可以鉴定和纯化融合蛋白，籍此将融合蛋白结合在柱内。然后，用适当的溶液(如酸性溶液)冲洗柱子以释放结合的融合蛋白而回收融合蛋白。也可通过裂解宿主细胞、分离多肽(例如通过尺寸排除色谱法)及收集多肽，鉴定和纯化重组多肽。对于本领域的普通技术人员而言，用于鉴定和纯化重组多肽的这些和其它方法是已知的。但是，在本发明的一个或多个实施方案中，优选的是GM-CSF部分不是融合蛋白的形式。

[0076]根据用于表达具有GM-CSF活性的蛋白质的系统，GM-CSF部分可以是非糖基化的或者是被糖基化的，两种形式都可应用。也就是说，GM-CSF部分可非糖基化的或者GM-CSF部分可被糖基化。在本发明的一个或多个实施方案中，优选的是GM-CSF部分被糖基化。糖基化的实例包括O-糖基化和N-糖基化。认为，内源性的人GM-CSF的糖基化位点是丝氨酸9(O-糖基化)、苏氨酸10(O-糖基化)、天冬酰胺27(N-糖基化)和天冬酰胺37(N-糖基化)。任何GM-CSF部分的优选的糖基化排列将发生在这些位点(或者对应于已知GM-CSF部分的这些位置的位点)。因此，GM-CSF部分可具有一定程度的糖基化，所述糖基化选自：无糖基化；在一个位点糖基化；在两个位点糖基化；在三个位点糖基化；和在四个位点糖基化。特别优选的糖基化排列是仅在丝氨酸9和苏氨酸10为O-糖基化并且无N-糖基化。

[0077]具有GM-CSF活性的部分可被有利地修饰，以包括一个或多个氨基酸残基，例如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，目的是使聚合物易于结合至氨基酸内的原子。例如，美国专利No.6,608,183描述了可以用作GM-CSF部分的GM-CSF的“添加半胱氨酸”序列以及制备该“添加半胱氨酸”序列的方法。此外，GM-CSF部分可被修饰以包括非-天然存在的氨基酸残基。对于本领域的普通技术人员而言，添加氨基酸残基和非-天然存在的氨基酸残基的技术都是熟知的。参见，例如，美国专利No.5,393,870和J.March，高等有机化学：反应机理和结构，第四版(纽约：Wiley-Interscience，1992)。

[0078]此外，GM-CSF部分可被有利地修饰以包括结合官能团(而不是通过添加含有官能团的氨基酸残基)。例如，GM-CSF部分可被修饰以包括巯基。另外，GM-CSF部分可被修饰以包括N-末端α碳。此外，GM-CSF部分可被修饰以包括一个或多个糖部分。也可应用被修饰而含有胺氧基、醛基或其它官能团的GM-CSF部分。另外，也可应用GM-CSF的氧化变异体作为GM-CSF部分。参见，例如，美国专利No.5,358,707。也包括GM-CSF衍生物作为GM-CSF部分。参见美国专利No.5,298,603。

[0079]GM-CSF部分的非限定性实例包括下面这些：人GM-CSF；具有GM-CSF活性的杂合蛋白，和具有GM-CSF活性的肽模拟物。上述任何能保持至少一定程度GM-CSF活性的生物学活性片段，缺失变异体，取代变异体或添加变异体，也可用作GM-CSF部分。

[0080]对于任何已知的部分，都可能确定是否该部分具有GM-CSF活性。例如，如美国专利No.5,393,870中所述，可收集源自健康捐赠者髂嵴的人骨髓，放入溶液并离心分离，收集细胞并稀释用于后续的培养。经培养，可鉴定细胞的每个集落，并可将所述GM-CSF部分加至适宜的集落且检验相对于对照的加速增殖。也可应用本领域的普通技术人员已知的其它方法，以确定已知的部分是否具有GM-CSF活性。这些方法对于确定该部分自身(和因此可用作“GM-CSF部分”)和相应的聚合物-部分缀合物的GM-CSF活性都是有用的。

[0081]GM-CSF部分的非限定性实例包括下面这些：如可在SEQ IDNO：1、SEQ ED NO：2和SEQ ID NO：3中的任一者识别的人GM-CSF；其切断形式；杂合变异体，和具有GM-CSF活性的肽模拟物。上述任何能保持至少一定程度GM-CSF活性的生物学活性片段、缺失变异体、取代变异体或添加变异体，也可用作GM-CSF部分。

[0082]根据用于表达具有GM-CSF活性的蛋白质的系统，GM-CSF部分可以是非糖基化的或者是被糖基化的，两种形式都可应用。也就是说，GM-CSF部分可为非糖基化的或者GM-CSF部分可被糖基化。

[0083]水溶性聚合物

[0084]如前所讨论的，每一缀合物含有直接地或通过含一个或多个原子的间隔部分结合至水溶性聚合物的GM-CSF。就水溶性聚合物而言，所述水溶性聚合物是非肽类的、无毒的、非天然存在的并且生物相容的。就生物相容性而言，经临床工作者例如医师评估，如果单独使用材料或者与其它材料(例如，如GM-CSF部分的活性剂)一起使用与活组织结合相关的有益效果超过了有害作用，那么该材料被认为是生物相容的。就非-免疫原性而言，如果材料在体内预期应用没有产生不想要的免疫反应(例如，形成抗体)或，如果产生了免疫反应，而临床工作者评估为这种反应不视为临床上显著的或重要的，那么该材料被认为是非免疫原性的。

[0085]另外，所述水溶性聚合物的典型特征在于具有2至约300个末端。这种聚合物的实例包括，但不限于，聚(亚烷基二醇)如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(多糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)和任意上述物质的组合。

[0086]所述的聚合物不限于特定的结构并且可以为线型(例如烷氧基PEG或双官能PEG)，或者非线型如分支、分叉、多臂(例如结合多元醇核的PEG)，和树枝状。另外，聚合物的内部结构可以被组织成任意数量的不同模式，并且可以选自均聚物、交替共聚物、无规则共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规则三聚物和嵌段三聚物。

[0087]活化PEG和用于与所述GM-CSF形成缀合物的其它活化水溶性聚合物(统称“聚合物试剂”)包括适于偶合至GM-CSF部分上想要的位点的活化官能团。因此，聚合物试剂包括与所述GM-CSF部分起反应的官能团。用于使这些聚合物与活性部分缀合的代表性聚合物试剂和方法是本领域中已知的且进一步描述在Zalipsky，S.等的“官能化聚(乙二醇)在多肽修饰中的应用”(“Use of FunctionalizedPoly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides”)《聚乙二醇化学：生物技术和生物医学的应用》(PolyethyleneGlycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications)，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992))和Zalipsky(1995)《高等药物综述》(Advanced Drug Reviews)16：157-182。

[0088]一般来说，缀合物中水溶性聚合物的重均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。然而，典型范围包括重均分子量在大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿的范围、大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围、约6,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围、约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围、约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约15,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约20,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围、约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、和约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围。对于任意给定的水溶性聚合物而言，优选具有一种或多种这些分子量范围的PEG。

[0089]水溶性聚合物的典型重均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。也可以应用总分子量为上述任意数量的分支形式的水溶性聚合物(例如含有两个20,000道尔顿聚合物的分支40,000道尔顿水溶性聚合物)。在一个或多个实施方案中，所述的缀合物没有与重均分子量小于约6,000道尔顿的PEG的任何PEG部分直接或间接结合。

[0090]当用作聚合物时，PEG通常包括许多的(OCH₂CH₂)单体【或者(CH₂CH₂O)单体，根据该PEG是如何定义的】。如本说明书通篇所用的，重复单元的数量以下标“n”来标明，例如“(OCH₂CH₂)_n。”因此，(n)数值通常落入下列范围的一种或多种：2至约3400，约100至约2300，约100至约2270，约136至约2050，约225至约1930，约450至约1930，约1200至约1930，约568至约2727，约660至约2730，约795至约2730，约795至约2730，约909至约2730，和约1,200至约1,900。对于任何分子量是已知的特定聚合物，通过聚合物的总重均分子量除以重复单体分子量来确定重复单元(即“n”)的数量是可能的。

[0091]就水溶性聚合物的分子量而言，在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，所述的缀合物含有直接或者通过包括一个或多个原子的间隔部分共价结合至水溶性聚合物的GM-CSF部分，其中所述水溶性聚合物的分子量大于5,000道尔顿。

[0092]用于本发明中一种特别优选的聚合物是封端的聚合物，也就是，具有至少一个末端被相对惰性基团如低级烷氧基基团(即C_1-6烷氧基)封端的聚合物，当然，也可使用羟基。例如，当聚合物是PEG时，优选使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，它是PEG的线型形式，其中该聚合物的一个末端带有甲氧基(-OCH₃)，而另一个末端是羟基或可被任选地化学修饰的其它官能团。

[0093]在一种用于本发明的形式中，游离或未结合的PEG为在每一末端用羟基终止的线型聚合物：

HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH，其中，(n)通常为0至约4,000的范围。

[0094]上述的聚合物，α-二羟基聚(乙二醇)、ω-二羟基聚(乙二醇)，可以表示为HO-PEG-OH简化形式，应当理解，-PEG-符号可以代表下列的结构单元：

-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，其中，(n)如上所定义。

[0095]用于本发明的另一种类型的PEG是甲氧基-PEG-OH，或简写为mPEG，其中一个末端是相对惰性的甲氧基基团，而另一个末端是羟基基团。mPEG的结构表示如下。

CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH其中，(n)如上所述。

[0096]多臂或分支PEG分子，如美国专利No.5,932,462中描述的那些，也可用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有下述结构：

其中：polya和polyb为PEG骨架(相同或者不同)，如甲氧基聚(乙二醇)；R″是不起反应的部分，如H、甲基或PEG骨架；并且P和Q是不起反应的键。在有些实例中，分支的PEG分子包括赖氨酸残基。在有些实例中，含赖氨酸残基的分支PEG试剂具有如下的结构(尽管表示的是含琥珀酰亚胺基的结构，也可用除琥珀酰亚胺基外起反应的基团来代替)：

在一些实例中，优选的是，所述聚合物试剂(以及从这种聚合物试剂制备的相应的缀合物)缺少聚合物部分通过“-OCH2CONHCH2CO-”基团与赖氨酸胺基相连的赖氨酸残基。在其它的实例中，优选的是，所述聚合物试剂(以及从这种聚合物试剂制备的相应的缀合物)缺少包括赖氨酸残基(其中该赖氨酸残基被用于影响分支)的分支水溶性聚合物。

[0097]此外，所述的PEG可包含分叉的PEG。分叉PEG的实例表示为下列结构：

其中X是一个或多个原子的间隔部分，并且每个Z都是通过定义长度的原子链将活化末端基团连接至C-H的碳原子。国际申请No.PCT/US99/05333公开了可用于本发明一个或多个实施方案中的各种分叉PEG结构。所述的将Z官能团连接至分支碳原子的原子链用作束缚基团并且可以包括，例如，烷基链、醚链、酯链、酰胺链及其组合。

[0098]所述的PEG聚合物可包含具有反应性基团如羧基沿着PEG长度而不是PEG链末端共价地结合的接枝PEG分子。所述接枝的起反应基团可以与直接或通过间隔部分如亚烷基相结合。

[0099]除了上述形式的PEG，所述聚合物也可以制备成在聚合物中具有一种或多种弱的或可降解的键(例如水解条件下可降解的键)，包括任何上述的聚合物。例如，PEG可被制备成在该聚合物内具有易于水解的酯连接。如下所示，这种水解导致聚合物分裂成较低分子量的片段：

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O→-PEG-CO₂H+HO-PEG-

[0100]其它的水解条件下可降解的键，用作聚合物骨架内可降解的键，包括：碳酸酯键；亚胺键，其产生于，例如，胺与醛反应(参见，例如，Ouchi等，(1997)Polymer Preprints 38(1)：582-3)；磷酸酯键，其形成于，例如，醇与磷酸基团反应；通常由醛与肼反应形成的腙键；通常由醛与醇之间反应形成的缩醛键；例如通过甲酸根与醇之间反应形成的原酸酯键；例如，由聚合物如PEG末端上的胺基与另一个PEG链的羧基反应而形成的某些酰胺键；例如，由带有末端异氰酸基团的PEG与PEG醇反应形成的尿烷键；例如，聚合物如PEG末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；和，例如，如聚合物末端的亚磷酰胺基与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。

[0101]一种或多种可降解的进入聚合物链的键的存在，可提供对给药时缀合物的最后想要的药理性质予以另外的控制。例如，可以给予大的且相对惰性的缀合物(例如，具有结合至GM-CSF部分的一条或多条高分子量PEG链，例如，具有分子量大于约20,000的一条或多条PEG链，其中该缀合物基本上不具有生物活性)，它被水解产生具有一部分初始PEG链的生物活性缀合物。通过这种方式，缀合物的特性可以更有效地修改以平衡随时间过程的聚合物生物活性。

[0102]本领域的普通技术人员应当认识到，上述涉及基本上水溶性聚合物片段决不是穷举的，而只是说明性的，具有上述性质的任意聚合物材料都被考虑到。如本文所用的，术语“聚合物试剂”通常上是指完整分子，其可包含水溶性聚合物片段以及官能团。

[0103]缀合物

[0104]如上所述，本发明的缀合物包括共价地结合(直接地或通过间隔部分)至GM-CSF部分的水溶性聚合物。典型地，对于任何特定的缀合物，一至四个水溶性聚合物被共价地结合至GM-CSF部分(其中，对于每个水溶性聚合物而言，该水溶性聚合物可直接地或通过间隔部分共价地结合至GM-CSF部分)。但是，在一些实例中，聚合物可带有分别被结合至GM-CSF部分(同样，就每个水溶性聚合物而言，直接地或者通过间隔部分而结合)的1、2、3、4、5、6、7、8或更多水溶性聚合物。此外，所述的缀合物可包括至多8个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多7个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多6个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多5个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多4个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多3个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，至多2个分别被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物，和至多1个被结合至GM-CSF部分的水溶性聚合物。

[0105]在GM-CSF部分与水溶性聚合物(或者被结合至水溶性聚合物的间隔部分)之间的特定键取决于许多因素。这种因素包括，例如，所应用的特定的键化学，特定的GM-CSF部分，在GM-CSF部分内可用的官能团(用于与聚合物连接或转化成适宜的结合位点)，在GM-CSF部分内可能存在的另外的反应性官能团，等等。

[0106]在本发明的一个或多个实施方案中，在GM-CSF部分与聚合物(或者被结合至聚合物的间隔部分)之间的键是水解条件下稳定的键，诸如酰胺、尿烷(也称作氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也称作硫化物)，或者尿素(脲)。在一个或多个实施方案中，所述的键不是源自带有官能团的聚合物试剂与GM-CSF部分的反应，其中所述的官能团选自三嗪、肼、酰肼、醛、氨基脲、马来酰亚胺、乙烯基砜、苯乙二醛、异氰酸酯、异硫氰酸酯、胺以及带有GM-CSF部分的三氟乙磺酰基(tresyl)官能团。

[0107]在本发明的一个或多个实施方案中，在GM-CSF部分与水溶性聚合物(或者被结合至水溶性聚合物的间隔部分)之间的键是可降解的键。通过这种方式，连接GM-CSF部分的键是“可降解的”。换言之，水溶性聚合物(与间隔部分，当存在时)裂解(通过水解，酶工艺，或其它)，籍此产生天然的或未缀合的GM-CSF部分。优选地，可降解的键产生水溶性聚合物(和任意的间隔部分)，其在体内自GM-CSF部分分离而不留下水溶性聚合物(和任意间隔部分)的任何片段。典型可降解键包括碳酸酯、羧酸酯、磷酸酯、硫醚、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺，和原酸酯。应用本领域常用的偶合方法，通过对GM-CSF部分(例如，蛋白C末端的羧基或者蛋白内含有的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基)和/或聚合物试剂适当的修饰，可以容易地制备这种键。但是，最优选的是，适当活化的聚合物与在GM-CSF部分内含有的非修饰官能团反应而容易地形成的可水解键。

[0108]就键而言，在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其含有在一氨基酸残基处直接或通过包含一个或多个原子的间隔部分共价地结合至水溶性聚合物的GM-CSF部分。

[0109]所述的缀合物(相对于未缀合的GM-CSF部分)可以具有或可以不具有可检测程度的GM-CSF活性。换言之，本发明的缀合物具有约0％至约100％或者更多未修饰的母体GM-CSF部分的生物活性。优选地，具有很少或无GM-CSF活性的化合物通常包括将聚合物与所述部分连接的可降解键，因此，不考虑缀合物缺少活性，活性的母体分子(或它具有GM-CSF活性的衍生物)通过降解键(例如，通过水溶液诱导键裂解的水解)而被释放出来。根据具有已利用的GM-CSF活性的特定部分的已知活性，应用适宜的体外或体内模型，可以确定这种活性。

[0110]优选地，通过应用水解条件下可裂解和/或酶可降解的键例如尿烷、酰胺、碳酸酯或含酯键，便于可降解键的降解。这样，通过选择聚合物分子的大小和能提供理想清除特性的官能团类型，可以调整缀合物的清除【通过单个水溶性聚合物的裂解】。本领域的普通技术人员可以确定聚合物的适宜分子大小以及可裂解的官能团。例如，应用常规试验，通过首先制备不同重均分子量和可降解官能团的各种聚合物-(CM-CSF)缀合物，然后通过将缀合物给予患者并定期取血样和/或尿样获得每个缀合物的清除状况，本领域的普通技术人员可确定适宜的分子大小和可裂解官能团。一旦已获得了每种被检验缀合物的一系列清除状况，就可以确定具有想要的清除状况的缀合物。

[0111]对于具有将GM-CSF部分与水溶性聚合物偶合的、水解稳定的键的缀合物，该缀合物一般会具有可检测程度的GM-CSF活性。例如，这种缀合物典型特征在于其具有满足下列一个或多个相对于未缀合GM-CSF部分的百分比的生物活性：至少约2％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，至少约100％，和大于105％(当在适宜的模型中检测时，诸如本文提供的和/或本领域熟知的那些)。优选地，带有水解条件下稳定的键(例如，酰胺键)的缀合物会具有至少一定程度的未修饰母体GM-CSF部分的生物活性。

[0112]现在将描述典型缀合物。预计GM-CSF部分具有(至少部分地)与人GM-CSF相似于或相关的氨基酸序列。因此，如前所示，当引用人GM-CSF的特定位置或原子时，这种引用只是为了方便而且本领域普通技术人员能够容易地确定具有GM-CSF活性的其它部分内相应的位置或原子。特别是，本文提供的关于人GM-CSF的描述常常不仅适用于人GM-CSF，也适用于任意的上述的片段、缺失变异体、取代变异体和添加变异体。

[0113]GM-CSF部分上的氨基基团提供了在GM-CSF部分与水溶性聚合物之间的结合点。在SEQ E)NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中提供的每种人GM-CSF部分都包含14个赖氨酸残基以及一个氨基末端，其中每个赖氨酸残基含有一个可用于缀合的ε-氨基。参见SEQ E)NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。因此，典型的结合点包括在位置25、26、28、49、55、59、61、66、64、73、77、110、114和115的任何一个或多个的氨基酸上的结合(通过赖氨酸残基的含胺基侧链)。此外，另一种GM-CSF部分包含含15个胺基的赖氨酸残基(参见SEQ ID NO：3)。因此，这种GM-CSF的优选结合点包括在位置23、25、26、28、49、55、59、61、66、64、73、77、110、114和115的任何一个的与赖氨酸相关的胺基残基上的结合。

[0114]许多合适的水溶性聚合物试剂的实例可用于与GM-CSF部分的可利用胺基形成共价键。下面的表1提供了特定的实例，以及相应的缀合物。表中，变量(n)表示重复单体单元的数量，“(GM-CSF)”表示与水溶性聚合物缀合后的GM-CSF部分。虽然表1中的每个聚合物部分【例如，(OCH₂CH₂)_n或(CH₂CH₂O)_n】以“CH₃”基团终止，但是可以其它的基团(如H和苄基)来代替。

表1：胺基特定性聚合物试剂以及形成的GM-CSF部分缀合物

[0115]可以多种技术实现聚合物试剂缀合至GM-CSF部分的胺基。在一种方法中，可将GM-CSF部分缀合至用琥珀酰亚胺基衍生物(或其它活化的酯基，其中与描述的用于琥珀酰亚胺基衍生物的那些相似的方法可用于其它活化的含酯基聚合物试剂)官能化的聚合物试剂。在该方法中，可在pH 7.0至9.0的含水介质中将带有琥珀酰亚胺基的聚合物试剂结合至GM-CSF部分，尽管不同的反应条件(例如，较低的pH如6至7，或不同的温度和/或低于15℃)可导致聚合物结合至GM-CSF部分上的不同位置。

[0116]可使用例如含有反应性酯的聚合物试剂制备典型缀合物，其包括下列结构：

其中：POLY为水溶性聚合物，是0或1；X¹，当存在时，为含有一个或多个原子的间隔部分；R¹为氢或有机基团；并且GM-CSF为GM-CSF部分。

[0117]关于对应于在上一段落中参照的结构，本文所提供的任何水溶性聚合物可以定义为POLY，本文所提供的任意的间隔部分可定义为X¹(当存在时)，本文所提供的任何有机基团可定义为R¹(在R¹不是氢的情况)，和本文所提供的任何GM-CSF部分可定义为GM-CSF。关于对应于在上一段落中参照的结构，优选的是：POLY为聚(乙二醇)如H₃CO(CH₂CH₂O)_n-，其中(n)为数值为3至4000的整数；(a)为1；X¹为C_1-6亚烷基，更优选地选自亚甲基(即-CH₂-)，亚乙基(即-CH₂-CH₂-)和亚丙基(即-CH₂-CH₂-CH₂-)；R¹为H或低级烷基如甲基或乙基；及GM-CSF为人GM-CSF。

[0118]另一个用于将GM-CSF部分缀合至聚合物试剂的方法通常是应用还原胺化反应，将GM-CSF部分的伯胺与用酮、醛或它们的水合形式(例如，水合酮和水合醛)官能化的聚合物试剂缀合。在该方法中，GM-CSF部分的伯胺与醛或酮(或者水合醛或水合酮的相应含羟基的基团)的羰基反应，由此形成希夫碱(Schiff base)。然后，通过应用还原剂如硼氢化钠，可将希夫碱还原性地转化成稳定的缀合物。选择性反应(例如，可能在N-端)是可能的，特别是涉及以酮或α-甲基分支的醛官能化聚合物和/或在特定的反应条件下(例如，降低的pH)。

[0119]可使用例如含有醛(或水合醛)或酮或(水合酮)的聚合物试剂制备典型缀合物，其包括下列结构：

其中：POLY为水溶性聚合物；(d)是0或1；X²，当存在时，为含有一个或多个原子的间隔部分；(b)是数值为1至10的整数；(c)是数值为1至10的整数；R²，在任何情况下都独立地为氢或有机基团；R³，在任何情况下都独立地为氢或有机基团；并且GM-CSF为GM-CSF部分。

[0120]关于对应于在上一段落中参照的结构，本文所提供的任意的水溶性聚合物可以定义为POLY，本文所提供的任意的间隔部分可定义为X²(当存在时)，本文所提供的任意的有机基团可独立地定义为R²和R³(在R²和R³独立地不是氢的情况)，和本文所提供的任意的GM-CSF部分可定义为GM-CSF。关于对应于在上一段落中参照的结构，在这些实例中优选的是：POLY为聚(乙二醇)如H₃CO(CH₂CH₂O)_n-，其中(n)为数值为3至4000的整数；(d)为1；X¹为酰胺【例如，-C(O)NH-】；(b)为2至6，更优选4；(c)为2至6，更优选4；每个R²和R³都独立地为H或低级烷基，当是低级烷烃时更优选地为甲基；及GM-CSF为人GM-CSF。在其它实例中，优选的是，该缀合物包括如下的结构：

其中：每个(n)独立地为数值为3至4000的整数；X²如上定义；(b)为2至6；(c)为2至6；R²，在任何情况下都独立地为氢或低级烷基；并且GM-CSF为GM-CSF部分。

[0121]羧基代表另一种官能团，它可作为GM-CSF部分上的结合点。结构上，所述的缀合物包括如下：

其中，GM-CSF和相邻的羰基对应于含羧基的GM-CSF部分；X为间隔部分，优选地选自O、N(H)和S的杂原子；并且POLY为水溶性聚合物如PEG，任选地在封端部分终止。

[0122]C(O)-X键源自在带有末端官能团的聚合物衍生物与含羧基的GM-CSF部分之间的反应。如上所述，特定的键将依赖于所用的官能团类型。如果聚合物是用羟基末端-官能化的或“活化的”，得到的键是羧酸酯，并且X为O。如果聚合物骨架是用巯基官能化的，得到的键是硫酯，并且X为S。当使用某些多臂、分支或分叉的聚合物时，C(O)-X部分，及特别是X部分，可以是相对地较复杂的而且可包括较长的键结构。

[0123]含酰肼部分的聚合物试剂也用于在羰基上的缀合。对于GM-CSF部分不含羰基部分的情况，羰基部分可通过还原任意羧酸(例如，C-末端羧酸)和/或通过提供GM-CSF部分的糖基化形式(其中被添加的糖带有羰基部分)而被引入。下面的表2提供了含有酰肼部分的聚合物试剂的特定实例，以及相应的缀合物。此外，通过使含有活化酯的聚合物试剂与肼(NH₂-NH₂)或肼基甲酸叔丁酯【NH₂NHCO₂C(CH₃)₃】反应，任何含有活化酯(例如，琥珀酰亚胺基团)的聚合物试剂可被转化成含酰肼部分。表中，变量(n)代表重复单体单元的数量，并且“＝C-(GM-CSF)”代表缀合至聚合物试剂之后的GM-CSF部分。任选地，腙键可用适当的还原剂还原。虽然表2中的每个聚合物部分【例如，(OCH₂CH₂)_n或(CH₂CH₂O)_n】都以“CH₃”基团终止，但是可以其它的基团(如H和苄基)来代替之。

表2：羧基特定性聚合物试剂及其形成的GM-CSF部分缀合物

效结合位点。GM-CSF部分的半胱氨酸残基中的巯基可与特异性与巯基反应的活化PEG反应，例如，N-马来酰亚胺基聚合物或其它的衍生物，例如美国专利No.5,739,208，国际专利公布No.WO01/62827以及下面的表3中所描述的。

[0125]对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，都有四个含巯基的半胱氨酸残基。尽管不希望被理论所束缚，但是认为这些序列中所有的半胱氨酸残基都参与了二硫键。结果是，与参加二硫键的半胱氨酸残基的缀合可破坏GM-CSF部分的三级结构并且可能显著地降低了它的全部活性。因此，在任意特定的GM-CSF部分缺少巯基或要避免二硫键破坏的情况，应用常规的合成技术可将半胱氨酸残基添加至GM-CSF部分。参见，例如，美国专利No.6,608,183和国际专利公布WO90/12874所描述的方法，其中这种方法可适用于GM-CSF部分。此外，也可应用常规的基因工程方法将半胱氨酸残基引入GM-CSF部分。

[0126]下列表3中提供了特定的实例以及相应的缀合物。表中，变量(n)代表重复的单体单元的数量，并且“-S-(GM-CSF)”代表缀合至水溶性聚合物之后的GM-CSF部分。尽管表3中的每个聚合物部分【例如，(OCH₂CH₂)_n或(CH₂CH₂O)_n】都以“CH₃”基团终止，但是也可用其它基团(如H和苄基)代替之。

表3：巯基特定性聚合物试剂及其形成GM-CSF部分缀合物

[0127]对于从带有一个或多个马来酰亚胺官能团(不考虑马来酰亚胺是否与GM-CSF部分上的氨基或巯基发生反应)的水溶性聚合物形成的缀合物，相应的马来酰胺酸形式的水溶性聚合物也可与GM-CSF部分反应。在一定条件下(例如，pH约7-9和在水存在下)，马来酰亚胺环将“打开”以形成相应的马来酰胺酸。然后，马来酰胺酸与GM-CSF部分的氨基或巯基反应。典型的基于马来酰胺酸的反应图解表示如下。POLY代表水溶性聚合物，并且GM-CSF代表GM-CSF部分。

[0128]根据本发明，代表性缀合物可具有如下的结构：

POLY-L_0，1-C(O)Z-Y-S-S-(GM-CSF)其中POLY为水溶性聚合物，L为任选连接键，Z为选自O、NH和S的杂原子，Y是选自C_2-10烷基、C_2-10取代的烷基、芳基以及取代的芳基，并且GM-CSF为GM-CSF部分。在美国专利申请公开No.2005/0014903中描述了可与GM-CSF部分反应且产生这种类型缀合物的聚合物试剂。

[0129]至于聚合物试剂，这里和其它处所述的那些可从商业来源购买(例如，Nektar Therapeutics，亨茨维尔，阿拉巴马州)。此外，在文献中描述了制备聚合物试剂的方法。

[0130]GM-CSF部分和水溶性聚合物可直接结合或者间接结合，在直接结合的情况中，在GM-CSF部分与聚合物之间没有任何插入的原子，在间接结合的情况中，一个或多个原子位于GM-CSF部分与聚合物之间。对于间接结合而言，“间隔部分”用作在GM-CSF部分与水溶性聚合物之间的键。构成间隔部分的所述一个或多个原子可包括一个或多个碳原子、氮原子、硫原子、氧原子及其组合。间隔部分可包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚和/或二硫基团。特定的间隔部分(包括“X”、X¹和X²)的非限定性实例包括选自如下的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-C(O)-O-CH₂-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-NH-CH₂-、-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-CH₂-、-C(O)-CH₂-、-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-[CH₂]_h-(OCH₂CH₂)_j-、二价的环烷基、-O-、-S-、氨基酸、-N(R⁶)-，以及任意上述的两种或多种的组合，其中R⁶为H或选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的有机基团，(h)是0至6，并且(j)是0至20。其它的特定间隔部分具有如下的结构：-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-、和-O-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-，其中每个亚甲基后面的下标值表示结构中包括的亚甲基数量，例如，(CH₂)_1-6是指该结构可含有1、2、3、4、5或6个亚甲基。另外，任意的上述间隔部分可进一步包括含有1至20个环氧乙烷单体单元【即，-(CH₂CH₂O)_1-20】的环氧乙烷寡聚物链。也就是说，环氧乙烷寡聚物链可出现在间隔部分的前面或后面，并且任选地在含有两个或多个原子的间隔部分的任意两个原子之间。此外，如果寡聚物与聚合物片段相邻并且仅代表聚合物片段的延伸，那么寡聚物链不被视为间隔部分的一部分。间隔部分不包括糖或碳水化合物(亦即，间隔部分明确地不包括糖基化残基的糖)。可通过糖基化残基(例如，糖或碳水化合物)结合水溶性聚合物。在那些需要这种排列的实例中，本申请是指如“通过糖基化残基将GM-CSF部分共价地结合至水溶性聚合物”的排列。

[0131]如上所述，在一些实例中水溶性聚合物-(GM-CSF)缀合物包括非线型水溶性聚合物。这种非线型水溶性聚合物包括分支的水溶性聚合物(但是也考虑了其它的非线型水溶性聚合物)。因此，在本发明的一个或多个实施方案中，所述的缀合物包括GM-CSF部分，其包括直接地或通过包含一个多个原子的间隔部分共价地结合至分支水溶性聚合物的内部胺基。如本文所用的，内部胺基是非N-末端氨基酸部分(并且既包括N-末端胺基，也包括N-末氨基酸侧链的任意胺基)的胺基。对于含有包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3序列的GM-CSF部分，例如，内部的胺基位于每个赖氨酸残基的每个链上。

[0132]应当注意的是，尽管这种缀合物包括了在GM-CSF部分的内部氨基酸上被结合至GM-CSF部分的分支水溶性聚合物，也可在其它的位置上将另外的分支水溶性聚合物结合至相同的GM-CSF部分。因此，例如，包括在GM-CSF部分的内部氨基酸上被(直接地或通过间隔部分)结合至GM-CSF部分的分支水溶性聚合物的缀合物，可进一步包括被直接地或通过含有一个或多个原子的间隔部分共价地结合至N-末端氨基酸残基的另外的分支水溶性聚合物，优选地在N-末端氨基上。如上所述，在一些实例中，分支水溶性聚合物缺少赖氨酸残基，其中聚合物部分通过“-OCH₂CONHCH₂CO-”基团被结合至赖氨酸的胺基。在其它的实例中，优选的是，分支水溶性聚合物缺少赖氨酸残基(其中赖氨酸残基被用于影响分支)。优选的分支水溶性聚合物包括如下的结构：

其中每个(n)独立地为数值3至4000的整数。

[0133]组合物

[0134]缀合物通常是组合物的部分。一般地，组合物含有多个缀合物，优选地尽管非必要地，每个缀合物带有分别被共价地结合(直接地或通过间隔部分)至一GM-CSF部分的一、二、三或四个水溶性聚合物。但是，所述的组合物也可含有带有被结合至任意特定GM-CSF部分的四、五、六、七、八个或更多聚合物的其它缀合物。

[0135]至于组合物中的缀合物，所述组合物通常满足一种或多种下列的特征：组合物中缀合物至少约85％具有被结合至GM-CSF部分的1至5个聚合物；组合物中缀合物至少约85％具有被结合至GM-CSF部分的1至4个聚合物；组合物中缀合物至少约85％具有被结合至GM-CSF部分的1至3个聚合物；组合物中缀合物至少约85％具有被结合至GM-CSF部分的1至2个聚合物；组合物中缀合物至少约85％具有被结合至GM-CSF部分的1个聚合物(即，被单PEG化)；组合物中缀合物至少约95％具有被结合至GM-CSF部分的1至5个聚合物；组合物中缀合物至少约95％具有被结合至GM-CSF部分的1至4个聚合物；组合物中缀合物至少约95％具有被结合至GM-CSF部分的1至3个聚合物；组合物中缀合物至少约95％具有被结合至GM-CSF部分的1至2个聚合物；组合物中缀合物至少约95％具有被结合至GM-CSF部分的1个聚合物(即，被单PEG化)；组合物中缀合物至少约99％具有被结合至GM-CSF部分的1至5个聚合物；组合物中缀合物至少约99％具有被结合至GM-CSF部分的1至4个聚合物；组合物中缀合物至少约99％具有被结合至GM-CSF部分的1至3个聚合物；组合物中缀合物至少约99％具有被结合至GM-CSF部分的1至2个聚合物；和，组合物中缀合物至少约99％具有被结合至GM-CSF部分的1个聚合物(即，被单PEG化)。

[0136]在一个或多个实施方案中，优选的是，含缀合物的组合物不含或基本上不含白蛋白。也可优选的是，所述组合物不含或基本上不含不具备GM-CSF活性的蛋白质。因此，优选的是，所述组合物是85％、更优选95％和最优选99％不含白蛋白。此外，优选的是，所述组合物是85％、更优选95％和最优选99％不含不具备GM-CSF活性的任意蛋白质。至于白蛋白在组合物中存在的情况，本发明的典型组合物基本上没有包含将GM-CSF部分的残基连接至白蛋白的聚(乙二醇)聚合物的缀合物。

[0137]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其含有：

(i)一种缀合物，其含有直接地或者通过包括一个或多个原子的间隔部分共价地结合至水溶性聚合物的人GM-CSF，其中所述的水溶性聚合物具有大于5,000道尔顿的重均分子量；和

(ii)一种药学上可接受的赋形剂，其中，组合物中缀合物至少约85％具有被结合至GM-CSF部分的1至2个聚合物。在一些实例中，所述药物组合物包括这样的条件：当水溶性聚合物是分支水溶性聚合物时，该分支水溶性聚合物缺少赖氨酸残基，其中聚合物部分通过“-OCH₂CONHCH₂CO-”基团被结合至赖氨酸的胺基。在其它的实例中，所述药物组合物包括这样的条件：水溶性聚合物缺少赖氨酸残基(其中赖氨酸残基被用于影响分支)。

[0138]通过选择适宜的聚合物试剂、聚合物试剂与GM-CSF部分的比例、温度、pH条件以及缀合物反应的其它方面，可实现控制用于任何特定部分的、所需数量的聚合物。此外，通过纯化的手段，可实现减少或消除不想要的缀合物(例如，带有4个或更多被结合的聚合物的那些缀合物)。

[0139]例如，可将水溶性聚合物-(GM-CSF)部分缀合物纯化，以获得/分离不同的缀合种类。明确地讲，将产物混合物纯化，以得到每个GM-CSF部分的任意处1、2、3、4、5或更多个的平均值的PEG，通常，每个GM-CSF部分有1、2或3个PEG。用于最终缀合物反应混合物纯化的策略依赖于许多因素，包括，例如，所用的聚合物试剂的分子量、特定的GM-CSF部分、想要的给药方案以及残余的活性和个体缀合物的体内特性。

[0140]需要时，应用凝胶过滤色谱法和/或离子交换色谱法可以分离具有不同分子量的缀合物。换言之，凝胶过滤色谱法用于基于它们不同的分子量(这种不同基本上对应于水溶性聚合物部分的平均分子量)而分馏不同数量的聚合物-与-(GM-CSF)部分比率【例如，1-mer，2-mer，3-mer，等等，其中，“1-mer”表示1个聚合物被结合至GM-CSF部分(或，当聚合物为PEG时，为单PEG化)，“2-mer”表示2个聚合物被结合至GM-CSF部分(或，当聚合物为PEG时，为双PEG化)，等等】。例如，在典型反应中，将20,000道尔顿蛋白质随机地缀合至分子量为约20,000道尔顿的PEG试剂，得到的反应混合物可含有分子量为约20,000道尔顿的未修饰的蛋白质，分子量为约40,000道尔顿的单PEG化蛋白质(或“1-mer”)，分子量为约60,000道尔顿的双PEG化蛋白质(或“2-mer”)，等等。

[0141]尽管可用这种方法来分离PEG和具有不同分子量的其它水溶性聚合物-(GM-CSF)部分缀合物，但是对于分离在GM-CSF部分内具有不同的聚合物结合位点的位置异构体，这种方法通常是无效的。例如，凝胶过滤色谱法可用于分离1-mer、2-mer、3-mer等彼此的混合物，但是，每个回收的PEG-mer组合物可包含被结合至GM-CSF部分内不同的反应性氨基(例如，赖氨酸残基)的PEG。

[0142]适于实现这种类型分离的凝胶过滤柱包括可从AmershamBiosciences(皮斯卡塔韦，纽约州)得到的Superdex和Sephadex柱。特定柱子的选择取决于想要的分馏范围。一般地应用适当的缓冲液，如磷酸、醋酸等，可实现洗脱。可用许多不同的方法分析收集的馏分，例如，(i)用于蛋白质含量的280nm吸光率，(ii)基于染料的蛋白分析，用牛血清蛋白作标准，(iii)用于PEG含量的碘检验(Sims等，(1980)Anal.Biochem，107：60-63)，(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，然后，使用碘化钡着色，和高效液相色谱。

[0143]借助于应用例如C18柱或C3柱(Amersham Biosciences或Vydac)的逆相-高效液相色谱(RP-HPLC)方法的逆相色谱法，或借助于应用离子交换柱例如可从Amersham Biosciences获得的Sepharose离子交换柱的离子交换色谱法，可实现位置异构体的分离。可以应用任一种方法来分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(位置异构体)。

[0144]优选地，所述的组合物基本上不含无GM-CSF活性的蛋白质。此外，优选地，所述的组合物基本上不含所有其它的非共价结合的水溶性聚合物。但是，在有些情况下，所述的组合物可含有水溶性聚合物-(GM-CSF)部分缀合物与未被缀合的GM-CSF的混合物。

[0145]任选地，本发明的组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。需要时，可将该药学上可接受的赋形剂添加至缀合物以形成组合物。

[0146]典型的药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，选自下述的那些：碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱，及其组合。

[0147]碳水化合物如糖，衍生的糖如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可用作赋形剂。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和醛糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。

[0148]所述的赋形剂也可包括无机盐或缓冲剂如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其组合。

[0149]所述的组合物也可包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适于本发明的抗微生物剂的非限定性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、西吡氯铵、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)，及其组合。

[0150]抗氧化剂也可存在于所述的组合物中。抗氧化剂被用于防止氧化，籍此防止缀合物或制剂的其它组分变质。适用于本发明的抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，及其组合。

[0151]表面活性剂可用作赋形剂。典型表面活性剂包括：聚山梨酯，如“吐温20”和“吐温80”和普郎尼克(pluronic)如F68和F88(两种都可从新泽西州橄榄山BASF公司获得)；山梨聚糖酯；类脂，如磷脂如卵磷脂和其它的磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺(但是不优选脂质体形式)，脂肪酸和脂肪酯；甾体类，如胆固醇；和络合剂，如EDTA，和锌及其它适宜的阳离子。

[0152]酸或碱可用作组合物中的赋形剂。可应用的酸的非限定性实例包括选自下述的这些酸：盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯醋酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸、及其组合。适宜的碱的实例包括，但不限于选自下述的碱：氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、醋酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾，及其组合。

[0153]组合物中缀合物(即，在活性剂与聚合物试剂之间形成的缀合物)的量根据许多因素而变化，但是当组合物被储存于单位剂量的容器(例如，小药瓶)中时优选地为治疗上有效的量。另外，可以将所述的药物制剂封装于注射器中。通过增加量缀合物的重复给药以确定产生临床上想达到的终点的量，来实验性确定治疗上有效的量。

[0154]组合物中任意个体赋形剂的量都根据赋形剂的活性和组合物的特定需要而变化。通常，任意个体赋形剂的最适量由常规的实验来确定，即，制备含有不同量的赋形剂(从低到高的范围)的组合物，检验稳定性和其它参数，然后确定获得最佳性能并无明显副作用的范围。

[0155]但是，通常情况下，组合物中含有赋形剂的量为约1％至约99％(按重量)，优选地约5％至约98％(按重量)，更优选地约15％至约95％(按重量)的赋形剂，最优选地浓度小于30％(按重量)。

[0156]上述的这些药学上可接受的赋形剂以及其它的赋形剂都被记载于《药物学与实践》(“Remington：The Science & Practiceof Pharmacy”)，第19版，Williams & Williams，(1995)，《医师桌上参考手册》(“Physician′s Desk Reference”)，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，以及Kibbe，A.H.《药用赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第3版，美国制药协会，华盛顿特区，2000。

[0157]本发明也提供了一种制备缀合物的方法，该方法包括，在缀合条件下，使GM-CSF部分与聚合物试剂接触。如本文所提供的，所述的方法不必包括进行保护和脱保护的步骤。下面的实验部分提供了用于制备缀合物的典型方法。一旦制备了缀合物，就可将药学上可接受的赋形剂添加到缀合物以提供药物组合物。

[0158]所述的药物组合物包括了所有类型的制剂并且特别是那些适于注射的制剂，例如，可被复配成液体的粉末或冻干品。用于注射前复配固体组合物的适宜稀释剂实例包括注射用抑菌水、5％葡萄糖水、磷酸盐缓冲盐水、林格液、盐水、无菌水、去离子水，及其组合。至于液体的药物组合物，考虑溶液和混悬液。

[0159]在本发明的一个或多个实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括将缀合物传输给患者，该方法包括对患者给予如本文所提供的药物组合物的步骤。这种方法具有实用性如，其中，作为用于筛选药物组合物毒性(针对已知标准的自身毒性或者其它组合物的毒性来相关地检验毒性)的方法。此外，所述的方法通过给予治疗有效量药物组合物可用于治疗患有对用缀合物治疗有响应的病症的患者。可通过例如静脉注射、肌肉注射、皮下注射等进行给药。用于胃肠外给药的适宜制剂类型包括可直接注射用(ready-for-injection)的溶液、用于使用前与溶剂组合的干粉，可直接注射用的混悬液、用于使用前与载体组合的干燥不溶的组合物，和乳液和用于用药前需稀释的浓缩液，及其它。

[0160]如前所述，传输的方法可用于治疗患有缀合物用药可以治疗或预防的病症的患者。本领域普通技术人员可鉴别特定缀合物可有效地治疗的病症。例如，在给予化疗剂之前、同时或之后，对患者给予所述的缀合物。此外，可对经骨髓移植(例如患有急性骨髓性白血病的患者)的患者给予所述的缀合物，其中用药发生于骨髓移植(自体的或异体的)之前、同时或之后。另外，缀合物通过增强外周单核细胞和淋巴细胞的细胞毒活性可用于治疗癌症、粘膜炎、口腔炎、腹泻、创伤愈合、肺泡蛋白沉积症和高胆固醇血症。最后，所述的缀合物也可用作疫苗佐剂。

[0161]给药的实际剂量根据年龄、体重、个体的一般状况以及被治疗病症的严重程度、卫生保健专业人员的判断和给予的缀合物而变化。对于本领域的普通技术人员而言，治疗上有效量是已知的，和/或描述在相关的参考教科书和文献中。一般地，根据体重，治疗上有效量为约0.001mg至100mg的范围，优选地剂量为0.01mg/天至75mg/天，和更优选地剂量为0.10mg/天至50mg/天。根据活性，本领域的普通技术人员可计算出基于国际单位活性的相应剂量。

[0162]任何特定缀合物(同理，优选作为药物组合物的组分而提供)的单位剂量可以多种用药方案而给药，这取决于临床人员的判断、患者的需要等。对于本领域的普通技术人员而言，特定的用药方案是已知的或者可应用常规的方法实验性确定。典型用药方案包括，但不限于，下述给药：每日五次、每日四次，每日三次，每日两次，每日一次，每周三次，每周两次，每周一次，每月两次，每月一次，及其任意的组合。一旦达到了临床的终点，停止该组合物的给药。

[0163]应当理解的是，尽管结合优选的特定实施方案对本发明进行了描述，以上的描述以及随后的实施例都是为了举例说明而不是限制本发明的范围。在其它方面，对于本发明所属领域的普通技术人员而言，在本发明的范围内的优点和改进将是显而易见的。

实验

[0164]除非另有说明，本发明的实施利用有机合成等的常规技术，这属于现有技术。这些技术在文献中有全面的解释。除非特别声明，试剂和材料是商业上可获得的。参见，例如，J.March，《高等有机化学：反应机理与结构》，第4版，(纽约：Wiley-Interscience，1992)，见上。

[0165]在下面的实施例中，发明人已作出努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的精确度，但是应当考虑实验误差和偏差。除非另有说明，温度是摄氏度，压力为在海平面等于或接近大气压。

[0166]即使本发明引用了本领域普通技术人员已知的其它缩写，使用了其它试剂和材料，以及本领域普通技术人员已知的其它方法，但是为了方便提供了下列列表和方法描述。

[0167]缩写：

[0168]NaCNBH₃ 氰基硼氢化钠

[0169]HCl 盐酸

[0170]HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

[0171]K或kDa 千道尔顿

[0172]SEC 尺寸排除色谱法

[0173]HPLC 高效液相色谱法

[0174]SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

[0175]SDS-PAGE分析

[0176]应用Bio-Rad系统(Mini-PROTEAN III Precast GelElectrophoresis System)，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析所标明的样品。将样品与样品缓冲液混合。然后，将制备的样品装至凝胶并运行约三十分钟。

[0177]SEC-HPLC分析

[0178]在安捷伦1100HPLC系统(安捷伦)上进行尺寸排除色谱法(SEC-HPLC)分析。应用Shodex protein KW-804柱(300×8mm，Phenomenex)，在pH 7.4的条件下，分析样品。柱的流速为0.5mL/分钟。应用280nm的UV检测被洗脱的蛋白质和PEG-蛋白质缀合物。

[0179]离子-交换色谱法

[0180]凭借AKTAprime系统(Amersham Biosciences)，应用HiTrap Q Sepharose HP阴离子交换柱(Amersham Biosciences)来纯化实施例1至6中制备的PEG化GM-CSF缀合物。至于所制备的各缀合物溶液，将缀合物溶液装载于用pH 7.5的20nM Tris缓冲液(缓冲液A)预平衡的柱子中，然后用十倍柱容积的缓冲液A冲洗以除去未反应的PEG试剂。随后，增加含有0-100％缓冲液B(含有0.5M NaCl缓冲液的20mM Tris，pH 7.5)的缓冲液A梯度。用UV检测仪在280nm监视洗脱物。首先洗脱任何较高-mer(例如，3-mer，4-mer等等)，随后是2-mer，然后1-mer，最后是未缀合的GM-CSF。根据色谱图，合并馏分，应用SEC-HPLC或SDS-PAGE测定各缀合物的纯度。

[0181]对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重组人GM-CSF(hGM-CSF)应用于实施例1-6，并且可从商业途径获得。通过确保重组人GM-CSF存在于无胺基的缓冲液中，应用(必要时)本领域的普通技术人员已知的缓冲液交换技术，制备hGM-CSF储备液。

实施例1

40kDa mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺衍生物与hGM-CSF的PEG化

分支的mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺衍生物，40kDa，(“mPEG2-NHS”)

[0182]将氩气保护下储存于-20℃的40kDa mPEG2-NHS加温至室温。将五倍过量(相对于在已测量等分的hGM-CSF贮存溶液中hGM-CSF的量)的已加温mPEG2-NHS溶解于2mM HCl中，形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速地加至等分的hGM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于磷酸钠缓冲液中，pH 7.0)并充分混合。在加入PEG试剂后，检测反应混合物的pH，并利用常规的技术调节至7.0。为了使mPEG2-NHS通过酰胺键偶合至hGM-CSF，将反应溶液放置慢速实验室振荡器(SlowSpeed Lab Rotator)上过夜以利于室温下缀合。用Tris缓冲液终止反应。所得缀合物溶液的特征如下所述。

[0183]图1显示了缀合物溶液SEC-HPLC分析的色谱图。PEG化反应产生了57％1-mer(单缀合物或一个PEG被结合至hGM-CSF)和13％2-mer(双缀合物或两个PEG被结合至hGM-CSF)类型。

[0184]应用阴离子-交换色谱法来纯化缀合物。图2显示了阴离子-交换纯化后的色谱图。收集缀合物的馏分并用SDS-PAGE来分析(图3)。被纯化的缀合物可达100％纯。

[0185]应用这种相同的方法，利用含其它重均分子量的mPEG2-NHS可以制备其它的缀合物。

实施例2

30kDa线型mPEG-琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯衍生物与hGM-CSF的PEG化

线型mPEG-琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯衍生物，30kDa(“mPEG-SMB”)

[0186]将氩气保护下储存于-20℃的30kDa mPEG-SMB加温至室温。将十倍过量(相对于在已测量等分的hGM-CSF贮存溶液中hGM-CSF的量)的已加温mPEG-SMB溶解于2mM HCl中，形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速地加至等分的hGM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于磷酸钠缓冲液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-SMB后，检测反应混合物的pH，并利用常规的技术调节至7.0。为了使mPEG-SMB通过酰胺键偶合至hGM-CSF，将反应溶液放置慢速实验室振荡器上过夜以利于室温下缀合。用Tris缓冲液终止反应。所得缀合物溶液的特征如下所述。

[0187]图4显示了缀合物溶液SEC-HPLC分析的色谱图。SEC-HPLC分析揭示PEG化反应产生了58％ 1-mer(单缀合物或一个PEG被结合至hGM-CSF)和14％ 2-mer(双缀合物或两个PEG被结合至hGM-CSF)类型。应用Q Sepharose高效柱和Tris缓冲液的阴离子-交换色谱法也用于纯化缀合物。所得缀合物种类的分离情况类似于图2中所示。

[0188]应用这种相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG-SMB可以制备其它的缀合物。

实施例3

20kDa mPEG-哌啶酮与hGM-CSF的PEG化，

[0189]可以自Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)获得分子量为20,000道尔顿的mPEG-哌啶酮(mPEG-PIP)。所述聚合物试剂的基本结构表示如下：

线型mPEG-哌啶酮衍生物，20kDa(“mPEG-PIP”)

[0190]将氩气保护下储存于-20℃的20kDa mPEG-PIP加温至室温。将五十至一百倍过量(相对于在已测量等分的hGM-CSF贮存溶液中hGM-CSF的量)的已加温mPEG-PIP溶解于10mM磷酸钠(pH 7.0)中，形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速地加至等分的hGM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于磷酸钠缓冲液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-PIP后，检测反应混合物的pH，并利用常规的技术调节至7.0，然后搅拌30分钟。然后，加入还原剂、氰基硼氢化钠，来制备13mMNaCNBH₃。将反应溶液放置慢速实验室振荡器上过夜以利于室温下缀合。用Tris缓冲液终止反应。所得缀合物溶液的特征如下所述。

[0191]PEG化反应产生了超过30％的1-mer(单缀合物或一个PEG被结合至hGM-CSF)。由于PEG环结构的高选择性，只得到很少2-mer。

[0192]阴离子-交换色谱法也用于纯化缀合物。图5描述了阴离子-交换纯化的情况。

实施例4

20kDa线型mPEG-丁醛衍生物与hGM-CSF的PEG化

线型mPEG-丁醛衍生物，20kDa(“mPEG-ButyrALD”)

[0193]将氩气保护下储存于-20℃的20kDa mPEG-ButyrALD加温至室温。将三十倍过量(相对于在已测量等分的hGM-CSF贮存溶液中hGM-CSF的量)的已加温mPEG-ButryALD溶解于Milli-Q水中，形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速地加至等分的hGM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于磷酸钠缓冲液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-ButryALD后，检测反应混合物的pH，并利用常规的技术调节至6.0，然后搅拌30分钟。然后，加入还原剂、氰基硼氢化钠，来制备9mM NaCNBH₃。将反应溶液放置慢速实验室振荡器上过夜以利于室温下缀合。用Tris缓冲液终止反应。所得缀合物溶液的特征如下所述。

[0194]mPEG-ButryALD的醛基基团可与hGM-CSF相关的伯胺反应，并且经还原剂如氰基硼氢化钠还原通过仲胺与所述伯胺共价成键。因为PEG化反应是在pH 6.0条件下进行的，PEG衍生物与hGM-CSF的结合更易于选择N-末端。图6显示了缀合物溶液的SEC-HPLC色谱图。PEG化反应产生了75％ 1-mer(一个PEG被结合至hGM-CSF或单PEG化)和4％ 2-mer(双缀合物或两个PEG被结合至hGM-CSF)类型。应用Q Sepharose高效柱和Tris缓冲液的阴离子-交换色谱法也用于纯化缀合物。所得缀合物种类的分离情况类似于图5中所示。

[0195]应用此种相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG-ButyrALD可以制备另外的缀合物。

实施例5

30kDa线型mPEG-丁醛衍生物与hGM-CSF的PEG化

线型mPEG-丁醛衍生物，30kDa(“mPEG-ButyrALD”)

[0196]将氩气保护下储存于-20℃的30kDa mPEG-ButyrALD加温至室温。将三十倍过量(相对于在已测量等分的hGM-CSF贮存溶液中hGM-CSF的量)的已加温mPEG-ButryALD溶解于Milli-Q水中，形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速地加至等分的hGM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于磷酸钠缓冲液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG-ButryALD后，检测反应混合物的pH，并利用常规的技术调节至6.0，然后搅拌30分钟。然后，加入还原剂、氰基硼氢化钠，来制备9mM NaCNBH₃。将反应溶液放置慢速实验室振荡器上过夜以利于室温下缀合。用Tris缓冲液终止反应。所得缀合物溶液的特征如下所述。

[0197]mPEG-ButryALD的醛基基团可与hGM-CSF相关的伯胺反应，并且经还原剂如氰基硼氢化钠还原通过仲胺与所述伯胺共价成键。因为PEG化反应是在pH 6.0条件下进行的，PEG衍生物与hGM-CSF的结合更易于选择N-末端。图7显示了缀合物溶液的SEC-HPLC色谱图。PEG化反应产生了63％ 1-mer(一个PEG被结合至hGM-CSF或单PEG化)和20％ 2-mer(双缀合物或两个PEG被结合至hGM-CSF)类型。应用Q Sepharose高效柱和Tris缓冲液的阴离子-交换色谱法也用于纯化缀合物。缀合物种类的分离情况类似于图2中所示。

[0198]应用此种相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG-ButyrALD可以制备另外的缀合物。

实施例6

40kDa分支mPEG2-丁醛衍生物与hGM-CSF的PEG化

分支mPEG-丁醛衍生物，40kDa(“mPEG2-ButyrALD”)

[0199]将氩气保护下储存于-20℃的40kDa mPEG2-ButyrALD加温至室温。将三十倍过量(相对于在已测量等分的hGM-CSF贮存溶液中hGM-CSF的量)的已加温mPEG2-ButyrALD溶解于Milli-Q水中，形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速地加至等分的hGM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于磷酸钠缓冲液中，pH 7.0)并充分混合。在加入mPEG2-ButryALD后，检测反应混合物的pH，并利用常规的技术调节至6.0，然后搅拌30分钟。然后，加入还原剂、氰基硼氢化钠，来制备9mM NaCNBH₃。将反应溶液放置慢速实验室振荡器上过夜以利于室温下缀合。用Tris缓冲液终止反应。所得缀合物溶液的特征如下所述。

[0200]mPEG2-ButryALD的醛基基团可与hGM-CSF相关的伯胺反应，并且经还原剂如氰基硼氢化钠还原通过仲胺与所述伯胺共价成键。因为PEG化反应是在pH 6.0条件下进行的，PEG衍生物与hGM-CSF的结合更易于选择N-末端。图8显示了缀合物溶液的SEC-HPLC色谱图。PEG化反应产生了65％ 1-mer(一个PEG被结合至hGM-CSF或单PEG化)和10％ 2-mer(双缀合物或两个PEG被结合至hGM-CSF)类型。应用Q Spepharose高效柱和Tris缓冲液的阴离子-交换色谱法也用于纯化缀合物。所得缀合物种类的分离情况类似于图2中所示。

[0201]应用此种相同的方法，利用具有其它重均分子量的mPEG2-ButyrALD可以制备另外的缀合物。

实施例7

hGM-CSF与mPEG-SBA的PEG化

[0202]可以自Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)获得分子量为20,000道尔顿的mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯。聚合物试剂的基本结构表示如下：

[0203]将GM-CSF溶于去离子水中，加入三乙胺以将pH升高至7.2-9。然后，在这种溶液中，加入1.5至10倍摩尔过量的mPEG-SBA。室温下搅拌得到的混合物数小时。

[0204]用SDS-PAGE分析反应混合物以确定蛋白质的PEG化程度。

实施例8

20K mPEG-MAL与被嵌入半胱氨酸的hGM-CSF的缀合

mPEG-MAL，20K

[0205]根据WO 90/12874中描述的工艺，用一个或多个半胱氨酸残基嵌入GM-CSF。

[0206]将氩气保护下储存于-20℃的20K mPEG-MAL加温至室温。将五至二十倍过量的已加温20K mPEG-MAL溶解于去离子水中，以制备10％mPEG MAL溶液。将mPEG MAL溶液迅速地加至等分的GM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于50mM HEPES中，pH 7.0)并充分混合。在室温反应1小时后，将反应瓶转移至冷室，并且在Rotomix(低速，Thermolyne)上于4℃下使反应过夜进行。

[0207]应用凝胶过滤色谱法纯化缀合物的混合物。开发尺寸排除色谱方法来分析反应的混合物，以及最终的产物。SDS-PAGE分析也可被用于表征样品。

实施例9

30K mPEG-MAL与GM-CSF的缀合

mPEG-MAL，30K

[0208]根据WO 90/12874中描述的工艺，用一个或多个半胱氨酸残基嵌入GM-CSF。

[0209]将氩气保护下储存于-20℃的30K mPEG-MAL加温至室温。将五至二十倍过量的已加温30K mPEG-MAL溶解于去离子水中，以制备10％mPEG MAL溶液。将mPEG MAL溶液迅速地加至等分的GM-CSF贮存溶液(1mg/mL溶于50mM HEPES中，pH 7.0)并充分混合。在室温反应1小时后，将反应瓶转移至冷室，并且在Rotomix(低速，Thermolyne)上4℃下使反应过夜进行。

[0210]应用凝胶过滤色谱法纯化缀合物的混合物。开发尺寸排除色谱方法来分析反应混合物，以及最终的产物。SDS-PAGE分析也被用于表征样品。

实施例10

典型(GM-CSF)-PEG缀合物的体外活性

[0211]测定实施例1-6中描述的缀合物的体外活性。所有被检验的缀合物都有生物活性。

实施例11-19

[0212]重复实施例1-9的每一个，只是用SEQ ID NO：1 GM-CSF代替了SEQ ID NO：2的GM-CSF部分。

实施例20

缀合物的体外活性

[0213]测定实施例11-19中描述的缀合物的体外活性。所有被检验的缀合物都有生物活性。

序列表

SEQ ID NO：1

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV

EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD

CWEPVQE

SEQ ID NO：2

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EALRLLNLSR DTAAEMNETV

EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD

CWEPVQE

SEQ ID NO：3

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARLLLNLSR DTAAEMNETV

EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM

ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD

CWEPVQE

Claims

1.一种缀合物，其含有如下结构：

其中：

POLY是水溶性聚合物；

(a)为0或1；

X¹，当存在时，是含有一个或多个原子的间隔部分；

R¹是有机基团；

GM-CSF是GM-CSF部分。

2.权利要求1的缀合物，其含有如下结构：

其中：

(n)是数值为3至4000的整数；

X¹如上定义；

R¹为选自甲基、乙基、丙基和异丙基；并且

GM-CSF是人GM-CSF。

3.权利要求1的缀合物，其含有如下结构：

其中，(n)是数值为3至4000的整数，并且GM-CSF是人GM-CSF。

4.一种缀合物，其包括下列结构：

其中：

POLY为水溶性聚合物；

(d)是0或1；

X²，当存在时，为含有一个或多个原子的间隔部分；

(b)是数值为1至10的整数；

(c)是数值为1至10的整数；

R²，在任何情况下都独立地为H或有机基团；

R³，在任何情况下都独立地为H或有机基团；并且

GM-CSF为GM-CSF部分。

5.权利要求4的缀合物，其含有如下结构：

其中：

(n)是数值为3至4000的整数；

X²如上定义；

(b)为2至6；

(c)为2至6；

R²，在任何情况下都独立地为H或低级烷基；并且

GM-CSF为人GM-CSF。

6.权利要求5的缀合物，其含有如下结构：

其中，(n)是数值为3至4000的整数，并且GM-CSF是人GM-CSF。

7.权利要求4的缀合物，其含有如下结构：

其中：

每个(n)是数值为3至4000的整数；

X如上定义；

(b)为2至6；

(c)为2至6；

R²，在任何情况下都独立地为H或低级烷基；并且

GM-CSF为GM-CSF部分。

8.权利要求5的缀合物，其含有如下结构：

其中：

每个(n)独立地是数值为3至4000的整数；并且GM-CSF是人GM-CSF。

9.一种缀合物，其包括GM-CSF部分，所述的GM-CSF部分包含直接地或通过包含一个或多个原子的间隔部分共价地结合至分支水溶性聚合物的内部胺基。

10.权利要求9的缀合物，其中，所述的缀合物进一步包含直接地或通过含有一个或多个原子的间隔部分共价地结合至N-末端氨基酸残基的另外的分支水溶性聚合物。

11.权利要求9的缀合物，其中所述的分支水溶性聚合物缺少通过-OCH₂CONHCH₂CO-键结合至赖氨酸胺基的赖氨酸残基。

12.权利要求9的缀合物，其中所述的分支水溶性聚合物含有下结构：

其中，每个(n)独立地是数值为3至4000的整数。

13.权利要求1、4或9的缀合物，其中，所述各缀合物中的水溶性聚合物选自聚(烯化氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉和聚(丙烯酰吗啉)。

14.权利要求13的缀合物，其中各水溶性聚合物是聚(烯化氧)。

15.权利要求14的缀合物，其中各聚(烯化氧)是聚(乙二醇)。

16.权利要求15的缀合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用一种封端部分封端，所述的封端部分选自羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃氧基、取代的烯烃氧基、炔烃氧基、取代的炔烃氧基、芳基氧基和取代的芳基氧基。

17.权利要求15的缀合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用甲氧基封端。

18.权利要求1、4或9的缀合物，其中，所述的水溶性聚合物具有大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿范围的总重均分子量。

19.权利要求18的缀合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约6,000道尔顿至约100,000道尔顿范围的总重均分子量。

20.权利要求19的缀合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约15,000道尔顿至约85,000道尔顿范围的总重均分子量。

21.权利要求20的缀合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约20,000道尔顿至约85,000道尔顿范围的总重均分子量。

22.权利要求21的缀合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约20,000道尔顿至约60,000道尔顿范围的总重均分子量。

23.权利要求1或4的缀合物，其中，所述的水溶性聚合物是分支的。

24.权利要求1、4或9的缀合物，其中，所述的GM-CSF部分选自人GM-CSF，和任意前述的生物学活性片断、缺失变异体、取代变异体或添加变异体。

25.权利要求1、4或9的缀合物，其中，所述的GM-CSF部分是重组取得的。

26.权利要求1、4或9的缀合物，其中，至多三个水溶性聚合物被结合至GM-CSF部分。

27.权利要求1、4或9的缀合物是双PEG化的形式。

28.权利要求1、4或9的缀合物是单PEG化的形式。

29.权利要求1、4或9的缀合物。其中所述的GM-CSF部分是非糖基化的。

30.权利要求1、4或9的缀合物。其中所述的GM-CSF部分是糖基化的。

31.一种药物组合物，其含有：

(i)一种缀合物，其含有直接地或者通过包括一个或多个原子的间隔部分共价地结合至水溶性聚合物的GM-CSF，其中所述的水溶性聚合物具有大于5,000道尔顿的重均分子量；和

(ii)一种药学上可接受的赋形剂，

其中，所述组合物中的所述缀合物至少约85％具有被结合至人GM-CSF部分的1至2个聚合物。

32.权利要求31的组合物，其中，在所述各缀合物中的各所述水溶性聚合物选自聚(烯化氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉和聚(丙烯酰吗啉)。

33.权利要求32的组合物，其中，所述各水溶性聚合物为聚(烯化氧)。

34.权利要求33的组合物，其中，所述各聚(烯化氧)是聚(乙二醇)。

35.权利要求34的组合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用一种封端部分封端，所述的封端部分选自羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯烃氧基、取代的烯烃氧基、炔烃氧基、取代的炔烃氧基、芳基氧基和取代的芳基氧基。

36.权利要求34的组合物，其中，所述聚(乙二醇)在末端上用甲氧基封端。

37.权利要求34的组合物，其中，所述聚(乙二醇)具有大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿范围的总重均分子量。

38.权利要求37的组合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约6,000道尔顿至约100,000道尔顿范围的总重均分子量。

39.权利要求38的组合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约15,000道尔顿至约85,000道尔顿范围的总重均分子量。

40.权利要求39的组合物，其中，聚(乙二醇)具有约20,000道尔顿至约85,000道尔顿范围的总重均分子量。

41.权利要求40的组合物，其中，所述聚(乙二醇)具有约20,000道尔顿至约60,000道尔顿范围的总重均分子量。

42.权利要求41的组合物，其中，在所述各缀合物中的所述各水溶性聚合物是线型水溶性聚合物。

43.权利要求31的组合物，其中，在所述各缀合物中的所述各水溶性聚合物是分支的水溶性聚合物。

44.权利要求43的组合物，其中所述的分支水溶性聚合物缺少通过-OCH₂CONHCH₂CO-键结合至赖氨酸胺基的赖氨酸残基。

45.权利要求31的组合物，规定当所述水溶性聚合物是分支的水溶性聚合物时，所述的分支水溶性聚合物缺少用于影响分支的赖氨酸残基。

46.权利要求43的组合物，其中，所述的分支水溶性聚合物含有括下列结构：

其中，每个(n)独立地是数值为3至4000的整数。

47.权利要求31的组合物，其中，所述的人GM-CSF包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

48.权利要求31的组合物，其中，所述的人GM-CSF包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

49.权利要求31的组合物，其中，所述的人GM-CSF为重组取得的。

50.权利要求48的组合物，其中，所述的人GM-CSF是非糖基化的。

51.权利要求48的组合物，其中，所述的人GM-CSF是糖基化的。

52.一种药物组合物，其包括：(i)权利要求1、4或9的缀合物；和(ii)一种药学上可接受的赋形剂。

53.权利要求31或52的组合物，其中所述的组合物基本上不含白蛋白。

54.权利要求31或52的组合物，其中所述的组合物基本上不含无GM-CSF活性的蛋白质。

55.权利要求31或52的组合物，其中所述的组合物基本上不含非共价地结合的水溶性聚合物。

56.权利要求31或52的组合物，是冻干形式。

57.权利要求31或52的组合物，是液体形式。

58.权利要求31或52的组合物，其中所述组合物中的所述缀合物至少约90％具有一个或两个被结合至人GM-CSF的聚合物。

59.权利要求58的组合物，其中所述组合物中的所述缀合物至少约95％具有一个或两个被结合至人GM-CSF的聚合物。

60.一种用于对患者进行一种缀合物给药的方法，该方法包括对患者给予权利要求31或52的药物组合物的步骤。

61.权利要求60的方法，是以皮下注射方式实现的。

62.一种用于制备一种缀合物的方法，其包括，在缀合条件下使GM-CSF部分与聚合物试剂进行接触以得到权利要求1、4或9的缀合物。

63.权利要求62的方法，其中不实施保护和脱保护步骤。