JP2004524020A - 改良された成長ホルモン分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、成長ホルモン(ＧＨ)活性を示し、ＧＨポリペプチドに共有結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含むコンジュゲートに関し、該ポリペプチドのアミノ酸配列は第一非ポリペプチド部分への結合基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基が導入されている、少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されている点において、野生型ヒトＧＨのアミノ酸配列と異なっている。該第一非ポリペプチド部分は、例えばＰＥＧまたは糖部分などのポリマー分子である。本発明のコンジュゲートは治療における特別な使用が見出されている。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン(ＧＨ)活性を発揮する新規ポリペプチド分子、該ポリペプチド分子の製造手段および方法、該ポリペプチド分子を含む医薬組成物、および特に成長ホルモン不全により引き起こされる様々な異常の治療における該ポリペプチド分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン(hＧＨ)は、191個のアミノ酸残基を含み、約22kＤaの分子量を有する単鎖ポリペプチドホルモンである。hＧＨはグリコシル化されておらず、下垂体前葉の成長ホルモン産生細胞において合成される。
【０００３】
いくつかの明確な生物学的活性がhＧＨによるものであるとされており、それには線形成長(体形成)、組織成長(骨格および細胞成長)、泌乳、マクロファージ活性化における効果ならびにインスリン様および糖尿病誘発作用が含まれる[Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519-47, 1983、Edwards et al., Science 239 (4841 Pt1):769-71 (1988)、Thorner and Vance, J. Clin. Invest. 82(3): 745-7 (1988)]。さらに、hＧＨを用いた治療は、たんぱく質、炭水化物、脂質および鉱質代謝に影響を及ぼす。生物学的効果は、hＧＨと特異的細胞レセプター、例えばhＧＨレセプターとの相互作用から得られる。細胞膜上のhＧＨレセプターの活性化にはレセプターの二量化が必要である。
【０００４】
hＧＨ分子上の２つの異なる部位に結合したhＧＨレセプターの細胞外部分の２つのコピーとhＧＨ間の複合体のＸ線構造はde Vosら(Science 255, 1992, 306-312)により報告されている。他の多数のhＧＨ実験構造が文献中に報告されている。hＧＨ構造の詳細はWO 99/03887にあり、その内容は本明細書中に参照して組み込まれる。
【０００５】
多くの組換えhＧＨ(rhＧＨ)製品が市場にて入手可能であり、例えばフマトロープ(Humatrope)[イーライリリー]、ヌトロピン(Nutropin)およびプロトロピン(Protropin)[ジェネンテック]、ノルジトロピン(Norditropin)[ノボ・ノルディスク], ジェノトロピン(Genotropin)[ファルマシア・アップジョン]およびサイゼン(Saizen)またはセロスチム(Serostim)[セローノ(Serono)]が含まれる。rhＧＨは、小児の腎不全およびＧＨ不足に起因する低身長、ならびにターナー症候群の治療を含むＧＨ欠乏症の治療に用いられる。このたんぱく質の機能的インビボ半減期は短く、最大効果を得るためには毎日皮下注射しなければならない(MacGillivray et al., J. Clin, Endocrinol. Metab. 81: 1806-1809)。また、hＧＨはAIDS患者の悪液質治療の承認を受けており、他の疾患と関連のある悪液質の治療については研究中である。より長い循環半減期を持つＧＨ分子は、必要な投与回数を減少させ、付随する治療効果を有する、より最適な治療hＧＨレベルを提供する可能性がある。
【０００６】
WO 93/00109は、継続的な効果的血清ＧＨ濃度を３日またはそれ以上の日数維持することを含む哺乳動物または鳥類のＧＨ応答組織を刺激する方法に関する。このような血清濃度を達成する１つの方法は、ＰＥＧ(ポリエチレングリコール)等の高分子物質に結合されたＧＨの使用によると記載されている。高分子物質への結合は、半減期の上昇をもたらすと述べられている。
【０００７】
US 4,179,337は、生理学的に活性な非免疫原性、水可溶性ポリペプチドコンジュゲートを得るために、酵素およびホルモンをＰＥＧ化する方法を開示している。 ＧＨはＰＥＧ化されるホルモンの一例として言及されている。
【０００８】
Clarkら(1996, JBC 271, 36, 21969-21977)は、hＧＨをＰＥＧ-ＮＨＳと反応させることにより製造されるＰＥＧ化hＧＨを開示している。
【０００９】
EP 458064 A2は、ソマトトロピンに導入されたまたは天然に存在するシステイン残基のＰＥＧ化を開示している。さらにEP 458064 A2は、野生型ウシソマトトロピンの残基102〜112に位置していると述べられているオメガループと称するループ中への２つのシステイン残基の組み込みについて言及しており、より具体的にはEP 458064 A2は、ウシソマトトロピンの残基102および112(それぞれ、SerからCysおよびTyrからCys)の置換について開示している。
【００１０】
WO 9511987は、親分子に存在するかまたは部位特異的突然変異誘発により導入されたシステイン残基のチオ基へのＰＥＧの結合について示している。WO 9511987はプロテアーゼ(nexin-1)のＰＥＧ化に関するが、hＧＨおよび他のたんぱく質の一般的ＰＥＧ化も示唆している。
【００１１】
WO 99/03887は、例えば追加のシステイン残基の挿入および導入されたシステイン残基へのＰＥＧの結合により修飾された成長ホルモンを開示している。
【００１２】
WO 0042175は、ＰＥＧ結合のための、遊離のシステイン残基を含むタンパク質を製造する方法に関する。WO 0042175は、hＧＨの突然変異タンパク質: T3C, S144CおよびT148CならびにそのシステインＰＥＧ化を開示している。
【００１３】
WO 9711178(ならびにUS 5849535、US 6004931およびUS 6022711)は、hＧＨのアゴニストまたはアンタゴニストとしてのＧＨ変異体の使用に関する。またWO 9711178は、hＧＨのＰＥＧ化を開示しており、これにはリジンのＰＥＧ化およびリジンの導入または置換(K168AおよびK172R)が含まれている。さらに、WO 9711178は置換G120Kをも開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＧＨ活性を呈するポリペプチド分子ならびにその製造方法および医学的治療におけるその使用方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
１つの態様において本発明は、高分子物質への結合基を有し、野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置と等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置に導入されている、少なくとも１つの導入非システインアミノ酸残基を含む成長ホルモンポリペプチド変異体(ＧＨ変異体)のコンジュゲートであって、非システインアミノ酸残基と反応性の少なくとも１つの高分子物質をも含むコンジュゲートに関する。
【００１６】
さらに本発明は、ｈＧＨのヘリックス中の表面の曝露した位置に相当する位置にあって第一の高分子物質への結合基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、成長ホルモンポリペプチドのコンジュゲートであって、さらに少なくとも１つのアミノ酸残基に結合した第一の高分子物質を含むコンジュゲートに関する。
【００１７】
また本発明は、P2, I4, L6, S7, R8, D11, N12, L15, R16, H18, R19, Q22, F25, D26, Q29, E30, Y35, P37, Y42, L45, L52, E56, S57, P59, S62, N63, R64, E65, E66, Q68, Q69, K70, S71, E74, E88, Q91, F92, R94, S95, L101, Y103, D107, S108, N109, Y111, D112, K115, D116, E119, G120, Q122, T123, G126, R127, R134, Y143, D154, A155, L156, K158, N159, G161, K168, D171, T175, R178およびR183からなる群から選択されるhＧＨの位置と等価である親ＧＨの位置に相当する場所に導入された少なくとも１つの導入システイン残基を含む変異体ＧＨのコンジュゲートであって、さらに少なくとも１つの第一システイン反応性高分子物質を含むコンジュゲートに関する。
【００１８】
さらに別の態様において本発明は、(第一)高分子物質への結合基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基が野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置と等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置から除去された、好ましくは非システインアミノ酸残基が除去された成長ホルモンポリペプチド変異体(変異体ＧＨ)のコンジュゲートであって、さらに該ポリペプチドに存在するアミノ酸に結合した少なくとも１つの(第一)高分子物質であって除去されたアミノ酸に反応性の高分子物質を含むコンジュゲートに関する。
【００１９】
さらに別の態様において本発明は、hＧＨの表面に曝露した位置と等価な親ＧＨの位置に導入された少なくとも１つのインビボグリコシル化部位を含む変異体ＧＨのコンジュゲートであって、さらに少なくとも１つのインビボ結合オリゴサッカライド部分を含むコンジュゲートに関する。
【００２０】
さらに別の態様において本発明は、本発明のポリペプチド(例えばＧＨ変異体)をコードしているヌクレオチド配列、発現ベクターおよび宿主細胞を含む本発明のＧＨ分子、特に本発明のコンジュゲートの製造手段および製造法に関する。
【００２１】
さらに本発明は、本発明のＧＨ分子を所望により薬学的に許容し得る希釈剤、担体またはアジュバントと共に含む医薬組成物に関する。さらに別の態様において本発明は、本発明の医薬組成物の使用および該組成物を用いて哺乳動物を治療する方法に関する。特に、本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは組成物を用いてＧＨ不全またはＧＨ欠乏に起因する疾患または病態を治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
定義
本明細書および請求の範囲では、次の定義が採用される:
「コンジュゲート」(または「コンジュゲート化ポリペプチド」と交換可能)という用語は、１またはそれ以上の高分子物質の、ポリペプチドへの共有結合(インビボグリコシル化を含む)により形成される異質(複合体またはキメラという意味において)分子を指すことを意図している。「共有結合」という用語は、ポリペプチドと高分子物質が、共有結合により互いに直接結合していること、または１もしくはそれ以上の架橋、スペーサーもしくは連結部分などの介在部分を介して共通結合により互いに間接的に結合していることのどちらかを意味する。コンジュゲートは適切な濃度および条件で可溶性、すなわち血液などの生理学的液体中で可溶性であるのが好ましい。本発明のコンジュゲート化ポリペプチドの例には、グリコシル化ポリペプチドおよびＰＥＧ化ポリペプチドならびにＰＥＧが糖部分に結合したグリコシル化ポリペプチドが含まれる。
【００２３】
「非コンジュゲート化ポリペプチド」という用語はコンジュゲートのポリペプチド部分(例えばＧＨ変異体)について用いることができる。
【００２４】
本明細書中、「アミノ酸残基に反応性の高分子物質を含むコンジュゲート」という表現または同様の表現の文脈において用いられる「〜に反応性」という用語は、高分子物質がアミノ酸に結合することを意味する。同様に、「高分子物質への結合基を有するアミノ酸の除去」という文脈における「反応性」という用語は、除去されたアミノ酸が存在した時には高分子物質と反応し得たであろうこと、すなわちその残基がコンジュゲートのポリペプチド部分に存在したなら高分子物質がアミノ酸残基の結合基に結合し得たであろうことを意味する。
【００２５】
「高分子物質」という用語は、本発明に従いポリペプチドＧＨ(ＧＨ変異体を含む)の結合基にコンジュゲート化し得る分子を示すことを意図している。高分子物質は通常、非ペプチド部分であり、すなわちペプチド結合によって互いに連結されているアミノ酸モノマーからなるペプチドポリマーとは異なる分子である。本発明において用いられる高分子物質の好ましい例には、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシド部分、オリゴサッカライド部分、親油性基、例えば脂肪酸およびセラミドが含まれる。
【００２６】
「ポリマー分子」という用語は、２つまたはそれ以上のモノマーの共有連結により形成される分子として定義され、「ポリマー基」と交換可能に使用することができる。コンジュゲート中の高分子物質の数が明示されている場合を除き、本明細書中、「高分子物質」への言及はいずれも、１またはそれ以上の該物質への言及を意図するものである。
【００２７】
「オリゴサッカライド部分」の用語は、１またはそれ以上のモノサッカライド残基を含み、インビボまたはインビトログリコシル化によりポリペプチドに結合(グリコシル化ポリペプチドの形態のポリペプチドコンジュゲートを生産する目的で)可能な炭水化物含有分子を示すことを意図するものである。
【００２８】
「インビボグリコシル化」の用語は、インビボ、すなわちポリペプチドを発現するグリコシル化細胞内での翻訳後プロセッシング時に、例えばＮ−連結またはＯ−連結グリコシル化により生じる、オリゴサッカライド部分のあらゆる結合を意味することを意図するものである。正確なオリゴサッカライド構造は用いられるグリコシル化生物に大きく依存する。
【００２９】
「インビトログリコシル化」は、インビトロで行われる合成グリコシル化を表すことを意図するものであり、これには、通常、所望により架橋剤を用いて、オリゴサッカライド部分をポリペプチドの結合基に共有連結することが含まれる。インビボおよびインビトログリコシル化はさらに以下で詳細に議論する。
【００３０】
「Ｎ−グリコシル化部位」は、配列：Ｎ-Ｘ'-Ｓ/Ｔ/Ｃ-Ｘ”(ここにＸ'はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｘ”はＸ'と同一であってもなくてもよいが、好ましくはプロリンとは異なる任意のアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギンであり、Ｓ/Ｔ/Ｃはセリン、スレオニンまたはシステインのいずれかであり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最も好ましくはスレオニンである)を有する。「Ｏ−グリコシル化部位」は、セリンまたはスレオニン残基のＯＨ基である。
【００３１】
「結合基（attachment group)」という用語は、ポリマー分子、親油性分子または有機誘導体化剤などの高分子物質を結合し得るポリペプチド、特にそのアミノ酸残基またはオリゴサッカライド部分の官能基を示すことを意図するものである。有用な結合基およびその適合高分子物質は以下の表から明らかである。
【００３２】
【表１】
Figure 2004524020
【００３３】
インビボＮ−グリコシル化に関しては、「結合基」なる用語を、慣習にとらわれず、Ｎ−グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基を指すために用いる。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン残基はグリコシル化中にオリゴサッカライド部分が結合される位置であるが、Ｎ−グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しないならこのような結合は成し遂げられない。
【００３４】
従って、高分子物質がオリゴサッカライド部分であって、Ｎ−グリコシル化によりコンジュゲート化が成し遂げられる場合、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変との関連において用いられる「高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基」の用語は、機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列に導入されるようにＮ−グリコシル化部位を構成する１またはそれ以上のアミノ酸残基が改変されることを意味すると理解すべきである。
【００３５】
「Ｏ−グリコシル化部位」のための結合基はセリンまたはスレオニン残基のＯＨ基であり、その観点から非ポリペプチド部分はＯ−連結糖部分である。
【００３６】
一般的に、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基が導入された本発明のコンジュゲートにとって、導入されたアミノ酸に高分子物質が結合していることが好ましい。さらに具体的には、高分子物質への結合部位として本明細書で特に示される位置について、本発明のコンジュゲートは少なくとも、そのような位置の１つに結合した高分子物質を含むと一般的に理解される。
【００３７】
「モノＰＥＧ化された」の用語は、ＧＨポリペプチドがそれに共有結合したポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む唯一のポリマーを有することを意味する。即ち「モノＰＥＧ化された」とは、ポリペプチドが、該ポリペプチドの特定の部位に共有結合した１個のＰＥＧ分子により修飾されていることを意味する。モノＰＥＧ化が意味するところとして、そのコンジュゲートは均一(例えばポリペプチドがある位置でモノＰＥＧ化されている)であるかもしれないし、または不均一(例えば各ポリペプチドの１つのリジン残基がモノＰＥＧ化されている、例えば一部のポリペプチドはある位置でモノＰＥＧ化されており他のポリペプチドは異なる位置でモノＰＥＧ化されている）かもしれない。
【００３８】
アミノ酸名および元素名(例えば、CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、Cなど)はProtein DataBank(PDB)(www.pdb.org)の定義に従って使用しており、これは、IUPAC命名法(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(残基名、元素名など), Eur.J.Biochem.，138，9-37 (1984)に基づきEur.J.Biochem., 152，1 (1985)にて修正されたものである。「アミノ酸残基」という用語は、以下の群に含まれるアミノ酸残基を示すことを意図している：アラニン(AlaまたはA)、システイン(CysまたはC)、アスパラギン酸(AspまたはD)、グルタミン酸(GluまたはE)、フェニルアラニン(PheまたはF)、グリシン(GlyまたはG)、ヒスチジン(HisまたはH)、イソロイシン(IleまたはI)、リジン(LysまたはK)、ロイシン(LeuまたはL)、メチオニン(MetまたはM)、アスパラギン(AsnまたはN)、プロリン(ProまたはP)、グルタミン(GlnまたはQ)、アルギニン(ArgまたはR)、セリン(SerまたはS)、スレオニン(ThrまたはT)、バリン(ValまたはV)、トリプトファン(TrpまたはW)、およびチロシン(TyrまたはY)残基。アミノ酸の位置/置換を同定するために使用される用語は次の通りである：あるアミノ酸配列においてT3とは、スレオニン残基が３位を占めていることを示している。T3Cは、３位のスレオニン残基がシステイン残基と置換されていることを示している。本明細書中、アミノ酸残基への番号付与は配列番号２に示されるアミノ酸配列との関連でなされている。多数の置換は「+」によって示され、例えばT3N+P5S/Tは、３位のスレオニン残基がアルギニン残基と置換され、かつ５位のプロリン残基がセリンまたはスレオニン残基と置換されているアミノ酸配列を意味している。
【００３９】
「ヌクレオチド配列」の用語は、２つまたはそれ以上のヌクレオチド分子の連続した繋がりを示すことを意図している。ヌクレオチド配列はゲノム、cＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成起源、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。
【００４０】
通常、「ポリメラ−ゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」の用語は、例えばUS 4,683,195に記載のごとく、インビトロで所望のヌクレオチド配列を増幅させる方法を示す。一般に、ＰＣＲ法には鋳型核酸に優先的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプライマーを用いたプライマー伸張合成のサイクルの繰り返しが含まれる。「細胞」、「宿主細胞」、「セルライン」および「細胞培養物」は本明細書では交換可能に用いられ、これらはすべて、細胞の発育または培養から生じる子孫を包含するものと理解すべきである。
【００４１】
「形質転換」および「トランスフェクション」は交換可能に用いられ、ＤＮＡを細胞に導入するプロセスを意味する。「機能的に結合」とは、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が、酵素結合によって、あるいはその配列の通常の機能を実行可能であるよう互いに関連した配置で、共有結合的に連結されていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列は、それらがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのヌクレオチド配列と機能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサーは、それらがコードしている配列の転写に影響する場合には、該配列と機能的に結合しており；リボソーム結合部位は、それがコード配列の翻訳を促進するように配置されている場合には、該配列と機能的に結合している。
【００４２】
「導入」という用語は、存在するアミノ酸残基の置換を主に意味するが、付加的なアミノ酸残基の挿入をも意味し得る。従って、このような文脈での「挿入」という用語は特に、親たんぱく質のものと比較して(例えばhＧＨの相当する配置(群)と比較して)２つのアミノ酸残基の間に、あるアミノ酸残基が導入されることを意味する。
【００４３】
「除去」という用語は、別のアミノ酸残基により、除去しようとするアミノ酸残基を置換することを主に意図するが、除去アミノ酸残基の欠失(置換を除く)をも意味し得る。例えば「少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されたＧＨポリペプチド変異体のコンジュゲート」という表現の文脈における「欠落」または「除去」という用語は、変異体ＧＨにおいて少なくとも１つのアミノ酸残基(例えば、非システイン残基またはシステイン)が親ＧＨのものと比べて(例えば配列番号２のｈＧＨと比較して)除去されていることを意味する。他の表現では、これは親ＧＨの等価な位置に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基が変異体ＧＨには存在しない(例えば、欠失または異なる型のアミノ酸残基での置換による)ことを意味する。
【００４４】
変異体ＧＨおよび親ＧＨに関して本明細書中で用いられる「導入」(「挿入」または「置換」を含む)および「除去」(「欠失」または「置換」)という用語は、親ＧＨのアミノ酸配列との比較における、特に配列番号２に示すhＧＨのアミノ酸配列との比較における本発明のＧＨ変異体のアミノ酸配列の差異を意味すると理解されている。ゆえに、好ましくはこれらの用語は、いかに変異体が得られるか、すなわちhＧＨの突然変異により作成されるか、別の親ＧＨ分子から作成されるかまたは他の任意の方法により作成されるかについていかなる限定も示すことを意図していない。
【００４５】
「アミノ酸残基はhＧＨヘリックス中の表面に曝露した位置と等価な位置にある」という表現は、そのアミノ酸残基がhＧＨへリックス中にあって同時にhＧＨの表面に曝露された位置にあることを意味し；本明細書の文脈では、これは、「アミノ酸残基はhＧＨの表面に曝露したヘリックス中の位置と等価な位置にある」または「アミノ酸残基はhＧＨの表面に曝露した位置と等価な位置に存在し、hＧＨのヘリックス中に存在する」とも表現することができる。
【００４６】
「機能的インビボ半減期」という用語は、通常の意味で用いており、即ち分子の生物学的活性の５０％が体内/標的器官に依然として存在している時間、またはポリペプチドもしくはコンジュゲートの活性が初期値の５０％になる時間である。
【００４７】
「血清半減期」なる用語は通常の意味で用いており、即ちポリペプチドまたはコンジュゲート分子の５０％が消失前に血漿または血流中に循環する時間である。血清半減期の別の用語には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」などがある。血清半減期の測定は、機能的インビボ半減期の測定より簡単であることが多く、血清半減期の大きさは通常、機能的インビボ半減期の大きさを良く示す。
【００４８】
機能的インビボ半減期および血清半減期は、後述の方法の部でさらに議論するように当分野で既知の適当な方法のいずれかにより測定することができる。機能的インビボ半減期または血清半減期について使用している「増大」という用語は、分子の関連する半減期が、対照分子の半減期に対して、統計的に有意に増大していることを示すために用いている。
【００４９】
「対照（参照）分子」は通常、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有していない組換えhＧＨ(例えばＥ.coliまたはＣＨＯ細胞において製造される)またはあらゆる他の市場で入手可能なhＧＨ製品、例えば上記の発明の背景の部に掲げたあらゆる製品(同等の条件下で測定される)である。
【００５０】
本発明のコンジュゲートに関連したクリアランス機構には、細網内皮系(RES)、腎、脾または肝臓、受容体介在性排除、あるいは特異的または非特異的タンパク質分解のうちの１またはそれ以上の作用が含まれるであろう。「腎クリアランス」の用語は通常の意味で用いられ、腎臓により行われるあらゆるクリアランス、例えば糸球体ろ過、尿細管排泄、尿細管除去を示す。通常、腎クリアランスは、分子量、サイズ(糸球体ろ過のカットオフと比較して)、対称性、形/堅さ、帯電性を含むコンジュゲートの物理的性質に依存する。通常、約67kＤaという見かけの分子量は、腎クリアランスに対してカットオフ値であると考えられる。腎クリアランスは任意の適当なアッセイ、例えば確立されたインビボアッセイにより測定することができる。例えば、ラベル化(放射性ラベルまたは蛍光ラベル化)ポリペプチドコンジュゲートを患者に投与し、患者から回収した尿中のラベル活性を測定することにより腎クリアランスを測定する。腎クリアランスの低下は、対照分子との比較において測定する。好ましくは、本発明のコンジュゲートは、同等の条件下で測定した対照分子との比較において腎クリアランスを少なくとも５０％、好ましくは少なくとも75％、そして最も好ましくは少なくとも90%低下させた。
【００５１】
「免疫原性」の用語は、免疫系から応答を誘導する物質の能力、特にある分子を投与した患者において抗体生成を上昇させる該分子の能力および/または分子に対して生成した抗体と反応する能力を示すことが意図されている。免疫応答は、細胞または抗体介在性応答であってよい(免疫原性の別の定義に関しては、例えばRoitt: Essential Immunology(第8版, Blackwell)を参照のこと)。免疫原性は当分野で既知の適当な方法のいずれかを使用して、例えばインビボまたはインビトロで測定することができる。
【００５２】
「ＧＨ活性を示す」の用語は、ポリペプチドがhＧＨの生物学的性質(ＧＨレセプターに結合する能力、プロラクチンレセプターに結合する能力および該レセプターの二量体化を引き起こす能力を含むが限定はされない)のうち少なくとも１つを有することを示すことを意図している。好ましくは、本発明のコンジュゲートはhＧＨの活性に定性的に匹敵するインビボまたはインビトロ活性を有する。さらに本発明のコンジュゲートの特異的活性は、対照分子の活性と同レベルまたはより高いのが望ましい。ＧＨ活性は、後述の方法の部に記載されている方法を含む当分野で既知の方法に従い測定することができる。
【００５３】
本明細書中で使用する「治療」の用語には病気の予防も含まれ、「病気」には場合により「障害（異常）」も含まれる。
【００５４】
「親」の用語は、本発明に従い修飾しようとするＧＨポリペプチドについて使用する。親ポリペプチドはいかなる起源であってもよいが、哺乳動物のＧＨが好ましい。親ＧＨは野生型哺乳動物ＧＨ(例えば、げっ歯類、霊長類または家畜由来)またはその変異体であってもよい。
【００５５】
「変異株」はＧＨ活性を示すポリペプチドであって、１またはそれ以上のアミノ酸残基が親ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するものであり、通常は１５までのアミノ酸残基、好ましくは最大１０、例えば最大５アミノ酸残基が配列番号２と異なる。従って、本発明のＧＨポリペプチドのアミノ酸配列は例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基が親ポリペプチドと異なっていてよい。好ましい態様において、本発明のポリペプチドは少なくとも１つのアミノ酸残基が配列番号２と異なるアミノ酸配列を有する。
【００５６】
好ましくは、親ＧＨはヒト由来であり、特にhＧＨまたはその変異体である。 成熟hＧＨのアミノ酸配列を配列番号２に示す。変異体hＧＨの１例は、挿入されたＮ末端メチオニンを有する配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである。
【００５７】
特異的突然変異/位置との関連で用いる「と異なる」または「を含む/を有する」の用語は、特定のアミノ酸差異とは別に存在する付加的な差異を許容することを意図している。例えば、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基の除去および/または導入に加えて、本発明のＧＨポリペプチドは、高分子物質への結合基を有するそのようなアミノ酸残基の導入および/または除去に関連しない他の置換を含んでいてよい。
【００５８】
本明細書中で使用する配列の番号付与は、通常、配列番号２に示す成熟hＧＨのアミノ酸配列に従う。
【００５９】
ＧＨ分子という用語は、ＧＨ活性を有するあらゆる分子、典型的には本発明のＧＨポリペプチドコンジュゲートまたはグリコシル化ＧＨポリペプチドを示すことを意図している。
【００６０】
ＧＨ変異体は本発明に従い修飾されたポリペプチドである(高分子物質への結合基の導入および/または除去による)。
【００６１】
アミノ酸置換について用いる「保存的」の用語は、その通常の意味を有することを意図している。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(例えばアルギニン、リジンおよびヒスチジン)、酸性アミノ酸(例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸、極性アミノ酸(例えばグルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えば、ロイシン、イソロイシンおよびバリン)、芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン)および小アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン)から成る群の中にある。特異的活性を通常は改変しないアミノ酸置換が当分野で知られており例えば、H. Neurath and R.L. Hill(1979, In, The Proteins, Academic Press, New York)により開示されている。最も普通に生じる交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/GluおよびAsp/Glyならびにこれらの逆である。
【００６２】
[配列表]:
配列番号:１ hＧＨの完全アミノ酸配列の開示(DeNoto et al., Nucleic. Acids. Res. 9:3719-3730(1981):
MATGSRTSLL LAFGLLCLPW LQEGSAFPTI PLSRLFDNAM LRAHRLHQLA
FDTYQEFEEA YIPKEQKYSF LQNPQTSLCF SESIPTPSNR EETQQKSNLE
LLRISLLLIQ SWLEPVQFLR SVFANSLVYG ASDSNVYDLL KDLEEGIQTL
MGRLEDGSPR TGQIFKQTYS KFDTNSHNDD ALLKNYGLLY CFRKDMDKVE
TFLRIVQCRS VEGSCGF
配列番号: 2 hＧＨの成熟アミノ酸配列の開示:
FPTIPLSRLF DNAMLRAHRL HQLAFDTYQE FEEAYIPKEQ KYSFLQNPQT
SLCFSESIPT PSNREETQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QFLRSVFANS
LVYGASDSNV YDLLKDLEEG IQTLMGRLED GSPRTGQIFK QTYSKFDTNS
HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV QCRSVEGSCG F
配列番号: 3 hＧＨのコード配列の開示
【００６３】
[本発明のコンジュゲート]:
１つの態様において本発明は、高分子物質への結合基を有する少なくとも１つの非システインアミノ酸残基の導入または除去により親成長ホルモンのアミノ酸配列(好ましくは配列番号２)と異なるアミノ酸配列を含む、成長ホルモンポリペプチド変異体(ＧＨ変異体)のコンジュゲートであって、該残基は野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置と等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置に導入またはそのような位置から除去されており、非システインアミノ酸残基と反応性の少なくとも１つの高分子物質を含むコンジュゲートに関する。
【００６４】
非システインアミノ酸残基の除去は、本発明のポリペプチドのコンジュゲート化部位の変調を意図するものである。例えば、ポリペプチドがＰＥＧ化される量を減少させるおよび/またはその位置を制御するためにリジンのＰＥＧ化に利用可能な特異的部位を除去するのが好ましいであろう。この文脈において、「非システインアミノ酸残基と反応性の少なくとも１つの高分子物質をも含むコンジュゲート」の表現は、ポリペプチドが別の位置で、高分子物質に反応性である、すなわちコンジュゲート化される少なくとも１つの非システインアミノ酸残基を含むことを意味する。
【００６５】
高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基を除去および/または導入することにより、選択した非ポリペプチド部分に分子がよりコンジュゲート化しやすいように、ポリペプチドを特異的に適応させ、コンジュゲート化パターンを最適化することができる(例えば、ＧＨポリペプチド表面上の非ポリペプチド部分の最適分布を確保し、それにより、例えばその機能を著しく損なうことなくポリペプチドのエピトープおよび他の表面部分を有効に遮断する)。こうしたコンジュゲート化が例えば、ポリペプチドの機能部位にまたは該部位の近くに位置するアミノ酸残基に不都合である場合(こうした部位でのコンジュゲート化は、受容体認識が損なわれるため、得られたコンジュゲートの不活性化または活性の低下を生じる可能性があるため)、１以上の結合基の除去によりポリペプチドの一部における非ポリペプチド部分へのコンジュゲート化を避けることが可能である。さらに、別の結合基の近くに位置する結合基は、こうした基への不均一なコンジュゲート化を避けるため、除去することが好都合であるかもしれない。
【００６６】
従って、本発明は、高分子物質への結合基を有し、野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置と等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置に導入されている、少なくとも１つの導入非システインアミノ酸残基を含む成長ホルモンポリペプチド変異体(ＧＨ変異体)のコンジュゲートであって、非システインアミノ酸残基と反応性の少なくとも１つの高分子物質をも含むコンジュゲートに関する。
【００６７】
非システインアミノ酸残基は、高分子物質への結合基を有する、システインとは異なる任意のアミノ酸残基である。この例は上記の定義の部で表中に示している。
【００６８】
例として、高分子物質が、例えばポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシド由来分子などのポリマー分子またはインビトロで結合したオリゴサッカライド部分である場合、非システインアミノ酸残基は、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアルギニンからなる群より選択することができる。高分子物質がオリゴサッカライド部分である場合、結合基は、例えばインビボグリコシル化部位、好ましくはＮ−グリコシル化部位である。
【００６９】
高分子物質への結合基を、本発明に従い、ＧＨポリペプチドに導入または該ポリペプチドから除去しようとする場合は、修飾されるポリペプチドの位置を、都合よくは、以下のように選択する。
【００７０】
好ましくは、その位置はhＧＨの表面に存在する位置と等価であり、より好ましくは２５％を越える側鎖が溶媒に曝露される、さらに好ましくは、５０％を越える側鎖が溶媒に曝露されるアミノ酸残基に占められる。表面に曝露した位置は、hＧＨ単独またはその２つのレセプター分子との複合体におけるhＧＨの三次元構造の分析により測定することができる。そのような構造から測定された表面曝露位置を後述の実施例１に記載する。また２５％を越えるまたは５０％を越える側鎖が表面に曝露しているアミノ酸残基を開示している。
【００７１】
さらに、本明細書中で開示する、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基、例えば非システインアミノ酸残基またはシステインを、実施例１で明確にしたhＧＨのレセプター結合部位の外に存在する位置と等価の位置に導入、少なくともレセプター結合部位１の中でない位置に導入するのが好ましく、またhＧＨアゴニスト活性を有する本発明のコンジュゲートにとってはレセプター結合部位２の外に存在する位置と等価な位置に導入するのが好ましい。この文脈において、高分子物質と反応性の導入されたアミノ酸残基は、存在するなら、高分子物質に結合するであろうことが理解される。
【００７２】
さらに別の態様において、本明細書中で開示するように高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基、例えば非システインアミノ酸残基をhＧＨのヘリックス中に存在する位置と等価の位置に導入するのが好ましい。特に、アミノ酸残基をｈＧＨのヘリックス中の表面に曝露した位置、好ましくはＡ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択したヘリックスの表面に曝露した位置に導入することができる。例えば、hＧＨ単独のモデル構造においてまたは２つのレセプター分子に複合体化したhＧＨのモデル構造において、好ましい該位置は、２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨの位置と等価であり；このような位置は実施例１に開示している。好ましい態様において、ヘリックス中の位置はhＧＨのレセプター結合部位の外部に存在する位置に等価である(具体的位置の例については実施例１を参照)。
【００７３】
「等価な位置」は、配列番号２に示したアミノ酸残基における位置に相同である(すなわち一次または三次構造のどちらかにおける位置において対応している)、既知の親ＧＨのアミノ酸配列における位置を示すことを意図している。「等価な位置」は、開示されたアラインメントから、またはＧＨ配列ファミリーの構成員のアラインメントを基に、例えばデフォルト・パラメーターを用いるプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷバージョン1.74(Thompson et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680)を用いて測定するのが都合よい。結合基の最適分布を決定するため、ポリペプチドの表面に位置するアミノ酸残基間の距離を、ポリペプチドの３Ｄ構造に基づき計算する。より具体的には、こうした結合基を有するアミノ酸残基のＣＢ間の距離、または結合基を有する一方のアミノ酸残基の官能基(リジンではＮＺ、アスパラギン酸ではＣＧ、グルタミン酸ではＣＤ、システインではＳＧ)および他方のアミノ酸残基のＣＢの間の距離を決定する。グリシンの場合、ＣＢの代わりにＣＡが用いられる。本発明のコンジュゲートのＧＨポリペプチド(例えばＧＨ変異体)において、前記距離のいずれも、不均一なコンジュゲート化を避けるため、または減少させるため、好ましくは８オングストロームより大きく、特に１０オングストロームより大きい。
【００７４】
別の態様において本発明は、ｈＧＨのヘリックス中の表面に曝露した位置と等価な位置にあって(第一)高分子物質への結合基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む成長ホルモンポリペプチドのコンジュゲートであって、さらに少なくとも１つのアミノ酸残基に結合した高分子物質を含むコンジュゲートに関する。好ましくは、該位置はヘリックスの最初の３つまたは最後３つのアミノ酸残基に等価な位置には存在しない。さらに別の態様において、該位置はヘリックスの最初の４つまたは最後４つのアミノ酸残基に等価な位置に存在しない。好ましい態様におけるこの限定は、高分子物質をこれらの位置に結合させようとする場合のみに及ぶことを意図していると理解される。ゆえに、高分子物質の結合に関与しない親ＧＨの他の型の修飾は、ＧＨ変異体においてｈＧＨのヘリックスに対応するヘリックスの最初３つまたは最後３つのアミノ酸残基に存在するかもしれない。
【００７５】
hＧＨのヘリックス(好ましくはＡ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択される)に存在する、特に本明細書中で開示されるhＧＨの表面に存在する位置に等価な位置は、例えばhＧＨ単独または２つのレセプター分子(「Ｂ」および「Ｃ」)との複合体におけるhＧＨの三次元構造の分析により、例えばVosら(science (1992) 255, 306-312)が開示しているように決定することができる。１つの態様において、hＧＨにおけるヘリックスの位置は以下の通り、次表中に示される：
【００７６】
【表２】
Figure 2004524020
【００７７】
１つの態様において、本発明のコンジュゲート中のアミノ酸残基(すなわち高分子物質への結合基を有する)は、12-31、75-89、109-125および158-181(配列番号２)からなる群から選択されるhＧＨ中の位置に等価な位置に存在し、例えばN12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、E88、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、K158、N159、G161、K168、D171、T175およびR178からなる群から選択され、好ましくはE30、E88、N109、Y111、D112、K115、Q122、K158、N159およびG161からなる群から選択される。特定の態様において、このアミノ酸残基は非システインアミノ酸残基であり、例えばLys、Asp、Glu、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Gln、ArgおよびHisからなる群から選択される。さらに、高分子物質への結合基を有するこのアミノ酸残基が、本明細書中で開示されるhＧＨのヘリックスにおける位置、すなわち特にｈＧＨのヘリックスの表面に曝露した位置、例えば上記の位置に等価な位置に導入されている、本発明の態様が意図されている。他の特定の態様において、この導入されたアミノ酸残基は、さらに本明細書中で開示されるようにCysである。
【００７８】
さらに別の態様において、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基であってｈＧＨのヘリックスにおける表面曝露位置に等価な位置にあるアミノ酸残基は、ヘリックスＣには存在しないか、または少なくともhＧＨのレセプター結合部位の外部にある位置に等価な位置にのみ存在するかまたは少なくともレセプター結合部位に等価な位置には存在せず、例えば少なくともG120の位置には存在しない。ゆえに、１つの態様において、アミノ酸残基はＡ、ＢまたはＤからなる群から選択されるヘリックスに存在する。
【００７９】
特に好ましい態様において、高分子物質への結合基を有する、導入されたアミノ酸残基は、ヘリックスＢの表面曝露位置、好ましくはE74、E88、Q91およびF92からなる群から選択される位置に等価な位置に存在する。特に好ましい位置は、E88またはQ91であり、例えばE88C、E88K、Q91CまたはQ91Kである。
【００８０】
従って、１つの態様において、高分子物質への結合基を有する導入されたアミノ酸残基は、E74に等価な位置に存在し、例えばE74Cである。別の態様において、導入された、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基はE91に等価な位置に存在し、例えばE91Cである。
【００８１】
１つの態様において、本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分は、100〜111(配列番号２)から選択されたhＧＨ中の位置に等価な位置にCys残基を有していない。
【００８２】
さらに、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基、例えば非システインアミノ酸残基を置換により親ＧＨに導入しようとするとき、置換すべきアミノ酸残基は、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基により保存的に置換され得るアミノ酸残基であってよい。
【００８３】
上記のように、高分子物質への結合基を有する非システインアミノ酸残基の導入に加えて、または導入の別法として、該結合基を有し、親ＧＨの機能的部位、例えばレセプター結合部位(例えば、K41、K168およびK172の位置のうち１つまたはそれ以上に存在)に位置するアミノ酸残基の除去は、好ましくはそのような基を有するアミノ酸残基の保存的置換または削除により行うことができる。
【００８４】
従って、さらに本発明は、(第一)高分子物質への結合基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基が、野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置に等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置から除去されている成長ホルモンポリペプチド変異体(変異体ＧＨ)のコンジュゲートであって、除去されたアミノ酸に反応性である、該ポリペプチドに存在するアミノ酸残基に結合した少なくとも１つの(第一)高分子物質をさらに含むコンジュゲートに関する。 好ましい態様において、少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基は、非システインアミノ酸残基である。
【００８５】
従って、さらに別の態様においてＧＨ変異体は、対応する親ＧＨに比較して該高分子物質への結合基を有する少なくとも１つの非システインアミノ酸残基を欠如している。言い換えれば、少なくとも１つの非システインアミノ酸残基、例えば１、２、３、４または５つの残基が親ＧＨから除去されている。好ましくは、該高分子物質への結合基を有する残基であって除去すべきものは、親ＧＨの機能的部位、例えばレセプター結合部位の一部を形成する残基である。
【００８６】
高分子物質への結合基を有する１またはそれ以上の残基の除去は、ＧＨ変異体を調製するために行われる高分子物質への結合基の唯一の修飾であってよい。また、高分子物質への結合基を有する1またはそれ以上の残基の除去は、高分子物質への結合基を有する1またはそれ以上の残基の導入との組み合わせにおいて行ってもよい。例えば、結合基の導入および／または除去は、結合基を分子表面に分配させたＧＨ変異体を創作するように設計する。
【００８７】
１つの態様において、高分子物質と反応性の１〜５、例えば１〜３、すなわち１のみ、２つまたは３つのアミノ酸残基が親ＧＨから除去されている。
【００８８】
高分子物質と反応性の除去されるアミノ酸残基は、本明細書中で示すようにhＧＨの表面に曝露した位置と等価な位置、すなわち、例えばhＧＨの表面に存在する位置と等価な位置に存在するのが好ましく、そしてより好ましくは、２５％を越えるその側鎖が溶媒に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が溶媒に曝露しているアミノ酸残基により占められている。
【００８９】
さらに別の態様において、高分子物質と反応性である、除去されるアミノ酸残基もまた本明細書に開示するヘリックスの位置に等価な位置に存在する。
【００９０】
例えば本明細書中の以降の部分で開示するように、本発明に従い改変しようとするアミノ酸残基の全数(配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して)は、好ましくは１５を越えない。
【００９１】
導入しようとするアミノ酸残基の正確な数およびアミノ酸残基の型は、所望のコンジュゲートの度合いおよび性質(例えば、高分子物質の同一性、いくつの高分子物質がポリペプチドにコンジュゲート化するのが望ましいまたは可能であるか、ポリペプチド中どこでコンジュゲート化を行うまたは避けるべきであるかなど)に依存する。
【００９２】
好ましくは、本発明のコンジュゲートのＧＨポリペプチド(すなわち本明細書中の文脈におけるＧＨ変異体)は、１〜１５のアミノ酸残基(例として１〜８または２〜８アミノ酸残基、例えば１〜５または２〜５アミノ酸残基)が配列番号２に示すアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。ゆえに、好ましくはＧＨ変異体は、全部で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸残基が、配列番号２に示すアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは本発明のコンジュゲートのために、配列番号２のアミノ酸残基と異なる少なくとも一部のアミノ酸残基が高分子物質、例えばＰＥＧ分子に結合している。
【００９３】
ＧＨ変異体は、高分子物質と反応性の残基でない少なくとも１つの追加のアミノ酸変化、例えばhＧＨと比較して１、２、３または４の追加のアミノ酸変化を含んでいてよく、この追加のアミノ酸変化(群)は、例えばアンタゴニスト特性をＧＨ変異体および対応するコンジュゲートに付与するものであり、例えばhＧＨのGly120に等価な位置における置換、例えばG120R、G120K、G120W、G120Y、G120F、G120Eである。; 例えばFuh et al. (1992) Science, 256, 1677-1680またはWO 9711178を参照。
【００９４】
さらに、H18D, H18A、H21N、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、E174AおよびI179Tからなる群から選択される(１またはそれ以上の)置換を含む本発明のコンジュゲートが包含され、好ましくは該コンジュゲートの高分子物質は、示された挿入アミノ酸残基と反応性でない。これらの置換は、本明細書中に開示される結合基を有するアミノ酸残基の挿入、例えばG120Cに加えて行ってもよい。
【００９５】
１つの態様において、本発明のコンジュゲートは置換G120Cならびに該位置に結合したシステイン反応性高分子物質、好ましくはＰＥＧを含む。
【００９６】
好ましい態様において、本発明のＧＨアンタゴニストはhＧＨレセプター(群)に結合することができ、レセプター部位１および２のうち少なくとも一方はhＧＨ(すなわち、好ましくは少なくともレセプター部位１)に結合することができるが、細胞内信号経路を活性化することはできない。
【００９７】
本発明のコンジュゲートは、さらに本明細書中で開示されるようにアゴニストまたはアンタゴニストとして成長ホルモン(ＧＨ)活性を示すことは理解される。
【００９８】
一部の態様において、本発明のＧＨポリペプチド(ＧＨ変異体を含む)または本発明のコンジュゲートは、例えばＧＨの過剰な生産を含む疾患、例えば癌または炎症状態の治療に使用するためのhＧＨアンタゴニストであってよい。
【００９９】
１つの態様において、高分子物質、好ましくはインビボグリコシル化により結合(導入されたアミノ酸または非導入アミノ酸への結合)した糖部分またはＰＥＧ基へのコンジュゲート化は、本発明の非コンジュゲート化ＧＨポリペプチドと比べて、または好ましくは非コンジュゲート化hＧＨに比べて本発明のコンジュゲートにhＧＨアンタゴニスト特性を付与する。実施例１における「レセプター結合部位」の部に、hＧＨアンタゴニスト特性を付与するために可能な結合部位の例を開示する。従って、さらに本発明は、hＧＨのレセプター結合部位２(すなわち低親和性部位)にある表面に曝露した位置に等価な位置に結合した少なくとも高分子物質を含む本発明のコンジュゲート、具体的には成長ホルモンポリペプチドのコンジュゲート、hＧＨアンタゴニスト活性を有するコンジュゲートに関する。例えば、本発明のコンジュゲートは、F1、P2、I4、P5、R8、L9、D11、N12、A13、L15、R16、H18、R19、Q22、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124およびR127からなる群から選択される；好ましくはF1、P2、I4、P5、R8、L9、D11、N12、A13、L15、R16、R19、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124およびR127からなる群から選択される；またはより好ましくはP2、I4、R8、L15、R16、R19、G120およびT123からなる群から選択されるhＧＨの位置と等価な位置に本明細書中で開示した高分子物質を含んでいてよい。高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基を、hＧＨと比較して導入するのが好ましい。従って本発明は、高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基(例えばCys)がhＧＨのレセプター結合部位２における表面に曝露された位置と等価な位置に導入されており、hＧＨアンタゴニスト活性を有する本発明のコンジュゲートに関する。本発明のアンタゴニストコンジュゲートがhＧＨのレセプター部位１に等価な位置に結合した高分子物質を含まないのが好ましい。
【０１００】
好ましくは、本発明のコンジュゲートは、比較し得る条件下で測定した場合に、機能的インビボ半減期の増大、血清半減期の増大および／または腎クリアランスの低下を含む、対照分子(本明細書で定義されている)との比較において改良された１またはそれ以上の性質を有する。好ましくは、半減期は少なくとも２の因子、例えば５、１０またはそれ以上の因子により増大する。
【０１０１】
さらに、本発明のコンジュゲートは、比較可能な条件下で測定した場合にhＧＨなどの対照分子のコンジュゲートより免疫原性を示さないのが好ましい。
【０１０２】
好ましくは、本発明のコンジュゲートはＧＨポリペプチドの１またはそれ以上の上述の所望の性質を改良するために十分な数または型の高分子物質を含む。通常、本発明のコンジュゲートは１〜１０の(第一)高分子物質、特に１〜８または１〜５の該物質、例えば全部で１、２、３、４、５、６、７または８の高分子物質を含む。
【０１０３】
高分子物質は、好ましくは導入されたアミノ酸残基(例えば非システインアミノ酸残基)(群)に結合しているが、それが反応性であるＧＨ変異体の他のアミノ酸残基に結合してもよく、その場合、他のアミノ酸残基は導入されたアミノ酸残基(群)と同じ型を有している。
【０１０４】
１つの態様において、本発明のコンジュゲートはモノＰＥＧ化されている。
【０１０５】
さらに別の態様において、本発明のコンジュゲートは、本明細書に示した位置の外に存在する該ポリペプチドのアミノ酸残基に結合される高分子物質、例えばＰＥＧを含まない。従って、１つの態様において、本発明のコンジュゲートはｈＧＨのヘリックスの表面曝露位置(群)に等価な位置(群)、好ましくは該ヘリックスの最初の３つまたは最後の３つでない位置(群)に存在するアミノ酸残基(群)にのみ結合した高分子物質(群)を含む。
【０１０６】
ゆえに、本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分は、好ましくはＡ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択されるｈＧＨのヘリックスの１つに、例えばＡ、Ｂ、ＣまたはＤのうちの１つにのみ等価な位置(群)に導入されたアミノ酸残基(群)、すなわち高分子物質への結合基を含む残基(群)を含んでいてよい。
【０１０７】
特定の態様において、本発明のポリペプチドコンジュゲートはポリペプチドのＮ末端に結合した１個のＰＥＧ分子を含み、他のＰＥＧ分子を含まないものであり、特に少なくとも約２０kＤaの分子量を有する線状または分岐ＰＥＧ分子を含む。この態様に従うポリペプチドはさらに、本発明のポリペプチドのＮ-連結またはＯ-連結グリコシル化部位に結合した1またはそれ以上のオリゴサッカライド部分またはインビトログリコシル化により結合したオリゴサッカライド部分を含んでもよい。
【０１０８】
さらに別の態様において、本発明はＮ末端アミノ酸残基に結合した高分子物質を含むhＧＨ(配列番号２)ポリペプチドのコンジュゲートに関する。好ましい態様において本発明は、ポリペプチドのＮ末端に結合した1個のＰＥＧ分子を有し、他のいかなるＰＥＧ分子も持たず、特に少なくとも約２０kＤaの分子量を有する線状または分岐ＰＥＧ分子を含むhＧＨ(配列番号２)のコンジュゲートに関する。
【０１０９】
別の態様において、本発明のポリペプチドコンジュゲートは、ＰＥＧ化に利用可能なＧＨ変異体における各リジン残基に結合したＰＥＧ分子であって、特に線状または分岐ＰＥＧ分子、例えば約５kＤaの分子量を有するＰＥＧ分子を含む。
【０１１０】
さらに本発明のコンジュゲートは、該第一高分子物質とは異なる少なくとも１つの第二高分子物質を含んでもよい。例えば、本発明のコンジュゲートは１〜10の第二高分子物質、特に１〜８または１〜５の第二物質を含んでいてよい。例えば、第一高分子物質がＰＥＧ型のポリマー分子である場合は所望の第二高分子物質はオリゴサッカライド部分、とりわけインビボ結合性オリゴサッカライド部分である。インビボ結合性オリゴサッカライド部分を本発明のポリペプチドの導入されたインビボグリコシル化部位に結合させる。
【０１１１】
通常、本発明に従うコンジュゲートは、少なくとも約６７kＤaの見かけの分子量を有し、好ましくは少なくとも約７０kＤaの分子量を有するが、これより低い分子量も腎クリアランスの低下をもたらすかもしれない。ポリマー分子、例えばＰＥＧは本発明のコンジュゲートの分子量の調整に特に有用であることが見出されている。
【０１１２】
本発明のコンジュゲートが現在入手可能なＧＨ製品に、注射の間隔の伸長を含む多くの有用性を与えることが意図されている。
【０１１３】
高分子物質がリジンまたはＮ末端アミノ酸残基に結合した本発明のコンジュゲート
好ましい態様において、本発明のコンジュゲートは、高分子物質が結合基としてイプシロンアミノ基を有する分子であるコンジュゲートである。例えば、この態様に従うコンジュゲートのＧＨ変異体は、少なくとも１つの導入されたリジン残基を含み、その残基はhＧＨの表面に曝露された位置に等価な親ＧＨの位置に導入されており、該コンジュゲートはさらにリジン残基と反応性の少なくとも１つの高分子物質を含んでいる。例えばhＧＨの単独またはそのレセプター分子に複合体化されたモデル構造において、リジン残基は、少なくとも２５％の側鎖がその表面に曝露されている、好ましくは少なくとも５０％の側鎖がその表面に曝露しているアミノ酸残基からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な親ＧＨの少なくとも１つの位置に導入されている。このようなアミノ酸残基を実施例１で同定する。好ましくは関連の位置(群)に存在するアミノ酸残基の置換により、とりわけ保存的置換によりリジン残基を導入する。本明細書中の実施例１において、リジン残基の導入に適当な特異的位置ならびに特異的置換を列挙する。
【０１１４】
この態様に従うコンジュゲートのＧＨ変異体は、本明細書中、後記の実施例１において同定するように好ましくは少なくとも１つのリジンへの置換を含む。その例として、R64K、R94K、R127K、R134KおよびR183K(番号付与は配列番号２に示すhＧＨの成熟アミノ酸配列に従う、すなわち等価な位置である)が挙げられる。
【０１１５】
この態様に従うコンジュゲートのＧＨ変異体は、通常は１〜10、特に１〜５または１〜３、例えば１、２、３、４または５の導入されたリジン残基を含む。
【０１１６】
別の態様において、ＧＨ変異体は対応する親ＧＨに比較して少なくとも１つのリジン残基を欠いている。言い換えれば、少なくとも１つのリジン残基、例えば１、２、３、４または５リジン残基が親ＧＨから除去されている。基本的に親ＧＨの任意のリジン残基(群)、特にhＧＨの９リジン残基をこの態様に従い、好ましくは置換により、とりわけ保存的置換により除去することができる。実施例１において、hＧＨの９つのアミノ酸残基が同定されている。好ましくは除去しようとするリジン残基(群)は、親ＧＨの機能的部位、例えばレセプター結合部位の一部を形成するリジン残基である。例えば、この態様に従うＧＨ変異体は、K41R、K168RおよびK172Rからなる群から選択されるhＧＨの置換に等価な、好ましくは少なくとも１または少なくとも２の置換を含む。１つの態様において、本発明のコンジュゲートはK41、168Rおよび172Rに等価な３つ全ての位置におけるリジンの置換、例えばK41R、K168RおよびK172Rを含む。好ましくはリジン残基が除去されたこのようなＧＨ変異体はリジン残基の導入も含む。
【０１１７】
1またはそれ以上のリジン残基の除去は、ＧＨ変異体を製造するために行われる、高分子物質に対する結合基の唯一の修飾であるかもしれない。この方法により、リジン反応性高分子物質をＧＨポリペプチドの残存する自然発生のリジン残基に結合させるが、例えばレセプター結合部位に位置する除去されたリジン残基へのコンジュゲート化が避けられる。または、例えばレセプター結合部位などの機能的部位に位置するリジン残基を欠失し、1またはそれ以上のリジン残基が加えられたＧＨ変異体を創出するために、1またはそれ以上のリジン残基の除去を1またはそれ以上のリジン残基の導入との組み合わせにおいて行うことができる。例えば、結合基の導入および／または除去は、上記の「本発明のコンジュゲート」の部において与えられる一般的ガイドラインに従い、分子表面に分布する結合基を有するＧＨ変異体を創出するために設計される。
【０１１８】
高分子物質は、リジン残基、例えばそのε−アミノ基に結合するあらゆる分子、例えばポリマー分子、親油性基、有機誘導体化剤であってよいが、これは好ましくは「ポリマー分子へのコンジュゲート化」の部に記載したポリマー分子のいずれかであり、特に分岐または線状ＰＥＧまたはポリアルキレンオキシドである。最も好ましくは、ポリマー分子はＰＥＧであり、コンジュゲート化に用いるべき活性化分子はＳＳ-ＰＥＧ、ＮＰＣ-ＰＥＧ、アルデヒド-ＰＥＧ、mＰＥＧ-ＳＰＡ、mＰＥＧ-ＳＣＭ、mＰＥＧ-ＢＴＣ(Shearwater Polymers, Inc)、ＳＣ-ＰＥＧ(Enzon, Inc.)、US 5,880,255に記載されるトレシル化mPEGまたはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシイミド-ＰＥＧ(US 5,122,614)である。
【０１１９】
通常、リジン残基へのコンジュゲート化に関しては、高分子物質は、約５または１０kＤaの分子量を有する。この態様に従うコンジュゲートは少なくとも１つの第二高分子物質、例えば１〜１０、1〜８または１〜５の該物質を含んでいてよい。
【０１２０】
第一の高分子物質がポリアルキレンオキシドまたはＰＥＧ由来ポリマーである場合、第二の高分子物質は、「高分子物質がオリゴサッカライド部分である本発明のコンジュゲート」の部に開示するように、好ましくはオリゴサッカライド部分、特にインビボ結合部分、例えば導入されたインビボグリコシル化部位に結合した部分である。
【０１２１】
非システインまたは非リジン残基に結合するペプチド部分を有する本発明のコンジュゲート
本明細書中の開示に基づいて当業者なら、リジン残基を用いる上記と同様のアプローチを使用して、親ＧＨへの置換により他の結合基を有するアミノ酸残基を導入してもよいことを理解するであろう。例えば、酸基を含む１またはそれ以上のアミノ酸残基(グルタミン酸またはアスパラギン酸)、またはアルギニンを、表面に曝露したアミノ酸残基により占められているhＧＨの位置に、特にその側鎖の少なくとも２５％が表面に曝露している、とりわけその側鎖の少なくとも５０％が表面に曝露しているアミノ酸残基により占められている位置と等価な親ＧＨにおける位置に導入してもよい。この目的のために、導入は置換、好ましくは保存的置換によるのが好ましい。リジン修飾されたコンジュゲートについて既に述べたものと同様に、得られる修飾化ポリペプチドを少なくとも１つの第一高分子物質(導入されているアミノ酸残基に結合し得る)にコンジュゲート化することができ、さらに少なくとも１つの第二高分子物質、例えばインビボ結合されたオリゴサッカライド部分を含んでもよい。
【０１２２】
高分子物質がシステイン残基に結合する本発明のコンジュゲート
さらに別の態様において本発明は、hＧＨのヘリックス中、表面に曝露した位置に等価な親ＧＨの位置に、該位置はヘリックスの最初の３つまたは最後の３つのアミノ酸残基に存在しないという条件で導入されている少なくとも１つの導入システイン残基を含むＧＨ変異体のコンジュゲートであって、さらに少なくとも１つの(第一)システイン反応性高分子物質を含むコンジュゲートに関する。この位置は好ましくは、単独またはその２つのレセプター分子に複合体化したhＧＨのモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露した、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露したhＧＨの位置に等価である。
【０１２３】
さらに別の態様において本発明は、P2、I4、L6、S7、R8、D11、N12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、Y35、P37、Y42、L45、L52、E56、S57、P59、S62、N63、R64、E65、E66、Q68、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、L101、Y103、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、G126、R127、R134、Y143、D154、A155、L156、K158、N159、G161、K168、D171、T175、R178およびR183からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な親ＧＨ(好ましくはhＧＨまたは最大10、または最大８、最大５、最大４、最大３、最大２、例えば１または２のアミノ酸残基が異なるその変異体)の位置に導入された少なくとも１つのシステイン残基(例えば、１のみ、２、３、４、５または６の導入されたCys)を含むＧＨ変異体のコンジュゲートに関し、該コンジュゲートは少なくとも１つの第一システイン反応性高分子物質、すなわち、特にジスルフィド架橋の部分を形成しない遊離のシステイン残基を含む。好ましい態様において、システイン反応性高分子物質は、導入されたCysの少なくとも１つに結合させる。
【０１２４】
１つの態様においてＧＨ変異体のコンジュゲートは、L6、S7、E30、Y35、P37、L52、S57、P59、E66、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、L101、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、Q122、G126、R134、Y143、D154、A155、L156、K158、N159およびG161からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な親ＧＨの位置に導入された少なくとも１つのシステイン残基(例えば、１のみ、２、３、４、５または６のシステイン残基)を含み、該コンジュゲートは少なくとも１つのシステイン反応性高分子物質を含む。
【０１２５】
さらに別の態様において、そのような「システイン」変異体ＧＨの該コンジュゲートは、上記に概説した群から選択される位置へのCysの導入に加え、さらにF1、T3、P5、E33、A34、K38、E39、Q40、S43、Q46、N47、P48、Q49、A98、N99、G104、S106、E129、D130、G131、P133、T135、G136、Q137、K140、Q141、K145、D147、E186、G187およびG190からなる群から選択される、好ましくはF1、T3、P5、E33、K38、E39、S43、Q46、N47、P48、Q49、N99、E129、G131、P133、T135、G136、D147、E186、G187およびG190からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な親ＧＨ(好ましくはhＧＨ)の位置に導入された少なくとも１つの付加的システイン残基(例えば、１のみ、２、３、４、５または６の付加的Cys)を含む。
【０１２６】
好ましくは本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分はY111に等価な位置にCysを有さず、少なくとも唯一の導入Cys残基として有することはない。本発明の１つの態様において、本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分は、100〜111(配列番号２)から選択されるhＧＨにおける位置に等価な位置に、例えばY111と等価な位置にCys残基を有すると共に本明細書中で開示する、例えばN12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、E88、N109、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、K158、N159、G161、K168、D171、T175およびR178からなる群から選択される、または好ましくはE30、E88、N109、D112、K115、Q122、K158、N159およびG161からなる群から選択される少なくとも１つの付加的導入Cysを有する。
【０１２７】
少なくとも１つの導入システイン残基(例えば全部で１、２、３、４、５または６の導入システイン残基)に加えて、ＧＨ変異体は好ましくは、hＧＨのものに対応するジスルフィド架橋を形成するCys 53、Cys 165、Cys 182およびCys 189(すなわち、Cys 53はCys 165と共に、Cys 182はCys 189と共に)と等価な位置に４つのシステイン残基を含む。
【０１２８】
１つの態様において、本発明のコンジュゲートは、置換G120Cを含み、そこに高分子物質、すなわちシステイン反応性分子が結合する。
【０１２９】
１つの態様において、本発明のコンジュゲートのＧＨポリペプチドは、本明細書中で開示されるように、該ポリペプチドがNo.100〜111のアミノ酸残基に等価な位置に最大１つのシステイン残基(すなわち唯一であるかまたは存在しない)を含むよう提供される。
【０１３０】
さらに別の態様において、本発明のコンジュゲートのＧＨポリペプチドは、本明細書中に開示するように、該ポリペプチドがhＧＨの100および111に対応する位置の両方に同時にシステイン残基を含まないように提供される。
【０１３１】
本発明のこの態様に従うコンジュゲートの高分子物質は、特定のコンジュゲート化法を用いるときにシステインを結合基として有するあらゆる分子(例えば、オリゴサッカライド部分、親油性基または有機誘導体化剤)であってよく、好ましくは高分子物質はポリマー分子、例えば「ポリマー分子へのコンジュゲート化」と題する部に記載するいずれかの分子である。好ましくは、ポリマー分子は線状または分岐ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシドからなる群から選択される。最も好ましくは、ポリマー分子はＰＥＧ、例えばＶＳ-ＰＥＧである。
【０１３２】
ポリペプチドとポリマー間のコンジュゲート化は、例えば「ポリマー分子へのコンジュゲート化」と題する部に開示するように、例えば該部において言及する段階的な方法または１工程法を用いて、あらゆる適当な方法により達成することができる。該ポリペプチドが唯一のコンジュゲート可能なシステイン残基を含むとき、好ましくは、これは少なくとも１０または少なくとも１５kＤaの分子量を有する、例えば１２kＤa、１５kＤaまたは２０kＤaの分子量を有する第一高分子物質に、直接または低分子量のポリマーにより間接的にコンジュゲート化される(例えばWO 99/55377に開示されている)。該コンジュゲートが２またはそれ以上の第一高分子物質を含むときは、通常、これらの各々は５または１０kＤaの分子量を有している。
【０１３３】
高分子物質がオリゴサッカライド部分である本発明のコンジュゲート
さらに別の態様において本発明は、少なくとも１つのインビボグリコシル化部位を含むグリコシル化ＧＨ変異体を含むコンジュゲートに関する。 好ましくは、インビボグリコシル化部位は、表面に曝露したアミノ酸残基により占められたhＧＨの位置と等価な位置(実施例１で同定)に導入する。インビボＮ−グリコシル化部位を用いたグリコシル化部位の導入を例として以下に示す。さらにＯ−グリコシル化部位またはインビトログリコシル化部位を同様の方法により導入することができることは理解されるであろう。
【０１３４】
適当なＮ−グリコシル化部位は、表面に曝露したアミノ酸残基、特に２５％を越えるその側鎖がhＧＨの表面に曝露している、そして好ましくは５０％を越えるその側鎖が該表面に曝露しているアミノ酸残基により占められるhＧＨの位置、そこから+１または+３の位置にプロリン残基が存在しない位置に等価な位置における、アスパラギン残基の導入、好ましくは置換により導入することができる。+２の位置に存在するアミノ酸残基がセリンまたはスレオニンであるなら、さらに別のアミノ酸の置換は必要でない。しかし、この位置が異なるアミノ酸残基で占められているなら、セリンまたはスレオニン残基を導入する必要がある。
【０１３５】
実施例１に、付加的なＮ−グリコシル化部位の導入に適当な位置を開示する。本発明のコンジュゲートのＧＨ変異体は単一のインビボグリコシル化部位を含んでいてよい。しかし、ポリペプチドは１を越えるインビボグリコシル化部位、特に１〜１０、例えば２〜５のインビボグリコシル化部位を含むのが望ましいかもしれない。ゆえに、ＧＨポリペプチドは１つの付加的グリコシル化部位を含んでいてもよく、あるいは２、３、４、５、６、７またはそれ以上の導入されたインビボグリコシル化部位を有していてもよい。
【０１３６】
本明細書中に記載するように、Ｎ−グリコシル化部位は、その部位のＮ残基が該位置に存在するような方法で導入する。同様に、そのような部位を構成するＳまたはＴ残基が該位置に存在するようにＯ−グリコシル化部位を導入する。
【０１３７】
さらに、効率的なグリコシル化を確実にするために、インビボグリコシル化部位、特にＮ−グリコシル化部位のＮ残基またはＯ−グリコシル化部位のＳまたはＴ残基が、本発明のＧＨポリペプチドの最後(すなわち、該ポリペプチドのＣ末端部分)の１０、１５、２０、２５、３０、４０または好ましくは最後の５０アミノ酸残基に存在しないのが好ましい。ゆえに、本明細書中に開示するグリコシル化部位(群)は、hＧＨ(配列番号２)の最初の180Ｎ末端アミノ酸残基に等価な位置内に位置するのが好ましく、最初の１７０または１６０または１５０のＮ末端アミノ酸残基内に位置するのが、より好ましい。
【０１３８】
さらに好ましくは、インビボグリコシル化部位は、唯一の突然変異が該部位を創作するのに必要とされる(すなわち、機能的グリコシル化を創作するのに必要なあらゆる他のアミノ酸残基は分子中に既に存在する)位置に導入する。
【０１３９】
さらに、上記のインビボグリコシル化部位の修飾のうち少なくとも１つを有するＧＨ変異体のアミノ酸配列は、第二の高分子物質への少なくとも１つの結合基が導入されているかもしれないという点で、親ポリペプチドのアミノ酸配列と異なっていてもよく、これは例えば「本発明のコンジュゲート」「高分子物質がリジン残基またはＮ末端アミノ酸残基に結合している本発明のコンジュゲート」または「非システインまたは非リジン残基に結合した高分子物質を有している本発明のコンジュゲート」および「高分子物質がシステイン残基に結合する本発明のコンジュゲート」と題する部に開示されている。
【０１４０】
インビボグリコシル化は、グリコシル化を行う真核生物の発現宿主における発現により行なわれる。発現宿主細胞は真菌(糸状真菌または酵母)、昆虫、動物細胞またはトランスジェニック植物細胞から選択することができる。１つの態様において、宿主細胞は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫまたはＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ 293、昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞、または酵母細胞、例えばS.cerevisiaeまたはPichia pastoris、または本明細書中に記載する任意の宿主細胞である。
【０１４１】
オリゴサッカライド部分に加えて、この部において開示する本発明の態様に従うコンジュゲートは、コンジュゲートのＧＨ変異体部分に存在する，所望により導入された１またはそれ以上の結合基にコンジュゲート化された追加の高分子物質、特にポリマー分子を、例えばコンジュゲートの分子量を約６７kＤaまたはそれ以上に増大させるために含んでいてよい。
【０１４２】
本発明のコンジュゲートの高分子物質
上記のように、本発明のコンジュゲートの高分子物質は、好ましくはポリマー分子、親油性化合物および有機誘導体化剤からなる群から選択される。これら全ての物質は、本発明のコンジュゲートのＧＨポリペプチド(例えばＧＨ変異体)に望ましい性質、特に機能的インビボ半減期の増大および/または血清半減期の増大をもたらすことができる。
【０１４３】
本発明のＧＨポリペプチド(例えばＧＨ変異体)は通常、唯一の型の高分子物質(第一高分子物質)にコンジュゲート化させるが、２またはそれ以上の異なる型の高分子物質(第二の高分子物質)、例えばポリマー分子とオリゴサッカライド部分に、親油性基とオリゴサッカライド部分に、有機誘導体化剤とオリゴサッカライド部分に、親油性基とポリマー分子などにコンジュゲート化させることもできる。２またはそれ以上の異なる高分子物質へのコンジュゲート化は同時にまたは順次行ってよい。
【０１４４】
[本発明のコンジュゲートの製造法]
以下の段落「親油性化合物へのコンジュゲート」、「ポリマー分子へのコンジュゲート」、および「有機誘導体化剤へのコンジュゲート」に、特定の型の高分子物質へのコンジュゲート化を記載する。
【０１４５】
親油性化合物へのコンジュゲート
ポリペプチドと親油性化合物は互いに、直接、またはリンカーを使用してコンジュゲート化が可能である。親油性化合物は、天然化合物、例えば飽和または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはステロイド、または合成化合物、例えば、１またはそれ以上のアルキル、アリール、アルケニル、または他の複数の不飽和化合物を伴うカルボン酸(carbon acid)、アルコール、アミンまたはスルホン酸であってよい。ポリペプチドおよび親油性化合物の、所望によりリンカーを介する、コンジュゲート化は、当分野に既知の方法、例えば Bodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 および WO 96/12505 に従い行うことができる。
【０１４６】
ポリマー分子へのコンジュゲート
本発明のポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、任意の適当なポリマー分子、例えば天然または合成のホモ-ポリマーまたはヘテロ-ポリマー、典型的には分子量300〜100,000Ｄaの範囲、例えば300〜20,000Ｄa、より好ましくは500〜10,000Ｄaの範囲、さらに好ましくは500〜5000Ｄaの範囲であってもよい。ホモ-ポリマーの例には、ポリオール(すなわちポリ-ＯＨ)、ポリアミン(すなわちポリ-ＮＨ２)およびポリカルボン酸(すなわちポリ-ＣＯＯＨ)が含まれる。ヘテロポリマーは種々のカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーである。
【０１４７】
適当なポリマー分子の例としては、ポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、分岐ＰＥＧｓ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリエチレン共マレイン酸無水物、ポリスチレン共マレイン酸無水物、デキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、または機能的インビボ半減期および/または血清半減期の増大のために適した任意の他の生物ポリマーを挙げることができる。ポリマー分子の他の例としては、ヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿たんぱく質が挙げられる。一般に、ポリアルキレングリコール誘導化ポリマーは、生分解性、非毒性、非抗原性、非免疫原性であり、種々の水溶解性を有し、生物から容易に抽出される。ＰＥＧは、例えばデキストランなどのポリサッカライドと比較して、架橋できる反応基が極めて少ないので、好ましいポリマー分子である。具体的には、モノ機能性ＰＥＧ、例えばメトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)が、そのカップリング化学が比較的単純であるので(唯一の反応基がポリペプチド上の結合基とのコンジュゲート化に利用される)、重要である。その結果、架橋の危険性が除去され、得られるポリペプチドコンジュゲートは比較的均一であり、ポリマー分子とポリペプチドとの反応性を比較的制御しやすい。ポリマー分子(群)をポリペプチドに共有結合させるには、ポリマー分子のヒドロキシ末端基を活性化型で提供、即ち反応性機能基と共に提供しなければならない。適当な活性化ポリマー分子は市販されており、例えばShearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA から入手可能である。あるいは、ポリマー分子は当業者に既知の、例えばWO 90/13540に記載されているような通常の方法によって活性化することができる。本発明に使用するための、活性化線状または分岐ポリマー分子の具体例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997および2000カタログ(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、これは本明細書の一部を構成するものとする)に記載されている。活性化ＰＥＧポリマーの具体例としては次の線状ＰＥＧ：NHS-PEG(例えばSPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEGおよび SCM-PEG)およびNOR-PEG)、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEGおよびMAL-PEG、ならびに分岐ＰＥＧ、例えばPEG2-NHS、およびUS 5,932,462やUS 5,643,575に開示されているもの(これらは本明細書の一部を構成するものとする)が挙げられる。さらに、以下の文献(これらは本明細書の一部を構成するものとする)は有用なポリマー分子および/またはＰＥＧ化化学を開示している：US 5,824,778、US 5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、US 4,902,502、US 5,281,698、US 5,122,614、US 5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、US 5,736,625、WO 98/05363、EP 809 996、US 5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、US 5,473,034、US 5,516,673、EP 605 963、US 5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503およびEP 154 316。ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子のコンジュゲートは、以下の文献(ここにはポリマー分子を活性化するために適当な方法も記載されている)に記載されているような通常の方法を使用することにより行われる：R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications"、Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking"、CRC Press, Florida, USA; G.T. Hermanson et al, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.。当業者なら、使用される活性化方法および/またはコンジュゲート化学がポリペプチドの結合基(群)(その例は上に記載)、およびポリマーの官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、またはハロアセテート)によって変動することは理解するであろう。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の結合基において利用可能なものすべて(即ち、ポリペプチドの表面に曝露されているような結合基)に対するコンジュゲート化を目的とすることができ、あるいは１つまたはそれ以上の特定の結合基、例えばN-末端アミノ基(US 5,985,265)を目的としてもよい。さらに、コンジュゲートは、１工程でも、段階的にでも行うことができる(例えば、WO 99/55377に記載されているように)。
【０１４８】
ＰＥＧ化は、結合するＰＥＧ分子の数、その分子のサイズおよび形態(例えば線状であるか分岐であるか)、およびポリペプチドにおける結合部位(群)に関して最適な分子が調製されるようデザインできることは理解されよう。例えば使用するポリマーの分子量は、達成しようとする所望の効果を考慮して選択される。例えば、本発明において主たる目的は高分子量を有するポリペプチドを生じさせる(例えば、腎クリアランスを減少させるため)ことである。これは少数の高分子量ポリマー分子またはより多数の低分子量ポリマー分子をコンジュゲート化することにより達成することができる。高い程度のエピトープ遮蔽を望む場合、ポリペプチドのすべてまたはほとんどのエピトープを効果的に遮蔽するに充分に多くの数の低分子量ポリマー分子(例えば、分子量約5,000Ｄa)を使用して達成することができる。例えば、２〜８個、例えば３〜６個のこのようなポリマーを使用することができる。
【０１４９】
タンパク質上の唯一の結合基へのコンジュゲート化に関して(US 5,985,265に記載されている)、ポリマー分子はそれが線状または分岐であっても、高分子量、例えば約２０kＤaを有するのが好都合であろう。通常、全ての利用可能なポリマー結合基をポリマー分子と反応させることを目的とした条件下にて、特にポリペプチドに比較してモル過剰の高分子物質を用いることによりポリマーのコンジュゲート化は行われる。活性化ポリマー分子とポリペプチドとの典型的なモル比は、約1000-1以下、特に200-１以下、好ましくは100-１以下、最適な反応を達成するために例えば10-１または ５-１以下である。しかし、等しいモル比を用いてもよい。
【０１５０】
本発明では、ポリマー分子をリンカーを介してポリペプチドと結合させることも意図されている。適当なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は塩化シアヌルである(Abuchowski et al.,(1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al.,(1986)、J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378)。
【０１５１】
コンジュゲート化反応の後、残りの活性化ポリマー分子は、当分野に既知の方法、例えば第１級アミンを反応混合物に加えることによって好ましくはブロックし、得られる不活化ポリマー分子を適当な方法によって取り出す。
【０１５２】
WO 99/55377に記載の一般的技術を適用して本発明のコンジュゲートを製造する。従って、さらに別の態様において本発明はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分を連続してＧＨポリペプチドに段階的に結合する方法であって、ポリペプチドを、式：
W-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-X(WおよびXはアミン、スルフィドリル、カロボキシルまたはヒドロキシル官能基と独立して反応し、低分子量ＰＥＧ部分をポリペプチドに結合させる基を表す)を有する低分子量のヘテロ二官能性またはホモ二官能性ＰＥＧ部分と反応させ、ポリペプチドに結合した低分子量ＰＥＧ部分を単官能性または二官能性ＰＥＧ部分と反応させて、単官能性または二官能性ＰＥＧ部分を低分子量ＰＥＧ部分の遊離端末に結合させ、ＰＥＧ-ポリペプチドコンジュゲートを製造する工程からなる方法に関する。「n」は整数値であり、低分子量ＰＥＧ部分の分子量に依存するであろう。１つの態様において、単官能性または二官能性ＰＥＧ部分は式：Y-CH2CH20(CH2CH20)、nCH2CH2-Z(式中、Yはポリペプチドに結合した低分子量ＰＥＧ部分の遊離端末上の端末基に反応性であり、Zは-OCH3またはXと反応して二官能性コンジュゲートを形成する基をあらわす)を有する。さらに別の態様において、単官能性または二官能性ＰＥＧ部分は、メトキシＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、加水分解によりまたは酵素により分解可能なＰＥＧ、ペンダントＰＥＧまたはデンドリマーＰＥＧである。さらに別の態様において、WおよびXは独立してオルトピリシルジスルフィド，マレイミド，ビニルスルホン，ヨードアセトアミド，ヒドラジド，アルデヒド，スクシンイミジルエステル，エポキシド，アミン，チオール，カルボキシル，活性エステル，ベンゾトリアゾールカルボネート，p-ニトロフェノールカルボネート、イソシアネートおよびビオチンからなる群から選択される。さらに別の態様において、低分子量ＰＥＧ部分は、約100〜5,000ダルトンの範囲の分子量を有し、１例はOPSS-PEG-ヒドラジドである。さらに別の態様において、単官能性または二官能性ＰＥＧ部分は約100〜200キロダルトンの分子量を有する。さらに別の態様において、低分子量ＰＥＧ部分および/または単官能性もしくは二官能性ＰＥＧ部分はポリエチレングリコールの共重合体であり、このようなポリエチレングリコールの共重合体は通常、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコール共重合体およびポリエチレングリコール/ポリ(乳酸/グリコール酸)共重合体からなる群から選択される。さらに別の態様において該方法はさらに、ポリペプチドへの連続的な２つのＰＥＧ部分の段階的結合に続いて、ＰＥＧ-ポリペプチドコンジュゲートを精製する工程を含む。上記および本明細書中で使用される「mPEG-ALDとの組み合わせにおけるOPSS-PEG-ヒドラジド」の用語は、WO 99/55377に開示されている段階的技術が用いられるであろうことを意味することを意図している。WO 99/55377による開示は、本明細書の一部を構成するものとする。
【０１５３】
本発明のペプチド(例えば、ＧＨ変異体)の機能的部位、例えばそのレセプター結合部位におけるポリマー分子の結合を避けるために、コンジュゲート化中にそのような部位を遮蔽する(コンジュゲート化前に機能的部位をブロックするとも称される)のが好都合であろう(例えば、WO 94/13322に記載の原理を用いて)。例えば、このような部位をモノクローナル抗体により遮蔽することができる。従って、ポリペプチドの機能的部位に結合し得るヘルパー分子によりポリペプチドの機能的部位をブロックすることができる。通常、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能部位を特異的に認識するもの、例えば受容体である。あるいは、ヘルパー分子は、ポリペプチドを認識する抗体、特にモノクローナル抗体であってもよい。特に、ヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、ポリペプチドは、コンジュゲート化を行う前にヘルパー分子と相互作用させる。これは、ポリペプチドの機能部位が遮蔽されるかまたは保護され、そしてその結果、非ポリペプチド部分、例えばポリマーによる誘導体化に利用不可能にされることを確実にする。ヘルパー分子からの溶離後、非ポリペプチド部分とポリペプチドの間のコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された機能部位を含み、回収することが可能である。ブロッキングされた機能部位を有するポリペプチドの、ポリマー、親油性化合物、有機誘導体化剤または他の化合物のいずれかへの後のコンジュゲート化は、通常の方式で行われる。
【０１５４】
ポリペプチドの機能的部位をコンジュゲート化から遮蔽するために用いられるヘルパー分子の性質とは関係なく、ヘルパー分子は、分子の一部に、選択された非ポリペプチド部分への結合基(このような基へのコンジュゲート化はヘルパー分子からのコンジュゲート化ポリペプチドの脱離を妨げるであろう)を持たないかまたはごく少数含むのが望ましい。これにより、ポリペプチドの非遮蔽部分に存在する結合基への選択的コンジュゲート化を達成することができ、コンジュゲート化の繰り返しサイクルにヘルパー分子を再使用することが可能である。例えば、非ポリペプチド部分が、リジンまたはＮ末端アミノ酸残基のイプシロンアミノ基を結合基として有するＰＥＧなどのポリマー分子であるなら、ヘルパー分子はコンジュゲート化可能なイプシロンアミノ基を実質的に持たないのが望ましく、好ましくは全てのイプシロンアミノ基を持たないのが望ましい。従って、ヘルパー分子はポリペプチドの機能的部位に結合し得るたんぱく質またはペプチドであり、該たんぱく質またはペプチドは選択した非ポリペプチド部分にコンジュゲート化可能なあらゆる結合基を持たないのが好ましい。
【０１５５】
さらなる態様において、ヘルパー分子はまず、カラム充填素材、例えばSephadexまたはアガロースビーズなどの固相、あるいは表面、例えば反応容器に共有結合される。続いて、ヘルパー分子を保持するカラム素材上にポリペプチドを装填し、そして当分野で既知の方法に従いコンジュゲート化を行う。この方法は、溶出により、ポリペプチドコンジュゲートが、ヘルパー分子から分離されることを可能にする。ポリペプチドコンジュゲートは、該ポリペプチドコンジュゲートの実質的な分解を導かない物理化学的条件下で、通常の技術により溶出される。ポリペプチドコンジュゲートを含む液相は、ヘルパー分子が共有結合したままである固相から分離される。分離は他の方法で達成してもよい：例えば、ヘルパー分子を、特異的結合剤(例えばストレプトアビジン)により認識可能な第二の分子(例えばビオチン)で誘導体化してもよい。特異的結合剤は、固相に連結させてもよく、それにより、第二のヘルパー−固相カラム上を通過させることを通じて、ヘルパー分子−第二の分子複合体からポリペプチドコンジュゲートを分離することが可能になり、該カラムは続く溶出の際、ヘルパー分子−第二の分子複合体を保持するが、ポリペプチドコンジュゲートを保持しないであろう。ポリペプチドコンジュゲートは、いかなる適切な様式でヘルパー分子から放出させてもよい。脱保護は、ヘルパー分子が、結合しているポリペプチドの機能部位から解離する条件を提供することにより、達成することが可能である。例えば、ポリマーがコンジュゲート化される抗体と抗イディオタイプ抗体の間の複合体は、pＨを酸性またはアルカリ性pＨに調整することにより、解離させることが可能である。ポリペプチドのアミノ酸残基への炭水化物部分の共有インビトロ結合を用い、炭水化物置換基の数またはプロフィールを修飾するかまたは増加させてもよい。用いる結合様式に応じ、炭水化物(類)を、ａ）アルギニンおよびヒスチジン(Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI)、ｂ）遊離カルボキシル基(例えばＣ末端アミノ酸残基、アスパラギンまたはグルタミンの)、ｃ）遊離スルフィドリル基、例えばシステインの遊離スルフィドリル基、ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン、チロシンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニンまたはトリプトファンの芳香族残基、あるいはｆ）グルタミンのアミド基に結合させてもよい。これらのアミノ酸残基は、ＧＨポリペプチドにおいて導入してもよい炭水化物部分への結合基の例を構成する。インビトロ結合の適当な方法は、例えばWO 87/05330およびAplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp.259-306, 1981に記載されている。さらに、タンパク質−およびペプチド−結合Gln残基へのオリゴサッカライド部分またはＰＥＧのインビトロ結合は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧases）によって行うことができる。トランスグルタミナーゼは、いわゆる架橋反応において、ドナーアミン基の、タンパク質−およびペプチド−結合Gln残基への転移を触媒する。ドナーアミン基は、タンパク質−またはペプチド−結合型、例えばリジン残基のε−アミノ基であってよく、あるいは小さい有機分子または大きい有機分子の部分であってもよい。ＴＧaseが触媒する架橋においてアミノドナーとして機能する小さい有機分子の例はプトレシン(１，４−ジアミノブタン)である。ＴＧaseが触媒する架橋においてアミノドナーとして機能する大きい有機分子の例はアミノ含有ＰＥＧである（Sato et al., Biochemistry 35, 13072-13080）。ＴＧaseは、概して、高度に特異的な酵素であり、タンパク質表面に曝露されているすべてのGln残基が、アミノ含有物質へのＴＧaseが触媒する架橋に利用されるわけではない。それどころか、ほんのわずかなGln残基が本来、ＴＧase基質として機能するが、Gln基が良いＴＧase基質であることを支配する正確なパラメーターは未だ知られていない。従って、タンパク質が、ＴＧaseが触媒する架橋反応を受けるようにするために、ＴＧase基質として非常に良好に機能することが知られている一連のアミノ酸配列を都合良い位置に加えるのが必要条件となることが多い。いくつかのアミノ酸配列、例えば物質Ｐ、エラフィン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、α２−プラスミンインヒビター、α−カゼイン、およびβ−カゼインが優秀な天然ＴＧase基質としてか、あるいはそれを含有するものとして知られている。
【０１５６】
有機誘導体化剤へのコンジュゲート化
ＧＨポリペプチドの共有修飾は、ポリペプチドの１またはそれ以上の結合基を有機誘導体化剤と反応させることにより、行うことができる。適切な誘導体化剤および方法は、当分野で周知である。例えば、システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート(および対応するアミン)、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（４−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。ヒスチジル残基は、ｐＨ ５.５〜７.０でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化されるが、これは、この物質が、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用である。該反応は、好ましくはｐＨ ６.０の０.１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応する。これらの薬剤を用いた誘導体化は、リジニル残基の荷電を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化させるのに適した他の試薬には、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル(methyl picolinimidate)、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロホウ化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２,４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、１つまたはいくつかの通常の試薬との反応により修飾され、これらの中には、フェニルグリオキサール、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpＫaのため、反応が、アルカリ条件で行われることを必要とする。
【０１５７】
さらに、これらの試薬は、システインの基と共にアルギニンのグアニジノ基と反応する可能性がある。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド類(Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ')(式中、ＲおよびＲ'が異なるアルキル基)、例えば１−シクロヘキシル−３−(２−モルホリニル−４−エチル)カルボジイミドまたは１−エチル−３−(４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１５８】
ＧＨ変異体を含むＧＨポリペプチドの製造方法
本発明に従い用いられるＧＨポリペプチド、例えばＧＨ変異体は、所望によりそのグリコシル化型は、当分野で知られている任意の適当な方法により製造することができる。このような方法には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築し、適当な形質転換またはトランスフェクトされた宿主中でその配列を発現させる方法が含まれる(例えばE.B. Jensen and S. Carlsen in Biotech and Bioeng. 36, 1-11 (1990)に記載)。本発明のポリペプチドは、組換え法を用いて(例えばＥ.coliにおいて)、Ｎ末端伸長、例えばMet-GH(例えばMet-hGH)、Met-Glu-Ala-GH(例えばMet-Glu-Ala-hGH)、Ala-Glu-GH(例えばAla-Glu-hGH)により、所望により引き続きたんぱく質分解を行うことによって製造することができ、高分子物質の結合前または後に、例えば本明細書中に開示される高分子物質のＮ末端結合前に、Ｎ末端伸長を含まないhＧＨが得られる。このような態様において、本発明のコンジュゲートのＧＨポリペプチド部分は、特に本明細書で示される医薬として使用するためにはＮ末端メチオニンを含まない。
【０１５９】
しかし、本発明のポリペプチドは、比較的非効率ではあるが、化学合成または、化学合成の組み合わせまたは化学合成および組換えＤＮＡ技術の組み合わせによって生産することができる。
【０１６０】
本発明のＧＨ変異体をコードするヌクレオチド配列は、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を基に合成し、ついでヌクレオチド配列を変化させて関連のアミノ酸残基を導入(挿入または置換)または除去(削除または置換)を行う。通常、このヌクレオチド配列は常法に従い部位特異的突然変異誘発により修飾することができる。または、ヌクレオチド配列は、化学合成、例えばオリゴヌクレオチド合成装置によって、調製することができ、ここでは、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、好ましくは、組換えポリペプチドが生産される宿主細胞において好まれるコドンが選択される。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応(ＬＣＲ)(Barany, PNAS 88: 189-193, 1991)によって合成し、組み立てることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的に、相補的組立て用の５'または３'オーバーハングを含有する。(合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法による)組立て後、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を組換えベクター中に挿入し、所望の形質転換宿主細胞内での該ポリペプチドの発現に必要とされる制御配列に作動可能に連結される。当然ながら、すべてのベクターおよび発現制御配列が同等に、本発明のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を発現するよう良好に機能するとは限らないと考えられる。同じ発現系によってすべての宿主細胞が同等に良好に機能するとも限らない。しかし、当業者であれば、これらのベクター、発現制御配列および宿主の中から不適当な実験を行うことなく選択することが可能であろう。例えば、ベクターの選択に当たり、宿主を考慮しなければならないが、それはベクターが宿主細胞中で複製し、または染色体に組込まれなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされている他のタンパク質の発現、例えば抗生物質マーカーも考慮しなければならない。発現制御配列を選択するには、種々の因子を考慮しなければならない。それには例えば、配列の相当する強度、その制御性、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との適合性、特に可能な二次構造に関するものがある。宿主は、その選択したベクターとの適合性、ヌクレオチドによってコードされる産物の毒性、その分泌特性、ポリペプチドが正しく折り畳まれる能力、発酵または培養要件、およびヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製の容易さを考慮して選択すべきである。組換えベクターは自律的に複製するベクター、即ち染色体外物質として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。別のベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに組込まれ、組込まれた染色体(群)と一緒に複製されるものである。ベクターは好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の転写に要する別のセグメントと作動可能に連結されている発現ベクターである。ベクターは典型的には、プラスミドまたはウイルスＤＮＡから得られる。本明細書に記載している宿主細胞での発現に適した多くの発現ベクターが市販され、または文献に記載されている。真核生物宿主のための有用な発現ベクターには例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターがある。具体的ベクターは例えば、pCDNA3.1(+) Hyg(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)および pCI-neo(Stratagene、La Jolla、CA、USA)である。酵母細胞に有用な発現ベクターには、2μプラスミドおよびその誘導体、POT1 ベクター(US 4,931,373)、Okkels、Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996に記載されているpJSO37 ベクター、およびpPICZ A、B またはC(Invitrogen)が含まれる。昆虫細胞に有用な発現ベクターには、pVL941、pBG311(Cate et al.、“Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, pp. 685-98 (1986)、pBluebac 4.5 および pMelbac(両者ともInvitrogenから入手可能)がある。細菌宿主に有用な発現ベクターには、既知の細胞プラスミド、例えばPBR322、pET3aおよびpET12a(両者ともNovagen Inc., WI, USAから得られる)を含むE.coli由来のプラスミド、より広範な宿主プラスミド、例えばRP4、ファージDNA、例えばラムダファージの多数の誘導体、例えばNM989および他のDNAファージ、例えばM13および線状一本鎖DNAファージがある。
【０１６１】
本発明に使用される他のベクターには、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をコピー数に増幅できるものがある。このような増幅可能なベクターは当分野で良く知られている。それには例えば、DHFR増幅によって増幅され得るベクター(例えば、Kaufman, U.S. Pat. No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression"、Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19(1982)を参照)、およびグルタミンシンテターゼ(「GS」)増幅(例えば、US 5,122,464および EP 338,841を参照)がある。
【０１６２】
組換えベクターはさらに、ベクターを問題の宿主細胞にて複製できるＤＮＡ配列を有していてもよい。そのような配列の例としては(宿主細胞が哺乳類細胞の場合)、SV40複製起点がある。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターを複製できる適当な配列は酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP 1-3および複製起点である。
【０１６３】
ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を相補する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR) をコードする遺伝子またはSchizosaccharomyces pombe TPI遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130に記載)、またはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含んでいてもよい。Saccharomyces cerevisiaeの選択マーカーにはura3とleu2が含まれる。糸状菌類の選択マーカーには、amdS、pyrG、arcB、niaD および sCがある。
【０１６４】
「制御配列」という用語は本明細書では、本発明のポリペプチドを発現させるのに必要なまたは有益なすべての成分を包含するものと定義される。各制御配列は天然でも、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって外来性でもよい。このような制御配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターがあるが、これらに限定されない。最小限度、制御配列はプロモーターを含む。本発明では、広範な発現制御配列を使用できる。このような有用な発現制御配列には、上記の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列、および原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御すると知られているあらゆる配列、およびそれらの種々の組合わせがある。哺乳類細胞において転写を指令するのに適当な制御配列の例としては、SV40およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス2主要後期プロモーター、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス先発型初期遺伝子プロモーターCMV)、ヒト伸張因子１α(EF-1α)プロモーター、Drosophila最小熱ショックタンパク質70プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ヒトユビキチンC(UbC)プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデノウイルス Elb 領域ポリアデニル化シグナルおよびKozak共通配列(Kozak、M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50)などが挙げられる。哺乳類細胞における発現を改良するには、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'非翻訳領域に合成イントロンを挿入すればよい。合成イントロンの例としては、プラスミドpCI-Neo由来の合成イントロンがある(Promega Corporation、WI、USAから入手可能)。昆虫細胞において転写させるのに適当な制御配列の例としては、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、Autographa californicaポリヘドロシスウイルス塩基性タンパク質プロモーター、バキュロウイルス先発型初期遺伝子1 プロモーター、バキュロウイルス39K後発型初期遺伝子プロモーター、およびSV40ポリアデニル化配列が挙げられる。酵母細胞において有用な適当な制御配列の例としては、酵母α-交配系のプロモーター群、酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ(TPI)プロモーター、酵母解糖系遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター群、ADH2-4c プロモーター、および誘導性GALプロモーターなどが挙げられる。糸状菌宿主細胞において有用な適当な制御配列の例としては、ADH3プロモーターおよびターミネーター、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼまたはアルカリホスファターゼ、A. niger α-アミラーゼ、A. niger またはA. nidulansグルコアミラーゼ、A. nidulansアセトアミダーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、TPI1ターミネーターおよびADH3ターミネーターが挙げられる。細菌宿主細胞において使用する適当な制御配列の例としては、lacシステム、trpシステム、TACまたはTRCシステムのプロモーターおよびラムダファージの主要プロモーター領域が挙げられる。
【０１６５】
シグナルペプチドの存在または不存在は、例えば、発現させようとするポリペプチド、タンパク質(それが細胞内または細胞外タンパク質のいずれでも)の産生に使用される発現宿主細胞に、およびそれが分泌されるのを望むか否かによって変動する。糸状菌において使用するには、シグナルペプチドは通常、Aspergillus sp.アミラーゼまたはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、Rhizomucor mieheiリパーゼまたはプロテアーゼまたはHumicola lanuginosaリパーゼをコードする遺伝子から誘導できる。シグナルペプチドは好ましくは、A. oryzae TAKAアミラーゼ、A. niger中性α-アミラーゼ、A. niger酸安定アミラーゼ、またはA. nigerグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導する。昆虫細胞において使用するには、シグナルペプチドは通常、昆虫遺伝子(WO 90/05783を参照)、例えばlepidopteran Manduca sexta脂質動員ホルモン前駆体(US 5,023,328)、ミツバチメリチン(Invitrogen)、エクジステロイドUDPグルコシルトランスフェラーゼ(egt)(Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993)またはヒト膵リパーゼ(hpl)(Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997)から得られる。哺乳類細胞において使用される好ましいシグナルペプチドは、ＧＨのもの、またはマウスＩｇカッパー軽鎖シグナルペプチド(Coloma、M (1992) J. Imm. Methods 152:89-104)である。酵母細胞にて使用するのに適したシグナルペプチドは、S. cereviciae由来のα-因子シグナルペプチド(US 4,870,008参照)、修飾カルボキシペプチダーゼ シグナルペプチド(L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897を参照)、酵母BAR1 シグナルペプチド(WO 87/02670を参照)、および酵母アスパラギン酸プロテアーゼ 3 (YAP3) シグナルペプチド(M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137を参照)および合成リーダー配列TA57(WO98/32867)であることが見出されている。E.coli細胞において使用するために適当なシグナルペプチドは、シグナルペプチドompAであることが見出されている(EP 581 821)。
【０１６６】
部位特異的突然変異誘発、合成、ＰＣＲまたは他の方法により調製される本発明のＧＨポリペプチド、特にＧＨ変異体をコードする本発明のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもいなくてもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチドが、発現される宿主細胞から分泌されるときに存在する。このようなシグナル配列は、存在するならば、ポリペプチドの発現に関して選択される細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドはポリペプチドと同種(例えば、通常、ＧＨに関連したもの)または異種(すなわちヒトと別の起源由来)であってよく、あるいは宿主細胞に対して同種または異種、すなわち、宿主細胞から通常に発現されるものあるいは宿主細胞から通常には発現されないものであってよい。したがって、シグナルペプチドは原核生物、例えばE.coliなどの細菌由来であっても、あるいは真核生物、例えば哺乳類、または昆虫または酵母細胞由来であってもよい。
【０１６７】
細菌、真菌(酵母を含む)、植物、昆虫、哺乳動物、または他の動物細胞または適当な動物セルラインもしくは別のセルラインを含む、いかなる適切な宿主を用いて本発明のＧＨポリペプチド(特にＧＨ変異体)を産生してもよい。細菌宿主細胞の例には、グラム陽性細菌、例えばバチルス属、例えばB.brevisまたは枯草菌、シュードモナス属またはストレプトミセス属、あるいはグラム陰性細菌、例えば大腸菌株が含まれる。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により(例えばChangおよびCohen, 1979, Molecular General Genetics 168：111-115を参照)、コンピテント細胞(例えばYoungおよびSpizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81：823-829またはDubnauおよびDavidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56：209-221を参照)、エレクトロポレーション(例えばShigekawaおよびDower, 1988, Biotechniques 6：742-751を参照)、またはコンジュゲート化(例えばKoehlerおよびThorne, 1987, Journal of Bacteriology 169：5771-5278を参照)を用いて行ってもよい。
【０１６８】
適切な糸状菌宿主細胞の例には、アスペルギルス属の株、例えば、A.oryzae、A.nigerまたはA.nidulans、フザリウム属あるいはトリコデルマ属が含まれる。真菌細胞は、本質的に既知の方法でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を伴う方法により、形質転換することが可能である。アスペルギルス属宿主細胞に適した形質転換法は、EP 238 023およびUS 5,679,543に記載される。フザリウム属種の形質転換に適した方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78：147-156およびWO 96/00787に記載される。適当な酵母宿主細胞の例としては、サッカロマイセス、例えばS. cerevisiae、Schizosaccharomyces、Klyveromyces、Pichia、例えばP. pastoris または P. methanolica、Hansenula、例えば H. polymorpha または Yarrowiaが挙げられる。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920に記載されている方法を用いて、Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA (YeastmakerTM Yeast Transformation System Kitについての製品プロトコール中)により開示されているように形質転換することが可能である。適当な昆虫宿主細胞の例としては、鱗翅目(Lepidoptora)セルライン、例えばSpodoptera frugiperda(Sf9 または Sf21)またはTrichoplusioa ni 細胞(High Five)(US 5,077,214)が挙げられる。昆虫細胞を形質転換し、異種のポリペプチドをそこで産生させることは、Invitrogenにより開示されているようにして行うことができる。適当な哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)セルライン、(例えばCHO-K1; ATCC CCL-61)、ミドリザルセルライン(COS)(例えば COS 1 (ATCC CRL-1650)、COS 7 (ATCC CRL-1651))；マウス細胞 (例えば NS/O)、幼若ハムスター腎 (BHK) セルライン (例えば ATCC CRL-1632または ATCC CCL-10)、およびヒト細胞 (例えば HEK 293 (ATCC CRL-1573))、ならびに組織培養における植物細胞などが挙げられる。さらに、US 5,047,335に記載のように、ＧＨポリペプチドの改良されたグリコシル化をもたらすために、CHO細胞などの哺乳類細胞を修飾してシアリルトランスフェラーゼ、例えば１,６−シアリルトランスフェラーゼを発現させることができる。さらに適当なセルラインは当業者に既知であり、例えばAmerican Type Culture Collection, Rockwille, Maryland, USAのような公の寄託機関から入手可能である。外来性DNAを哺乳類宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、ウイルスベクターおよびLipofectamin 2000を使用するLife Technologies Ltd, Paisley, UK に記載されているトランスフェクション法などがある。これらの方法は当分野で周知であり、例えばAusbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAに記載されている。哺乳類細胞の培養は、確立された方法、例えばAnimal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999、Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USAおよびHarrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press, 1997に記載されているようにして行う。
【０１６９】
本発明の生産方法では、当分野で既知の方法によりポリペプチド産生に適した栄養培地中で細胞を培養する。例えば細胞は、フラスコ振盪培養、小規模または大規模発酵(例えば、連続、バッチ、床バッチ、または固体状態発酵)など、研究室または工業用発酵槽において培養し、ポリペプチドが発現および／または単離できるに適した培地および条件下に行う。培養は当業者に既知の手法により、炭素および窒素原および無機塩を含む適当な栄養培地において行う。適当な培地は市販品として入手可能であり、または開示されている組成(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従って調製することができる。ポリペプチドが栄養培地に分泌されるなら、そのポリペプチドは培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、細胞溶解により回収することができる。
【０１７０】
得られたポリペプチドは当分野で既知の方法により回収できる。例えばポリペプチドは、遠心、濾過、抽出、スプレー乾燥、留去または沈降などの通常の手法(これらに限定されない)によって栄養培地から回収することができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除)、電気泳動法(例えば、調製用等電点電気泳動)、示差溶解性(例えば硫安沈殿)、SDS-PAGEまたは抽出(例えばProtein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照)などの当分野で既知の種々の手法(これらに限定されない)によって精製することができる。サイトカインポリペプチドの特異的精製法は、Human Cytokines, Handbook of Basic and Clinical Research, Volume II, Blackwell Science, Eds. Aggarwal and Gutterman, 1996, pp. 19-42に記載されている。
【０１７１】
本発明のコンジュゲートの均一な調製物
好ましくは、本発明のコンジュゲートは実質的に均一な調製物の形態で提供される。本発明の文脈における「実質的に均一な調製物」は、通常、適当な緩衝液中で、５０％を越える、例えば７５％を越えるおよび好ましくは８５％を越える、または９０％を越える同一のコンジュゲートを含む調製物、すなわちコンジュゲート化の程度および性質が同じである調製物である。実質的に均一な調製物は、ポリペプチドに比べモル過剰な高分子物質の存在下でコンジュゲート化を行うときに、選択した高分子物質に全ての結合基がコンジュゲート化され得るような方法で、本発明のＧＨポリペプチド、特にＧＨ変異体が、分子表面に位置する必要数の結合基を含むことを確保することにより、好都合に得られる。好ましくは、本発明のこの態様において用いられる高分子物質はポリマー分子である。
【０１７２】
薬学的使用および製剤
さらに別の態様において本発明は、ＧＨ分子、すなわち特に本発明のＧＨコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。さらに本発明は、薬剤として使用するＧＨ分子、特に本発明のＧＨコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。従って、１つの態様において、本発明に従うＧＨポリペプチド、ＧＨコンジュゲートまたは医薬組成物は、病気を治療(場合により予防も含む)するための、特にＧＨ欠乏症を治療するための薬剤の製造に用いられる。このような病気(傷害も含む)には、ＧＨ欠乏および/またはＧＨ不全により引き起こされる不十分な成長(例えば、ＧＨＤ/ＧＨＩ小児)が含まれる。さらに、本発明のコンジュゲートは、ターナー症候群、大人におけるＧＨ欠乏症(すなわちＧＨＤＡ)、軟骨形成不全症、小児の腎不全を含む慢性腎不全、ＡＩＤＳのるいそうの治療およびＡＩＤＳ患者の悪液質および他の病気と関連した悪液質の治療に用いてもよい。また、本発明のコンジュゲートを用いて食欲抑制、例えば低脂肪食摂取中の人に対する薬剤、所望により抗糖尿病薬または他の食欲抑制性または満腹感惹起性薬物をも含む薬剤を製造してもよい。さらに本発明のコンジュゲートを用いて、哺乳動物、特にヒトにおいて仮骨延長と同時に骨形成を促進するための薬剤を製造することができる。さらに別の態様において、本発明のコンジュゲートを用いて、仮骨延長術を受ける哺乳動物において骨折の治癒を高めるための薬剤を製造することができ、好ましくは、この場合本発明のコンジュゲートは延長術の処置と同時に投与される。さらに別の態様において、本発明のコンジュゲートはhＧＨのアンタゴニストであり、ＧＨの過剰産生を伴う病気、例えば癌または炎症状態を治療する薬剤の製造に用いることができる。別の態様において、本発明のポリペプチド、特にコンジュゲートは上記の病気を有する哺乳動物の治療方法において用いられ、該方法は本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは医薬組成物を、それらを必要とする哺乳動物に投与することからなる。
【０１７３】
本発明のＧＨポリペプチドの治療用製剤(本発明の医薬組成物を含む)は、好ましくは１またはそれ以上の薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む組成物で投与する。このような医薬組成物は、本質的に当分野で既知の方法により製造され、十分な保存安定性を有しヒトまたは動物への投与に適しているポリペプチド薬剤を得ることができる。本明細書の文脈における「薬学的に許容しうる」は、用いられる用量および濃度で、投与される患者にいかなる不利な影響も引き起こさない担体または賦形剤を意味する。こうした薬学的に許容しうる担体および賦形剤は、当分野で良く知られている(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]を参照)。本発明のポリペプチドの製剤は、例えばWO 9611702、WO 9611703、WO 9611704、WO 9639173、WO 9702833、WO 9746252、WO 9703692(例えば、亜鉛および所望によりリジンおよびカルシウムイオンで前処理された本発明のＧＨポリペプチドを含む医薬組成物)またはWO 9739768に開示されているであろう。
【０１７４】
薬物の形態
本発明のポリペプチドは、「そのまま」で、および／またはその塩の形態で用いてもよい。適切な塩には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩ならびに例えば亜鉛塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの塩または複合体は、結晶および／または無定形構造として存在してもよい。
【０１７５】
用量
本発明のポリペプチドおよびコンジュゲートは、薬学的有効量が患者に投与されるであろう。本明細書中の「薬学的有効量」は、投与される状態に対して所望の効果をもたらすに十分な用量を意味する。正確な用量は、治療すべき障害（異常）に応じ、既知の方法を用いて当業者により確かめられるであろう。１つの態様において、例えば、本発明のコンジュゲートの用量は、毎日の投与として、または好ましくは毎日より少ない投与として、例えば週に１〜５回、例えば１〜３または１〜２回、例えば週に２〜３回または週に１回、または最大もしくは最小約５、１０、１５、２０、２５または３０日毎に、ポリペプチドを約0.001〜約2.0 mg/kg(体重)、または約0.01〜約1.0 mg/kg(体重)の範囲での用量に対応している。この用量は単一用量として投与するかまたは一日のうちに繰り返される用量として投与してもよい。例えば、病気または病状の治療は、既に列記した通りである。
【０１７６】
薬物の混合
本発明の薬剤組成物は、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。これらの薬物は、同一の医薬組成物の一部として取り込まれていてもよいし、あるいは本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートと別個に、同時にまたは他の治療計画にしたがい、投与してもよい。さらに、本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは医薬組成物は、他の療法の補助的薬物として用いてもよい。
【０１７７】
患者
本発明の目的のための「患者」には、ヒトおよび他の哺乳動物が含まれる。ゆえに本法はヒトの治療および獣医学的用途の両者に適用される。
【０１７８】
組成物の型および投与経路
本発明のポリペプチドの医薬組成物は、多様な形態、例えば液体、ゲル、凍結乾燥物中に、または圧縮固体として処方してもよい。好ましい型は、治療される特定の適応症に応じるであろうし、当業者は容易に決定し得るであろう。
【０１７９】
本発明の製剤の投与は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻内、経皮、腹腔内、筋内、肺内を含むが、それに限定されない多様な方法で、またはあらゆる他の許容し得る様式で行うことが出来る。製剤は、注入により連続的に投与してもよく、静脈内ボーラスが許容し得るが、当分野で周知の技術、例えばポンプまたは移植を用いて行ってもよい。一部の例では、製剤は、溶液またはスプレーとして、直接適用される。
【０１８０】
非経口剤
医薬組成物の一例は、非経口投与用に設計された溶液である。多くの場合、医薬溶液製剤は、直後の使用に適した、液体の形態で提供されるが、このような非経口製剤は、凍結または凍結乾燥形態で提供することもできる。前者の場合、組成物は、使用前に融解しなければならない。後者の形態は、凍結乾燥調製物が、その液体対応物より一般的により安定であると当業者に認識されるように、さらに多様な保存条件下で、組成物に含まれる活性化合物の安定性を高めるために用いられることが多い。このような凍結乾燥調製物は、１以上の適切な薬学的に許容し得る希釈剤、例えば注射用滅菌水または滅菌生理食塩水溶液の添加により、使用前に再構成される。
【０１８１】
非経口剤の場合、これらは、必要に応じて、望ましい純度を有するポリペプチドを、当分野で通常用いられる１以上の薬学的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤(このすべてが「賦形剤」と称される)、例えば緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤および／または他の種々の添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液として、保存用に調製するのが好ましい。
【０１８２】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲にｐＨを維持するのを補助する。これらは、典型的には、約２ｍＭから約５０ｍＭの濃度範囲で存在する。本発明での使用に適した緩衝剤には、有機および無機酸の両方、並びにそれらの塩、例えばクエン酸緩衝剤(例えばクエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など)、コハク酸緩衝剤(例えばコハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸緩衝剤(例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸緩衝剤(例えばフマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸緩衝剤(グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など)、シュウ酸緩衝剤(例えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸緩衝剤(例えば乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など)および酢酸緩衝剤(例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など)が含まれる。さらに可能な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤およびＴrisなどのトリメチルアミン塩が含まれる。保存剤は、微生物増殖を遅延させるために添加され、そして典型的には、約０.１％〜２％(w/v)の量で添加される。本発明での使用に適した保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが含まれる。等張化剤は、液体組成物の等張性を確保するために添加され、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮し、重量０.１％〜２５％、典型的には１％〜５％の量で存在してもよい。
【０１８３】
安定化剤が存在しても良く、これは広いカテゴリーの賦形剤を指し、機能として、充填剤から、治療用薬物を可溶化するかまたは変性もしくは容器壁への接着を防ぐのを助ける添加剤までの範囲にある可能性がある。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール(上に列挙)；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オミシン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール(myoinisitol)、ガラクチトール、グリセロールなど、およびイノシトールなどのシクリトール類を含む有機糖または糖アルコール類；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド(すなわち＜１０残基)；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコースなどの単糖；ラクトース、マルトースおよびスクロースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖、およびデキストランなどの多糖であってもよい。安定化剤は、典型的には、活性タンパク質重量を基にした重量部分０.１から１０,０００の範囲で存在する。
【０１８４】
非イオン性表面活性剤または界面活性剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療用薬物を可溶化させるのを助けると共に、治療用ポリペプチドを、震蘯誘導凝集から保護するために存在してもよく、これはまた、製剤がポリペプチドの変性を引き起こすことなく、剪断表面応力に曝露されることも可能にする。適切な非イオン性表面活性剤には、ポリソルベート類(２０、８０など)、ポリオキサマー類(１８４、１８８など)、Pluronic(登録商標)ポリオール類、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類(Tween(登録商標)−２０、Tween(登録商標)−８０など)が含まれる。
【０１８５】
さらに多様な賦形剤には、充填剤または増量剤(例えばデンプン)、キレート剤(例えばＥＤＴＡ)、酸化防止剤(例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ)および共溶媒が含まれる。
【０１８６】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製された微小カプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−(メチルメタクリレート)微小カプセルに捕捉しても、コロイド性薬剤搬送系(例えばリポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)に捕捉しても、またはマクロエマルジョンに捕捉してもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(上記)に開示されている。
【０１８７】
インビボ投与に使用する非経口製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば無菌ろ過膜を通すろ過により、容易に達成される。
【０１８８】
持続放出調製物
持続放出調製物の適切な例には、本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス、フィルムまたは微小カプセルなどの適切な形態を有するマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類(例えばポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド類、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体類、分解不能エチレン−酢酸ビニル、分解可能乳酸−グリコール酸共重合体類、例えばProLease(登録商標)技術またはLupron Depot(登録商標)(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体)、ならびにポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマー類は、１００日までまたはそれを越えるような長期間、分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲル類は、より短い期間、タンパク質を放出する。被包ポリペプチドが、体内に長期間保持される場合、これらは３７℃で水分に曝露された結果、変性するかまたは凝集し、生物学的活性の損失そしておそらく免疫原性の変化を生じる可能性がある。関与する機構に応じ、安定化のための合理的戦略を工夫してもよい。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加剤を使用し、そして特定のポリマーマトリックス組成を開発することにより、達成することができる。
【０１８９】
さらに本発明は、以下の非限定的実施例により開示される。
【０１９０】
方法
[修飾すべきアミノ酸を決定するための方法]
接触可能表面積 ( ＡＳＡ )
コンピュータープログラムAccess(B.Lee and F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55：379-400(1971))バージョン２(著作権:1983 Yale University)を用いて、構造中の個々の原子の接触可能表面積(ＡＳＡ)を計算する。この方法は、典型的には、１.４オングストロームのプローブサイズを用いて、接触可能表面積(ＡＳＡ)をプローブ中心により形成される面積と定義する。この計算の前に、全ての水分子および全ての水素原子を、たんぱく質に直接関与しない他の原子と同様に座標組から除去する。
【０１９１】
側鎖原子の断片的 (fractional) ＡＳＡ
側鎖原子の断片的ＡＳＡは、側鎖における原子のＡＳＡの合計を、伸長されたＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチドにおけるその残基種の側鎖原子のＡＳＡを示す値で割ることにより、計算する。Hubbard, Campbell ＆ Thornton(1991) J. Mol. Biol. 220, 507-530を参照。この実施例に関し、ＣＡ原子は、グリシン残基の側鎖の一部とみなされるが、残りの残基に関してはみなされない。以下の値は、側鎖に対する標準１００％ ＡＳＡとして使用される：
【０１９２】
【表３】
Figure 2004524020
【０１９３】
構造中に検出されない残基は、フレキシブル領域中に常在すると考えられるため、１００％曝露を有すると通常、規定される。
【０１９４】
原子間距離の測定
原子間の距離は、分子グラフィックスソフトウェア、例えばInsightII v.98.0, MSI Inc.を用いて測定した。
【０１９５】
[ＧＨのインビトロおよびインビボ活性の測定法]
インビトロＧＨ活性のアッセイ
インビトロＧＨ活性は、ＧＨの存在下に増殖するセルラインを使用することにより測定することができる。例えば、このようなセルラインはhＧＨレセプターまたは乳腺刺激性レセプターのどちらかを発現しているものである。例えば、ヒトＧＨレセプターを発現しているマウスプロ-ＢセルラインBa/F3-hGHR(Wada et al., 1998, Mol. Endocrinol. 12, 146-156)またはラットのNb2ラットリンパ腫セルライン(Gout et al., 1980, Cancer Res. 40, 2433-2436)の増殖は、ＧＨ活性の測定に有用である。さらに、WO 99/03887はＧＨ活性の測定に有用なセルラインの構築を開示している。ＧＨに対するインビトロアッセイを開示しているWO 0042175中の実施例１またはUS 6,004,931中の実施例XIも参照。
【０１９６】
機能的インビボ半減期の測定
機能的インビボ半減期は、例えば、Clarkらにより開示されている「げっ歯動物におけるクリアランスの分析」プロトコール(1996, JBC, 271, 36, 21969-21977)を使用することにより測定することができる。
【０１９７】
アンタゴニストＧＨ活性のアッセイ
これはUS 6,004,931中、例えばExample XIIまたはexample XIIIに記載のように測定することができる。
【０１９８】
レセプター結合の測定
これはUS 6,004,931に記載のように測定することができる。
【０１９９】
分子量の測定
分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、マトリックス支援レーザー脱離質量分析または平衡遠心分離により測定することができる。適当なＳＤＳ法は、Laemmli(U.K., Nature Vol 227 (1970), p680-85)により開示されている。
【０２００】
さらに、見かけの分子量はゲル透過クロマトグラフィー(ＧＰＣ)を用いて、目的成分の保持時間を、様々な好ましくは球形のたんぱく質標準の保持時間と比較することにより推定することができる(Protein purification methods, a practical approach (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306)。
【０２０１】
ＧＨのＰＥＧ化法
ＰＥＧ化はClarkら(1996, JBC, 271, 36, 21969-21977)により開示されている方法を用いて、またはWO 93/00109 (“Methods of hGH PEGylation”)またはWO 99/03887に開示されているように達成することができる。
インビボ活性
WO 99/03887は、本発明のＧＨコンジュゲートのインビボ活性を測定に有用な動物ＧＨ欠乏モデルを開示している。
【実施例】
【０２０２】
[実施例１]
Vosら(Science 255 (1992) 306-312)により報告されている、hＧＨ分子上の２つの異なる部位に結合したレセプターの細胞外部分の２つのコピーと共に形成される複合体におけるhＧＨのＸ線構造を用いて、高分子物質(例えばＰＥＧまたはインビボグリコシル化部位)への結合部位を導入する位置または該部位を除去する位置を決定する。この構造の座標はProtein Data Bank(PDB)(Bernstein et.al. J. Mol. Biol. (1977) 112 pp. 535)から入手可能であり、「The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB」(ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ/ｐｄｂ/； 受入コード:3HHR)を通じてコンピューター上で入手することができる。hＧＨ分子の構造部分は、Ｃ末端F191残基を除く全成熟配列に及んでいる。２つのジスルフィド架橋が分子中に存在しており、残基C53とC165を結合し、C182とC185を結合している。ヒト成長ホルモンレセプター(hＧＨＲ)の細胞外部分の２つの分子の結合部位は、活性化のための結合様式を表すと考えられている。１つのhＧＨＲ分子(ラベル化Ｂ)は、「部位１」として知られるhＧＨの部位に高親和性で結合し、他のhＧＨＲ分子(ラベル化Ｃ)は「部位２」として知られるhＧＨの部位に低親和性で結合することが知られている。明らかに、hＧＨは、最初のhＧＨＲ分子が結合された後にのみ他のhＧＨＲ分子に結合するが、これは両hＧＨと既に結合したhＧＨＲ分子との相互作用によるものである可能性がある(総論としてKossiakoff and Voss, Adv. in Prot. Chem. 52, 67-108, 1999を参照)。
【０２０３】
配列への番号付与 :
この実施例で用いられる配列への番号付与は、配列番号２に示す成熟hＧＨのアミノ酸配列に従っている。
【０２０４】
表面への曝露：
ＡＳＡの計算は、hＧＨ分子単独(分子Ａ)、hＧＨ分子と２つのレセプター分子(分子ＢおよびＣ)からなる完全複合体ならびにhＧＨ１分子とhＧＨＲ１分子の２つの組み合わせ(各々ＡおよびＢ分子ならびにＡおよびＣ分子)について行った。
【０２０５】
単離されたhＧＨ分子(分子Ａ)について断片的ASA計算を行った結果、次に示す残基は、２５％を越えるその側鎖が表面に曝露していた：F1、P2、T3、I4、P5、L6、S7、R8、D11、N12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、E33、A34、Y35、P37、K38、E39、Q40、Y42、S43、L45、Q46、N47、P48、Q49、L52、E56、S57、P59、S62、N63、R64、E65、E66、Q68、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、Y103、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、G126、R127、E129、D130、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、K140、Q141、Y143、K145、D147、D154、A155、L156、K158、N159、G161、K168、D171、T175、R178、C182、R183、E186、G187およびG190. 次に示す残基は、５０％を越えるその側鎖が表面に曝露していた: F1、P2、T3、I4、P5、S7、R8、D11、N12、L15、H18、F25、Q29、E33、Y35、P37、K38、E39、Y42、S43、Q46、N47、P48、Q49、L52、S57、S62、N63、R64、E65、Q69、E88、Q91、R94、S95、N99、L101、Y103、S108、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、K158、D171、T175、R178、E186、G187およびG190。
【０２０６】
hＧＨ分子と２つのレセプター(すなわちhＧＨＲ)分子間の複合体について断片的ASA計算を行った結果、次に示すhＧＨ中の残基は２５％を越えるその側鎖が表面に曝露していた：F1、T3、P5、L6、S7、D11、Q22、D26、Q29、E30、E33、A34、Y35、P37、K38、E39、Q40、S43、Q46、N47、P48、Q49、L52、E56、S57、P59、N63、R64、E65、E66、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、Y103、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、Q122、G126、R127、E129、D130、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、K140、Q141、Y143、K145、D147、D154、A155、L156、K158、N159、G161、R183、E186、G187およびG190. 次に示す残基は、５０％を越えるその側鎖が表面に曝露していた: T3、P5、S7、Q29、E33、Y35、P37、K38、E39、S43、N47、P48、Q49、L52、S57、E65、Q69、E88、Q91、R94、S95、N99、L101、Y103、S108、D112、K115、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、K158、E186、G187およびG190.
【０２０７】
hＧＨ分子とhＧＨＲ分子Ｂ(高親和性「部位１」)間の複合体について部分的ＡＳＡ計算を行った結果、次に示すhＧＨ中の残基は２５％を越えるその側鎖が表面に曝露していた： F1、P2、T3、I4、P5、L6、S7、R8、D11、N12、L15、R16、R19、Q22、D26、Q29、E30、E33、A34、Y35、P37、K38、E39、Q40、S43、Q46、N47、P48、Q49、L52、E56、S57、P59、N63、R64、E65、E66、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、Y103、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、G126、R127、E129、D130、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、K140、Q141、Y143、K145、D147、D154、A155、L156、K158、N159、G161、R183、E186、G187、G190。次に示す残基は、５０％を越えるその側鎖が表面に曝露していた: F1、P2、T3、I4、P5、S7、R8、D11、N12、L15、Q29、E33、Y35、P37、K38、E39、S43、N47、P48、Q49、L52、S57、E65、Q69、E88、Q91、R94、S95、N99、L101、Y103、S108、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、K158、E186、G187、G190。
【０２０８】
hＧＨ分子とhＧＨＲ分子Ｃ(低親和性「部位２」)間の複合体について断片的ASA計算を行った結果、次に示すhＧＨ中の残基は２５％を越えるその側鎖が表面に曝露していた：F1、T3、P5、L6、S7、D11、H18、Q22、F25、D26、Q29、E30、E33、A34、Y35、P37、K38、E39、Q40、Y42、S43、L45、Q46、N47、P48、Q49、L52、E56、S57、P59、S62、N63、R64、E65、E66、Q68、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、Y103、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、Q122、G126、R127、E129、D130、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、K140、Q141、Y143、K145、D147、D154、A155、L156、K158、N159、G161、K168、D171、T175、R178、C182、R183、E186、G187、G190. 次に示す残基は、５０％を越えるその側鎖が表面に曝露していた: T3、P5、S7、H18、F25、Q29、E33、Y35、P37、K38、E39、Y42、S43、Q46、N47、P48、Q49、L52、S57、S62、N63、R64、E65、Q69、E88、Q91、R94、S95、N99、L101、Y103、S108、D112、K115、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、K158、D171、T175、R178、E186、G187、G190。
【０２０９】
レセプター結合部位：
レセプター分子と相互作用する側鎖原子を有するhＧＨ中の残基は、単離されたhＧＨ分子に対するＡＳＡ計算結果と比較して、複合体のＡＳＡ計算結果において変化した側鎖ＡＳＡを有する残基として定義することができる。それらの残基は次に示す通りである: F1、P2、I4、P5、R8、L9、D11、N12、A13、M14、L15、R16、H18、R19、H21、Q22、F25、D26、Q29、K41、Y42、L45、Q46、P48、S51、E56、S62、N63、R64、E65、T67、Q68、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124、R127、Y164、R167、K168、D171、K172、E174、T175、F176、R178、I179、C182、R183、E186、C189、G190。換言すれば、これら残基はレセプター結合部位に属すると考えられる。２５％を越える側鎖ＡＳＡを依然として有する、次のリストにある残基：F1、P5、D11、Q22、D26、Q29、Q46、P48、E56、N63、R64、E65、Y103、D116、E119、R127、R183、E186、G190、またはさらに５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する残基：P5、Q29、P48、E65、Y103、E186、G190は、レセプター結合部位の端に位置していると考えられる。
【０２１０】
レセプター結合部位は、その構造中の２つのhＧＨＲ各々との相互作用に基づいて２つに分割することができる。上記と同様の考えに基づき、hＧＨ単独とＢ分子(高親和性「部位１」)のみを含む計算結果との間で側鎖ＡＳＡが変化した残基は次の通りである：M14、H18、H21、Q22、F25、D26、Q29、K41、Y42、L45、Q46、P48、S51、E56、S62、N63、R64、E65、T67、Q68、Y164、R167、K168、D171、K172、E174、T175、F176、R178、I179、C182、R183、E186、C189、G190。換言すれば、これらの残基はレセプター結合「部位１」に属すると考えられる。単離されたhＧＨとＣ分子(低親和性「部位２」)のみを含む計算結果との間で側鎖ＡＳＡが変化した残基は次の通りである: F1、P2、I4、P5、R8、L9、D11、N12、A13、L15、R16、H18、R19、Q22、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124、R127。換言すれば、これらの残基はレセプター結合「部位２」に属すると考えられる。これらのリストから理解されるように、残基H18とQ22は両レセプター分子と相互作用を有する。
【０２１１】
[リジン残基の導入/除去]
リジン残基の除去
hＧＨは９つのリジンを含む。１つの態様において、1またはそれ以上のリジン残基は、該残基への高分子物質の結合を回避するために、好ましくはあらゆる他のアミノ酸残基への置換により、好ましくはアルギニンへの置換により除去される。従って、K38、K41、K70、K115、K140、K145、K158、K168およびK172からなる群から選択される少なくとも１つのリジン残基が除去される。特に重要であるのは、レセプター結合部位の1またはそれ以上のリジン、すなわちK41, K168およびK172からなる群から選択されるリジンの除去である。
【０２１２】
結合基を導入するための、好ましくは置換によるリジンの導入
表面に曝露した残基のリジン残基への置換は、リジン反応性高分子物質への新しい可能性な結合ポイントを導入するであろう。特に重要であるのは、hＧＨと２つのレセプター分子の間の複合体構造においてその側鎖が表面に曝露している残基である。より好ましくは、２５％を越える側鎖ＡＳＡを有する、さらに好ましくは５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する残基である。好ましくは、1またはそれ以上のリジン残基、例えば１、２、３、４、５またはそれ以上のリジン残基を、下記リスト中に同定される1またはそれ以上のアミノ酸残基と置換することにより導入する。
【０２１３】
次に示す非リジン残基は２５％を越える側鎖ＡＳＡを有し、リジンへの置換の標的である：F1、T3、P5、L6、S7、D11、Q22、D26、Q29、E30、E33、A34、Y35、P37、E39、Q40、S43、Q46、N47、P48、Q49、L52、E56、S57、P59、N63、R64、E65、E66、Q69、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、Y103、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、D116、E119、Q122、G126、R127、E129、D130、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、Q141、Y143、D147、D154、A155、L156、N159、G161、R183、E186、G187およびG190。５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する、より好ましい非リジン残基は次の通りである：T3、P5、S7、Q29、E33、Y35、P37、E39、S43、N47、P48、Q49、L52、S57、E65、Q69、E88、Q91、R94、S95、N99、L101、Y103、S108、D112、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、E186、G187、G190。これらのリストから、アルギニン残基を含む位置、すなわちR64、R94、R127、R134、R183で、より好ましくはR94および／またはR134で置換を行うのが、さらに好ましい。また、残基側鎖がレセプター界面の一部として規定される位置で突然変異を行わないのが好ましい。この結果、突然変異誘発の標的となる、２５％を越える側鎖ＡＳＡを有する、非リジン残基は次の通りである：T3、L6、S7、E30、E33、A34、Y35、P37、E39、Q40、S43、N47、Q49、L52、S57、P59、E66、Q69、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、Q122、G126、E129、D130、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、Q141、Y143、D147、D154、A155、L156、N159、G161、G187、T142。より好ましくは、５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する非リジン残基は次の通りである：T3、S7、E33、Y35、P37、K38、E39、S43、N47、Q49、L52、S57、Q69、E88、Q91、R94、S95、N99、L101、S108、D112、K115、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、K158、G187。これらのリストから、アルギニン残基を含む位置、すなわちR94および／またはR134で置換を行うのが、より好ましい。
【０２１４】
[グリコシル化部位]
Ｎ−グリコシル化部位の導入
hＧＨはＮ−グリコシル化部位を含まない。Ｎ−グリコシル化部位は、上記の、特に「定義」「高分子物質がオリゴサッカライド部分である本発明のコンジュゲート」の部に開示したように、1または２の残基の突然変異により導入することができる。hＧＨと２つのレセプター分子間の複合体についての計算において、残基を「Ｎ」とすべき部位が２５％を越える側鎖ＡＳＡを有し、「Ｘ」と「Ｚ」がＰではなくて突然変異させる残基のどれもがジスルフィド架橋に関与するCysでない部位が、グリコシル化部位のＮ残基を導入するための突然変異誘発の標的である：T3、P5、L6、S7、D11、Q22、D26、Q29、E30、E33、Y35、P37、K38、E39、Q40、S43、Q46、P48、Q49、L52、S57、P59、N63、R64、E65、E66、Q69、K70、S71、E74、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、Y103、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、Q122、G126、R127、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、K140、Q141、Y143、K145、D147、D154、A155、L156、K158、N159、G161、R183およびE186。これは、以下に示すものからなる群から選択される、対応する突然変異により行うことができる：T3N+P5S/T、P5N、P5N+S5T、L6N+R8S/T、S7N+L9S/T、D11N+A13S/T、Q22N+A24S/T、D26N+Y28S/T、Q29N+F31S/T、E30N+E32S/T、E33N+Y35S/T、Y35N+P37S/T、P37N+E39S/T、K38N+Q40S/T、E39N+K41S/T、Q40N+Y42S/T、S43N+L45S/T、Q46N+P48S/T、P48N+T50S、P48N、Q49N、Q49N+S51T、L52N+F54S/T、S57N+P59S/T、P59N+P61S/T、E65S/T、R64N+E66S/T、E65N+T67S、E65N、E66N+Q68S/T、Q69N、Q69N+S71T、K70N+N72S/T、S71N+L73S/T、E74N+L76S/T、Q91N+L93S/T、F92N+R94S/T、R94N+V96S/T、S95N+F97S/T、A98N、A98N+S100T、L101S/T、L101N+Y103S/T、Y103N+A105S/T、G104N、G104N+S106T、S106N、S106N+S108T、D107N+N109S/T、S108N+V110S/T、Y111S/T、Y111N+L113S/T、D112N+L114S/T、K115N+L117S/T、D116N+E118S/T、E119N+I121S/T、Q122N+L124S/T、G126N+L128S/T、R127N+E129S/T、E129N+G131S/T、G131N+P133S/T、P133N+T135S、P133N、R134N+G136S/T、T135N+Q137S/T、G136N+I138S/T、Q137N+F139S/T、K140N+T142S、K140N、Q141N+Y143S/T、Y143N+K145S/T、K145N+D147S/T、D147N+N149S/T、D154N+L156S/T、A155N+L157S/T、L156N+K158S/T、K158N+Y160S/T、G161S/T、G161N+L163S/T、R183N+V185S/T、E186NおよびE186N+S188T。さらに好ましいのは、残基を「Ｎ」とすべき位置が５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する位置である： T3、P5、S7、Q29、E33、Y35、P37、K38、E39、S43、P48、Q49、L52、S57、E65、Q69、Q91、R94、S95、N99、L101、Y103、S108、D112、K115、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155、K158およびE186。これは、以下に示すものからなる群から選択される、対応する突然変異により行うことができる：T3N+P5S/T、P5N、P5N+S5T、S7N+L9S/T、Q29N+F31S/T、E33N+Y35S/T、Y35N+P37S/T、P37N+E39S/T、K38N+Q40S/T、E39N+K41S/T、S43N+L45S/T、P48N+T50S、P48N、Q49N、Q49N+S51T、L52N+F54S/T、S57N+P59S/T、E65N+T67S、E65N、Q69N、Q69N+S71T、Q91N+L93S/T、F92N+R94S/T、R94N+V96S/T、S95N+F97S/T、L101S/T、L101N+Y103S/T、Y103N+A105S/T、S108N+V110S/T、D112N+L114S/T、K115N+L117S/T、Q122N+L124S/T、G126N+L128S/T、E129N+G131S/T、G131N+P133S/T、P133N+T135S、P133N、R134N+G136S/T、T135N+Q137S/T、G136N+I138S/T、Y143N+K145S/T、D147N+N149S/T、D154N+L156S/T、A155N+L157S/T、K158N+Y160S/T、E186NおよびE186N+S188T。
【０２１５】
これらのリストから、「位置１」または「位置３」においてＮまたはＳ/Ｔを既に保持している位置にＮ−グリコシル化部位を導入するのがより好ましい：P5、P48、Q49、N63、E65、Q69、A98、N99、G104、S106、N109、P133、K140、N159およびE186(２５％を越える側鎖ＡＳＡを有する)、より好ましくはP5、P48、Q49、E65、Q69、N99、P133およびE186(５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する)。 これは、以下に示すものからなる群から選択される、対応する突然変異により行うことができる：P5N、P48N、Q49N、E65S/T、E65N、Q69N、A98N、L101S/T、G104N、S106N、Y111S/T、P133N、K140N、G161S/TおよびE186N、より好ましくは、次のものからなる群から選択される：P5N、P48N、Q49N、E65N、Q69N、L101S/T、P133NおよびE186N。
【０２１６】
従って、導入されたＮ残基との相対的な位置＋２にＳまたはＴ残基を位置＋２に含まない、上記リストにおけるあらゆる他の位置のために、Ｓまたは好ましくはＴ残基がそのような位置に導入されるであろう(Ｎ残基の導入に加えて)ことが理解されるであろう。
【０２１７】
さらに、「Ｎ」とすべき残基が、レセプター界面部分として規定されるその側鎖を有する位置にＮ−グリコシル化部位を導入しないのが好ましいであろう。この結果、以下の位置(hＧＨと２つのレセプター分子間の複合体についての計算で２５％を越える側鎖ＡＳＡを有し、「Ｘ」および「Ｚ」がPではなく、突然変異がなされるいずれの残基もジスルフィド架橋に関与するCysではない)が、新たに可能性あるグリコシル化部位を導入するための突然変異誘発への標的である: T3、L6、S7、E30、E33、Y35、P37、K38、E39、Q40、S43、Q49、L52、S57、P59、E66、Q69、K70、S71、E74、Q91、F92、R94、S95、A98、N99、L101、G104、S106、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Q137、K140、Q141、Y143、K145、D147、D154、A155、L156、K158、N159および／またはG161。これは、T3N+P5S/T、L6N+R8S/T、S7N+L9S/T、E30N+E32S/T、E33N+Y35S/T、Y35N+P37S/T、P37N+E39S/T、K38N+Q40S/T、E39N+K41S/T、Q40N+Y42S/T、S43N+L45S/T、Q49N、Q49N+S51T、L52N+F54S/T、S57N+P59S/T、P59N+P61S/T、E66N+Q68S/T、Q69N、Q69N+S71T、K70N+N72S/T、S71N+L73S/T、E74N+L76S/T、Q91N+L93S/T、F92N+R94S/T、R94N+V96S/T、S95N+F97S/T、A98N、A98N+S100T、L101S/T、L101N+Y103S/T、G104N、G104N+S106T、S106N、S106N+S108T、D107N+N109S/T、S108N+V110S/T、Y111S/T、Y111N+L113S/T、D112N+L114S/T、K115N+L117S/T、Q122N+L124S/T、G126N+L128S/T、E129N+G131S/T、G131N+P133S/T、P133N+T135S、P133N、R134N+G136S/T、T135N+Q137S/T、G136N+I138S/T、Q137N+F139S/T、K140N+T142S、K140N、Q141N+Y143S/T、Y143N+K145S/T、K145N+D147S/T、D147N+N149S/T、D154N+L156S/T、A155N+L157S/T、L156N+K158S/T、K158N+Y160S/T、G161S/TおよびG161N+L163S/Tからなる群から選択される、対応する突然変異により行うことができる。
【０２１８】
さらに、「Ｎ」とすべき残基が５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する次の位置がより好ましい：T3、S7、E33、Y35、P37、K38、E39、S43、Q49、L52、S57、Q69、Q91、R94、S95、N99、L101、S108、D112、K115、Q122、G126、E129、G131、P133、R134、T135、G136、Y143、D147、D154、A155および/またはK158。これは、T3N+P5S/T、S7N+L9S/T、E33N+Y35S/T、Y35N+P37S/T、P37N+E39S/T、K38N+Q40S/T、E39N+K41S/T、S43N+L45S/T、Q49N、Q49N+S51T、L52N+F54S/T、S57N+P59S/T、Q69N、Q69N+S71T、Q91N+L93S/T、R94N+V96S/T、S95N+F97S/T、L101S/T、L101N+Y103S/T、S108N+V110S/T、D112N+L114S/T、K115N+L117S/T、Q122N+L124S/T、G126N+L128S/T、E129N+G131S/T、G131N+P133S/T、P133N+T135S、P133N、R134N+G136S/T、T135N+Q137S/T、G136N+I138S/T、Y143N+K145S/T、D147N+N149S/T、D154N+L156S/T、A155N+L157S/T、K158N+Y160S/Tからなる群から選択される、対応する突然変異により行うことができる。
【０２１９】
これらのリストから、「位置１」または「位置３」にＮまたはＳ/Ｔを既に保持している位置にＮ−グリコシル化部位を導入するのが、より好ましい：Q49、Q69、A98、N99、G104、S106、N109、P133、K140および／またはN159(２５％を越える側鎖ＡＳＡを有する)、より好ましくはQ49、Q69、N99および/またはP133(５０％を越える側鎖ＡＳＡを有する)。これは、Q49N、Q69N、A98N、L101S/T、G104N、S106N、Y111S/T、P133N、K140N、G161S/Tからなる群から選択される、より好ましくはQ49N、Q69N、L101S/T、P133Nからなる群から選択される、対応する突然変異により行うことができる。

Claims (88)

  1. (第一)高分子物質への結合基を有し、野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置と等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置に導入されている、少なくとも１つの導入非システインアミノ酸残基を含む成長ホルモンポリペプチド変異体(ＧＨ変異体)のコンジュゲートであって、非システインアミノ酸残基と反応性の少なくとも１つの(第一)高分子物質をも含むコンジュゲート。
  2. 導入位置が、hＧＨ単独のモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 導入位置が、hＧＨがその２つのレセプター分子に複合体化したモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項１に記載のコンジュゲート。
  4. 導入位置が、好ましくはＡ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択されるhＧＨのヘリックスに存在する位置に等価である、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
  5. 導入されたアミノ酸残基がhＧＨのヘリックスの最初３つまたは最後３つのアミノ酸残基に等価な位置に存在しない、請求項４に記載のコンジュゲート。
  6. アミノ酸残基が、hＧＨのレセプター結合部位の外部に存在する位置に等価な位置に導入される、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート。
  7. 第一高分子物質への結合部位を有し、親ＧＨに存在する少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＧＨ変異体において欠落している請求項１〜６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  8. 非システインアミノ酸残基がLys、Asp、Glu、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Gln、ArgおよびHisからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載のコンジュゲート。
  9. 非システインアミノ酸残基がリジン残基である、請求項８に記載のコンジュゲート。
  10. ＧＨ変異体が、R64K、R94K、R127K、R134KおよびR183Kから選択されるhＧＨの置換に等価な少なくとも１つの置換を含む、請求項９に記載のコンジュゲート。
  11. 親ＧＨに存在する少なくとも１つのリジン残基がＧＨ変異体から欠落している、請求項９または１０に記載のコンジュゲート。
  12. 欠落リジンが、請求項２〜５のいずれかの定義に従い、表面に曝露したhＧＨの位置に等価な親ＧＨの位置から除去されている、請求項１１に記載のコンジュゲート。
  13. ＧＨ変異体が、K41R、K168RおよびK172Rからなる群から選択されるhＧＨの置換に等価な少なくとも１つの置換を含む、請求項１１または１２に記載のコンジュゲート。
  14. 成長ホルモンポリペプチドのコンジュゲートであって、該ポリペプチドが(第一)高分子物質への結合基を有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基がｈＧＨのヘリックス中の表面に曝露した位置と等価な位置に存在し、該位置は該ヘリックスの最初３つまたは最後３つのアミノ酸残基に等価な位置に存在せず、該少なくとも１つのアミノ酸残基に結合した高分子物質をも含むコンジュゲート。
  15. ヘリックスがＡ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択される、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. アミノ酸残基が12〜31、75〜89、109〜125および158〜181(配列番号２)からなる群から選択されるhＧＨにおける位置に等価な位置に存在する、請求項１４または１５に記載のコンジュゲート。
  17. アミノ酸残基がN12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、E88、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、K158、N159、G161、K168、D171、T175およびR178からなる群から選択されるhＧＨ中の位置に等価な位置に存在する、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  18. アミノ酸残基がE30、E88、N109、Y111、D112、K115、Q122、K158、N159およびG161からなる群から選択されるhＧＨ中の位置に等価な位置に存在する、請求項１７に記載のコンジュゲート。
  19. 高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基が非システインアミノ酸残基である、請求項１4〜1８のいずれかに記載のコンジュゲート。
  20. 非システインアミノ酸残基がLys、Asp、Glu、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Gln、ArgおよびHisからなる群から選択される、請求項１９に記載のコンジュゲート。
  21. 親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)との比較において高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基が前記の位置に導入されている、請求項１4〜２０のいずれかに記載のコンジュゲート。
  22. 導入されたアミノ酸残基が、hＧＨのレセプター結合部位の外部に存在する位置に等価な位置にある、請求項２１に記載のコンジュゲート。
  23. 導入されたアミノ酸残基がCysである、請求項２１または２２に記載のコンジュゲート。
  24. Cysが、100〜111(配列番号２)から選択されたhＧＨにおける位置に等価な位置に導入されていない、請求項２３に記載のコンジュゲート。
  25. 高分子物質への結合部位を有する少なくとも１つのアミノ酸残基が、hＧＨの表面に曝露した位置に等価な親成長ホルモンポリペプチドの位置から除去されている、請求項１４〜２２のいずれかに記載のコンジュゲート。
  26. 除去される残基が非システインアミノ酸残基、例えばLys、Asp、Glu、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Gln、ArgおよびHisからなる群から選択される、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. 除去されるアミノ酸残基がhＧＨのレセプター結合部位に存在する位置に等価な位置にある、請求項２５または２６に記載のコンジュゲート。
  28. 少なくとも１つの導入されたシステイン残基を含むＧＨ変異体のコンジュゲートであって、該残基は、好ましくはＡ、Ｂ、ＣおよびＤからなる群から選択されるｈＧＨのヘリックス中の表面に曝露した位置に等価な親ＧＨの位置に導入されており、ただし該位置は該ヘリックスの最初の３つまたは最後の３つのアミノ酸残基に存在せず、少なくとも１つの(第一)システイン反応性高分子物質をも含むコンジュゲート。
  29. 改変位置が、２５％を越えるその側鎖が表面に曝露されているhＧＨの位置に等価である、請求項１４〜２８のいずれかに記載のコンジュゲート。
  30. 改変位置が、５０％を越えるその側鎖が表面に曝露されているhＧＨの位置に等価である、請求項１４〜２８のいずれかに記載のコンジュゲート。
  31. P2、I4、L6、S7、R8、D11、N12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、Y35、P37、Y42、L45、L52、E56、S57、P59、S62、N63、R64、E65、E66、Q68、Q69、K70、S71、E74、E88、Q91、F92、R94、S95、L101、Y103、D107、S108、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、G126、R127、R134、Y143、D154、A155、L156、K158、N159、G161、K168、D171、T175、R178およびR183からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な親ＧＨの位置に等価な位置に導入されている少なくとも１つの導入システイン残基を含むＧＨ変異体のコンジュゲートであって、さらに少なくとも１つの(第一)システイン反応性高分子物質を含むコンジュゲート。
  32. CysがｈＧＨのヘリックスに存在する位置に等価な親ＧＨの位置に導入されていて、該位置が該ヘリックスの最初３つまたは最後３つのアミノ酸残基に存在しない、請求項３１に記載のコンジュゲート。
  33. 親ＧＨの位置がN12、L15、R16、H18、R19、Q22、F25、D26、Q29、E30、E74、E88、Q91、F92、N109、Y111、D112、K115、D116、E119、G120、Q122、T123、K158、N159、G161、K168、D171、T175およびR178からなる群から選択される、請求項３１または３２に記載のコンジュゲート。
  34. 親ＧＨの位置がE30、E74、E88、Q91、F92、N109、Y111、D112、K115、Q122、K158、N159およびG161からなる群から選択される、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  35. (第一の)高分子物質への結合基を有する少なくとも１つの非システインアミノ酸残基が、野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置と等価な親成長ホルモンポリペプチド(親ＧＨ)の位置から除去されている成長ホルモンポリペプチド変異体(ＧＨ変異体)のコンジュゲートであって、除去非システインアミノ酸残基と反応性である、該ポリペプチドに存在する非システインアミノ酸残基に結合した少なくとも１つの(第一)高分子物質をも含むコンジュゲート。
  36. 除去された残基がリジンである、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  37. １〜３リジン残基が親ＧＨから除去されている、請求項３６に記載のコンジュゲート。
  38. 除去された残基が親ＧＨの機能的部位、例えばレセプター結合部位の一部を形成する、請求項３５〜３７のいずれかに記載のコンジュゲート。
  39. 変異体ＧＨがK41R、K168RおよびK172Rからなる群から選択されるhＧＨの置換に等価な少なくとも１つの置換を含む、請求項３５〜３８に記載のコンジュゲート。
  40. 少なくとも１つの導入リジン残基を、野生型ヒト成長ホルモン(hＧＨ)の表面に曝露した位置に等価な親成長ホルモンポリペプチドの位置にさらに含む、請求項３５〜３９に記載のコンジュゲート。
  41. アミノ酸残基がhＧＨのレセプター結合部位の外部に存在する位置に等価な位置に導入される、請求項４０に記載のコンジュゲート。
  42. 改変位置が、hＧＨ単独のモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項３５〜４１のいずれかに記載のコンジュゲート。
  43. 改変位置が、hＧＨがその２つのレセプター分子に複合体化したモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項３５〜４１のいずれかに記載のコンジュゲート。
  44. hＧＨのレセプター結合部位２において表面に曝露した位置に等価な位置にあるアミノ酸残基の結合基に結合した少なくとも１つの高分子物質を含む成長ホルモンポリペプチドのコンジュゲートであって、該アミノ酸残基と反応性の少なくとも１つの(第一)高分子物質をも含むコンジュゲート。
  45. 高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基が、hＧＨのレセプター結合部位２における表面に曝露した位置に等価な位置に導入されている請求項１〜４４のいずれかに記載のコンジュゲート。
  46. 導入位置が、２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項４４または４５に記載のコンジュゲート。
  47. アミノ酸残基が、F1、P2、I4、P5、R8、L9、D11、N12、A13、L15、R16、H18、R19、Q22、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124およびR127からなる群から選択される；好ましくはF1、P2、I4、P5、R8、L9、D11、N12、A13、L15、R16、R19、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124およびR127からなる群から選択される；そしてさらに好ましくはF1、P2、I4、P5、R8、D11、N12、L15、R16、R19、Y103、D116、E119、G120、T123およびR127からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な位置に存在する、請求項４４〜４６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  48. 導入位置が、ｈＧＨのヘリックス、好ましくはヘリックスＡまたはヘリックスＣ中に存在する位置に等価である、請求項４４〜４７のいずれかに記載のコンジュゲート。
  49. 導入されたアミノ酸残基がヘリックスの最初の３つまたは最後の３つのアミノ酸残基に等価な位置に存在しない、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  50. 高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基が非システインアミノ酸残基である、請求項４４〜４９のいずれかに記載のコンジュゲート。
  51. 非システインアミノ酸残基がLys、Asp、Glu、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Gln、ArgおよびHisからなる群から選択される、請求項５０に記載のコンジュゲート。
  52. 高分子物質への結合基を有するアミノ酸残基がCysである、請求項４５〜４９のいずれかに記載のコンジュゲート。
  53. P2、I4、R8、L9、D11、N12、A13、L15、R16、H18、R19、Q22、Y103、D116、L117、E119、G120、T123、L124およびR127からなる群から選択される、好ましくはP2、I4、R8、D11、N12、L15、R16、R19、Y103、D116、E119、G120、T123およびR127からなる群から選択されるhＧＨの位置に等価な位置にCysが導入されている、請求項５２に記載のコンジュゲート。
  54. 高分子物質が前記の位置に結合したオリゴサッカライドである、請求項４５〜５１のいずれかに記載のコンジュゲート。
  55. 高分子物質がポリマー分子であるかまたはインビトロで結合しているオリゴサッカライド部分である、請求項１〜５４のいずれかに記載のコンジュゲート。
  56. ポリマー分子がＰＥＧである、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  57. ＧＨポリペプチドが少なくとも１つのグリコシル化部位を含み、高分子物質が、好ましくはインビボグリコシル化により結合されているオリゴサッカライド部分である、請求項１〜５４のいずれかに記載のコンジュゲート。
  58. 唯一のアミノ酸残基が高分子物質に結合している、請求項１〜５７のいずれかに記載のコンジュゲート。
  59. 唯一の高分子物質、唯一のオリゴサッカライド部分または唯一のＰＥＧ基、例えばモノＰＥＧ化された基を含む、請求項１〜５８のいずれかに記載のコンジュゲート。
  60. 少なくとも１つの導入されたインビボグリコシル化部位を含み、該インビボグリコシル化部位がhＧＨの表面に曝露した位置に等価な親ＧＨ中の位置に導入されているＧＨ変異体のコンジュゲートであって、少なくとも１つのオリゴサッカライド部分をも含むコンジュゲート。
  61. 導入位置が、hＧＨ単独のモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項６０に記載のコンジュゲート。
  62. 導入位置が、hＧＨがその２つのレセプター分子に複合体化したモデル構造において２５％を越えるその側鎖が表面に曝露している、好ましくは５０％を越えるその側鎖が表面に曝露しているhＧＨ中の位置に等価である、請求項６０に記載のコンジュゲート。
  63. アミノ酸残基がhＧＨのレセプター結合部位の外部に存在する位置に等価な位置に導入される、請求項６０〜６２のいずれかに記載のコンジュゲート。
  64. インビボで結合したオリゴサッカライド部分と異なる少なくとも１つの第二高分子物質をも含む、請求項６０〜６３のいずれかに記載のコンジュゲート。
  65. ポリペプチドＧＨが請求項１〜５９のいずれかで定義されたものである、請求項６４に記載のコンジュゲート。
  66. 親ＧＨがhＧＨまたはその変異体である、請求項１〜６５のいずれかに記載のコンジュゲート。
  67. コンジュゲートのポリペプチド部分が、配列番号２と比較してアミノ酸残基が最大１５、好ましくは最大１０、例えば最大５個異なるアミノ酸配列を有する、請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  68. ポリペプチドが、配列番号２と比較してアミノ酸残基が少なくとも１個異なるアミノ酸配列を有する、請求項６７に記載のコンジュゲート。
  69. 少なくとも１つの異なるアミノ酸残基が高分子物質に反応性である、請求項６８に記載のコンジュゲート。
  70. 最大１０、例えば最大５個のアミノ酸残基がhＧＨと異なる、例えば５、４、３、２または１個のアミノ酸残基が配列番号２と異なるアミノ酸配列を有する、Ｎ末端アミノ酸残基に結合した高分子物質を含む、ＧＨポリペプチドのコンジュゲート。
  71. 高分子物質がＮ末端F1に結合している、請求項７０に記載のコンジュゲート。
  72. 高分子物質がＰＥＧである、請求項７０または７１に記載のコンジュゲート。
  73. １〜１０の第一高分子物質を含む、請求項１〜７２のいずれかに記載のコンジュゲート。
  74. １〜５のみ、１〜２のみ、１〜３のみ、２〜３のみ、または１のみの高分子物質分子がポリペプチドに結合している、請求項７３に記載のコンジュゲート。
  75. 対照ＧＨと比較して増大した機能的インビボ半減期を有する、請求項１〜７４のいずれかに記載のコンジュゲート。
  76. 請求項１〜７０のいずれかに記載の変異体hＧＨをコードするヌクレオチド配列。
  77. 請求項７６に記載のヌクレオチド配列を含んでいる、発現ベクター。
  78. 請求項７６に記載のヌクレオチド配列または請求項７７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  79. 細菌、酵母、菌類または哺乳類細胞である、請求項７８記載の宿主細胞。
  80. 請求項１〜７０のいずれかに記載の変異体ＧＨのために定義されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  81. 親ＧＨの機能的インビボ半減期を増大させる方法であって、請求項１〜７５のいずれかの定義に従ってポリペプチドＧＨを製造し、得られる修飾ポリペプチドを高分子物質とのコンジュゲート化に供するか、または高分子物質がインビボで結合されるオリゴサッカライド部分である場合には、グリコシル化を行う生物にＧＨを発現させることを含む方法。
  82. 高分子物質が、ポリマー分子、親油性基および有機誘導体化剤からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
  83. 請求項１〜７５のいずれかに記載のコンジュゲートおよびｂ）薬学的に許容しうる希釈剤、担体を含む、医薬組成物。
  84. 病気の治療のための、請求項１〜７５のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項８３に記載の医薬組成物。
  85. ＧＨ不全に関連した病気の治療用薬物を製造するための、請求項１〜７５のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項８３に記載の医薬組成物の使用。
  86. ターナー症候群、大人におけるＧＨ欠乏症(すなわちＧＨＤＡ)、軟骨形成不全症、小児の腎不全を含む慢性腎不全、ＡＩＤＳのるいそうからなる群から選択される病気の治療およびＡＩＤＳ患者の悪液質および他の疾患と関連した悪液質の治療のための薬物を製造するための、請求項１〜７５のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項８３に記載の医薬組成物の使用。
  87. ＧＨ治療により治療し得る病気に罹患している患者を治療する方法であって、請求項８３に記載の医薬製剤の有効量を患者に投与することからなる方法。
  88. 請求項８６に記載の病気に罹患している患者を治療する方法であって、請求項８３に記載の医薬製剤の有効量を患者に投与することからなる方法。
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