JP2013533264A - 成長ホルモンコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、胆汁酸残基を含む成長ホルモンコンジュゲートに関し、前記コンジュゲーションは、野生型のアミノ酸残基を介して生じる場合もあり、突然変異体のアミノ酸残基を介して生じる場合もある。成長ホルモンポリペプチドは、野生ヒト成長ホルモンまたは成長ホルモン変異体でありうる。

Description

本発明は、胆汁酸誘導体を含む成長ホルモンコンジュゲートに関する。コンジュゲートは、ヒト成長ホルモンが通常適用される成長ホルモン欠損症の治療または他の治療において有用である。
成長ホルモン(GH)は、哺乳動物の下垂体前葉により分泌されるポリペプチドホルモンである。種に依存するが、GHは、約22kDaの分子量に対応する約190アミノ酸残基からなるタンパク質である。GHは、細胞表面受容体であるGH受容体(GHR)に結合し、これを介してシグナル伝達する。GHは、成長の促進、正常な身体組成、同化、および脂質代謝の維持において重要な役割を果たす。GHはまた、グルコース取込みの低下、脂質分解、アミノ酸取込みおよびタンパク質合成の上昇など、中間代謝に対しても直接的な影響を及ぼす。該ホルモンはまた、脂肪組織、肝臓、腸、腎臓、骨格、結合組織、および筋肉を含めた他の組織に対しても影響を及ぼす。例えば、Genotropin(商標)(Pharmacia Upjohn社製)、Nutropin(商標)およびProtropin(商標)(Genentech社製)、Humatrope(商標)(Eli Lilly社製)、Serostim(商標)(Serono社製)、Norditropin(Novo Nordisk社製)、Omnitrope(Sandoz社製)、Nutropinデポ剤(Genentech社およびAlkermes社製)などの組換えhGHが製造され、市販されている。加えて、例えば、Somatonorm(商標)(Pharmacia Upjohn/Pfizer社製)など、N末端にさらなるメチオニン残基を伴う類似体もまた市販されている。
GHは、タンパク質のGHファミリーの他のメンバーである、プロラクチン(PRL)および胎盤性ラクトゲン(PL)と共通のトポロジーを共有する。GHは、2つの保存的ジスルフィド結合を伴う「上行-上行-下行-下行」トポロジーを示す4ヘリックスバンドルタンパク質(図1)として分類される。具体的に述べると、野生型のヒトGH(hGH)は、191アミノ酸残基からなり、53位、165位、182位、および189位において4つのシステイン残基を有し、これが、C53をC165と、C182をC189とそれぞれ連結する2つの分子内ジスルフィド結合を形成することにより、タンパク質の三次元構造を安定化させている(図1)。hGHの構造は、遊離形において(Chantalet L.ら、Protein and Peptide Letters (1995) 3、333〜340頁)、ならびにその結合タンパク質との複合体において(ヒトGHR(hGHR)の細胞外ドメイン)(Devos, A. M.ら、Science (1992) 255、306〜312頁)、X線結晶構造解析により実験的に決定されている。これらの構造は、タンパク質データバンク(PDB)に寄託されており、公表されている(PDB受託コード:それぞれ、1HGUおよび1HWG)。したがって、公表されているhGH構造から、hGHRに対するhGHの結合に重要な残基を同定することができる。さらに、hGHの動態特性は、核磁気共鳴(NMR)分光分析(Kasimova M. R.ら、J. Mol. Biol. (2002)、318、679〜695頁)により研究されている。X線データとNMRデータとを組み合わせると、十分に構造化され、十分に定義されているhGH領域を、それほど構造化されておらず、かつ、それほど動的でない領域から識別することができる。それほど構造化されておらず、かつ、それほど動的でないhGH領域は、タンパク質分解による切断を特に受けやすく、このような領域を適正に安定化させれば、タンパク質分解に対する安定性が改善されるであろう。
所望の化学的特性または生物学的特性を示すhGH類似体を作製しようとする試みにおいて、hGHは、広範な変異誘発にかけられてきた。とりわけ、複数の目的のシステイン変異体が記述されてきた。
US2003/0162949は、GHスーパー遺伝子ファミリーメンバーのシステイン変異体について開示している。これらのタンパク質の部位特異的で生物学的に活性なコンジュゲートを創出するための一般的な方法が提供されている。該方法は、システイン残基を、該タンパク質の非必須領域に付加するか、部位指向性変異誘発を用いて、該タンパク質中の非必須アミノ酸をシステイン残基に置換し、次いで、該付加されたシステイン残基を介して、システイン反応性ポリマーまたは他の種類のシステイン反応性部分を該タンパク質に共有結合により連結するステップを伴う。
WO02/055532は、共有結合した少なくとも1つのポリペプチド以外の部分を有する、遺伝子操作されたhGH変異体、特に、導入されたシステイン残基をPEG化に用いたhGH変異体を記載している。
US5,951,972は、少なくとも1つの天然システイン残基または該タンパク質内へと組み込まれたシステイン残基が、各種の置換基により生理学的に活性な形で誘導体化されている、天然および組換えの、哺乳動物およびヒトのタンパク質およびポリペプチドを記載している。
タンパク質分解によるhGHの切断は、詳細に研究されている。残基128〜154からなる長いループは、トロンビン、プラスミン、コラゲナーゼ、スブチリシン、およびキモトリプシン様セリンプロテアーゼなど、複数のプロテアーゼについての推定切断部位を有する。したがって、hGHのこの部分は、タンパク質分解による切断を特に受けやすいことが示されている(Lewis, U.J.、Ann. Rev. Physiol. (1984)、46、33〜42頁)。hGHを分解することが報告されている酵素には、トロンビン、プラスミン、スブチリシン、キモトリプシン様セリンプロテイナーゼ、およびカリクレインが含まれる。
ラット組織内でのhGHの分解については、精査されている(Garcia-Barrosら、J. Endocrinol. Invest. (2000)、23、748〜754頁)。
ラット甲状腺内では、大きな親油性アミノ酸残基での切断に有利なキモトリプシン様プロテアーゼにより、まず、Y143とS144との間のペプチド結合が切断されて2つの鎖分子がもたらされた後、Y42とS43との間の切断により、N末端ペプチドであるF1〜Y42が遊離することが判明した。2つの鎖分子へと分裂したループは、キモトリプシン様プロテアーゼを介して、さらにカルボキシペプチダーゼの作用を介して、F146とD147との間の切断によりさらにプロセシングされる。
タンパク質分解に対して安定化されたhGH類似体を作製する複数の方法が報告されている。
Alamら、J. Biotech. (1998) 65、183〜190頁は、特異的な点変異により、トロンビンおよびプラスミンに対して耐性のhGH変異体をデザインした。トロンビンは、R134とT135との間で特異的にhGHを切断するが、二重変異体であるhGH(R134D、T135P)は、トロンビンによる切断に対して耐性のhGH変異体をもたらし、三重変異体であるhGH(R134D、T135P、K140A)は、結果として、プラスミンに対して耐性であった。さらに、後者のhGH変異体は、7日間にわたり、ヒト血漿によるタンパク質分解に対して耐性であった。
EP534568は、R134を、アラニン、ロイシン、トレオニン、フェニルアラニン、プロリン、またはヒスチジンへと変異させることにより、タンパク質分解に対して安定化させたhGH変異体を記載している。
WO2004/022593/Nautilus社は、GH変異体を含め、タンパク質分解に対する安定性を増大させた修飾サイトカインを生成する、一般的なハイスループット指向の発生法を記載している。
WO2006/048777/Nautilus社は、タンパク質分解に対する安定性を改善した、修飾hGH類似体について具体的に記載している。該類似体は、1〜55、57、58、60〜63、67〜87、89〜91、93、95〜100、102〜128、131〜132、135〜139、141、142、144、148〜182、184、185、および187〜191位に1〜5カ所の変異を含む。システイン残基の導入は、潜在的に、ジスルフィド結合された望ましくない二量体の形成をもたらす可能性があり、WO2006/048777では、システインによるアミノ酸残基の置換が、範囲から明確に除外されている; WO2006/048777(p.65)では、「システイン残基によりアミノ酸を置換すると、潜在的に、分子間のジスルフィド結合が形成されるであろうから、この変化を明確に回避する」と述べられている。
US2003/0162949 WO02/055532 US5,951,972 EP534568 WO2004/022593 WO2006/048777 WO92/09690 US6,004931 US6,143,523 US6,136,536 US6,057,292 US5,849,535 WO97/11178 WO90/04788 WO2008101240 WO200811283687 WO2008027854 WO2008014430 US20080095837 US4,683,202 US6,358,705 WO2009/024791 WO2005/070468 US5156956
Chantalet L.ら、Protein and Peptide Letters (1995) 3、333〜340頁 Devos, A. M.ら、Science (1992) 255、306〜312頁 Kasimova M. R.ら、J. Mol. Biol. (2002)、318、679〜695頁 Lewis, U.J.、Ann. Rev. Physiol. (1984)、46、33〜42頁 Garcia-Barrosら、J. Endocrinol. Invest. (2000)、23、748〜754頁 Alamら、J. Biotech. (1998) 65、183〜190頁 Carey, M. C、Cahalane, M. J.、「Entero-hepatic Circulation」、「The Liver: Biology and Pathobiology」、2版、Raven Press Ltd、New York、1988、33章、573〜616頁 「Computational Molecular Biology」、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988 「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993 「Computer Analysis of Sequence Data」、第1部、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994 「Sequence Analysis in Molecular Biology」、von Heinje, G.、Academic Press、1987 「Sequence Analysis Primer」、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991 Carilloら、SIAM J. Applied Math. (1988) 48、1073頁 Devereuxら、Nucl. Acid. Res. (1984) 12、387 Altschulら、J. Mol. Biol. (1990) 215、403〜410頁 「BLAST Manual」、Altschulら、NCB/NLM/NIH、Bethesda、Md. 20894 Dayhoffら、「Atlas of Protein Sequence and Structure」、(1978) 5 Henikoffら、PNAS USA (1992) 89、10915〜10919頁 Needlemanら、J. Mol. Biol. (1970) 48、443〜453頁 J. Pharm. Sci. 66、2(1977) CabritaおよびBottomley、Biotechnology Annual Review (2004) 10、31〜50頁 Dombkowski A., A.、Bioinformatics (2003) 19、1852〜1853頁 Petersenら、Protein Eng. (1999) 12、535〜548頁 Masuda.Nら、Biochim. Biophys. Acta 949 (1988) (1)、125〜131頁 GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、2006 J. Am. Chem. Soc. (2003) 125、11782〜11783頁 Science (2003) 301、964〜967頁 Science (2001) 292、498〜500頁 Science (2004) 303、371〜373頁 Sambrook, J、Fritsch, EF、およびManiatis, T、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989 BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Letters (1981) 22、1859〜1869頁 Matthesら、EMBO Journal (1984) 3、801〜805頁 Saikiら、Science (1988) 239、487〜491頁 J. Am. Chem. Soc.(1964)、86、5175〜5180頁、「A New Substituent Constant, Derived from Partition Coefficients」 C. A. Lipinskiら、Advanced Drug Delivery Reviews(1997)、23、3〜25頁、「Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings」 I. Moriguchi、S. Hirono、I. Nakagome、H. Hirano、Chem. Pharm. Bull.(1994)、42、976〜978頁、「Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods」 Takatsukaら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2006) 62、52〜58頁 Kondohら、Mol Pharmacology (2005) 67、749〜756頁 Palmbergerら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2007) 66、405〜412頁 Leitner, V.Mら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2003) 56、207〜214頁 H. L. Leussenら、Parm. Res. (1996) 13、1668〜1672頁 H. L. Leussenら、Int. J. Pharmaceuticals (1996) 141、39〜52頁 M. Gumbleton、Adv. Drug. Del. Rev. (2001) 49、281〜300頁 K.C. Partlowら、Biomaterials (2008) 29、3367〜3375頁 Leeら、Biotechnol. Appl. Biochem. (2007) 46、211〜217頁 S.Y. Chaeら、Bioconjugate Chem. (2008) 19、334〜341頁 Russell-Jones G.: 17章、「Membrane Transporters as Drug Targets」(1999) SaidおよびMohammed、Curr. Opin. Gastroent. (2006) 22、140〜146頁 Chalasaniら、J.Con.Release (2007) 117、421〜429頁 H. LiおよびZ.M. Qian、Med. Res. Rev. (2002) 22、225〜250頁 LiangおよびYang、Biochem. Biophys. Res. Comm. (2005) 225、734〜738頁 J.D Irvineら、J.Pharm.Sci.(1999)、88 P. Artursson、J.Pharm.Sci.(1990)、79
タンパク質分解に対して耐性であるhGH化合物を開発する必要が明らかに存在する。このような安定化化合物ならば、hGHに所望の生物学的特性を保持する一方で、タンパク質分解による切断に対する安定性を増大させるはずである。このようなGH分子ならば、安定性を増大させ、クリアランスを遅延させ、かつ/またはin vivoにおける半減期を延長させるであろう。
さらに、タンパク質による治療剤は一般に、経口では十分なアベイラビリティーが得られないため、静脈内投与または皮下投与する必要がある。タンパク質の経口バイオアベイラビリティーが低いのは、部分的には、消化管におけるタンパク質分解に起因する。したがって、また、hGH関連障害を治療するのに経口投与されうるhGH化合物を開発する必要も存在する。
天然の胆汁酸は、一連の輸送体タンパク質の作用を介して、腸肝ループ内に厳重に封じ込められている(Carey, M. C、Cahalane, M. J.、「Entero-hepatic Circulation」、「The Liver: Biology and Pathobiology」、2版、Raven Press Ltd、New York、1988、33章、573〜616頁)。この腸および肝臓による取り込み機構により、腸内に分泌される胆汁酸のうちの約90%が、回腸内で再吸収され、腸肝循環と称し、胆汁塩を腸系から肝臓および胆嚢へと戻す循環において再循環する。
天然の胆汁酸と同様の特性を有する成長ホルモン化合物または成長ホルモンコンジュゲートは、経口バイオアベイラビリティーのほか、薬理学的に適切な肝臓レベルおよび高肝対血漿比(または高肝対組織比)を示すことが可能であり、したがって、極めて有望な化合物である。
本発明は、胆汁酸を共有結合させた成長ホルモンコンジュゲートについて説明する。本明細書で説明される通り、胆汁酸は、プロテアーゼに対して安定化させた成長ホルモン変異体など、多様な成長ホルモン化合物に結合させることができる。
ある態様における本発明は、成長ホルモン化合物に連結された胆汁酸残基を包含する成長ホルモンコンジュゲートに関する。このような成長ホルモンコンジュゲートは、式(I):
A-W-B-GH (I)
[式中、
GHは、成長ホルモン化合物を表し、
Aは、胆汁酸残基を表し、
Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、
Wは、AとBとを連結する化学基である]
および薬学的に許容されるその塩により記載することができる。
本発明のさらなる実施形態では、成長ホルモン化合物(GH)が、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する、ヒト成長ホルモン(配列番号1)またはその変異体である。
さらなる態様における本発明は、成長ホルモン欠損症を治療する方法におけるその使用など、このような成長ホルモンコンジュゲートの任意の使用に関する。
さらなる態様における本発明は、成長ホルモン化合物に連結された胆汁酸残基を包含する成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法であって、前記胆汁酸残基を、成長ホルモン化合物に共有結合させる方法に関する。
hGH結合タンパク質(PDB 1HWG)の2つのコピーに結合したhGHの構造を示す図である。hGH内の4つの主要なヘリックスを濃いグレーで示し、「H1〜H4」と表示する。方向(N末端→C末端)を、矢印により示す。hGHのN末端およびC末端を、それぞれ、「N」および「C」と表示する。C53をC165と、C182をC189とそれぞれ連結する2つのジスルフィド結合を、黒色の棒線および丸印で表わす。また、H3およびH4を連結する長い可撓性のループにおけるそれぞれ最初の残基および最後の残基を表わす、L128およびD154も表示する。 4つの主要なヘリックス(H1〜H4)を強調および表示した、hGHの野生型アミノ酸配列を示す図である。また、主要なヘリックスを連結する3つのループ(L1〜L3)も表示する。ヘリックスの定義は、その結合タンパク質(PDB 1HWG)と複合体化したhGHを指す。
定義
本文脈では、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語を互換的に用い、同じものを指すことを意図する。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により接合される2つ以上のアミノ酸による配列を指し、前記アミノ酸は、天然の場合もあり、非天然の場合もある。構成要素であるアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸の群に由来することが可能であり、遺伝子コードによってはコードされない天然アミノ酸であることが可能であるほか、合成アミノ酸であることも可能である。遺伝子コードによりコードされない天然アミノ酸は、例えば、Hyp(ヒドロキシプロリン)、y-カルボキシグルタミン酸、Orn(オルニチン)、ホスホセリン、D-アラニン、およびD-グルタミンである。合成アミノ酸は、D-アラニンおよびD-ロイシンなど、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のD-異性体、Aad(α-アミノアジピン酸)、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Agl(α-アミノグリシン)、Asu(α-アミノスベリン酸)、Cpa(β-シクロペンチルアラニン)、Chg(シクロヘキシルグリシン)、Dab(α,γ-ジアミノ酪酸)、Dap(α,β-ジアミノプロパン酸)、Hcy(ホモシステイン)、Hpr(ホモプロリン)、Nle(ノルロイシン)、Phg(フェニルグリシン)、Hph(ホモフェニルアラニン)、1Nal(β-(1-ナフチルアラニン)、2Nal(β-(2-ナフチルアラニン)、2Pal(β-(2-ピリジル)アラニン、3Pal(β-(3-ピリジル)アラニン、Pip(4-アミノピペリジン-4-カルボン酸)、Pra(プロパルギルグリシン)、Pyr(ピログルタミン酸)、Gla(γ-カルボキシグルタミン酸)、Hci(ホモシトルリン)、Nva(ノルバリン)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、およびアントラニル酸など、化学合成により作製されるアミノ酸を含む。
該用語はまた、「タンパク質」という用語も包含し、これは、1つのポリペプチド鎖からなる場合もあり、例えば、システインジスルフィド架橋など、非共有結合もしくは共有結合による相互作用を介して併せて保持される2つ以上のポリペプチド鎖からなる場合もある。
該用語はまた、例えば、さらなるジスルフィド結合を含むことに加えて、PEG、炭水化物、脂肪酸、アルブミン結合剤、アルキル鎖、親油性基、ビタミン、胆汁酸、またはペプチドの側鎖もしくは主鎖に対するスペーサーなどであるがこれらに限定されない部分を結合させることにより誘導体化させたペプチドを包含することも意図することを理解されたい。ペプチドという用語は、任意の適切なペプチドを包含し、各々のアミノ酸ポリマーを含有する各種の分子が、著明な差違を伴い、これにより、本発明の個々の実施形態(例えば、複数のポリペプチド鎖からなる抗体などのペプチドは、例えば、単鎖抗体、ペプチドであるイムノアドヘシン、または免疫原性の単鎖ペプチドとは著明に異なる)を形成しうることを読者が認識すると仮定すれば、別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、ポリペプチドおよびタンパク質という用語と同義に用いることができる。したがって、本明細書におけるペプチドという用語は、一般に、任意の適切なサイズおよび組成(アミノ酸数およびタンパク質分子中における会合鎖数)を有する任意の適切なペプチドを指すものと理解すべきである。さらに、本明細書に記載のペプチドは、別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、非天然アミノ酸残基および/または非L-アミノ酸残基を含みうる。
別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り(ならびに、ポリペプチドおよび/またはタンパク質という用語についての個別の実施形態として論じる限り)、ペプチドという用語はまた、誘導体化されたペプチド分子も包含する。誘導体化されたペプチド分子とは、そのアミノ酸残基のうちの1つまたは複数が、化学修飾されている(例えば、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成により)か、または1つまたは複数のアミノ酸以外の有機および/もしくは無機の原子もしくは分子による置換基(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)基、親油性置換基(場合によっては、これを、β-アラニン、γ-アミノ酪酸(GABA)、L/D-グルタミン酸、コハク酸などのスペーサー残基またはスペーサー基を介して、該ペプチドのアミノ酸配列へと連結することもできる)、フルオロフォア、ビオチン、放射性核種など)と会合しているペプチド分子であり、また、あるいは代替的に、別段に言及するか、または文脈によりこれに反する言及を行わない限り、非必須アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、および/または非L-アミノ酸残基も含みうる(しかし、このような誘導体は、それら自体において、またはそれ自体により、本発明の個別の特徴として考える場合があり、このような分子を、ペプチドという意味の範囲内に包含させるのは、ネイキッドペプチド(naked peptides)と、このような誘導体との任意の種類の等価性を示唆するためではなく、本発明を説明する際の便宜のために行うのであることを、ここでもまた認識されたい)。
このようなアミノ酸残基の非限定的な例には、例えば、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、プロパルギルグリシン、ならびにスタチンをハロゲン化したアミノ酸が含まれる。
本明細書に記載される「化合物」は、「タンパク質」の場合もあり、「ペプチド」の場合もあり、「ポリペプチド」の場合もあり、ポリペプチドは、それが改変された方法に関わらず、wthGHと同様の所望の生物学的活性を保持する、「類似体」の場合もあり、「変異体」の場合もある。
ポリペプチドを指す場合に本明細書で用いられる「類似体」または「変異体」という用語は、前記ペプチドの改変形を意味し、この場合、該ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換されており、かつ/または1つまたは複数のアミノ酸残基が、該ペプチドから欠失しており、かつ/または1つまたは複数のアミノ酸残基が、該ペプチドに付加されている。このようなアミノ酸残基の置換または付加または欠失は、該ペプチドのN末端で生じる場合もあり、かつ/または該ペプチドのC末端で生じる場合もあり、かつ/または該ペプチドのN末端もしくはC末端で生じる場合もある。その光学異性体が言及されているわけではないすべてのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解されたい。
「ジスルフィド結合」または「ジスルフィド架橋」という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。タンパク質における「ジスルフィド結合」または「ジスルフィド架橋」は、システイン残基のチオール基間で形成される。
「さらなるシステイン」または「導入されるシステイン」という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。該用語は、野生型hGHには存在しないシステイン残基を包含することを意図する。構造的変化を最小化するため、通常アミノ酸残基の置換を介してシステイン残基を導入し、これにより、hGHの長さを維持する。ループ部分内、またはヘリックスの周縁部では、付加的cys残基の挿入が許容されるが、ヘリックス内におけるcys残基の導入は、それほど推奨されない。
「さらなるジスルフィド結合」または「導入されるジスルフィド結合」という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。該用語は、そのうちの少なくとも1つが野生型hGH内には存在しない2つのシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合を包含することを意図する。
本明細書では、「単一点突然変異」という用語を用いて、突然変異(配列番号1で定義されるhGHと比較した)を指す。「さらなる単一点突然変異」という用語は、単一点突然変異が、成長ホルモン化合物中に導入されるさらなるシステイン突然変異を形成する任意のジスルフィド架橋には関しないことを明記するのに用いることができる。「cysによるさらなる単一点突然変異」という用語は、システイン残基を導入する点突然変異を特定するのに用いることができる。このような突然変異は、hGHにおける「さらなる単一点突然変異」の場合もあり、hGHにおけるなおさらなる突然変異の場合もある。
本発明を規定するために本明細書で用いられる「コンジュゲート」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドであって、ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が、胆汁酸残基に共有結合しているペプチドまたはポリペプチドを指す。したがって、本発明についての「コンジュゲート」という用語は、胆汁酸コンジュゲートを、代替的な誘導体から識別するための用語として用いられる。しかし、他の文献は、「コンジュゲート」という用語と「誘導体」という用語とを互換的に用いるので、他の文献を参照する場合は、これらの用語が互換的に用いられうることが注意される。動詞としては、この用語が、部分(本明細書では、胆汁酸残基またはリンカー)を、タンパク質またはポリペプチドへと結合させる工程を示すことが意図される。
本明細書で用いられる「誘導体」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドを指し、この場合、該ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が、PEG、炭水化物部分、アルブミン結合剤、脂肪酸、親油性基、ビタミン、または成長ホルモン化合物の側鎖もしくは主鎖に対するスペーサーなどのポリマーを導入することにより化学改変されている。化学改変はまた、一過性の性格でもありうる、すなわち、それらは、in vivoにおいて容易に除去することができる。化学改変は、例えば、細胞自体を介して、または発現後においてペプチドに対して実施される化学改変を介して、翻訳後において導入することができる。
本発明の文脈では、「ヒト成長ホルモン(hGH)」という語と、「hGH wt」という語と、「野生型hGH(wthGH)」という語とが互換的に用いられ、いずれも、配列番号1としてのアミノ酸配列を伴うタンパク質を指す。
当技術分野で知られる「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される、2つ以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、「同一性」はまた、2つ以上のアミノ酸残基の連なりの間のマッチ数により決定される、ペプチド間の配列類似性も意味する。「同一性」では、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)により扱われる、ギャップアライメント(存在する場合)を伴う、2つ以上の配列間の同一性のマッチ百分率が測定される。類似ペプチドの同一性は、知られる方法により容易に計算することができる。このような方法には、「Computational Molecular Biology」、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988;「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993;「Computer Analysis of Sequence Data」、第1部、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994;「Sequence Analysis in Molecular Biology」、von Heinje, G.、Academic Press、1987;「Sequence Analysis Primer」、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991;ならびにCarilloら、SIAM J. Applied Math. (1988) 48、1073頁に記載の方法が含まれるがこれらに限定されない。
同一性を決定するのに好ましい方法は、被験配列間で最大のマッチを与えるようにデザインされる。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにおいて説明されている。2つの配列間の同一性を決定するのに好ましいコンピュータプログラムによる方法には、GAP(Devereuxら、Nucl. Acid. Res. (1984) 12、387;ウィスコンシン州、マジソン、ウィスコンシン大学、Genetics Computer Group)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschulら、J. Mol. Biol. (1990) 215、403〜410頁)を含めたGCGプログラムパッケージが含まれる。BLASTXプログラムは、米国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)および他の情報源(「BLAST Manual」、Altschulら、NCB/NLM/NIH、Bethesda、Md. 20894; Altschulら、前出)から公開されている。よく知られたSmith Watermanによるアルゴリズムもまた、同一性を決定するのに用いることができる。
例えば、コンピュータアルゴリズムであるGAP(ウィスコンシン州、マジソン、ウィスコンシン大学、Genetics Computer Group)を用いて、それらの百分率による配列同一性が決定される2つのペプチドを、それら各々のアミノ酸が最適な形でマッチングするように整列させる(該アルゴリズムにより決定される「マッチ範囲」)。ギャップ開始時のペナルティー(対角成分の平均の3倍として計算される;「対角成分の平均」とは、用いられる比較行列の対角成分の平均である;「対角成分」とは、特定の比較行列により、各々の完全なアミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である)、ならびにギャップ伸長時のペナルティー(これは通常、ギャップ開始時のペナルティーの1/10倍である)のほか、PAM 250またはBLOSUM 62などの比較行列も、該アルゴリズムと共に用いられる。標準的な比較行列(PAM 250比較行列については、Dayhoffら、「Atlas of Protein Sequence and Structure」、(1978) 5; BLOSUM 62比較行列については、Henikoffら、PNAS USA (1992) 89、10915〜10919頁を参照されたい)もまた、アルゴリズムによって用いられる。
ペプチド配列比較に好ましいパラメータには、以下:
アルゴリズム: Needlemanら、J. Mol. Biol. (1970) 48、443〜453頁;比較行列: Henikoffら、PNAS USA (1992) 89、10915〜10919頁によるBLOSUM 62;ギャップペナルティー: 12;ギャップ長ペナルティー: 4;類似性の閾値
が含まれる。
GAPプログラムは、上記のパラメータにより有用となる。上述のパラメータは、GAPアルゴリズムを用いてペプチド比較(末端ギャップについてのペナルティーを伴わない)を行うためのデフォルトのパラメータである。
「プロテアーゼ(proteaseまたはproteases)」とは、加水分解によるペプチド結合の切断を触媒する能力を保有するすべての酵素を包含することを意図する。プロテアーゼは、細胞内プロテアーゼ、細胞内プロテイナーゼ、または細胞内ペプチダーゼの場合もあり、細胞外プロテアーゼ、細胞外プロテイナーゼ、または細胞外ペプチダーゼの場合もあり、膜結合プロテアーゼ、膜結合プロテイナーゼ、または膜結合ペプチダーゼの場合もあり、哺乳動物の腸管内におけるプロテアーゼ、ならびに哺乳動物の血漿中に存在するプロテアーゼを包含する。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼおよびエクソプロテアーゼのいずれの種類でもありうる。プロテアーゼは、以下の種類:セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼでありうるがこれらに限定されない。プロテアーゼの特定の例は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、因子VIIa、因子Xa、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼ、DPPIV、中性エンドペプチダーゼ、グランザイムB、プロリンエンドペプチダーゼ、テルモリシン、トロンビン、Arg-Cプロテイナーゼ、Asp-Nエンドペプチダーゼ、カスパーゼ1〜10、クロストリパイン、エンテロキナーゼ、グルタミルエンドペプチダーゼ、LysC、LysN、およびブドウ球菌(Staphylococcus)属ペプチダーゼIである。
「タンパク質分解に対して耐性」、または「タンパク質分解に対する安定性の増大」、または「タンパク質分解による切断に対する安定性の増大」、または「タンパク質分解に対する安定性の改善」、または「タンパク質分解に対する安定性」という用語は互換的に用いられ、同じものを指すことを意図する。本発明のhGH化合物との関連で用いられる該用語は、特定の条件下におけるプロテアーゼによる前記hGH化合物のポリペプチド鎖の切断が、野生型hGHと比較してより遅い速度でなされることを示すことを意図する。
タンパク質分解によるタンパク質の切断の速度は、当業者に知られる複数の技法により測定することができる。hGHまたはhGH化合物の分解速度を測定するアッセイの例については、実施例5に記載する。
「in vivoにおける機能的半減期」という用語は、その通常の意味、すなわち、ペプチド、例えば、成長ホルモン化合物の生物学的活性の50%が、体内/標的器官中になおも存在する時間、またはペプチド、例えば、成長ホルモン化合物の活性が、その初期値の50%となる時間の意味で用いられる。in vivoにおける機能的半減期の決定に対する代替法として、「in vivoにおける血漿半減期」および持続的作用を決定すること、すなわち、除去される前にペプチドの50%が血流中を循環する時間を決定することもできる。血漿半減期の決定は、機能的半減期の決定より簡単であることが多く、血漿半減期の大きさは、通常、in vivoにおける機能的半減期の大きさについての良好な指標である。
「アルカン」または「アルキル」という用語は、直鎖状、分枝状、および/または環状の飽和炭化水素を指すことを意図する。別の炭素原子数で明記されない限り、この用語は、1〜20(両端を包含する)など、1〜10(両端を包含する)、例えば、1〜5(両端を包含する)など、1〜30(両端を包含する)の炭素原子を伴う炭化水素を指すことを意図する。アルキルおよびアルキレンという用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。
「C1〜6アルキル」という用語は、両端を包含する1〜6個の炭素原子を有する、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を指す。このような基の例には、メチル基、2-プロピル基、1-ブチル基、2-ブチル基、2-メチル-2-プロピル基、2-メチル-1-ブチル基、およびn-ヘキシル基が含まれるがこれらに限定されない。
「C3〜10シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、およびシクロデカニルを指すことが典型的である。
「アルケン」という用語は、少なくとも1つの炭素間二重結合を含む直鎖状、分枝状、および/または環状の炭化水素を指すことを意図する。別の炭素原子数で明記されない限り、この用語は、2〜20(両端を包含する)など、2〜10(両端を包含する)、例えば、2〜5(両端を包含する)など、2〜30(両端を包含する)の炭素原子を伴う炭化水素を指すことを意図する。アルケニルおよびアルケニレンという用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。
「アルキン」という用語は、少なくとも1つの炭素間三重結合を含む直鎖状、分枝状、および/または環状の炭化水素を指すことを意図し、場合によって、1つまたは複数の炭素間二重結合を含みうる。別の炭素原子数で明記されない限り、この用語は、2〜20(両端を包含する)など、2〜10(両端を包含する)、例えば、2〜5(両端を包含する)など、2〜30(両端を包含する)の炭素原子を伴う炭化水素を指すことを意図する。アルキニルおよびアルキニレンという用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。
「ホモ環状芳香族化合物」という用語は、ベンゼンおよびナフタレンなど、芳香族炭化水素を指すことを意図する。
「ヘテロ環状化合物」という用語は、そのうちの1、2、3、または4つが、N、O、および/またはSから選択されるヘテロ原子である、5、6、または7つの環原子を含む環状化合物を指すことを意図する。例には、チオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジンのほか、ピペリジン、ピラゾリジン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペラジン、およびモルホリンなど、それらの部分的または完全な水素化同等物など、ヘテロ環状芳香族化合物が含まれる。
「ヘテロアルカン」、「ヘテロアルケン」、および「ヘテロアルキン」という用語は、1つまたは複数のヘテロ原子またはヘテロ基が、前記部分の構造中に挿入されている、上記で定義されたアルカン、アルケン、およびアルキンを指すことを意図する。ヘテロ基およびヘテロ原子の例には、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)-、-C(S)-、および-N(R*)- [式中、R*は、水素、またはC1〜6アルキルを表す]が含まれる。ヘテロアルカンの例には、
が含まれる。
「ラジカル」または「ビラジカル」という用語は、そこから、それぞれ、1つまたは2つの水素原子が除去されている化合物を指すことを意図する。具体的に言及する場合、ラジカルはまた、化合物から大型の原子団、例えば、ヒドロキシル基をホルマール除去することにより形成される部分も指す場合がある。
「ハロゲン」という用語は、周期表の第7主族のメンバー、例えば、F、Cl、Br、およびIを指すことを意図する。
本発明の文脈では、「アリール」という用語が、炭素環式芳香環ラジカルまたは縮合した芳香環系ラジカルを指すことを意図し、この場合、環のうちの少なくとも1つは芳香環である。典型的なアリール基には、フェニル基、ビフェニリル基、ナフチル基などが含まれる。
本明細書で用いられる、単独または組合せにおける「ヘテロアリール」または「ヘタリール」という用語は、例えば、5〜7つの環員原子を伴う芳香環ラジカル、または、例えば、7〜18の環員原子を伴う縮合した芳香環系ラジカルを指し、この場合、少なくとも1つの環が、1つまたは複数のヘテロ原子を、窒素ヘテロ原子、酸素ヘテロ原子、または硫黄ヘテロ原子から選択される環原子として含有する芳香環であり、N-オキサイド、ならびに一酸化硫黄および二酸化硫黄が、許容可能なヘテロ芳香族置換基である。例には、フラニル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、およびインダゾリルなどが含まれる。
「モチーフ」という用語は、スペーサー(B)など、大型部分内の小型の化学部分を記載するのに用いられ、この場合、このようなモチーフは、1つまたは複数の化学基により形成されうる。
「残基」という用語は、アミノ酸との関連における通常の使用と同等の化学的単位、例えば、共有結合したアミノ酸残基からなるタンパク質またはペプチドについて用いられる。特に、残基という用語は、胆汁酸残基との関連で用いられ、これは、化学的な連結基を介してスペーサーに共有結合させた胆汁酸を指す。
本発明の文脈では、「薬学的に許容される塩」という用語が、患者に対して有害ではない塩を指すことを意図する。このような塩には、薬学的に許容される酸添加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸添加塩には、無機酸の塩ならびに有機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の代表的な例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが含まれる。適切な有機酸の代表的な例には、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデリン酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などが含まれる。薬学的に許容可能な無機酸添加塩または有機酸添加塩のさらなる例には、参照により本明細書に組み込まれる、J. Pharm. Sci. 66、2(1977)において列挙されている、薬学的に許容される塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などが含まれる。アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などが含まれる。
成長ホルモンコンジュゲート
本発明の態様は、成長ホルモン化合物に共有結合させた胆汁酸残基を含む成長ホルモンコンジュゲートに関する。一実施形態では、コンジュゲートを、式(I):
A-W-B-GH (I)
[式中、
GHは、成長ホルモン化合物を表し、
Aは、胆汁酸残基を表し、
Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、
Wは、AとBとを連結する化学基である]
および薬学的に許容されるその塩により記載することができる。
本明細書の下記で説明される通り、このようなコンジュゲートの構成要素は、成長ホルモン受容体に対する刺激効果を維持しながら、さらなる機能性をもたらす、異なる成長ホルモン変異体または成長ホルモン誘導体を組み入れることにより変化させることができる。
加えて、成長ホルモンコンジュゲートでは、ヒト成長ホルモンの主要な機能性が通常維持される。ヒト成長ホルモンコンジュゲートのin vitroおよびin vivoにおける活性は、任意の成長ホルモン化合物として調べることができる。
成長ホルモン化合物
本発明によれば、成長ホルモン化合物が、ヒト成長ホルモンの主要な機能性を保持し、一実施形態では、ヒト成長ホルモン(配列番号1)と同一でありうる。
本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1に対して、少なくとも20%、少なくとも30%など、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%など、例えば、少なくとも60%、少なくとも70%など、例えば、少なくとも80%、少なくとも90%などの同一性、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%など、例えば、少なくとも97%、少なくとも98%などの同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
一実施形態では、成長ホルモン化合物のin vitroにおける活性は、配列番号1により定義されるhGHのin vitroにおける活性と同等である。in vitroにおける成長ホルモン化合物の活性は、本明細書の方法5で記載されるBAFアッセイで測定することが好ましい。
本明細書の下記で記載されるさらなる実施形態では、成長ホルモン化合物の成長ホルモン活性が、BAFアッセイ(方法5で説明される)で決定されるhGH活性、および/または下垂体切除ラット(方法6で説明される)において決定されるhGH活性の少なくとも5%、例えば、少なくとも25%など、少なくとも10%など、少なくとも1%である。
一実施形態では、化合物のin vitroにおける活性が、in vitroにおけるhGH活性とは異なりうる。上記した通り、in vitroにおける活性が低下しても、他の機能性により補完されうる。
一実施形態では、in vitroにおける活性が、hGH活性の少なくとも1%など、少なくとも5%など、例えば、少なくとも10%、少なくとも25%などでありうる。さらなる実施形態では、配列番号1により定義される野生型hGHと比べた化合物のEC50比が、10を超えず、8を超えず、6を超えず、4を超えず、2を超えない。ある実施形態では、配列番号1により定義される野生型hGHと比較した前記化合物のEC50比が、5〜0.01、または3〜0.01など、または2〜0.01などである。代替法では、本発明によるEC50を、方法7で記載する表面プラズモン共鳴解析(SPR)により測定することができる。対応する実施形態では、SPRにより決定される、in vitroにおける活性が、hGH活性の少なくとも1%など、少なくとも5%など、例えば、少なくとも10%、少なくとも25%などでありうる。さらなる実施形態では、SPRにより決定される、配列番号1により定義される野生型hGHと比べた化合物のEC50比が、10を超えず、8を超えず、6を超えず、4を超えず、2を超えない。一実施形態では、配列番号1により定義される野生型hGHと比較した前記化合物のEC50比が、5〜0.01、または3〜0.01など、または2〜0.01などである。
疑念を回避する目的で述べると、成長ホルモン化合物の活性はまた、これらのアッセイにおいてhGHより高い場合もある。
ある方法で(胆汁酸コンジュゲーションに加えた方法で)成長ホルモン化合物を誘導体化する一実施形態では、誘導体化により活性が顕著に変化しうるので、hGHと比べた成長ホルモンの活性を、誘導体化されていない成長ホルモン化合物において測定することができる。例えば、成長ホルモン化合物のin vivoにおける機能的半減期を延長させる特性修飾基により誘導体化された成長ホルモン化合物の場合、誘導体化された成長ホルモン化合物の活性は、hGHの活性よりはるかに低い場合があるが、この低下は、滞留時間の延長により相殺される。
代替的な実施形態では、成長ホルモン活性を、誘導体化されたホルモン化合物において測定することもできる。ならびに、さらなる実施形態では、成長ホルモン活性を、成長ホルモンコンジュゲート(胆汁酸コンジュゲーションを含めた)および任意のさらなる特性修飾的な化学修飾において測定し、このようなコンジュゲーションおよび/または修飾が、受容体の相互作用に干渉しないことを確認する。試験は、モルベースで、または相対タンパク質/ペプチド含量によりhGHと比較されうること、例えば、任意の誘導体またはコンジュゲーションの重量を包含しないことに注意すべきである。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、このようなポリペプチドの断片であり、この断片が、顕著な量の、上記で説明した成長ホルモン活性を保持している。
本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、hGHの切断形である、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基が、配列番号1に対応するN末端および/またはC末端から欠失しているが、前記化合物は、野生型hGHの所望の生物学的特性を保持している。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、in vivoにおける半減期を延長させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、保管寿命を延長させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、融合タンパク質でありうる。
本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、PEG、炭水化物、アルブミン結合剤、脂肪酸、アルキル鎖、親油性基、ビタミン、またはその側鎖もしくは主鎖に対するスペーサーなどであるがこれらに限定されない部分を結合させることにより(胆汁酸コンジュゲートに加えて)化学修飾されている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、化学修飾されていないhGHまたはhGH変異体と比較した場合、上皮を介する輸送を容易とするために化学修飾されている。化学修飾は、本明細書で説明されるコール酸残基のコンジュゲーションなどでありうる。Caco-2細胞アッセイまたはMDCK細胞アッセイなどの異なるアッセイを用いて、細胞層を介する成長ホルモン化合物の輸送を推定することができる。
一実施形態では、本発明の成長ホルモン化合物が、in vivoにおける作用の持続を延長させるために化学修飾されている。
本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、in vivoにおける機能的半減期の持続を延長させるために化学修飾されている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物の化学修飾が、一過性の性質でもありうる、すなわち、in vivoにおいてそれらはまた、容易に除去することもできる。
一実施形態では、成長ホルモン化合物の修飾が、成長ホルモン化合物とヒト成長ホルモン受容体(hGHR)との結合を妨げない任意のアミノ酸残基において生じうる。
本明細書の下記で記載されるさらなる実施形態では、コンジュゲーションを、wt hGH残基および突然変異体残基から選択される異なる位置で発生させることができる。
一実施形態では、コンジュゲーションを、N末端またはC末端を介して結合させる。
一実施形態では、コンジュゲーションを、Gln40、およびGln141などのGln残基を介して結合させる。
胆汁酸リンカーまたは代替的な誘導体を、突然変異体の残基を介してGHに結合させる、さらなる実施形態では、コンジュゲートのGHが、GHのN末端領域、H1領域、L1領域、H2領域、L2領域、またはH3領域におけるCysによる単一突然変異のうちのいずれか1つから選択される、Cysによる単一突然変異を有しうる。
さらなるこのような実施形態では、Cysによる単一突然変異を、N末端に位置させ、突然変異をhGH(配列番号1)のT3C、P5C、S7Cのうちのいずれか1つなどとするか、H1(アミノ酸9〜35に対応する)に位置させ、突然変異をhGH(配列番号1)のD11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35Cのうちのいずれか1つなどとするか、L1(アミノ酸36〜71に対応する)に位置させ、突然変異をhGH(配列番号1)のQ40C、K41C、Y42C、S55C、S57C、S62Cのうちのいずれか1つなどとするか、H2、L2、またはH3(アミノ酸72〜98、アミノ酸99〜106、およびアミノ酸107〜127に対応する)に位置させ、突然変異をhGH(配列番号1)のE88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101 C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cのうちのいずれか1つなどとする。Cysによる単一突然変異をhGH変異体内に存在させる場合、突然変異は、対応するアミノ酸残基に配置される。
さらなる実施形態は、GHコンジュゲートであって、GHにおけるCysによる単一突然変異が、Q40C、S62C、およびL101Cのうちのいずれか1つなど、hGH(配列番号1)のT3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cのうちのいずれか1つから選択されるGHコンジュゲートを包含する。
なおさらなる実施形態では、Cysによる単一突然変異が、hGHにおけるアミノ酸93〜106内、またはhGH変異体における対応する残基内に配置される。
さらなる具体的な実施形態では、Cysによる単一突然変異が、アミノ酸99〜106、もしくはアミノ酸99〜103などのL2内、または対応する残基内に配置される。
in vivoにおける貯留時間が延長された成長ホルモンコンジュゲートを得るためには、成長ホルモン化合物の安定性を最適化し、とりわけ、タンパク質分解を受けにくい成長ホルモン化合物を適用することが有望である。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、プロテアーゼに対する安定性を増大させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、タンパク質分解に対する安定性を増大させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、膵臓プロテアーゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、消化管内に存在するプロテアーゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、哺乳動物の血漿中に存在するプロテアーゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を有する。ジスルフィド結合は、それらの一方または両方が点変異により野生型hGH配列中の導入される、システイン対の間で形成される。変異部位は、導入されるシステイン残基が、フォールドタンパク質の三次元構造内に適切な形で配置され、ジスルフィド結合の形成を可能とするように選択される。ただ1つのシステインを導入する場合、ジスルフィド結合を形成するときのそのパートナーは、野生型hGHに存在する4つのシステイン残基のうちの1つを包含する。さらなるジスルフィド結合を有するフォールドタンパク質は、適切な宿主生物を介して、可溶性形態のhGHの適切なシステイン変異体を発現させることにより得ることもでき、当業者によく知られている(CabritaおよびBottomley、Biotechnology Annual Review (2004) 10、31〜50頁)成長ホルモン化合物の標準的なリフォールディング条件を用いて封入体から回収することもできる。例えば、その結合タンパク質の2つのコピーと複合体化させたhGH(PDB受託コード1HWG)の、実験的に決定された三次元構造を用いるコンピュータ計算法により、さらなるジスルフィド結合を導入するための候補位置の同定を支援することができる。ジスルフィド結合を導入するのに適切な位置は、Dombkowski A., A.、Bioinformatics (2003) 19、1852〜1853頁;およびPetersenら、Protein Eng. (1999) 12、535〜548頁に記載されるジスルフィド結合についての距離および形態についての基準に基づいて選択することができる。
システイン変異体は、導入されるジスルフィド結合が、タンパク質の天然構造を破壊せず、hGHと関連する所望の生物学的活性に対して及ぼす負の影響が最小限であるように選択される。したがって、化合物は、導入されるジスルフィド結合が、hGHRとの相互作用を損なわないように構築される。受容体との相互作用に重要なhGH内の領域は、1HWGから同定されている。したがって、1HWG構造を解析することにより、生物学的活性に関しては中性であるジスルフィド結合を導入するのに適切な位置の選択を誘導することができる。
システイン変異体は、導入されるジスルフィド結合が、タンパク質分解による切断に対する安定性を増大させるように選択することができる。タンパク質が、タンパク質分解による切断をどの程度受けやすいかは、部分的には、前記タンパク質のアミノ酸一次配列により規定される。プロテアーゼは、比較的非特異的な場合もあり、選択性の程度を変化させながら、アミノ酸一次配列内の特異的モチーフを認識する場合もある。しかし、タンパク質分解に対する安定性には、基質として作用するタンパク質分子の三次元構造および動態が強く影響する。高度に可撓性で動的なループ構造が、プロテアーゼにより触媒される切断に対して特に脆弱であるのに対し、十分に構造化された領域は、一般にそれほど脆弱ではない。したがって、ジスルフィド結合を導入することにより、タンパク質の力動的領域を安定化させることにより、タンパク質分解による切断に対する保護が得られる。
2つのシステイン残基間におけるジスルフィド架橋では、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合の形成を容易にするために、本明細書の上記で定義した領域または位置のうちのいずれかにおいて、システイン残基を導入することもでき、これに置換することもできる。アミノ酸残基の置換および挿入は、当業者に知られる標準的な技法により実施することができる。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1により定義されるhGHと比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む。本明細書で上記した通り、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドは、配列番号1により同定されるヒト成長ホルモンと高レベルの同一性を有することが好ましい。
したがって、配列番号1により定義されるhGHに1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を導入することによりタンパク質分解に対して耐性とした、安定なGH化合物は、本明細書に記載の胆汁酸残基のコンジュゲーションにかけられる。一実施形態では、該成長ホルモン化合物が、タンパク質分解に対して安定化されている。
一実施形態では、ループ部分とヘリックス構造との間にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。
一実施形態では、ループ部分内にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。
一実施形態では、ループ部分間にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。
一実施形態では、ヘリックス間にジスルフィド結合を導入することにより、成長ホルモン化合物のタンパク質分解に対する増大した安定性を達成する。
一実施形態では、導入されるジスルフィド結合のうちの少なくとも1つが、成長ホルモン化合物の2つのシステイン残基を連結し、前記システイン残基のうちの少なくとも1つは、野生型hGH内には存在しない。
一実施形態では、成長ホルモン化合物に導入されるジスルフィド結合が、H3とH4とを連結するループ(L3;残基128〜154)を安定化させる、すなわち、導入されるジスルフィド結合内のシステインのうちの少なくとも1つが、残基128〜154を含む部分に配置される(図1および2)。
一実施形態では、成長ホルモン化合物に導入されるジスルフィド結合が、Dombkowski A., A.、Bioinformatics (2003) 19、1852〜1853頁;およびPetersenら、Protein Eng. (1999) 12、535〜548頁に記載されている距離および形態についての基準を用いて選択されるシステイン残基間に配置される。
上記した通り、成長ホルモン化合物は、ポリペプチドのループ部分とヘリックス部分との間を連結するか、またはループ部分内を連結するか、またはループ部分間を連結する、またはヘリックス部分間を連結する、さらなるジスルフィド結合を含む。本出願の目的では、任意のこのようなさらなるジスルフィド結合の位置を、配列番号1で定義されるhGHポリペプチドと関連して説明する。ヘリックス間、ループ間、およびループとヘリックスとの間を連結する結合をもたらす、Cysによる突然変異の非限定的な例を、以下の表に列挙する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C、および/またはV185C/S188Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C、および/またはR94C/D107Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
本発明による一実施形態では、コンジュゲートの成長ホルモン化合物は、システインのうちの少なくとも1つが、L3(配列番号1中のアミノ酸128〜154)、またはアミノ酸135〜148、もしくは対応するアミノ酸残基により定義されるループの中央領域などに存在する、さらなるジスルフィド結合を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物のさらなるジスルフィド結合のシステインのうちの少なくとも1つが、L3の、配列番号1中のアミノ酸141、アミノ酸142、アミノ酸143、アミノ酸144、アミノ酸145、またはアミノ酸146、好ましくはアミノ酸143またはアミノ酸144に対応する位置に存在する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、および/またはF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、および/またはF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
本発明による一実施形態は、成長ホルモン化合物が、L3をL1と連結するさらなるジスルフィド結合を含むコンジュゲートに関する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1のL3内のアミノ酸54、アミノ酸55、アミノ酸56、アミノ酸57、アミノ酸58、またはアミノ酸59に対応するアミノ酸残基を、配列番号1のL1内のアミノ酸143またはアミノ酸144に対応するアミノ酸と連結するさらなるジスルフィド結合を含む。
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、および/またはS71C/S132Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
本発明による一実施形態は、L3をヘリックス2(H2)などのヘリックス部分と連結するさらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物に関する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1のH2内のアミノ酸84またはアミノ酸85に対応するアミノ酸残基を、配列番号1のL3内のアミノ酸143またはアミノ酸144に対応するアミノ酸と連結するさらなるジスルフィド結合を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、およびF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、および/またはF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
本発明による一実施形態は、L2をヘリックス1と連結するさらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物に関する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、D26C/V102CまたはD26C/Y103Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
一実施形態では、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、および/またはエラスターゼなどの消化性プロテアーゼなど、プロテアーゼによる分解に対して安定化されている。
本発明の一実施形態では、成長ホルモン化合物が、トリプシン、キモトリプシン、および/またはエラスターゼによるタンパク質分解に対する安定性を増大させている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、キモトリプシンおよび/またはエラスターゼによる分解に対して安定化されている。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、H21/M170、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、および/またはS85C/S144Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、D26/V102C、D26/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C、および/またはR94C/D107Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、および/またはS85C/S144Cに対応する少なくとも1対の変異を含む。
さらなる実施形態では、本発明が、式Iの成長ホルモンコンジュゲートであって、成長ホルモン化合物が、ヒト成長ホルモンと比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合、および少なくとも1つのさらなる単一点突然変異を含む成長ホルモンコンジュゲートに関する。少なくとも1つの単一点突然変異を成長ホルモン化合物中に組み入れうるのは、成長ホルモン化合物の機能性と関連する多様な理由による。前記少なくとも1つのさらなる単一点突然変異は、プロテアーゼに対する安定性をさらに増大させること、および/または、例えば、化学修飾に適する化学的実体を含むアミノ酸残基を導入することにより、化学修飾に適する「部位」をもたらすことを目的としうる。
したがって、本発明は、成長ホルモン化合物が、配列番号1により定義されるヒト成長ホルモンと比較して、本明細書で上記した1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合、および少なくとも1つのさらなる単一点突然変異を含む、任意の成長ホルモンコンジュゲートに関する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物の少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、既知のプロテアーゼ部位に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の1〜55、57、58、60〜63、67〜87、89〜91、93、95〜100、101、102〜128、131〜132、135〜139、141、142、144、148〜182、184、185、および/または187〜191位に対応する位置に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異を、hGHの位置T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122、およびG126に対応する位置に存在させる。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の10、40、41、42、55、57、62、101、134、136、139、142、および/または144位に対応する位置に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の55、57、62、101、134、136、139、142、および/または144位に対応する位置に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1の62、101、134、136、139、142、および/または144位に対応する位置に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L1(配列番号1のアミノ酸36〜71に対応する)および/またはL3(配列番号1のアミノ酸128〜154に対応する)に存在し、さらなる実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L1に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L1の中央領域(配列番号1のアミノ酸40〜65に対応する)に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、配列番号1の40、41、42、55、57、および/または62位に対応する位置に存在する。一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L3に存在し、さらなる実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、L3の中央領域(配列番号1のアミノ酸134〜148に対応する)に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つの単一点突然変異が、配列番号1の134、136、139、142、および/または144位に対応する位置に存在する。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異は、配列番号1で定義されるhGHの62位に対応する位置である。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1で定義されるhGHの62位に対応する位置である。このような一実施形態では、セリン(S62)が、トレオニン(T)、アスパラギン(N)、システイン(C)、ヒスチジン(H)、グルタミン(Q)、およびグルタミン酸(E)の群から選択されるアミノ酸残基で置換される。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1で定義されるhGHの55位に対応する位置である。このような一実施形態では、セリン(S55)が、トレオニン(T)、アスパラギン(N)、システイン(C)、ヒスチジン(H)、グルタミン(Q)、およびグルタミン酸(E)の群から選択されるアミノ酸残基で置換される。
一実施形態では、少なくとも1つのさらなる単一点突然変異が、配列番号1で定義されるhGHの57位に対応する位置である。このような一実施形態では、セリン(S57)が、トレオニン(T)、アスパラギン(N)、システイン(C)、ヒスチジン(H)、グルタミン(Q)、およびグルタミン酸(E)の群から選択されるアミノ酸残基で置換される。
本発明によれば、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合が、配列番号1と比較して少なくとも2つのアミノ酸をアミノ酸置換することにより得られる。
さらなる実施形態では、化合物が、配列番号1と比較して、正確に1つのさらなるジスルフィド結合を含む。
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも2つのさらなるシステインを含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドが、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に2つのさらなるシステインを含む。
さらなる実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも2つのさらなるシステインを含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1と比較して、正確に3つのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に2つのさらなるシステインおよび正確に1つのさらなる単一点突然変異を含む。
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1と比較して、最大で合計10カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、最大で7カ所など、最大で6カ所など、最大で5カ所など、最大で4カ所など、最大で合計8カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に3つのさらなるシステインを含む。
一実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、1つのさらなるジスルフィド結合、およびcysによる単一点突然変異を含む。
一実施形態では、Cysによる単一点突然変異が、GHのN末端領域、H1領域、H2領域、L2領域、またはH3領域におけるCysによる単一点突然変異のうちのいずれか1つから選択される。
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGH(配列番号1)のT3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cに対応する突然変異の群から選択される、Cysによる単一点突然変異を有する。
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGHにおけるアミノ酸99〜106、またはアミノ酸99〜103など、アミノ酸93〜106に対応する位置に配置される、Cysによる単一点突然変異を有する。
一実施形態では、cysによるさらなる単一点突然変異が、N99C、S100C、またはL101Cである。一実施形態では、cysによるさらなる単一点突然変異が、hGHにおけるアミノ酸55〜62に対応する位置に配置される。一実施形態では、cysによるさらなる単一点突然変異が、S55C、S57C、またはS62Cである。
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1と比較して、最大で合計10カ所のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物が、最大で7カ所など、最大で6カ所など、最大で5カ所など、最大で4カ所など、最大で合計8カ所のアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物のポリペプチドが、配列番号1と比較して、正確に3カ所のアミノ酸置換を含む。
その中にさらなるジスルフィド架橋を導入しうるGH化合物の他の例には、参照により本明細書に組み込まれる、WO92/09690(Genentech社)、US6,004931(Genentech社)、US6,143,523(Genentech社)、US6,136,536(Genentech社)、US6,057,292(Genentech社)、US5,849,535(Genentech社)、WO97/11178(Genentech社)、WO90/04788(Genentech社)、WO02/055532(Maxygen APS社およびMaxygen Holdings社)、US5,951,972(American Cynanamid社)、US2003/0162949(Bolder Biotechnologies社)において開示されるGH化合物が含まれる。含まれるさらなる例は、Masuda.Nら、Biochim. Biophys. Acta 949 (1988) (1)、125〜131頁により説明される、20kDaの変異体など、hGHの天然変異体である。
本明細書に記載のすべての実施形態では、成長ホルモン化合物が、配列番号1の120位に対応する位置にGly残基を有することがさらなる選択肢である。
本明細書で記載される成長ホルモンポリペプチドは、当業者により、方法1および2に従い、本明細書の下記で説明される通りに調製することができる。
ポリペプチドの作製は、当技術分野でよく知られている。例えば、ポリペプチドは、古典的なペプチド合成、例えば、tert-Boc化学反応もしくはtert-Fmoc化学反応を用いる固相ペプチド合成、または他の十分に確立された技法により作製することができる(例えば、GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、2006を参照されたい)。
ポリペプチドはまた、その発現を可能とする条件下にある適切な栄養培地中においてそれをコードするDNA配列を含有し、それを発現させることが可能な宿主細胞を培養するステップを含む方法によっても作製することができる。非天然のアミノ酸残基を含むポリペプチドの場合、例えば、tRNA変異体を用いることにより、該非天然アミノ酸が、ポリペプチド内へと組み込まれるように、組換え細胞を改変すべきである。
ポリペプチドはまた、細胞を含まない、in vitroにおける転写/翻訳系を用いても作製することができる。新規の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドはまた、例えば、J. Am. Chem. Soc. (2003) 125、11782〜11783頁; Science (2003) 301、964〜967頁; Science (2001) 292、498〜500頁; Science (2004) 303、371〜373頁;ならびに本明細書の参考文献中に記載される通り、フレームシフト系またはナンセンス抑制系を用いても作製することができる。
細胞を培養するのに用いられる培地は、適切な補充物質を含有する最小培地または複合培地など、宿主細胞を増殖させるのに適する、任意の従来の培地でありうる。適切な培地は、市販品の販売元から販売されているか、または公表されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中のレシピ)に従い調製することができる。次いで、遠心分離または濾過により宿主細胞を培地から分離するステップを含めた従来の手順により、細胞が生成するペプチドを、培地から回収することができる。細胞外生成物については、対象となるポリペプチドの種類に応じて、濾過、カラムクロマトグラフィー、または沈殿、例えば、精密濾過、限外濾過、等電沈殿、各種のクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを介する精製により、上清のタンパク質成分を単離する。細胞内生成物またはペリプラズム生成物の場合は、培地から単離した細胞を、分解するかまたは透過させて抽出し、生成物であるポリペプチドまたはその前駆体を回収する。
ポリペプチドをコードするDNA配列は、適切な形でゲノムまたはcDNAに由来することが可能であり、例えば、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、標準的な技法(例えば、Sambrook, J、Fritsch, EF、およびManiatis, T、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989を参照されたい)に従い、特異的なDNAプローブまたはRNAプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、該ペプチドの全部または一部をコードするDNA配列についてスクリーニングすることにより得ることができる。ポリペプチドをコードするDNA配列はまた、確立された標準的な方法、例えば、BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Letters (1981) 22、1859〜1869頁により記載されるホスホルアミダイト法、またはMatthesら、EMBO Journal (1984) 3、801〜805頁により記載される方法を介する合成によっても調製することができる。DNA配列はまた、例えば、US4,683,202またはSaikiら、Science (1988) 239、487〜491頁に記載される特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によっても調製することができる。
発現させるペプチドをコードするDNA配列を、組換えDNA手順にかけることが簡便でありうる任意のベクター内に挿入することができるが、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が、染色体の複製から独立している染色体外の実体、例えば、プラスミドとして存在するベクターでありうる。代替的に、ベクターは、宿主細胞内へと導入されると、宿主細胞のゲノム内へと組み込まれ、それが組み込まれた染色体と併せて複製されるベクターでもありうる。
ベクターは、ポリペプチドをコードするDNA配列が、プロモーターなど、DNAの転写に必要とされるさらなる部分へと作動的に連結される発現ベクターでありうる。プロモーターは、選択される宿主細胞内において転写活性を示す任意のDNA配列であることが可能であり、該宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。各種の宿主細胞内で発現させるペプチドをコードするDNAの転写を誘導するのに適切なプロモーターの例は当技術分野で知られており、例えば、Sambrookら、前出を参照されたい。
発現させるペプチドをコードするDNA配列はまた、必要な場合、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、および翻訳エンハンサー配列にも作動的に連結することができる。本発明の組換えベクターは、対象の宿主細胞内でベクターを複製することが可能なDNA配列をさらに含みうる。
ベクターはまた、選択マーカー、例えば、その産物が、宿主細胞内における欠損を補完する遺伝子、または薬物、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子も含みうる。大規模生産の場合、選択マーカーは、例えば、抗生剤耐性ではない場合がある、例えば、ベクター内における抗生剤耐性遺伝子は、該ベクターを大規模生産に用いるときに除去される場合がある。ベクターから抗生剤耐性遺伝子を除去する方法は、当技術分野で知られている(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、US6,358,705を参照されたい)。
発現させるペプチドを、宿主細胞の分泌経路内へと誘導するために、組換えベクター内に分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られている)を施すことができる。分泌シグナル配列は、適正なリーディングフレーム内においてペプチドをコードするDNA配列に結合する。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするDNA配列に対して5’側に配置することが一般的である。分泌シグナル配列は、ペプチドと通常の形で会合する配列の場合もあり、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来する場合もある。
発現させるペプチドをコードするDNA配列、プロモーター、ならびに、場合によって、ターミネーターおよび/または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを、複製に必要な情報を含有する適切なベクター内へと挿入するのに用いられる手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら、前出を参照されたい)。
DNA配列または組換えベクターを導入する宿主細胞は、本ペプチドを生成することが可能な任意の細胞であることが可能であり、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、および高等真核細胞を包含する。当技術分野でよく知られ、用いられている適切な例は、大腸菌(E. coli)細胞株、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞株、または哺乳動物のBHK細胞株もしくはCHO細胞株であるがこれらに限定されない。発現させるペプチドはまた、当技術分野でよく知られる、in vitroにおける転写/翻訳系を用いることによっても作製することができる。
胆汁酸リンカー
ある態様における本発明は、胆汁酸リンカーに関する。本発明による成長ホルモンコンジュゲートは、下記の化学反応の節において説明される通りに調製することができる。コンジュゲーションの方法は、胆汁酸リンカーの共有結合を伴うが、これは、用いられる方法に応じて、式:
A-W-B1-NH2、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH2-CH=CH2、および
[式中、Aは、胆汁酸残基を表し、B1は、親水性スペーサーを表し、Wは、AとB1とを連結する化学基である]により記載することができる。A、W、およびB1に関するさらなる詳細を、胆汁酸残基、スペーサー、および連結基Wとの関連で下記に示す。B1は、以下:
A-W-B1-NH2→A-W-B1-NH-GH→A-W-B-GH(B=B1-NH)
A-W-B1-CHO→A-W-B1-CH2-GH→A-W-B-GH(B=B1-CH2-)
A-W-B1-LG→A-W-B1-GH→A-W-B-GH(B1=B)
A-W-B1-C(O)NHCH2-CH=CH2→A-W-B1-C(O)NHCH2-CH2-CH2-GH→A-W-B-GH(B=B1-C(O)NHCH2-CH2-CH2-)、および
に記載される通り、Bの一部として見ることができる。
胆汁酸残基
胆汁酸は、天然において多様な形態で生成するが、成長ホルモン化合物にコンジュゲートする前に、さらに修飾にかけることができる。
本発明によれば、成長ホルモンコンジュゲートは、コラン酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、およびタウロケノデオキシコール酸からなる群から選択される胆汁酸残基(A)を含む。
一実施形態では、胆汁酸リンカーおよび/または成長ホルモンコンジュゲートが、
[式中、(*)は、Wを介する親水性スペーサー(B)への結合点を表す]からなる群から選択される胆汁酸残基(A)を含む。
一実施形態では、胆汁酸残基(A)が、コール酸残基であり、このようなコール酸残基が、
[式中、(*)は、Wを介する親水性スペーサー(B)への結合点を表す]からなる群から選択される。
上記から見られる通り、一実施形態では、コール酸残基を、コール酸残基の「3」位、「7」位、「12」位、または「24」位により、Wを介して親水性スペーサー(B)に連結することができる。
一実施形態では、コール酸残基を、「3」位、「7」位、または「12」位により、Wを介して親水性スペーサー(B)に連結することができる。
一実施形態では、コール酸残基を、「3」位により、Wを介して親水性スペーサー(B)に連結することができる。
一実施形態では、コール酸残基を、「7」位により、Wを介して親水性スペーサー(B)に連結することができる。
一実施形態では、コール酸残基を、「12」位により、Wを介して親水性スペーサー(B)に連結することができる。
親水性スペーサー
胆汁酸リンカーおよび/または成長ホルモンコンジュゲートは、親水性スペーサーの存在によりさらに特徴づけられる。親水性スペーサーは、胆汁酸リンカーの機能性を最適化するために、成長ホルモン化合物および胆汁酸残基からの適切な距離をもたらすことを目的とする。コンジュゲートのより優れた合成またはより優れた副次的効果などのさらなる機能性は、スペーサー基のほか、個別のリンカーとも関連しうる。
親水性スペーサーの可溶性は、そのlogP値により記載することができる。分配係数としてもまた知られるlogPとは、平衡にある2つの不混和性溶媒の混合物の2つの相における化合物の濃度比の対数である。溶媒のうちの1つが水であるのに対し、第2の溶媒は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサン、およびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)から選択されることが典型的である。これらの異なる溶媒中で測定されるlogP値は、主に、水素結合の効果のために、差違を示す。オクタノールが、水素結合を与えかつ受け取るのに対し、シクロヘキサンは不活性である。クロロホルムが水素結合を与えうるのに対し、PGDPは水素結合を受け取りうるのみである。
本発明の別の実施形態では、親水性スペーサーの、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサン、またはプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)におけるLogPが、-0.5未満である。
さらなる実施形態では、親水性スペーサーの、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサン、またはプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)におけるLogPが、-1未満である。
代替的に、公表されているアルゴリズム(J. Am. Chem. Soc. (1964)、86、5175〜5180頁、「A New Substituent Constant, Derived from Partition Coefficients」、C. A. Lipinskiら、Advanced Drug Delivery Reviews(1997)、23、3〜25頁、「Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings」、ならびにI. Moriguchi、S. Hirono、I. Nakagome、H. Hirano、Chem. Pharm. Bull.(1994)、42、976〜978頁、「Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods」)を用いて、親水性スペーサー部分のmLogPおよび/またはcLogPとして、LogP値を計算することもできる。
本発明の一実施形態では、親水性スペーサーが、mLogP <0である。さらなる実施形態では、親水性スペーサーのmLogPが、-1.00未満など、-1.50、-2.00、-2.50、-3.00、-3.50、-4.00、または4.50未満など、-0.50未満である。
本発明の一実施形態では、親水性スペーサーが、cLogP<0である。さらなる実施形態では、親水性スペーサーのcLogPが、-1.00未満など、-1.50、-2.00、-2.50、-3.00、-3.50、-4.00、もしくは4.50未満、または-5.00、-5.50、もしくは-6.00未満など、-0.50未満である。
コール酸残基などの特性修飾基を、ポリペプチドおよびタンパク質へとコンジュゲートする場合、タンパク質とコール酸残基との距離が、最終化合物の機能性に影響を及ぼす可能性があり、したがって、親水性スペーサーの使用が有利でありうる。親水性スペーサーを包含するリンカーとタンパク質とのコンジュゲーション反応は通常、緩衝処理された水性環境において実施されるので、親水性スペーサーの使用は、最終化合物の水溶性を増大させる可能性があるほか、このような化合物の収量および合成の容易さを増大させる可能性もある。本明細書の下記で示す通り、本発明で用いられる親水性スペーサーは、COOH基の形態における多数の負の電荷、および/または(-CH2-CH2-O-)n反復基の形態におけるさらなる極性をもたらし、これらのいずれもが、可溶性に肯定的な影響を個別に及ぼしうる。
一実施形態では、親水性スペーサーが、成長ホルモン化合物と胆汁酸残基とを、これらの30〜50%がNまたはOである、少なくとも5つの水素以外の原子を含む化学的部分で分離するスペーサーである。
一実施形態では、親水性スペーサーが、成長ホルモン化合物と胆汁酸残基とを、0〜5つのCOOH基を含む化学的部分で分離するスペーサーである。
一実施形態では、親水性スペーサーが、成長ホルモン化合物と胆汁酸残基とを、0〜100の-CH2-CH2-O-基を含む化学的部分で分離するスペーサーである。
一実施形態では、親水性スペーサー(B)が、少なくとも1つのOEGモチーフである、ラジカルの8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、すなわち、-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-を含む。さらなる実施形態では、親水性スペーサーが、少なくとも2つのOEGモチーフを含む。一実施形態では、このようなOEGモチーフ(複数可)の配向性が、-CO-が、成長ホルモン化合物に最も近接し、-NH-が、アルブミン結合残基に最も近接するような配向性である。
2つのOEGモチーフを含むさらなる実施形態では、2つのモチーフが、同一の配向性を有する場合もあり、異なる配向性を有する場合もある。ある実施形態では、このような2つのOEGモチーフが、互いと隣接して配置されるが、代替的な実施形態では、このようなOEGモチーフが、共有結合させた1つまたは複数の原子で分離される。
ある実施形態では、親水性スペーサーが、少なくとも1つのグルタミン酸残基を含む。グルタミン酸は、2つのカルボン酸基を含む。そのγ-カルボキシ基は、リシンのε-アミノ基とのアミド結合、または存在する場合は、OEG分子のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とのアミド結合を形成するのに用いることができる。代替的に、リシンのε-アミノ基とのアミド結合、または存在する場合はOEG分子のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とのアミド結合を形成するのに、α-カルボキシ基を用いることもできる。Gluのアミノ基は、アルブミン結合残基のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合はOEGモチーフのカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGluのγ-カルボキシ基もしくはα-カルボキシ基とのアミド結合を形成する。
一実施形態では、親水性スペーサー(B)が、2つ以上のグルタミン酸残基を含みうる。1つのGluのアミノ基の、第2のGluのγ-カルボキシ基への連結を、「γ-Glu」モチーフと称する場合がある。
一実施形態では、親水性スペーサーが、少なくとも1つの組み合わされたOEG-Gluモチーフ(-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-NH-CH(-COOH)-(CH2)2-CO-)、もしくは、少なくとも1つの組み合わされたGlu-OEGモチーフ(-NH-CH(-COOH)-(CH2)2-CO-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)、またはこれらの組合せを含み、この場合、このようなGlu-OEGモチーフとOEG-Gluモチーフとを、1つまたは複数の共有結合させた原子により分離することもでき、γ-Gluを形成するGluのアミド結合により互いと直接結合することもできる。
一実施形態では、親水性スペーサー(B)が、式
-X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、F-D1 -(CH2)l6-D2-であり、
l1、l2、l3、l4、l5、およびl6は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
Fは、アリール、ヘタリール、ピロリジン-2,5-ジオン、または原子価結合であり、
この場合、アリール基およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OH、またはC1〜6アルキルで置換されており、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
D1、D2、E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-NHC(O)C1〜6アルキル、-C(O)NHC1〜6アルキル、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]
を有する。
さらなる具体的な実施形態では、スペーサーが、上記で定義された通りであり、この場合、
l1、l2、l3、l4、l5、およびl6が、独立に0〜6であり、
m1、m3、m4、m6、およびm7が、独立に0〜6であり、
m2およびm5が、独立に0〜6であり、
n1、n2、n3、およびn4が、独立に0〜6である。
さらなる具体的な実施形態では、スペーサーが、上記で定義された通りであり、この場合、D1およびD2が、-O-または原子価結合から独立に選択される。
さらなる具体的な実施形態では、スペーサーが、上記で定義された通りであり、この場合、E1およびE2が、-O-または原子価結合から独立に選択される。
さらなる具体的な実施形態では、スペーサーが、上記で定義された通りであり、この場合、W1〜W6が、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-NHC(O)C1〜6アルキル、または-C(O)NHC1〜6アルキル、および原子価結合からなる群から独立に選択される。
さらなる具体的な実施形態では、スペーサーが、上記で定義された通りであり、この場合、R3、R4、R5、R6、およびR7が、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OH、またはC1〜6アルキルから独立に選択され、この場合、アルキル基が、場合によって、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OHで置換されている。
本発明のさらなる実施形態では、成長ホルモンコンジュゲートが、
から選択される親水性スペーサー(B)を含む。
化学連結基
胆汁酸リンカーおよび/または成長ホルモンコンジュゲートは、コール酸リンカーの合成法により決定される化学連結基(W)によりさらに特徴づけられる。化学連結基とは、胆汁酸残基(A)と親水性スペーサー(B)との連結の結果であるか、またはそうではなくて、化学的活性基は、胆汁酸リンカー(A-W-B1-X)[式中、Xは、脱離基(LG)、例えば、B1と、コンジュゲートされる化合物、例えば、hGHまたは代替的な化合物との化学的共有結合の形成に関与しうるハロゲン基または化学的反応基である]の合成時に変化しうるので、胆汁酸残基(A)と、リンカーを合成するのに用いられる中間体との連結の結果である。
一実施形態では、化学基(W)が、-NR1-、-NHC(O)[CH2]n1C(O)-、-NHC(O)CH=CHC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、または-C(O)-
[式中、R1は、水素または-[CH2]n2R2から選択され、n2は、1〜4であり、R2は、-C(O)OH、-S(O)2OH、またはテトラゾール-1 -イルから選択され、n1は、2〜8である]から選択される。
一実施形態では、化学基(X)が、-NH2、-CHO、-LG、-C(O)NHCH2-CH=CH2、または
[式中、LGは、ハロゲンである]から選択される。
成長ホルモンコンジュゲート
本明細書で説明される通り、成長ホルモンコンジュゲートは、本明細書で説明される成長ホルモン化合物と胆汁酸リンカーとを共有結合させることにより形成される。
胆汁酸リンカーは、GHの活性が、前出の節において説明した通りに維持される限りにおいて、成長ホルモン化合物の任意の残基に共有結合させることができる。一実施形態では、GHが、野生型のアミノ酸残基においてコンジュゲートされる。
一実施形態では、GHが、N末端、C末端、Gln40、およびGln141の群から選択される野生型のアミノ酸残基においてコンジュゲートされる。
一実施形態では、GHが、突然変異体残基においてコンジュゲートされる。
一実施形態では、GHが、成長ホルモン化合物に単一点突然変異として導入されるcys残基である突然変異体残基においてコンジュゲートされる。
一実施形態では、成長ホルモンコンジュゲートが、
からなる群から選択される。
成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法
本明細書の下記で示される化学反応の節では、本発明による成長ホルモンコンジュゲートを調製するのに適する方法を説明する。当業者は、このようなコンジュゲートの代替的な調製法も理解しうる。
一態様では、本発明が、成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法であって、
a)胆汁酸リンカーを、成長ホルモン化合物(GH)へとコンジュゲートするステップと、
b)前記成長ホルモンコンジュゲートを得るステップと
を含む方法に関する。
一実施形態では、得られる成長ホルモンコンジュゲートが、本明細書で記載される式I[式中、Aは、胆汁酸残基を表し、Bは、親水性スペーサーを表し、Wは、AとBとを連結する化学基である]により定義される。
一実施形態では、この方法において用いられる胆汁酸リンカーが、
A-W-B1-NH2、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH2-CH=CH2、および
[式中、Aは、胆汁酸残基を表し、B1は、親水性スペーサーを表し、Wは、AとB1とを連結する化学基である]からなる群から選択される。
本明細書における説明に基づけば、B1が、得られる成長ホルモンコンジュゲートの親水性スペーサーとの関連で定義されるBに関することが明らかである。
一実施形態では、親水性スペーサーB1が、親水性スペーサーBの特徴のうちのいずれかを含む。一実施形態では、親水性スペーサーB1が、得られる成長ホルモンコンジュゲートの親水性スペーサーBに含まれる。
一実施形態では、親水性スペーサーB1が、式
-X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、原子価結合であり、
l1、l2、l3、l4、およびl5は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]
を有する。
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に定義および記載される成長ホルモンコンジュゲートを含む医薬組成物も対象とする。
一実施形態では、本発明の医薬組成物を、複数の剤形、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、多相乳剤、発泡体、軟膏(salves)、ペースト、プラスター、軟膏(ointments)、錠剤、コーティング錠剤、吸収増強化合物を共調合した錠剤、洗浄液、カプセル、例えば、硬質ゼラチンカプセルおよび軟質ゼラチンカプセル、コーティングカプセル、坐剤、ドロップ、ゲル、スプレー、粉末、マイクロ粒子、ナノ粒子、エアゾール、吸入剤、注射液、in situ形質転換溶液、例えば、in situゲル化溶液、in situ硬化溶液、in situ沈殿化溶液、in situ結晶化溶液、注射液、および植え込み剤として投与することができる。
本発明の一実施形態では、医薬組成物を、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、および静脈内投与を介して投与することができる。
本発明の一実施形態では、経口医薬組成物を、複数の投与経路、例えば、舌下(lingual、sublingual)投与、口腔内投与、口内投与、直腸内投与、胃内投与、および腸内投与を介して投与することができる。
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、例えば、そのすべてが当業者によく知られるデバイスである、計量型吸入器、乾燥粉末吸入器、および噴霧器を用いて、例えば、GHコンジュゲートなどのペプチドコンジュゲートを肺内投与するための固体、半固体、粉末、および溶液の組成物中において有用である。
一実施形態では、GHコンジュゲートの安定性をさらに増強し、バイオアベイラビリティーを増大させ、可溶性を増大させ、有害作用を軽減し、当業者によく知られる時間療法を達成し、患者による服薬順守を増進するか、またはこれらの任意の組合せを増進するため、本発明の医薬組成物を、例えば、共有結合的相互作用、疎水性相互作用、および静電的相互作用を介して、薬物担体、薬物送達系、および高度薬物送達系へとさらに混合するか、またはさらに結合させることができる。担体、薬物送達系、および高度薬物送達系の例には、ポリマー、例えば、セルロースおよび誘導体、多糖、例えば、デキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、キトサンおよび誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリル酸ポリマーおよびメタクリル酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにこれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えば、アルブミン、ゲル、例えば、熱ゲル化系、例えば、当業者によく知られるブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ粒子、液晶およびこれらの分散液、脂質-水系中での相挙動のうちで当業者によく知られるL2相およびこれらの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルジョン、自己乳化ポリマー、自己マイクロ乳化ポリマー、シクロデキストリンおよびこれらの誘導体、ならびにデンドリマーが含まれるがこれらに限定されない。
参照により本明細書に組み込まれる経口製剤のための送達系の各種の例には、親水性化合物の浸透を増大させることが知られる界面活性剤が含まれる。界面活性剤の例は、Takatsukaら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2006) 62、52〜58頁により記載される、カプリン酸ナトリウム、酒石酸、Brij56、Brij58、Brij35、Brij30、脂肪酸糖、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、p-t-オクチルフェノールポリオキシエチレン9.5(Triton X-100)である。経口送達系にはまた、プロテアーゼ阻害剤および粘液溶解物質もまた含まれうる。プロテアーゼ阻害剤の例は、ダイズトリプシン阻害剤、アプロチニン、およびキモスタチンである。粘液溶解物質の例は、粘液溶解剤および界面活性剤の併用を介する、ジチオトレイトールおよびN-アセチルシステインによる、吸収の悪い親水性化合物に対する腸内吸収増強剤である。Emisphere社により開発された5-CNACおよび類似の化合物(WO2008101240、WO200811283687、WO2008027854、WO2008014430、US20080095837)もまた例として含まれる。
経口製剤送達系にはまた、上皮細胞の密着結合に対する特異的開口剤として機能する、密着接合調節剤もまた含まれうる。これらの密着接合調節剤は、一過性でも非一過性でも機能し、上皮細胞を併せて密着させるタンパク質複合体に干渉する(Kondohら、Mol Pharmacology (2005) 67、749〜756頁)。経口製剤のための送達系の他の例には、粘膜付着剤(例えば、チオール含有添加剤(共製剤)または共有結合させた側鎖により、粘膜層への付着を増大させることができる)、キトサン分子およびカルボマー分子、ポリアクリレート、PEGおよびその誘導体(Palmbergerら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2007) 66、405〜412頁; Leitner, V.Mら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2003) 56、207〜214頁; H. L. Leussenら、Parm. Res. (1996) 13、1668〜1672頁; H. L. Leussenら、Int. J. Pharmaceuticals (1996) 141、39〜52頁; Takatsukaら、Eur. J. Pharm. Biopharm. (2006) 62、52〜58頁)が含まれる。経口製剤のための送達系のさらなる例には、カベオラ/脂質ラフト、SMVT(ナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター)が含まれる。経口送達のための製剤の別の例には、ビタミンB12(Cobalamin)を基質として用いるIRF(内因性因子受容体)、FcRn(新生児Fc受容体)、およびトランスフェリンなど、受容体を介するトランスサイトーシスのための製剤 (M. Gumbleton、Adv. Drug. Del. Rev. (2001) 49、281〜300頁; K.C. Partlowら、Biomaterials (2008) 29、3367〜3375頁; Leeら、Biotechnol. Appl. Biochem. (2007) 46、211〜217頁; S.Y. Chaeら、Bioconjugate Chem. (2008) 19、334〜341頁; Russell-Jones G.: 17章、「Membrane Transporters as Drug Targets」(1999); SaidおよびMohammed、Curr. Opin. Gastroent. (2006) 22、140〜146頁; Chalasaniら、J.Con.Release (2007) 117、421〜429頁; H. LiおよびZ.M. Qian、Med. Res. Rev. (2002) 22、225〜250頁; LiangおよびYang、Biochem. Biophys. Res. Comm. (2005) 225、734〜738頁)が含まれる。
一実施形態では、本発明のGH化合物が、成長ホルモン活性を及ぼし、これを用いて、循環成長ホルモン量の増大から利益を得る疾患または状態を治療することができる。このような疾患または状態には、成長ホルモン欠損症(GHD);ターナー症候群;プラダー-ウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患、若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症、HAART治療を受ける小児おけるHIV感染(HIV/HALS小児); SGA性低身長児; SGA以外の極低出生体重児における低身長(VLBW);骨格異形成;低軟骨形成症;軟骨無形成症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD;脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、および手指など、長骨における骨折もしくは長骨の骨折;頭蓋骨、手の指節骨底、および足の趾節骨底など、海綿骨における骨折もしくは海綿骨の骨折;例えば、手、膝、もしくは肩における腱もしくは靭帯の手術後における患者;仮骨延長法を施されているかもしくはこれを経過しつつある患者;膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手関節、もしくは顎関節など、股関節もしくは椎間板の置換術、半月板の修復術、脊椎の癒合術もしくは装具固定術後における患者;ネイル、スクリュー、およびプレートなどの骨合成材料を体内に固定した患者;骨折による偽関節もしくは骨折の変形治癒を示す患者;例えば、脛骨または第一趾からの骨切除術後の患者;移植片植え込み後の患者;外傷もしくは関節炎により引き起こされる、膝における関節軟骨の変性;ターナー症候群を示す患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析の成人患者(APCD);栄養不良に随伴する、APCDにおける心血管疾患; APCDにおける悪液質の可逆化; APCDにおける癌; APCDにおける慢性閉塞性肺疾患; APCDにおけるHIV; APCDである高齢者; APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;肝機能不全; HIV感染を示す男性;短腸症候群;中心性肥満; HIVに随伴する脂肪異栄養症候群(HALS);男性不妊症;大規模な待期的手術、アルコール/薬物の解毒、もしくは神経外傷後における患者;老化;虚弱高齢者;骨関節症;外傷による軟骨損傷;勃起障害;線維筋痛;記憶障害;抑うつ症;外傷性脳傷害;クモ膜下出血;極低出生時体重;メタボリック症候群;グルココルチコイドミオパシー;または小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長が含まれる。成長ホルモンはまた、筋肉組織、神経組織、もしくは創傷の治癒の加速化;損傷した組織への血流の加速化もしくは改善;または損傷した組織における感染率の低減にも用いられている。
一実施形態では、本発明が、疾患を治療する方法であって、循環成長ホルモン化合物量の増大から利益を得る疾患または状態を治療するのに成長ホルモン化合物活性を用いることができ、有効量の、配列番号1による成長ホルモン化合物またはそのコンジュゲートによる医薬組成物を、患者に投与するステップを含む方法に関する。
一実施形態では、本発明が、それを必要とする患者に、治療有効量の、本発明による成長ホルモン化合物を投与するステップを含む方法に関する。したがって、本発明は、これらの疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、本発明による成長ホルモン化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
本明細書で用いられる、「治療有効量」の本発明の化合物とは、所与の疾患およびその合併症の臨床症状を治癒させるか、緩和するか、または部分的に停止させるのに十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量が、「治療有効量」と規定される。各々の目的に対する有効量は、例えば、疾患または傷害の重症度のほか、対象の体重、性別、年齢、および全般的状態に依存する。適切な用量の決定は、医師または獣医の技術分野の範囲内にある、日常的な実験を用いて達成することができる。
一実施形態では、本発明が、上述の疾患または状態を治療するのに用いられる薬剤の製造における、成長ホルモン化合物またはそのコンジュゲートの使用を提供する。
本明細書で定義および記載される成長ホルモン化合物は、治療用タンパク質として用いられることを意図する。
本明細書で引用される刊行物、特許出願、および特許を含めたすべての参考文献は、参照によりその全体において、ならびに、各参考文献が、参照により組み込まれるように個別かつ具体的に示され、かつ、本明細書においてその全体性において(法律により許容される最大限度まで)示されたと仮定した場合と同程度に本明細書に組み込まれる。
本明細書では、すべての見出しおよび小見出しを便宜のためだけに用いるものであり、いかなる形でも本発明を限定するものとしては理解しないものとする。
本明細書で示される任意およびすべての例、または例示的表現(例えば、「など」)は、本発明をよりよく例示することだけを意図するものであり、別段に特許請求しない限り、本発明の範囲に対して限定を付与するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、本発明の実施にとって本質的ではあるが特許請求はなされない、いかなる要素を示すものとしても理解しないものとする。
本明細書における特許文献の引用および組込みは、便宜だけを目的とするものであり、このような特許文献の妥当性、特許性、および/または法的強制力のうちのいかなる観点を反映するものでもない。
本発明は、関連法規により許容される通り、本明細書に付属の特許請求の範囲で列挙される対象物に対するすべての改変およびその同等物を包含する。
本発明は、本明細書の下記で提示される非限定的な実施形態の列挙によりさらに説明される。
実施形態1:式(I):
A-W-B-GH (I)
[式中、
GHは、成長ホルモン化合物を表し、
Aは、胆汁酸残基を表し、
Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、
Wは、AとBとを連結する化学基である]
の成長ホルモンコンジュゲートおよび薬学的に許容される塩。
実施形態2:成長ホルモン化合物GHが、配列番号1により定義されるヒト成長ホルモン(hGH)と比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態1に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態3.:成長ホルモン化合物GHが、ループ部分とヘリックス部分との間を連結する、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態2に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態4:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/V103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/V143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C、および/またはV185C/S188Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態5:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C、および/またはR94C/D107Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態4に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態6:成長ホルモン化合物が、さらなるジスルフィド結合を含み、システインのうちの少なくとも1つが、配列番号1中のアミノ酸128〜154に対応するL3内、または配列番号1中のアミノ酸135〜148に対応する領域内などに存在する、実施形態1から5のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態7:さらなるジスルフィド結合のシステインのうちの少なくとも1つが、配列番号1中のアミノ酸141、アミノ酸142、アミノ酸143、アミノ酸144、アミノ酸145、またはアミノ酸146、好ましくはアミノ酸143またはアミノ酸144に対応する位置にあるL3内に存在する、実施形態6に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態8:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、および/またはF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態6に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態9:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、および/またはF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態8に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態10:成長ホルモン化合物が、L3をL1と連結するさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態1から9のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態11:化合物が、配列番号1のL3内のアミノ酸54、アミノ酸55、アミノ酸56、アミノ酸57、アミノ酸58、またはアミノ酸59に対応するアミノ酸残基を、配列番号1のL1内のアミノ酸143またはアミノ酸144に対応するアミノ酸と連結するさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態10に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態12:化合物が、配列番号1中に、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、および/またはS71C/S132Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態11に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態13:成長ホルモン化合物が、L3をヘリックス部分と連結するさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態2から9のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態14:化合物が、L3をヘリックス2と連結するさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態13に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態15:化合物が、配列番号1のH2内のアミノ酸84またはアミノ酸85に対応するアミノ酸残基を、配列番号1のL3内のアミノ酸143またはアミノ酸144に対応するアミノ酸と連結するさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態14に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態16:化合物が、配列番号1中に、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、およびF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態14に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態17:化合物が、配列番号1中に、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、および/またはF92C/T148Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態16に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態18:成長ホルモン化合物が、L2をヘリックス1と連結するさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態1から9のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態19:化合物が、D26C/V102CまたはD26C/Y103Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態18に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態20:ポリペプチド配列が、配列番号1により定義されるhGHと90%など、95%など、96%など、97%など、98%など、99%など、少なくとも80%同一である、実施形態1から19のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態21:成長ホルモン化合物が、プロテアーゼ部位における少なくとも1つの単一点突然変異を含む、実施形態1から20のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態22:成長ホルモン化合物が、配列番号1の1〜55、57、58、60〜63、67〜87、89〜91、93、95〜100、102〜128、131〜132、135〜139、141、142、144、148〜182、184、185、および/または187〜191位に対応する位置における少なくとも1つの単一点突然変異を含む、実施形態1から21のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態23:成長ホルモン化合物が、配列番号1の55、57、62、101、134、136、142、および/または144位に対応する位置(複数可)における少なくとも1つの単一点突然変異を含む、実施形態1から22のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態24:少なくとも1つの単一点突然変異が、L1(配列番号1のアミノ酸36〜71に対応する)および/またはL3(配列番号1のアミノ酸128〜154に対応する)に存在する、実施形態1から23のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態25:少なくとも1つの単一点突然変異が、L1に存在する、実施形態24に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態26:少なくとも1つの単一点突然変異が、L1の中央領域(配列番号1のアミノ酸40〜65に対応する)に存在する、実施形態25に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態27:少なくとも1つの単一点突然変異が、配列番号1の40、41、42、および/または62位に対応する位置に存在する、実施形態26に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態28:少なくとも1つの単一点突然変異が、L3に存在する、実施形態24に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態29:少なくとも1つの単一点突然変異が、L3の中央領域(配列番号1のアミノ酸134〜148に対応する)に存在する、実施形態28に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態30:少なくとも1つの単一点突然変異が、配列番号1の134、136、139、142、および/または144位に対応する位置に存在する、実施形態29に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態31:そのin vitroにおける活性が、配列番号1により定義される野生型hGHの活性の少なくとも5%である、実施形態1から29のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態32:ポリペプチドのin vivoにおける機能的半減期が、ヒト成長ホルモンと比較して2倍以上である、実施形態1から31のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態33:ポリペプチドのin vivoにおける機能的半減期が、ヒト成長ホルモンと比較して2〜10倍である、実施形態1から30のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態34:ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、および/またはエラスターゼなどの消化性プロテアーゼなど、プロテアーゼによる分解に対して安定化されている、実施形態1から33のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態35:化合物が、キモトリプシンおよび/またはエラスターゼによる分解に対して安定化されている、実施形態34に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態36:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、H21/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、および/またはS85C/S144Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態35に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態37:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C、および/またはR94C/D107Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態36に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態38:成長ホルモン化合物が、配列番号1中に、S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、および/またはS85C/S144Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、実施形態35に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態39: 1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合が、配列番号1と比較して少なくとも2つのアミノ酸をアミノ酸置換することにより得られる、実施形態1から39のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態40:成長ホルモン化合物が、配列番号1と比較して、正確に1つのさらなるジスルフィド結合を含む、実施形態1から39のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態41:成長ホルモン化合物が、番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも2つのさらなるシステインを含む、実施形態1から40のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態42:配列番号1と比較して、正確に3つのアミノ酸置換を含む、実施形態1から41のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態43:配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に2つのさらなるシステイン、および正確に1つの単一点突然変異を含む、実施形態1から42のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態44:成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に2つのさらなるシステインを含む、実施形態1から43のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態45:成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、正確に3つのさらなるシステインを含む、実施形態1から43のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態46:成長ホルモン化合物が、配列番号1で定義されるヒト成長ホルモンと比較して、1つのさらなるジスルフィド結合、およびcysによる単一点突然変異を含む、実施形態45に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態47: cysによる単一点突然変異が、GHのN末端領域、H1領域、H2領域、L2領域、またはH3領域におけるcysによる単一点突然変異のうちのいずれか1つから選択される、実施形態67に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態48: cysによる単一点突然変異が、hGH(配列番号1)のT3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cに対応する突然変異の群から選択される、実施形態46に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態49: cysによる単一点突然変異が、hGHにおけるアミノ酸99〜106、またはアミノ酸99〜103など、アミノ酸93〜106に対応する位置に配置される、実施形態47に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態50:GHが、野生型のアミノ酸残基においてコンジュゲートされる、実施形態1から49のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態51:GHが、N末端、C末端、Gln40、およびGln141の群から選択される野生型のアミノ酸残基においてコンジュゲートされる、実施形態1から50のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態52:GHが、突然変異体残基においてコンジュゲートされる、実施形態1から50のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態53:突然変異体残基が、cysによる突然変異である、実施形態52に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態54: cysによる突然変異が、hGH(配列番号1)のT3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、およびG126Cに対応する突然変異の群から選択される、実施形態53に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態55:cysによる突然変異体が、ヒト成長ホルモンのL101C突然変異に対応する、実施形態54に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態56:ヒト成長ホルモンと比較して、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、および/またはエラスターゼなどの消化性プロテアーゼなど、プロテアーゼ(複数可)によるタンパク質分解に対して安定化させた、実施形態1から55のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態57:成長ホルモン化合物が、上皮を介する輸送を容易とするために化学修飾されている、実施形態1から56のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態58:成長ホルモン化合物が、wthGHと比較した場合、上皮を介する輸送を容易とするために化学修飾されている、実施形態1から57のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態59:成長ホルモン化合物が、wthGHと比較した場合、in vivoにおける機能的半減期を延長させるために化学修飾されている、実施形態1から58のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態60:そのin vivoにおける機能的半減期が、hGHと比較して2倍以上である、実施形態59に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態61: in vivoにおける機能的半減期が、hGHと比較して2〜10倍である、実施形態60に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態62:化学修飾が、そのhGHRとの結合を妨げないアミノ酸残基において生じる、実施形態57から61のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態63:胆汁酸残基(A)が、コラン酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、およびタウロケノデオキシコール酸からなる群から選択される、実施形態1から62のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態64:胆汁酸残基(A)が、
[式中、(*)は、Wを介する親水性スペーサー(B)への結合点を表す]からなる群から選択される、実施形態1から63のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態65:胆汁酸残基(A)が、コール酸残基である、実施形態1から64のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態66:コール酸残基が、
[式中、(*)は、Wを介する親水性スペーサー(B)への結合点を表す]からなる群から選択される、実施形態65に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態67:コール酸残基が、「3」位、「7」位、「12」位、または「24」位により、Wを介して親水性スペーサー(B)に連結される、実施形態63に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態68:化学基(W)が、-NR1-、-NHC(O)[CH2]n1C(O)-、-NHC(O)CH=CHC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、または-C(O)-
[式中、R1は、水素または-[CH2]n2R2から選択され、n2は、1〜4であり、R2は、-C(O)OH、-S(O)2OH、またはテトラゾール-1-イルから選択され、n1は、2〜8である]から選択される、実施形態1から67のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態69:親水性スペーサー(B)が、式
-X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、F-D1 -(CH2)l6-D2-であり、
l1、l2、l3、l4、l5、およびl6は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
Fは、アリール、ヘタリール、ピロリジン-2,5-ジオン、または原子価結合であり、
この場合、アリール基およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OH、またはC1〜6アルキルで置換されており、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
D1、D2、E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-NHC(O)C1〜6アルキル、-C(O)NHC1〜6アルキル、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]
を有する、実施形態1から68のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
実施形態70:
l1、l2、l3、l4、l5、およびl6が、独立に0〜6であり、
m1、m3、m4、m6、およびm7が、独立に0〜6であり、
m2およびm5が、独立に0〜6であり、
n1、n2、n3、およびn4が、独立に0〜6である、
実施形態69に記載のコンジュゲート。
実施形態71:D1およびD2が、-O-または原子価結合から独立に選択される、実施形態69または70に記載のコンジュゲート。
実施形態72:E1およびE2が、-O-または原子価結合から独立に選択される、実施形態69から71のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
実施形態73:W1〜W6が、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-NHC(O)C1〜6アルキル、または-C(O)NHC1〜6アルキル、および原子価結合からなる群から独立に選択される、実施形態69から72のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
実施形態74:R3、R4、R5、R6、およびR7が、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OH、またはC1〜6アルキルから選択され、この場合、アルキル基が、場合によって、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)2OHで置換されている、実施形態69から73のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
実施形態75:親水性スペーサー(B)の可溶性(mLogP)が、1未満である、実施形態1から74のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態76:親水性スペーサー(B)が、少なくとも1つのOEGモチーフ(-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)を含む、実施形態1から75のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態77:親水性スペーサー(B)が、少なくとも2つのOEGモチーフ(-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)を含む、実施形態1から76のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態78:親水性スペーサー(B)が、少なくとも1つのグルタミン酸残基を含む、実施形態1から77のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態79:親水性スペーサー(B)が、2つ以上のグルタミン酸残基を含む、実施形態1から78のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態80:親水性スペーサー(B)が、少なくとも1つのリシン残基を含む、実施形態1から79のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態81:親水性スペーサー(B)が、α-カルボキシ基またはカルボキシ基により、リシン、OEGモチーフ、または別のGlu残基に由来するアミン基とアミド結合を形成する、少なくとも1つのグルタミン酸残基を含む、実施形態1から80のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態81:親水性スペーサー(B)が、アミノ基を介して、アルブミン結合残基(A)のカルボキシ基、OEGモチーフのカルボキシ基、または別のGluのγ-カルボキシ基もしくはα-カルボキシ基とアミド結合を形成する、少なくとも1つのグルタミン酸残基を含む、実施形態1から80のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態82:親水性スペーサー(B)が、
から選択される、実施形態1から81のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態83:
から選択される、実施形態1から82のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態84:実施形態1に記載の成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法であって、
a)胆汁酸リンカーを、成長ホルモン化合物(GH)へとコンジュゲートするステップと、
b)実施形態1から83のいずれか1つに記載の前記成長ホルモンコンジュゲートを得るステップと
を含む方法。
実施形態85:胆汁酸リンカーが、A-W-B1-NH2、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH2-CH=CH2、および
[式中、Aは、胆汁酸残基を表し、B1は、親水性スペーサーを表し、Wは、AとBとを連結する化学基である]からなる群から選択される、実施形態84に記載の方法。
実施形態86:親水性スペーサーB1が、実施形態70から82において定義される親水性スペーサーBの特徴のうちのいずれかを含むか、または親水性スペーサーB1が、実施形態70から82において定義される親水性スペーサーBに含まれる、実施形態85に記載の方法。
実施形態87:親水性スペーサーB1が、式: -X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、原子価結合であり、
l1、l2、l3、l4、およびl5は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]
を有する、実施形態85に記載の方法。
実施形態87:実施形態1から83のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
実施形態88:患者に対して、舌下(lingual、sublingual)投与、口腔内投与、口内投与、経口投与、胃腸内投与、鼻腔内投与、肺内投与、経上皮投与、皮内投与、経皮投与、および非経口投与しうる、実施形態87に記載の医薬組成物。
実施形態89:経口投与用である、実施形態87または88に記載の医薬組成物。
実施形態90:実施形態1から83のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を調製する方法。
実施形態91:疾患を治療する方法であって、患者が循環成長ホルモン量の増大から利益を得る疾患または状態を治療するのに成長ホルモン活性を用いることができ、有効量の、実施形態1から83のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲート、または実施形態87から89のいずれか1つに記載の医薬組成物を、患者に投与するステップを含む方法。
実施形態92:成長ホルモン活性の増大から患者が利益を得る疾患または状態を治療する方法であって、有効量の、実施形態1から83のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲートまたは実施形態87から89のいずれか1つに記載の医薬組成物を患者に投与するステップを含む方法。
実施形態93:疾患が、成長ホルモン欠損症(GHD);ターナー症候群;プラダー-ウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患、若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症、HAART治療を受ける小児おけるHIV感染(HIV/HALS小児); SGA性低身長児; SGA以外の極低出生体重児における低身長(VLBW);骨格異形成;低軟骨形成症;軟骨無形成症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD(GHDA);脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、および手指など、長骨における骨折もしくは長骨の骨折;頭蓋骨、手の指節骨底、および足の趾節骨底など、海綿骨における骨折もしくは海綿骨の骨折;例えば、手、膝、もしくは肩における腱もしくは靭帯の手術後における患者;仮骨延長法を施されているかもしくはこれを経過しつつある患者;膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手関節、もしくは顎関節など、股関節もしくは椎間板の置換術、半月板の修復術、脊椎の癒合術もしくは装具固定術後における患者;ネイル、スクリュー、およびプレートなどの骨合成材料を体内に固定した患者;骨折による偽関節もしくは骨折の変形治癒を示す患者;例えば、脛骨または第一趾からの骨切除術後の患者;移植片植え込み後の患者;外傷もしくは関節炎により引き起こされる、膝における関節軟骨の変性;ターナー症候群を示す患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析の成人患者(APCD);栄養不良に随伴する、APCDにおける心血管疾患; APCDにおける悪液質の可逆化; APCDにおける癌; APCDにおける慢性閉塞性肺疾患; APCDにおけるHIV; APCDである高齢者; APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;肝機能不全; HIV感染を示す男性;短腸症候群;中心性肥満; HIVに随伴する脂肪異栄養症候群(HALS);男性不妊症;大規模な待期的手術、アルコール/薬物の解毒、もしくは神経外傷後における患者;老化;虚弱高齢者;骨関節症;外傷による軟骨損傷;勃起障害;線維筋痛;記憶障害;抑うつ症;外傷性脳傷害;クモ膜下出血;極低出生時体重;メタボリック症候群;グルココルチコイドミオパシー;または小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長から選択される、実施形態90または91に記載の、疾患を治療する方法。
実施形態94:薬剤として用いられる、実施形態1から83のいずれかに記載の成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態95:疾患を治療するための薬物として用いられる、実施形態1から83のいずれか1つに記載の成長ホルモンコンジュゲートであって、前記疾患が、成長ホルモン欠損症(GHD);ターナー症候群;プラダー-ウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患、若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症、HAART治療を受ける小児おけるHIV感染(HIV/HALS小児); SGA性低身長児; SGA以外の極低出生体重児における低身長(VLBW);骨格異形成;低軟骨形成症;軟骨無形成症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD(GHDA);脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、および手指など、長骨における骨折もしくは長骨の骨折;頭蓋骨、手の指節骨底、および足の趾節骨底など、海綿骨における骨折もしくは海綿骨の骨折;例えば、手、膝、もしくは肩における腱もしくは靭帯の手術後における患者;仮骨延長法を施されているかもしくはこれを経過しつつある患者;膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手関節、もしくは顎関節など、股関節もしくは椎間板の置換術、半月板の修復術、脊椎の癒合術もしくは装具固定術後における患者;ネイル、スクリュー、およびプレートなどの骨合成材料を体内に固定した患者;骨折による偽関節もしくは骨折の変形治癒を示す患者;例えば、脛骨または第一趾からの骨切除術後の患者;移植片植え込み後の患者;外傷もしくは関節炎により引き起こされる、膝における関節軟骨の変性;ターナー症候群を示す患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析の成人患者(APCD);栄養不良に随伴する、APCDにおける心血管疾患; APCDにおける悪液質の可逆化; APCDにおける癌; APCDにおける慢性閉塞性肺疾患; APCDにおけるHIV; APCDである高齢者; APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;肝機能不全; HIV感染を示す男性;短腸症候群;中心性肥満; HIVに随伴する脂肪異栄養症候群(HALS);男性不妊症;大規模な待期的手術、アルコール/薬物の解毒、もしくは神経外傷後における患者;老化;虚弱高齢者;骨関節症;外傷による軟骨損傷;勃起障害;線維筋痛;記憶障害;抑うつ症;外傷性脳傷害;クモ膜下出血;極低出生時体重;メタボリック症候群;グルココルチコイドミオパシー;または小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長から選択される成長ホルモンコンジュゲート。
実施形態96:薬剤としての、実施形態1から83のいずれかに記載の成長ホルモンの使用。
実施形態97:疾患の治療方法における、実施形態1から83のいずれかに記載の成長ホルモン化合物の使用。
実施形態98:疾患が、成長ホルモン欠損症(GHD);ターナー症候群;プラダー-ウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患、若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症、HAART治療を受ける小児おけるHIV感染(HIV/HALS小児); SGA性低身長児; SGA以外の極低出生体重児における低身長(VLBW);骨格異形成;低軟骨形成症;軟骨無形成症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD;脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、および手指など、長骨における骨折もしくは長骨の骨折;頭蓋骨、手の指節骨底、および足の趾節骨底など、海綿骨における骨折もしくは海綿骨の骨折;例えば、手、膝、もしくは肩における腱もしくは靭帯の手術後における患者;仮骨延長法を施されているかもしくはこれを経過しつつある患者;膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手関節、もしくは顎関節など、股関節もしくは椎間板の置換術、半月板の修復術、脊椎の癒合術もしくは装具固定術後における患者;ネイル、スクリュー、およびプレートなどの骨合成材料を体内に固定した患者;骨折による偽関節もしくは骨折の変形治癒を示す患者;例えば、脛骨また第一趾からの骨切除術後の患者;移植片植え込み後の患者;外傷もしくは関節炎により引き起こされる、膝における関節軟骨の変性;ターナー症候群を示す患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析の成人患者(APCD);栄養不良に随伴する、APCDにおける心血管疾患; APCDにおける悪液質の可逆化; APCDにおける癌; APCDにおける慢性閉塞性肺疾患; APCDにおけるHIV; APCDである高齢者; APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;肝機能不全; HIV感染を示す男性;短腸症候群;中心性肥満; HIVに随伴する脂肪異栄養症候群(HALS);男性不妊症;大規模な待期的手術、アルコール/薬物の解毒、もしくは神経外傷後における患者;老化;虚弱高齢者;骨関節症;外傷による軟骨損傷;勃起障害;線維筋痛;記憶障害;抑うつ症;外傷性脳傷害;クモ膜下出血;極低出生時体重;メタボリック症候群;グルココルチコイドミオパシー;または小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長から選択される、実施形態69または実施形態70に記載の使用。
実施形態99: A-W-B1-NH2、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH2-CH=CH2、および
[式中、Aは、胆汁酸残基を表し、B1は、親水性スペーサーを表し、Wは、AとB1とを連結する化学基である]の群から選択される胆汁酸リンカー。
実施形態100:
Aが、実施形態64から67の1つまたは複数における通りに定義され、
B1が、実施形態69から82の1つまたは複数において定義されるBに含まれ、
Wが、実施形態68における通りに定義される、
実施形態99に記載の胆汁酸リンカー。
実施形態101:本明細書に記載のリンカー1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、および13からなる群から選択される、実施形態99に記載の胆汁酸リンカー。
化学反応
化学反応7361
ある態様において、本発明は、式(I)の成長ホルモンコンジュゲートの調製であって、GH化合物を、TGアーゼ触媒化学反応を用いる特性修飾基で処理する調製に関する。まず、アミノアルコールを用いる2ステップの反応によりアルデヒド官能基またはケトン官能基を導入し、次いで、これを過ヨウ素酸で処理して、酸化的切断によりアルデヒド官能基またはケト官能基を生成させる。アミノアルコールの例示のための非限定的な例には、1,3-ジアミノ-2-プロパノールおよび1-アミノ-2,3-ジヒドロキシプロパンだけが含まれる。
さらなる態様では、本発明が、式(I)の成長ホルモンコンジュゲートの調製であって、GH化合物に由来するアルデヒドまたはケトンを、特性修飾基に由来するアニリンまたはヘテロアリールアミンで処理して、アミンをもたらすことを含む調製(III→IV)に関する。
ある実施形態では、GH化合物に由来するアルデヒドを、特性修飾基に由来するアニリンまたはヘテロアリールアミンで処理する。
「GH化合物に由来するアルデヒド(またはケトン)」または「GH化合物に由来するアルデヒドまたはケトン」という用語は、アルデヒド官能基もしくはケトン官能基を共有結合させたGH化合物、またはそこにおいてアルデヒド官能基もしくはケトン官能基を生成させたGH化合物を指すことを意図する。下記で例示される化合物(III)など、GH化合物に由来するアルデヒドの調製は、当業者によく知られており、これらの知られた手順のうちのいずれかを用いて、本明細書で開示される本発明を実現するのに必要とされる、GH化合物に由来するアルデヒド(III)を調製することができる。
一実施形態では、コンジュゲートA-W-B-GH(IV)を、以下:
に例示する通りに調製する。
TGアーゼを介する酵素反応の結果、141位および/または40位におけるGlnが修飾される(II)。修飾されたGH(II)を、過ヨウ素酸で処理し、アミノアルコールを切断して、GHに由来するアルデヒド(III)をもたらす。GHのA-W-B1-NH2とのコンジュゲーションは、還元的アルキル化(III→IV)により発生させる。当業者には、本明細書で例示される還元的アルキル化がよく認識されている。
化学反応I:7361化学反応
ある態様では、本発明が、式(I)の成長ホルモンコンジュゲートの調製であって、GH化合物を、TGアーゼ触媒化学反応を用いて、特性修飾基に由来するアミン、アニリン、またはヘテロアリールアミンで直接処理して、成長ホルモンコンジュゲートをもたらす調製(I→III)に関する。
ある実施形態では、GH化合物を、特性修飾基に由来するアミン、アニリン、またはヘテロアリールアミンで処理する。
一実施形態では、コンジュゲートA-W-B-GH(III)を、以下:
に例示する通りに調製する。
GH(I)を、A-W-B1-NH2(II)とTGアーゼを介して酵素反応させる結果、141位および/または40位におけるGlnが修飾され、コンジュゲートA-W-B-GH(III)がもたらされる。
化学反応II:7361化学反応
一態様では、GHコンジュゲートであるA-W-B-GH(V)を、以下:
に例示される通り、GHのN末端へのコンジュゲーションにより調製する。
GHのA-W-B1-CHO(IV)とのコンジュゲーションは、還元的アルキル化(GH→V)により発生させる。当業技術分野では、タンパク質、例えば、GHのN末端を修飾するのに、上記で例示された還元的アルキル化がよく認識されており、
親水性スペーサーB1は、式:
-X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、原子価結合であり、
l1、l2、l3、l4、およびl5は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]
を有する。
化学反応IV
一実施形態では、コンジュゲートA-W-B-GH(IX)を、以下:
に例示する通りに調製する。
この場合、GH化合物は、場合によって、R10を低分子の有機部分とする混合ジスルフィド(GH-S-S-R10(VI))として保護される単一のシステイン残基を含有する。混合ジスルフィドの非限定的な例には、
シスタミン(R10=-CH2CH2NH2)、システイン(R10 =-CH2CH(C(O)OH)NH2)、ホモシステイン(R10=-CH2CH2CH(C(O)OH)NH2)、およびグルタチオン(R10=-CH2CH(C(O)NH-CH2C(O)OH)NH-C(O)CH2CH2CH(C(O)OH)NH2)とのジスルフィドが含まれる。
誘導体化工程では、リンカーであるA-W-B1-LG(VIII)[式中、LGは、-Cl、-Br、-Iなどの無機脱離基、またはメシル酸もしくはトシル酸などの有機脱離基を表す]を用いる。GH(VI)のA-W-B1-LG(VIII)とのコンジュゲーションは、求核的置換(VII→IX)により発生させる。当業技術分野では、GHなどのタンパク質における遊離システインを修飾するのに、上記で例示した求核的置換がよく認識されている。
化学反応V
一実施形態では、コンジュゲートA-W-B-GH(XI)を、以下:
に例示する通りに調製する。
上記の(VI)から得られた、Cysを脱保護化したGH化合物(VII)を、マレイミドで置換したリンカー(X)と反応させて、GHコンジュゲートであるA-W-B1-C(O)NHCH2CH2-ピロリジン-2,5-ジオン-3-GH(XI)
[式中、親水性スペーサーB1は、式:
-X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、原子価結合であり、
l1、l2、l3、l4、およびl5は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]を有する]
をもたらすことができる。
化学反応VI
一実施形態では、コンジュゲートA-W-B-GHを、以下:
に例示する通りに調製する。
胆汁酸リンカーは、WO2009/024791において説明されるS-ニトロシル化学反応を用いて、単一のcysによるGH誘導体に結合させることができる。
DEA NONOate(Sigma Aldrich)などのNOドナーを付加することにより、Cysを脱保護化したGH化合物(VII)を、S-ニトロシル化にかける。次いで、単一のcysがニトロシル化されたGH(XII)を、アリルアミンで置換した胆汁酸リンカー(XIII)と反応させて、オキシム(XIV)をもたらし、これにより、加水分解後に、GHコンジュゲートであるA-W-B1-C(O)NHCH2C(O)CH2-CysGH(XV)
[式中、親水性スペーサーB1は、式:
-X1-X2-X3-X4-
[式中、
X1は、-W1-[(CHR3)l1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR4)l2-W3]m3}n2-であり、
X2は、-[(CHR5)l3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR6)l4-W5]m6}n4-であり、
X3は、-[(CHR7)l5-W6]m7-であり、
X4は、原子価結合であり、
l1、l2、l3、l4、およびl5は、0〜10から独立に選択され、
m1、m3、m4、m6、およびm7は、0〜6から独立に選択され、
m2およびm5は、0〜6から独立に選択され、
n1、n2、n3、およびn4は、0〜6から独立に選択され、
R3、R4、R5、R6、およびR7は、水素、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-NH-C(=NH)-NH2、C1〜6アルキル、C1〜6アリール、またはC1〜6ヘタリールから独立に選択され、
この場合、アルキル基、アリール基、およびヘタリール基は、場合によって、ハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH2、-S(O)OH、-S(O)2OH、-CN、または-OHで置換されており、
E1、およびE2は、-O-、-N(R8)-、-N(C(O)R9)-、または原子価結合から独立に選択され[式中、R8およびR9は、水素またはC1〜6アルキルを独立に表す]、
W1〜W6は、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O)NHS(O)2-、-S(O)2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)-、または原子価結合から独立に選択される[式中、s2は、0または1である]]を有する]
をもたらすことができる。
(実施例)
本明細書に記載される各種の化合物の調製および特徴づけ、ならびにそれらの生物学的活性を評価する方法について説明する以下の実施例を参照することにより、本発明をさらに明示する。本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、材料および方法のいずれに対しても、多くの変更を行うことが可能であることは、当業者に明らかであろう。
略号:
amu=原子量単位
CV=カラム容量
hr(s)=時間(複数可)
Hz=ヘルツ
L=リットル(複数可)
M=モルの
mbar=ミリバール
mg=ミリグラム(複数可)
min.=分(複数可)
mL=ミリリットル(複数可)
mM=ミリモルの
mm=ミリメートル(複数可)
mmol=ミリモル(複数可)
nmol=ナノモル(複数可)
mol=モル(複数可)
μL=マイクロリットル
N=規定度の
nm=ナノメートル(s)
sec=秒(s)
ppm=100万分の1
ESI=エレクトロスプレーによるイオン化
i.v.=静脈内
m/z=質量対電荷比
MS=質量分析
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
RP=逆相
HPLC-MS=高圧液体クロマトグラフィー-質量分析
NMR=核磁気共鳴分光法
p.o.=経口
rtまたはRT=室温
s.c.=皮下
Rt=貯留時間
Boc=tertブチルオキシカルボニル
O-t-Bu=tertブチルエステル
t-Bu=tertブチル
Boc-4-ABZ-OH=4-tert-ブトキシカルボニルアミノ-安息香酸
DCM=ジクロロメタン、CH2CI2、塩化メチレン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA=N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
DTT=ジチオトレイトール
EDAC=1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド
Et2O=ジエチルエーテル
EtOAc=酢酸エチル
Fmoc=9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Fmoc-Glu-O-t-Bu=N-Fmoc-グルタミン酸-1-t-ブチルエステル
Fmoc-Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(ジフェニル-p-トリルメチル)アミノ]-2-(9H-フルオレン-9-イル-メトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸
Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
Fmoc-Thx-OH=N-Fmoc-trans-4-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
H2O=水
HOBt=1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
MeCN=アセトニトリル
MeOH=メタノール
MSNT=1-(メシチレン-2-スルホニル)-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール
MTP=3-メチル-チオ-1-プロパノール
NaCl=塩化ナトリウム
NaOH=水酸化ナトリウム
NMP=N-メチルピロリジン-2-オン
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
TIS=トリイソプロピルシラン
TSPP:トリス(3-スルホフェニル)ホスフィン三ナトリウム塩
CDCl3=ジュウテリオクロロホルム
CD3OD=テトラジュウテリオメタノール
DMSO-d6=ヘキサジュウテリオジメチルスルホキシド
TNBS=トリニトロベンゼンスルホン酸
TSTU=O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウラニウムテトラフルオロホウ酸
TFAA=トリフルオロ酢酸無水物
TEA=トリエタノールアミン
方法1.hGH化合物を調製するための一般的な方法
成長ホルモン化合物をコードする遺伝子を、組換えによりプラスミドベクター内へと挿入した。QuickChange部位指向性変異誘発キット(Stratagene社製)を用いることにより、システインの変異を導入した。その後、プラスミドベクターを用いて、適切な大腸菌株を形質転換した。タンパク質は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー精製に適する、N末端におけるヒスチジンに富むペプチドタグを伴う可溶性タンパク質として発現させた。hGH変異体またはGH変異体は、N末端メチオニンと共に、またはそこからMEAE配列がその後切断されるMEAE融合体として発現させることができる
50%グリセロール中において細胞原液を調製し、-80℃で保存した。グリセロール原液中の菌株をLBAプレート内に接種し、その後、37℃で一晩にわたりインキュベートした。LB培地により各プレートの内容物を洗浄し、500mlのLB+AMP培地へと希釈して、発現させた。0.6のOD600に達するまで、培養物を220rpmで振とうしながら37℃でインキュベートした。0.2mMのIPTGを用いて、30℃で6時間にわたり後続の誘導を実施し、2.0の最終OD600を得た。遠心分離により、細胞を最終的に回収した。
その後、細胞をpH8.5の20mMトリス-HCl中に懸濁させ、30kPSIで細胞破砕器を用いてこれらを破壊した。遠心分離により上清を回収し、その後、クロマトグラフィーによる精製にかけた。
精製は、捕捉ステップとして、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いた後で、Unizyme社製のジアミノペプチダーゼを用いてペプチドタグを除去して実施した。イオン交換クロマトグラフィーにより最終精製を達成した。精製はまた、当業者に知られるイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、および膜ベースの分離法を用いることによるがこれらに限定されずに達成することができるであろう。
方法2.Cysにより突然変異させたGHタンパク質の単離および精製
MEAE-hGH [Q84C、Y143C、L101C]を用いて、この方法を例示する。当技術分野に共通の一般的な知識に基づく単離および精製のスキームを若干変化させて可能な同様の方法で、代替的な突然変異体も単離および精製することができる。
細胞は、遠心分離(6056×Gで30分間にわたる)により回収し、-80℃で保存することができる。ホモジナイゼーション:細胞ペレット(2580g)を、約20kgの緩衝液(20mMのトリス、0.1%のTween-20、5mMのEDTA、pH = 8.5)中で溶解させ、pHを8.5へと調整した後に、1000バールおよび200バールの2回の圧力降下によりホモジナイゼーションを行った。細胞ホモジネート(約20kg)を、8Mの尿素中で1:1に希釈する結果として、4Mの尿素濃度を得た。この溶液に、シスタミン2HCl(18g)(0.9g/L)を添加し、結果として得られる混合物を、静かに撹拌しながら、5℃で一晩にわたりインキュベートした。濾過:ホモジネートを、1.0および0.5μmの全量濾過方式により濾過する結果として、約42kgの透過物を得た。MEAE-hGH [Q84C、Y143C、L101C]の精製は、3つのクロマトグラフィーステップと、N末端のMEAE配列を除去する酵素消化とからなる。Q Sepharose XL(GE Healthcare社製)を用いてMEAE-hGH [Q84C、Y143C、L101C]を捕捉し、トリス-NaCl緩衝液、pH8.5中の直線勾配による溶出を介して溶出させた。回収したプールに1.0MのNaClを添加してから、Phenyl Sepharose 6FF(high sub)(GE Healthcare社製)へと投入した。WFIにおける段階的溶出を用いてタンパク質を溶出させ、導電性を低下させて、酵素消化を行った。
酵素DAPI(ジペプチジルアミノペプチダーゼ1)を用いて、MEAE配列を除去した。DAPIは、同時に2つのN末端アミノ酸を切断するが、hGHにおける第2のアミノ酸は、天然のDAPI消化に対する停止をもたらすプロリン残基なので、AEの後で切断は停止される。消化は、2mg/mLのタンパク質濃度、pH4.3、40℃で実施した。消化反応の後、LC-MSにかけ、消化が完了する約60分後に停止させた。5℃まで冷却した後、39% v/vの低温エタノール(99%)を添加して、タンパク質を等電点沈殿させ(iso-precipitate)、pHを4.9に調整した。反応混合物は、5℃で少なくとも2時間にわたり保存し、タンパク質を沈殿させた。
沈殿したhGH [Q84C、Y143C、L101C]を、7Mの尿素-トリエタノールアミン緩衝液、pH7.5中で再溶解させ、Source 30Q(GE Healthcare社製)上で精製し、標的タンパク質を、少量の切断されなかった物質、および他の不純物から分離した。最終生成物を、トリエタノールアミン緩衝液、pH7.5中の直線勾配により溶出させた。RP-HPLC解析(UV 214nm)による生成物の純度は、> 97%である。
方法3.コール酸コンジュゲート化合物の調製方法
1.一般式をA-W-B1-CHOとする胆汁酸リンカーの、GH化合物(I)のN末端フェニルアラニンへの連結
対象の胆汁酸リンカーは、ジアルキルアセタール(すなわち、A-W-B1-CH(OR)2)として合成されることが典型的であり、コンジュゲーションの前に遊離アルデヒドへと転換することが必要である。これは、以下の通りに行うことができる。胆汁酸リンカーであるジアルキルアセタールを、酸(例えば、TFA)で処理し、蒸発させて乾燥させる。得られた遊離アルデヒドを、さらなる精製なしに用いる。次いで、1NのNaOHを添加することによりpHを7.0に維持しながら、緩衝液(例えば、HEPES、pH7.0)中のGH溶液を少しずつ添加する。次いで、水中で溶解させたNaCNBH3を、5分間隔で少しずつ添加する。1時間にわたる撹拌後に清明な溶液が得られることが典型的である。反応フラスコをスズ箔でラッピングし、反応混合物を、室温で一晩にわたり静かに撹拌する。LC/MSにより反応試料を解析して、生成物の形成を検証する。次いで、IEXクロマトグラフィーおよびHICクロマトグラフィー、サイズ除外カラム、ならびに限外濾過の組合せを用いて、hGHコンジュゲートを精製する。通常、純度を95%以上とするコンジュゲートが得られる。
2.一般式をA-W-B1-NH2とする胆汁酸リンカーの、トランスアミノ化および酸化されたGH化合物(I)への連結
GHのグルタミン残基にアルデヒドハンドルを結合させるためのトランスグルタミナーゼの使用については、WO2005/070468において既に説明されている。この方法は、本発明に従い、式をA-W-B1-NH2とする胆汁酸ベースのリンカーを結合させるのに用いることができる。用いられるTGアーゼは、US5156956によるストレプトバーチシリウム・モバラエンス(Streptoverticillium mobaraense)に由来する微生物性トランスグルタミナーゼである。
反応は、以下の通りに実施することができる。WO2005/070468において説明される通り、まず、GH(I)を、1,3-ジアミノ-2-プロパノール(II)でトランスアミノ化する。
次のステップでは、トランスアミノ化されたGH(III)に、過ヨウ素酸を添加する。酸化は、場合によって、暗所内で、30分間にわたり、4〜10℃などの低温で行うことが典型的である。過ヨウ素酸は、GHにおけるメチオニン残基を、それらの対応するメチオニンスルホキシド残基へと酸化する可能性がある。この酸化の危険性を最小化するため、過ヨウ素酸による酸化時に、低分子の有機チオエーテルを添加することができる。適切な有機チオエーテルは、3-メチルチオプロパン-1-オールであるが、当業者は、他の有機チオエーテルも示唆することができるであろう。
トランスアミノ化されたGH化合物(III)の酸化:
ナトリウムシアノボロハイドライドを効率的に還元するのに必要とされる酸溶液を得るために、緩衝液の交換を実施することができる。通常、過剰量のA-W-B1-NH2アミンを用い、ナトリウムシアノボロハイドライドを、ある時間にわたり少量で添加することができる。
胆汁酸リンカー(V)による(IV)の還元的アミノ化:
その後の反応は、以下の通りに実施することができる。
酸化されたトランスアミノ化GH(IV)に、AcOH(1.5mL)とpH6.00の50mM MES(0.5mL)との混合物中の胆汁酸リンカー溶液を添加する。結果として得られる反応混合物をRTで30分間にわたり静かに振とうし、このとき、NaCNBH3溶液(15μL(500μLのMilli-Q水+AcOH(15μL)中に溶解させた22mgのNaCNBH3))を添加する。試料をスズ箔で覆い、RTで一晩にわたり撹拌する。
コンジュゲートは、アニオン交換クロマトグラフィーにより以下の通りに単離することができる。Amicon Ultra15デバイス(Ultracel 10K管)を用いて、4000rpm/分で3×8分間にわたる遠心分離を介し、純水で緩衝液交換(3回)することにより、酢酸を除去する。次いで、Amicon Filterデバイスを用いて、混合物を、20mMのTEA、pH:8.50へと緩衝液交換し、20mMのTEAで50mLの最終容量へと希釈してから、それを、HiLoad Q Sepharose、26/10カラムへとロードした。まず、カラムを20mMのTEA、pH8.50(緩衝液A)で洗浄し、次いで、2mL/分の流速で、20CVにわたる0〜100%(緩衝液B)の勾配を用いて、20mMのTEA、500mMのNaCl、pH8.50(緩衝液B)で溶出させる。プールした画分は、Amicon Ultra15デバイス(Ultracel 10K管)を用いて、4000rpm/分で3×8分間にわたる遠心分離により、5回にわたり、純水中に10mMの重炭酸アンモニウムへと緩衝液交換した。
3.一般式をA-W-B1-LG(VIII)とする胆汁酸リンカーの、単一の内部遊離cysを有するGH化合物(VII)への連結
1)適切な選択的還元剤[H]による、ジスルフィド(VI)の還元を介する遊離Cys GH(VII)の脱離
2)脱離基(LG)で活性化された胆汁酸リンカー(VIII)で遊離Cys GH(VII)をアルキル化することにより、CysにおいてコンジュゲートされたGH化合物(IX)をもたらす
システイン残基は、場合によって、Rを低分子の有機部分とする混合ジスルフィド(GH-S-S-R(VI))として保護する。混合ジスルフィドの非限定的な例には、シスタミン(R=-CH2CH2NH2)、システイン(R =-CH2CH(C(O)OH)NH2)、ホモシステイン(R=-CH2CH2CH(C(O)OH)NH2)、およびグルタチオン(R=-CH2CH(C(O)NH-CH2C(O)OH)NH-C(O)CH2CH2CH(C(O)OH)NH2)とのジスルフィドが含まれる。
誘導体化工程では、胆汁酸リンカーであるA-W-B1-LG[式中、LGは、-Cl、-Br、-Iなどの無機脱離基、またはメシル酸もしくはトシル酸などの有機脱離基を表す]を用いる。GHのA-W-B1-LGとのコンジュゲーションは、求核的置換(VII→IX)により発生させる。誘導体化工程で、反応基として、アクリル官能基のマレイミドを用いる場合は、マレイミド官能基またはアクリル酸官能基の二重結合へのスルフィド付加により、コンジュゲーションを発生させる。
本明細書で説明される通りに調製されるGHコンジュゲートは、HPLC、サイズ除外クロマトグラフィーなどの標準的な方法により精製することができるが、イオン交換クロマトグラフィーによっても精製することができる。
上記で説明された一般的な連結法は、例示的な目的のためだけに用いられるものであり、当業者は、コンジュゲートを調製するために、他の緩衝液、精製法、および反応条件も選択しうることに注意されたい。
方法4.精製された成長ホルモン化合物に対するタンパク質化学による特徴づけ
MALDI-TOF質量分析
Autoflex MALDI-TOF測定器(Bruker)を用いて、分子量を決定した。試料は、α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸をマトリックスとして用いて調製した。
MALDI-MSを用いて、完全精製タンパク質を解析した。観察された質量は、アミノ酸配列から推定される理論的質量と符合した。
トリプシンおよびAspNによる消化の後、DTTによるジスルフィド結合の還元前および還元後においてこの消化物のMALDI-MS解析を用いるペプチドマッピングにより、各化合物中のジスルフィド結合についての結合を裏付けることができる。
キャピラリー電気泳動
Agilent Technologies 3DCEシステム(Agilent Technologies)を用いて、キャピラリー電気泳動を実施した。データ収集およびシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを用いて実施した。キャピラリーは、Agilent製で64.5cm(有効長を56.0cmとする)および内径50μmの「Extended Light Path Capillary」とした。UV検出は、200nm(バンド幅を16nmとし、基準波長を380nmとし、基準バンド幅を50nmとする)で実施した。泳動電解質は、pH7の50mMリン酸緩衝液(方法A)とした。0.1MのNaOHで3分間にわたり、次いで、Milli-Q水で2分間にわたり、さらに、電解質で3分間にわたり、キャピラリーを条件付けした。各泳動後、キャピラリーをMilli-Q水で2分間にわたり、次いで、リン酸で2分間にわたり、さらに、Milli-Q水で2分間にわたりフラッシュした。流体力学的注入は、50ミリバールで4.0秒間にわたり行った。電圧は、+25kVとした。キャピラリーの温度は、30℃とし、泳動時間は、10.5分間とした。
RP-HPLC
RP-HPLC解析は、4.6mm×250mmおよび5μmのVydac 218TP54 C-18シリカカラム(The Separations Group、Hesperia)を用いるAgilent 1100システム上で実施した。検出は、214nm、254nm、280nm、および301nmのUVを介した。カラムは、0.1%のTFA/H2Oで平衡化し、試料は、0.1%のTFA/H2Oに対して適切な0〜90%のMeCN勾配により溶出させた。
LC-MS
LC-MS解析は、2つのPerkin Elmer Series 200 Microポンプ、Perkin Elmer Series 200オートサンプラー、Appleid Biosystems 785A UV検出器、およびSedex 75 Evapoative Light sattering検出器を装備したPE-Sciex API 100質量分析器またはPE-Sciex AP 150質量分析器上で実施した。3.0mm×50mmおよび5μmのWaters Xterra C-18シリカカラムを、RT、1.5mL/分で溶出させた。このカラムを、5%のMeCN/0.1%のTFA/H2Oで平衡化し、5%のMeCN/0.1%のTFA/H2Oで1.0分間にわたり、次いで、90%のMeCN/0.1%のTFA/H2Oまでの直線勾配で7分間にわたり溶出させた。検出は、214nmにおけるUV検出およびEvaporative light Scatteringを介した。カラム溶出物の画分は、PE-Sciex API 100質量分析器のイオンスプレーインターフェースへと導入した。解析中は、300〜2000amuの質量範囲を2秒間ごとに走査した。
タンパク質の定量化
NanoDrop ND-1000 UV質量分析器を用いて、280nmにおける吸光度を測定することにより、タンパク質濃度を推定した。
誘導体化部位(複数可)を決定するための酵素的ペプチドマッピング
還元およびアルキル化されたタンパク質のAsp-N消化を用いて、ペプチドマッピングを実施した。まず、標準的な手順により、タンパク質をDTTおよびヨードアセトアミドで処理した。HPLCを用いて、アルキル化された生成物を精製した。続いて、精製されたアルキル化生成物を、酵素:基質比を1:100とするエンドプロテアーゼAsp-N(Boehginger)により、一晩にわたり消化した。消化物は、C-18カラムおよび標準的なTFA/MeCN緩衝液系を用いて、HPLC分離した。結果として得られるペプチドマップを、誘導体化されていないhGHのペプチドマップと比較し、貯留時間の異なる画分を回収し、MALDI-TOF質量分析を用いてさらに解析した。
SDD PAGE
NuPAGEを4%〜12%とするビス-トリスゲル(Invitrogen NP0321BOX)を用いて、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。ゲルは、銀染色(Invitrogen LC6100)またはクーマシー染色(Invitrogen LC6065)した。
タンパク質クロマトグラフィー
タンパク質クロマトグラフィーは、GE Health Care製のAekta Explorerクロマトグラフィーシステムおよびカラム上で実施した。Q-Sepharose HP 26/10カラムを用いて、アニオン交換を行った。出発緩衝液は、pH8.5の20mMトリエタノールアミン緩衝液とし、溶出緩衝液は、出発緩衝液+0.2M NaClとした。化合物は、勾配を0〜75%とする溶出緩衝液により、15カラム容量にわたり溶出させることが典型的であった。脱塩処理および緩衝液交換は、HiPrep 26/10カラムを用いて実施した。
TNBS試験
DMF中に10%のDIPEA溶液(溶液1)および1MのTNBS水溶液(溶液2)を調製した。小型の試験管内に数個の樹脂ビーズを入れ、各溶液(1および2)を1〜3滴ずつ添加した。短い混合時間の後、混合物をRTで10分間にわたり放置した後、ビーズを目視した。強い橙色または赤色のビーズは、陽性の結果(すなわち、遊離アミンの存在)を示し、黄色またはわずかに橙色のビーズは、弱い陽性を示し、無色のビーズは陰性とする。
方法5.精製された成長ホルモン化合物の生物学的活性についての解析
細胞ベースの受容体能による増殖アッセイ、すなわちBAFアッセイにより、hGH化合物の生物学的活性を測定する。該方法は、hGH化合物に対する一般性を示す。
BAF-3細胞(骨髄に由来するマウスBリンパ球前駆細胞株)は、増殖および存続についてIL-3依存性である。IL-3は、それらが刺激されるとGHが活性化される同一のメディエーターであるJAK-2およびSTATを活性化する。
BAF-3細胞に、hGH受容体を含有するプラスミドをトランスフェクトする。hGHにより刺激されると増殖することが可能なクローンを、本明細書の下記でBAF3-GHRと称する、hGH依存性細胞株へと転換する。該細胞株は、用量に比例する増殖パターンによりGHに反応し、したがって、これらを増殖アッセイにおいて用いて、異なるhGH化合物の効果を評価することができる。
37℃、5%CO2で24時間にわたり、飢餓培地(GHを有さない培地)中でBAF3-GHR細胞を増殖させた。細胞を遠心分離し、培地を除去し、細胞を飢餓培地中に再懸濁させ、細胞2.22×105個/mlとした。90μlの細胞上清の一部を、マイクロ滴定プレート(96ウェルNUNCクローンプレート)内に播種する。細胞に、異なる濃度の成長ホルモン化合物を添加し、37℃、5%CO2で72時間にわたりプレートをインキュベートする。
AlamarBlueは、細胞代謝に生得の反応により還元され、したがって、生細胞数の間接的な測定値を提供する、AlamarBlue(登録商標)(BioSource社製;型番Dal 1025)という酸化還元指示薬である。AlamarBlue(登録商標)を6倍に希釈し(5μlのAlamarBlue(登録商標)+25μlの飢餓培地)、30μlの希釈されたAlamarBlue(登録商標)を各ウェルに添加する。次いで、細胞をさらに4時間にわたりインキュベートする。最後に、544nmの励起フィルターおよび590nmの発光フィルターを用いる蛍光プレートリーダーにより、細胞の代謝活性を測定する。
所与の化合物についての結果を、前記化合物のEC50と、並行して測定したwthGHのEC50との比として表現する。
方法6.下垂体切除Sprague Dawleyラットにおける、in vivo用量-反応試験
以前の3A
雄の下垂体切除Sprague Dawleyラットにおいて、in vivoの用量-反応関係を調べることができる。下垂体切除ラットは、よく知られて認知された、成長ホルモン欠損の動物モデルであり、手術により下垂体を除去した後では、成長ホルモンの生成が生じない。これはまた、ヒトにおける成長ホルモン欠損の別の重要な臨床特徴である、循環インスリン様成長因子1(IGF-1)レベルの低下ももたらす。
体重90〜100gの4週齢の雄ラットに対して、下垂体切除術を実施する。手術の3〜4週間後に、体重100〜110gの動物を試験に組み入れた。手術後3〜4週間の間に、体重が10%を超えて増加した動物は、試験に組み入れなかった。
通常、下垂体切除Sprague Dawleyラット70匹を、各群10匹ずつ7つの投与群に無作為に割り当てる。1つの群には媒体だけを施し、非治療対照群として用いた。3つの群には、被験化合物(例えば、hGH変異体)を、それぞれ33、3.3、0.33ナノモルずつ施し、3つの群には、対照薬としてのhGHを50、5.0、および0.5ナノモルずつ施した。化合物および媒体のいずれも、頸部での単回の皮下投与として投与した。1週間にわたり、毎日午前8〜10時に体重を測定した。
0日目の体重を7日目の体重と比較することによって、用量依存的な形での体重の増加の評価を得ることができる。
パラメータEmax、E0、およびED50の推定値を計算するため、非線形回帰分析により、S字型用量-反応曲線の式により実験データ(0日目〜7日目の体重増加)を近似する。該式は、GraphPad Prism version 4.00 for Windows(登録商標)(米国、サンディエゴ、GraphPad Software社製)に内蔵されるS字型用量-反応曲線の式である。パラメータ推定値および95%信頼区間を含めたデータが通常提示される。
パラメータE0およびEmaxの推定値については、hGH[Q84C、Y143C]と、hGHとで差が観察されなかった。しかし、hGH[Q84C、Y143C]では、ED50が、hGHと比較して著明に低値であったことは、hGH[Q84C、Y143C]のin vivoにおける効力が高いことを示す。
方法7.表面プラズモン共鳴解析による受容体相互作用試験
表面プラズモン共鳴解析を用いて、hGH化合物の受容体相互作用について解析することができる。この方法は、hGH化合物について一般性がある。Biacore T100測定器(スウェーデン、GE Healthcare社製)を用いる表面プラズモン共鳴により、hGH結合タンパク質(hGHBP)との、hGHおよび類似体の相互作用を調べる。製造元の指示書に従い、典型的には5000RUのレベルで、抗hGH mAb(米国、Fitzgerald Industiries International社製;型番10G05B)を、CM-5チップ上へと固定化する。ランニングバッファー(10mM HEPES、0.15M NaCl、30mM EDTA、0.05% Surfactant P20、pH7.4)中10〜25μg/mlでwthGHまたは類似体を捕捉し、この結果、250〜400 RUのリガンドが捕捉された。その後、30ml/分で、該表面全体に、0〜800nMの濃度のhGHBPを注射する。抗hGH mAbを固定化させているがhGHが捕捉されなかった表面を、基準として用いる。
1:1のラングミュア結合モデルを伴う、Biacore(商標)Evaluation Software 2.0により、反応速度データを解析した。
方法8.プロテアーゼによる野生型hGHおよびGH化合物の分解速度を測定するアッセイ
37℃で最長24時間にわたり、適切な緩衝液(例えば、PBSまたは重炭酸アンモニウム)中における関与性のプロテアーゼ(トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、因子VIIa、因子Xa、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼ、DPPIV、中性エンドペプチダーゼ、グランザイムB、プロリンエンドペプチダーゼ、ブドウ球菌ペプチダーゼI、テルモリシン、トロンビン、Arg-Cプロテイナーゼ、Asp-Nエンドペプチダーゼ、カスパーゼ1〜10、クロストリパイン、エンテロキナーゼ、グルタミルエンドペプチダーゼ、LysC、およびLysN、または組織抽出物)により、対象の化合物を消化させた。タンパク質分解は、HPLCアッセイにより評価する。
タンパク質分解による消化:
重炭酸アンモニウム緩衝液中1mg/mlの被験化合物溶液100μLを、37℃で最長24時間にわたり、酵素により分解させる。各時点に対応する部分試料を採取し、1%TFA中への10倍希釈を介して該試料を酸化させることにより、タンパク質分解反応を停止させる。逆相HPLCによりこれらの希釈試料を解析して、タンパク質分解による消化の程度を推定する。
HPLC法:
水中に0.1%TFA〜0.1%TFA含有100% MeCNの直線勾配により溶出させる2×150mmのVydac C4逆相カラム上に、30分間にわたり、0.2ml/分の流速で、10μLの上記溶液を注射する。214nmにおけるUV吸収により、ピークの検出を実施する。時点t=Tにおけるピーク面積(AT)と、時点t=0におけるピーク面積(A0)とから、(AT/A0)×100%として、時点t=Tにおける完全化合物(%)を計算する。
下記の例に示す結果は、4時間後(上式におけるT=4)に得られた。GraphPad Prismソフトウェアver. 5.01を用いて、完全化合物(%)を時間に対してプロットする。また、GraphPad Prismソフトウェアにより、1相減衰としてのT1/2も計算する。実施例で用いられる酵素は、エラスターゼ(Sigma社製;ブタ膵臓に由来する)およびキモトリプシン(Roche社製;配列決定グレード)である。緩衝液は、pH8.5の50mM重炭酸アンモニウムである。
方法9.ゲッチンゲンミニブタへの腸内投与および静脈内投与を介する成長ホルモン化合物の薬物動態特性
研究では通常、Ellegaard Goettingen Minipigs A/Sから得られる、体重約30kgの雄ゲッチンゲンミニブタ8匹を用いる。2週間の馴致期間の後、動物を手術にかけ、各動物に2本ずつの中央静脈カテーテルを挿入する。術後、動物は、それらの通常の個別の檻に収容する。動物の体重は、投与前に測定する。腸内投与を施す動物の場合は、消化管内に異物が存在しないことを確保するために、投与の2日前に檻から藁および寝床材料を除去する。
静脈内投与の場合は、短い中央カテーテルを介して20ナノモル/kgを施し、投与後、2mLの生理食塩液でフラッシュする。
腸内投与の場合は、内視鏡(Pentax製の胃内視鏡)を介して800ナノモル/kgを投与する。胃内視鏡は、経口挿入し、食道および胃を経て、幽門を介して、空腸へと通す。空腸に被験処方物を放出し、胃内視鏡を引き抜く。投与手順中は、ミニブタをSedatorおよびPropofolで鎮静させ、手順後は、Antisedanを筋肉内に施す。
血液試料は、通常以下の時点:
静脈内投与:投与前、投与の15分間後、30分間後、45分間後、1、1.5、2、3、4、6、8、24、48、および72時間後
腸内投与:投与前、投与の5分間後、15分間後、30分間後、45分間後、1、1.5、2、3、4、6、8、24、48、および72時間後
に回収する。
各試料採取時には、各動物から2mLずつの血液を採取する。血液試料は、中央カテーテルを介して採取する。各血液試料を採取した後は、カテーテルを、生理食塩液中に5mLのヘパリン(10U/mL)ですすぐ。試料採取時には、最初の1mLの血液を廃棄する。細菌汚染および凝固の危険性を回避するため、血液試料採取時には、滅菌法が必要とされる。
血液試料は、8mMのEDTAを含有する試験管内に回収する。血液試料は、最大20分間にわたり氷上に保ってから、遠心分離(4000rpm、4℃、10分間)にかける。即座に血漿を回収し、アッセイするまで-20℃で保存する。被験化合物について、血漿試料を解析する。
モルモット抗hGHポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、ビオチニル化hGH結合タンパク質(ヒトGH受容体の可溶性部分)を検出タンパク質として用いる、サンドウィッチELISAにより被験化合物濃度を決定する。アッセイの検出限界を0.2nMとする。
静脈内投与の場合は、化合物を、20mg/mLのグリシン、2mg/mLのマンニトール、pHを8.2へと調整した2.4mg/mLのNaHCO3中に0.6mMまで溶解させる。
腸内投与の場合は、化合物を、20mg/mLのグリシン、2mg/mLのマンニトール、pHを8.2へと調整した2.4mg/mLのNaHCO3中に6mMまで溶解させる。
方法10.Sprague Dawleyラットへの腸内投与を介する成長ホルモン化合物の薬物動態特性
通常、Taconic M&B(Rekv.No.2010 0824)から、約250〜300gのSprague Dawleyラット24匹を得る。動物は、各ケージ内の動物を4〜5匹ずつとするIV型ケージ内に収容する。研究中、ラットは、飲用水(水道水)へのアクセスが自由であるが、投与前の18時間にわたり絶食させる。絶食中、動物は、ケージ内の寝床材料または営巣材料なしの格子上に置き、少なくとも18時間にわたる絶食時間を確保するために、投与前日の午後2時に食物を取り去る。絶食時間中、動物は、飲用水へのアクセスが自由である。
手術日には、鎮痛剤の用量計算を正確とするため、麻酔の前にラットの体重を測定する。体重測定の直後、動物には、生理食塩液(1+9)中で50mg/mLに希釈したRimadyl Vetの鎮痛剤前投与を、0.1mL/100gで皮下に施す。
研究は滅菌研究ではないが、手術手順は、可能な限り無菌的に実施する。手術部位を、70%エタノールで消毒し、手術部位の汚染を最小化するように注意を払う。
動物が入眠するまでの初期には、ラットに3%のイソフルランで麻酔をかけ、次いで、手術の残りの時間では、イソフルランを2〜2.5%へと低減する。手術前に、腹部を剃毛し、70%のエタノールで消毒する。
手術の直前、各ラットには、生理食塩液(1+9)中で0.3mg/mLに希釈したTemagesicの皮下投与を、0.125mL/100gで施す。動物を一晩にわたり静置する場合は、投与の1時間後および投与の6〜8時間後に同じ用量を施す。
麻酔中は、皮膚の色および呼吸に特に重点を置きながら、ラットを持続的にモニタリングする。オピオイドを用いると、体温の喪失(低体温状態)が引き起こされる可能性があるので、研究中は、ラットを、37℃の温熱ラックに置く。
麻酔をかけたラットは、背部が温熱毛布または断熱プレートに接するように寝かせる。皮膚に正中線切開を施す。剣状軟骨(剣状突起)の約1cm下方から白線に沿って、腹腔内に2cmの切開を施す。顕著な屈曲をもたらす、幽門から約50〜60cmの空腸部分を、腹部脂肪層の下方に同定する。被験化合物(動物1匹当たり0.2mLずつ)を、G27シリンジを用いる腸内注射を介して空腸へと送達する。投与後は、注射針を注意深く引き抜き、注射針の孔は、Histoacryl(登録商標)の滴下により閉止する。30秒後、腸を腹部内に戻し、創傷端がぴったりと縫合されるように、手術用縫合剤(Vicryl 4-0)により腹部壁を閉止する。創傷用クリップを用いて皮膚を閉止する。創傷を閉止した後、ラットの脇腹の皮下に2mLの生理食塩液を施し、脱水を回避し、加熱ランプ下にある特別回復ケージ内に入れる。
麻酔から完全に回復したら、動物を、温熱ラック内の通常ケージに入れる。
以下の時点: 投与前、投与の0.5、1、2、3、4および6時間後において、全ての動物の尾静脈から200μLずつの血液試料を回収する。血液試料は、8mMのEDTAを含有する試験管内に回収する。血液試料は、最大20分間にわたり氷上に保ってから、遠心分離(4000rpm、4℃、10分間)にかける。即座に血漿を回収し、アッセイするまで-20℃で保存する。被験化合物について、血漿試料を解析する。モルモット抗hGHポリクローナル抗体を捕捉抗体として用い、ビオチニル化hGH結合タンパク質(ヒトGH受容体の可溶性部分)を検出タンパク質として用いる、サンドウィッチELISAにより被験化合物濃度を決定する。アッセイの検出限界を0.2nMとする。
腸内投与の場合は、化合物を、20mg/mLのグリシン、2mg/mLのマンニトール、pHを8.2へと調整した2.4mg/mLのNaHCO3中に1.5mMまで溶解させる。
方法11.Caco-2透過性アッセイ
Caco-2細胞を、細胞の単層を介する被験化合物の輸送を測定するのに用いた。Cako-2細胞系は、ヒト結腸直腸癌腫に由来し、ヒト腸を介する薬物吸収の予測に広く用いられている。分化させたCaco-2細胞の細胞層は、小腸の円柱上皮に類似しており、このため、化合物の輸送特性を調べるのに有用である。Caco-2細胞輸送研究から得られる見かけの透過性係数(Papp)は、ヒト腸における吸収と相関することが示されている(J.D Irvineら、J.Pharm.Sci.(1999)、88、およびP. Artursson、J.Pharm.Sci.(1990)、79)。アッセイは、半透膜上で細胞を培養して実施する。被験化合物を、細胞層の頂端側に添加し、側底側におけるそれらの出現をある時間にわたり測定すると、計算されたPappにより腸の吸収が表される。
材料
Caco-2細胞は、American Type Culture Collection ATCC(Manassas、VA、USA)から得た。全ての細胞培養試薬は、別段に注記しない限り、LONZA BioWhittakerから購入した。0.25%トリプシン-EDTAは、Invitrogen、Gibco(Denmark)から購入した。MEM(非必須アミノ酸)は、Invitrogen、Gibco(Denmark)から、FBS HIは、Invitrogen、Gibco(Denmark)から、Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)型番14025およびHEPES型番15630は、Invitrogen、Gibco(Denmark)から購入した。マンニトール、D-[1-3H(N)]は、Perkin Elmer Danmark A-Sから購入した。シンチレーション液であるMicroscint 40は、Packard BioScience(Groningen、The Netherlands)から得た。
細胞の培養
Caco-2細胞を、培養フラスコに播種して、10%ウシ胎仔血清、ペニシリン-ストレプトマイシン(それぞれ、100U/mLおよび100μg/mL)、および1%の非必須アミノ酸で補充した、Ultraglutamineを伴うダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で継代培養した(DPBSおよび0.25%トリプシン-EDTAを用いる)。細胞(継代を23〜40代目とする)を、細胞105個/cm2の密度で、組織培養処理されたTranswells(商標)(Costar、NY、USA)上に播種した。続いて、播種の22〜24日後に、輸送実験を実施した。Caco-2細胞の単層培養物は、5%CO2-95%O2で湿度を90%とする37℃の雰囲気中で増殖させた。増殖培地は、隔日で置換した。上皮電圧抵抗計(Millicell(登録商標)-ERS、Millipore、Denmark)を用いて、37℃でΩcm2単位のTEERを測定したところ、成熟Caco-2細胞の単層は、輸送実験で用いる前に、TEER>600Ωcm2を示した。
透過性アッセイ
マンニトール、D-[1-3H(N)](0.8μCi/mL)によるPappの測定、および2時間の実験時間におけるTEER変化のモニタリングを介して、Caco-2細胞の完全性を評価した。実験の前に、増殖培地を、成熟Caco-2細胞から除去し、細胞の単層を、37℃のHBSSで1回すすいだ。全ての化合物輸送実験は、200μMの被験化合物溶液を用いて実施し、頂端部容量は400μLであり、側底部容量は1000μLであった。輸送実験では、被験化合物を、pH7.4の頂端部コンパートメントに添加し、15、30、45、60、および120分間後に200μLを側底部コンパートメントから除去し、次いで、側底部コンパートメントに、200μLのあらかじめ加熱した調製したての緩衝液を再補充した。120分間後、実験終了時における化合物濃度を確立するために、2×10μLの試料を、ドナーコンパートメントから採取した。全ての実験は、37℃で2時間にわたり実施した。放射性対照化合物であるマンニトール、D-[1-3H(N)]を含有する試料を、Pacard製のTopCount NXTを用いて解析する一方で、被験化合物を含有する試料は、同種ビーズベースのアッセイである、Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay(LOCI)を用いて解析した。LOCI試薬は、2つのラックスビーズ試薬と、サンドウィッチ内の抗体のうちの1つであるビオチニル化抗体とを包含する。ビーズ試薬のうちの1つは、ストレプトアビジンでコーティングされ、感光性色素を含有する市販試薬(ドナービーズ)とした。第2のビーズ試薬(アクセプタービーズ)は、サンドウィッチを構成する他の抗体でコーティングした。アッセイ時には、3つの試薬が分析物と組み合わさって、ビーズ-凝集物免疫複合体を形成する。複合体を照射すると、ドナービーズから一重項酸素が放出され、これがアクセプタービーズへと導かれて化学発光を誘発し、これを、EnVisionプレートリーダーで測定した。発生した光の量は、被験化合物の濃度に比例した。試料/較正物質/対照物質を、アッセイ緩衝液中で10倍に希釈した。1μLの希釈した試料/較正物質/対照物質を、384ウェルのLOCIプレートに適用した。ビオチニル化mAbであるHGH-7(ES7)をコンジュゲートしたアクセプタービーズと、ビオチニル化したmAbであるHGH-3A7(ES3)をコンジュゲートしたアクセプタービーズとの混合物15μLを、各ウェルに添加した(21〜22℃)。プレートを21〜22℃で1時間にわたりインキュベートした。30μLのストレプトアビジンでコーティングしたドナービーズ(67μg/mL)を各ウェルに添加し、全てを、21〜22℃で30分間にわたりインキュベートした。680nmのレーザーにより励起した後で、バンド幅を520〜645nmとするフィルターを伴うEnvisionプレートリーダーにより、21〜22℃でプレートを読み取った。ウェル1つ当たりの全測定時間は、70ミリ秒間の励起時間を包含する210ミリ秒間とした。
透過性の計算
以下の式: Papp=dQ/dt×1/(AC0)[式中、Aは、フィルターの面積(1cm2)であり、C0は、ドナーコンパートメント内の初期濃度である]を用いてPappを計算するには、ある時間にわたり側底部コンパートメントに出現する被験化合物の蓄積量であるdQ/dtを用いた。
胆汁酸リンカーの調製
リンカー1:-NN-AU-0087
材料
固体支持体:0.7〜1.3ミリモル/g、100〜200メッシュのPAM樹脂、Sigma。
Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、MSNT(1-(メシチレン-2-スルホニル)-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール)(Chemimpex製)、Fmoc-Glu-OtBu(Novabiochem)、Fmoc-Gly-OH(GL Biochem)、コール酸(Sigma)。
Fmoc-Gly-OHのPAM樹脂への結合
PAM樹脂(3g、3.3ミリモル)を、乾燥DCM(P2O5により蒸留した)中で1時間にわたり膨潤させた。Fmoc-Gly-OH(4.9g、5当量、16.5ミリモル)、MSNT(4.9g、5当量、16.5ミリモル)、N-メチルイミダゾール(0.75mL、3.75当量、12.4ミリモル)を、2〜3適のTHFを含有する、乾燥DCM(20mL)中で溶解させた。次いで、この溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加した。樹脂を、Robbins scientific製の回転装置内、RTで一晩にわたり回転させた。2時間にわたる反応後、樹脂を、DCM(6×10mL)およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。同一の条件下で工程を今一度繰り返した。
Fmoc-Gly-PAMのFmoc基の除去
Fmoc-Gly-PAMのFmoc基を、20%(v/v)ピペリジン/DMF(15mL)溶液で、それぞれ、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF(10×5mL)、DCM(6×10mL)、およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。
Fmoc-アミノ酸/リンカー/コール酸を逐次的に連結するための一般的な手順
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸(樹脂投入量に対して5当量)、HOBt(5当量)、およびDIC(5当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。
コール酸-コハク酸を連結するための一般的な手順
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、コール酸-コハク酸(樹脂投入量に対して3当量)、HOBt(3当量)、およびDIC(3当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで16時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。
t-ブチル基のペプチジル樹脂からの切断
標的分子を固相へと逐次的に結合させた後で、樹脂をエーテル(6×10mL)で洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド-樹脂を、RTの95%TFA、2.5%TIS、2.5%水(25mL)からなる切断カクテルで1時間にわたり処理することにより達成した。次いで、樹脂を、DCM(2×5mL)、DMF(2×5mL)、DCM(2×5mL)で洗浄した。乾燥させた、t-ブチル側鎖を切断したペプチド樹脂を、45℃のCHCl3/アミノアセトアルデヒドジメチルアセタールの混合物(54:36)で26時間にわたり処理した。切断後、樹脂を排出し、DCM、MeOH、H2O、0.1%TFA、HFIP、DCM、MeOH、およびDCMで洗浄した。濾過物を採取し、真空中で蒸発させ、結果として得られる油を、所与容量の蒸留水中に溶解させた。TFAでpHを7に調整し、溶液を凍結乾燥させ、粗生成物をもたらした。粗生成物を、調製的HPLCで精製して263mgの化合物をもたらし、その識別をLC-MSで確認した。
ペプチドの精製および特徴づけ
解析的HPCL(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150mm、5μm)。
温度:25℃。
溶媒A:0.1%TFA/H2O。
溶媒B:9:1:0.1(MeCN/H2O/TFA)。
流速1mL/分。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
粗ペプチドは、MeCN/H2O(1:1)混合物中で溶解させた。
調製的HPLC(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax-Eclipse XDB-C18、9.4×250mm、5μm。
温度:25℃。
溶媒A:0.005%TFA/H2O。
溶媒B:MeCN。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
コール酸t-ブチルエステル-コハク酸の合成
ステップ1:コール酸からのコール酸t-ブチルエステルの合成:
トリフルオロ酢酸無水物(200mL、1.43モル)を、氷冷水浴温度の乾燥THF(1L)中で撹拌されたコール酸溶液(50g、0.123モル)へと、5分間にわたり添加した。氷冷水浴を除去し、混合物を80分間にわたり撹拌し、その後、混合物を再冷却し、tert-ブタノール(300mL、3.16モル)を添加した。RTで7時間にわたり撹拌した後、アンモニア水(280mL、25%w/w)を、冷却しながら添加し、温度を20℃未満に保ち、溶液を、RTで12時間にわたり放置した。別分量のアンモニア水(100mL)を添加し、RTでさらに4時間後、混合物を、ジエチルエーテル(2L)と水(1L)との間で分割した(トリフルオロ酢酸の加水分解の進行は、EtOAcを溶離剤とし、RF=0.4とするTLCによりモニタリングする)。有機層は、2NのNaOH溶液(6×1L)、水(6×1L)、ブリン(1L)で洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥させた。有機層を濾過し、減圧下で揮発性物質を蒸発させることにより、固体としてのコール酸tert-ブチルエステル(54g、95%)をもたらし、TLCおよび1H-NMRにより精製した。
ステップ2:コール酸tertブチルエステルからのコール酸t-ブチルエステル-ONH2の合成:
コール酸tert-ブチルエステル(15g、32.3ミリモル)をTHF(150mL)中で溶解させた。トリフェニルホスフィン(16.9g、2当量、64.6ミリモル)およびN-ヒドロキシフタルイミド(10.5g、2当量、64.6ミリモル)を、0℃の反応混合物に添加した。DEAD(13mL、2.5当量、80.8ミリモル)を、1時間にわたり滴下により添加した。添加の完了後、反応混合物をRTに到達させ、一晩にわたり撹拌した。減圧下で揮発性物質を除去した。残留油をEtOH(100mL)中で溶解させ、ヒドラジン水和物(12mL、247.3ミリモル)を添加し、反応混合物を45℃で3時間にわたり加熱したところ、この時点で、TLCが、反応の完全性を示した。減圧下で揮発性物質を除去し、淡色の固体をもたらし、これを、DCM(2×500mL)で洗浄した。減圧下で濾過物を濃縮し、黄色の固体をもたらした。シリカゲル(60〜120メッシュ)を用いるカラムクロマトグラフィーにより、粗物質を精製した。化合物は、溶離剤としてのDCM中1〜2%のMeOHで溶出させた。
ステップ3:コール酸t-ブチルエステル-ONH2からのコール酸t-ブチルエステル-コハク酸の合成:
コール酸t-ブチルエステル-ONH2 (20g、41.7ミリモル)をTHF(200mL)中で溶解させた。コハク酸無水物(4.6g、1.1当量、45.9ミリモル)、トリエチルアミン(11.5g、2当量、83.5ミリモル)を、反応混合物に添加し、RTで3時間にわたり撹拌した。TLCは、反応の完全性を示した。減圧下でTHFを除去し、粘性の油をもたらした。この油を、EtOAc(200mL)中で溶解させ、クエン酸溶液、水、ブリンで洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗固体(30g)をもたらした。この粗生成物を、AcOEt/MeOHの共溶媒中で溶解させることを介する再結晶化により精製し、純度を95%とする10g(42%)の化合物をもたらした。
化合物の識別は、LC-MSおよびNMRにより確認した。
リンカー2:
上記においてリンカー1との関連で説明したのと同様の方法で、アミノアセトアルデヒドジメチルアセタールの代わりに、4,4-ジメトキシブチルアミンを用いて、以下の化合物を調製した。
TOF-MS:質量970.93
リンカー3:NN-AU-0090
上記においてリンカー1との関連で説明したのと同様の方法で、以下の化合物を調製した。
TOF-MS:質量1087.28
リンカー4:(NN-AU-0109)
上記においてリンカー1との関連で説明したのと同様の方法で、アミノアセトアルデヒドジメチルアセタールの代わりに、4,4-ジメトキシブチルアミンを用いて、以下の化合物を調製した。
TOF-MS:質量1115.34
リンカー5:(NN-AU-0091)
材料
固体支持体:1.01ミリモル/g、200〜400メッシュのクロロトリチルクロリド(CTC)樹脂。
Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-Lys(Dde)-OH(Chemimpex)。
Fmoc-Lys(Dde)-OHのポリマー支持体への結合:
クロロトリチルクロリド(CTC)樹脂(4g、4ミリモル)を、乾燥DCM(P2O5により蒸留した)中で1時間にわたり膨潤させた。Fmoc-Lys(Dde)-OH(2.6g、1.2当量、4.8ミリモル)およびDIPEA(3.52mL、4.8当量、19.2ミリモル)を、乾燥DCM(25mL)中で溶解させた。この溶液を、樹脂に移した。樹脂を、Robbins scientific製の回転装置内、RTで一晩にわたり回転させた。反応物を、DCM(6×10mL)およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。
CTC-Lys(Dde)-Fmoc樹脂のFmoc基の除去:
CTC-Lys(Dde)-FmocのFmoc基を、20%(v/v)ピペリジン/DMF(20mL)溶液で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF(10×5mL)、DCM(6×10mL)、およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。
Fmoc-アミノ酸/リンカーを逐次的に連結するための一般的な手順:
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸(樹脂投入量に対して3当量)、HOBt(3当量)、およびDIC(3当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。脱保護化および連結のサイクルにより、アミノ酸を同様の形で逐次的に連結した。
コール酸t-ブチルエステル-コハク酸の連結:
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、コール酸t-ブチルエステル-コハク酸(樹脂投入量に対して3当量)、HOBt(3当量)、およびDIC(3当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで一晩にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。
ペプチジル樹脂からのDdeの脱保護化
ペプチジル樹脂のDde基を、DMF(20mL)中に3%のNH2-NH2で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF(10×5mL)、DCM(6×10mL)、およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。Dde基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。
ブロモ酢酸の連結:
遊離アミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、ブロモ酢酸(樹脂投入量に対して5当量)、HOBt(5当量)、およびDIC(5当量)の溶液を、遊離アミン樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。
切断
ステップI:保護されたペプチドとしての固相からの切断
ブロモ酢酸の最終的な連結後に、樹脂(4g)をエーテル(6×10mL)で洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド-樹脂を、RTのヘキサフルオロイソプロパノール:DCM(1:4、40mL)の混合物で3時間にわたり処理することにより達成した。濾過により切断混合物を回収し、樹脂を、DCM(2×5mL)で洗浄した。過剰な試薬を、窒素下で小容量へと濃縮し、少量のDCM(5〜10mL)を残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。工程を3〜4回にわたり繰り返し、大半の揮発性物質を除去した。残留物を0℃まで冷却し、ジエチルエーテル無水物を添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離し、上清のジエチルエーテルを除去し、新たなジエチルエーテルをペプチドに添加し、再度遠心分離した。工程を3回にわたり繰り返し、全ての有機物を除去し、純度を40%とする粗化合物を3.0gもたらした。
ステップII:側鎖保護基の切断
t-ブチル基の最終的な脱保護化は、粗化合物を、25%のTFA、およびDCM(20mL)中に2.5%のTIPCからなる切断カクテルで処理することにより達成した。溶液を30分間撹拌した。過剰な試薬を、窒素下で小容量へと濃縮し、少量のDCM(5〜10mL)を残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。工程を3〜4回にわたり繰り返し、大半の揮発性物質を除去した。残留物を0℃まで冷却し、ジエチルエーテル無水物を添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、上清のジエチルエーテル相を除去し、新たなジエチルエーテルをペプチドに添加し、再度遠心分離した。工程を3回にわたり繰り返し、全ての有機物を除去し、純度を約35%とする2.7gの粗化合物をもたらした。化合物を調製的HPLCによって精製し、純粋な化合物をもたらした。
リンカー5の精製および特徴づけ
解析的HPCL(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150mm、5μm)。
温度:25℃。
溶媒A:0.1%TFA/H2O。
溶媒B:9:1:0.1(MeCN/H2O/TFA)。
流速1mL/分。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
粗ペプチドは、MeCN/H2O (1:1)混合物中で溶解させ、注入した。
Rt=15.45分間
調製的HPLC(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax-Eclipse XDB-C18、9.4×250mm、5μm。
温度:25℃。
溶媒A:0.1%TFA/H2O。
溶媒B:MeCN。
流速7mL/分
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
リンカー6:(NN-AU-0078)
材料
固体支持体:0.7〜1.3ミリモル/g、100〜200メッシュのPAM樹脂(Sigma)。
Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、MSNT(Chemimpex)、Fmoc-Glu-OtBu(Novabiochem)、Fmoc-Gly-OH(GL Biochem)。
Fmoc-Gly-OHのPAM樹脂への第1の結合:
PAM樹脂(3g、3.3ミリモル)を、乾燥DCM(P2O5により蒸留した)中で1時間にわたり膨潤させた。Fmoc-Gly-OH(4.9g、5当量、16.5ミリモル)、MSNT(4.9g、5当量、16.5ミリモル)、N-メチルイミダゾール(0.75mL、3.75当量、12.4ミリモル)を、2〜3適のTHFを含有する、乾燥DCM(20mL)中で溶解させ、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加した。樹脂を、Robbins scientific製の回転装置内、RTで一晩にわたり回転させた。2時間の反応後、樹脂を、DCM(6×10mL)およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。同一の条件下で工程を今一度繰り返した。
Fmoc-Gly-PAMのFmoc基の除去:
Fmoc-Gly-PAMのFmoc基を、20%(v/v)ピペリジン/DMF(15mL)溶液で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF(10×5mL)、DCM(6×10mL)、およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。
Fmoc-アミノ酸/リンカー/コール酸を逐次的に連結するための一般的な手順:
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸(樹脂投入量に対して5当量)、HOBt(5当量)、およびDIC(5当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。
t-ブチル基のペプチジル樹脂からの切断:
標的分子を固相へと逐次的に結合させた後で、樹脂をジエチルエーテル(6×10mL)で洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド-樹脂を、RTの95%TFA、2.5%トリイソプロピルシラン(TIS)、2.5%水(25mL)からなる切断カクテルで1時間にわたり処理することにより達成した。次いで、樹脂を、DCM(2×5mL)、DMF(2×5mL)、DCM(2×5mL)で洗浄した。乾燥させた、t-ブチル側鎖を切断したペプチド樹脂を、45℃のCHCl3(54mL)とアミノアセトアルデヒドジメチルアセタール(36mL)との混合物で26時間にわたり処理した。切断後、樹脂を排出し、DCM、MeOH、H2O、0.1%TFA、HFIP、DCM、MeOH、およびDCMで洗浄した。濾過物を採取し、真空下で蒸発させた。結果として得られる油を、蒸留水中に溶解させ、TFAでpHを7に調整した。溶液を凍結乾燥させ、粗油をもたらした。粗油を、調製的HPLCで精製して263mgの化合物をもたらした。
ペプチドの精製および特徴づけ
解析的HPCL(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150mm、5μm)。
温度:25℃。
溶媒A:0.1%TFA/H2O。
溶媒B:9:1:0.1(MeCN/H2O/TFA)。
流速1mL/分。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
粗ペプチドは、MeCN/H2O(1:1)混合物中で溶解させ、注入した。
Rt=14.37分間
調製的HPLC(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax-Eclipse XDB-C18、9.4×250mm、5μm。
温度:25℃。
溶媒A:0.005%TFA/H2O。
溶媒B:MeCN。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
リンカー7:(NN-AU-0015)
材料
固体支持体:0.24ミリモル/gのTentagel S RAM樹脂2g
Boc-4-アミノ安息香酸、H-Lys(Fmoc)-OH、HATU、NMM、DMF、Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(Chem Impex)、コハク酸無水物、コール酸、DIC(Sigma)、TFA、ピペリジン、DMF、DCM(Spectrochem、Bombay、India)、およびHOBt(Chemlabs、Leonid chemicals(Pvt)Ltd、India)。
Boc-アミノ安息香酸-Lys(Fmoc)-OHの合成
Boc-4-アミノ安息香酸(1,16g、4.8ミリモル、0.9当量)、HATU(2.05g、5.4ミリモル、1.0当量)、およびNMM(1.2mL、10.8ミリモル、2当量)を、DMF(20mL)中で溶解させ、反応混合物を、氷冷浴温度で5分間にわたり撹拌した。この混合物に、H-Lys(Fmoc)-OH(2g、5.4ミリモル、1.0当量)を、氷冷浴温度で添加し、混合物を、RTでさらに3時間にわたり撹拌した。反応(TLCによりモニタリングされる)の完了後、反応混合物を氷冷水で冷まし、沈殿物を濾過した。得られた沈殿物を、氷冷水およびヘキサンでさらに洗浄した。乾燥後に得られた化合物(2.1g、65%)を、次のステップにおいてさらに精製することなく用いた。
Boc-アミノ安息香酸-Lys(Fmoc)-OHのポリマー支持体への結合:
Tentagel S RAM樹脂(2g、0.24ミリモル)を、DCMおよびDMF中で1時間ずつにわたり膨潤させた。Boc-アミノ安息香酸-Lys(Fmoc)-OH(1.4g、2.4ミリモル)、HOBt(327.6mg、2.4ミリモル)、DIC(371.6mg、2.4ミリモル)を、DMF(10mL)中で溶解させ、あらかじめ膨潤させた樹脂に移した。樹脂を、RTのRobbins scientific製の回転装置内で5時間にわたり回転させた。反応物を、DCM(6×10mL)およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。
Boc-アミノ安息香酸-Lys(Fmoc)樹脂のFmoc基の除去:
上記Boc-アミノ安息香酸-Lys(Fmoc)樹脂のFmoc基を、20%(v/v)ピペリジン/DMF(20mL)溶液で、5分間および15分間の2回にわたり処理することにより脱保護化した。次いで、樹脂を、DMF(10×5mL)、DCM(6×10mL)、およびDMF(6×10mL)で濾過および洗浄した。Fmoc基の脱保護化は、ニンヒドリン陽性試験により確認した。
Fmoc-アミノ酸を逐次的に連結するための一般的な手順:
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。乾燥DMF中であらかじめ活性化させた、Fmocを保護したアミノ酸(樹脂投入量に対して3当量)、HOBt(3当量)、およびDIC(3当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで3時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。脱保護化および連結のサイクルにより、アミノ酸を同様の形で逐次的に連結した。
コハク酸無水物の連結:
Fmocを脱保護化したアミン樹脂を、DMF中で膨潤させた。NMP中にDIPEA(5当量)を伴うコハク酸無水物(樹脂投入量に対して5当量)の溶液を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで2時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。連結反応の完了は、ニンヒドリン陰性試験により確認した。
コール酸ヒドロキシルアミンの連結:
乾燥DMF中のコール酸t-ブチルエステル-ONH2(樹脂投入量に対して5当量)、HOBt(5当量)、およびDIC(5当量)を、あらかじめ膨潤させた樹脂に添加し、反応混合物を、RTで24時間にわたり回転させた。樹脂を、DMF(6×5mL)、DCM(6×5mL)、およびDMF(6×5mL)で濾過および洗浄した。
ペプチドの樹脂からの切断:
標的分子を固相へと逐次的に結合させた後で、樹脂をジエチルエーテル(6×10mL)で洗浄し、一晩にわたり真空デシケーター内で乾燥させた。ペプチドの固体支持体からの切断は、ペプチド-樹脂を、RTの95%/2.5%/2.5%のTFA/TIS/水(25mL)からなる切断カクテルで3時間にわたり処理することにより達成した。濾過により切断混合物を回収し、樹脂を、DCM(2×5mL)で洗浄した。過剰な試薬を、窒素下で小容量へと濃縮し、少量のDCM(5〜10mL)を残留物に添加し、窒素下で蒸発させた。工程を3〜4回にわたり繰り返し、大半の揮発性物質を除去した。残留物を0℃まで冷却し、ジエチルエーテル無水物を添加して、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離し、上清のジエチルエーテル相を除去し、新たなジエチルエーテルをペプチドに添加し、再度遠心分離した。工程を3回にわたり繰り返し、全ての有機物を除去し、粗化合物(純度を15%とする1.3g)をもたらした。調製的HPLCにより標的化合物を精製し、化合物をもたらした。
ペプチドの精製および特徴づけ
解析的HPCL(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150mm、5μm)。
温度:25℃。
溶媒A:0.1%TFA/H2O。
溶媒B:9:1:0.1(MeCN/H2O/TFA)。
流速1mL/分。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
粗ペプチドは、MeCN/H2O(1:1)混合物中で溶解させ、注入した。
Rt=7.46分間
調製的HPLC(Agilent 1100シリーズ)
カラム:Zorbax-Eclipse XDB-C18、9.4×250mm、5μm。
温度:25℃。
溶媒A:0.005%TFA/H2O。
溶媒B:MeCN。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
勾配
リンカー8:(NN-AU-0016)
上記においてリンカー7との関連で説明したのと同様の方法で、FMOC-Lys(Mtt)-OHおよびWang樹脂を用いて、以下の化合物を調製した。
TOF-MS:質量916.13
リンカー9 :(NN-AU-0086)
上記においてリンカー7との関連で説明したのと同様の方法で、FMOC-Lys(Mtt)-OHおよびWang樹脂を用いて、以下の化合物を調製した。
TOF-MS:質量1059.4
HPLC:
カラム:Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150mm、5μm)。
温度:25℃。
溶媒A:0.1%TFA/H2O。
溶媒B:9:1:0.1(MeCN/H2O/TFA)。
流速1mL/分。
モニタリングされる波長:220nm(ダイオードアレイ検出器)。
Rt=14.02分。
リンカー10:
材料
手順
NMP中に0.5MのHOBt溶液を調製した。
樹脂を、DCM中で30分間にわたり膨潤させた。
樹脂を、カダベリン:DCMの混合物(10mL、1:9)で30分間にわたり処理した。
樹脂を、DCM中に5%のDIPEA、5%のMeOHで30分間にわたり処理した。
樹脂を、DCMで洗浄した(3回)。
Fmoc-OEG-OHの連結:
NMP(8mL)中に0.5MのFmoc-OEG-OH/DIC/HOBt溶液を調製し、2分間にわたる混合の後、トリチル樹脂(1g)へと添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうした後、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LC-MSにより解析した。
キャッピング:
Ac2O/DIPEA/NMP(1:1.5)溶液を添加した。樹脂をRTで10分間にわたり撹拌し、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。
De-Fmoc:
樹脂を、30%ピペリジン-NMPで2×10分間にわたり処理した。
樹脂を、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。
第2のFmoc-OEG-OHの連結:
NMP(8mL)中に0.5MのFmoc-OEG-OH/DIC/HOBt溶液を調製し、2分間にわたり混合し、上記の樹脂に添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうした後、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LC-MSにより解析した。
De-Fmoc:
樹脂を、30%ピペリジン-NMPで2×10分間にわたり処理した。
樹脂を、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。
Fmoc-Glu-tBuの連結:
NMP(8mL)中に0.5MのFmoc-Glu-tBu/DIC/HOBt溶液を調製し、2分間にわたり混合し、樹脂に添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうし、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LC-MSにより解析した。
De-Fmoc:
樹脂を、30%ピペリジンNMPで2×10分間にわたり処理した。
樹脂を、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。
コール酸の連結:
NMP(8mL)中に0.5Mのコール酸/DIC/HOBt溶液を調製し、2分間にわたり混合し、樹脂に添加した。樹脂をRTで45分間にわたり振とうした後、NMP(5回)およびDCM(5回)で洗浄した。少量の生成物を樹脂から切断し、LC-MSにより解析した。
樹脂からの切断:
樹脂を、TFA/水/Et3SiH混合物(15mL、90:5:5)で10分間ずつ2回にわたり処理した。混合された濾過物を濃縮し、LC-MSにより解析した。LC-MSは、生成物(60%)およびトリフルオロアセチル化された生成物(40%)の形成を示した。次いで、残留油を、2MのNH3/MeOH(10mL)中に溶解させ、RTで1時間にわたり撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、残留物をMeCNとMQとの混合物(11mL、1:10)中で溶解させ、水を用いる調製的HPLCにより濾過および精製した。
画分を、真空中で混合および濃縮し、194mgの無色の油をもたらした。
TOF-MS:質量912.13
上記においてリンカー5との関連で説明したのと同様の方法で、FMOC-Lys(Mtt)-OHおよびWang樹脂を用いて、以下の化合物を調製した。
リンカー11:
リンカー12:
および
リンカー13:
コール酸をコンジュゲートした化合物の合成
方法3.1による、N末端のPheにおけるリンカー3の結合
化合物A:NNC 0186-0000-0078
リンカー3による、N末端における、hGH[Q83C、Y143C]NNC 0186-0000-0017の還元的アルキル化。
試料:
凍結乾燥させたhGH[Q83C、Y143C](15mg)を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液中に溶解させ、Amicon Ultra15デバイス(Ultracel 10K管)を用いて、4000rpm/分、10℃で3×8分間にわたる遠心分離により、25mMのHEPES、pH7.0へと緩衝液交換した。
手順:
アルデヒドを脱離させるために、リンカー3(11mg)をTFA(500μL)で6分間にわたり処理し、蒸発させた後で、EtOH(0.5mL)で2回にわたりストリッピングし、乾燥させた。
1NのNaOHを添加することによりpHを約7.0に保ちながら、上記のhGH[Q83C、Y143C]溶液を少しずつ添加した。水(500μL)中に溶解させたNaCNBH3(53mg)を、5分間隔で少しずつ(5×100μL)添加した。
反応フラスコをスズ箔でラッピングし、反応混合物を、室温で一晩にわたり静かに撹拌する。1時間にわたる撹拌後に、清明な溶液が得られる。一晩にわたり撹拌した後、LC/MSにより試料を解析した。Rt=6分間のときに生成物のm/z:23,063であったが、また、出発タンパク質も残存した。
IEXクロマトグラフィーおよびHICクロマトグラフィー、G25カラム上における緩衝液の交換、ならびに限外濾過の組合せを用いて混合物を精製し、純度を95%とする4mgの化合物を得た。
生成物のm/z:23,063[M+1]。
化合物B:NNC 0186-0000-0036
方法3.1に従うリンカー6による、N末端における、hGH[Q83C、Y143C]の還元的アルキル化。
試料:
凍結乾燥させたhGH[Q83C、Y143C](200mg)を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液中に溶解させ、Amicon Ultra15デバイス(Ultracel 10K管)を用いて、4000rpm/分、10℃で3×7分間にわたる遠心分離により、25mMのHEPES、pH7.00へと緩衝液交換した。最終容量:40mL。
手順:
リンカー6(39.6mg)を、50%のTFA/H2O(2mL)混合物で20分間にわたり処理し、回転蒸発器上で蒸発させて乾燥させ、EtOH(2×1mL)でストリッピングした。
1NのNaOH(5μL)を、乾燥させたリンカーに添加して、pHの降下を防止しながら、hGH[Q83C、Y143C]を添加した。
上記のhGH[Q83C、Y143C]溶液をリンカーに添加し、1NのNaOH(90μL)によりpHを7.00に調整した。反応混合物を添加する間、pHは6.55に降下した。1NのNaOH(40μL)によりpHを7.00に調整した。
NaCNBH3(67.6mg)を水(600μL)中に溶解させ、5分間隔で少しずつ(3×200μL)添加した。反応混合物をスズ箔でラッピングし、一晩にわたり静かに撹拌しながらインキュベートした。一晩にわたり撹拌した後、LC-MS解析はなお、ある量の出発物質も示した。反応混合物を、RTでインキュベートし、静かに撹拌し、4℃で一晩にわたり静置した。反応混合物のpHを7.50に調整し、Milli-Q水で20mSの伝導率まで希釈してから、Aektaシステム上で精製した。
試料容量:110mL
カラム:HiLoad 26/10 Q Sepharose
緩衝液A:20mM HEPES、pH:7.50+10%エチレングリコール
緩衝液B:20mM HEPES、pH:7.50+1M NaCl+10%エチレングリコール
流速:6mL/分。
勾配:0〜5%、1CV、5〜40%、12CV、40〜100%、1CV
画分のサイズ:7mL。流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて試料を適用した。画分E4において、所望の質量実測値:22,989
十分に純粋でなかった全ての画分は、さらなる精製のためにプールされた。
3回にわたる操作において、画分E4を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。
カラム:50/30 Sephadex G25 Fine
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液。
流速:10mL/分。
画分のサイズ:45mL。
1.操作:画分A2〜A3をプールした。16.6mgの純粋化合物
2.操作:画分A1〜A2をプールした。12.9mgの純粋化合物
3.操作:画分A7〜A8をプールした。19.2mgの純粋化合物
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z:実測値22,989
化合物C:NNC 0186-0000-0050
方法3.2に従う、Gln残基におけるリンカー7の結合。
上記で説明した通りに、トランスアミノ化されたhGH[Q83C、Y143C]を生成させ、リンカー7とコンジュゲートした。TOF-LC-MS:質量23,253.99
プール1:収量:12.8mg。純度:100%。
プール2:収量:19.2mg。純度:100%。
化合物D:NNC 0186-0000-0061
上記において化合物Cとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー8を用いて、以下の化合物を調製した。
化合物E:NNC 0186-0000-0081
方法3.3に従う、101位(L101C)におけるリンカー5の結合。
方法2で説明した通りに得られたhGH[Q84C、L101C、Y143C]は、その遊離システインの一部が、グルタチオンおよびシスタミンで保護されていた。TEA/EDTA緩衝液中のTSPPを用いて、選択的脱保護を実施した。
約0.1MのNaCl(170mL、タンパク質濃度:2.69mg/mL)を伴う20mMのTEA緩衝液、pH7.4中のhGH[Q84C、L101C、Y143C]溶液に、2mMの濃度までEDTA(126mg)を添加し、6NのNaOHによりpHを8.5に調整した。TSPP(339mg、25当量)を添加し、結果として得られる混合物を、RTで4時間にわたり静かに撹拌した。
LC-MS TOF:22,028は、脱保護されたタンパク質に対応する(-75)。
リンカーによる連結
トリス/NaCl中の脱保護されたhGH[Q84C、L101C、Y143C]溶液(140mg、13.3mL)に、NMP(1mL)、NaCl(0.88mg)、およびトリシン/EDTA緩衝液(14mL)の混合物中に溶解させたリンカー5溶液(33mg)を添加した。結果として得られる混合物を、周囲温度で一晩(16時間)にわたり静かに撹拌した。
LC-MS TOF:Rt=6,6分間のときに実測値23,010
粗生成物についてのHPLC:約92%の純度
総量:138mg。
化合物F:NNC 0186-0000-0087
上記において化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー5およびGH化合物であるhGH[S62C、Q84C、Y143C]を用いて、以下の化合物を調製した。
タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50へと緩衝液交換した。
緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:20mM TEA、pH:8.50+10%エチレングリコール
流速:8mL/分。
画分A3およびA5を、精製のためにプールした。
精製:
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜10%の緩衝液B
勾配2:12CVにわたり10〜40 %の緩衝液B
勾配3:1CVにわたり40〜100%の緩衝液B流速:6mL/分。
温度:RT
画分:7mL
画分D1 1〜D8をプールおよび緩衝液交換し、画分C12およびD12をプールおよび緩衝液交換した:
画分D1 1〜D8の緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液
流速:8mL/分。
画分A2、A4、A6、およびB6を、回収およびプールして、純度を100%とする47.5mgの化合物(HPLCによる定量化)を得た。
C12およびD12の緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液
流速:8mL/分
画分B4を、回収およびプールして、純度を90%とする11.9mgの化合物(HPLCによる定量化)を得た。LC-MS TOF:23,036.62[M+1]
化合物G:NNC 0186-0000-0088
方法3.2に従う、hGH[Q83C、Y143C]のGln40位におけるリンカー10の結合。
胆汁酸リンカーであるA-W-B1-NH2(II)およびmTGアーゼによるGH化合物(I)の直接的なトランスアミノ化(方法3(2)で説明した)。
緩衝液:
反応緩衝液: 20mMのトリエタノールアミン、pH8.5
イミダゾール緩衝液: pH 7.4の20mMイミダゾール緩衝液、10mMのCaCl2、10%のグリセロール、0.02%のTween 80。
溶液:
A:反応緩衝液中に227uMのhGH[Q84C、Y143C]溶液(4.4 mg)
B:反応緩衝液中に2.91mMのリンカー10溶液
D:20mMのイミダゾール緩衝液(515μL)、pH7.4、10mMのCaCl2、10%のグリセロール、0.02%のTween 80中のAjinomoto TGase(31mg);C=60mg/mL=11.4μM。
以下のスキームに従い、25℃で溶液Aと溶液Bとを混合し、溶液Dを添加した。結果として得られる混合物を、RTで42時間にわたり撹拌した。
以下の表に記載される操作条件を用いて、反応混合物を、Aekta 100システム上で精製した。
40mL中に9〜18%の緩衝液B1により、3つのピークを溶出させた。標的分子(LC-MS:22,933)を含有する画分を回収した。
化合物H
化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー11およびGH化合物であるhGH[Q84C、L101C、Y143C]を用いて、以下の化合物を調製した。
タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50へと緩衝液交換した。
緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:20mM TEA、pH:8.50+10%エチレングリコール
流速:8mL/分。
画分を、精製のためにプールした。
精製:
反応混合物は、Aektaシステムで精製した。
20mM TEA、pH8.50+10%エチレングリコールにより、0.1M NaClの塩濃度へと希釈した。
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
CIP:1MのNaOH
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜14%の緩衝液B
勾配2:10CVにわたり14〜19%の緩衝液B
勾配3:1CVにわたり19〜100%の緩衝液B
流速:5mL/分
温度:RT
画分:画分1つ当たり7mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて試料を適用した。
極めて幅の広いピーク。
画分E12、E7、F3、F8、G2、G5を、HPLCで解析した。
画分E7〜G7を、プールした。
容量:190mL
HPLCで脱塩する前に定量化および点検を行う。
実測面積:3624836、注入量:5μL、励振係数:1000000=0.72mg/mL×190mL=137mg(緩衝液交換前)
RTにおける生成物:14.36分後。
脱塩:
Aekta上で、生成物を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。
カラム: HiPrep G25 Fine 50/20 desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム
流速:8mL/分
操作:1.5CV
温度:RT
画分:画分1つ当たり45mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、2回にわたる操作により試料を適用した。
1回目の操作に由来する画分A3〜A5を、2回目の操作に由来する画分A2〜A4と併せてプールした。
容量: 270mL
プールは、カットオフを10kDaとするAmicon Filterデバイスを用いて濃縮した。
4000rpm/6分間で遠心分離した。
総容量:37.5mL
HPLCで定量化した:
実測面積:16576155、注入量:5μL、励振係数:1000000=3.32mg/mL×37.5mL=124.5mg
LC-MS(エレクトロスプレー):Rt:6分間のときにm/z:22,978.4
HPLC:Rt=14.23分間
化合物I
化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー12およびGH化合物であるhGH[Q84C、L101C、Y143C]を用いて、以下の化合物を調製した。
タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50へと緩衝液交換した。
緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:20mM TEA、pH:8.50+10%エチレングリコール
流速:8mL/分。
精製:
反応混合物は、Aekta上で精製した。
20mM TEA、pH8.50+10%エチレングリコールにより、0.1M NaClの塩濃度へと希釈した。
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
CIP:1MのNaOH
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜15%の緩衝液B
勾配2:10CVにわたり15〜25%の緩衝液B
勾配3:1CVにわたり25〜100%の緩衝液B
流速:5mL/分
温度:RT
画分:画分1つ当たり7mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて試料を適用した。
幅の狭いピークによる良好な分離。
画分C10、C12、D9、およびD7を、解析した。すべて純粋で、生成物を含む。
画分C10〜D7を、プールした。
容量:63mL
脱塩:
Aekta上で、生成物を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。
カラム: HiPrep G25 Fine 50/20 desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム
流速:8mL/分
操作:1.5CV
温度:RT
画分:画分1つ当たり45mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、1回の操作により試料を適用した。
画分A3〜A5を、プールした。
容量:135mL
プール画分は、カットオフを10kDaとするAmicon Filterデバイスを用いて濃縮した。
4000rpm/6分間で遠心分離した。
容量: 21.3mL
HPLCで定量化した:
実測面積:16991257、注入量:5μL、2×FF、励振係数:1000000=6.80mg/mL×21.3mL=144.5mg
純度:100%
HPLC:Rt=13.65分間
LC-MS(エレクトロスプレー):Rt:6分間のときにm/z:22,994.5。
化合物J
化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー13およびGH化合物であるhGH[Q84C、L101C、Y143C]を用いて、以下の化合物を調製した。
タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50へと緩衝液交換した。
緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:20mM TEA、pH:8.50+10%エチレングリコール
流速:8mL/分。
精製:
反応混合物は、Aekta上で精製した。
20mM TEA、pH8.50+10%エチレングリコールにより、0.1M NaClの塩濃度へと希釈した。
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
CIP:1MのNaOH
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜14%の緩衝液B
勾配2:10CVにわたり14〜25%の緩衝液B
勾配3:2CVにわたり25〜100%の緩衝液B
流速:5mL/分
温度:RT
画分:画分1つ当たり7mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
画分C2、C11、およびD8はTOFで点検し、画分B1、C3、C6、C9、C12、D10はHPLCで解析した。
画分B1〜D5の全てを、プールした。
脱塩:
Aekta上で、プールした画分を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。
カラム: HiPrep G25 Fine 50/20 desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム
流速:8mL/分
操作:1.3CV
温度:RT
画分:画分1つ当たり45mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、2回の操作により試料を適用した。
1回目の操作に由来する画分A4、A5、およびA6を、2回目の操作に由来する画分A3、A4、およびA5と併せてプールした。
プールは、カットオフを10kDaとするAmicon Filterデバイスを用いて濃縮した。
4000rpm/6分間で遠心分離した。
容量:30mL
HPLCで定量化した:
実測面積:17898813、注入量:5μL、2×FF、励振係数:1000000=3,58mg/mL×29.5mL=105.5mg。
Rt:13.63分間のときに純度:96%
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z:22,994
化合物K
化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー5およびGH化合物であるhGH[L101C]を用いて、以下の化合物を調製した。
タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50へと緩衝液交換した。
緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:20mM TEA、pH:8.50+10%エチレングリコール
流速:8mL/分。
1回目の精製:
反応混合物は、Aekta上で精製した。
20mM TEA、pH 8.50+10%エチレングリコールにより、0.1M NaClの塩濃度へと希釈した。
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
CIP:1MのNaOH
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜15%の緩衝液B
勾配2:10CVにわたり15〜30%の緩衝液B
勾配3:2CVにわたり30〜100%の緩衝液B
流速:5mL/分
温度:RT
画分:画分1つ当たり7mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
画分D5、D4、D1、E3、およびE4はHPLCで解析した。
全ての画分において、所望の生成物の直前のピークを検出した。
全ての画分を、異なる勾配を用いる第2の精製のためにプールした。
2回目の精製:
プーリングされた画分は、Aekta上で精製した。
20mM TEA、pH8.50+10%エチレングリコールにより、0.1M NaClの塩濃度へと希釈した。
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜xx%の緩衝液B
勾配2:10CVにわたりxx%の緩衝液B
勾配3:2CVにわたりxx〜100%の緩衝液B
流速:5mL/分
温度:RT
画分:画分1つ当たり7mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
脱塩:
Aekta上で、生成物を、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。
カラム: HiPrep G25 Fine 50/20 desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム
流速:8mL/分
操作:1.3CV
温度:RT
画分:画分1つ当たり45mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
画分A3、A4、およびA5と併せてプールした。
プール画分は、カットオフを10kDaとするAmicon Filterデバイスを用いて濃縮した。
4000rpm/6分間で遠心分離した。
容量:18mL
HPLCで定量化した:
実測面積:11570188、注入量:5μL、2×FF、励振係数:1000000=2.31mg/mL×2=4.62mg/mL×17.7mL=82mg
Rt:13.70分間。
LC-MS TOF:Rt:6分間のときに質量実測値:23,097
化合物L
化合物Eとの関連で説明したのと同様の方法で、リンカー5およびGH化合物であるhGH[Q40C、Q84C、Y143C]を用いて、以下の化合物を調製した。
タンパク質とリンカーとを一晩にわたり連結した後、反応混合物を、20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50へと緩衝液交換した。
緩衝液交換:
カラム: HiPrep 26/10 Desalting
緩衝液A:20mM TEA、pH:8.50+10%エチレングリコール
流速:8mL/分。
精製:
反応混合物は、Aekta上で精製した。
20mM TEA、pH8.50+10%エチレングリコールにより、0.1M NaClの塩濃度へと希釈した。
カラム: HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
CIP:1MのNaOH
緩衝液A:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン+10%エチレングリコール、pH8.50+1M NaCl
勾配1:1CVにわたり0〜15%の緩衝液B
勾配2:11CVにわたり15〜25%の緩衝液B
勾配3:2CVにわたり25〜100%の緩衝液B
流速:5mL/分
温度:RT
画分:画分1つ当たり7mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
画分C2、C3、C5、C7、C9、C11、D12、D10、D8、およびD6を解析した(HPLC)。全ての純粋な画分をプールしたが、2つのプールを作製し、個別に脱塩した。
プールI:C2〜C10。
プールII:C11〜D8
脱塩:
Aekta上で、２つのプールを、10mMの重炭酸アンモニウム緩衝液へと緩衝液交換した。
プールI
カラム: HiPrep G25 Fine 50/20 desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム
流速:8mL/分
操作:1.3CV
温度:RT
画分:画分1つ当たり45mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
プールII
カラム: HiPrep G25 Fine 50/20 desalting
緩衝液A:10mMの重炭酸アンモニウム
流速:8mL/分
操作:1.3CV
温度:RT
画分:画分1つ当たり45mL
流速を5mL/分とする試料ポンプを用いて、試料を適用した。
画分A3、A4、およびA5と併せてプールした。
プールは、カットオフを10kDaとするAmicon Filterデバイスを用いて濃縮した。
4000rpm/6分間で遠心分離した。
容量:31mL
HPLCで定量化した:
プール1:実測面積:8819533、注入量:5μL、励振係数:1000000=1.76mg/mL
プール2:実測面積:8974748、注入量:5μL、励振係数:1000000=1.79mg/mL
両方のプールを混合し、31mLの全容量をもたらした。総量:55mg
LC-MS(エレクトロスプレー):Rt:7分間のときにm/z:22,995.6
HPLC:Rt=13.72分間
(実施例1)
上記(方法5および8)のBAFアッセイおよびタンパク質分解による消化を介する、選択された化合物についての解析
さらなるジスルフィド結合を含む成長ホルモン化合物を調製し、in vitroにおける活性およびプロテアーゼに対する安定性をアッセイした。以下に示す結果は、4時間後(T=4)に得られた。
(実施例2)
方法5および8に記載したBAFアッセイおよびタンパク質分解による消化を介する、選択された化合物についての解析
方法5および8に従い、成長ホルモン化合物を調べた。
(実施例3)
BAF-3 hGH受容体アッセイ(方法5)を用いて、in vitroにおける胆汁酸コンジュゲートの効力を解析した。
本発明の化合物のプロテアーゼに対する安定性は、一般的方法において説明した通り、化合物を、キモトリプシンまたはエラスターゼと共に4時間にわたりインキュベートすることにより決定した。完全GH化合物の百分率(%)を測定し、結果を、以下の表に組み入れる。
(実施例4)
CACO 2アッセイにおけるGH化合物の透過性
腸のCaco-2細胞の単層を介して輸送されるGH化合物の能力を、上記の方法11で説明した通りに決定した。吸収方向における見かけの透過性(Papp)を測定し、一連のGH化合物について計算されたPappを、以下の表に列挙する。
計算されたPappは、プロテアーゼに対して安定化させたGH化合物および/またはコール酸をコンジュゲートしたGH化合物が、Caco-2細胞単層を介して輸送されることを裏付ける。ある化合物については高値のPappが得られる一方で、他の化合物は、Papp値が0.5×10-8cm/秒を下回る低度の輸送を示す。
(実施例5)
GH化合物の薬物動態特性
ミニブタにおける、hGH、hGH(Q84C、Y143C)、およびコール酸誘導体を伴うhGH(Q84C、Y143C、L101C)の薬物動態特性を、内視鏡による投与および静脈内投与後において探索した。上記で説明した手順(本明細書の方法9)に従い、hGH、hGH(Q84C、Y143C)、およびコール酸誘導体を伴うhGH(Q84C、Y143C、L101C)(化合物E)について解析した。計算された薬物動態パラメータを、以下の表に組み入れる。
さらなる研究では、上記で説明した通り、Sprague Dawleyラットにおける、hGH、hGH(Q84C、Y143C)、およびコール酸誘導体を伴うhGH(Q84C、Y143C、101C)の薬物動態特性を、腸内注射後において探索した。上記で説明した手順(本明細書の方法10)に従い、hGH(Q84C、Y143C)およびコール酸誘導体を伴うhGH(Q84C、Y143C、L101C)(化合物E)について解析した。計算された薬物動態パラメータを、以下の表に組み入れる。

Claims (15)

  1. 式(I):
    A-W-B-GH (I)
    [式中、
    GHは、成長ホルモン化合物を表し、
    Aは、胆汁酸残基を表し、
    Bは、GHに共有結合させた親水性スペーサーを表し、
    Wは、AとBとを連結する化学基である]
    の成長ホルモンコンジュゲートおよび薬学的に許容される塩。
  2. 成長ホルモン化合物GHが、配列番号1により定義されるヒト成長ホルモン(hGH)と比較して、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、請求項1に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  3. 成長ホルモン化合物が、ループ部分とヘリックス部分との間を連結する、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、請求項2に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  4. 化合物が、配列番号1中に、R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C、および/またはV185C/S188Cに対応する少なくとも1対の変異を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  5. 成長ホルモン化合物が、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含み、そのシステインのうちの少なくとも1つが、配列番号1中のアミノ酸128〜154に対応するループ3(L3)内に存在する、請求項2から4のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  6. 成長ホルモン化合物が、L3を、ヘリックス2(H2)またはループ1(L1)と連結する、1つまたは複数のさらなるジスルフィド結合を含む、請求項5に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  7. 胆汁酸残基(A)が、コール酸残基である、請求項1から6のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  8. コール酸残基が、
    [式中、(*)は、Wを介する親水性スペーサー(B)への結合点を表す]から選択される、請求項7に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  9. GHが、N末端、Gln40、およびGln141からなる群から選択される野生型アミノ酸残基においてコンジュゲートされる、請求項1から8のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  10. GHが、突然変異体のアミノ酸残基においてコンジュゲートされる、請求項1から8のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  11. 突然変異体のアミノ酸基が、システイン(Cys)である、請求項10に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  12. cys突然変異体が、ヒト成長ホルモンにおける101位に対応する位置にある、請求項11に記載の成長ホルモンコンジュゲート。
  13. 請求項1に記載の成長ホルモンコンジュゲートを調製する方法であって、
    a)コール酸リンカーを、成長ホルモン化合物(GH)へとコンジュゲートするステップと、
    b)前記成長ホルモンコンジュゲートを得るステップと
    を含む方法。
  14. 請求項1から12のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  15. 循環成長ホルモン量の増大から患者が利益を得る、疾患または状態を治療するために成長ホルモン活性を使用することができる疾患を治療する方法であって、有効量の、請求項1から12のいずれか一項に記載の成長ホルモンコンジュゲートまたは請求項14に記載の医薬組成物を患者に投与するステップを含む方法。
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