ES2869309T3 - Método para la conjugación de proteínas con tioéter - Google Patents

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Charlotte Schou Hunneche
Thomas Budde Hansen
Ernst Broberg Hansen
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Abstract

Un método para preparar un conjugado de proteína en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, que comprende las etapas de; a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína, b) adicionar un agente reductor a dicha composición de proteína para obtener una mezcla de reducción, en donde el agente reductor es una fosfina, c) permitir que ocurra una reacción de reducción, d) obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH), e) eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa, f) añadir una fracción química activada (Z*) a la solución, (que comprende la proteína reducida), obtener una mezcla de conjugación que incluye 1-4 equivalentes de la fracción química (Z*), g) permitir que ocurra una reacción de conjugación y h) obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z), en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la conjugación de proteínas con tioéter
Campo técnico
La presente invención, refiere métodos mejorados para preparar conjugados de proteínas con un tioéter, mediante el uso de una cisteína libre de la proteína, como punto de unión para una fracción de interés.
Antecedentes
Los conjugados de proteínas tienen múltiples funcionalidades, particularmente en la industria farmacéutica, donde la capacidad de enlazar covalentemente varias fracciones a una proteína terapéutica de interés, y de esta manera mejorar las propiedades de la molécula de interés particular.
La conjugación de péptidos, generalmente se obtiene mediante síntesis en estado sólido, mientras que este enfoque es menos atractivo para proteínas más grandes. Cuando se desea la conjugación de polipéptidos/proteínas más grandes, el proceso se complica por la necesidad de obtener una conjugación específica del sitio para obtener un producto homogéneo. Se han desarrollado varias técnicas que proporcionan medios para conjugar residuos N- y C-terminales, así como también residuos internos de aminoácidos.
Para las proteínas de la hormona del crecimiento, los residuos de Gin y Lis, se han dirigido con éxito como se describió en documentos tal como WO2005/070468 y WO2009/027369, en donde la especificidad de la enzima para residuos de aminoácidos internos particulares, asegura la conjugación específica del sitio.
La conjugación específica de sitio de proteínas, incluida la hormona del crecimiento, se describió previamente, por ejemplo, en el documento WO 99/03887, donde la conjugación dirigida al sitio se obtiene mediante un residuo de cisteína adicionada, haciendo reaccionar la proteína con un polímero o fracción reactiva con cisteína. Antes de esto, la proteína se reduce parcialmente con ditiotreitol (DTT) para mejorar la PEGilación con la PEG-maleimida (o PEG-vinilsulfona), teniendo cuidado de no reducir también los enlaces disulfuro de la proteína. La publicación describe además, las dificultades para obtener una elevada proporción de proteína mono-PEGilada, en la composición del producto final.
También se describen diferentes medios para obtener la reducción selectiva de una cisteína adicionada en el documento WO 2006/134173, tratando principalmente con factor ViIa, que incluye también enlaces disulfuro internos. Los documentos WO2011 / 089255 y WO2012 / 010516, describen el uso de un residuo de cisteína adicional para la conjugación de aglutinantes de albúmina y residuos de ácido cólico, respectivamente.
Además, la conjugación cis, también puede aplicarse a proteínas, anticuerpos o sus fragmentos, tal como se describió en los documentos WO 2007/03898 y WO2012166622.
Las etapas de reducción y conjugación, son en sí mismas procesos químicos conocidos, pero los procesos requieren mucho manejo, lo que hace que los procesos sean de larga duración e ineficaces.
Por lo tanto, para avanzar de la investigación al desarrollo con compuestos conjugados cis, existe una necesidad insatisfecha de proporcionar métodos que sean eficientes, económicos y aplicables a escala industrial.
Resumen
La presente patente, refiere un método para preparar un conjugado de proteína, en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, que comprende las etapas de;
a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína,
b) adicionar un agente reductor a dicha composición de la proteína, en donde el agente reductor es una fosfina, c) permitir que ocurra la reducción,
d) obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH),
e) eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa,
f) añadir una fracción química activada (Z*) a la solución que comprende la proteína reducida
g) permitir que ocurra una reacción de conjugación y
h) obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z),
en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial.
El método implica usar un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial. En particular, la reacción de reducción y conjugación, es de acuerdo con la invención, se realiza en el tanque de retenido de un sistema de filtración y cuando se considera favorable, el sistema de filtración puede usarse durante todo el proceso.
El método, puede incluir además etapas de ultrafiltración y / o diafiltración. En situaciones donde se desea una concentración específica de uno o más reactivos, puede aplicarse una etapa de ultrafiltración. Como un ejemplo, la concentración del disulfuro mixto, puede ajustarse mediante una etapa de ultrafiltración para alcanzar al menos 100 pM, tal como 150 pM, 250 pM, 350 pM o incluso tal como superior a 400 pM, independientemente de la concentración del disulfuro mixto en la preparación de partida. Para una hormona del crecimiento, la concentración puede ser al menos 2 g/L, tal como 5 g/L o tal como 10 g/L, independientemente de la concentración de la hormona del crecimiento en la preparación de partida.
Pueden usarse diafiltraciones para eliminar moléculas pequeñas del sistema de filtración y puede usarse un umbral relevante, tal como 10 kDa pero, por supuesto, en dependencia de la proteína y los reactivos usados.
El método aplica un disulfuro mixto como punto de partida, ya que se ha encontrado que es una fuente fiable de proteína con una cisteína libre, normalmente presentada como una cisteína libre bloqueada, en donde la caperuza se deriva de cisteína, cisteamina o glutatión.
El agente reductor y las condiciones para las reducciones deben ser favorables para la reducción selectiva de disulfuro mixto y fosfinas, tal como una triarilfosfina y, en particular, la trifenilfosfina-3,3'-disulfonato disódico (TPPDS), se han identificado como agentes reductores útiles. Los inventores han encontrado que el método de la presente invención elimina la necesidad de una elevada concentración del agente reductor, aunque se obtiene un proceso más eficiente, cuando la concentración del agente reductor es al menos igual a la concentración de la proteína (P-S-S-Caperuza).
Puede usarse una fracción halogenada como fracción química activada (Z*). Cuando la fracción química activada, se adiciona a la proteína reducida (etapa f), se encuentra que al menos un (1) equivalente de la fracción química activada (Z*), resulta más favorable con relación a la cantidad de disulfuro mixto.
Como se describió en la presente descripción, el método puede aplicarse para la conjugación de un amplio intervalo de proteínas y fracciones químicas, y proporciona un método eficiente y conveniente para obtener tales conjugados de proteínas.
La invención, puede también resolver problemas adicionales que resultarán evidentes a partir de la descripción de las modalidades ilustrativas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A, muestra la reducción de GH-L101C-S-Glutatión a una concentración de 2,4 g/L con 5 equivalentes de TPPDS a pH 7,4. La reacción fue seguida por HPLC-AIE, y se representa gráficamente el % de área relativa del material de partida, el producto intermedio de reacción y el producto, frente al tiempo de reacción. ▲: GH-L101C-S-Glutatión, X: producto intermedio de reacción, •: GH-L101C-SH.
La Figura 1B, muestra la conjugación de la cadena lateral con el GH-L101C-SH reducido, después de la reducción durante 4 horas como se muestra en la figura 1A. Se adicionan 2,2 equivalentes de cadena lateral directamente a la mezcla de reducción sin diafiltración. El % de área relativa de los materiales de partida y el producto, se representa gráficamente frente al tiempo de reacción. El % de área de la cadena lateral se establece en 100 % al comienzo de la reacción de conjugación. X: Cadena lateral, • : GH-L101C-SH, ▲: GH-L101C-S-Cadena lateral, O: GH-L101C-S-Glutatión, A: producto intermedio de reacción.
La Figura 2, muestra la reducción de GH-L101C-S-Glutatión después de la ultrafiltración a 5 g/L con 10 equivalentes de TPPDS a pH 8,0 y 20 °C. La reacción fue seguida por HPLC-AIE, y se representa gráficamente el % de área relativa del material de partida, el producto intermedio de reacción y el producto frente al tiempo de reacción. A: GH-L101C-S-Glutatión, X: producto intermedio de reacción, O: GH-L101C-SH. La figura representa los datos del experimento 17, de la Tabla 1.
La Figura 3A, muestra la conjugación de la cadena lateral con el GH-L101C-SH reducido, después de la reducción durante 4 horas como se muestra en la figura 2. Se adicionan tres (3) equivalentes de cadena lateral, directamente a la mezcla de reducción sin cualquier diafiltración. El % de área relativa del material de partida y el producto, se representan gráficamente frente al tiempo de reacción. El % de área de la cadena lateral, se establece en 100 % al comienzo de la reacción de conjugación. w: Cadena lateral, • : GH-L101C-SH, ■: GH-L101C-S-cadena lateral.
La Figura 3B, muestra la conjugación de la cadena lateral con el GH-L101C-SH reducido, después de la reducción durante 4 horas, como se muestra en la figura 2. Se adicionan tres (3) equivalentes de cadena lateral a la proteína reducida, después que la mezcla de reducción, se ha diafiltrado en el tampón 1. El % de área relativa del material de partida y el producto, se representan gráficamente frente al tiempo de reacción. El % de área de la cadena lateral, se establece en 100 % al comienzo de la reacción de conjugación. w: Cadena lateral, O: GH-L101C-SH, □: GH-L101C-S-cadena lateral
La Figura 4A, muestra la reducción de GH-L101C-S-Glutatión después de la ultrafiltración a una concentración de 10 g/L con 5 equivalentes de TPPDS a pH 7,4. La reacción fue seguida por HPLC-AIE, y se representa gráficamente el % de área relativa del material de partida, el producto intermedio de reacción y el producto, frente al tiempo de reacción. A: GH-L101C-S-Glutatión, X: producto intermedio de reacción, O: GH-L101C-SH.
La Figura 4B, muestra la conjugación de la cadena lateral con el GH-L101C-SH reducido después de la reducción durante 4 horas, como se muestra en la figura 4A. Se adicionan 2,2 equivalentes de cadena lateral a la proteína reducida, después de que la mezcla de reducción se ha diafiltrado en el tampón 3. El % de área relativa del material de partida y el producto, se representan gráficamente frente al tiempo de reacción. El % de área de la cadena lateral se establece en 100 % al comienzo de la reacción de conjugación. X: Cadena lateral, O: GH-L101C-SH, A: GH-L101C-S-cadena lateral.
La Figura 5, muestra la correlación de la concentración mínima de la proteína durante la reducción como función de la fuerza iónica a tres temperaturas diferentes. Los ejemplos experimentales de la tabla 1, se presentan con los siguientes símbolos: X: T=5 °C, A: T=20 °C y O: T=40 °C.
La Figura 6, muestra la reducción de GH-L101C-S-Glutatión bajo las condiciones de los experimentos 9, 12, 15 y 16, de la tabla 1. La reacción se monitoreó mediante HPLC-AIE y se representa gráficamente el % de área relativa del material de partida frente al tiempo de reacción. La línea sólida es de 5 °C y la línea de puntos es de 40 °C.
La Figura 7, muestra la correlación de la concentración mínima de la proteína durante la conjugación, en función de la fuerza iónica a tres temperaturas diferentes. Los ejemplos experimentales de la tabla 2, se presentan con los siguientes símbolos; X: T=5 °C, A: T=20 °C y O: T=40 °C.
La Figura 8, muestra ejemplos de la reacción de conjugación, donde se monitorea el contenido relativo de la proteína reducida (GH-L101C-SH). La figura 8A, muestra el contenido relativo de proteína reducida durante la conjugación, en las condiciones de los experimentos 5, 6 y 11 de la tabla 2. La figura 8B, muestra el contenido relativo de proteína reducida durante la reacción de conjugación, de los experimentos 14, 15, 18 y 19 de la tabla 2. Las figuras muestran la conversión de GH-L101C-SH reducido (después de la diafiltración) y la adición de la cadena lateral. La reacción se monitoreó mediante HPLC-AIE y se representa gráficamente el % de área relativa del material de partida frente al tiempo de reacción.
SEQ ID NO: 1 - hormona humana del crecimiento AA 1-181
FPTIPLSRLF DNAMLRAHRL HQLAFDTYQE FEEAYIPKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT
PSNREETQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QFLRSVFANS LVYGASDSNV YDLLKDLEEG
IQTLMGRLED GSPRTGQIFK QTYSKFDTNS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV
QCRSVEGSCGF DEFINICIONES
El término "polipéptido" y "péptido" como se usa en la presente descripción, significan un compuesto formado por al menos dos aminoácidos conectados por un enlace amida (o péptido).
El término "aminoácido", incluye el grupo de aminoácidos codificados por el código genético, que se denomina en la presente descripción aminoácido estándar. Que incluye, además, los aminoácidos naturales que no están codificados por el código genético, así como también los aminoácidos sintéticos. Los aminoácidos naturales comúnmente conocidos, incluyen Y-carboxiglutamato, hidroxiprolina, ornitina, sarcosina y fosfoserina. Los aminoácidos sintéticos comúnmente conocidos, comprenden aminoácidos fabricados mediante síntesis química, tal como Aib (ácido alfaaminoisobutírico), Abu (ácido alfa-aminobutírico), Tle (terc-butilglicina), P-alanina, ácido 3-aminometilbenzoico, ácido antranílico.
El término "proteína", como se usa en la presente descripción, significa un compuesto bioquímico que consiste de uno o más polipéptidos.
El término "hormona del crecimiento" se usa para describir las hormonas del crecimiento de tipo silvestre, tales como la hormona humana del crecimiento identificada por SEQ ID NO: 1.
El término "variante de la hormona del crecimiento", como se usa en la presente descripción, significa una proteína de la hormona del crecimiento que tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de la estructura de una hormona del crecimiento natural, por ejemplo, la hormona humana del crecimiento identificada por SEQ ID NO:1, eliminar, adicionar y/o sustituir, al menos un residuo de aminoácido que se encuentra en la hormona de humana del crecimiento natural y/o adicionar al menos un residuo de aminoácido. El término también es usado, para una proteína de la hormona del crecimiento modificada, en donde uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de la hormona del crecimiento han sido sustituidos por otros residuos de aminoácidos, y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos han sido eliminados de la hormona del crecimiento, y/o en donde se han agregado uno o más residuos de aminoácidos, y/o se adicionan en la hormona del crecimiento.
Con el término "compuesto de hormona del crecimiento", como se usa en la presente descripción, se entiende una molécula de hormona del crecimiento retenedora de al menos algunas de las funcionalidades de la hormona del crecimiento humana identificadas por SEQ ID NO: 1, y la estructura general de la misma, que incluye los dos enlaces disulfuro intramoleculares que conectan C53 con C165 y C182 con C189 o residuos de aminoácidos correspondientes en variantes de la hormona del crecimiento. Tales moléculas pueden ser variantes de la hormona del crecimiento, derivados de la hormona del crecimiento o fusiones de la hormona del crecimiento, y derivados y fusiones de variantes de la hormona del crecimiento.
Como se usa en la presente descripción, el término "derivado de la hormona del crecimiento" es, por tanto, una hormona del crecimiento humana o un análogo/variante de la hormona del crecimiento humana, que comprende al menos una modificación covalente unida a uno o más aminoácidos, tal como a una o más cadenas laterales de aminoácidos de la hormona del crecimiento, o variante o análogo de la hormona del crecimiento en donde la modificación(es) está en forma de unión de amidas, carbohidratos, grupos alquilo, ésteres, PEGilaciones.
Tales derivados de la hormona del crecimiento, pueden denominarse "hormona del crecimiento alquilada" que recubre la modificación de la hormona del crecimiento mediante la unión de uno o más fracciones químicas, opcionalmente mediante un enlazador a la proteína de la hormona del crecimiento.
La fracción química, puede describirse como una entidad modificadora de propiedades. La fracción química, puede ser lipofílica, que incluye un ácido graso, y unida a la proteína o análogo de la hormona del crecimiento, opcionalmente mediante un enlazador. La fracción química, que incluye opcionalmente cualquier enlazador, puede describirse como la "cadena lateral". En la presente solicitud, uniendo la fracción química a la cisteína libre, la "cadena lateral" se unirá como extensión del residuo de aminoácido de cisteína.
El término "fusiones de la hormona del crecimiento", como se usa en la presente descripción, refiere una molécula de proteína donde un compuesto de la hormona del crecimiento (tipo silvestre o variante) se expresa como proteína de fusión con un polipéptido de interés y, por lo cual, enlazado por un enlace peptídico tradicional.
El término "fármaco", "terapéutico", "medicamento" o "medicina", cuando se usan en la presente descripción, refiere un ingrediente activo usado en una composición farmacéutica, que puede usarse en terapia.
El término "ultrafiltración", se usa para describir el proceso de filtrar una solución mediante el uso de una membrana o filtro apropiado, donde el proceso generalmente debido a una diferencia de presión, resulta en una reducción del volumen de la solución, con el resultado de que la molécula de interés en la solución está concentrada.
El término "diafiltración", se usa para describir el proceso de filtración de una solución mediante el uso de una membrana o filtro apropiado, donde el proceso implica un cambio en los excipientes de la solución a medida que la solución de partida se intercambia con una nueva solución a medida que se drena la solución del sistema, que se sustituye por la nueva solución. En la mayoría de los sistemas, la solución se considera intercambiada cuando el 5 veces el volumen de la solución de partida, se ha drenado del sistema y el sistema se ha rellenado con la misma cantidad de la nueva solución. Mediante este proceso, la molécula de interés se transfiere de una solución a una nueva solución.
Descripción
La presente invención, refiere un método para preparar un conjugado de proteína en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial El método puede partir de una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína sujeta a conjugación. Este disulfuro se reduce para obtener una proteína con una cisteína libre (P-SH), adecuada para la conjugación. La reacción de conjugación se realiza subsecuentemente por adición de una fracción química activada (Z*) a la proteína reducida, que conduce a la formación de la proteína conjugada (P-S-Z). Como se describió en la presente descripción, las etapas individuales se han optimizado para obtener un proceso eficiente para la preparación de conjugados de proteínas.
La presente solicitud, refiere un método para la preparación de un conjugado de proteína en donde la proteína (P) se une a una fracción química (Z), mediante un átomo de azufre que forma un tioéter. Como se describió en la presente descripción más abajo, la proteína puede ser cualquier proteína de interés, e incluye en particular proteínas terapéuticas tal como la hormona del crecimiento y variantes de la hormona del crecimiento.
En una modalidad, la invención, refiere un método para preparar un conjugado de proteína en donde la fracción química se enlaza a la proteína mediante un residuo de cisteína de la proteína. Por lo cual, el átomo de azufre proporciona el punto de unión para que la fracción química se una a la proteína, de manera que, la proteína y la fracción química se enlazan covalentemente mediante un tioéter.
Se ha encontrado que, las "cisteínas libres" son puntos de unión adecuados para conjugaciones de varios grupos modificadores de propiedades. Una cisteína libre, en la presente descripción, refiere un residuo de cisteína que no está acoplado en un enlace disulfuro ordinario entre dos cisteínas de uno o dos polipéptidos. Normalmente, una cisteína libre, será una cisteína que se ha introducido en una secuencia polipeptídica de interés mediante mutagénesis selectiva del sitio, pero algunas proteínas pueden incluir alternativamente una cisteína en una posición adecuada. Como se describió en los antecedentes, una cisteína adicionada puede ser un punto de unión adecuado para un grupo modificador de propiedades a una proteína. Mediante la introducción de un residuo de cisteína, generalmente se obtiene una cisteína libre, como no hay ningún socio para formar un enlace disulfuro en la proteína.
En una modalidad, la invención refiere un método para preparar un conjugado de proteína, en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, que comprende las etapas de;
a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína,
b) agregar un agente reductor a dicha composición, obteniendo una mezcla de reducción, en donde el agente reductor es una fosfina,
c) permitir que ocurra la reducción,
d) obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH),
e) eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa,
f) añadir una fracción química activada (Z*) a la solución que comprende la proteína reducida para obtener una mezcla de conjugación,
g) permitir que ocurra la reacción de conjugación y
h) obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z),
en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial.
El método permite la reducción selectiva de la cisteína libre, y de esta manera, una conjugación química selectiva de la proteína.
Disulfuro mixto
Los disulfuros (R1-SS-R2), son enlaces covalentes de dos átomos de azufre, que pueden estar presentes en moléculas diferentes (o iguales). En las proteínas, los residuos de cisteína, pueden unirse mediante un enlace disulfuro también llamado cistina.
Para ser un objetivo efectivo de una reacción de conjugación, la cisteína libre debe estar en forma reducida. Una proteína con una cisteína libre, por la misma razón, puede ser difícil de producir y, por lo cual, se obtiene frecuentemente como un disulfuro mixto, que incluye una pequeña fracción orgánica. Los disulfuros mezclados son moléculas que incluyen un disulfuro, similar al enlace disulfuro entre dos residuos de aminoácidos de cisteína, cada uno incluido en una secuencia de polipéptidos (que puede ser igual o no). En la presente descripción, la pequeña fracción orgánica se denomina como caperuza y el disulfuro mixto es, por lo cual, una molécula de proteína-S-S-Caperuza. En la presente solicitud, el término "disulfuros mezclado", se usa para moléculas que comprenden un enlace disulfuro que enlaza dos entidades diferentes, que ambos no son polipéptidos, aunque las moléculas de disulfuro mixto, pueden incluir adicionalmente enlaces disulfuro "normales" adicionales.
En una modalidad, el método de la invención incluye una etapa de reducción de una molécula de proteína-S-S-Caperuza, a medida que la proteína sujeta a conjugación se obtiene en forma de una composición de molécula de proteína-S-S-Cap.
Como se describió anteriormente, la caperuza normalmente se deriva de una pequeña fracción orgánica, que incluye al menos un átomo de azufre que es parte del enlace disulfuro del disulfuro mixto. Tales fracciones orgánicas pueden existir como monómeros en forma reducida, o como dímeros en forma oxidada. En el disulfuro mixto, -S-Caperuza es, por lo cual, la forma oxidada del monómero o medio dímero. En una modalidad, el -S-Caperuza se deriva de cisteína/cistina, cisteamina/cistamina (que es una cistina descarboxilada) o glutatión (G-SH)/ disulfuro de glutatión (GS-SG), y el disulfuro mixto está, por lo cual, en una modalidad seleccionado de Proteína-S-S-cis, Proteína-S-S-cis o Proteína-S-S-G, donde cis, refiere la mitad de una cistina, cist, refiere la mitad de una cistamina y G, refiere la mitad del disulfuro de glutatión. En otras palabras, en una modalidad, la caperuza de proteína-S-S-Caperuza, se deriva de cisteína, cisteamina o glutatión.
Como se describió anteriormente, el objetivo de la reducción es obtener una molécula con una cisteína reducida libre (-SH), que es reactiva en una reacción de conjugación.
En una modalidad, el disulfuro mixto es una molécula de proteína-S-S-Caperuza, en donde la proteína-S se deriva de una proteína, que comprende una cisteína libre.
La invención, refiere un método para preparar un conjugado de proteína en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, que comprende las etapas de;
a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína,
b) adicionar un agente reductor a dicha composición de la proteína, en donde el agente reductor es una fosfina, c) permitir que ocurra la reducción,
d) obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH),
e) eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa,
f) añadir una fracción química activada (Z*) a la solución que comprende la proteína reducida
g) permitir que ocurra la reacción de conjugación y
h) obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z),
en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial.
Cada etapa adicional, se explicará más abajo y se ilustrará en los Ejemplos.
Proteínas de la hormona del crecimiento
Como se describió anteriormente, el objetivo de la reducción, es obtener una molécula de proteína con una cisteína reducida libre (-SH), que es reactiva en una reacción de conjugación.
En una modalidad, el disulfuro mixto es una molécula de proteína-S-S-Caperuza, en donde la proteína-S se deriva de una proteína, que comprende una cisteína libre. En una modalidad adicional, la proteína es una hormona del crecimiento.
La estructura de las proteínas de la hormona del crecimiento se compone de cuatro hélices (hélice 1 -4) conectadas por tres lazos (L1-3), y un segmento C-terminal. En la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO: 1), la hélice 1 se define por el residuo AA 6-35, la hélice 2 se define por los residuos AA 71-98, la hélice 3 se define por el residuo AA 107-127 y la hélice cuatro, se define como residuos AA 155-184.
Como la hormona del crecimiento humana de tipo silvestre no incluye cisteínas libres, la presente invención refiere principalmente variantes de la hormona del crecimiento, que incluyen una cisteína adicional que proporciona una cisteína libre. El método puede aplicarse en el proceso de preparación de conjugados o derivados de la hormona del crecimiento, mediante el uso de tal cisteína libre. Tales derivados pueden obtenerse mediante la alquilación de un grupo tiol libre, introducido mediante sustituciones de un solo aminoácido en la secuencia de la hormona del crecimiento.
En una modalidad, la hormona del crecimiento puede ser una fusión de la hormona del crecimiento, por ejemplo, una molécula de proteína que incluye una secuencia de la hormona del crecimiento enlazada a una segunda secuencia de proteína por medio de un enlace peptídico. Las fusiones se obtienen normalmente, mediante la expresión de la proteína de fusión mediante el uso de un vector de expresión recombinante que enlaza una secuencia de ADN que codifica tal secuencia de la hormona del crecimiento, con una secuencia de ADN que codifica tal segunda proteína, que incluye opcionalmente una secuencia enlazadora. Las fusiones de hormona del crecimiento, incluyen fusiones, que comprenden una región o regiones Fc de anticuerpos y/o una proteína de albúmina.
El término "compuesto de hormona del crecimiento", como se usa en la presente descripción, refiere colectivamente una molécula de la hormona del crecimiento, que retiene sustancialmente las características funcionales de la hormona del crecimiento humana madura identificada por SEQ ID NO: 1. Por lo cual, el compuesto puede ser una hormona del crecimiento, una proteína de fusión de la hormona del crecimiento, una variante o análogo de la hormona del crecimiento o un derivado de la hormona del crecimiento, que incluye también la hormona del crecimiento acilada o alquilada.
En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento de acuerdo con la invención, comprende menos de 8 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana.
En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento comprende menos de 7 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana. En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento comprende menos de 6 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana.
En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento comprende menos de 5 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana. En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento comprende menos de 4 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana. En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento comprende menos de 3 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana. En una modalidad, un análogo de la hormona del crecimiento comprende menos de 2 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) con relación a la hormona del crecimiento humana.
En una serie de modalidades, el análogo de la hormona del crecimiento de la hormona de crecimiento es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a la hormona del crecimiento humana identificada por SEQ ID NO: 1.
El compuesto de la hormona del crecimiento, tiene preferentemente una vida media plasmática aumentada (T1/2), en comparación con la hormona del crecimiento humana de tipo silvestre. Esto se puede lograr por diversos medios conocidos por un experto en la técnica, tales como sustituciones de aminoácidos que estabilizan la proteína frente a la degradación. También puede obtenerse un tiempo de circulación aumentado de un compuesto de la hormona del crecimiento mediante enlace covalente o no covalente a proteínas séricas. La albúmina sérica puede usarse por conjugación directa (que incluye opcionalmente un enlazador) o por fusión de proteínas con una hormona del crecimiento o su variante. Alternativamente, también puede considerarse el enlace químico a la albúmina, así como también, la fusión o enlace con las regiones Fc del anticuerpo. La unión no covalente a la albúmina, puede obtenerse al usar aglutinantes de albúmina, tal como grupos alquilo unidos covalentemente a una hormona del crecimiento o sus variantes.
En una modalidad, la hormona del crecimiento es una variante que se estabiliza frente a la degradación proteolítica (mediante mutaciones específicas), y tales variantes pueden además alquilarse, en uno o más aminoácidos de la proteína de la hormona del crecimiento.
En el documento WO 2011/089250, pueden encontrarse ejemplos no limitantes de proteínas de la hormona del crecimiento que se estabilizan frente a la degradación proteolítica (mediante mutaciones específicas).
Las variantes de la proteína de la hormona del crecimiento estabilizada por proteasa, incluyen variantes donde se introduce un puente disulfuro adicional. El puente de disulfuro adicional, conecta preferentemente L3 con la hélice 2. Este puede obtenerse introduciendo dos residuos de aminoácidos de cisteína adicionales, que en modalidades preferidas sustituyen al residuo de aminoácido de tipo silvestre en las posiciones correspondientes a AA84 o AA85 en H2 y AA143 o AA144 en L3 de SEQ ID NO 1. La variante de la hormona del crecimiento puede por lo cual, de acuerdo con la invención, comprender preferentemente un par de mutaciones correspondientes a L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C o F92C/T148C en la SEQ ID NO 1. En una modalidad adicional, la variante de la hormona del crecimiento comprende un par de mutaciones correspondientes a L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C o F92C/T148C en SEQ ID NO 1.
En una modalidad, la hormona del crecimiento es una variante de la hormona del crecimiento, adecuada para la modificación específica de sitio/monosustitución, tal como la alquilación de una fracción química a una cisteína libre introducida por mutación, posiblemente en adición de cualquier mutación estabilizadora de proteasa descrita anteriormente. En el documento WO2011 / 089255, puede encontrarse una lista no limitante de variantes de la hormona del crecimiento adecuadas para la alquilación.
En una modalidad adicional, la proteína es una variante de la hormona del crecimiento, que incluye una cisteína libre. En una modalidad adicional, la proteína es una variante de la hormona del crecimiento, que incluye una cisteína libre introducida en la hormona del crecimiento humana identificada por SEQ ID NO: 1. En una modalidad adicional, la proteína es una variante de la hormona del crecimiento, que incluye una mutación de cisteína seleccionada del grupo de: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C y G190C. En una modalidad adicional, la proteína es una variante de la hormona del crecimiento, que incluye una mutación de cisteína seleccionada del grupo de: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C y G126C.
En modalidades adicionales, la mutación de cys libre se localiza dentro de AA 93-106 en hGH, o en los residuos correspondientes en las variantes de hGH. En modalidades adicionales específicas, la mutación de cys libre se localiza dentro de L2, tal como dentro de AA 99-106 o AA 99-103 o en los residuos correspondientes.
En una modalidad adicional, la mutación de cys libre se selecciona del grupo de: E30C, Y42C, S55C, S57C, S62C, Q69C, S95C, A98C, N99C, L101C, V102C y S108C.
En una modalidad adicional, la mutación de cys única es E30C. En una modalidad adicional, la mutación de cys única es Y42C. En una modalidad adicional, la mutación de cys única es S55C. En una modalidad adicional, la mutación de cys única es S57C. En una modalidad adicional, la mutación de cys única es S62C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es Q69C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es S95C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es A98C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es N99C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es S100C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es L101C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es V102C. En una modalidad adicional, la mutación de cys libre es S108C.
En una modalidad adicional, la proteína es una variante de la hormona del crecimiento, que incluye una mutación de cisteína se selecciona de Y42C y L101C.
Agente reductor
Para obtener una proteína con un átomo de azufre reactivo, se adiciona un agente reductor a la composición de disulfuro mixto y la mezcla se incuba para permitir que se produzca la reducción para obtener una proteína con un átomo de azufre reactivo, por ejemplo, una proteína reducida del formato: proteína-S-H. Las etapas descritas son a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína, b) añadir un agente reductor a dicha composición de la proteína, c) permitir que ocurra la reducción y obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH).
En una modalidad, el agente reductor es una fosfina, tal como una fosfina aromática, tal como una triarilfosfina, tal como una triarilfosfina sustituida, tal como trifenilfosfina -3,3',3''-trisulfonato trisódico (TPPTS) o una trifenilfosfina -3,3'-disulfonato disódico. (TPPDS).
Una vez que se ha reducido el disulfuro mixto, se ha obtenido una solución, que comprende una proteína reducida (P-SH). Antes de la subsecuente conjugación, puede ser beneficioso eliminar el agente reductor y/o la molécula caperuza liberable. En una modalidad, puede incluirse una etapa opcional de eliminar moléculas pequeñas, tal como moléculas con un peso molecular por debajo de 10 kDa de la solución, que comprende la proteína reducida (P-SH). En una modalidad, las moléculas con un peso molecular por debajo de 10 kDa, se eliminan de la solución que comprende la proteína reducida mediante diafiltración.
Fracción química (Z)
En una reacción de conjugación, una fracción química se enlaza covalentemente al átomo de azufre de la cisteína libre de la proteína reducida (proteína SH).
La fracción química puede ser cualquier fracción adecuada para la conjugación con una proteína, tal como una fracción modificadora de propiedades. La fracción modificadora de propiedades, puede ser una fracción química capaz de alterar una o más características de la proteína de interés. En una modalidad, la fracción química es un grupo modificador de propiedades, tal como una fracción química capaz de estabilizar la proteína, aumentar la vida media circulatoria o aumentar la potencia. En una modalidad, la fracción química es un agente de prolongación. En una modalidad, la fracción química (Z) es un aglutinante de albúmina (AB). Para que la conjugación ocurra efectivamente, la fracción química puede usarse en una forma activada (Z*). En el método, de acuerdo con la invención como se describió anteriormente en la presente descripción, se adiciona una fracción química activada (Z*) a la solución, que comprende la proteína reducida, y la conjugación de la fracción química de la proteína reducida, resulta en la preparación de una proteína conjugada (P-S-Z). Por lo cual, el método de acuerdo con la invención incluye las etapas adicionales de: añadir una fracción química activada (Z*) a la solución, que comprende la proteína reducida, permitir que ocurra la reacción de conjugación y obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z).
En resumen, de la descripción anterior, la presente invención, refiere un método para preparar un conjugado de proteína en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, que comprende las etapas de;
a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína,
b) adicionar un agente reductor a dicha composición de la proteína, en donde el agente reductor es una fosfina,
c) permitir que ocurra la reducción,
d) obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH),
e) eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa,
f) añadir una fracción química activada (Z*) a la solución que comprende la proteína reducida
g) permitir que ocurra una reacción de conjugación, tal como una conjugación química selectiva, y
h) obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z)
en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial.
La fracción química puede ser cualquier fracción adecuada para la conjugación con una proteína, tal como una fracción modificadora de propiedades. La fracción modificadora de propiedades, puede ser una fracción química capaz de alterar una o más características de la proteína de interés. En una modalidad, la fracción química es un grupo modificador de propiedades, tal como una fracción química capaz de estabilizar la proteína, aumentar la vida media circulatoria o aumentar la potencia. En una modalidad, la fracción química es un aglutinante de albúmina. Para que la conjugación ocurra efectivamente, la fracción química, puede usarse en una forma activada. En el método de acuerdo con la invención como se describió anteriormente en la presente descripción, se combina una fracción química activada con la proteína reducida, y la conjugación de la fracción química con la proteína reducida, resulta en la preparación de una proteína conjugada mediante un átomo de azufre.
La fracción química, es preferentemente una fracción química activada, lo que significa una fracción que es capaz de reaccionar con la proteína SH formando una molécula de proteína-S-fracción química. Tales fracciones químicas, activadas, pueden incluir reactivos de alquilación electrofílica suave, que incluyen grupos maleimida o haloacetilo, que son conocidos en la técnica.
En una modalidad, la fracción química activada (Z*), es una fracción química halogenada (Z-halo), tal como un grupo modificador de propiedades halogenado, tal como un agente de prolongación halogenado. La fracción química halogenada (Z-halo), puede incluir Br, I o Cl. Si se prefiere, puede realizarse una reacción de activación específica antes de la conjugación y antes de adicionar la fracción química a la proteína reducida.
En una modalidad, la fracción química activada (Z*) es un aglutinante de albúmina halogenada (AB-halo). En una modalidad, la fracción química (Z*), es un aglutinante de albúmina halogenada, que incluye Br, I o Cl, tal como se describió en el documento WO2011/089255. En una modalidad, la fracción química activada es una yodoacetamida, tal como una yodoacetamida de una cadena lateral de aglutinante de albúmina.
En una modalidad, la fracción química activada (Z*) es una fracción química sustituida con maleimida (Z-maleimida), tal como un grupo modificador de propiedades sustituido con maleimida, tal como un agente de prolongación sustituido con maleimida. En una modalidad, la fracción química activada (Z*) es un aglutinante de albúmina sustituida con maleimida, tal como se describió en el documento WO2011/089255).
Las reacciones de reducción y conjugación descritas en los Ejemplos 2 y 3, incluyen la reacción de la hormona del crecimiento reducida L101C, con una cadena lateral del aglutinante de albúmina halogenada, en donde el halógeno es yodo.
En una modalidad, la cadena lateral de unión a la albúmina puede ser seleccionada de:
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En el documento WO2011/089255, se describen cadenas laterales de unión a la albúmina adicionales. En una modalidad, la cadena lateral de albúmina activada es una versión yoduro de la anterior. Tales fracciones yoduro, pueden obtenerse disolviendo una fracción química halogenada (Br o Cl) en una solución de KI (yoduro de potasio), que proporciona una yodoacetamida.
Los ejemplos de fracciones químicas adicionales, incluyen moléculas de PEG, albúmina sérica, aglutinantes de albúmina, FC, dominios, la proteína de unión a la hormona del crecimiento, polímeros AA (tecnología XTEN, Amunix y PASylation®, proteína XL) y grupos carbohidratos tal como heparosano e hidroxietilalmidón.
Como se describió en la presente descripción más abajo, la efectividad de la etapa de conjugación, puede depender de la relación de proteína reducida (P-SH) y una fracción química activada (Z*).
Composición del disulfuro mixto
La composición del disulfuro mixto, que comprende la proteína que se va a conjugar en una cisteína libre se obtiene preferentemente como una composición purificada, que comprende solo cantidades menores de otras proteínas o impurezas, y se afirma que el experto en la técnica, conocerá los métodos para producir y purificar las proteínas con una cisteína libre, como parte de un disulfuro mixto.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto tiene una concentración de la proteína de 5-4000 pM, 25 -1000 pM, 50-850 pM, 100-600 pM, 250-600 pM o 250-500 pM. En modalidades adicionales, se prefiere que la concentración de la proteína es superior a 100 pM, tal como 150 pM, 250 pM, 350 pM o incluso tal como superior a 400 pM.
En una modalidad donde el disulfuro mixto es una hormona del crecimiento o una variante de la hormona del crecimiento, la concentración es preferentemente 0,1-100 g/L, 0,5-25 g/L, 1-20 g/L, 2-15 g/L, 5-15 g/L o tal como 5-12 g/L. En una modalidad, la composición de hGH tiene una concentración de al menos 2,5 g/L, o tal como al menos 4,0 g/L, o tal como al menos 8,0 g/L o tal como al menos 10 g/L. También se observa que la concentración puede ajustarse incluyendo una etapa adicional, de manera que una preparación del disulfuro mixto se diluye o se concentra para alcanzar una concentración preferida de la proteína. En una modalidad, el método incluye una etapa de ultrafiltración de una preparación de disulfuro mixto, que produce la composición de la composición del disulfuro mixto.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto tiene un pH que es adecuado para la reducción de la proteína y/o subsecuentemente para que la proteína reducida se conjugue, tal como un pH de 4-10, tal como 5-9 o 6-8. En una modalidad adicional, el pH puede ser de 7,0-8,0, o de 7,2-7,8 o de 7,3-7,6, tal como alrededor de 7,4-7,5.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto tiene una conductividad de alrededor de 5-50 mS/cm a 22 °C, o tal como 5-25 mS/cm a 22 °C o una conductividad alrededor de 10 mS/cm a 22 °C.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende un tampón.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en: BES, HEPES, MES, fosfato, citrato, bis-tris y trietanolamina.
En una modalidad, la composición disulfuro mixto, comprende 5-50 mmol/kg de trietanolamina, tal como 10-25 mmol/kg de trietanolamina o tal como alrededor de 20 mmol/kg de trietanolamina.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende una sal.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en: sales de sodio, amonio, guanidinio y potasio.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en: sales de sulfato, acetato y halogenuro.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en: sulfato de sodio, acetato de sodio, acetato de amonio, clorhidrato de guanidinio, KI, y NaCl.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende NaCl.
En una modalidad, la composición de disulfuro mixto, comprende 25-500 mmol/kg de NaCl, tal como 50-250 mmol/kg, tal como 75-100 mmol/kg de NaCl o tal como alrededor de 80 mmol/kg de NaCl.
Etapas del método
En la descripción general anterior, los componentes usados en el método, se describen con cierta variabilidad. Los puntos adicionales de variabilidad dentro del alcance de la invención son la duración de la etapa del proceso, el uso de diferentes concentraciones de cada componente y los excipientes de las soluciones, en las que se proporcionan los componentes y los excipientes de las soluciones en las que se realiza cada paso del método.
Aunque un experto sabrá que puede ser posible una variación adicional, la siguiente descripción, describe modalidades adicionales, que los inventores han encontrado particularmente favorables. Los detalles para ilustrar los procesos, pueden encontrarse en los ejemplos.
Adicionar el agente reductor
Para tener una reducción efectiva del disulfuro mixto, se aplica habitualmente un exceso del agente reductor en concentraciones molares. Mediante la adición del agente reductor a la composición del disulfuro mixto, se obtiene una mezcla de reducción. La cantidad de agente reductor, puede expresarse en equivalentes de la cantidad de disulfuro mixto (o P-S-S-Caperuza), de manera que en el caso donde la cantidad de agente reductor sea 1 equivalente de la cantidad de disulfuro mixto, las concentraciones molares del disulfuro mixto y el agente reductor en la mezcla son iguales.
En una modalidad, la cantidad del agente reductor que se adiciona en la etapa b) es al menos 2 equivalentes de la cantidad de disulfuro mixto (o P-S-S-Caperuza), tal como 3-20 equivalentes, tal como 4-15 equivalentes o tal como 5­ 10 equivalentes. En una modalidad, se adicionan 2-12 equivalentes de agente reductor. En una modalidad, se adicionan 2-10 equivalentes de agente reductor. En una modalidad, se adicionan 3-7 o 4-6 equivalentes de agente reductor.
Como el agente reductor puede ser un recurso costoso, es ventajoso reducir la cantidad requerida, que, como se describió en la presente descripción, es posible si se optimizan las etapas del proceso. Una reacción de reducción efectiva mediante el uso de cantidades inferiores del agente reductor, requiere que las restantes condiciones de reacción se seleccionen cuidadosamente como se proporciona en la presente invención.
En una modalidad, la cantidad de agente reductor es a lo máximo 10 equivalentes, tal como a lo máximo 8, tal a lo máximo 5 equivalentes del disulfuro mixto, tal como a lo máximo 4, tal como a lo máximo 3, tal como a lo máximo 2,5, tal como a lo máximo 2, tal como a lo máximo 1,5 equivalentes del disulfuro mixto a reducir.
En una modalidad, la cantidad de agente reductor es como 1-8, tal como 2-6 equivalentes del disulfuro mixto a reducir.
La reducción del disulfuro mixto puede, en dependencia de las condiciones, tomar minutos u horas. El experto sabrá que diferentes condiciones resultarán en una eficacia diferente y, por lo cual, el tiempo y las condiciones necesarias para obtener una reducción completa o casi completa del disulfuro mixto, se describen en más detalles en la presente descripción más abajo.
El agente reductor puede adicionarse como concentrado o simplemente adicionar el agente como un polvo sólido a la composición de disulfuro mixto. El agente reductor se mezcla con la composición de disulfuro mixto para iniciar la reducción. La mezcla, puede denominarse mezcla de reducción.
Para tener un proceso suficientemente efectivo, la reducción debe resultar en al menos 80 % de reducción, tal como una reducción de al menos 90 % de la cantidad total del disulfuro mixto. En tales casos, la reducción se considera satisfactoria cuando la cantidad del disulfuro mixto es a lo máximo 20 %, tal como a lo máximo 10 % de la cantidad del disulfuro mixto en la mezcla de reducción. En modalidades preferidas, puede obtenerse una reducción de alrededor del 95 % de disulfuro mixto, dejando alrededor del 5 % de disulfuro mixto no reducido en la solución que comprende la proteína reducida. En una modalidad adicional, un proceso eficiente deja a lo máximo 2 % de disulfuro mixto dentro de un tiempo adecuado.
La reducción puede ocurrir durante un período de al menos 15 minutos, tal como al menos 30 minutos o tal como al menos 1 hora. En una modalidad, la mezcla de reducción se deja durante 2-10 horas, tal como 3-6 horas o alrededor de 3-4 horas, después de la adición del agente reductor.
En una modalidad, la reducción se realiza para un máximo de 24 horas, tal como para un máximo de 12 horas, tal como para un máximo de 8 horas, tal como para un máximo de 6 horas, tal como para un máximo de 4 horas.
La reducción puede tomar lugar, en una modalidad, a 1-50 °C, tal como a temperatura ambiente, tal como a 18-25 °C. En modalidades alternativas, la reducción puede realizarse a una temperatura más fría, tal como por debajo de 10°C, tal como alrededor de 4-6 °C.
En dependencia de las condiciones aplicadas, puede resultar ventajoso incluir sal en la mezcla de reducción. La sal puede ser cualquier sal o una combinación de sales, tales como las sales descritas en relación con la composición de disulfuro mixto.
Los inventores de la presente invención, han proporcionado una serie de condiciones que permiten la reducción eficiente de la mezcla-disulfuro y se usa esta información para describir la concentración del disulfuro mixto, que se usa en dependencia de la temperatura y la sal (fuerza iónica de la mezcla de reducción.
La cantidad de sal en una solución, puede describirse mediante la fuerza iónica (I). Este valor se calcula a partir de las concentraciones y cargas de todos los iones presentes en esa solución. Por simplicidad, cualquier carga de la proteína, y el agente reductor no se incluye en los cálculos de acuerdo con la presente invención, mientras que el tampón y los componentes de sal, sí. Como se ve en los ejemplos en la presente descripción, el aumento de la fuerza iónica (principalmente aumentando la concentración de sal) permite una reacción eficiente bajo condiciones menos favorables (temperatura baja o concentración baja de los reactivos).
Como se describió en el Ejemplo 5, las condiciones para la reacción de reducción pueden describirse mediante el uso de una correlación entre la concentración de proteína más baja adecuada, y la temperatura y la fuerza iónica, mediante el uso de un máximo de diez equivalentes de agente reductor en la mezcla de reducción. La concentración mínima de la proteína que permite una reducción eficiente está definida por la ecuación:
Cmín = a*I-a1exp(-b*T), en donde T es la temperatura en grados Celsius,
I es la fuerza iónica en M (mol/L), Cmín es M (mol/L) y las constantes son a = 0,137 * 10-3M1425, a1 = 0,425 y b = 0,070 °C-1.
El límite superior para la concentración del disulfuro mixto, puede ser de naturaleza práctica, como muchas proteínas no son solubles a concentraciones muy elevadas. Se contempla que para la mayoría de las proteínas, la reacción de reducción trabajará a concentraciones hasta 100 g/L.
El límite superior para la fuerza iónica de la mezcla de reducción, también puede ser de naturaleza práctica, como muchas sales, no son solubles en concentraciones muy elevadas. Se contempla que para la mayoría de las sales, la reacción de reducción trabajará a concentraciones hasta 5 M.
El límite superior para la temperatura de la mezcla de reducción, puede ser de naturaleza práctica, como muchas proteínas no son estables a temperaturas muy elevadas. Se contempla que para la mayoría de las proteínas la reacción de reducción, trabajará a concentraciones hasta 50°C.
Siguiendo esta guía, puede obtenerse una reacción de reducción efectiva mediante el uso de a lo máximo 10 equivalentes del agente reductor. También será claro para el experto en la materia, que puede ser necesario un ajuste para proteínas individuales y reacciones en dependencia de su estabilidad.
En algunas modalidades, la concentración del disulfuro mixto en la mezcla de reducción, es similar a la concentración de la proteína de la composición de disulfuro mixto, como el agente reductor simplemente se adiciona a la composición en forma concentrada. En una modalidad, la concentración del disulfuro mixto, puede ser tal como 5-4000 pM, 25­ 1000 pM, 50-850 pM, 100-600 pM, 250-600 pM o 250-500 pM. En modalidades adicionales, se prefiere que la concentración del disulfuro mixto sea superior a 100 pM, tal como 150 pM, 250 pM, 350 pM o incluso tal como superior 400 pM. En una modalidad donde el disulfuro mixto es una hormona del crecimiento o una variante de la hormona del crecimiento, la concentración es preferentemente 0,1-100 g/L, 0,5-25 g/L, 1-20 g/L, 2-15 g/L, 5-15 g/L o tal como 5-12 g / L. En una modalidad, la concentración de GH es al menos 2,5 g/L, o tal como al menos 4,0 g/L, o tal como al menos 8,0 g/L o tal como al menos 10 g/L.
Etapa intermedia
Antes de continuar con la etapa de conjugación, la proteína reducida (P-SH) puede separarse de la mezcla de reducción, tal como del exceso de agente reductor y/o la pequeña molécula orgánica del disulfuro mixto, por ejemplo, el H-S-Caperuza de la proteína con una cisteína libre bloqueada (P-S-S-Caperuza). Esta etapa opcional, puede ser una etapa de eliminación de moléculas con un peso molecular bajo, tal como moléculas con un peso molecular por debajo de 10 kDa.
El experto, conocerá varios métodos para eliminar compuestos de pequeño peso molecular, tal como por filtración mediante el uso de una membrana adecuada. En una modalidad, el método comprende una etapa de diafiltración mediante el uso de una membrana/filtro con un punto de corte de 5 kDa, 10 kDa o 30 kDa.
El punto de corte puede elegirse por un experto en dependencia de la especificidad de tamaño requerida; sabiendo que un punto de corte cercano al peso molecular del producto, aumenta el riesgo de perder el producto. Una regla general es tener un punto de corte 1/3-1/6 del peso molecular del producto de interés.
Una opción adicional antes de continuar con la etapa de conjugación es cambiar la solución de la proteína reducida (P-SH), por ejemplo, cambiar el solvente, es decir, los excipientes individuales o las concentraciones de los excipientes del solvente. En una modalidad, el método comprende una etapa de cambio de solvente de la solución de la etapa d) antes de la etapa f).
Una forma conveniente de cambiar el solvente, es la diafiltración. En una modalidad, se incluye una etapa de diafiltración para eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa y/o para cambiar el solvente de la solución, que comprende la proteína reducida (P-SH).
La eficacia de una etapa de diafiltración, por ejemplo, la cantidad de moléculas pequeñas y excipientes que se eliminan, está relacionada con el volumen de filtrado generado, con relación al volumen de retenido. También se observa que la palabra "eliminar", en este contexto debe leerse como "reducir la concentración de", como las cantidades residuales de moléculas y excipientes de bajo peso molecular, generalmente estarán presentes después de una etapa de diafiltración (o una etapa alternativa del proceso) "eliminar” moléculas de bajo peso molecular.
El volumen total de la composición, cuando se inicia la diafiltración se usa como referencia para evaluar el volumen necesario. La diafiltración se realiza habitualmente a volumen constante, de modo que el volumen del filtrado generado sea igual al volumen del nuevo solvente que se introduce en el sistema. Para que la diafiltración sea efectiva, debe usarse preferentemente más de un (1) volumen de nuevo solvente.
En una modalidad, se aplican al menos 2 volúmenes de solvente para la diafiltración, alternativamente se aplican al menos 3, tal como al menos 4 o al menos 5 volúmenes de solvente para la diafiltración.
En una modalidad, el método de acuerdo con la invención, comprende una etapa de cambio de solvente de la solución, que comprende la proteína reducida antes de iniciar la reacción de conjugación.
En una modalidad, el método de acuerdo con la invención, comprende una etapa de cambio de solvente de la solución de la etapa d) antes de la etapa f). En una modalidad adicional, el solvente se cambia por diafiltración.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, tiene o se cambia a una solución con un pH adecuado para la proteína, la proteína reducida obtenida y el conjugado de proteína a preparar, tal como un pH de 4-10, tal como 5-9 o 6-8. En una modalidad adicional, el pH puede ser de 7,0-8,0, o de 7,2-7,8 o de 7,3-7,6, tal como alrededor de 7,4-7,5.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, tiene o se cambia a una solución que tiene una conductividad de alrededor de 1-150 mS/cm a 22°C, o tal como 5-50 mS/cm a 22 °C, o tal como 5-25 mS/cm a 22 °C o una conductividad alrededor de 10 mS/cm a 22 °C.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, que comprende o se cambia por una solución que comprende un tampón. En una modalidad, el tampón se selecciona de: BES, HEPES, MES, fosfato, citrato, bis-tris y trietanolamina.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución que comprende 5-50 mmol/kg de trietanolamina, tal como 10-25 mmol/kg de trietanolamina o tal como alrededor de 20 mmol/kg de trietanolamina.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución que comprende una sal, tal como cualquiera de las sales descritas en relación con la composición de disulfuro mixto.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución, que comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en: sulfato de sodio, acetato de sodio, acetato de amonio, clorhidrato de guanidinio, KI y NaCl.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución que comprende NaCl.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución sin sal. En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución sin NaCl.
En una modalidad, la solución de la proteína reducida, comprende o se cambia a una solución que comprende 10­ 2000 mmol/kg de NaCl, tal como 50-500 mmol/kg de NaCl, tal como 75-100 mmol/kg de NaCl o tal como alrededor de 80 mmol/kg de NaCl.
La etapa de conjugación
Como se describió anteriormente, la conjugación se realiza de acuerdo con el método por adición de una fracción química activada (Z*) a la solución que comprende la proteína reducida.
Si la reducción anterior no es completa la relación de proteína reducida a disulfuro mixto (P-SH/P-S-S-Caperuza) puede prevenir una reacción de conjugación de elevado rendimiento. Además, la presencia de un exceso de agente reductor y moléculas Caperuza liberadas, pueden interferir con la reacción de conjugación.
De nuevo, la relación relativa de los reactivos, por ejemplo, la proteína reducida y la fracción química activada, influye en la efectividad de la reacción.
En una modalidad, la concentración molar de la fracción química activada es al menos igual o tal vez dos veces la concentración molar de la proteína que se va a conjugar. Esto también puede expresarse en equivalentes, por ejemplo, al menos 10, tal como 8, tal como 6, tal como 4, tal como 2 o tal como al menos uno (1) equivalente (s) de la fracción química activada (Z*) puede usarse con relación a la proteína que se va a conjugar. Como la fracción química activada (Z*) puede ser un recurso costoso, es ventajoso reducir la cantidad requerida, que, como se describió en la presente descripción, es posible si se optimizan las etapas anteriores. Una reacción de conjugación efectiva mediante el uso de cantidades reducidas de la fracción química activada (Z*), requiere que las condiciones de reacción restantes se seleccionen cuidadosamente como se proporciona en la presente invención. En una modalidad, la cantidad de la fracción química activada (Z*) es a lo máximo 8 equivalentes de la proteína, tal como a lo máximo 6, tal como a lo máximo 4, tal como a lo máximo 3, tal como a lo máximo 2,5, tal como a lo máximo 2, tal como a lo máximo 1,5 equivalentes de la proteína a conjugar.
Como se describió en relación con la mezcla de reducción, la solución de la conjugación puede denominarse mezcla de conjugación. Con referencia a las etapas del método a) -h) descritas anteriormente, la adición de la fracción química activada (Z*) en la etapa f) conduce a la formación de una mezcla de conjugación. Además, está claro que los componentes de la mezcla de conjugación, pueden ajustarse para optimizar las condiciones de conjugación.
La conjugación de la proteína reducida con la fracción química puede, en dependencia de las condiciones, tomar minutos u horas. El experto, sabrá que diferentes condiciones, resultarán en una eficacia diferente y, por lo cual, el tiempo necesario para obtener una conjugación completa o casi completa, variará en base a las condiciones, como se describirá con más detalle en la presente descripción más abajo. De acuerdo con el presente método, la reacción de conjugación se considera satisfactoria cuando la cantidad del material de partida, por ejemplo, la proteína reducida, alcanza 10 %, tal como 5 % o preferentemente 2 % o menos.
Como se describió en el Ejemplo 6, las condiciones para la reacción de conjugación pueden describirse mediante el uso de una correlación entre la concentración más baja adecuada de la proteína en dependencia de la temperatura, la fuerza iónica y la cantidad relativa de la fracción química activada (Z*) que se usa en la mezcla de conjugación. La concentración mínima de la proteína (Cmín en M (mol/L) ) que permite una conjugación eficiente, por lo cual, se define por Cmín = a*exp(-b1*T-b2*I)+d*exp(-d1*T), en donde T es la temperatura en grados Celsius, I es la fuerza iónica en M (mol/L), a = 6,96*10-4 M, b1 = 0,0396 °C-1, b2 = 10,9 M-1, d = 6,12*10-5 M y d1 = 0,0289 °C-1.
Como se describió anteriormente en relación con la reducción, el límite superior para la proteína, la fuerza iónica y la temperatura, pueden ser de naturaleza práctica. Se contempla que, para la mayoría de las proteínas la reacción de conjugación trabajará a concentraciones de hasta 100 g/L. Igualmente, se contempla que para la mayoría de las sales la reacción de conjugación trabajará a concentraciones de hasta 5 M. Se contempla además, que para la mayoría de las proteínas la reacción de conjugación trabajará a concentraciones de hasta 50°C. Siguiendo esta guía, puede obtenerse una reacción de conjugación efectiva, mediante el uso a lo máximo 4 equivalentes de la fracción química activada (Z*).
La fracción química activada puede adicionarse como concentrado o simplemente adicionar el agente como un polvo sólido a la solución que comprende la proteína reducida. En una modalidad, la fracción química activada se disuelve en una solución adecuada antes de adicionar la fracción química activada a la solución que comprende la proteína reducida. También puede ser que la fracción química, se active en una solución antes de la reacción de conjugación.
De acuerdo con la invención, la mezcla de conjugación preferida, tiene un pH de 5-10, tal como 7,0-9,0 o 7,0-8,5.
En una modalidad, la concentración de la proteína reducida en la mezcla de conjugación es de al menos 50 pM. En otras modalidades, se prefiere que la concentración de proteína reducida en la mezcla de conjugación, sea superior a 100 pM, tal como 150 pM, 250 pM, 350 pM o incluso tal como superior a 400 pM.
En una modalidad para la conjugación de la hormona del crecimiento humana, la concentración es de al menos 1 g/L. En modalidades preferidas, la concentración de hormona del crecimiento humana es incluso mayor, tal como al menos 2,0 g/L, tal como al menos 3,0 g/L, tal como al menos 5 g/L, o al menos 7,5 g/L o al menos 10 g/L.
De acuerdo con la presente invención, la eficiencia de la conjugación puede mejorarse por incluir sal en la mezcla de conjugación. Esto es particularmente útil en el intervalo de concentración de proteína más bajo, por ejemplo, cuando la concentración de la proteína reducida es 50 mM-150 mM, o para la hormona del crecimiento humana cuando la concentración de proteína es 1-3 g/L en la mezcla de conjugación. Por supuesto, también es posible incluir sal, cuando se aplica una concentración de la proteína más alta.
La sal puede incluirse en cualquiera de las soluciones usadas en la mezcla de conjugación o adicionarse por separado para optimizar las condiciones de reacción. Las sales están formadas por un catión y un anión, que proporcionan una carga positiva y negativa igual. Las sales pueden describirse como neutras, básicas o ácidas, en base a los iones obtenidos cuando se hidrolizan en agua. Las sales pueden ser cualquier sal, tal como cualquiera de las sales descritas en relación con la composición de disulfuro mixto. Las sales pueden ser inorgánicas u orgánicas, tales como sales de sodio, amonio, guanidinio y potasio, o tales como sales de sulfato, acetato y halogenuro, o tales como sulfato de sodio, acetato de sodio, acetato de amonio, clorhidrato de guanidinio, KI y NaCl.
La cantidad de sal en una solución, puede describirse mediante la fuerza iónica (I). Este valor se calcula a partir de las concentraciones y la carga de todos los iones presentes en esa solución. Por simplicidad, cualquier carga de la proteína y la fracción química activada (Z*), no se incluye en los cálculos de acuerdo con la presente invención, mientras que los componentes tampón y sal, sí. Como se ve en los ejemplos en la presente descripción, la concentración de trietanolamina (tampón) y NaCl (u otras sales) se incluyen cuando se calcula I.
En una modalidad, la fuerza iónica (I) de la mezcla de conjugación es superior a 0,1 M, tal como superior a 0,2 M, tal como superior a 0,3 M, tal como superior a 0,4 M, tal como superior a 0,5 M. Como se mencionó anteriormente, puede ser particularmente útil en casos, cuando la concentración de la proteína reducida en la mezcla de conjugación sea baja, tal como 50-250 pM o tal como 1-5 g/L o 0,5-3,0 g/L para la hormona del crecimiento humana.
De manera similar, las condiciones de reacción pueden ajustarse en dependencia de la temperatura para la reacción de conjugación. En muchas situaciones se considera ventajoso realizar reacciones a gran escala a temperatura ambiente o alrededor de ella (T= 18-25 °C), pero en otras situaciones puede ser preferida, por diversas razones, aumentar o disminuir la temperatura para la reacción de conjugación.
En una modalidad, la reacción de conjugación se realiza a 15-50 °C, tal como en situaciones donde la concentración de la proteína reducida es superior a 150 pM como se describe anteriormente. En modalidades alternativas, puede aplicarse un intervalo de temperatura más bajo, si se incluye sal en la mezcla de conjugación.
En una modalidad donde la reacción de conjugación se lleva a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente, tal como por debajo de 20 °C, tal como por debajo de 15 °C, tal como por debajo de 10 °C, o tal como 2-8 °C, la mezcla de conjugación preferentemente tiene un fuerza iónica (I) superior a 0,1 M, tal como superior a 0,2 M, tal como superior a 0,3 M, tal como superior a 0,4 M, tal como superior a 0,5 M.
La fracción química activada, se mezcla con la proteína reducida para iniciar la conjugación. La mezcla en la presente descripción, se denomina mezcla de conjugación. La conjugación puede ocurrir durante un período de al menos 15 minutos, tal como al menos 1 hora, tal como al menos 2 horas, tal como al menos 3 horas, tal como al menos 4 horas o tal como al menos 5 horas. En una modalidad, la mezcla de conjugación se deja durante 2 horas, tal como 3-6 horas o alrededor de 3-4 horas, después de la adición de la fracción química activada. En una modalidad, la mezcla de conjugación se deja durante 2-20 horas, tal como 6-16 horas o alrededor de 8-12 horas, después de la adición de la fracción química activada.
En una modalidad, la conjugación puede realizarse para un máximo de 24 horas, tal como para un máximo de 18 horas, tal como para un máximo de 12 horas, tal como para un máximo de 6 horas, tal como para un máximo de 4 horas.
La reacción de conjugación puede tomar lugar a varias temperaturas, tal como de 1 a 50 °C, o tal como de 10 a 50 °C. En una modalidad, la conjugación puede tomar lugar a temperatura ambiente, tal como a 15-25 °C o 20-25 °C. En modalidades alternativas, la reducción puede realizarse a una temperatura más fría, tal como por debajo de 10°C, tal como alrededor de 4-6 °C.
A medida que avanza la reacción de conjugación, se obtiene una preparación de la proteína conjugada (P-S-Z) y una vez que se obtiene tal preparación, el experto puede proceder con más etapas de purificación, tal como la diafiltración del producto en un tampón de almacenamiento adecuado, eliminando las impurezas con un bajo peso molecular, como se describió anteriormente o con etapas de purificación más específicas tales como cromatografía de intercambio aniónico.
Equipo
El equipo usado en los ejemplos, en la presente descripción, ejemplifica el equipo adecuado para realizar el método. El método puede realizarse en vasos/tubos ordinarios con transferencias intermedias como sea necesario. La invención también puede realizarse con elevada ventaja en equipos de filtración de flujo transversal o filtración de flujo tangencial (TFF). Tal equipo es bien conocido en la técnica, y permite escalar el proceso de laboratorio a escala industrial
En la filtración de flujo transversal, el líquido pasa tangencialmente a través de la membrana/filtro, y el retenido y el permeado o filtrado, pueden recogerse/ drenarse continuamente y el retenido puede recircularse en el sistema.
Como se describió en los ejemplos, el sistema puede usarse para ultrafiltración y/o diafiltración de la proteína, en varias etapas del proceso de conjugación. Antes de la reducción, la preparación de disulfuro puede ultrafiltrarse para obtener una composición de un disulfuro mixto de una concentración deseada.
La presión de entrada y la presión de salida, pueden ajustarse y pueden adicionarse nuevas soluciones, que incluyan tampones y/u otros excipientes a medida que se drena el permeado del sistema.
El sistema también puede usarse sin aplicar una diferencia de presión, lo que significa que el volumen de líquido es constante y no se drena ningún permeado del sistema.
Con referencia al método de la invención, uno o más de la(s) etapa(s) se realizan en una modalidad en un sistema de ultrafiltración/diafiltración o sistema TFF.
En una modalidad adicional, la reducción (etapa c) se realiza en un tanque de retenido de un sistema de ultrafiltración/diafiltración o de un sistema de filtración de flujo transversal//TFF.
El agente reductor puede adicionarse al tanque de concentrado y aplicarse circulación para mezclar el agente reductor con la composición del disulfuro mixto. Durante la mezcla, los excipientes de la solución (que comprenden el disulfuro mixto y el agente reductor) no cambian, y el volumen de la misma se mantiene constante. Aunque la mezcla se produce en el sistema, no se aplica filtración, por ejemplo, no se introduce solución adicional en el sistema y/o no se aplica una diferencia de presión a través de la membrana y, en consecuencia, no se obtiene ningún permeado.
En una modalidad, no se obtiene ni se produce ningún permeado durante la adición y/o mezcla del agente reductor con el disulfuro mixto. En una modalidad, no se obtiene ni se produce ningún permeado durante la etapa de reducción. En una modalidad, la diafiltración no se realiza como parte de la etapa b) y / o c).
En una modalidad adicional, la conjugación (etapa g) se realiza en un tanque de retenido de un sistema de ultrafiltración/diafiltración o un sistema de filtración de flujo transversal/TFF.
En una modalidad, se usa un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial durante todo el proceso.
En una modalidad adicional, el método incluye una o más etapa(s) de ultrafiltración/diafiltración para concentrar la proteína, eliminar moléculas con un peso molecular por debajo de 10 kDa, o cambiar los excipientes o la concentración de excipientes de las soluciones usadas.
Cuando el método ha llegado a su fin, la preparación de la proteína conjugada (P-S-Z) (etapa h), puede obtenerse vaciando el sistema de filtración de flujo transversal.
Ejemplos
Método general para la preparación de una proteína hormona del crecimiento con una cisteína libre
La proteína puede expresarse de forma recombinante en E. coli, tal como se describió en el documento WO 2011/089255.
En breve, las células de E. coli que expresan GH-L101C, se aíslan mediante centrifugación. El precipitado celular se resuspende en un tampón Tris, que contiene EDTA y Polisorbato 20. Las células se interrumpe pasándolas a través de un homogeneizador de presión elevada. El homogeneizado obtenido se mezcla con una solución de urea, se ajusta el pH y se deja durante la noche. De este modo, la proteína se solubiliza y el glutatión de origen natural, se acopla a la cisteína libre que conduce a la formación de GH-L101C-S-Glutatión. Antes de la reducción/conjugación con la albúmina de cadena lateral, el precursor GH-L101C-S-Glutatión puede purificarse mediante cromatografía de intercambio aniónico.
La proteína se captura en una etapa de intercambio aniónico mediante el uso de Q Sepharose XL como fase estacionaria y tampón Tris como fase móvil. La elución se realiza mediante el uso de un gradiente lineal de cloruro de sodio. Después de un ajuste de la fuerza iónica, la proteína eluida se purifica mediante cromatografía de interacción hidrófoba. Se usa fenil sefarosa FF como fase estacionaria, y tampón Tris como fase móvil. La elución se realiza aplicando un gradiente por etapas, donde se varían las concentraciones de cloruro de sodio.
La etiqueta MEAE se elimina, mediante digestión enzimática del precursor, que resulta en un GH-L101C-S-Glutatión que finalmente se purifica mediante intercambio aniónico después de la dilución. Source 30Q, se usa como fase estacionaria y trietanolamina como fase móvil. La elución se realiza mediante el uso de un gradiente lineal de cloruro de sodio. La proteína ahora está lista para la etapa de conjugación.
Método general para preparar un aglutinante de albúmina de cadena lateral
El aglutinante de albúmina de cadena lateral, puede sintetizarse como se describió en el documento WO 2011/089255. Antes de la conjugación de la cadena lateral del aglutinante de albúmina al GH-L101C-SH, la cadena lateral se activa disolviendo la cadena lateral en una solución de KI (5 M), ácido ascórbico (50 mM) y trietanolamina (150 mM), pH 7,5. La concentración de la cadena lateral en la solución de KI está generalmente entre 5 y 30 g/L.
Ejemplo 1: Reducción y conjugación sin el uso de un sistema TFF
El GH-L101C-S-Glutatión se usa como se obtiene de la cromatografía de intercambio aniónico, como se describió anteriormente. La concentración es 2,4 g/L, NaCl es 0,08 M, trietanolamina es 0,02 M y el pH 7,4. La fuerza iónica es de 0,09 M.
TPPDS (5 equivalentes ~ 0.12 g por g de GH-L101C-S-Glutatión) se adicionan al GH-L101C-S-Glutatión, y la reducción es seguida por HPLC-AIE cada 30 minutos durante 4 horas (mediante el uso de un muestreador automático, ver figura IA ) . Después de 4 horas, la solución de cadena lateral (2,2 equivalentes ~ 0,12 g por g de GH-L101C-S-Glutatión) se adicionan a la mezcla de reducción y la reacción de conjugación es seguida por HPLC-AIE durante la noche (ver figura IB ) .
Ejemplo 2: Reducción y conjugación de GH-L101C-SH con el uso de un sistema TFF para ultrafiltración y diafiltración. Equipo:
Sistema TFF Millipore Labscale
Sistema ÁKTAcrossflow TFF
Filtro Sartocon Slice 200, punto de corte 10 kD (Hydrosart ©)
Soluciones:
Figure imgf000019_0001
Se obtiene una preparación de GH-L101C-S-Glutatión, como se describió en el método anterior. La preparación de GH se carga en el sistema TFF (Sistema Millipore Lab scale TFF) y se realiza la ultrafiltración hasta obtener una concentración de 5 g/L.
El agente reductor (TPPDS) se adiciona en exceso el GH (10 equivalentes ~ 0,24 g por g de GH-L101C-S-Glutatión) en el tanque de retenido y se aplica la circulación hasta que sea homogénea (aproximadamente 15 minutos). La mezcla de reducción se deja (sin circulación) durante 4 horas. La reacción es seguida por HPLC-AIE. Como puede verse en la figura 2, la reducción ocurre en 4 horas bajo las condiciones aplicadas.
Para evaluar el efecto de incluir una etapa de diafiltración, se obtienen muestras (1 ml) de GH-L101C-SH reducido, antes y después de tal etapa, y se realizan reacciones de conjugación separadas.
La proteína reducida se diafiltra con 5 veces el volumen a volumen constante mediante el uso de un tampón de diafiltración 1 (condiciones: 350 mL, 0,4 bar (entrada), 0,3 bar (salida) y un flujo de 17 LMH) mediante el uso de una membrana 10 kD (Hydrosart©), para eliminar moléculas de bajo peso molecular (< 10 kda). La OD280 de la solución de reducción, fue 23,7 debido a TPPDS. La eliminación de TPPDS se siguió a OD280, y el permeado mostró inicialmente una elevada absorbancia a 280 nM, que disminuyó a 0,058. Al final, el retenido tenía una OD280 equivalente a la DO280 antes de la adición de TPPDS, lo que indica que se había eliminado TPPDS.
La conjugación se realiza mediante el uso de 1 mL de la proteína reducida (obtenida antes de la diafiltración) mediante la adición de 0,1 mL de la solución de cadena lateral, que corresponder a la adición de 3 equivalentes de cadena lateral (~ 0,16 g por g de GH-L101C-S-Glutatión), y el proceso de alquilación se controla mediante HPLC-AIE (Figura 3A).
Paralelamente, se establece una reacción de conjugación mediante el uso de 1 mL del retenido concentrado (GH-L101C-SH reducido después de la diafiltración), y agregando 0,1 mL de solución de cadena lateral, que a la adición de 3 equivalentes de cadena lateral (~ 0,16 g por g de GH-L101C-S-Glutatión). La reacción de conjugación se monitorea mediante HPCL (Figura 3B).
El retenido concentrado restante (66 mL), se mezcla con una solución de cadena lateral y se hace circular en el sistema TFF para asegurar la mezcla. La mezcla se deja durante la noche sin bombear.
Además, para purificar el producto, la mezcla de conjugación (retenido) se diafiltra con 5 veces el volumen a volumen constante en el tampón de diafiltración 2, eliminando las moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa, y se prepara el producto para cualquier etapa cromatográfica subsecuente.
La HPLC-AIE de GH-L101C-S-cadena lateral conjugada final diafiltrada, muestra una conversión casi completa de GH-L101C-SH y una reducción satisfactoria en la cantidad de cadena lateral y KI, en comparación con la mezcla de conjugación (no mostrada).
Ejemplo 3: Reducción y conjugación de GH-L101C-SH con el uso de un sistema TFF para ultrafiltración y diafiltración con elevada concentración de GH y baja concentración de cadenas laterales.
Equipo:
Sistema TFF Millipore Labscale
Sistema ÁKTAcrossflow TFF
Filtro Sartocon Slice 200, punto de corte 10 kD (Hydrosart ©)
Soluciones:
Figure imgf000020_0001
Como anteriormente, se carga una preparación de GH en el sistema TFF (ÁKTAcrossflow), y se realiza la ultrafiltración hasta obtener una concentración de GH-L101C-S-Glutatión de 10 g/L (presión de entrada 2 bar, presión de salida 1 bar). Se adiciona la misma cantidad de TPPDS (5 eq), como en el ejemplo 1, al tanque de retenido, y se aplica circulación hasta que sea homogénea (aproximadamente 15 minutos). La reducción es seguida por HPLC-AIE cada 30 minutos durante 4 horas (mediante el uso de un muestreador automático, ver figura 4A).
Después de 4 horas, la mezcla de reducción se diafiltra 5 veces a volumen constante en el tampón de diafiltración 3. La solución de cadena lateral (2,2 equivalentes ~ 0.12 g por g de GH-L101C-S-Glutatión) se adiciona y se aplica la circulación hasta que sea homogénea (aproximadamente 15 minutos). La reacción de conjugación es seguida por HPLC-AIE (mediante el uso de un muestreador automático, ver figura 4b ).
Después de la reacción de conjugación, la mezcla de conjugación se diafiltra con 5 veces a volumen en tampón de diafiltración 4, para reducir el contenido de KI y la cadena lateral restante y se prepara la proteína conjugada para cualquier etapa cromatográfica subsecuente.
Ejemplo 4: Método para la purificación de la proteína conjugada GH-L101C-S-cadena lateral
Después de la conjugación, el producto puede purificarse mediante cromatografía de intercambio aniónico, en donde se usa Q Sepharose HP como fase estacionaria y trietanolamina como fase móvil. La elución puede realizarse como un gradiente lineal de cloruro de sodio. El producto puede someterse a diafiltración en un tampón de almacenamiento adecuado, que elimina las impurezas con un tamaño menor que el punto de corte de la membrana de 10 kDa. Una etapa de UF/DF, también permite la preparación de un producto concentrado.
Resumen del ejemplo 1-4
Los procesos de reducción y conjugación realizados mediante el uso de un sistema TFF han demostrado ser exitosos. Se han presentado 3 ejemplos de la reducción de GH-L101C-S-Glutatión con el uso de TPPDS, y los resultados se muestran en las figuras 1A, 2 y 4A. La Figura 1A, muestra la reducción con 5 equivalentes de TPPDS a una concentración de la proteína de 2,4 g/L. La conversión del material de partida es solo aproximadamente 60 %, después de 4 horas. Sin embargo, cuando la reducción se realiza a 5 g/L con 10 equivalentes de TPPDS (Figura 2) o a 10 g/L con 5 equivalentes de TPPDS (Figura 4A), la reacción se completa, dentro de menos de 4 horas. También se observa que la cantidad de agente reductor, puede reducirse cuando la concentración de sustrato (precursor de proteína) es mayor.
Los ejemplos anteriores, incluyen varias demostraciones de que la reacción de conjugación puede realizarse en un sistema TFF (Figura 3A, 3B y 4B). En todos los ejemplos, la reducción se dejó correr durante 4 horas.
La conjugación mostrada en la figura 1B, resulta en una conjugación de al menos de 60 % después de 20 horas. Como se ve en la figura 1A, la reducción del material de partida fue incompleta y, por lo tanto, el GH-L101C-S-Glutatión restante y el producto intermedio de reacción podrían interferir con la reacción de conjugación. Durante el período de reacción, el GH-L101C-S-Glutatión y el producto intermedio de reacción, se convirtieron completamente en GH-L101C-SH, pero no ocurrió una conversión completa en GH-L101C-S-cadena lateral. Es posible que la cadena lateral se agotara por reacción con el glutatión y posiblemente el TPPDS restante, antes de que pudiera reaccionar con el tiol libre de la proteína.
La única diferencia entre la figura 3A y 3B, es una etapa de diafiltración intermedia que aumenta el rendimiento de la conjugación superior a 90 %, en comparación con por debajo de 80 %.
También se observa que la diafiltración intermedia, afecta la concentración de la cadena lateral. Sin diafiltración, la concentración de la cadena lateral cae casi inmediatamente, mientras que la realización de las etapas de diafiltración intermedia, evita esta dramática caída en la concentración de la cadena lateral.
Es probable que la caída en la concentración de la cadena lateral, sea causada por la reacción de la cadena lateral con el glutatión liberado (correspondiente a 1 equivalente de cadena lateral) y posiblemente TPPDS. Al introducir la diafiltración intermedia, estas reacciones secundarias ya no son posibles.
Otra ventaja de la ultrafiltración y diafiltración combinadas, se ilustra al comparar la figura 3B y 4B. En la figura 3B, la reacción de conjugación rápida y casi completa se obtiene mediante la adición de 3 equivalentes de cadena lateral y mediante el uso de un pH 8,0. Dado que la proteína no es muy estable a pH 8,0, sería ventajoso un pH más bajo. Sin embargo, un pH más bajo también resulta en una velocidad de reacción más baja. De manera similar, el uso de la cadena lateral, debe limitarse al mínimo, pero una disminución en la cadena lateral, también disminuirá la velocidad de reacción. La Figura 4B, muestra que es posible obtener una reacción rápida y satisfactoria con el uso de menos cadena lateral y un pH más bajo, aumentando la concentración de la proteína durante la reacción de conjugación.
Como la proteína conjugada obtenida en la mezcla de conjugación no es muy estable, puede ser ventajoso incluir una etapa de purificación adicional. Como se describió en el ejemplo 4, la introducción de una etapa de diafiltración final, resulta en una preparación de proteína estable que puede almacenarse en condiciones normales, y adicionalmente, la preparación de proteína puede aplicarse directamente a una columna subsecuente, sin dilución o ajuste del pH, evitando así una manipulación adicional.
Ejemplo 5: La definición de la concentración mínima de la proteína para la reacción de reducción
Los inventores de la presente invención, han encontrado que un parámetro clave para controlar es la concentración de la proteína en la mezcla de reacción de reducción. Como se vio anteriormente, en situaciones donde el material de partida tiene una concentración relativamente baja, puede obtenerse una reacción mejorada, que incluye una etapa de concentración antes de adicionar el agente reductor. Mediante la concentración de la composición de la proteína, podría obtenerse una reducción satisfactoria, mediante el uso de menos equivalentes de agente reductor. Los estudios adicionales, muestran que la velocidad de reacción también estaba influenciada por la temperatura y la fuerza iónica de la mezcla de reducción.
Para describir el efecto combinado de la concentración de la proteína, la temperatura y la fuerza iónica de la mezcla de reducción, se investigó un número significativo de condiciones (ejemplos en la tabla 1). Como estándar, se incluyó trietanolamina (20 mM) y NaCl (80 mM), que proporciona una fuerza iónica de 0,09. En experimentos 4, 5, 10, 11 y 16, se incluyó sal adicional, para aumentar la fuerza iónica, mientras que la concentración de sal se redujo en 14 y 15. La fuerza iónica del tampón se calcula como la fracción de tampón cargado multiplicada por la concentración total de tampón. La fracción (x) de tampón cargado se calcula a partir del pKa del tampón, mediante el uso de la ecuación de Henderson-Hasselbalch:
x = i
1 10 V H - p K a m '
pKa es 7,8 a 22°C para trietanolamina.
Tabla 1. Las condiciones para las reacciones de reducción, incluyen la concentración de la proteína (Cp), la temperatura (Temp), el número de equivalentes (n) del agente de reducción y la fuerza iónica en la mezcla de reducción (incluyen los tampones, pero excluyen el componente de la proteína), para los experimentos de reducción 1-20. La Cmín calculada, como se describió más abajo, también se incluye para comparación. Los ejemplos 9-20, se representan gráficamente en la figura 5.
Figure imgf000022_0001
Se desarrolló un modelo mecanicista que describe la reducción en base a la cinética de reacción. Además del efecto inherente de la concentración de la proteína y la relación molar del agente reductor, el modelo incluye el efecto de la conductividad y la temperatura sobre las constantes de velocidad de la reacción. Los parámetros del modelo se determinaron por ajuste a datos experimentales. A continuación, se usaron simulaciones de modelos para describir el efecto combinado de la concentración de la proteína, la temperatura y la fuerza iónica en un número significativo de condiciones.
Se obtuvo una correlación que describe la concentración mínima requerida a una temperatura y fuerza iónica dadas, para obtener una reducción satisfactoria. Satisfactorio, en este caso significa que la concentración de la proteína inicial se reduce a <2 % dentro de aproximadamente 6 h. El gran número de puntos de datos creados mediante el uso de la simulación, permitió una correlación detallada, de ahí la forma específica (inusual) de la correlación.
La siguiente correlación se derivó y se ilustra por la figura 5.
Cm¡n = a*I-a1exp(-b*T),
en donde
T es la temperatura en grados Celsius
I es la fuerza iónica en M (mol/L)
Cm¡n es M (mol/L) y las constantes son
a = 0,137*10-3M1'425
a1 = 0,425
b = 0,070 C-1
El cálculo de Cmín para los experimentos 9 y 16, de la tabla 1 y la figura 9 se ejemplifican más abajo.
Cm¡n se calcula de acuerdo con la siguiente correlación descrita anteriormente en donde
Cmín = a*I-a1exp(-b*T),
Cálculo de experimento 9
I = 0,08 (NaCl) 0,02*1/(1+10<74 -78 >) (trietanolamina) = 0,09 M
T = 5 °C:
Cmín = 0,137*10-3 * 0,09-0425 * exp(-0,070*5) = 0,26*10-3 M = 0,26 mM
Cp para el experimento 9 fue de 0,11 mM, que está por debajo de Cmín y por lo cual, fuera del intervalo de condiciones favorables de acuerdo con la presente invención.
Cálculo de experimento 16
I = 0,516 (NaCl) 0,004*1/(1+10<74 -78 )) (trietanolamina) = 0,52 M
T = 40 °C:
Cmín = 0,137*10-3 * 0,52-0425 * exp(-0,070*40) = 0,01*10-3 M = 0,01 mM
Cp para el experimento 16 es 0,02 que es superior a la Cmín y dentro del intervalo de condiciones favorables de acuerdo con las presentes invenciones.
La usabilidad se ilustra además en la figura 6, que muestra dos experimentos con una concentración de la proteína (Cp ) mayor que la Cmín (Exp.12 y 16) y dos experimentos con una Cp menor que la Cmín (Exp. 9 y 15). En los experimentos 12 y 16, el material de partida (proteína-S-S-Caperuza) se convierte por debajo del 2 % dentro de un tiempo de reacción de 6 h. Los experimentos 12 y 16, demuestran que puede obtenerse un rendimiento de reacción útil con una elevada concentración de la proteína (exp.12) para compensar una baja temperatura, o para tener ambas, una fuerza iónica elevada y una temperatura más elevada, para compensar una concentración baja de la proteína ( exp.16).
Ejemplo 6: La definición de la concentración mínima de la proteína para la reacción de conjugación
Como se vio en los ejemplos anteriores (tal como el Ejemplo 3), se obtuvo una reacción de conjugación satisfactoria, mediante el uso de una concentración de la proteína más elevada también en la reacción de conjugación, lo que permitió el uso de menos equivalentes de la fracción química activada (Z*) ejemplificado por una cadena lateral de unión a albúmina. Nuevamente se investigó la influencia de la fuerza iónica y la temperatura, y una reacción de conjugación satisfactoria en este caso, significa que la concentración de la proteína de partida (proteína-SH) se reduce a <5 % dentro de aproximadamente 10 h. Como estándar, se incluyen trietanolamina (20 mM), NaCl (80 mM) y KI (0,5 M), que proporciona una fuerza iónica de alrededor de 0,5.
Tabla 2 Ejemplos de diferentes condiciones probadas para la reacción de conjugación.
Las condiciones para las reacciones de conjugación, incluyen la concentración de la proteína (Cp), la temperatura (Temp), el número de equivalentes (n) de la cadena lateral Z* y la fuerza iónica en la mezcla de conjugación (incluyen los tampones, pero excluyen la proteína y la cadena lateral) para los experimentos de conjugación 1 -21. Los ejemplos 10-21 se representan gráficamente en la figura 7.
Figure imgf000024_0001
La Cmín calculada, como se describió más abajo, también se incluye para comparación.
*Este ejemplo es el único con guanidinio HCl
Las condiciones para la reacción de conjugación, incluyen la concentración de la proteína (Cp), la temperatura (Temp) en grados Celsius, el número de equivalentes (n) de la cadena lateral y la fuerza iónica, por ejemplo, la concentración de sales en la mezcla de reducción (incluyen tampones, pero excluyen las proteínas y los componentes de la cadena lateral. En base a las condiciones de conjugación probadas en el experimento 1 -20, de la tabla 2, se desarrolló un modelo mecanicista mediante el uso del mismo enfoque, como para la reducción. Fue usada la simulación, para generar una cantidad sustancial de datos mediante el uso del desarrollo de una correlación que describe la concentración mínima de la proteína, requerida en las combinaciones dadas de temperatura y fuerza iónica para obtener una conjugación satisfactoria. Satisfactorio, en este caso significa, que la concentración de la proteína reducida, se reduce a <5 % dentro de aproximadamente 10 h. En base a los datos obtenidos, pueden definirse las condiciones adecuadas para la reacción de conjugación mediante el uso de la siguiente definición para la concentración mínima de la proteína (Cmín), en dependencia de la temperatura y la fuerza iónica, como se ilustra en la figura 7.
Cmín = 6,96*10-4 * exp(-0,0396 *5 - 10,9 *I)+6,12*10-5 *exp(-0,0289 *5)
= 6,96*10-4 * exp(-1,98 - 10,9 *I)+5,30*10-5
Cm¡n = a*exp(-bi *T-b2*I)+d*exp(-di *T), en donde T es la temperatura en grados Celsius, I es la fuerza iónica en M (mol/L) y Cmin es la concentración mínima de la proteína en M (mol/L)
a = 6,96*10-4 M
b1 = 0,0396 °C-1
b2 = 10,9 M-1
d = 6,12*10-5 M
d1 = 0,0289 °C-1
Los cálculos para los experimentos de conjugación 15 y 18, se muestran más abajo:
Cálculo de experimento 15
I = 0,08 (NaCl) 0,75 (KI) 0,02*1/(1+10<74 -78 >) (trietanolamina) = 0,84 M
T = 5 °C:
Cmín = 6,96*10-4 * exp(-0,0396 *5 - 10,9*0,84)+6,12*10-5 *exp(-0,0289 *5) = 0,05*10-3 M = 0,05 mM La concentración de la proteína (Cp ), del experimento 15, fue 0.45 M, claramente superior a la Cmín como calculado. Cálculo de experimento 18
I = 0,027 (NaCl) 0,07 (KI) 0,007*1/(1+10<74 -78 >) (trietanolamina) = 0,10 M
T = 40 °C:
Cmín = 6,96*10-4 * exp(-0,0396 *40 - 10,9*0,10)+6,12*10-5 *exp(-0,0289 *40) = 0,07*10-3 M = 0,07 mM La concentración de la proteína (Cp ), en el experimento 18, fue de 0,04 mM, que está por debajo de Cmín de 0.10 M. La usabilidad de la correlación se ilustra en las Figuras 8A y 8B, que muestran una serie de experimentos que prueban diferentes condiciones de conjugación. En el experimento 11, la cantidad de proteína reducida se reduce a alrededor del 5 % del material de partida, después de aproximadamente 10 a 20 °C (Cp = 0,08 mM y 3,6 eq de cadena lateral). En el experimento 5, la reacción es más rápida, lo que se obtiene mediante el uso de una mayor cantidad de proteína reducida (Cp), incluso si el número de equivalentes de la cadena lateral se reduce a 2 eq. Como se ve, para el experimento 6, en comparación con el experimento 5, un aumento en la fuerza iónica, acelera adicional la reacción. En el experimento 14, 15 y 19 (Figura 8B), la concentración de la proteína (Cp ) es mayor que la Cmín, mientras que el experimento 18 demuestra la baja eficacia de un experimento con Cp por debajo de Cmín. En este último, la reacción fue muy lenta y después de 20 h queda todavía aproximadamente un 20 % de material de partida. En el experimento 19, la fuerza iónica aumenta, pero la Cp y T se mantienen constante, en comparación con el experimento. 18, que resulta en una velocidad de reacción más alta y, por lo cual, una conversión del material de partida por debajo del 5 % en menos de 3 h. Los dos ejemplos a 5 °C, tienen ambos un Cp superior a la Cmín, y la conversión del material de partida por debajo del 5 %, se obtiene en aproximadamente 10 horas o menos. Sin embargo, el aumento de C p y fuerza iónica en el experimento 15 comparado con experimento 14, resulta en una conversión incluso con mayor eficiencia del material de partida.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un conjugado de proteína en donde la proteína (P) se une covalentemente a una fracción química (Z) mediante un tioéter, que comprende las etapas de;
a) obtener una composición de un disulfuro mixto, que comprende la proteína,
b) adicionar un agente reductor a dicha composición de proteína para obtener una mezcla de reducción, en donde el agente reductor es una fosfina,
c) permitir que ocurra una reacción de reducción,
d) obtener una solución que comprende una proteína reducida (P-SH),
e) eliminar moléculas de la solución con un peso molecular por debajo de 10 kDa,
f) añadir una fracción química activada (Z*) a la solución, (que comprende la proteína reducida), obtener una mezcla de conjugación que incluye 1-4 equivalentes de la fracción química (Z*),
g) permitir que ocurra una reacción de conjugación y
h) obtener una preparación de dicha proteína conjugada (P-S-Z),
en donde el método se realiza en un sistema de filtración de flujo transversal/filtración de flujo tangencial.
2. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el disulfuro mixto, es una proteína con una cisteína libre bloqueada (P-S-S-Caperuza).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la Caperuza se deriva de cisteína, cisteamina o glutatión.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la mezcla de reducción de la etapa b) tiene una concentración de disulfuro mixto de al menos Cmín, en donde Cmín se define por:
Cmín = a*I-a1exp(-b*T),
en donde, T es la temperatura en grados Celsius, I es la fuerza iónica (M) de la mezcla de reducción, a = 0,137*10-3M1425, a1 = 0,425 y b = 0,070 °C-1.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la mezcla de conjugación de f) tiene una concentración de la proteína reducida de al menos Cmín, donde Cmín se define por:
Cmín = a*exp(-b1*T-b2*I)+d*exp(-d1*T)
en donde, T es la temperatura en grados Celsius, I es la fuerza iónica (M) de la mezcla de conjugación, a = 6,96*10-4 M, b1 = 0,0396 °C-1, b2 = 10,9 M-1, d = 6,12*10-5 M y d1 =0,0289 °C-1.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la fosfina es una triarilfosfina, tal como trifenilfosfina-3,3'-disulfonato disódico (TPPDS).
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la cantidad de agente reductor incluido en la mezcla de reducción de la etapa b) es a lo máximo 10 equivalentes de la proteína (P-S-S-Caperuza).
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la fracción química activada (Z*) es un aglutinante de albúmina halogenada, que incluye Br, I o Cl.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la fracción química activada (Z*) es un aglutinante de albúmina halogenada, que incluye yodo (I).
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la fracción química activada (Z*) es una yodoacetamida de un aglutinante de albúmina.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la fracción química activada
Figure imgf000028_0001
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la mezcla de conjugación de la etapa f) incluye a lo máximo 3 equivalentes de la fracción química activada (Z*), con relación al disulfuro mixto.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, donde la etapa e), es la diafiltración realizada mediante el uso una membrana de celulosa, tal como una membrana Hydrosart © de 10 kD.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el tampón de diafiltración no incluye un agente reductor.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la composición de la etapa a), la mezcla de reducción de la etapa b), la solución de la etapa d), la mezcla de conjugación de la etapa f) y/o la preparación de la etapa h), comprenden trietanolamina.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la composición de la etapa a), la mezcla de reducción de la etapa b), la solución de la etapa d), la mezcla de conjugación de la etapa f) y/o la preparación de la etapa h), tienen un pH 7,0-8,0.
17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la proteína es un polipéptido de la hormona del crecimiento, que comprende una mutación puntual en L101C.
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