ES2197373T3 - Fragmentos de anticuerpos monovalentes. - Google Patents
Fragmentos de anticuerpos monovalentes.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS MONOVALENTES. CADA UNO DE ESTOS FRAGMENTOS TIENE UNA O VARIAS MOLECULAS POLIMERAS UNIDAS ESPECIFICAMENTE A UN SITIO POR UN ATOMO DE AZUFRE DE UN RESIDUO CISTEICO SITUADO FUERA DEL CAMPO DE LA REGION VARIABLE DEL ANTICUERPO. LOS POLIMEROS INCLUYEN POLIMEROS SINTETICOS O NATURALES, COMO POR EJEMPLO LOS POLIALQUILENOS, LOS POLIALQUENILENOS, LOS POLIOXIALQUILENOS O LOS POLISACARIDOS. CADA UNO DE ESTOS FRAGMENTOS PUEDE FIJARSE A UNA O VARIAS MOLECULAS DE MARCADO O MOLECULAS EFECTORAS, Y SE USA EN LA TERAPIA O EN LOS DIAGNOSTICOS DONDE EL FRAGMENTO HA MEJORADO NOTABLEMENTE LA FIJACION Y/O LAS PROPIEDADES FARMACOCINETICAS COMPARATIVAMENTE A OTROS FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS QUE TIENEN EL MISMO NUMERO Y TIPO DE MOLECULAS POLIMERAS, PERO EN LOS CUALES LAS MOLECULAS POLIMERAS SE FIJAN DE UN MODO ALEATORIO.
Description
Fragmentos de anticuerpos monovalentes.
La invención se refiere a fragmentos de
anticuerpo monovalente modificados, a sus procedimientos de
preparación, a composiciones que los contienen y a su uso en
medicina.
Se ha producido un aumento en el uso de
anticuerpos usados a nivel clínico para propósitos de diagnóstico y
terapéuticos. El objetivo, en cada caso es aprovechar la
combinación de la elevada especificidad y afinidad de la
interacción antígeno-anticuerpo, para permitir la
detección y/o el tratamiento de una lesión particular. El anticuerpo
se usa solo, o se carga con otro átomo o molécula como por ejemplo
un radiosiótopo o un fármaco citotóxico.
La farmacocinética y la biodistribución de un
anticuerpo juegan un papel principal en la determinación de si
tendrá éxito su uso en el ámbito clínico. Por lo tanto, el
anticuerpo debe poder administrarse en el punto de acción y
permanecer retenido allí durante un periodo de tiempo adecuado para
lograr su propósito. También debe estar presente sólo a nivel
subtóxico en los lugares fuera de la diana y se debe catabolizar de
manera bien definida.
Para diversos usos la farmacocinética de los
anticuerpos no es adecuada. Esto es especialmente verdad para el
diagnóstico de tumores y la terapia con
anticuerpo-radioisótopo o conjugados de fármacos.
Para diagnóstico con dichos conjugados las vidas medias altas
limitan la razón de tumor a señal de fondo y por lo tanto, la
sensibilidad de detección de la lesión. Para terapia, una vida
media alta conduce a una exposición a largo plazo de tejidos
normales al conjugado de anticuerpo y, por lo tanto, la toxicidad
limitada por la dosis.
Hay disponible una gran variedad de enfoques para
manipular la farmacocinética de los anticuerpos, y estos suelen
afectar sólo a su biodistribución. El enfoque más simple y más
generalmente aplicable es el uso de fragmentos de anticuerpo. Éstos
se pueden purificar más rápido del torrente circulatorio que los
anticuerpos completos y se distribuyen más rápidamente de la sangre
a los tejidos, lo cual es un particular ventaja en algunas
aplicaciones, por ejemplo, para detección y terapia de tumores
mediante imágenes.
Para mejorar aún más la farmacocinética de los
fragmentos de anticuerpo hemos investigado el uso de polímeros. La
unión de materiales poliméricos como por ejemplo polietilenglicol
(PEG) a moléculas de proteínas está bien establecida y se ha
demostrado que la unión de un polímero puede alterar sustancialmente
las propiedades farmacológicas de una molécula de proteína. Por
ejemplo, la modificación de proteínas con PEG puede alterar in
vivo la vida media en circulación de la proteína, la
antigenicidad e inmunogenicidad, solubilidad, estabilidad mecánica y
resistencia a proteolisis [Abuchowski, A. et al J. Biol.
Chem (1977) 252, 3578-3581 y
3582-3586; Nucci, M. L. et al, Adv. Drug
Delivery Reviews (1991) 6, 133-151; Francis,
G. et al, Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt,
R.T. ed.); y Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo
Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization
(1991) pp 235-263 (Ahem, T. J y Manning, M., ed.s)
Plenum, New York].
La unión de PEG a moléculas de proteína se ha
logrado usando diferentes procedimientos químicos, la mayoría de los
cuales unen el PEG a residuos de lisina u otros residuos de
aminoácidos sobre la superficie de la proteína de manera aleatoria
[Zalipsky, S. & Lee, C. Poly(ethylene glycol) Chemistry:
Biotechnical and Biomedical Applications (1992) pp
347-370 (Harris, J.M., ed), Plenum, New York]. Esto
suele conducir a la deficiencia parcial de la función de la
proteína, por ejemplo, se reduce la actividad catalítica de las
enzimas [Nucci, M.L. et al ibid].
Se ha informado sobre las modificaciones de
proteínas en un punto específico para introducir puntos para la
unión de PEG. La interleucina-2, por ejemplo, se ha
modificado por mutagénesis para sustituir un residuo de treonina que
normalmente está glicosilado por una cisteína para permitir la unión
de PEG, [Goodson, R.J. & Katre, N.V. Bio/Techlogy (1990)
8, 343-346]. Se eligió un sitio que
normalmente está glicosilado como éste porque se creyó que era capaz
de tolerar la modificación por PEG sin perturbar la estructura de la
proteína. En otro ejemplo, la enzima purina nucleósido fosforilasa
se ha modificado para reemplazar selectivamente residuos de arginina
con lisinas para proporcionar en este caso hasta dieciocho sitios
potenciales de unión de PEG por molécula de enzima [Hershefield,
M.S. et al P. N.A.S. (1991), 88,
7185-7189].
Estudios previos con anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos han usado unión aleatoria de PEG mediante residuos de
lisina [por ejemplo, Ling, T. G. I. & Mattiasson, B. J.
Immunol. Methods (1983), 59, 327-337;
Wilkinson, I. et al Immunol. Letters (1987) 15,
17-22; Kitamura, K. et al Cancer Res.
(1991), 51, 4310-4315; Delgado, C. et
al Br. J. Cancer (1996), 73, 175-182] y
derivados tiolados [Pedley, R.B. et al Br. J. Cancer (1994),
70, 1126-1130]. La unión aleatoria a menudo
da como resultado anticuerpos modificados que solo son capaces de
unirse a su antígeno diana con afinidad, avidez o especificidad
reducidas. En un intento de superar esto, los residuos de lisina
críticos en los bucles de unión del antígeno (CDR) se han sustituido
con argininas para permitir la modificación con menos pérdida de
inmunoreactividad [Benhar, I. et al Bioconjugate Chemistry
(1994) 5, 321-326].
Los puntos específicos en las regiones constantes
y bisagra de anticuerpos se pueden organizar para permitir la unión
a un punto específico de un intervalo de moléculas efectoras e
informadoras [Lyons, A. et al Prot. Eng. (1990), 3,
703-709; y las solicitudes de patente europea nº
348442 y 347433]. Ahora hemos determinado que los que la unión a un
punto específico de polímeros a fragmentos de anticuerpo
monovalentes se puede usar para evitar la pérdida de
inmunorreactividad asociada anteriormente con procedimientos de
unión aleatoria. Además, los fragmentos modificados de esta manera
han mejorado visiblemente la unión y/o las propiedades
farmacocinéticas cuando se comparan con fragmentos que se han
modificado aleatoriamente con el mismo número y tipo de moléculas
poliméricas.
Por lo tanto, según un aspecto de la invención
proporcionamos un fragmento de anticuerpo monovalente que comprende
un fragmento de anticuerpo monovalente y al menos una molécula
polimérica en unión covalente que se caracteriza porque cada residuo
de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo fuera del
dominio de la región variable del fragmento se une covalentemente
mediante su átomo de azufre a una molécula polimérica o forma una
unión disulfuro con un segundo residuo de cisteína localizado en el
fragmento con tal que al menos uno de dichos residuos de cisteína se
una a una molécula polimérica.
El fragmento de anticuerpo modificado según la
invención es, esencialmente, un fragmento de anticuerpo monovalente
unido covalentemente a una o más, por ejemplo, una, dos o tres
moléculas poliméricas mediante uno o más, por ejemplo, uno, dos o
tres residuos de cisteína localizados en el fragmento fuera de su
dominio de la región variable. El fragmento puede tener,
adicionalmente, una o más moléculas efectoras o informadoras unidas
covalentemente al mismo, según se describe posteriormente en la
presente memoria descriptiva.
El fragmento de anticuerpo modificado de la
invención puede ser capaz, en general, de unirse selectivamente a un
antígeno. El antígeno puede ser cualquier antígeno asociado a una
células, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, como
por ejemplo un linfocito T, una célula del endotelio o un marcador
de célula tumoral, o puede ser un antígeno soluble. Ejemplos
particulares de antígenos de la superficie celular incluyen
moléculas de adhesión, por ejemplo integrinas como por ejemplo
integrinas \beta1, por ejemplo VLA-4,
E-selectina, P-selectina o
L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a,
CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52,
CD69, antígeno carcinoembrionario (CEA), glubulina de la grasa
láctea humana (HMFG1 y 2), antígenos MHC de clase I y II, y VEGF, y
cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Los antígenos
solubles incluyen interleucinas como por ejemplo
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-8 o IL-12, agentes víricos, por
ejemplo, el virus respiratorio sincitial o antígenos de
citomegalovirus, inmunoglubulinas, como por ejemplo IgE,
interferones como por ejemplo el interferón \alpha el interferón
\beta o el interferón \gamma, el factor \alpha de necrosis
tumoral, el factor \beta de necrosis tumoral, factores
estimulantes de colonia como por ejemplo G-CSF o
GM-CSF y factores de crecimiento derivados de
plaquetas como por ejemplo PDGF-\alpha y PDGF-
\beta y, cuando sea apropiado, los receptores de los mismos.
El término dominio de la región variable según se
usa en la presente memoria descriptiva en relación con el fragmento
según la invención pretende significar la parte del fragmento de
anticuerpo que contiene el punto de unión al antígeno. El dominio
de región variable puede tener cualquier tamaño o composición de
aminoácidos y comprende, en general, al menos una secuencia de
aminoácidos hipervariable responsable de la unión al antígeno
embebida en una secuencia marco conservada. En términos generales el
dominio de la región variable (V) puede ser cualquier disposición
adecuada de dominios variables de la cadena pesada (VH) o ligera
(VL) de la inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, el dominio de
la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL siendo
estos capaces de unirse independientemente al antígeno con afinidad
aceptable. Alternativamente, el dominio de la región V puede ser
dimérico y contener dímeros VH-VH,
VH-VL y VL-VL en los que las cadenas
VH y VL se asocian de manera no covalente. Sin embargo, cuando se
desee, las cadenas se pueden acoplar directamente, por ejemplo,
mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables o
mediante un conector, por ejemplo, un conector peptídico, para
formar un dominio de cadena sencilla.
El dominio de la región variable puede ser
cualquier dominio variable de origen natural o una versión del mismo
sometida a estudio técnico. Por versión sometida a estudio técnico
se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando
técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones
sometidas a estudio técnico incluyen las creadas, por ejemplo, a
partir de regiones variables de anticuerpos naturales mediante
inserciones, deleciones o cambios en o hacia las secuencias de
aminoácidos de los anticuerpos naturales. Ejemplos particulares de
este tipo incluyen los dominios de la región variable sometidos a
estudio técnico que contienen, al menos, un CDR y, opcionalmente,
uno o más aminoácidos marco conservados de un anticuerpo y el resto
del dominio de la región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de la región variable generalmente
está unido de manera covalente a al menos un residuo de cisteína o
en particular dos o tres residuos de cisteína cada uno unido
covalentemente mediante su átomo de azufre a una molécula
polimérica.
La localización de cada residuo de cisteína se
puede variar de acuerdo con el tamaño y la naturaleza del fragmento
de anticuerpo requerido. Por lo tanto, en un ejemplo extremo, un
residuo de cisteína unido mediante su átomo de azufre a un polímero
se puede unir directamente a un aminoácido
C-terminal del dominio de la región variable. Este
puede ser, por ejemplo, el C-terminal de la cadena
VH o VL según se ha descrito anteriormente. Si se desea, en este
ejemplo, se pueden unir covalentemente más aminoácidos, incluyendo
más polímeros unidos a cisteína, al C-terminal del
primer residuo de cisteína.
En la práctica, sin embargo, es preferible, en
general, que el dominio de la región variable se una covalentemente
por el aminoácido C-terminal a al menos otro dominio
de anticuerpo o un fragmento del mismo que contiene, o está unido o
uno, dos, tres o más residuos de cisteína, cada uno unido
covalentemente mediante su átomo de azufre a una molécula
polimérica. Por lo tanto, por ejemplo, cuando haya presente un
dominio VH en el dominio de la región variable se puede unir a un
dominio CH1 de inmunoglobulina o a un fragmento del mismo. De manera
similar, un dominio VL se puede unir a un dominio CK o a un
fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, el fragmento según
la invención puede ser un fragmento Fab en el que el dominio de
unión a antígeno contiene dominios VH y VL asociados unidos
covalentemente por su C-terminal al dominio CH1 y
CK, respectivamente. El dominio CH1 puede prolongarse con más
aminoácidos, por ejemplo, para proporcionar un dominio de región
bisagra según se encuentra en un fragmento Fab, o para proporcionar
más dominios, como por ejemplo los dominios de anticuerpo CH2 y CH3.
En cada uno de los casos anteriores uno o más, por ejemplo, uno, dos
o tres residuos de cisteína, cada uno unido a una molécula
polimérica, se pueden localizar en cualquier punto en cualquier
dominio.
La molécula polimérica en el fragmento según la
invención puede ser, en general, un polímero de origen natural o
sintético, por ejemplo, un polialquileno, polialquenileno o
polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente
sustituido, o un polisacárido ramificado o no, por ejemplo, un homo-
o heteropolisacárido.
Los sustituyentes opcionales particulares que
pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados
anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.
Ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen
poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o
poli(vinilalcohol) de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido, y derivados de los mismo, especialmente
poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido como por ejemplo
metoxi(polietilenglicol) y sus derivados. Los polímeros de
origen natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano o glicerina y sus
derivados. El término ``derivados'' según se usa en la presente
memoria descriptiva pretende incluir derivados reactivos, por
ejemplo, los grupos reactivos selectivos para tiol como por ejemplo
maleimidas y similares. El grupo reactivo se puede unir
directamente o mediante un segmento de unión al polímero. Debe
entenderse que el residuo de dicho grupo en algunos casos forma
parte del producto de la invención como el grupo de unión entre el
fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero se puede variar según se
desee, pero en general está en el intervalo de peso molecular de
aproximadamente 500 kDa a aproximadamente 50000 Da, por ejemplo, de
5000 a 40000 Da e incluyendo 25000 a 40000 Da. El tamaño del
polímero se puede seleccionar, en particular, según el uso
pretendido para el producto. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se
pretende que el producto salga del torrente circulatorio y penetre
en el tejido, por ejemplo para usarlo en el tratamiento de un
tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de pequeño peso
molecular, por ejemplo, de aproximadamente 5000 Da. Para
aplicaciones en las que el producto permanece en el torrente
circulatorio puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso
molecular, por ejemplo, en el intervalo de 25000 Da a 40000 Da.
Tal y como se ha explicado anteriormente, cada
molécula de polímero en el fragmento de anticuerpo modificado según
la invención se une covalentemente a un átomo de azufre de un
residuo de cisteína localizado en el fragmento. La unión covalente
es, en general, un enlace disulfuro o, en particular, un enlace
azufre-carbono.
Los fragmentos particularmente útiles según la
invención son aquellos en los que dos o especialmente tres residuos
de cisteína localizados en el fragmento fuera del dominio de la
región variable están unidos covalentemente, cada uno de ellos,
mediante su átomo de azufre a una molécula polimérica, distinta del
residuo de cisteína localizado en el fragmento fuera del dominio de
la región variable y están en unión disulfuro con un segundo residuo
de cisteína localizado en el fragmento. En estos fragmentos
particulares el polímero puede ser, especialmente, un polímero
sintético, particularmente un polímero de polialquileno como por
ejemplo poli(etilenglicol) o especialmente
metoxi(etilenglicol) o un derivado del mismo y especialmente
con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 25000 Da a
aproximadamente 40000 Da.
Cuando se desee, el fragmento de anticuerpo según
la invención pueden ser una o más moléculas efectoras o informadoras
unidas al mismo y la invención incluye dichos anticuerpos
modificados. Las moléculas efectoras o informadoras pueden estar
unidas al fragmento de anticuerpo mediante cualquier cadena lateral
de aminoácido disponible o grupo funcional aminoácido terminal
localizado en el fragmento, por ejemplo, cualquier grupo amino,
imino, hidroxilo o carboxilo.
Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo,
agentes antineoplásicos, toxinas (como por ejemplo toxinas
enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos
de las mismas, por ejemplo, ricino y fragmentos del mismo),
proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, ácidos
nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y
fragmentos de los mismos, radionucleidos y metales quelados. Los
grupos informadores adecuados incluyen metales quelados, compuestos
fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por RMN o
espectroscopía ESR.
Los agentes antineoplásicos particulares incluyen
agentes citotóxicos y citostáticos, por ejemplo, agentes de
alquilación, como por ejemplo mostazas nitrogenadas (por ejemplo,
mostaza de clorambucilo, melfalano, mecloretamina, ciclofosfamida o
uracilo) y derivados de los mismos, trietilenfosforamida,
trietilentiofosforamida, busulfano o cisplatina; antimetabolitos;
como por ejemplo metotrexato, fluororacilo, floxuridina,
citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido
fluorocítrico, antibióticos como por ejemplo bleomicinas (por
ejemplo, sulfato de bleomicina), doxorubicina, daunorubicina,
mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C), actinomicinas (por ejemplo,
dactinomicina), plicamicina, calicaemicina y derivados de las mismas
o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, como
por ejemplo etoposida, vincristina o vinblastina y derivados de las
mismas; alcaloides, como por ejemplo elipticina; polioles como por
ejemplo taxicina-I o taxicina-II;
hormonas, como por ejemplo andrógenos (por ejemplo, dromostanolona o
testolactona), estrógenos (por ejemplo, diosfato de
dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de
estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno);
antraquinonas, como por ejemplo mitoxantrona; ureas, como por
ejemplo hidroxiurea; hidracinas, como por ejemplo procarbazina; o
imidazoles, como por ejemplo dacarbazina.
Los grupos efectores particularmente útiles son
calicaemicina y sus derivados (véase, por ejemplo, las solicitudes
de patente sudafricanas nº 85/8794, 88/8127 y 90/2839).
Los metales quelados incluyen quelatos de metales
di- o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8
inclusive. Ejemplos particulares de dichos metales incluyen tecnecio
(Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag),
plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio
(Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general el metal es,
preferiblemente, un radionucleido. Los radionucleidos particulares
incluyen ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{58}Co, ^{60}Co,
^{67}Cu, ^{195}Au, ^{199}Au, ^{110}Ag, ^{203}Pb,
^{206}Bi, ^{207}Bi, ^{111}In, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{88}Y,
^{90}Y, ^{160}Tb, ^{153}Gd y ^{47}Sc.
El metal quelado puede ser por ejemplo uno de los
tipos de metales quelados anteriores con cualquier agente quelante
polidentado, por ejemplo poliaminas acíclicas o cíclicas,
poliéteres, (por ejemplo, éteres corona y derivados de los mismos);
poliamidas; porfirinas; y derivados carbocíclicos.
En general, el tipo de agente quelante depende
del metal que se use. Un grupo particularmente preferido de agentes
quelantes en conjugados de acuerdo con la invención, sin embargo,
son poliaminas acíclicas o cíclicas, especialmente ácidos
poliaminocarboxílicos, por ejemplo ácido
dietilentriaminaopentacético y derivados del mismo, y aminas
macrocíclicas, por ejemplo, derivados cíclicos
tri-aza y tetra-aza (por ejemplo,
tal y como se describe en la solicitud de la patente internacional
nº WO 92/22583); y poliaminas, especialmente desferrioxamina y
derivados de la misma.
El fragmento de anticuerpo modificado de acuerdo
con la invención se puede preparar haciendo reaccionar un fragmento
de anticuerpo que contiene al menos un residuo de cisteína reactivo
con un polímero activado tiol-selectivo. La
reacción se puede llevar a cabo generalmente en un disolvente, por
ejemplo una disolución acuosa de tampón como por ejemplo un tampón
de acetato o de fosfato, a aproximadamente pH neutro, por ejemplo un
pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0, por ejemplo a
temperatura ambiente. El polímero activado se empleará generalmente
en una concentración en exceso relacionada con la concentración del
fragmento de anticuerpo. En algunos casos puede ser necesario
reducir el material de partida de anticuerpo con un reactivo como
por ejemplo \beta-mercaptoetilamina (por ejemplo,
tal y como se describe del Ejemplo 1 en adelante), para generar un
residuo de cisteína reactivo apropiado. Donde sea necesario, el
producto deseado que contiene el número deseado de moléculas de
polímero se puede separar de cualquier otro producto generado
durante el procedimiento de producción y que contenga un número no
deseado de moléculas de polímero por medios convencionales, por
ejemplo, por cromatografía.
El material de partida de fragmentos de
anticuerpos se puede obtener a partir de cualquier anticuerpo
completo, especialmente un anticuerpo monoclonal completo,
[preparado por inmunización convencional y procedimientos de fusión
de células], usando cualquier técnica de ruptura enzimática
convencional y/o digestión, por ejemplo por tratamiento con pepsina.
De forma alternativa, el material de partida de anticuerpos se
puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante que
conlleva la manipulación y re-expresión de ADN que
codifica regiones variables y/o constantes del anticuerpo. Tal ADN
se conoce y/o está disponible fácilmente a partir de bibliotecas de
ADN que incluyen por ejemplo bibliotecas de anticuerpos de fagos
[ver Chiswell, D. J. y McCafferty, J. Tibtech. 10
80-84 (1992)] o se puede sintetizar donde se
desee. Los procedimientos convencionales de biología molecular y/o
químicos se pueden usar para secuenciar y manipular el ADN, por
ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína,
para modificar, añadir o delecionar de la forma que se desee otros
aminoácidos o dominios.
Desde aquí, se pueden preparar y usar uno o más
vectores de expresión replicables que contienen el ADN para
transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea
celular que no produce mieloma, como por ejemplo una línea NSO de
ratón o una bacteriana, por ejemplo, una línea de E. coli, en
la que se dará la producción del anticuerpo. Para obtener una
transcripción y traducción eficaces, la secuencia de ADN en cada
vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas,
particularmente un promotor y una secuencia líder unidos de forma
eficaz a la secuencia del dominio variable. Los procedimientos
particulares para producir anticuerpos de esta forma son bien
conocidos generalmente y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo,
los procedimientos básicos de biología molecular se describen en
Maniatis et al [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York, 1989]; la secuenciación se puede llevar a cabo
tal y como se describe en Sanger et al [PNAS 74, 5463,
(1997)] y el manual de secuenciación de Amersham International plc;
y la mutagénesis dirigida de sitio se puede llevar a cabo de
acuerdo con el procedimiento de Kramer et al [Nucl. Acids
Res. 12, 9441, (1984)] y el manual de Anglian Biotechnology
Ltd. De forma adicional, existen numerosas publicaciones, incluyendo
especificaciones de patentes, detallando técnicas adecuadas para la
preparación de anticuerpos por manipulación de ADN, creación de
vectores de expresión y transformación de células adecuadas, por
ejemplo, tal y como se ha revisado en Mountain A. Y Adair, J. R. En
Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [ed. Tombs, M. P.,
10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, UK] y en la
solicitud de la patente internacional nº WO 91/09967.
El material polimérico activado de partida para
uso en la preparación de fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la
invención puede ser cualquier polímero que contenga un grupo tiol
reactivo, como por ejemplo un ácido o éster
\alpha-halocarboxílico, por ejemplo yodoacetamida,
una imida, por ejemplo malimida, una sulfona de vinilo o un
disulfuro. Tales materiales de partida se pueden obtener
comercialmente (por ejemplo de Shearwater Polymers Inc., Huntsville,
AL, USA) o se pueden preparar a partir de materiales de partida
disponibles comercialmente usando procedimientos químicos
convencionales, por ejemplo tal y como se describe en Zalipsky, S.
& Lee, C, ibid, y en los ejemplos de aquí en
adelante.
Donde se desee obtener un fragmento de anticuerpo
de acuerdo con la invención unido a una molécula efectora o
informadora, ésta se puede preparar por procedimientos
convencionales químicos o de ADN recombinante en los que el
fragmento de anticuerpo se une directamente o por medio de un agente
de acoplamiento a la molécula efectora o informadora antes o después
de la reacción con el polímero activado de la forma adecuada.
Procedimientos químicos particulares incluyen por ejemplo aquellos
descritos en las solicitudes de patente internacional nºs WO
93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 y WO 89/01476. De forma
alternativa, cuando la molécula efectora o informadora es una
proteína o polipéptido la unión se puede alcanzar usando
procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo tal y como se
describe en la solicitud de la patente internacional nº WO 86/01533
y en la solicitud de la patente europea nº 392745.
El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
invención puede ser útil en la detección o tratamiento de varias
enfermedades o trastornos. Tales enfermedades o trastornos pueden
incluir aquellos descritos en los encabezamientos de una enfermedad
infecciosa, por ejemplo, una infección viral; enfermedad
inflamatoria/autoinmunidad, por ejemplo, artritis reumatoide,
osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino; cáncer;
enfermedad alérgica/atópica, por ejemplo asma, eccema; enfermedad
congénita, por ejemplo, fibrosis cística, anemia drepanocítica;
enfermedad dermatológica, por ejemplo, psoriasis; enfermedad
neurológica, por ejemplo, esclerosis múltiple; transplantes, por
ejemplo, rechazo al transplante de órganos, enfermedad de injerto
contra huésped; y enfermedad metabólica/idiopática, por ejemplo,
diabetes.
Los fragmentos de anticuerpos modificados de
acuerdo con la invención se pueden formular para uso en terapia y/o
diagnóstico y de acuerdo con un aspecto adicional de la invención,
proporcionamos una composición farmacéutica que comprende un
fragmento de anticuerpo monovalente modificado que comprende un
fragmento de anticuerpo monovalente modificado y al menos una
molécula de polímero con unión covalente caracterizado por que cada
unión covalente es a través de un átomo de sulfuro de un residuo de
cisteína situado en la parte de fuera del fragmento del anticuerpo
del dominio de la región variable del fragmento, junto con uno o
más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
Tal y como se ha explicado anteriormente, el
fragmento de anticuerpo modificado en este aspecto de la invención
se puede unir opcionalmente a uno o más grupos efectores o
informadores.
La composición farmacéutica puede tomar cualquier
forma adecuada de administración, y, preferiblemente en una forma
adecuada para administración parenteral, por ejemplo, por inyección
o infusión, por ejemplo por inyección de bolus o infusión continua.
Cuando la composición es por inyección o infusión, puede tomar la
forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o
acuoso, y puede contener agentes de formulación tales como agentes
de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o de dispersión.
De forma alternativa, la composición de
anticuerpos puede ser en forma seca, para reconstitución antes de su
uso con un líquido estéril apropiado.
Si la composición de anticuerpos es adecuada para
administración oral, la formulación puede contener, además de un
ingrediente activo, aditivos como por ejemplo: almidón, por
ejemplo, almidón de patata, de maíz o de trigo, o celulosa, o
derivados de almidón como por ejemplo, celulosa microcristalina;
sílice; varios azúcares como por ejemplo la lactosa; carbonato de
magnesio y/o fosfato de calcio. Es deseable que, si la formulación
es para administración oral será bien tolerada por el sistema
digestivo del paciente. A este final, puede ser deseable incluir
formadores de mucosidad y resinas en la formulación. Puede ser
deseable también mejorar la tolerancia formulando el anticuerpo en
una cápsula la cual es insoluble en los jugos gástricos. Puede ser
preferible incluir también el anticuerpo o la composición en una
formulación de libración controlada.
Si la composición de anticuerpos es adecuada para
la administración rectal, puede contener un agente aglutinante y/o
lubricante; por ejemplo glicoles poliméricos, gelatinas, mantequilla
de cacao de u otras ceras o grasas vegetales.
Los usos terapéuticos y diagnósticos de
fragmentos de acuerdo con la invención comprenden típicamente
administrar una cantidad efectiva del fragmento de anticuerpo a un
sujeto humano. La cantidad exacta que hay que administrar variará de
acuerdo con el uso de un anticuerpo y con la edad, sexo y condición
del paciente, pero se puede variar típicamente de aproximadamente
0,1 mg a 1000 mg, por ejemplo de aproximadamente 1 mg a 500 mg. El
anticuerpo se puede administrar en forma de dosis única o de manera
continua durante un período de tiempo. Las dosis se pueden repetir
de forma que sea adecuado. Las dosis típicas pueden estar por
ejemplo entre 0,1 y 50 mg/kg de peso corporal por una sola dosis
terapéutica, particularmente entre 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal
para una única dosis terapéutica.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. En
los Ejemplos, se usan los siguientes fragmentos de anticuerpos y se
identifican en cada caso por el nombre abreviado que se da
posteriormente. En cada caso el anticuerpo se preparó a partir de un
anticuerpo monoclonal de ratón tal y como se describe en la
solicitud de la patente internacional nº WO 92/01059 (A5B7) o usando
procedimientos similares (hTNF40 y cTN3):
- hA5B7
- - Éste es un anticuerpo humano modificado que reconoce el antígeno carcinoembrionario. El fragmento de anticuerpo usado aquí tiene un residuo de cisteína disponible para unirse a PEG y localizado en su región bisagra después de la activación con \beta-mercaptoetilamina.
- hTNF40
- - Éste es un anticuerpo humano modificado que reconoce TNF\alpha humano. Dos fragmentos de anticuerpos hTNF40 se usan en los Ejemplos, uno (Ejemplo 2) que tiene un único residuo de cisteína en la región bisagra (ver hA5B7 anterior), y un segundo (Ejemplo 3) que tiene dos residuos de cisteína en la región bisagra, disponibles para unirse a PEG.
- cTN3
- - Este es un anticuerpo quimérico de hámster/ratón que reconoce TNF\alpha de ratón y que tiene una región constante IgG2a de ratón. El anticuerpo tiene tres residuos de cisteína en la región bisagra disponibles para unirse a PEG.
- hg162
- - Éste es un anticuerpo humano modificado que reconoce el receptor PDGF\beta humano. El fragmento de anticuerpo usado aquí tiene un único residuo de cisteína presente en su región bisagra disponible para unirse a PEG.
Las siguientes abreviaturas se usan en el Ejemplo
1:
En los Ejemplos 2 a 7, la abreviatura PEG se usa
para referirse a metoxipoli(etilenglicol) lineal o
ramificado, con o sin un segmento conector entre la cadena de
poli(etilenglicol) y un grupo tilo reactivo como se indica.
En cada Ejemplo, la unión al anticuerpo ocurre a través de un enlace
-S-C- tal y como se describe anteriormente, o, en el
Ejemplo 5 a través de un enlace -S-S-.
En todos los Ejemplos, se usan las siguientes
abreviaturas:
- DTDP - 4,4'-ditiodipiridina
- PBS - solución salina tamponada con fosfato
- HPLC - cromatografía líquida de alto rendimiento
- ABC - área bajo la curva.
Se expresó Fab' de hA5B7 en células W3110 de
E. coli crecidas en un fermentador de 1,5 litros. Las células
se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en el volumen
original con Tris 100 mM a pH 7,4 que contenía AEDT 10 mM, y se
incubó durante una hora a 55ºC. El extracto celular resultante se
clarificó luego por centrifugación, se llevó a 1 M con respecto a
la glicina, y el pH se ajustó a 7,5 con glicinato de sodio al 50%
(peso/volumen). La muestra se aplicó a una columna de Streamline®
A (Pharmacia) equilibrada con glicina/glicinato 1 M a pH 8,0.
Después de lavar con el tampón de equilibración, se eluyó el Fab' de
hA5B7 con citrato 0,1 M a pH 3,0. El hA5B7 eluído se ajustó luego a
pH 6,0 con Tris 2 M a pH 8,5 y se concentró por ultrafiltración.
Se preparó un derivado de maleimida de PEG tal y
como se ha descrito previamente [Pedley et al (1994)
ibid]. Se disolvió metoxipolioxietilenamina (peso molecular
medio de aproximadamente 5000, Sigma) en tampón de fosfato de sodio
0,1 M, a pH 7,0, y se incubó con un exceso molar de 1,2 partes de
éster de N-hidroxisuccinamida del ácido
3-maleimidopropiónico durante una hora a temperatura
ambiente. La extensión de la reacción se determinó depositando gotas
de alícuotas de la mezcla de la reacción sobre una placa TLC
(Kieselgel 60), y revelándose con ninhidrina. La reacción se
consideraba terminada cuando no quedaba coloración púrpura (reacción
de la amina con la ninhidrina). El producto
PEG-maleimida se desaló usando una columna
(Pharmacia) de Sephadex G-25 (PD-10)
en agua desionizada, y liofilizada. La presencia de grupos activos
de maleimida se demostró por retrotitulación con
\beta-mercaptoetilamina.
Se desaló Fab' de hA5B7 purificado a una
concentración de aproximadamente 11 mg/ml en tampón acetato 0,1 M, a
pH 6,0, usando una columna Bio-Spin 6
(Bio-Rad). El grupo tiol de la región bisagra se
activó entonces por reducción con
\beta-mercaptoetilamina. El Fab' de hA5B7 se
incubó con \beta-mercaptoetilamina 5 mM en tampón
acetato 0,1 M a pH 6,0 durante 30 minutos a 37ºC. La muestra se
desaló después usando una columna Bio-Spin 6 en
tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0. El número de grupos tiol por molécula
de Fab' se midió por titulación con DTDP cono se ha descrito
previamente [Lyons et al., (1990) ibid]. La muestra
se incubó después durante 2,5 horas a temperatura ambiente con un
exceso molar mayor de 10 veces de maleimida-PEG
producido tal y como se ha descrito anteriormente. El Fab'
modificado por PEG se desaló después en una columna
Bio-Spin 6 en una solución salina tamponada con
fosfato a pH 6,8 y se llevó a cabo una titulación de tiol, para
asegurarse que los grupos tiol han reaccionado completamente con el
reactivo PEG-maleimida.
Se desaló Fab' de hA5B7 a aproximadamente 11
mg/ml en tampón fosfato a pH 8,0 usando una columna
Bio-Spin 6. Los tioles se introdujeron
aleatoriamente en residuos de lisina por reacción con un exceso
molar de 7 veces de 2-iminotiolano (reactivo de
Traut) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la
desalación en fosfato 0,1 M a pH 6,0 usando una columna
Bio-Spin 6, se determinó el número de grupos tiol
usando titulación con DTDP. El Fab' de hA5B7 tiolado reaccionará
después con PEG-maleimida y se desaló tal y como se
ha descrito anteriormente para la modificación específica de
sitio.
Con el fin de comparar los dos procedimientos de
unión de PEG (específica de sitio y aleatoria), se buscaron muestras
con un grado similar de modificación. Usando las condiciones
anteriormente descritas, la unión específica de sitio a la región
bisagra dio lugar a un promedio de 0,98 moléculas de PEG por
molécula de Fab', mientras que la unión aleatoria a través del
reactivo de Traut dio lugar a un promedio de 1,18 moléculas de PEG
por molécula de Fab'. El análisis por PAGE-SDS en
condiciones no reductoras (Figura 1) reveló que la banda mayor en la
muestra de Fab' de hA5B7 sin modificar (calle 1) tiene un peso
molecular esperaba de aproximadamente 50 kDa. La muestra con PEG
unido por medio de unión específica de sitio a la región bisagra
(calle 2) contiene algún Fab residual no modificado, así como otras
dos especies distintas con pesos más grandes, de los cuales el más
importante tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 66
kDa. Se detecta también una cantidad similar de Fab' residual no
modificado en la muestra modificada aleatoriamente. Se puede ver que
esta muestra es mucho más heterogénea que la muestra modificada
específica de sitio con algunas bandas discretas pero también unas
bandas de tinción difusa que cubren un intervalo de peso molecular
relativamente amplio. El tamaño exacto de proteínas modificadas por
PEG no se puede deducir a partir de esta técnica ya que se sabe que
la unión de PEG altera el correr de las bandas de proteínas en
electroforesis con las proteínas patrón. Sin embargo, se puede ver
que ambas preparaciones se han modificado con PEG y que se producen
especies moleculares diferentes en cada caso.
Con el fin de evaluar la modificación por PEG en
la actividad de Fab' de hA5B7, se llevó a cabo un ensayo cinético
por resonancia de plasmón en superficie usando un instrumento
Biacore 2000 (Pharmacia Biosensor). El ensayo se llevó a cabo por
una modificación del procedimiento anteriormente descrito [Abraham
et al., J. Immunol. Methods (1995), 183,
119-125].
Se cambió el tampón del antígeno
carcinoembrionario (ACE) (100 ml, 0,92 \mug/ml) por acetato de
sodio 0,1 M a pH 5,5 usando una columna Bio-Spin 6
(Bio-Rad). Se añadió peryodato de sodio (2 \mul,
50 mM en acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 recién preparado) y la
mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. La reacción se paró
por cambio de tampón con acetato de sodio 10 mM a pH 4,0 en una
columna Bio-Spin 6 para dar 100 ml de ACE oxidado a
aproximadamente 0,89 mg/ml. El ACE oxidado se inmovilizó después
sobre un circuito detector CM5 (Pharmacia Biosensor) usando el
procedimiento convencional de acoplamiento con aldehído descrito en
las instrucciones del fabricante. En resumen, esto requería de la
activación de la superficie por inyección de reactivo EDC/NHS (15
\mul, kit de acoplamiento a aminas, Pharmacia Biosensor) a una
velocidad de flujo de 5 \mul/min, seguido de una inyección de 35
\mul de hidrazina y luego 35 \mul de etanolamina 1 M. Después
de ésto se siguió con una inyección de 35 \mul de ACE oxidado a 5,
1, 0,2 o 0,05 \mug/ml en acetato de sodio a pH 4,0. Finalmente se
pasaron 40 \mul de cianoborohidruro de sodio 0,1 M sobre la
superficie y el circuito detector se lavó con 4 alícuotas sucesivas
de ácido clorhídrico 10 mM antes de su uso. Cada muestra de Fab' de
hA5B7 se diluyó en ocho diluciones dobles de 20 \mug/ml en tampón
HBS (Pharmacia Biosensor). Las muestras se inyectaron sobre la
superficie del ACE para observar las cinéticas de unión y
disociación. Las constantes de velocidad de asociación y de
disociación se calcularon asumiendo cinéticas de unión simples 1:1 y
aplicando las ecuaciones de velocidad no lineales suministradas con
el programa de análisis del fabricante.
Los resultados de este análisis (Tabla 1)
muestran que en este ensayo había alguna pérdida de potencia (al 56%
de los Fab' de hA5B7 no modificados) como resultado de la unión
específica de sitio en la región bisagra. Sin embargo, la unión de
un número similar de moléculas de PEG de una forma aleatoria dando
lugar a un material con solamente un 29% de inmunorreactividad. La
pérdida de potencia parece ser debido fundamentalmente debido a la
velocidad reducida de asociación, aunque también se da una velocidad
de disociación ligeramente incrementada.
Para un análisis farmacocinético se marcaron las
muestras de Fab' con ^{125}I usando el reactivo de
Bolton-Hunter por metodología estándar y se desaló
en una solución salina tamponada con fosfato a pH 6,8 para eliminar
el ^{125}I que no ha reaccionado. Se inyectaron i.v. en la vena
de la cola grupos de seis ratas Wistar macho con 20 \mug de Fab'
marcado. Se tomaron muestras de sangre a tiempos seleccionados, se
contaron en un contador gamma y se calculó el porcentaje de dosis
inyectado por gramo de sangre. Las velocidades de aclaramiento y los
valores de área bajo la curva se determinaron usando el paquete de
software SIPHAR.
Las curvas de aclaramiento para el Fab' de hA5B7
y para las dos preparaciones modificadas por PEG se muestran en la
Figura 2. De estas curvas se puede ver claramente que el
aclaramiento de Fab' modificado específico de sitio es
inesperadamente más lento que aquel del material modificado
aleatoriamente. Los parámetros farmacocinéticos calculados (Tabla 2)
muestran que la modificación con PEG disminuye aproximadamente en
dos veces la velocidad de aclaramiento de Fab' de hA5B7 en las
fases \alpha y \beta. Estas mejoras se reflejan en los valores
del área bajo la curva (ABC) que muestran un efecto importante de la
unión a PEG. La unión específica de sitio de PEG da lugar a un
incremento del ABC de aproximadamente 18 veces comparado con el de
Fab' no modificado, mientras que el PEG unido aleatoriamente da
lugar a un incremento de solamente seis veces comparado con el de
Fab' no modificado.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline \+ K _{as} (x 10 ^{4} M ^{-1} s ^{-1} ) \+ K _{dis} (x 10 ^{-4} s ^{-1} ) \+ K _{D} (nM) \+ Inmunorre- \\ \+ \+ \+ \+ actividad \\\hline Fab' no \+ 8,60 \+ 1,61 \+ 1,87 \+ 100% \\ modificado \+ \+ \+ \+ \\\hline Unión a la región \+ 5,18 \+ 1,73 \+ 3,34 \+ 56% \\ bisagra \+ \+ \+ \+ \\\hline Unión aleatoria \+ 3,26 \+ 2,12 \+ 6,50 \+ 29% \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline \+ T1/2 \alpha (h) \+ T1/2 \beta (h) \+ ABC (0- \infty ) (% de dosis x hora) \\\hline Fab' no \+ 0,33 \+ 10,0 \+ 47 \\ modificado \+ \+ \+ \\\hline Unión aleatoria \+ 0,58 \+ 22,1 \+ 293 \\\hline Unión a la región \+ 0,71 \+ 22,5 \+ 866 \\ bisagra \+ \+ \+ \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se expresó un Fab' de hTNF40 en células W3110 de
E. Coli crecidas en un fermentador de 1,5 l y un extracto
celular preparado tal y como se describe en el Ejemplo 1. El
extracto celular se diluyó a una conductividad de 3,5 S/cm, se
ajustó a pH 4,5 y se aplicó a una columna de SP Streamline®
(Pharmacia) equilibrada con tampón acetato 50 mM a pH 4,5. Después
de lavar con tampón de equilibrado se diluyó el Fab' con cloruro de
sodio 200 mM en tampón acetato 50 mM a pH 4,5. El pH del material
eluído se ajustó a 6 y el Fab' se purificó además por aplicación a
una columna de G-sepharosa de proteínas equilibrada
con PBS. Después de lavar con PBS, el Fab' se eluyó con glicina
-ácido clorhídrico 0,1 M a pH 2,7 e inmediatamente se reajustó el pH
a 6. El Fab' purificado se concentró después por ultrafiltración a
más de 10 mg/ml.
Se cambió el pH de Fab' purificado por un tampón
fosfato 0,1 M a pH 6 que contenía AEDT 2 mM. El grupo tiol de la
región bisagra se activó después por reducción con
\beta-mercaptoetilamina tal y como se describe en
el Ejemplo 1. Ésto dio lugar a una media de 1,1 grupos tiol por Fab'
tal y como se determina por valoración con DTDP. La muestra de
Fab'-PEG se produjeron luego con un PEG de 25 kDa y
uno de 40 kDa usando derivados del tipo
PEG-maleimida suministrados por Shearwater Polymers
Inc. Huntsville, AL, USA. El derivado PEG-maleimida
de 25 kDa era una única cadena de PEG unida directamente a un grupo
maleimida, y el derivado PEG-maleimida de 40 kDa se
preparó a partir de una estructura ramificada que comprende dos
cadenas de PEG de 20 kDa unidas a través de un derivado de lisina a
un grupo maleimida. El Fab' recién reducido y desalado con un exceso
molar de tres veces de PEG-maleimida de 25 kDa o un
exceso molar de nueve veces de PEG-maleimida de 40
kDa durante una noche a temperatura ambiente y los conjugados
Fab'-PEG resultantes purificados por HPLC de gel de
filtración usando una columna Zorbax GF-250,
corrieron en tampón fosfato 0,2 M a pH 7,0. Con vistas a comparar
propósitos, se preparó también un Fab' de hTNF40 modificado por PEG
con PEG de 25 kDa tal y como se describe para la unión de PEG de
5kDa a Fab' de hA5B7 en el Ejemplo 1. Se preparó un conjugado con un
promedio de 1,5 moléculas de PEG por Fab'.
Se examinaron muestras purificadas por
PAGE-SDS en condiciones no reductoras. Los
conjugados de PEG corrieron como se esperaba con una movilidad
inferior a los de Fab' no modificados y se vio que estaban libres de
Fab' (Figura 3). Además, los conjugados de tipo Fab'
modificado-PEG de la región bisagra quedaron más
definidos en PAGE-SDS que el conjugado de PEG
aleatorio.
La capacidad de los conjugados de PEG para unirse
a su antígeno, TNF, se examinó en un bioensayo L929 y se comparó con
Fab' e IgG. L929 es una línea celular de fibroblastos adherentes de
ratón la cual es sensible a la acción citotóxica de TNF en
presencia del inhibidor actinomicina D de síntesis de proteínas. Es
posible por lo tanto comparar la actividad de antagonistas de TNF,
como por ejemplo anticuerpos anti-TNF, usando esta
línea celular. Se cultivan placas de 96 pocillos sembradas con
monocapas de células L929 en 100 ng/ml de TNF humano, con 1
\mug/ml de actinomicina D durante 18 horas en medio RPMI
suplementado con glutamina. En estas condiciones mueren entre el 95
y el 100% de las células y fracasan en la adhesión al plástico del
cultivo de tejido. Las células que quedaban se fijaron después con
metanol al 100% durante 1 minuto y se tiñeron con violeta cristal al
5%. Las placas se lavaron después y las células teñidas se
disolvieron en ácido acético al 30% antes del análisis en un lector
de placas. Este experimento se llevó a cabo también con titulaciones
de muestras de anticuerpos añadidos a los pocillos al mismo tiempo
que el TNF. Los resultados se representan gráficamente cono
concentración de antagonista de TNF frente a TNF residual donde
cuanto más baja era la concentración de TNF, mayor era la
inhibición. Los anticuerpos inhibidores se pueden comparar entonces
comparando la concentración de cada uno requerida para inhibir un
90% de la actividad de TNF para dar un valor de CI90.
El anticuerpo hTNF40 y su fragmento Fab' tienen
un CI90 de 3 ng/ml en este ensayo de L929. Los resultados con ambos
conjugados de PEG de 25 y 40 kDa modificados en la región bisagra
también muestran valores de CI90 de 3 ng/ml, sugiriendo que estos
conjugados neutralizaban TNF en la misma extensión que Fab' de
hTNF40 e IgG (Figura 4). El conjugado Fab' de
hTNF40-PEG conjugado aleatoriamente era menos
potente que las preparaciones de conjugados de región bisagra con un
valor de CI90 de 10 ng/ml. Los análisis farmacocinéticos de los
conjugados se llevaron a cabo en ratas con material marcado con
^{125}I tal y se describe en el Ejemplo 1. Los resultados (Figura
5), demuestran una vida media de circulación incremetada para todos
los fragmentos de Fab' modificados por PEG comparado con los de Fab'
no modificado. La unión de moléculas de PEG más grandes en la región
bisagra incrementó la vida media de circulación en mayor medida que
las moléculas de PEG más pequeñas. Los Fab' modificados
aleatoriamente con un promedio de 1,5 moléculas de PEG de 25 kDa por
Fab' (promedio de PEG de 37,5 kDa por Fab') mostró una vida media de
circulación intermedia entre los conjugados de Fab' de la región
bisagra con PEG de 25 kDa y de 40 kDa.
En otro experimento diferente se comparó la
farmacocinética de IgG de hTNF40, Fab' y de Fab'-PEG
(25 kDa unido a la región bisagra) en ratas después de marcar con
^{111}In. Los IgG y Fab' se conjugaron con el quelante
macrocíclico 9N3 para marcar con ^{111}In tal y como se describe
[Turner et al., Br. J. Cancer 70,
35-41 (1991)]. Para el conjugado de PEG, se preparó
el conjugado Fab'-9N3 y se marcó con ^{111}In
usando el mismo procedimiento y posteriormente el PEG de 25 kDa se
unió a la región bisagra tal y como se ha descrito anteriormente. El
conjugado marcado se purificó después por HPLC de filtración en
gel. Los resultados del experimento farmacocinético en ratas con
estos conjugados marcados con ^{111}In (figura 6) demuestran de
nuevo un incremento en la vida media en la circulación para el Fab'
modificado por PEG comparado con la del Fab' no modificado con
niveles en sangre más elevados que con IgG a las 144 horas.
En este ejemplo se demuestra la aplicabilidad de
este procedimiento a fragmentos de Fab' producidos por digestión de
IgG los cuales contienen dos residuos de cisteína en la región
bisagra.
Se expresó anticuerpo completo de hTNF40 en
células NS0, se purificó por cromatografía en sepharosa de proteína
A y se produjo F(ab')_{2} por digestión con pepsina usando
técnicas convencionales. Se purificó F(ab')_{2} por
cromatografía de filtración en gel usando Sephacryl
S-200 HR. Después de cambiar el tampón por tampón
fosfato 0,1 M a pH 8 que contenía AEDT 5 mM, se redujo a Fab' por
incubación con \beta-mercaptoetilamina durante 30
minutos a 37ºC. Se añadió luego PEG-maleimida (PEG
de 25 kDa - ver Ejemplo 2) a un exceso molar de tres veces sobre la
concentración de Fab' y se dejó continuar la reacción durante una
noche. La mezcla resultante se analizó por HPLC de filtración en gel
y se encontró que contenía una mezcla de Fab' no modificado,
Fab'-PEG y de Fab'-(PEG)_{2} (Figura 7). El
material modificado por PEG se purificó por HPLC de filtración en
gel y dio lugar a una mezcla 1:2 de Fab'-PEG:
Fab'-(PEG)_{2}.
Se calculó la actividad de unión a antígeno por
ensayo de BIAcore el cual midió la afinidad para la unión a TNF. Las
muestras modificadas de Fab' o de PEG se capturaron con un
anticuerpo anti-Fab' inmovilizado y el TNF humano
pasó sobre la superficie. Luego se analizó la cinética de unión a
TNF. Los resultados sugerían que la mezcla de
Fab'-PEG y Fab'-(PEG)_{2} tenía una
afinidad de unión, K_{D}, de 0,14 nM. Ésto se comparó
favorablemente con el Fab' no modificado que tenia una K_{D} de
0,28 nM en el mismo ensayo, sugiriendo que no había pérdida de
actividad de unión a antígeno debido a la unión de PEG.
Se calculó la farmacocinética del material
purificado que contenía una mezcla de Fab'-PEG y
Fab'-(PEG)_{2} en ratas después de marcar radiactivamente
con ^{125}I. Los resultados (Figura 8) demuestran una vida media
de circulación mejorada comparada con la de
Fab'-PEG solo, el cual se había producido a partir
de material expresado en E. Coli con una única cisteína de la
región bisagra preparado tal y como se describe en el Ejemplo 2.
El anticuerpo cTN3 se expresó en células NSO, se
purificó y se digirió con pepsina para producir F(ab')_{2}
usando técnicas convencionales. Se cambió el tampón de
F(ab')_{2} purificado por tampón fosfato 0,1 M a pH 8,0
que contenía AEDT 5 mM y luego se redujo con
\beta-mercaptoetilamina 9 mM y se modificó con PEG
en la región bisagra tal y como se describe en el Ejemplo 3. Se
obtuvo una mezcla de Fab', Fab'-PEG,
Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3}. Se separaron Fab'
y Fab'-PEG de Fab'-(PEG)_{2} y
Fab'-(PEG)_{3} por HPLC de filtración en gel. La muestra
purificada de Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3}
contenía una relación 1,6:1 de
Fab'-(PEG)_{2}:Fab'-(PEG)_{3}.
El análisis de unión a antígeno de Fab',
Fab'-PEG, y Fab'-(PEG)_{2} + Fab'-
(PEG)_{3}de cTN3 se llevó a cabo a través de una variante
del bioensayo L929 descrito anteriormente. Los anticuerpos TN3 se
incubaron con TNF de ratón. En este ensayo, las IgG de cTN3 tienen
un CI90 de aproximadamente 1000 pg/ml. En el mismo ensayo, Fab' y
Fab'-PEG tienen el mismo perfil de inhibición y los
mismos valores de CI90. Por lo tanto, los resultados demostraron que
no había pérdida de función de unión a antígeno después de la
modificación por PEG (figura 9).
Se calculó la farmacocinética del material
purificado de Fab'-PEG y de una mezcla de
Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3} en ratas después
de marcar radiactivamente con ^{125}I. También se compararon en
el mismo experimento Fab' e IgG de cTN3. Los resultados (Figura 10)
demuestran un aclaramiento muy rápido para Fab' no modificado
mientras que el Fab' modificado por PEG tiene una vida media de
circulación mucho más larga. Esto se mejora además por la adición de
más PEG tal y como se ha demostrado para la muestra de
Fab'-(PEG)_{2} + Fab'- (PEG)_{3}. Esta muestra
tenía un ABC incrementada comparada con la de la IgG (Figura
10).
En los Ejemplo 5 y 6 se demuestra el uso de
reactivos tiol-selectivos alternativos:
Se ha visto que las vinilsulfonas son específicas
de grupo tiol cuando se usan a pH 8 o por debajo [Morpurgo, M. Et
al, Bioconjugate Chem. (1996), 7,
363-368]. En este Ejemplo, el PEG se une a Fab' de
un modo específico de sitio usando un derivado de vinilsulfona con
PEG de 5 kDa (Shearwater Polymers Inc. Ibid) en el que el PEG
se une directamente al grupo sulfona.
El Fab' de hTNF40 se preparó y se redujo para
generar un tiol libre de la región bisagra tal y como se describe en
el Ejemplo 2. En esta preparación resultó un promedio de 1,1 tioles
por Fab' tal y como se había determinado por titulación con DTDP.
Después de desalar en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 que contenía
AEDT 2 mM, se añadió un exceso molar de PEG-sulfona
de vinilo de 30 veces y la mezcla de reacción se incubó durante una
noche. El análisis por PAGE-SDS reveló la
conjugación de PEG con la molécula de Fab' con un rendimiento de
aproximadamente un 30% (Figura 11). El conjugado
Fab'-PEG se purificó por cromatografía de
interacción hidrofóbica usando una columna HP Hi Trap de
fenilsepharosa (Pharmacia). La mezcla de entrecruzamiento se llevó a
1,5 M con respecto al sulfato de amonio y se cargó en una columna HP
de fenilsepharosa pre-equilibrada con tampón fosfato
50 mM a pH 7,0 que contenía sulfato de amonio 1,5 M. Se eluyó el
conjugado Fab'-PEG usando un gradiente lineal de
volumen de columna 50 a fosfato 50 mM a pH 7. La afinidad de unión a
antígeno se comparó con la de Fab' no modificado por análisis
BIAcore tal y como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de
este análisis (Tabla 3) demostró la no pérdida de actividad de
unión a antígeno a través de la conjugación de PEG por medio del
reactivo de vinilsulfona ya que la afinidad de unión del conjugado
Fab'-PEG era similar a la de IgG.
En este Ejemplo, el PEG se une de un modo
específico de sitio a Fab' usando un derivado de yodoacetamida con
PEG de 5 kDa (Shearwater Polymers Inc. Ibid) en el que el PEG
se une directamente al grupo acetamida.
El Fab' de hTNF40-PEG se preparó
y se purificó tal y como se describe en el Ejemplo 5 usando un
exceso molar de PEG-yodoacetamida de 30 veces. La
afinidad para unión a antígeno del producto se comparó con la de
Fab' no modificado por análisis BIAcore como se describe en el
Ejemplo 3. Los resultados de este análisis (Tabla 3) demostró la no
pérdida de actividad de unión a antígeno a través de la conjugación
de PEG por medio del reactivo de yodoacetamida ya que la afinidad de
unión del conjugado Fab'-PEG era similar a la de
IgG.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline \+ kas \+ kdis \+ Kd (M) \\\hline IgG convencional \+ 4,41x10 ^{5} \+ 6,90x10 ^{-5} \+ 1,56x10 ^{-10} \\\hline Fab'-PEG (40 kDa) de PEG- \+ 4,29x10 ^{5} \+ 7,87x10 ^{-5} \+ 1,84x10 ^{-10} \\ maleimida (Ejemplo 3) \+ \+ \+ \\\hline Fab'-PEG (5 kDa) de PEG- \+ 3,69x10 ^{5} \+ 4,74x10 ^{-5} \+ 1,29x10 ^{-10} \\ vinilsulfona (Ejemplo 5) \+ \+ \+ \\\hline Fab'-PEG (5 kDa) de PEG- \+ 3,85x10 ^{5} \+ 5,88x10 ^{-5} \+ 1,53x10 ^{-10} \\ yodoacetamida (Ejemplo 6) \+ \+ \+ \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
En este ejemplo, la aplicación de unión
específica de sitio de PEG se demuestra con fragmento Fab'
recombinante adicional.
Se expresó un Fab' de anticuerpo humano
modificado hg162, el cual reconoce el receptor de PDGF\beta en
E. Coli tal y como se describe para el fragmento de Fab' de
hTNF40 (ver Ejemplo 2). Las células se recuperaron del cultivo de
fermenteación por centrifugación y se extrajo el Fab' resuspendiendo
las células en tris 100 mM a pH 7,4 que contenía AEDT 10 mM e
incubando a 60ºC durante una noche. Se purificó entonces el Fab' por
cromatografía de lecho expandido usando una columna de Streamline A™
(Pharmacia) la cual se pre-equilibró con
glicina/glicinato 1 M a pH 8,0. La muestra se llevó a 1 M respecto
a la glicina y el pH se ajustó a 7,5 con glicinato de sodio al 50%
(peso/volumen) antes de la aplicación a la columna en modo de lecho
expandido. Después de lavar con un tampón de equilibración, el
material de la columna se empaquetó en forma de lecho empaquetado y
se eluyó Fab' con citrato 0,1 M a pH 3,0.
Se alcanzó una purificación adicional ajustando
el pH del eluato a 7,5 con tris 2 M y aplicándolo a una columna de
sepharosa de Proteína G pre-equilibrada con solución
salina tamponada con fosfato a pH 7,4. después de lavar con tampón
de equilibración, se eluyó el fab' con glicina-HCl a
pH 2,7. El pH del Fab' eluído se ajustó después a 6,0 con tris
2M.
El Fab' de anti-PDGF\betaR se
diafiltró en tampón fosfato 0,1 M, a pH 6,0 que contenía AEDT 2 mM.
El tiol de la región bisagra se activó por reducción con
\beta-mercaptoetilamina. El Fab' se incubó con
\beta-mercaptoetilamina 5 mM en tampón fosfato
0,1, a pH 6,0 que contenía AEDT 2 mM durante 30 minutos a 37ºC. La
muestra se desaló en tampón fosfato 0,1 M, a pH 6,0 que contenía
AEDT 2 mM usando columnas de Sephadex G-25 (PD10).
El número de grupos tiol por molécula de Fab' se midió por
titulación con DTDP, y se encontró que era 1,08. Se añadió después
PEG-maleimida (40 kDa, ver Ejemplo 2) en un exceso
molar de tres veces y se dejó reaccionar durante una noche. La
conversión a Fab'-PEG se alcanzó con un rendimiento
de aproximadamente un 60% (Figura 12). El conjugado
Fab'-PEG se purificó después por HPLC de filtración
en gel tal y como se describe en el Ejemplo2.
La afinidad de unión a antígeno de Fab' de
anti-PDGF\betaR-PEG se comparó con
la de Fab' no modificado por análisis BIAcore. El análisis cinético
para determinar las velocidades de unión de Fab' de
anti-PDGF\betaR-PEG a PDGF\betaR
se llevó a cabo usando un BIACORE 2000 (Biacore AB). Una molécula de
fusión de Fc de IgG de ratón-PDGF\betaR fue
capturada por una IgG anti-ratón inmovilizada en la
superficie del circuito detector. A esto le siguió una inyección de
Fab' de anti-PDGF\betaR-PEG. El
fragmento F(ab')_{2} de IgG de cabra
anti-ratón purificado por afinidad específico del
fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch), se inmovolizó sobre un
Circuito Detector CM5 por medio de química de acoplamiento de
aminasa un nivel de 11500 RU. Se preparó una superficie virgen
siguiendo el procedimiento de inmovilización pero omitiendo la
inyección de la molécula capturada. Se usó tampón HBS (HEPES 10 mM a
pH 7,4, NaCl 0,15 M, AEDT 3 mM, Agente Tensoactivo P20 al 0,005%,
Biacore AB) como tampón de elución con una velocidad de flujo de 10
\mul/min. Una inyección de Fc de IgG de ratón- PDGF\betaR
expresado en el sobrenadante de células COS recombinantes se capturó
por medio de una IgG anti-ratón inmovilizada a un
nivel entre 200 y 259 RU. Las moléculas de Fab' de
anti-PDGF\betaR o Fab'-PEG se
titularon sobre la superficie de Fc de PDGF\betaR de IgG de 2
PDGF\betaR a 0,52 mg/ml. Las superficies se generaron inyectando
10 ml de ácido clorhídrico 30 mM. Las inyecciones de Fc de IgG de
ratón- PDGF\betaR y cada concentración de Fab' de
anti-PDGF\betaR o Fab'-PEG se
repitieron sobre la superficie virgen en forma de controles. El
sensograma para cada concentración de Fab' de anti- PDGF\betaR o
Fab'-PEG resultó correcta de acuerdo con el
correspondiente sensograma para la superficie virgen después de la
eliminación de la inyección de Fc de
IgG-PDGF\betaR y de la etapa de regeneración. Los
parámetros cinéticos se calcularon usando un software BIAevaluation
2,1.
Los resultados para Fab' y
Fab'-PEG se muestran en la Tabla 4. Había poca
diferencia en los valores de los parámetros cinéticos determinados,
demostrando que la unión de PEG a la región bisagra ha dado lugar a
muy poca pérdida de afinidad de unión a antígeno.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline \+ kas \+ kdis \+ Kd (M) \\\hline Fab' \+ 6,89x10 ^{6} \+ 2,52x10 ^{-3} \+ 3,66x10 ^{-10} \\\hline Fab'-PEG \+ 4,45x10 ^{6} \+ 2,77x10 ^{-3} \+ 6,22x10 ^{-10} \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La farmacocinétia de Fab' de
anti-PDGF\betaR y de Fab'-PEG se
examinaron en un experimento con ratas usando muestras marcadas con
^{125}I tal y como se describe en el ejemplo 1. los resultados
demostraron un aclaramiento mucho más lento de la sangre para
Fab'-PEG comparado con el de Fab' (Figura 13). Esto
se reflejó en los cálculos de los parámetros farmacocinéticos
mostrados en la Tabla 5.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline \+ T1/2 \alpha (horas) \+ T1/2 \beta (horas) \+ ABC (0- \infty )(% \+ AUC (% \\ \+ \+ \+ de dosis x h) \+ valor de IgG) \\\hline IgG \+ 5,3 +/- 1,3 \+ 95,9 +/- 10,9 \+ 6442 +/- 525 \+ 100 \\\hline Fab' \+ 0,35 +/- 0,01 \+ 20,3 +/- 6,0 \+ 90 +/- 12 \+ 1,4 \\\hline Fab'-PEG (40 \+ 8,9 +/- 4,7 \+ 49,1 +/- 4,8 \+ 5890 +/- 1296 \+ 91 \\ kDa) \+ \+ \+ \+ \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Claims (6)
1. Un fragmento de anticuerpo monovalente
modificado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en
el que:
dicha cadena pesada consta de un dominio V_{H}
unido covalentemente en su C- terminal a un dominio C_{H}1;
dicha cadena ligera consta de un dominio V_{L},
el cual es complementario al dominio V_{H}, unido covalentemente
en su C-terminal a un dominio C_{L};
dicho dominio C_{H}1 se extiende para
proporcionar un dominio bisagra, el cual contiene solamente un
residuo de cisteína;
los residuos de cisteína en los dominios V_{H},
C_{H}1, V_{L} y C_{L} se unen por enlace disulfuro entre
ellos; y
el residuo de cisteína en el dominio bisagra se
une covalentemente a una molécula de polímero a través de su átomo
de azufre.
2. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el polímero es un polímero de
polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal
o ramificada opcionalmente sustituidos, o un polisacárido no
ramificado.
3. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el polímero es un
poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o
poli(vinilalcohol) de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituidos o uno de sus derivados.
4. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que el polímero es
metoxi(polietilenglicol) o uno de sus derivados.
5. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 unido covalentemente a una
o más moléculas efectoras o informadoras.
6. Una composición farmacéutica que comprende un
fragmento de anticuerpo monovalente de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores junto con uno o más excipientes,
diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
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