ES2197373T3 - Fragmentos de anticuerpos monovalentes. - Google Patents

Fragmentos de anticuerpos monovalentes.

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ES2197373T3 ES97947810T ES97947810T ES2197373T3 ES 2197373 T3 ES2197373 T3 ES 2197373T3 ES 97947810 T ES97947810 T ES 97947810T ES 97947810 T ES97947810 T ES 97947810T ES 2197373 T3 ES2197373 T3 ES 2197373T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS MONOVALENTES. CADA UNO DE ESTOS FRAGMENTOS TIENE UNA O VARIAS MOLECULAS POLIMERAS UNIDAS ESPECIFICAMENTE A UN SITIO POR UN ATOMO DE AZUFRE DE UN RESIDUO CISTEICO SITUADO FUERA DEL CAMPO DE LA REGION VARIABLE DEL ANTICUERPO. LOS POLIMEROS INCLUYEN POLIMEROS SINTETICOS O NATURALES, COMO POR EJEMPLO LOS POLIALQUILENOS, LOS POLIALQUENILENOS, LOS POLIOXIALQUILENOS O LOS POLISACARIDOS. CADA UNO DE ESTOS FRAGMENTOS PUEDE FIJARSE A UNA O VARIAS MOLECULAS DE MARCADO O MOLECULAS EFECTORAS, Y SE USA EN LA TERAPIA O EN LOS DIAGNOSTICOS DONDE EL FRAGMENTO HA MEJORADO NOTABLEMENTE LA FIJACION Y/O LAS PROPIEDADES FARMACOCINETICAS COMPARATIVAMENTE A OTROS FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS QUE TIENEN EL MISMO NUMERO Y TIPO DE MOLECULAS POLIMERAS, PERO EN LOS CUALES LAS MOLECULAS POLIMERAS SE FIJAN DE UN MODO ALEATORIO.

Description

Fragmentos de anticuerpos monovalentes.
La invención se refiere a fragmentos de anticuerpo monovalente modificados, a sus procedimientos de preparación, a composiciones que los contienen y a su uso en medicina.
Se ha producido un aumento en el uso de anticuerpos usados a nivel clínico para propósitos de diagnóstico y terapéuticos. El objetivo, en cada caso es aprovechar la combinación de la elevada especificidad y afinidad de la interacción antígeno-anticuerpo, para permitir la detección y/o el tratamiento de una lesión particular. El anticuerpo se usa solo, o se carga con otro átomo o molécula como por ejemplo un radiosiótopo o un fármaco citotóxico.
La farmacocinética y la biodistribución de un anticuerpo juegan un papel principal en la determinación de si tendrá éxito su uso en el ámbito clínico. Por lo tanto, el anticuerpo debe poder administrarse en el punto de acción y permanecer retenido allí durante un periodo de tiempo adecuado para lograr su propósito. También debe estar presente sólo a nivel subtóxico en los lugares fuera de la diana y se debe catabolizar de manera bien definida.
Para diversos usos la farmacocinética de los anticuerpos no es adecuada. Esto es especialmente verdad para el diagnóstico de tumores y la terapia con anticuerpo-radioisótopo o conjugados de fármacos. Para diagnóstico con dichos conjugados las vidas medias altas limitan la razón de tumor a señal de fondo y por lo tanto, la sensibilidad de detección de la lesión. Para terapia, una vida media alta conduce a una exposición a largo plazo de tejidos normales al conjugado de anticuerpo y, por lo tanto, la toxicidad limitada por la dosis.
Hay disponible una gran variedad de enfoques para manipular la farmacocinética de los anticuerpos, y estos suelen afectar sólo a su biodistribución. El enfoque más simple y más generalmente aplicable es el uso de fragmentos de anticuerpo. Éstos se pueden purificar más rápido del torrente circulatorio que los anticuerpos completos y se distribuyen más rápidamente de la sangre a los tejidos, lo cual es un particular ventaja en algunas aplicaciones, por ejemplo, para detección y terapia de tumores mediante imágenes.
Para mejorar aún más la farmacocinética de los fragmentos de anticuerpo hemos investigado el uso de polímeros. La unión de materiales poliméricos como por ejemplo polietilenglicol (PEG) a moléculas de proteínas está bien establecida y se ha demostrado que la unión de un polímero puede alterar sustancialmente las propiedades farmacológicas de una molécula de proteína. Por ejemplo, la modificación de proteínas con PEG puede alterar in vivo la vida media en circulación de la proteína, la antigenicidad e inmunogenicidad, solubilidad, estabilidad mecánica y resistencia a proteolisis [Abuchowski, A. et al J. Biol. Chem (1977) 252, 3578-3581 y 3582-3586; Nucci, M. L. et al, Adv. Drug Delivery Reviews (1991) 6, 133-151; Francis, G. et al, Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R.T. ed.); y Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization (1991) pp 235-263 (Ahem, T. J y Manning, M., ed.s) Plenum, New York].
La unión de PEG a moléculas de proteína se ha logrado usando diferentes procedimientos químicos, la mayoría de los cuales unen el PEG a residuos de lisina u otros residuos de aminoácidos sobre la superficie de la proteína de manera aleatoria [Zalipsky, S. & Lee, C. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (1992) pp 347-370 (Harris, J.M., ed), Plenum, New York]. Esto suele conducir a la deficiencia parcial de la función de la proteína, por ejemplo, se reduce la actividad catalítica de las enzimas [Nucci, M.L. et al ibid].
Se ha informado sobre las modificaciones de proteínas en un punto específico para introducir puntos para la unión de PEG. La interleucina-2, por ejemplo, se ha modificado por mutagénesis para sustituir un residuo de treonina que normalmente está glicosilado por una cisteína para permitir la unión de PEG, [Goodson, R.J. & Katre, N.V. Bio/Techlogy (1990) 8, 343-346]. Se eligió un sitio que normalmente está glicosilado como éste porque se creyó que era capaz de tolerar la modificación por PEG sin perturbar la estructura de la proteína. En otro ejemplo, la enzima purina nucleósido fosforilasa se ha modificado para reemplazar selectivamente residuos de arginina con lisinas para proporcionar en este caso hasta dieciocho sitios potenciales de unión de PEG por molécula de enzima [Hershefield, M.S. et al P. N.A.S. (1991), 88, 7185-7189].
Estudios previos con anticuerpos y fragmentos de anticuerpos han usado unión aleatoria de PEG mediante residuos de lisina [por ejemplo, Ling, T. G. I. & Mattiasson, B. J. Immunol. Methods (1983), 59, 327-337; Wilkinson, I. et al Immunol. Letters (1987) 15, 17-22; Kitamura, K. et al Cancer Res. (1991), 51, 4310-4315; Delgado, C. et al Br. J. Cancer (1996), 73, 175-182] y derivados tiolados [Pedley, R.B. et al Br. J. Cancer (1994), 70, 1126-1130]. La unión aleatoria a menudo da como resultado anticuerpos modificados que solo son capaces de unirse a su antígeno diana con afinidad, avidez o especificidad reducidas. En un intento de superar esto, los residuos de lisina críticos en los bucles de unión del antígeno (CDR) se han sustituido con argininas para permitir la modificación con menos pérdida de inmunoreactividad [Benhar, I. et al Bioconjugate Chemistry (1994) 5, 321-326].
Los puntos específicos en las regiones constantes y bisagra de anticuerpos se pueden organizar para permitir la unión a un punto específico de un intervalo de moléculas efectoras e informadoras [Lyons, A. et al Prot. Eng. (1990), 3, 703-709; y las solicitudes de patente europea nº 348442 y 347433]. Ahora hemos determinado que los que la unión a un punto específico de polímeros a fragmentos de anticuerpo monovalentes se puede usar para evitar la pérdida de inmunorreactividad asociada anteriormente con procedimientos de unión aleatoria. Además, los fragmentos modificados de esta manera han mejorado visiblemente la unión y/o las propiedades farmacocinéticas cuando se comparan con fragmentos que se han modificado aleatoriamente con el mismo número y tipo de moléculas poliméricas.
Por lo tanto, según un aspecto de la invención proporcionamos un fragmento de anticuerpo monovalente que comprende un fragmento de anticuerpo monovalente y al menos una molécula polimérica en unión covalente que se caracteriza porque cada residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo fuera del dominio de la región variable del fragmento se une covalentemente mediante su átomo de azufre a una molécula polimérica o forma una unión disulfuro con un segundo residuo de cisteína localizado en el fragmento con tal que al menos uno de dichos residuos de cisteína se una a una molécula polimérica.
El fragmento de anticuerpo modificado según la invención es, esencialmente, un fragmento de anticuerpo monovalente unido covalentemente a una o más, por ejemplo, una, dos o tres moléculas poliméricas mediante uno o más, por ejemplo, uno, dos o tres residuos de cisteína localizados en el fragmento fuera de su dominio de la región variable. El fragmento puede tener, adicionalmente, una o más moléculas efectoras o informadoras unidas covalentemente al mismo, según se describe posteriormente en la presente memoria descriptiva.
El fragmento de anticuerpo modificado de la invención puede ser capaz, en general, de unirse selectivamente a un antígeno. El antígeno puede ser cualquier antígeno asociado a una células, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, como por ejemplo un linfocito T, una célula del endotelio o un marcador de célula tumoral, o puede ser un antígeno soluble. Ejemplos particulares de antígenos de la superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo integrinas como por ejemplo integrinas \beta1, por ejemplo VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, antígeno carcinoembrionario (CEA), glubulina de la grasa láctea humana (HMFG1 y 2), antígenos MHC de clase I y II, y VEGF, y cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Los antígenos solubles incluyen interleucinas como por ejemplo IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 o IL-12, agentes víricos, por ejemplo, el virus respiratorio sincitial o antígenos de citomegalovirus, inmunoglubulinas, como por ejemplo IgE, interferones como por ejemplo el interferón \alpha el interferón \beta o el interferón \gamma, el factor \alpha de necrosis tumoral, el factor \beta de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonia como por ejemplo G-CSF o GM-CSF y factores de crecimiento derivados de plaquetas como por ejemplo PDGF-\alpha y PDGF- \beta y, cuando sea apropiado, los receptores de los mismos.
El término dominio de la región variable según se usa en la presente memoria descriptiva en relación con el fragmento según la invención pretende significar la parte del fragmento de anticuerpo que contiene el punto de unión al antígeno. El dominio de región variable puede tener cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprende, en general, al menos una secuencia de aminoácidos hipervariable responsable de la unión al antígeno embebida en una secuencia marco conservada. En términos generales el dominio de la región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de la cadena pesada (VH) o ligera (VL) de la inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, el dominio de la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL siendo estos capaces de unirse independientemente al antígeno con afinidad aceptable. Alternativamente, el dominio de la región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL y VL-VL en los que las cadenas VH y VL se asocian de manera no covalente. Sin embargo, cuando se desee, las cadenas se pueden acoplar directamente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables o mediante un conector, por ejemplo, un conector peptídico, para formar un dominio de cadena sencilla.
El dominio de la región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión del mismo sometida a estudio técnico. Por versión sometida a estudio técnico se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones sometidas a estudio técnico incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos naturales mediante inserciones, deleciones o cambios en o hacia las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Ejemplos particulares de este tipo incluyen los dominios de la región variable sometidos a estudio técnico que contienen, al menos, un CDR y, opcionalmente, uno o más aminoácidos marco conservados de un anticuerpo y el resto del dominio de la región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de la región variable generalmente está unido de manera covalente a al menos un residuo de cisteína o en particular dos o tres residuos de cisteína cada uno unido covalentemente mediante su átomo de azufre a una molécula polimérica.
La localización de cada residuo de cisteína se puede variar de acuerdo con el tamaño y la naturaleza del fragmento de anticuerpo requerido. Por lo tanto, en un ejemplo extremo, un residuo de cisteína unido mediante su átomo de azufre a un polímero se puede unir directamente a un aminoácido C-terminal del dominio de la región variable. Este puede ser, por ejemplo, el C-terminal de la cadena VH o VL según se ha descrito anteriormente. Si se desea, en este ejemplo, se pueden unir covalentemente más aminoácidos, incluyendo más polímeros unidos a cisteína, al C-terminal del primer residuo de cisteína.
En la práctica, sin embargo, es preferible, en general, que el dominio de la región variable se una covalentemente por el aminoácido C-terminal a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo que contiene, o está unido o uno, dos, tres o más residuos de cisteína, cada uno unido covalentemente mediante su átomo de azufre a una molécula polimérica. Por lo tanto, por ejemplo, cuando haya presente un dominio VH en el dominio de la región variable se puede unir a un dominio CH1 de inmunoglobulina o a un fragmento del mismo. De manera similar, un dominio VL se puede unir a un dominio CK o a un fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, el fragmento según la invención puede ser un fragmento Fab en el que el dominio de unión a antígeno contiene dominios VH y VL asociados unidos covalentemente por su C-terminal al dominio CH1 y CK, respectivamente. El dominio CH1 puede prolongarse con más aminoácidos, por ejemplo, para proporcionar un dominio de región bisagra según se encuentra en un fragmento Fab, o para proporcionar más dominios, como por ejemplo los dominios de anticuerpo CH2 y CH3. En cada uno de los casos anteriores uno o más, por ejemplo, uno, dos o tres residuos de cisteína, cada uno unido a una molécula polimérica, se pueden localizar en cualquier punto en cualquier dominio.
La molécula polimérica en el fragmento según la invención puede ser, en general, un polímero de origen natural o sintético, por ejemplo, un polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, o un polisacárido ramificado o no, por ejemplo, un homo- o heteropolisacárido.
Los sustituyentes opcionales particulares que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi. Ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o poli(vinilalcohol) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, y derivados de los mismo, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido como por ejemplo metoxi(polietilenglicol) y sus derivados. Los polímeros de origen natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano o glicerina y sus derivados. El término ``derivados'' según se usa en la presente memoria descriptiva pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo, los grupos reactivos selectivos para tiol como por ejemplo maleimidas y similares. El grupo reactivo se puede unir directamente o mediante un segmento de unión al polímero. Debe entenderse que el residuo de dicho grupo en algunos casos forma parte del producto de la invención como el grupo de unión entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero se puede variar según se desee, pero en general está en el intervalo de peso molecular de aproximadamente 500 kDa a aproximadamente 50000 Da, por ejemplo, de 5000 a 40000 Da e incluyendo 25000 a 40000 Da. El tamaño del polímero se puede seleccionar, en particular, según el uso pretendido para el producto. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se pretende que el producto salga del torrente circulatorio y penetre en el tejido, por ejemplo para usarlo en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de pequeño peso molecular, por ejemplo, de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en el torrente circulatorio puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo, en el intervalo de 25000 Da a 40000 Da.
Tal y como se ha explicado anteriormente, cada molécula de polímero en el fragmento de anticuerpo modificado según la invención se une covalentemente a un átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. La unión covalente es, en general, un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono.
Los fragmentos particularmente útiles según la invención son aquellos en los que dos o especialmente tres residuos de cisteína localizados en el fragmento fuera del dominio de la región variable están unidos covalentemente, cada uno de ellos, mediante su átomo de azufre a una molécula polimérica, distinta del residuo de cisteína localizado en el fragmento fuera del dominio de la región variable y están en unión disulfuro con un segundo residuo de cisteína localizado en el fragmento. En estos fragmentos particulares el polímero puede ser, especialmente, un polímero sintético, particularmente un polímero de polialquileno como por ejemplo poli(etilenglicol) o especialmente metoxi(etilenglicol) o un derivado del mismo y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 25000 Da a aproximadamente 40000 Da.
Cuando se desee, el fragmento de anticuerpo según la invención pueden ser una o más moléculas efectoras o informadoras unidas al mismo y la invención incluye dichos anticuerpos modificados. Las moléculas efectoras o informadoras pueden estar unidas al fragmento de anticuerpo mediante cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional aminoácido terminal localizado en el fragmento, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, hidroxilo o carboxilo.
Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo, agentes antineoplásicos, toxinas (como por ejemplo toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de las mismas, por ejemplo, ricino y fragmentos del mismo), proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionucleidos y metales quelados. Los grupos informadores adecuados incluyen metales quelados, compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por RMN o espectroscopía ESR.
Los agentes antineoplásicos particulares incluyen agentes citotóxicos y citostáticos, por ejemplo, agentes de alquilación, como por ejemplo mostazas nitrogenadas (por ejemplo, mostaza de clorambucilo, melfalano, mecloretamina, ciclofosfamida o uracilo) y derivados de los mismos, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfano o cisplatina; antimetabolitos; como por ejemplo metotrexato, fluororacilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos como por ejemplo bleomicinas (por ejemplo, sulfato de bleomicina), doxorubicina, daunorubicina, mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C), actinomicinas (por ejemplo, dactinomicina), plicamicina, calicaemicina y derivados de las mismas o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, como por ejemplo etoposida, vincristina o vinblastina y derivados de las mismas; alcaloides, como por ejemplo elipticina; polioles como por ejemplo taxicina-I o taxicina-II; hormonas, como por ejemplo andrógenos (por ejemplo, dromostanolona o testolactona), estrógenos (por ejemplo, diosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno); antraquinonas, como por ejemplo mitoxantrona; ureas, como por ejemplo hidroxiurea; hidracinas, como por ejemplo procarbazina; o imidazoles, como por ejemplo dacarbazina.
Los grupos efectores particularmente útiles son calicaemicina y sus derivados (véase, por ejemplo, las solicitudes de patente sudafricanas nº 85/8794, 88/8127 y 90/2839).
Los metales quelados incluyen quelatos de metales di- o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8 inclusive. Ejemplos particulares de dichos metales incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general el metal es, preferiblemente, un radionucleido. Los radionucleidos particulares incluyen ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{58}Co, ^{60}Co, ^{67}Cu, ^{195}Au, ^{199}Au, ^{110}Ag, ^{203}Pb, ^{206}Bi, ^{207}Bi, ^{111}In, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{88}Y, ^{90}Y, ^{160}Tb, ^{153}Gd y ^{47}Sc.
El metal quelado puede ser por ejemplo uno de los tipos de metales quelados anteriores con cualquier agente quelante polidentado, por ejemplo poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres, (por ejemplo, éteres corona y derivados de los mismos); poliamidas; porfirinas; y derivados carbocíclicos.
En general, el tipo de agente quelante depende del metal que se use. Un grupo particularmente preferido de agentes quelantes en conjugados de acuerdo con la invención, sin embargo, son poliaminas acíclicas o cíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo ácido dietilentriaminaopentacético y derivados del mismo, y aminas macrocíclicas, por ejemplo, derivados cíclicos tri-aza y tetra-aza (por ejemplo, tal y como se describe en la solicitud de la patente internacional nº WO 92/22583); y poliaminas, especialmente desferrioxamina y derivados de la misma.
El fragmento de anticuerpo modificado de acuerdo con la invención se puede preparar haciendo reaccionar un fragmento de anticuerpo que contiene al menos un residuo de cisteína reactivo con un polímero activado tiol-selectivo. La reacción se puede llevar a cabo generalmente en un disolvente, por ejemplo una disolución acuosa de tampón como por ejemplo un tampón de acetato o de fosfato, a aproximadamente pH neutro, por ejemplo un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0, por ejemplo a temperatura ambiente. El polímero activado se empleará generalmente en una concentración en exceso relacionada con la concentración del fragmento de anticuerpo. En algunos casos puede ser necesario reducir el material de partida de anticuerpo con un reactivo como por ejemplo \beta-mercaptoetilamina (por ejemplo, tal y como se describe del Ejemplo 1 en adelante), para generar un residuo de cisteína reactivo apropiado. Donde sea necesario, el producto deseado que contiene el número deseado de moléculas de polímero se puede separar de cualquier otro producto generado durante el procedimiento de producción y que contenga un número no deseado de moléculas de polímero por medios convencionales, por ejemplo, por cromatografía.
El material de partida de fragmentos de anticuerpos se puede obtener a partir de cualquier anticuerpo completo, especialmente un anticuerpo monoclonal completo, [preparado por inmunización convencional y procedimientos de fusión de células], usando cualquier técnica de ruptura enzimática convencional y/o digestión, por ejemplo por tratamiento con pepsina. De forma alternativa, el material de partida de anticuerpos se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante que conlleva la manipulación y re-expresión de ADN que codifica regiones variables y/o constantes del anticuerpo. Tal ADN se conoce y/o está disponible fácilmente a partir de bibliotecas de ADN que incluyen por ejemplo bibliotecas de anticuerpos de fagos [ver Chiswell, D. J. y McCafferty, J. Tibtech. 10 80-84 (1992)] o se puede sintetizar donde se desee. Los procedimientos convencionales de biología molecular y/o químicos se pueden usar para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear residuos de cisteína, para modificar, añadir o delecionar de la forma que se desee otros aminoácidos o dominios.
Desde aquí, se pueden preparar y usar uno o más vectores de expresión replicables que contienen el ADN para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular que no produce mieloma, como por ejemplo una línea NSO de ratón o una bacteriana, por ejemplo, una línea de E. coli, en la que se dará la producción del anticuerpo. Para obtener una transcripción y traducción eficaces, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y una secuencia líder unidos de forma eficaz a la secuencia del dominio variable. Los procedimientos particulares para producir anticuerpos de esta forma son bien conocidos generalmente y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, los procedimientos básicos de biología molecular se describen en Maniatis et al [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]; la secuenciación se puede llevar a cabo tal y como se describe en Sanger et al [PNAS 74, 5463, (1997)] y el manual de secuenciación de Amersham International plc; y la mutagénesis dirigida de sitio se puede llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento de Kramer et al [Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)] y el manual de Anglian Biotechnology Ltd. De forma adicional, existen numerosas publicaciones, incluyendo especificaciones de patentes, detallando técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos por manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación de células adecuadas, por ejemplo, tal y como se ha revisado en Mountain A. Y Adair, J. R. En Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [ed. Tombs, M. P., 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, UK] y en la solicitud de la patente internacional nº WO 91/09967.
El material polimérico activado de partida para uso en la preparación de fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención puede ser cualquier polímero que contenga un grupo tiol reactivo, como por ejemplo un ácido o éster \alpha-halocarboxílico, por ejemplo yodoacetamida, una imida, por ejemplo malimida, una sulfona de vinilo o un disulfuro. Tales materiales de partida se pueden obtener comercialmente (por ejemplo de Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) o se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando procedimientos químicos convencionales, por ejemplo tal y como se describe en Zalipsky, S. & Lee, C, ibid, y en los ejemplos de aquí en adelante.
Donde se desee obtener un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención unido a una molécula efectora o informadora, ésta se puede preparar por procedimientos convencionales químicos o de ADN recombinante en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o por medio de un agente de acoplamiento a la molécula efectora o informadora antes o después de la reacción con el polímero activado de la forma adecuada. Procedimientos químicos particulares incluyen por ejemplo aquellos descritos en las solicitudes de patente internacional nºs WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 y WO 89/01476. De forma alternativa, cuando la molécula efectora o informadora es una proteína o polipéptido la unión se puede alcanzar usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo tal y como se describe en la solicitud de la patente internacional nº WO 86/01533 y en la solicitud de la patente europea nº 392745.
El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser útil en la detección o tratamiento de varias enfermedades o trastornos. Tales enfermedades o trastornos pueden incluir aquellos descritos en los encabezamientos de una enfermedad infecciosa, por ejemplo, una infección viral; enfermedad inflamatoria/autoinmunidad, por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino; cáncer; enfermedad alérgica/atópica, por ejemplo asma, eccema; enfermedad congénita, por ejemplo, fibrosis cística, anemia drepanocítica; enfermedad dermatológica, por ejemplo, psoriasis; enfermedad neurológica, por ejemplo, esclerosis múltiple; transplantes, por ejemplo, rechazo al transplante de órganos, enfermedad de injerto contra huésped; y enfermedad metabólica/idiopática, por ejemplo, diabetes.
Los fragmentos de anticuerpos modificados de acuerdo con la invención se pueden formular para uso en terapia y/o diagnóstico y de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, proporcionamos una composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo monovalente modificado que comprende un fragmento de anticuerpo monovalente modificado y al menos una molécula de polímero con unión covalente caracterizado por que cada unión covalente es a través de un átomo de sulfuro de un residuo de cisteína situado en la parte de fuera del fragmento del anticuerpo del dominio de la región variable del fragmento, junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Tal y como se ha explicado anteriormente, el fragmento de anticuerpo modificado en este aspecto de la invención se puede unir opcionalmente a uno o más grupos efectores o informadores.
La composición farmacéutica puede tomar cualquier forma adecuada de administración, y, preferiblemente en una forma adecuada para administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, por ejemplo por inyección de bolus o infusión continua. Cuando la composición es por inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o de dispersión.
De forma alternativa, la composición de anticuerpos puede ser en forma seca, para reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.
Si la composición de anticuerpos es adecuada para administración oral, la formulación puede contener, además de un ingrediente activo, aditivos como por ejemplo: almidón, por ejemplo, almidón de patata, de maíz o de trigo, o celulosa, o derivados de almidón como por ejemplo, celulosa microcristalina; sílice; varios azúcares como por ejemplo la lactosa; carbonato de magnesio y/o fosfato de calcio. Es deseable que, si la formulación es para administración oral será bien tolerada por el sistema digestivo del paciente. A este final, puede ser deseable incluir formadores de mucosidad y resinas en la formulación. Puede ser deseable también mejorar la tolerancia formulando el anticuerpo en una cápsula la cual es insoluble en los jugos gástricos. Puede ser preferible incluir también el anticuerpo o la composición en una formulación de libración controlada.
Si la composición de anticuerpos es adecuada para la administración rectal, puede contener un agente aglutinante y/o lubricante; por ejemplo glicoles poliméricos, gelatinas, mantequilla de cacao de u otras ceras o grasas vegetales.
Los usos terapéuticos y diagnósticos de fragmentos de acuerdo con la invención comprenden típicamente administrar una cantidad efectiva del fragmento de anticuerpo a un sujeto humano. La cantidad exacta que hay que administrar variará de acuerdo con el uso de un anticuerpo y con la edad, sexo y condición del paciente, pero se puede variar típicamente de aproximadamente 0,1 mg a 1000 mg, por ejemplo de aproximadamente 1 mg a 500 mg. El anticuerpo se puede administrar en forma de dosis única o de manera continua durante un período de tiempo. Las dosis se pueden repetir de forma que sea adecuado. Las dosis típicas pueden estar por ejemplo entre 0,1 y 50 mg/kg de peso corporal por una sola dosis terapéutica, particularmente entre 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal para una única dosis terapéutica.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. En los Ejemplos, se usan los siguientes fragmentos de anticuerpos y se identifican en cada caso por el nombre abreviado que se da posteriormente. En cada caso el anticuerpo se preparó a partir de un anticuerpo monoclonal de ratón tal y como se describe en la solicitud de la patente internacional nº WO 92/01059 (A5B7) o usando procedimientos similares (hTNF40 y cTN3):
hA5B7
- Éste es un anticuerpo humano modificado que reconoce el antígeno carcinoembrionario. El fragmento de anticuerpo usado aquí tiene un residuo de cisteína disponible para unirse a PEG y localizado en su región bisagra después de la activación con \beta-mercaptoetilamina.
hTNF40
- Éste es un anticuerpo humano modificado que reconoce TNF\alpha humano. Dos fragmentos de anticuerpos hTNF40 se usan en los Ejemplos, uno (Ejemplo 2) que tiene un único residuo de cisteína en la región bisagra (ver hA5B7 anterior), y un segundo (Ejemplo 3) que tiene dos residuos de cisteína en la región bisagra, disponibles para unirse a PEG.
cTN3
- Este es un anticuerpo quimérico de hámster/ratón que reconoce TNF\alpha de ratón y que tiene una región constante IgG2a de ratón. El anticuerpo tiene tres residuos de cisteína en la región bisagra disponibles para unirse a PEG.
hg162
- Éste es un anticuerpo humano modificado que reconoce el receptor PDGF\beta humano. El fragmento de anticuerpo usado aquí tiene un único residuo de cisteína presente en su región bisagra disponible para unirse a PEG.
Las siguientes abreviaturas se usan en el Ejemplo 1:
1
En los Ejemplos 2 a 7, la abreviatura PEG se usa para referirse a metoxipoli(etilenglicol) lineal o ramificado, con o sin un segmento conector entre la cadena de poli(etilenglicol) y un grupo tilo reactivo como se indica. En cada Ejemplo, la unión al anticuerpo ocurre a través de un enlace -S-C- tal y como se describe anteriormente, o, en el Ejemplo 5 a través de un enlace -S-S-.
En todos los Ejemplos, se usan las siguientes abreviaturas:
DTDP - 4,4'-ditiodipiridina
PBS - solución salina tamponada con fosfato
HPLC - cromatografía líquida de alto rendimiento
ABC - área bajo la curva.
Ejemplo 1 Purificación de Fab' de hA5B7
Se expresó Fab' de hA5B7 en células W3110 de E. coli crecidas en un fermentador de 1,5 litros. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en el volumen original con Tris 100 mM a pH 7,4 que contenía AEDT 10 mM, y se incubó durante una hora a 55ºC. El extracto celular resultante se clarificó luego por centrifugación, se llevó a 1 M con respecto a la glicina, y el pH se ajustó a 7,5 con glicinato de sodio al 50% (peso/volumen). La muestra se aplicó a una columna de Streamline® A (Pharmacia) equilibrada con glicina/glicinato 1 M a pH 8,0. Después de lavar con el tampón de equilibración, se eluyó el Fab' de hA5B7 con citrato 0,1 M a pH 3,0. El hA5B7 eluído se ajustó luego a pH 6,0 con Tris 2 M a pH 8,5 y se concentró por ultrafiltración.
Preparación del reactivo PEG-maleimida
Se preparó un derivado de maleimida de PEG tal y como se ha descrito previamente [Pedley et al (1994) ibid]. Se disolvió metoxipolioxietilenamina (peso molecular medio de aproximadamente 5000, Sigma) en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, a pH 7,0, y se incubó con un exceso molar de 1,2 partes de éster de N-hidroxisuccinamida del ácido 3-maleimidopropiónico durante una hora a temperatura ambiente. La extensión de la reacción se determinó depositando gotas de alícuotas de la mezcla de la reacción sobre una placa TLC (Kieselgel 60), y revelándose con ninhidrina. La reacción se consideraba terminada cuando no quedaba coloración púrpura (reacción de la amina con la ninhidrina). El producto PEG-maleimida se desaló usando una columna (Pharmacia) de Sephadex G-25 (PD-10) en agua desionizada, y liofilizada. La presencia de grupos activos de maleimida se demostró por retrotitulación con \beta-mercaptoetilamina.
Preparación de hA5B7 de Fab'-PEG (específica de sitio)
Se desaló Fab' de hA5B7 purificado a una concentración de aproximadamente 11 mg/ml en tampón acetato 0,1 M, a pH 6,0, usando una columna Bio-Spin 6 (Bio-Rad). El grupo tiol de la región bisagra se activó entonces por reducción con \beta-mercaptoetilamina. El Fab' de hA5B7 se incubó con \beta-mercaptoetilamina 5 mM en tampón acetato 0,1 M a pH 6,0 durante 30 minutos a 37ºC. La muestra se desaló después usando una columna Bio-Spin 6 en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0. El número de grupos tiol por molécula de Fab' se midió por titulación con DTDP cono se ha descrito previamente [Lyons et al., (1990) ibid]. La muestra se incubó después durante 2,5 horas a temperatura ambiente con un exceso molar mayor de 10 veces de maleimida-PEG producido tal y como se ha descrito anteriormente. El Fab' modificado por PEG se desaló después en una columna Bio-Spin 6 en una solución salina tamponada con fosfato a pH 6,8 y se llevó a cabo una titulación de tiol, para asegurarse que los grupos tiol han reaccionado completamente con el reactivo PEG-maleimida.
Preparación de Fab' de hA5B7 -PEG aleatoriamente modificado
Se desaló Fab' de hA5B7 a aproximadamente 11 mg/ml en tampón fosfato a pH 8,0 usando una columna Bio-Spin 6. Los tioles se introdujeron aleatoriamente en residuos de lisina por reacción con un exceso molar de 7 veces de 2-iminotiolano (reactivo de Traut) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la desalación en fosfato 0,1 M a pH 6,0 usando una columna Bio-Spin 6, se determinó el número de grupos tiol usando titulación con DTDP. El Fab' de hA5B7 tiolado reaccionará después con PEG-maleimida y se desaló tal y como se ha descrito anteriormente para la modificación específica de sitio.
Análisis de muestras modificadas por PEG
Con el fin de comparar los dos procedimientos de unión de PEG (específica de sitio y aleatoria), se buscaron muestras con un grado similar de modificación. Usando las condiciones anteriormente descritas, la unión específica de sitio a la región bisagra dio lugar a un promedio de 0,98 moléculas de PEG por molécula de Fab', mientras que la unión aleatoria a través del reactivo de Traut dio lugar a un promedio de 1,18 moléculas de PEG por molécula de Fab'. El análisis por PAGE-SDS en condiciones no reductoras (Figura 1) reveló que la banda mayor en la muestra de Fab' de hA5B7 sin modificar (calle 1) tiene un peso molecular esperaba de aproximadamente 50 kDa. La muestra con PEG unido por medio de unión específica de sitio a la región bisagra (calle 2) contiene algún Fab residual no modificado, así como otras dos especies distintas con pesos más grandes, de los cuales el más importante tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 66 kDa. Se detecta también una cantidad similar de Fab' residual no modificado en la muestra modificada aleatoriamente. Se puede ver que esta muestra es mucho más heterogénea que la muestra modificada específica de sitio con algunas bandas discretas pero también unas bandas de tinción difusa que cubren un intervalo de peso molecular relativamente amplio. El tamaño exacto de proteínas modificadas por PEG no se puede deducir a partir de esta técnica ya que se sabe que la unión de PEG altera el correr de las bandas de proteínas en electroforesis con las proteínas patrón. Sin embargo, se puede ver que ambas preparaciones se han modificado con PEG y que se producen especies moleculares diferentes en cada caso.
Con el fin de evaluar la modificación por PEG en la actividad de Fab' de hA5B7, se llevó a cabo un ensayo cinético por resonancia de plasmón en superficie usando un instrumento Biacore 2000 (Pharmacia Biosensor). El ensayo se llevó a cabo por una modificación del procedimiento anteriormente descrito [Abraham et al., J. Immunol. Methods (1995), 183, 119-125].
Se cambió el tampón del antígeno carcinoembrionario (ACE) (100 ml, 0,92 \mug/ml) por acetato de sodio 0,1 M a pH 5,5 usando una columna Bio-Spin 6 (Bio-Rad). Se añadió peryodato de sodio (2 \mul, 50 mM en acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 recién preparado) y la mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. La reacción se paró por cambio de tampón con acetato de sodio 10 mM a pH 4,0 en una columna Bio-Spin 6 para dar 100 ml de ACE oxidado a aproximadamente 0,89 mg/ml. El ACE oxidado se inmovilizó después sobre un circuito detector CM5 (Pharmacia Biosensor) usando el procedimiento convencional de acoplamiento con aldehído descrito en las instrucciones del fabricante. En resumen, esto requería de la activación de la superficie por inyección de reactivo EDC/NHS (15 \mul, kit de acoplamiento a aminas, Pharmacia Biosensor) a una velocidad de flujo de 5 \mul/min, seguido de una inyección de 35 \mul de hidrazina y luego 35 \mul de etanolamina 1 M. Después de ésto se siguió con una inyección de 35 \mul de ACE oxidado a 5, 1, 0,2 o 0,05 \mug/ml en acetato de sodio a pH 4,0. Finalmente se pasaron 40 \mul de cianoborohidruro de sodio 0,1 M sobre la superficie y el circuito detector se lavó con 4 alícuotas sucesivas de ácido clorhídrico 10 mM antes de su uso. Cada muestra de Fab' de hA5B7 se diluyó en ocho diluciones dobles de 20 \mug/ml en tampón HBS (Pharmacia Biosensor). Las muestras se inyectaron sobre la superficie del ACE para observar las cinéticas de unión y disociación. Las constantes de velocidad de asociación y de disociación se calcularon asumiendo cinéticas de unión simples 1:1 y aplicando las ecuaciones de velocidad no lineales suministradas con el programa de análisis del fabricante.
Los resultados de este análisis (Tabla 1) muestran que en este ensayo había alguna pérdida de potencia (al 56% de los Fab' de hA5B7 no modificados) como resultado de la unión específica de sitio en la región bisagra. Sin embargo, la unión de un número similar de moléculas de PEG de una forma aleatoria dando lugar a un material con solamente un 29% de inmunorreactividad. La pérdida de potencia parece ser debido fundamentalmente debido a la velocidad reducida de asociación, aunque también se da una velocidad de disociación ligeramente incrementada.
Para un análisis farmacocinético se marcaron las muestras de Fab' con ^{125}I usando el reactivo de Bolton-Hunter por metodología estándar y se desaló en una solución salina tamponada con fosfato a pH 6,8 para eliminar el ^{125}I que no ha reaccionado. Se inyectaron i.v. en la vena de la cola grupos de seis ratas Wistar macho con 20 \mug de Fab' marcado. Se tomaron muestras de sangre a tiempos seleccionados, se contaron en un contador gamma y se calculó el porcentaje de dosis inyectado por gramo de sangre. Las velocidades de aclaramiento y los valores de área bajo la curva se determinaron usando el paquete de software SIPHAR.
Las curvas de aclaramiento para el Fab' de hA5B7 y para las dos preparaciones modificadas por PEG se muestran en la Figura 2. De estas curvas se puede ver claramente que el aclaramiento de Fab' modificado específico de sitio es inesperadamente más lento que aquel del material modificado aleatoriamente. Los parámetros farmacocinéticos calculados (Tabla 2) muestran que la modificación con PEG disminuye aproximadamente en dos veces la velocidad de aclaramiento de Fab' de hA5B7 en las fases \alpha y \beta. Estas mejoras se reflejan en los valores del área bajo la curva (ABC) que muestran un efecto importante de la unión a PEG. La unión específica de sitio de PEG da lugar a un incremento del ABC de aproximadamente 18 veces comparado con el de Fab' no modificado, mientras que el PEG unido aleatoriamente da lugar a un incremento de solamente seis veces comparado con el de Fab' no modificado.
TABLA 1 Inmunorreactividad de las muestras de Fab' que se unen a ACE por análisis de BIAcore
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline
  \+ K _{as}  (x 10 ^{4}  M ^{-1}  s ^{-1} )  \+ K _{dis}  (x
10 ^{-4}  s ^{-1} )   \+  K _{D}  (nM)  \+ Inmunorre- \\   \+  \+ 
\+  \+ actividad \\\hline  Fab' no  \+ 8,60  \+ 1,61  \+ 1,87  \+
100% \\  modificado \+ \+ \+ \+ \\\hline  Unión a la región  \+ 5,18
 \+ 1,73  \+ 3,34  \+ 56% \\  bisagra \+ \+ \+ \+ \\\hline  Unión
aleatoria  \+ 3,26  \+ 2,12  \+ 6,50  \+ 29%
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA 2 Propiedades farmacocinéticas de Fabs modificados por PEG
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline
  \+ T1/2 \alpha  (h)  \+ T1/2 \beta  (h)  \+ ABC
(0- \infty ) (% de dosis x hora) \\\hline  Fab' no 
\+ 0,33  \+ 10,0  \+ 47 \\  modificado \+ \+ \+ \\\hline  Unión
aleatoria  \+ 0,58  \+ 22,1  \+ 293 \\\hline  Unión a la región  \+
0,71  \+ 22,5  \+ 866 \\  bisagra \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 2 Unión específica de sitio de PEG de Fab' de hTNF40 Purificación de Fab' de hTNF40
Se expresó un Fab' de hTNF40 en células W3110 de E. Coli crecidas en un fermentador de 1,5 l y un extracto celular preparado tal y como se describe en el Ejemplo 1. El extracto celular se diluyó a una conductividad de 3,5 S/cm, se ajustó a pH 4,5 y se aplicó a una columna de SP Streamline® (Pharmacia) equilibrada con tampón acetato 50 mM a pH 4,5. Después de lavar con tampón de equilibrado se diluyó el Fab' con cloruro de sodio 200 mM en tampón acetato 50 mM a pH 4,5. El pH del material eluído se ajustó a 6 y el Fab' se purificó además por aplicación a una columna de G-sepharosa de proteínas equilibrada con PBS. Después de lavar con PBS, el Fab' se eluyó con glicina -ácido clorhídrico 0,1 M a pH 2,7 e inmediatamente se reajustó el pH a 6. El Fab' purificado se concentró después por ultrafiltración a más de 10 mg/ml.
Preparación de Fab' de hTNF40-PEG (25 kDa) y de Fab' de hTNF40-PEG (40 kDa) a través de la unión de PEG al grupo tiol de la región bisagra
Se cambió el pH de Fab' purificado por un tampón fosfato 0,1 M a pH 6 que contenía AEDT 2 mM. El grupo tiol de la región bisagra se activó después por reducción con \beta-mercaptoetilamina tal y como se describe en el Ejemplo 1. Ésto dio lugar a una media de 1,1 grupos tiol por Fab' tal y como se determina por valoración con DTDP. La muestra de Fab'-PEG se produjeron luego con un PEG de 25 kDa y uno de 40 kDa usando derivados del tipo PEG-maleimida suministrados por Shearwater Polymers Inc. Huntsville, AL, USA. El derivado PEG-maleimida de 25 kDa era una única cadena de PEG unida directamente a un grupo maleimida, y el derivado PEG-maleimida de 40 kDa se preparó a partir de una estructura ramificada que comprende dos cadenas de PEG de 20 kDa unidas a través de un derivado de lisina a un grupo maleimida. El Fab' recién reducido y desalado con un exceso molar de tres veces de PEG-maleimida de 25 kDa o un exceso molar de nueve veces de PEG-maleimida de 40 kDa durante una noche a temperatura ambiente y los conjugados Fab'-PEG resultantes purificados por HPLC de gel de filtración usando una columna Zorbax GF-250, corrieron en tampón fosfato 0,2 M a pH 7,0. Con vistas a comparar propósitos, se preparó también un Fab' de hTNF40 modificado por PEG con PEG de 25 kDa tal y como se describe para la unión de PEG de 5kDa a Fab' de hA5B7 en el Ejemplo 1. Se preparó un conjugado con un promedio de 1,5 moléculas de PEG por Fab'.
Análisis de conjugados Fab'-PEG
Se examinaron muestras purificadas por PAGE-SDS en condiciones no reductoras. Los conjugados de PEG corrieron como se esperaba con una movilidad inferior a los de Fab' no modificados y se vio que estaban libres de Fab' (Figura 3). Además, los conjugados de tipo Fab' modificado-PEG de la región bisagra quedaron más definidos en PAGE-SDS que el conjugado de PEG aleatorio.
La capacidad de los conjugados de PEG para unirse a su antígeno, TNF, se examinó en un bioensayo L929 y se comparó con Fab' e IgG. L929 es una línea celular de fibroblastos adherentes de ratón la cual es sensible a la acción citotóxica de TNF en presencia del inhibidor actinomicina D de síntesis de proteínas. Es posible por lo tanto comparar la actividad de antagonistas de TNF, como por ejemplo anticuerpos anti-TNF, usando esta línea celular. Se cultivan placas de 96 pocillos sembradas con monocapas de células L929 en 100 ng/ml de TNF humano, con 1 \mug/ml de actinomicina D durante 18 horas en medio RPMI suplementado con glutamina. En estas condiciones mueren entre el 95 y el 100% de las células y fracasan en la adhesión al plástico del cultivo de tejido. Las células que quedaban se fijaron después con metanol al 100% durante 1 minuto y se tiñeron con violeta cristal al 5%. Las placas se lavaron después y las células teñidas se disolvieron en ácido acético al 30% antes del análisis en un lector de placas. Este experimento se llevó a cabo también con titulaciones de muestras de anticuerpos añadidos a los pocillos al mismo tiempo que el TNF. Los resultados se representan gráficamente cono concentración de antagonista de TNF frente a TNF residual donde cuanto más baja era la concentración de TNF, mayor era la inhibición. Los anticuerpos inhibidores se pueden comparar entonces comparando la concentración de cada uno requerida para inhibir un 90% de la actividad de TNF para dar un valor de CI90.
El anticuerpo hTNF40 y su fragmento Fab' tienen un CI90 de 3 ng/ml en este ensayo de L929. Los resultados con ambos conjugados de PEG de 25 y 40 kDa modificados en la región bisagra también muestran valores de CI90 de 3 ng/ml, sugiriendo que estos conjugados neutralizaban TNF en la misma extensión que Fab' de hTNF40 e IgG (Figura 4). El conjugado Fab' de hTNF40-PEG conjugado aleatoriamente era menos potente que las preparaciones de conjugados de región bisagra con un valor de CI90 de 10 ng/ml. Los análisis farmacocinéticos de los conjugados se llevaron a cabo en ratas con material marcado con ^{125}I tal y se describe en el Ejemplo 1. Los resultados (Figura 5), demuestran una vida media de circulación incremetada para todos los fragmentos de Fab' modificados por PEG comparado con los de Fab' no modificado. La unión de moléculas de PEG más grandes en la región bisagra incrementó la vida media de circulación en mayor medida que las moléculas de PEG más pequeñas. Los Fab' modificados aleatoriamente con un promedio de 1,5 moléculas de PEG de 25 kDa por Fab' (promedio de PEG de 37,5 kDa por Fab') mostró una vida media de circulación intermedia entre los conjugados de Fab' de la región bisagra con PEG de 25 kDa y de 40 kDa.
En otro experimento diferente se comparó la farmacocinética de IgG de hTNF40, Fab' y de Fab'-PEG (25 kDa unido a la región bisagra) en ratas después de marcar con ^{111}In. Los IgG y Fab' se conjugaron con el quelante macrocíclico 9N3 para marcar con ^{111}In tal y como se describe [Turner et al., Br. J. Cancer 70, 35-41 (1991)]. Para el conjugado de PEG, se preparó el conjugado Fab'-9N3 y se marcó con ^{111}In usando el mismo procedimiento y posteriormente el PEG de 25 kDa se unió a la región bisagra tal y como se ha descrito anteriormente. El conjugado marcado se purificó después por HPLC de filtración en gel. Los resultados del experimento farmacocinético en ratas con estos conjugados marcados con ^{111}In (figura 6) demuestran de nuevo un incremento en la vida media en la circulación para el Fab' modificado por PEG comparado con la del Fab' no modificado con niveles en sangre más elevados que con IgG a las 144 horas.
Ejemplo 3 Producción de Fab' de hTNF40-(PEG)_{2}
En este ejemplo se demuestra la aplicabilidad de este procedimiento a fragmentos de Fab' producidos por digestión de IgG los cuales contienen dos residuos de cisteína en la región bisagra.
Preparación de Fab' de hTNF40-(PEG)_{2}
Se expresó anticuerpo completo de hTNF40 en células NS0, se purificó por cromatografía en sepharosa de proteína A y se produjo F(ab')_{2} por digestión con pepsina usando técnicas convencionales. Se purificó F(ab')_{2} por cromatografía de filtración en gel usando Sephacryl S-200 HR. Después de cambiar el tampón por tampón fosfato 0,1 M a pH 8 que contenía AEDT 5 mM, se redujo a Fab' por incubación con \beta-mercaptoetilamina durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió luego PEG-maleimida (PEG de 25 kDa - ver Ejemplo 2) a un exceso molar de tres veces sobre la concentración de Fab' y se dejó continuar la reacción durante una noche. La mezcla resultante se analizó por HPLC de filtración en gel y se encontró que contenía una mezcla de Fab' no modificado, Fab'-PEG y de Fab'-(PEG)_{2} (Figura 7). El material modificado por PEG se purificó por HPLC de filtración en gel y dio lugar a una mezcla 1:2 de Fab'-PEG: Fab'-(PEG)_{2}.
Unión a antígeno y análisis farmacocinético
Se calculó la actividad de unión a antígeno por ensayo de BIAcore el cual midió la afinidad para la unión a TNF. Las muestras modificadas de Fab' o de PEG se capturaron con un anticuerpo anti-Fab' inmovilizado y el TNF humano pasó sobre la superficie. Luego se analizó la cinética de unión a TNF. Los resultados sugerían que la mezcla de Fab'-PEG y Fab'-(PEG)_{2} tenía una afinidad de unión, K_{D}, de 0,14 nM. Ésto se comparó favorablemente con el Fab' no modificado que tenia una K_{D} de 0,28 nM en el mismo ensayo, sugiriendo que no había pérdida de actividad de unión a antígeno debido a la unión de PEG.
Se calculó la farmacocinética del material purificado que contenía una mezcla de Fab'-PEG y Fab'-(PEG)_{2} en ratas después de marcar radiactivamente con ^{125}I. Los resultados (Figura 8) demuestran una vida media de circulación mejorada comparada con la de Fab'-PEG solo, el cual se había producido a partir de material expresado en E. Coli con una única cisteína de la región bisagra preparado tal y como se describe en el Ejemplo 2.
Ejemplo 4 Preparación de Fab'-PEG, Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3} de cTN3
El anticuerpo cTN3 se expresó en células NSO, se purificó y se digirió con pepsina para producir F(ab')_{2} usando técnicas convencionales. Se cambió el tampón de F(ab')_{2} purificado por tampón fosfato 0,1 M a pH 8,0 que contenía AEDT 5 mM y luego se redujo con \beta-mercaptoetilamina 9 mM y se modificó con PEG en la región bisagra tal y como se describe en el Ejemplo 3. Se obtuvo una mezcla de Fab', Fab'-PEG, Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3}. Se separaron Fab' y Fab'-PEG de Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3} por HPLC de filtración en gel. La muestra purificada de Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3} contenía una relación 1,6:1 de Fab'-(PEG)_{2}:Fab'-(PEG)_{3}.
Unión a antígeno y análisis farmacocinético
El análisis de unión a antígeno de Fab', Fab'-PEG, y Fab'-(PEG)_{2} + Fab'- (PEG)_{3}de cTN3 se llevó a cabo a través de una variante del bioensayo L929 descrito anteriormente. Los anticuerpos TN3 se incubaron con TNF de ratón. En este ensayo, las IgG de cTN3 tienen un CI90 de aproximadamente 1000 pg/ml. En el mismo ensayo, Fab' y Fab'-PEG tienen el mismo perfil de inhibición y los mismos valores de CI90. Por lo tanto, los resultados demostraron que no había pérdida de función de unión a antígeno después de la modificación por PEG (figura 9).
Se calculó la farmacocinética del material purificado de Fab'-PEG y de una mezcla de Fab'-(PEG)_{2} y Fab'-(PEG)_{3} en ratas después de marcar radiactivamente con ^{125}I. También se compararon en el mismo experimento Fab' e IgG de cTN3. Los resultados (Figura 10) demuestran un aclaramiento muy rápido para Fab' no modificado mientras que el Fab' modificado por PEG tiene una vida media de circulación mucho más larga. Esto se mejora además por la adición de más PEG tal y como se ha demostrado para la muestra de Fab'-(PEG)_{2} + Fab'- (PEG)_{3}. Esta muestra tenía un ABC incrementada comparada con la de la IgG (Figura 10).
En los Ejemplo 5 y 6 se demuestra el uso de reactivos tiol-selectivos alternativos:
Ejemplo 5 Preparación de Fab' de hTNF40-PEG usando un reactivo vinilsulfona
Se ha visto que las vinilsulfonas son específicas de grupo tiol cuando se usan a pH 8 o por debajo [Morpurgo, M. Et al, Bioconjugate Chem. (1996), 7, 363-368]. En este Ejemplo, el PEG se une a Fab' de un modo específico de sitio usando un derivado de vinilsulfona con PEG de 5 kDa (Shearwater Polymers Inc. Ibid) en el que el PEG se une directamente al grupo sulfona.
El Fab' de hTNF40 se preparó y se redujo para generar un tiol libre de la región bisagra tal y como se describe en el Ejemplo 2. En esta preparación resultó un promedio de 1,1 tioles por Fab' tal y como se había determinado por titulación con DTDP. Después de desalar en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 que contenía AEDT 2 mM, se añadió un exceso molar de PEG-sulfona de vinilo de 30 veces y la mezcla de reacción se incubó durante una noche. El análisis por PAGE-SDS reveló la conjugación de PEG con la molécula de Fab' con un rendimiento de aproximadamente un 30% (Figura 11). El conjugado Fab'-PEG se purificó por cromatografía de interacción hidrofóbica usando una columna HP Hi Trap de fenilsepharosa (Pharmacia). La mezcla de entrecruzamiento se llevó a 1,5 M con respecto al sulfato de amonio y se cargó en una columna HP de fenilsepharosa pre-equilibrada con tampón fosfato 50 mM a pH 7,0 que contenía sulfato de amonio 1,5 M. Se eluyó el conjugado Fab'-PEG usando un gradiente lineal de volumen de columna 50 a fosfato 50 mM a pH 7. La afinidad de unión a antígeno se comparó con la de Fab' no modificado por análisis BIAcore tal y como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de este análisis (Tabla 3) demostró la no pérdida de actividad de unión a antígeno a través de la conjugación de PEG por medio del reactivo de vinilsulfona ya que la afinidad de unión del conjugado Fab'-PEG era similar a la de IgG.
Ejemplo 6 Preparación de Fab' de hTNF40-PEG usando un reactivo yodoacetamida
En este Ejemplo, el PEG se une de un modo específico de sitio a Fab' usando un derivado de yodoacetamida con PEG de 5 kDa (Shearwater Polymers Inc. Ibid) en el que el PEG se une directamente al grupo acetamida.
El Fab' de hTNF40-PEG se preparó y se purificó tal y como se describe en el Ejemplo 5 usando un exceso molar de PEG-yodoacetamida de 30 veces. La afinidad para unión a antígeno del producto se comparó con la de Fab' no modificado por análisis BIAcore como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de este análisis (Tabla 3) demostró la no pérdida de actividad de unión a antígeno a través de la conjugación de PEG por medio del reactivo de yodoacetamida ya que la afinidad de unión del conjugado Fab'-PEG era similar a la de IgG.
TABLA 3 Análisis cinético de conjugados Fab' de hTNF40-PEG
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline
  \+ kas  \+ kdis  \+ Kd (M) \\\hline  IgG convencional  \+
4,41x10 ^{5}   \+ 6,90x10 ^{-5}   \+ 1,56x10 ^{-10}  \\\hline 
Fab'-PEG (40 kDa) de PEG-  \+ 4,29x10 ^{5}   \+
7,87x10 ^{-5}   \+ 1,84x10 ^{-10}  \\ maleimida (Ejemplo 3) \+ \+ \+
\\\hline  Fab'-PEG (5 kDa) de PEG-  \+ 3,69x10 ^{5} 
 \+ 4,74x10 ^{-5}   \+ 1,29x10 ^{-10}  \\  vinilsulfona (Ejemplo 5)
\+ \+ \+ \\\hline  Fab'-PEG (5 kDa) de PEG-  \+
3,85x10 ^{5}   \+ 5,88x10 ^{-5}   \+ 1,53x10 ^{-10}  \\ 
yodoacetamida (Ejemplo 6) \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 7 Preparación de Fab' de anti-PDGF\betaR-PEG
En este ejemplo, la aplicación de unión específica de sitio de PEG se demuestra con fragmento Fab' recombinante adicional.
Se expresó un Fab' de anticuerpo humano modificado hg162, el cual reconoce el receptor de PDGF\beta en E. Coli tal y como se describe para el fragmento de Fab' de hTNF40 (ver Ejemplo 2). Las células se recuperaron del cultivo de fermenteación por centrifugación y se extrajo el Fab' resuspendiendo las células en tris 100 mM a pH 7,4 que contenía AEDT 10 mM e incubando a 60ºC durante una noche. Se purificó entonces el Fab' por cromatografía de lecho expandido usando una columna de Streamline A™ (Pharmacia) la cual se pre-equilibró con glicina/glicinato 1 M a pH 8,0. La muestra se llevó a 1 M respecto a la glicina y el pH se ajustó a 7,5 con glicinato de sodio al 50% (peso/volumen) antes de la aplicación a la columna en modo de lecho expandido. Después de lavar con un tampón de equilibración, el material de la columna se empaquetó en forma de lecho empaquetado y se eluyó Fab' con citrato 0,1 M a pH 3,0.
Se alcanzó una purificación adicional ajustando el pH del eluato a 7,5 con tris 2 M y aplicándolo a una columna de sepharosa de Proteína G pre-equilibrada con solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. después de lavar con tampón de equilibración, se eluyó el fab' con glicina-HCl a pH 2,7. El pH del Fab' eluído se ajustó después a 6,0 con tris 2M.
El Fab' de anti-PDGF\betaR se diafiltró en tampón fosfato 0,1 M, a pH 6,0 que contenía AEDT 2 mM. El tiol de la región bisagra se activó por reducción con \beta-mercaptoetilamina. El Fab' se incubó con \beta-mercaptoetilamina 5 mM en tampón fosfato 0,1, a pH 6,0 que contenía AEDT 2 mM durante 30 minutos a 37ºC. La muestra se desaló en tampón fosfato 0,1 M, a pH 6,0 que contenía AEDT 2 mM usando columnas de Sephadex G-25 (PD10). El número de grupos tiol por molécula de Fab' se midió por titulación con DTDP, y se encontró que era 1,08. Se añadió después PEG-maleimida (40 kDa, ver Ejemplo 2) en un exceso molar de tres veces y se dejó reaccionar durante una noche. La conversión a Fab'-PEG se alcanzó con un rendimiento de aproximadamente un 60% (Figura 12). El conjugado Fab'-PEG se purificó después por HPLC de filtración en gel tal y como se describe en el Ejemplo2.
La afinidad de unión a antígeno de Fab' de anti-PDGF\betaR-PEG se comparó con la de Fab' no modificado por análisis BIAcore. El análisis cinético para determinar las velocidades de unión de Fab' de anti-PDGF\betaR-PEG a PDGF\betaR se llevó a cabo usando un BIACORE 2000 (Biacore AB). Una molécula de fusión de Fc de IgG de ratón-PDGF\betaR fue capturada por una IgG anti-ratón inmovilizada en la superficie del circuito detector. A esto le siguió una inyección de Fab' de anti-PDGF\betaR-PEG. El fragmento F(ab')_{2} de IgG de cabra anti-ratón purificado por afinidad específico del fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch), se inmovolizó sobre un Circuito Detector CM5 por medio de química de acoplamiento de aminasa un nivel de 11500 RU. Se preparó una superficie virgen siguiendo el procedimiento de inmovilización pero omitiendo la inyección de la molécula capturada. Se usó tampón HBS (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, AEDT 3 mM, Agente Tensoactivo P20 al 0,005%, Biacore AB) como tampón de elución con una velocidad de flujo de 10 \mul/min. Una inyección de Fc de IgG de ratón- PDGF\betaR expresado en el sobrenadante de células COS recombinantes se capturó por medio de una IgG anti-ratón inmovilizada a un nivel entre 200 y 259 RU. Las moléculas de Fab' de anti-PDGF\betaR o Fab'-PEG se titularon sobre la superficie de Fc de PDGF\betaR de IgG de 2 PDGF\betaR a 0,52 mg/ml. Las superficies se generaron inyectando 10 ml de ácido clorhídrico 30 mM. Las inyecciones de Fc de IgG de ratón- PDGF\betaR y cada concentración de Fab' de anti-PDGF\betaR o Fab'-PEG se repitieron sobre la superficie virgen en forma de controles. El sensograma para cada concentración de Fab' de anti- PDGF\betaR o Fab'-PEG resultó correcta de acuerdo con el correspondiente sensograma para la superficie virgen después de la eliminación de la inyección de Fc de IgG-PDGF\betaR y de la etapa de regeneración. Los parámetros cinéticos se calcularon usando un software BIAevaluation 2,1.
Los resultados para Fab' y Fab'-PEG se muestran en la Tabla 4. Había poca diferencia en los valores de los parámetros cinéticos determinados, demostrando que la unión de PEG a la región bisagra ha dado lugar a muy poca pérdida de afinidad de unión a antígeno.
TABLA 4 Análisis BIAcore de Fab' de anti-PDGF\betaR y Fab'-PEG
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|}\hline
  \+ kas  \+ kdis  \+ Kd (M) \\\hline  Fab'  \+ 6,89x10 ^{6}   \+
2,52x10 ^{-3}   \+ 3,66x10 ^{-10}  \\\hline 
Fab'-PEG  \+ 4,45x10 ^{6}   \+ 2,77x10 ^{-3}   \+
6,22x10 ^{-10} 
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La farmacocinétia de Fab' de anti-PDGF\betaR y de Fab'-PEG se examinaron en un experimento con ratas usando muestras marcadas con ^{125}I tal y como se describe en el ejemplo 1. los resultados demostraron un aclaramiento mucho más lento de la sangre para Fab'-PEG comparado con el de Fab' (Figura 13). Esto se reflejó en los cálculos de los parámetros farmacocinéticos mostrados en la Tabla 5.
TABLA 5 Parámetros farmacocinéticos de Fab' de anti-PDGF\betaR-PEG comparados con los de Fab' e IgG
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline
  \+ T1/2 \alpha  (horas)  \+ T1/2 \beta  (horas)  \+ ABC
(0- \infty )(%  \+ AUC (% \\   \+  \+  \+ de dosis x
h)  \+ valor de IgG) \\\hline  IgG  \+ 5,3 +/- 1,3  \+ 95,9 +/- 
10,9  \+ 6442 +/- 525  \+ 100 \\\hline  Fab'  \+ 0,35 +/- 0,01  \+
20,3 +/-  6,0  \+ 90 +/- 12  \+ 1,4 \\\hline 
Fab'-PEG (40  \+ 8,9 +/- 4,7  \+ 49,1 +/- 4,8  \+
5890 +/- 1296  \+ 91 \\  kDa) \+ \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Claims (6)

1. Un fragmento de anticuerpo monovalente modificado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que:
dicha cadena pesada consta de un dominio V_{H} unido covalentemente en su C- terminal a un dominio C_{H}1;
dicha cadena ligera consta de un dominio V_{L}, el cual es complementario al dominio V_{H}, unido covalentemente en su C-terminal a un dominio C_{L};
dicho dominio C_{H}1 se extiende para proporcionar un dominio bisagra, el cual contiene solamente un residuo de cisteína;
los residuos de cisteína en los dominios V_{H}, C_{H}1, V_{L} y C_{L} se unen por enlace disulfuro entre ellos; y
el residuo de cisteína en el dominio bisagra se une covalentemente a una molécula de polímero a través de su átomo de azufre.
2. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polímero es un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos, o un polisacárido no ramificado.
3. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el polímero es un poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o poli(vinilalcohol) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos o uno de sus derivados.
4. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polímero es metoxi(polietilenglicol) o uno de sus derivados.
5. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 unido covalentemente a una o más moléculas efectoras o informadoras.
6. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo monovalente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
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