ES2299268T3 - Hibridos proteicos de anticuerpos y sueros. - Google Patents
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Abstract
Una proteína híbrida que comprende un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno unido covalentemente a una molécula de albúmina o un fragmento de la misma, en la que el fragmento de anticuerpo y la albúmina están unidos indirectamente mediante una molécula puente entre los grupos tiol de un residuo de cisteína presente en el anticuerpo y otro presente en la albúmina en la posición 34, en la que la molécula puente tiene de 10 Aº a 20 Aº de longitud.
Description
Híbridos proteicos de anticuerpos y sueros.
Esta invención se refiere a fragmentos de
anticuerpo modificados, a procedimientos para su preparación y a su
uso en medicina.
Dado que los anticuerpos muestran una gran
especificidad en su unión a otras moléculas, son beneficiosos como
agentes terapéuticos o de diagnóstico, o como reactivos (por
ejemplo, como reactivos de purificación por afinidad o como enzimas
catalíticas). La aparición de la tecnología de hibridomas y la
generación de animales transgénicos ha permitido la producción de
grandes volúmenes de anticuerpos monoclonales, suficientes para su
uso terapéutico. La mayoría de tales anticuerpos se han generado
para el tratamiento de enfermedades agudas, tales como tipos
particulares de cáncer. Para el tratamiento de enfermedades crónicas
y/o más comunes, es probable que se requieran todavía grandes
cantidades de anticuerpo. Un aumento del uso también conlleva un
aumento de la necesidad de un agente terapéutico más barato.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse
en células de insecto o de mamífero cultivadas o en animales
transgénicos, pero la capacidad de estas tecnologías para
suministrar a un gran mercado a un coste razonable aún no está
demostrada hasta este punto. De nuevo, se ha mostrado que los hongos
pueden producir proteínas heterólogas [por ejemplo, Sleep, D.,
et al (1991) Bio/Technology, 9, 183-187],
pero se ha notificado que la expresión de inmunoglobulina G
completa (IgG1) en un hongo se produce sólo a un nivel bajo (en
Saccharomyces cerevisiae) o en cultivo de matraz de
agitación (en Pichia pastoris), de modo que aún no está
demostrada la producción de anticuerpos a partir de hongos a escala
industrial. [Horwitz, A. H., et al (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85, 8678-8682; Ogunjimi, A.A. et al
(1999) Biotechnology Lett. 21, 561-567]. Además, se
esperaría que la glicosilación del anticuerpo fuese diferente a la
de sistemas de mamífero y en mamíferos esto puede generar problemas
de inmunogenicidad y función anómala (activación del complemento,
unión a receptores Fc, transcitosis y prolongación de la semivida a
través de la interacción con el receptor FcRn) [Nose, M. y Wigzell,
H. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6632-6636;
Tao, M.-H. y Morrison, S. L. (1989) J. Immunol. 143,
2595-2601; Wawrzynczak, E. J. et al (1992)
Molec. Immunol. 29, 213-220; Kim, J.-K., et
al (1994) Eur. J. Immunol. 24, 2429-2434].
No se conoce que los sistemas bacterianos puedan
producir un anticuerpo funcional completo en un rendimiento
suficiente para proporcionar un procedimiento rentable para la
fabricación a gran escala, pero son una fuente de fragmentos de
inmunoglobulina de bajo coste, tales como Fab' [Better, M., et
al (1988) Science, 240, 1041-1043]. Sin
embargo, los fragmentos de anticuerpo pueden carecer de diversas de
las funciones de un anticuerpo completo. Por ejemplo, Fab',
F(ab')_{2} o scFv carecen del dominio Fc que confiere una
larga vida in vivo: [Medesan. C. et al (1997) J.
Immunol. 158, 2211-2217]. Se ha notificado que la
semivida en la circulación en mamíferos de Fab' o
F(ab')_{2} es aproximadamente el 1% de la de la IgG
completa [Waldmann, T. A. y Strober, W. (1969) Progr. Allergy, 13,
1-110.] y se ha notificado que la semivida de la
fase \beta (el tiempo que tarda en eliminarse la mitad de las
moléculas en la circulación) de Fab' es aproximadamente el 5% de la
de la IgG completa [Chapman, A. P., et al (1999) Nature
Biotechnology, 17, 780-783]. Por tanto, aunque
pueden ser baratos de producir, estos fragmentos se eliminan
rápidamente de la circulación y pueden ser de uso terapéutico
limitado. Esto ha conducido a intentos para prolongar la semivida de
los fragmentos de anticuerpo, por ejemplo mediante la modificación
de Fab' o F(ab')_{2} in vitro mediante la adición de
una o más moléculas de polietilenglicol a cada molécula de
fragmento. Memoria descriptiva de la patente internacional número
WO98/925971.
En la presente invención, se ha tratado la
necesidad identificable de un medio para producir de manera rentable
un fragmento de IgG que pueda unirse a antígeno y que tenga una
semivida larga in vivo. Se ha logrado esto empleando una
proteína vehículo para prolongar la inmunoglobulina en la
circulación.
Por tanto, según un aspecto de la invención, se
proporciona una proteína híbrida de múltiples componentes que
comprende un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno unido
covalentemente a una proteína vehículo sérica o fragmento de la
misma, en la que la proteína vehículo sérica es una molécula de
albúmina y en la que el fragmento de anticuerpo y la albúmina están
unidos indirectamente según lo mencionado en la reivindicación
1.
Existe una variedad de proteínas en el plasma,
que circulan en el organismo con semividas medidas en días, por
ejemplo 5 días para la proteína de unión a tiroxina y 2 días para la
transtirretina [Bartalena, L y Robbins, J. (1993) Clinics in Lab.
Med. 13, 583-598] o 65 h en la segunda fase de la
renovación de la \alpha1-glicoproteína ácida
yodada [Bree, F. et al (1986) Clin, Pharmacokin. 11,
336-342]. De nuevo, los datos de Gitlin et
al. [Gitlin, D., et al (1964) J. Clin. Invest. 10,
1938-1951] sugieren que en mujeres embarazadas la
semivida de la \alpha1-glicoproteína ácida es de
3,8 días, de 12 días para la transferrina y de 2,5 días para el
fibrinógeno.
La albúmina sérica es una proteína abundante
tanto en el compatimento vascular como extravascular [Peters, Jr.,
T. (1985) Adv. Prot. Chem. 37, 161-245]. La semivida
de la albúmina en el hombre, aproximadamente 19 días [Peters, 1985
igual que la referencia anterior], es similar a la de la IgG1
(aproximadamente 21 días [Waldeman+Strober ibídem]), aunque es
menor en otras especies (aproximadamente 2 días en ratas, por
ejemplo [Peters, 1985 ibídem]). La albúmina no presenta la
capacidad observada de los anticuerpos de unirse específicamente a
ligandos, particularmente aquéllos de elevado peso molecular.
El documento WO9200763 da a conocer el
acoplamiento químico de moléculas de albúmina a fragmentos de IgM o
IgA para restaurar la afinidad de unión a antígeno.
El documento WO9533492 da a conocer el
acoplamiento químico de un agente de transporte dirigido (molécula
de unión específica a la matriz extracelular del tejido) a un agente
antiproliferativo o citotóxico. El conjugado resultante se usa en
la inhibición de la cicatrización de heridas en el ojo.
Opcionalmente, el agente de transporte dirigido puede acoplarse
químicamente a una molécula vehículo tal como albúmina para permitir
la unión de múltiples moléculas del agente antiproliferativo o
citotóxico a cada molécula de agente de transporte dirigido.
Yukawa N. et al. (1997) J. Immunol. 18,
215-233 dan a conocer un conjugado de albumina
sérica unida a Fab' de conejo biespecífico policlonal para su uso
en un inmunoensayo de hemaglutinación para determinar la
beta-microseminoproteína. La molécula de albúmina se
usa como una molécula conectora a la que se unen múltiples
fragmentos Fab'.
En la presente invención se ha producido una
serie de proteínas híbridas que tienen ventajosamente las
capacidades de unión a antígeno de un fragmento de anticuerpo y la
longevidad de la albúmina sérica in vivo. Adicionalmente,
los híbridos pueden ser especialmente adecuados para su uso en
futuras madres o madres lactantes dado que como con otras diversas
proteínas séricas, la albúmina se transporta mal a través de la
placenta: la albúmina marcada inyectada en una madre aparece con un
5% o menos de actividad específica en el feto tras 25 días [Gitlin,
D. Kumate, J. Urrusti, J. y Morales. C. (1964) J. Clin. Invest 10,
1938-1951]. Esto contrasta con la IgG, que se
transporta eficazmente a través de la placenta hasta el feto. De
manera similar, la albúmina no se transporta a través de la pared
intestinal de los neonatos, mientras que la IgG sí, mediante
interacción con el receptor FcRn. Por tanto, de manera ventajosa,
un feto o neonato se expondría a: cantidades mínimas de los
híbridos según la invención de la circulación materna o de la
leche.
Con respecto a la producción comercial, se ha
notificado que la albúmina recombinante se produce a varios gramos
por litro de cultivo de levaduras (Pichia pastoris o
Kluyveromyces lactis [Barr, K. A., et al (1992)
Pharm. Eng. 12, 48-51; Fleer, R., et al
(1991) Bio/Technology 9, 968-975; Cregg, J. M.,
et al (1993) Bio/Technology 11, 905-910]).
Este nivel de expresión hace factible de manera rentable la
producción industrial de la proteína de calidad farmacéutica, según
lo comentado por Fleer et al [Fleer, R., et al (1991)
Bio/Technology 9, 968-975]. De manera similar, se ha
encontrado que los ratones transgénicos expresan como máximo 10 g
por litro de albúmina en su leche [Hurwitz, D. R, et al
(1994) Transgenic Res. 3,365-375].
El componente de fragmento de anticuerpo de
unión a antígeno en las proteínas según la invención comprenderá en
general un dominio de región variable de anticuerpo que contiene uno
o más sitios de unión a antígeno.
El dominio de región variable puede ser de
cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá
generalmente al menos una secuencia de aminoácidos hipervariable
responsable de la unión a antígeno incluida en una secuencia de
entramado. En términos generales, el dominio de región variable (V)
puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de
cadena pesada (V_{H}) y/o ligera (V_{L}). Por tanto, por
ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y ser un
dominio V_{H} o V_{L} en el que estos pueden unirse
independientemente al antígeno con afinidad aceptable. Como
alternativa, el dominio de región V puede ser dimérico y contener
dímeros V_{H}-V_{H},
V_{H}-V_{L} o V_{L}-V_{L},
en los que las cadenas V_{H} y V_{L} no están asociadas
covalentemente. Sin embargo, si se desea, las cadenas pueden
acoplarse covalentemente o bien directamente, por ejemplo a través
de un puente disulfuro entre los dos dominios variables, o a través
de un conector, por ejemplo un conector peptídico, para formar un
dominio de cadena sencilla, por ejemplo scFv.
El dominio de región variable puede ser
cualquier domino variable que se produce en la naturaleza o una
versión modificada mediante ingeniería genética del mismo. Por
versión modificada por ingeniería genética se quiere decir un
domino de región variable que se ha creado usando técnicas de
modificación por ingeniería genética de ADN recombinante. Tales
versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas,
por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos
naturales mediante inserciones, deleciones o cambios en o a las
secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos
particulares de este tipo incluyen los dominios de región variable
modificados por ingeniería genética que contienen al menos una CDR y
opcionalmente uno o más aminoácidos de entramado de un anticuerpo y
el resto del domino de región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de región variable podrá unirse
selectivamente en general a un antígeno. El antígeno puede ser
cualquier antígeno asociado a células, por ejemplo un antígeno de la
superficie celular tal como un marcador de células tumorales, de
células endoteliales o de células T, o puede ser un antígeno de la
matriz extracelular, un antígeno intracelular o un antígeno
soluble. Los ejemplos particulares de antígenos de la superficie
celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo integrinas
tales como integrinas \beta1, por ejemplo VLA-4,
selectina E, seledina P o selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8,
CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45,
CDW52, CD69, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina de la
grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antígenos del MHC clase I y MHC
clase II, y VEGF, y cuando sea apropiado, receptores de los mismos.
Los antígenos solubles incluyen interleucinas tales como
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-8 o IL-12, antígenos virales,
por ejemplo antígenos del virus sincitial respiratorio o del
citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones
tales como interferón \alpha, interferón \beta o interferón
\gamma, factor \alpha de necrosis tumoral, factor \beta de
necrosis tumoral, factores estimuladores de colonias tales como
G-CSF o GM-CSF, y factores de
crecimiento derivados de las plaquetas tales como
PDGF-\alpha y PDGF-\beta, y
cuando sea apropiado, receptores de los mismos.
En la práctica, se prefiere generalmente que el
dominio de región variable esté unido covalentemente en un
aminoácido C-terminal a al menos otro dominio de
anticuerpo o un fragmento del mismo. Por tanto, por ejemplo, cuando
está presente un dominio V_{H} en el dominio de región variable,
éste puede estar unido a un dominio C_{H}1 de inmunoglobulina o
un fragmento del mismo. De manera similar, un dominio V_{L} puede
estar unido a un dominio C_{K} o un fragmento del mismo. De esta
forma, por ejemplo, el fragmento según la invención puede ser un
fragmento Fab en el que el dominio de unión a antígeno contiene
dominios V_{H} y V_{L} asociados unidos covalentemente en sus
extremos C-terminales a un dominio CH1 y C_{K}
respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con otros
aminoácidos, por ejemplo para proporcionar un dominio de región
bisagra tal como se encuentra en un fragmento Fab', o para
proporcionar otros dominios, tales como dominios CH2 y CH3 de
anticuerpo.
El componente de proteína vehículo sérica en las
proteínas híbridas según la invención es albúmina o un fragmento de
la misma que será en particular de origen humano y que puede tener
uno o más aminoácidos adicionales o diferentes con respecto a la
secuencia que se produce en la naturaleza siempre con tal que la
secuencia resultante sea funcionalmente equivalente con respecto a
la semivida. Los fragmentos incluyen cualquier parte más pequeña de
la proteína original que conserve la función de vehículo de la
secuencia madura.
Los componentes de anticuerpo y de proteína
vehículo en las proteínas híbridas según la invención están unidos
covalentemente de manera indirecta. El enlace covalente indirecto
pretende significar que un aminoácido en un fragmento de anticuerpo
está unido a un aminoácido en una proteína vehículo a través de una
secuencia química intermedia, por ejemplo un grupo puente. Los
grupos puente particulares incluyen por ejemplo cadenas alifáticas,
incluyendo peptídicas, según lo descrito más particularmente a
continuación en el presente documento.
Los grupos puente particulares útiles para unir
indirectamente un anticuerpo a una proteína vehículo incluyen
grupos alifáticos, cicloalifáticos, heteroalifáticos,
heterocicloalifáticos, aromáticos y heteroaromáticos opcionalmente
sustituidos. Los grupos particulares incluyen cadenas de alquileno
C_{1-20}, alquenileno C_{2-20}
o alquinileno C_{2-20} lineales o ramificadas
opcionalmente sustituidas, opcionalmente interrumpidas y/o
sustituidas en los extremos terminales con uno o más átomos de -O- o
-S-, o grupos -N(R^{1})- [en la que R^{1} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}],
-N(R^{1})CO-, -CON(R^{1})-,
-N(R^{1})SO_{2}-, -SO_{2}N(R^{1})-,
-C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -S(O)-,
-S(O)_{2}-, compuesto aromático, por ejemplo fenilo,
compuesto heteroaromático, por ejemplo piridilo o cicloalquilo, por
ejemplo ciclohexilo. Tales cadenas incluyen, por ejemplo, cadenas
de alquileno C_{1-10} lineales o ramificadas
opcionalmente sustituidas tales como cadenas de butileno,
pentileno, hexileno o heptileno opcionalmente sustituidas, residuos
de aminoácidos individuales y cadenas peptídicas, que contienen por
ejemplo de dos a veinte aminoácidos, que pueden ser iguales o
diferentes, por ejemplo cadenas de poliglicina tales como
(Gly)_{n} en la que n es un número entero desde dos hasta
diez. Los sustituyentes opcionales que pueden estar presentes en
cualquiera de las cadenas anteriores incluyen uno o más átomos de
halógeno, por ejemplo átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, o grupos
alquilo C_{1-6}, alcoxilo
C_{1-6}, haloalquilo C_{1-6},
haloalcoxilo C_{1-6}, -OH o
-N(R^{1})(R^{2}) [en el que R^{2} es según lo definido
para R^{1}].
El grupo puente que une indirectamente un
anticuerpo a una proteína vehículo lo hace en la cadena lateral de
residuos de cisteína ubicados en el anticuerpo o proteína vehículo.
En cada punto de unión puede estar presente el residuo de un grupo
reactivo. Por ejemplo, cuando el grupo puente está unido a un
residuo de cisteína en el anticuerpo o proteína vehículo, puede
incorporarse el residuo de un grupo reactivo selectivo para tiol
tal como un grupo maleimida o similar como parte de la unión.
Si se desea, la proteína híbrida según la
invención puede tener una o más moléculas efectoras o indicadoras
unidas a ella y la invención se extiende a tales proteínas
modificadas. Las moléculas efectoras o indicadoras pueden unirse al
fragmento de anticuerpo y/o a la proteína vehículo a través de
cualquier cadena lateral de aminoácidos disponible o grupo
funcional del aminoácido terminal ubicados en cualquier componente,
por ejemplo cualquier grupo amino, imino, hidroxilo o carboxilo
libres. El enlace puede ser directo o indirecto, a través de grupos
puente o espaciadores, según lo descrito justo anteriormente, para
unir los componentes de anticuerpo y de proteína vehículo. Como
alternativa, el indicador/efector puede unirse al resto de
enlace.
Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo,
agentes antineoplásicos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente
activas de origen vegetal o bacteriano y fragmentos de las mismas,
por ejemplo ricina y fragmentos de la misma), proteínas
biológicamente activas, por ejemplo enzimas, ácidos nucleicos y
fragmentos de los mismos, por ejemplo ADN, ARN y fragmentos de los
mismos, polímeros naturales o sintéticos tales como polisacáridos o
polímeros de polialquileno tales como polietilenglicol,
radionúclidos, particularmente yodo radiactivo, y metales quelados.
Los grupos indicadores adecuados incluyen metales quelados,
compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse
mediante espectroscopía de RMN o ESR.
Los agentes antineoplásicos particulares
incluyen agentes citotóxicos y citostáticos, por ejemplo agentes
alquilantes, tales como mostazas de nitrógeno (por ejemplo
clorambucil, melfalán, mecloretamina, ciclofosfamida o mostaza de
uracilo) y derivados de las mismas, trietilenfosforamida,
trietilentiofosforamida, busulfán, o cisplatino; antimetabolitos,
tales como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina,
mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido
fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (por ejemplo,
sulfato de bleomicina), doxorubicina, daunorubicina, mitomicinas
(por ejemplo mitomicina C), actinomicinas (e.g. dactinomicina),
plicamicina, calicheamicina y derivados de las mismas, o
esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, tales
como etopósido, vincristina o vinblastina y derivados de los mismos;
alcaloides, tales como elipticina; polioles tales como
taxicina-I o taxicina-II; hormonas,
tales como andrógenos (por ejemplo dromostanolona o testolactona),
progestinas (por ejemplo acetato de megestrol o acetato de
medroxiprogesterona), estrógenos (por ejemplo difosfato de
dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de
estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo tamoxifeno);
antraquinonas, tales como mitoxantrona, ureas, tales como
hidroxiurea; hidrazinas, tales como procarbazina; o imidazoles,
tales como dacarbazina.
Los grupos efectores particularmente útiles son
la calicheamicina y derivados de la misma (véase por ejemplo las
memorias descriptivas de las patentes surafricanas números 85/8794,
88/8127 y 90/2839).
Los metales quelados incluyen quelatos de
metales di- o tripositivos que tienen un número de coordinacion
desde 2 hasta 8 incluidos. Los ejemplos particulares de tales
metales incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre
(Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In),
galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc).
En general, el metal es preferiblemente un radionúclido. Los
radionúclidos particulares incluyen ^{99m}Tc, ^{186}Re,
^{188}Re, ^{58}Co, ^{60}Co, ^{67}Cu, ^{195}Au,
^{199}Au, ^{110}Ag, ^{203}Pb, ^{206}Bi, ^{207}Bi,
^{111}In, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{88}Y, ^{90}Y, ^{160}Tb,
^{153}Gd y ^{47}Sc.
El metal quelado puede ser, por ejemplo, uno de
los tipos anteriores de metal quelado con cualquier agente quelante
polidentado adecuado, por ejemplo poliaminas cíclicas o acíclicas,
poliéteres (por ejemplo, éteres corona y derivados de los mismos);
poliamidas; porfirinas; y derivados carbocíclicos.
En general, el tipo de agente quelante dependerá
del metal en uso. Sin embargo, un grupo particularmente útil de
agentes quelantes en conjugados según la invención son poliaminas
cíclicas y acíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos,
por ejemplo ácido dietilentriaminapentaacético y derivados del
mismo, y aminas macrocíclicas, por ejemplo derivados de triaza y
tetraaza cíclicos (por ejemplo, según lo descrito en la memoria
descriptiva de la patente internacional número WO 92/22583); y
poliamidas, especialmente desferrioxiamina y derivados de la
misma.
En las proteínas según la invención, cada
fragmento de anticuerpo de unión a antígeno es preferiblemente un
fragmento Fab' monovalente, que contiene opcionalmente uno o más
aminoácidos adicionales unidos al extremo
C-terminal del dominio CH1 y es especialmente un
fragmento Fab'. Los fragmentos Fab' particularmente útiles incluyen
aquéllos en los que el dominio bisagra contiene un único residuo de
cisteína. Los fragmentos de albúmina incluyen uno o más dominios I,
II y/o III o subdominios de los mismos [véase, por ejemplo, Peters,
T. en "All about Albumin", Academic press, London (1996)].
En los híbridos de
anticuerpo-albúmina según la invención, cada
componente de proteína está unido indirectamente entre los grupos
tiol de un residuo de cisteína presente en el anticuerpo y otro en
la albúmina. El enlace indirecto puede lograrse mediante una
molécula puente según se describió anteriormente. Los grupos
particularmente útiles incluyen grupos conectores no rompibles,
especialmente cadenas de alquileno C_{1-10}
lineales o ramificadas opcionalmente sustituidas.
El anticuerpo es preferiblemente un fragmento
Fab' que contiene opcionalmente uno o más aminoácidos adicionales
unidos al extremo C-terminal del dominio CH1. Los
fragmentos especialmente útiles incluyen fragmentos Fab'. El
residuo de cisteína al que está unida la molécula puente o
espaciadora se ubica preferiblemente en el dominio CH1 del Fab o,
especialmente, se ubica en cualquier extensión del extremo
G-terminal del dominio CH1 del Fab, por ejemplo en
el dominio bisagra de un Fab'.
La albúmina puede ser en particular albúmina
sérica humana madura o un fragmento de la misma. La molécula puente
está unida al residuo de cisteína en la posición 34 de la albúmina.
De manera ventajosa, para evitar la formación no deseable de
homodímeros [véanse los ejemplos más adelante], la molécula puente
tiene aproximadamente desde 10 \ring{A} hasta aproximadamente 20
\ring{A} de longitud, por ejemplo aproximadamente 16 \ring{A}.
Las moléculas puente adecuadas en este intervalo de longitud pueden
determinarse fácilmente a partir de fuentes publicadas, por ejemplo
catálogos de fabricantes [véase más adelante]. Las moléculas puente
particularmente útiles incluyen cadenas de hexileno opcionalmente
sustituidas. Cuando cada extremo de la molécula puente está unido
al residuo de cisteína, esto puede ser a través de un puente
disulfuro o, en particular, una unión
azufre-carbono. Cuando el enlace es una unión
azufre-carbono, el residuo de un grupo reactivo
selectivo para tiol, tal como una maleimida, puede estar presente
como parte de cada extremo del grupo puente o espaciador.
Las proteínas híbridas según la invención pueden
ser útiles en la detección o tratamiento de varias enfermedades o
trastornos. Tales enfermedades o trastornos pueden incluir los
descritos con los títulos generales de enfermedad infecciosa, por
ejemplo infección viral; autoinmunidad/enfermedad inflamatoria, por
ejemplo artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria
intestinal; cáncer, enfermedad alérgica/atópica, por ejemplo asma,
eczema; enfermedad congénita, por ejemplo fibrosis quística, anemia
drepanocítica; enfermedad dermatológica, por ejemplo psoriasis;
enfermedad neurológica, por ejemplo esclerosis múltiple;
trasplantes, por ejemplo rechazo al trasplante de órganos,
enfermedad de injerto contra huésped; y enfermedad
metabólica/idiopática, por ejemplo diabetes.
La proteína híbrida según la invención puede
formularse para su uso en terapia y/o diagnosis y según otro
aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica
que comprende una proteína híbrida de múltiples componentes que
comprende un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno unido
covalentemente a una molécula de albúmina o fragmento de la misma,
junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
Según se explicó anteriormente, la proteína
híbrida en este aspecto de la invención puede estar unida
opcionalmente a uno o más grupos efectores o indicadores.
La composición farmacéutica puede tomar
cualquier forma para la administración, por ejemplo para la
administración oral, bucal, parenteral, nasal, tópica o rectal, o
una forma adecuada para la administración mediante inhalación o
insuflación, y preferiblemente está en una forma adecuada para la
administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o
infusión, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión
continua. Si la composición es para inyección o infusión, puede
tomar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un
vehículo acuoso o aceitoso y puede contener agentes de formulación
tal como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes,
antioxidantes y/o de dispersión.
Como alternativa, la composición puede estar en
forma seca, para la reconstitución antes de su uso con un líquido
estéril apropiado.
Si la composición es adecuada para la
administración oral, la formulación puede contener, además del
principio activo, aditivos tales como: almidón, por ejemplo almidón
de patata, maíz o trigo o derivados de celulosa o almidón tales
como celulosa microcristalina; sílice; diversos azúcares tales como
lactosa; carbonato de magnesio y/o fosfato de calcio. Es deseable
que, si la formulación es para administración oral, sea bien
tolerada por el sistema digestivo del paciente. Para este fin,
puede ser deseable incluir en la formulación formadores de
mucosidad y resinas. También puede ser deseable mejorar la
tolerancia formulando el anticuerpo en una cápsula que sea
insoluble en los jugos gástricos. También puede ser preferible
incluir el anticuerpo o composición en una formulación de liberación
controlada.
Si la composición es adecuada para la
administración rectal, la formulación puede contener un agente de
unión y/o lubricante; por ejemplo glicoles poliméricos, gelatinas,
manteca de cacao u otras ceras o grasas vegetales.
Los usos terapéuticos y de diagnóstico de las
proteínas híbridas según la invención comprenden normalmente
administrar una cantidad eficaz de la proteína a un sujeto humano.
La cantidad exacta que va a administrarse variará según el uso
pretendido de la proteína y la edad, sexo y estado del paciente,
pero puede variarse normalmente desde aproximadamente 0,1 mg hasta
1000 mg, por ejemplo desde aproximadamente 1 mg hasta 500 mg. La
proteína puede administrarse como una dosis única o de una manera
continua a lo largo de un periodo de tiempo. Las dosis pueden
repetirse según sea apropiado. Las dosis típicas pueden ser por
ejemplo de entre 0,1-50 mg/kg de peso corporal por
dosis terapéutica única, particularmente de entre
0,1-20 mg/kg de peso corporal para una dosis
terapéutica única.
Las proteínas híbridas según la invención pueden
prepararse mediante procedimientos químicos, enzimáticos y/o de ADN
recombinante convencionales.
Por tanto, por ejemplo, la proteína híbrida
puede prepararse mediante el uso de técnicas de ADN recombinante
que implican la manipulación y reexpresión de ADN que codifica
regiones variables y/o constantes del anticuerpo y una proteína
vehículo deseada o un fragmento de la misma. Tal ADN se conoce y/o
está fácilmente disponible a partir de bibliotecas de ADN que
incluyen por ejemplo bibliotecas de fago-anticuerpo
[véase Chiswell, D J y McCafferty, J. Tibtech. 10,
80-84 (1992)] o puede sintetizarse si se desea.
Pueden usarse procedimientos de química y/o biología molecular
convencionales para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para
introducir codones para crear residuos de cisteína, para modificar,
añadir o delecionar otros aminoácidos o dominios en el anticuerpo
y/o vehículo según se desee.
A partir de aquí, pueden prepararse uno o más
vectores de expresión replicables que contienen el ADN y usarse
para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo una línea
celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o
una línea bacteriana, por ejemplo una línea de E. coli, o,
especialmente, una línea fúngica, tal como una línea de levaduras,
por ejemplo miembros del género Pichia, Saccharomyces,
o Kluyveromyces, en las que se producirá la producción del
anticuerpo. Con el fin de obtener una transcripción y traducción
eficaces, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias
reguladoras apropiadas, particularmente una secuencia promotora y
líder operativamente unida a la secuencia del dominio variable. Los
procedimientos particulares para producir proteínas recombinantes de
esta forma se conocen bien en general y se usan rutinariamente. Por
ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica
por Maniatis et al [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory, Nueva York, 1989]; la secuenciación del ADN puede
realizarse según lo descrito por Sanger et al [PNAS 74, 5463,
(1977)] y el manual de secuenciación plc de Amersham International;
y la mutagénesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo según el
procedimiento de Kramer et al [Nucl. Acids Res. 12, 9441,
(1984)] y el manual de Anglian Biotechnology Ltd. Adicionalmente,
existen numerosas publicaciones, incluyendo memorias descriptivas de
patentes, que detallan técnicas adecuadas para la preparación de
proteínas mediante manipulación de ADN, creación de vectores de
expresión y transformación de células apropiadas, por ejemplo según
lo descrito en la memoria descriptiva de la patente internacional
número WO86/01533 y la memoria descriptiva de la patente europea
número 392745.
La síntesis química de las proteínas híbridas
según la invención puede lograrse acoplando apropiadamente un
anticuerpo funcionalizado, una proteína vehículo y, cuando sea
apropiado, grupos puente en un orden predeterminado. Pueden
emplearse técnicas de acoplamiento químico convencionales que
utilizan materiales de partida que contienen uno o más grupos
funcionales reactivos tales como tioles, ácidos, tioácidos,
anhídridos, haluros de ácido, ésteres, imidas, aldehídos, cetonas,
iminas y aminas. El anticuerpo y proteína vehículo de partida pueden
obtenerse fácilmente a partir de fuentes naturales y/o mediante
técnicas de ADN recombinante según se describió anteriormente. Los
grupos puente adecuados, por ejemplo en el intervalo de longitud de
10 \ring{A}-20 \ring{A} según se describió
anteriormente, están disponibles comercialmente [véase, por ejemplo
Pierce & Warriner (UK) Ltd., Chester, RU] o bien pueden
obtenerse mediante funcionalización simple de productos químicos
fácilmente disponibles conocidos usando química convencional.
Por tanto, en un enfoque general, un grupo
puente homo- o heteropolifuncional, por ejemplo bi- o trifuncional,
puede acoplarse en primer lugar al anticuerpo o bien a la proteína
vehículo y el producto resultante puede acoplarse según sea
necesario al/a los componente(s) restante(s) para
proporcionar la proteína híbrida de la invención. Las reacciones de
acoplamiento pueden realizarse usando condiciones convencionales
para las reacciones de este tipo. Por tanto, por ejemplo, la
reacción puede realizarse en un disolvente, por ejemplo un
disolvente orgánico, un disolvente acuoso-orgánico
o, especialmente, un disolvente acuoso a o aproximadamente a
temperatura ambiente hasta aproximadamente 70ºC. Preferiblemente,
para evitar la polimerización no deseada en la primera reacción de
acoplamiento, se emplea el grupo puente homo- o heteropolifuncional
en una concentración en exceso con respecto al anticuerpo o
proteína vehículo. De manera similar, en la segunda reacción de
acoplamiento, se emplea preferiblemente el anticuerpo o proteína
vehículo en una concentración en exceso con respecto al producto de
la primera reacción de acoplamiento. Se describen reacciones
ilustrativas en detalle en los ejemplos a continuación en el
presente documento para la preparación de proteínas según la
invención y estos pueden adaptarse fácilmente usando diferentes
materiales de partida para proporcionar otros compuestos de la
invención.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
En estos se hace referencia a diversas figuras que son:
Figura
1
Se hizo correr el conjugado
RSA-Fab' tanto en condiciones reductoras como no
reductoras. Se estimaron los pesos moleculares aparentes
aproximados mediante comparación con proteínas convencionales que se
hacen correr en el mismo gel en condiciones reductoras. Se
determinaron las proporciones molares mediante secuenciación en el
extremo N-terminal de bandas inmunotransferidas de
geles sobre membrana de PVDF.
Figura
2
Se marcaron las proteínas con ^{125}I antes de
la inyección en 6 ratas. Se cuantificó la radiactividad presente en
la muestra de sangre tomada a intervalos mediante recuento de rayos
gamma. Se muestran los resultados del análisis mediante Winnonlin.
Las unidades para la semivida plasmática en las fases \alpha y
\beta (t_{1/2}\alpha y t_{1/2}\beta, respectivamente) son
horas (h). Las áreas bajo las curvas de concentración
plasmática-tiempo (AUC, 0-\infty)
están en las unidades de h*% de dosis. Los datos representados como
conjugado RSA-Fab' (factor de corrección) se han
corregido a partir de los datos para el conjugado
RSA-Fab' para tener en cuenta la inestabilidad de la
proteína marcada, según se describe en el texto.
Figura
3
Se inyectaron proteínas no marcadas en 2 ratas y
se cuantificaron posteriormente en muestras de plasma mediante
ELISA. En el caso del conjugado, el ELISA empleó la unión del
ligando (TNF) y del anticuerpo anti-albúmina, y en
el caso del control Fab'-Cys empleó la unión del TNF
y de la cadena L anti-kappa, según se describe en
el texto. Las unidades para la semivida plasmática en las fases
\alpha y \beta (t_{1/2}\alpha y t_{1/2}\beta,
respectivamente) son horas (h). Como alternativa, se sometieron a
ensayo las muestras mediante neutralización de la actividad de TNF
en el ensayo L929. Las áreas bajo las curvas de concentración
plasmática-tiempo (AUC, 0-\infty)
están en las unidades de h*%\mug/ml. Las curvas para
RSA-Fab' se superponen entre sí y asimismo las
curvas para Fab'-Cys. Barras de error = e.e.m.
Figura
4
Diagrama de flujo del procedimiento de
construcción.
Figura
5
Se hizo correr una muestra de cada proteína de
fusión antes y después de la cromatografía en Blue Sepharose en
condiciones reductoras, junto con marcadores de peso molecular
convencionales y RSA convencional en el mismo gel.
\newpage
Figura
6
Se marcaron las proteínas con ^{125}I antes de
la inyección en 6 ratas. Se cuantificó la radiactividad presente en
la muestra de sangre tomada a intervalos mediante recuento de rayos
gamma. Se muestran los resultados de los análisis mediante
Winnonlin. Las unidades para la semivida plasmática en las fases
\alpha y \beta (t_{1/2}\alpha y t_{1/2}\beta,
respectivamente) son horas (h). Las áreas bajo las curvas de
concentración plasmática-tiempo (AUC,
0-\infty) están en las unidades de h*% de
dosis.
Figura
7
Se usó este reactivo en la generación del
conjugado RSA-F(ab')_{2}.
Figura
8
Se hicieron correr las proteínas convencionales
y de muestra purificada en el mismo gel en condiciones reductoras.
Se determinaron las proporciones molares mediante secuenciación en
el extremo N-terminal de bandas inmunotransferidas
de geles sobre membrana de PVDF.
Figura
9
Se calcularon 2 valores para K_{D} para cada
una de las curvas (bifásicas), tal como se muestra. Cada fase de
cada curva se muestra como una línea recta.
Se produjo Fab' anti-TNF
recombinante en E. coli, y se preparó a partir del periplasma
mediante los procedimientos descritos en la memoria descriptiva de
la patente internacional número WO98/25971.
Se disolvió albúmina sérica de rata (RSA,
fracción V, Sigma, número de código A-6272) hasta
6,7 mg/ml (0,1 mM) en acetato de sodio, 0,1 M, pH 5,9. Se añadió
disolución de ditiotreitol (100 mM en el mismo tampón acetato) para
dar una concentración final de ditiotreitol de 0,3 M, proporcionando
así un exceso molar de 3 veces sobre la RSA. Se incubó la mezcla a
37ºC durante 40 min. Se sometió entonces la mezcla a cromatografía
sobre Sephadex G25M usando una columna PD10 (Pharmacia, número de
código 17-0851-01, usada según las
instrucciones del fabricante), eliminando así el ditiotreitol e
intercambiando el tampón por fosfato de sodio, 0,1 M, pH 6,
etilendiaminatetraacetato (EDTA) 2 mM. La concentración de RSA en
esa fase fue de 70 \muM.
Se disolvió
1,6-bismaleimidohexano (BMH, Pierce, número de
código 22330) hasta 7,736 mg/ml (28 mM) en dimetilformamida. Se
añadió la disolución de BMH a la disolución de RSA reducida para dar
un exceso molar de 21 veces de BMH sobre RSA. Se incubó la mezcla a
21ºC durante 100 min., se sometió entonces a cromatografía sobre
G25M en un tampón de fosfato de sodio, 0,1 M, pH 6, EDTA 2 mM. La
concentración de RSA derivatizada fue de 46 \muM en esa fase.
Se mezclaron las disoluciones de RSA
derivatizada y el Fab' anti-TNF (187 \muM) en
fosfato de sodio, 0,1 M, pH 6, EDTA 2 mM para dar una proporción
molar, RSA:Fab':1:1,3 (que, corregida para la derivatización de RSA
y la reducción del tiol de Fab' dio una proporción, RSA
derivatizada:Fab' reducido:1:1,4). Se incubó la mezcla a 21ºC
durante 2 h, aunque la reacción se completó esencialmente en el
plazo de 1 h. Se almacenó entonces la mezcla a 4ºC hasta que se
sometió a los procedimientos de purificación.
El procedimiento para la preparación de la
molécula control, Fab' anti-TNF unido covalentemente
mediante BMH a través de tioles a cisteína (en lugar de RSA) fue
esencialmente el mismo que para la preparación del conjugado (véase
anteriormente). Se hizo reaccionar Fab' 20 \muM a 21ºC durante 95
min. con un exceso molar de 40 veces de BMH (añadido como una
disolución en dimetilformamida). Tras la cromatografía sobre G25M
(para eliminar BMH), se hizo reaccionar el Fab' derivatizado con
cisteína (Sigma, número de código C-4820) a una
proporción molar de Fab':tiol libre de cisteína:1:4,5. Tras la
reacción a 21ºC durante 160 min., se almacenó la muestra a 4ºC
antes de la purificación del producto de
Fab'-Cys.
Se sometió la mezcla de reacción en primer lugar
a cromatografía sobre Gammabind plus (Pharmacia), una matriz que
tiene afinidad por Fab'. Se equilibró una columna de 5,3 ml en un
tampón de fosfato de sodio, 0,1 M, pH 6, EDTA 2 mM a un caudal de 2
ml/min. Toda la cromatografía fue a una temperatura de 21ºC. Se
aplicó la muestra a la columna a un caudal de 1 ml/min., y se lavó
entonces la columna en el mismo tampón (fosfato de sodio, 0,1 M, pH
6, EDTA 2 mM) hasta que se restauró el nivel inicial. Se eluyó la
proteína adsorbida mediante la aplicación de un tampón de ácido
acético, 0,5 M, preparado a pH 3 mediante la adición de hidróxido de
sodio. Se recogió el eluyente completo en fracciones y se analizó
cada fracción mediante SDS PAGE (usando tanto condiciones
reductoras como no reductoras). Tal como se esperaba de esta matriz
de afinidad, el Fab' no conjugado eluyó en el tampón a pH 3,
mientras que la RSA no conjugada no se unió nada a la matriz y salió
en la fracción no retenida durante la carga de la muestra. La
conjugación de un único Fab' a una molécula de RSA afectó claramente
a su unión a la proteína G sobre la matriz, para el conjugado que
salió en la fracción no retenida, justo ligeramente más tarde que
(y solapándose con) la RSA no conjugada. Se sometió la fracción que
contenía el conjugado una vez más a cromatografía sobre Gammabind
plus (tal como anteriormente), con el fin de separar más RSA de la
misma. Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado (y
algunas trazas de RSA) en una célula agitada (Amicon, membrana de
punto de corte de peso molecular nominal de 10 kDa).
Se eliminó la RSA contaminante de la preparación
mediante cromatografía de permeación en gel sobre una columna de
HPLC GF250 de tamaño 2x23 cm (usando un aparato de HPLC Hewlett
Packard 1090). Se equilibró la columna y se eluyó en un tampón de
fosfato de sodio, 0,2 M, pH 7, a un caudal de 3 ml/min., a 21ºC. Se
sometió a cromatografía la muestra de conjugado concentrado (y RSA)
y se controló la elución a 280 y 220 nm. Se recogieron las
fracciones correspondientes a los picos observados y se analizaron
mediante SDS PAGE. Se combinaron las fracciones que contenían el
conjugado (que se resolvió completamente a partir de la RSA que
eluye más tarde) y se concentraron en una célula agitada (Amicon,
membrana de punto de corte de peso molecular nominal de 10 kDa). Se
almacenó la disolución a 4ºC, con azida de sodio añadida al 0,05%
(p/v), para actuar como conservante.
Se diluyó la mezcla de reacción que contenía el
producto de Fab'-Cys 5 veces en un tampón de acetato
de sodio, 50 mM, pH 4,5, luego se cargó en una columna Mono S (de
volumen de 1 ml), usando un aparato FPLC (Pharmacia). Se eluyeron
entonces las proteínas adsorbidas en un gradiente de cloruro de
sodio de 0 a 250 mM en acetato de sodio, 50 mM, pH 4,5. Se controló
la elución (1 ml/min. a 21ºC) mediante la absorción a 280 nm. Se
analizaron los picos recogidos mediante SDS PAGE.
Se marcaron las proteínas en los grupos
\varepsilon-amino de residuos de lisilo, usando
reactivo de Bolton y Hunter marcado con ^{125}I (Amersham
International, número de código IM5861). Se disolvieron las
proteínas o se diluyeron en un tampón de borato, para dar una
concentración final de borato de 0,1 M, pH 8. Se mezcló entonces
una disolución (de entre 300 \mul y 370 \mul) que contenía 300
\mug de proteína con 20 \mul de disolución de reactivo de
Bolton y Hunter en propan-2-ol (que
contenía 9 MBq de ^{125}I). Se incubó la mezcla a 21ºC durante 15
min., luego se extinguió la reacción mediante la adición de 60
\mul de disolución de glicina, 1 M, en borato, 0,1 M, pH 8,5.
Tras aproximadamente 5 min. de reacción a 21ºC, se sometió la mezcla
de reacción a cromatografía sobre Sephadex G25M usando una columna
PD10 (Pharmacia, número de código
17-0851-01, usada según las
instrucciones del fabricante). Al hacer esto, se intercambió el
tampón por solución salina tamponada con fosfato. Se calculó la
actividad específica de cada preparación a partir de los cálculos de
la concentración de proteína (véanse los procedimientos analíticos)
y de radiactividad, y estaban normalmente en el intervalo de 0,45
\muCi/\mug a 0,54 \muCi/\mug. Se usaron directamente las
muestras radiomarcadas tras el marcaje.
La electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodesilsulfato de sodio (SDS PAGE) utilizó geles de SDS
prefabricados (Novex), de 1 mm de espesor y de una concentración de
acrilamida del 4% al 20%, que se hicieron correr según las
instrucciones del fabricante. Se tiñeron los geles empapándolos
durante 1 h en Coomassie BBG en ácido perclórico (Sigma, número de
código B-8772), seguido por lavado en agua. Se
usaron diversos patrones de peso molecular con el fin de derivar
pesos (aparentes) moleculares aproximados para las proteínas de la
muestra. Estos patrones eran los marcadores Mark 12 y Seeblue, no
teñidos y teñidos previamente, respectivamente (Novex). Para las
inmunotransferencias de tipo Western, a la SDS PAGE le siguió la
inmunotransferencia a una membrana de difluoruro de polivinilideno
(Millipore), con detección del fragmento Fd de Fab' mediante la
fracción de IgG de oveja anti-IgG(Fd) humana
(The Binding Site, número de código PC075) seguido por fragmento
F(ab')_{2}-affinipure-peroxidasa
de IgG de conejo anti-oveja, fragmento Fc
(Immunoresearch, número de código 313036046) y visualización
mediante el uso de quimioluminiscencia (ECL; Amersham
International). Para la autorradiografía, a la SDS PAGE le siguió
la exposición del gel a película fotográfica (Hyperfilm MP; Amersham
International). Para la obtención de imágenes de muestras
radiomarcadas en geles (y posterior cuantificación), se expusieron
los geles a selecciones de alta resolución o de uso general y se
procesaron en el sistema Canberra Packard Cyclone, usando el
programa Optiquant.
La cuantificación de las disoluciones de
proteína fue mediante absorción a una longitud de onda de 280 nm en
una célula de 1 cm, usando coeficientes de absorción (para una
disolución de 1 mg/ml en una célula de 1 cm) de 1,43 para Fab' o
F(ab')_{2} y de 0,58 para RSA. Se calculó un coeficiente de
1,0 para el conjugado RSA-Fab' a partir de los de
RSA y Fab', pesado según las masas constituyentes de los dos
componentes.
Se midió la concentración de tiol libre en una
disolución de proteína añadiendo un volumen de 1/9 de
4,4'-ditiodipiridina (5 mM, por tanto la
concentración final fue de 0,5 mM) en solución salina tamponada con
fosfato. Tras 10 min. a 21ºC, se midió la absorbancia a 324 nm en
una célula de 1 cm. Se restó la absorbancia de una muestra de
blanco sólo con el tampón de este valor, y se multiplicó este número
por 56,1167 para dar el resultado en \muM de tiol (corrigiéndose
éste además para cualquier dilución de la muestra original).
Se realizó la secuenciación en el extremo
N-terminal de la proteína según las instrucciones
del fabricante en un secuenciador de proteínas modelo 470A con un
instrumento de HPLC 120A y un sistema de análisis de datos 900A en
línea (Applied Biosystems). Se adsorbió la proteína en disolución en
una membrana de difluoruro de polivinilideno en un dispositivo
Prosorb (Applied Biosystems). Se inmunotransfirieron las proteínas a
partir de la SDS PAGE a una membrana de difluoruro de
polivinilideno (Immobilon PSQ, Millipore), y se detectaron las
bandas de proteína mediante tinción por Ponceau S al 0,1% (p/v)
(Sigma, número de código P-3504) en ácido acético
al 1% (v/v) durante 1 min., destiñendo después el fondo en agua. Se
cortaron las bandas y se secuenciaron directamente.
Se realizó el estudio de resonancia de plasmón
superficial de las interacciones con el ligando en un aparato
BIACORE 2000 (Biacore AB), según las recomendaciones del fabricante.
Se usó una superficie de chip detector revestido por anticuerpo de
cabra anti-F(ab')_{2} humano (Jackson
ImmunoResearch Lab. Inc.), que se une a la cadena ligera, para unir
el conjugado, Fab' o IgG, cuya unión al ligando (TNF) de la
disolución pudo medirse después.
Se realizaron los ELISA tal como sigue a
continuación, con etapas intercaladas lavando en Tween 20 al 0,1%
en solución salina tamponada con fosfato. Se revistieron los
pocillos de la placa de microtitulación con el antígeno citocina.
Se bloquearon entonces los sitios de unión no específica mediante
incubación de los pocillos con una disolución al 5% (p/v) de leche
desnatada secada ("Marvel", Premier Beverages, RU) en solución
salina tamponada con fosfato, durante 1 h. Se diluyeron las
muestras o patrones en albúmina sérica bovina, al 1% (p/v) en
solución salina tamponada con fosfato y después se incubaron en los
pocillos durante 1 h a 21ºC. La cuantificación fue mediante
absorción a 630 nm, generada a partir de 3,2'5,5'
tetrametilbencidina (120 \muM en acetato 10 mM, pH6) como
resultado de la actividad de peroxidasa, siguiendo cualquiera
de:
(i) Para la detección del conjugado
albúmina-Fab', se incuba cada pocillo con anticuerpo
de conejo anti-albúmina de rata (Cappel, número de
producto 55711, diluido 1 en 4000 en albúmina sérica bovina al 1% en
solución salina tamponada con fosfato), seguido por conjugado de
cabra anti-inmunoglobulina Fc de
conejo-peroxidasa (Jackson, número de producto
111-036-046, diluido 1 en 5000 en
albúmina sérica bovina al 1% (p/v) en solución salina tamponada con
fosfato).
(ii) Para la detección de Fab', se incuba en
anticuerpo de cabra anti-cadena ligera kappa humana
(Southern Biotechnology Associates, Inc., número de producto
2060-01, diluido 1 en 5000 en albúmina sérica bovina
al 1% en solución salina tamponada con fosfato), seguido por
conjugado de asno anti-inmunoglobulina (H+L) de
cabra-peroxidasa (Jackson, número de producto
705-035-147, diluido 1 en 5000 en
albúmina sérica bovina al 1% (p/v) en solución salina tamponada con
fosfato).
El formato (i) de ensayo dio una respuesta
lineal en el intervalo de 40-500 ng/ml de conjugado,
y el formato (ii) de ensayo dio una respuesta lineal en el
intervalo de 5-100 ng/ml de Fab'.
Para someter a ensayo la neutralización de la
actividad de TNF, se hizo crecer una monocapa de células L929 de
ratón en RPMI 1640 normal más glutamina y suero de ternero fetal al
10% (v/v). Se añadió TNF en presencia de actinomicina D (al 1%,
p/v) con o sin muestra/anti-TNF. Se controló la
muerte celular provocada por TNF mediante el ensayo de MTT: se
añadió bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
(MTT; Sigma, número de código M-2128) hasta una
concentración final de 50 \mug/ml en el medio de las células
tratadas y se incubó a 37ºC durante 4 h. Se paró la reacción y se
solubilizó el color marrón producido por las células vivas mediante
una disolución de SDS, al 20% (p/v) en dimetilformamida el 50% en
agua, a pH 4,7 (mediante adición de ácido acético al 50%, 1 M, en
ácido clorhídrico, 1 M) y después se cuantificó midiendo la
absorbancia a 570 nm. Habiendo restado la absorbancia a 630 nm,
pudo evaluarse el grado de supervivencia celular (y así la
concentración de TNF activo presente) mediante la comparación con
muestras de células tratadas mediante cantidades patrón de TNF en
ausencia de actividad neutralizante de TNF.
\newpage
Se prepararon de manera reciente plasma y sangre
(heparinizados) de rata. A 100 \mul se añadieron 12 \mul de
disolución de proteína marcada con ^{125}I. La incubación fue a
37ºC en un tubo de 0,5 ml tapado, retirándose muestras de 0,5
\mul y 2 \mul a intervalos para la SDS PAGE y la
autorradiografía.
Se mezcló el conjugado no marcado o
Fab'-Cys (2 \mul de disolución 0,9 mg/ml) con 100
\mul de plasma de rata recién preparado y se incubó a 37ºC en un
tubo de 0,5 ml tapado. Se retiraron muestras de 2 \mul a
intervalos para el análisis mediante inmunotransferencia de tipo
Western.
Recibieron cada una de las ratas Wistar macho
(de aproximadamente 250 g cada una) 20 \mug de proteína marcada
con ^{125}I, o 180 \mug de proteína no marcada en disolución en
solución salina tamponada con fosfato, que se inyectaron en una
vena de la cola. Después de eso, se tomaron muestras de sangre de la
arteria de la cola a intervalos, preparándose el plasma mediante
heparinización y centrifugación. Se analizaron las muestras según
se describió anteriormente (véanse los procedimientos analíticos) y
se calculó la radiactividad en la sangre completa como cpm/g de
sangre. Se calculó el porcentaje de dosis inyectada (% de DI) para
cada rata individual, basándose en patrones y se expresó como % de
DI/ml de volumen de sangre total. Se usaron grupos de 6 ó 2 ratas
para el estudio de la proteína marcada con ^{125}I o no marcada,
respectivamente.
Se analizaron los datos mediante el programa
WinNonlin con el fin de determinar los valores farmacocinéticos
citados. Se usó un modelo bicompartimental para este análisis a
menos que se indique lo contrario.
Se sabe que aunque la albúmina sérica tiene un
residuo de cisteinilo que no está implicado en un puente disulfuro
(residuo 34 en la secuencia de la albúmina humana madura), muchas de
las moléculas en una preparación de albúmina no presentan un tiol
de cisteinilo libre debido a la formación de disulfuros mixtos con
moléculas tales como glutatión o cisteína libre [Peters,
ibídem 1985]. Según esto, el análisis de la disolución de
albúmina de rata antes de la reducción mostró que había 0,15 moles
de tiol por mol de albúmina, es decir, sólo un 15% de las moléculas
de albúmina presentaban un tiol libre. Tras la reducción, esto
aumentó hasta 0,95 moles de tiol por mol de albúmina, consecuente
con la presencia de un grupo tiol libre en el 95% de las moléculas
de albúmina, lo más probablemente en la posición 34 en la secuencia
de albúmina madura, ya que la reducción en condiciones tales como
las usadas en el presente documento no perturban ninguno de los
disulfuros presentes en cualquier lugar en la molécula [Peters,
ibídem 1985]. La posterior reacción en este residuo de
cisteinilo permitió la unión de otra molécula en un sitio
específico, y en una proporción molar de 1:1, sin producción
concomitante de otros productos de proporción superior de
albúmina:otra molécula que sería necesario eliminar posteriormente.
Las coordenadas para la estructura cristalina de la albúmina sérica
humana se han depositado en la base de datos Brookhaven (como
entrada 1AO6, por S. Sugio, S. Mochizuki y A. Kashima). La
inspección de este modelo muestra que el residuo de cisteinilo
libre en la posición 34 se encuentra en una hendidura entre dos
hélices, pero no está claro a partir de esto qué longitud debe tener
un brazo espaciador en un agente de reticulación con el fin de
funcionar eficazmente. La ausencia de homodímero de albúmina sería
ventajosa en un procedimiento de producción ya que el rendimiento
de heterodímero sería entonces mayor, y tampoco habría necesidad de
una etapa adicional para eliminar el homodímero. Se encontró que el
agente de reticulación usado en el presente ejemplo produjo este
resultado ventajoso. La reacción de la albúmina reducida con un
exceso molar de 20 veces de BMH provocó una derivatización del 80%
de estas moléculas de albúmina. No se formaron homodímeros de
albúmina durante la derivatización de la albúmina (o reacción
posterior con otras moléculas proteicas). El brazo espaciador del
agente de reticulación, de 16,1 \ring{A} de longitud, era lo
suficientemente largo para alcanzar desde el tiol de cisteinilo en
la posición 34 hasta la superficie de la molécula de albúmina, en
la que pudo reaccionar con el tiol libre en una molécula de Fab'. No
era lo suficientemente largo para penetrar en la hendidura
equivalente en una segunda albúmina para alcanzar el tiol libre
allí, y así se evitó la producción de homodímeros.
Se mezclaron la albúmina derivatizada y Fab' en
la proporción molar de 1:1,4:albúmina:Fab'. El análisis mediante
SDS PAGE de los productos al final de la reacción indicó un
rendimiento de conjugado de albúmina-Fab' del orden
del 20% al 30%, aunque se esperaría que esto mejorase mediante la
optimización de las condiciones de reacción. Se purificó el
conjugado de la mezcla de reacción mediante cromatografía de
afinidad, no uniéndose el conjugado sorprendentemente a la matriz
tal como lo hizo Fab', pero eluyéndose ligeramente más tarde que la
albúmina, que no se unió en absoluto. Habiéndose eliminado el Fab'
no reaccionado, se separó la albúmina del conjugado mediante
exclusión molecular. Se analizó la preparación final de conjugado
mediante SDS PAGE (figura 1), que indicó (mediante los pesos
moleculares aparentes) el enlace de un Fab' por molécula de
albúmina. En la SDS PAGE no reducida la banda principal fue un
conjugado de 1 RSA con 1 molécula de Fab', según se determinó
mediante la secuenciación N-terminal de la proteína
de la banda. Aproximadamente un 37% del conjugado estaba presente
como una banda de peso molecular superior que tenía también una
proporción de RSA:Fab' de 1:1. Se asumió que éste era un material
de dímero, análogo a la aparición observada de polímeros de albúmina
en preparaciones no tratadas de albúmina. También estaban presentes
cantidades menores (aproximadamente el 2% del material total) de
conjugado que carecía de la cadena L, y un derivado pequeño supuesto
del conjugado (aproximadamente el 4% del total). El análisis de la
secuencia N-terminal de la proteína de la banda
principal en SDS PAGE en condiciones reductoras mostró que era
FSA-Fd (es decir, la cadena H de Fab'), de modo que
el enlace era específicamente a través de Fd de Fab' y no a través
de la cadena L. Por tanto, se confirmó la estequiometría 1:1 de la
conjugación.
La conjugación de Fab' con cisteína (para
producir la molécula control, Fab'-Cys) dio un buen
rendimiento (prácticamente todo el derivado de Fab' reaccionó con
la cisteína con sólo trazas de material de tipo F(ab')_{2}
mayor de aproximadamente 55 kDa (aparente) en la SDS PAGE en
condiciones no reductoras. Esta traza de material eluyó junto
después del producto Fab'-Cys, que eluyó en una
concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 75 mM en la
cromatografía Mono S, y se excluyó de la misma.
La capacidad de someter a ensayo el conjugado en
un ELISA que dependía de la unión del conjugado a TNF indicó que el
conjugado conservaba la capacidad de unirse a TNF. Esto se confirmó
mediante el análisis de la unión del conjugado a TNF mediante
resonancia de plasmón superficial usando el aparato BIACORE 200
(tasas de asociación y disociación, y constante de equilibrio,
véase la tabla 1). Esto mostró que el Fab' anti-TNF
no estaba afectado por la conjugación a la albúmina. Se confirmó
también esto mediante su igual capacidad para la neutralización de
TNF: en un ensayo de muerte de células L929 provocada por TNF, la
concentración de proteína para inhibir el 90% de la actividad de
TNF (la CI90) para el conjugado albúmina-Fab'
anti-TNF fue de 14,7 pM, en comparación con 18,0 pM
para el conjugado de Fab'
anti-TNF-cisteína, 10,9 pM para
F(ab')_{2} anti-TNF y 11,3 pM para IgG4
anti-TNF. El mantenimiento de la actividad de unión
de Fab' se atribuyó a la orientación deseada del dominio de unión
de Fab' lejos del punto de conjugación con la molécula de albúmina,
lograda seleccionando como diana la región de bisagra de Fab' como
el punto de unión al otro resto.
El control, Fab'-Cys, conservó
también su capacidad de unirse a, y de neutralizar, TNF, según se
observa mediante su detección por ELISA y su actividad en el ensayo
de L929.
Se controló la RSA marcada con ^{125}I, Fab',
F(ab')_{2} y el conjugado RSA-Fab' en
plasma tomado como muestra a diversos tiempos a lo largo de 144 h
(figura 2). La semivida en la fase \beta observada de la albúmina
estaba de acuerdo con el valor de la bibliografía de aproximadamente
2 días [Peters, ibídem 1985]. La semivida en la fase \beta
del F(ab')_{2} y el Fab', era similar a la de
F(ab')_{2} descrita anteriormente [por ejemplo, Kitamura
et al, ibídem; Chapman et al, ibídem], y
estaba precedida por una eliminación rápida en la fase \alpha,
típica de tales moléculas. Sin embargo, cuando Fab' estaba conjugado
a RSA, persistió en la circulación de la rata hasta un grado
comparable a la albúmina de rata. Debido a una reducción de la
eliminación durante tanto la fase \alpha como \beta, el
conjugado mostró un área bajo la curva de concentración plasmática
(AUC, 0-\infty) 35 veces mayor que el control
Fab'-Cys, similar a la de la albúmina sola. Con el
fin garantizar que la radiactividad detectada en las muestras de
plasma reflejaba el conjugado restante, se corrieron las muestras
de una rata a la que se había administrado conjugado marcado en SDS
PAGE y se exploraron mediante un sistema de detección y
cuantificación de la radiactividad (Phosphorimager) (datos no
mostrados). Esto mostró la persistencia in vivo del
conjugado marcado intacto durante al menos 120 h, y se calculó que
la semivida en la fase \beta del conjugado intacto era de 32,70 h,
en buena concordancia con el resultado equivalente de la detección
mediante ^{125}I total.
Se inspeccionó la estabilidad del conjugado en
el plasma. La incubación del conjugado no marcado en plasma de rata
(in vitro) a 37ºC durante 68 h en presencia o ausencia de una
variedad de inhibidores de proteasas, controlada mediante SDS PAGE
e inmunotransferencia de tipo Western, indicó que el conjugado era
estable en el plasma de rata. El conjugado que se había marcado con
^{125}I se incubó in vitro en solución salina tamponada
con fosfato (pH 7) durante hasta 10 días y también se encontró que
era estable.
Sin embargo, la incubación del conjugado marcado
con ^{125}I a 37ºC en el plasma o sangre de rata in vitro
indicó que la molécula no era completamente estable, experimentando
algunas moléculas escisión en o cerca del punto de enlace entre la
albúmina y la molécula de Fab'. Dado que el conjugado no marcado era
estable, se atribuyó la inestabilidad observada a la modificación
de la proteína mediante la presencia de ^{125}I o mediante el
procedimiento de marcaje. A pesar de una aparente inestabilidad en
estas condiciones, se mantuvo el material intacto incluso tras 168
h de incubación in vitro. Se evaluó la integridad del
conjugado in vivo mediante SDS PAGE de muestras de plasma,
seguido por cuantificación del conjugado intacto mediante
exploración por sistema de detección y cuantificación de la
radiactividad, y como en los experimentos in vitro, se
observó una pequeña inestabilidad del conjugado marcado con
^{125}I. Los resultados observados a partir de los experimentos
in vivo pudieron ajustarse en consecuencia para reflejar
solamente la cantidad de conjugado intacto, marcado. Los datos
ajustados dieron el resultado mostrado en la figura 2 (véase el
conjugado (corrección)), que fue tal que incluso la versión marcada
ligeramente inestable del conjugado tenía un AUC que era 17 veces
mayor que la del control Fab'-Cys.
La conclusión de que los datos derivados del uso
del conjugado marcado con ^{125}I representan una subestimación
de la longevidad del conjugado no marcado in vivo estaba
apoyada por un experimento en el que el conjugado no estaba
marcado. Se controló la proteína no marcada mediante dos formas de
ELISA y mediante la actividad biológica (neutralización de TNF en
el ensayo L929). Los resultados del uso de los tres ensayos en
muestras de dos ratas fueron similares entre sí (figura 3),
mostrando que RSA-Fab' era estable in vivo
durante periodos prolongados. Sin embargo, Fab'-Cys
se eliminó rápidamente, de modo que se obtuvieron pocos datos
mediante ELISA como para permitir el uso de un modelo
bicompartimental, y el AUC estimado facilitado en la figura 3 es
mediante el uso de un modelo monocompartimental. Se obtuvieron muy
pocos datos mediante el uso del ensayo de actividad como para
permitir cualquier modelado en absoluto. El AUC del conjugado
RSA-Fab' fue aproximadamente 200 veces mayor que el
del control Fab'-Cys.
Se ha mostrado que es posible preparar un
fragmento Fab' de anticuerpo IgG, reticularlo químicamente con
albúmina in vitro conservando la capacidad de unión total
(teniendo la misma afinidad observada en el anticuerpo completo), y
se demuestra que tiene una semivida significativamente más larga
in vivo que la del Fab' no conjugado. El conjugado contenía
un Fab' por molécula de albúmina. La semivida en la fase \beta del
conjugado en la rata era aproximadamente dos veces la del Fab no
conjugado, estando próxima a la de la albúmina no conjugada, y el
área bajo la curva era aproximadamente 200 veces mayor para el
conjugado que para el Fab' no conjugado. Por tanto, la consecuencia
de la conjugación de Fab' con albúmina fue una prolongación
significativa de su actividad biológica in vivo, permitiendo
(en el presente caso) un tratamiento anti-citocina
prolongado.
El plásmido pPIC(scFv) contenía el gen
para un scFv anti-TNF, que comprendía los dominios
variables en el orden V_{L}-V_{H}. Este
plásmido se escindió con enzimas de restricción KpnI y NotI para
generar un fragmento de ADN "vector" que se purificó tras la
electroforesis en agarosa. Dentro de éste se ligó un fragmento PvuII
- NotI de ADN que contenía el gen de HSA madura, junto con un
conector de 200 pb que codificaba una fusión en marco directa entre
el extremo C-terminal de scFv y el extremo
N-terminal de HSA. Este procedimiento se resume en
la figura 4. El conector o fragmento de unión introdujo también un
sitio de restricción ClaI único para facilitar la construcción de
otra serie de genes que codifican proteínas de fusión que contienen
espaciadores diferentes para separar físicamente los motivos scFv y
HSA. Se usaron casetes oligonucleotídicos hibridados para introducir
los siguientes espaciadores entre los sitios KpnI y ClaI:
1. Una secuencia que codifica 3 repeticiones de
la secuencia Gly_{4}Ser.
2. Una secuencia derivada del extremo
N-terminal flexible de la región bisagra de IgG1
humana.
Además, se generó un gen que codifica otra
proteína de fusión en la que se usó el dominio C de la cadena ligera
kappa de Ig humana como un espaciador para separar el scFv (esta
vez en la orientación V_{H}-V_{L}) de la HSA.
La nomenclatura del constructo fue: scFv-HSA;
scFv-G4S-HSA;
scFv-UHL-HSA;
scFv-C_{K}-HSA,
respectivamente.
Se linealizaron estos plásmidos y se
transfectaron en células de Pichia pastoris competentes. Esto
se realizó usando un kit de expresión en Pichia
"EasySelect" (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se seleccionaron transformantes mediante resistencia a
zeomicina (500 g/ml) incorporada en el agar YPDS usado para
hacerlos crecer. Se confirmaron los transformantes como
Mut^{++}, es decir, que podían utilizar metanol como única
fuente de carbono, aunque sensibles a la presencia de metanol en
exceso. Se recogieron dos colonias de cada uno de los 4 tipos de
transformante y se hicieron crecer en cultivo de matraz de
agitación en medio BMGY, según las instrucciones del kit de
expresión en Pichia "EasySelect". Cada cultivo era de
25 ml en un matraz de 25 ml, se incubó a 30ºC, agitando a 225 rpm.
Tras 16-18 h, cuando los cultivos habían crecido
hasta dar una densidad óptica a 600 nm (DO600) de entre 2 y 6, se
recogieron las células mediante centrifugación y se resuspendieron
en 30 ml-40 ml de medio BMMY (que contiene metanol
como fuente de carbono), hasta dar una DO600 de 1. Se continuó
entonces la incubación con agitación y adición ocasional de metanol
con el fin de mantener una concentración de metanol de
aproximadamente el 0,5% (v/v). Tras 84 h de incubación, se
centrifugaron los cultivos y se conservaron los sobrenadantes para
su uso en la preparación de proteínas de fusión expresadas y
secretadas.
Se purificaron las proteínas expresadas del
medio de cultivo de levaduras tras la clarificación mediante
centrifugación. Se sometió el medio a cromatografía en una matriz
de Blue sepharose (Pharmacia), que actuó como una matriz de
afinidad para las proteínas que contenían albúmina, tal como sigue a
continuación. Se mezcló cada sobrenadante clarificado con un
volumen de solución salina tamponada con fosfato, pH 7, y se aumentó
el pH de la mezcla desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente
7 mediante la adición de un pequeño volumen de disolución de
hidróxido de sodio (2 M). Se aplicó entonces la muestra a una
columna de 1,5 ml de Blue sepharose, equilibrada previamente en
solución salina tamponada con fosfato, pH 7. El caudal en todas las
fases fue de 0,5 ml/min, y la temperatura fue de 21ºC. Tras la
aplicación, se lavó la columna con solución salina tamponada con
fosfato hasta que se logró un nivel inicial estable, y entonces se
eluyó la proteína unida mediante el eluyente tiocianato de sodio,
0,2 M en solución salina tamponada con fosfato. Se controló la
elución mediante absorción a una longitud de onda de 280 nm. Se
recogió la proteína eluida, se concentró y se intercambió su tampón
por solución salina tamponada con fosfato mediante el uso de un
concentrador de célula agitada (Amicon, usando una membrana de
filtro con un punto de corte de peso molecular nominal de 10 kDa).
Se cuantificó la proteína mediante absorbancia a una longitud de
onda de 280 nm y el uso de un coeficiente de absorción teórico que
se calculó para cada proteína de fusión mediante el uso del
programa ProtParam (encontrado en el sitio de Internet ExPasy).
Se marcaron proteínas de fusión sin conector,
con conector de G4S o con conector de bisagra superior, y albúmina
sérica humana no modificada con ^{125}I, según se describió en el
ejemplo 1, anterior.
Se caracterizaron las proteínas y se analizó su
farmacocinética en ratas según se describió en el ejemplo 1.
Se expresaron las cuatro proteínas de fusión
scFv-albúmina sérica humana (HSA) en Pichia
pastoris, que se secretaron en el medio a las siguientes tasas,
según se determinó mediante absorbancia a 280 nm de disoluciones de
proteína preparadas mediante cromatografía (media de 2
experimentos): scFv-HSA (sin conector), 9,0
\mug/ml; scFv-G4S-HSA, 8,5
\mug/ml; scFv-UHL-HSA, 7,5
\mug/ml; scFv-C_{K} conector, 7,8 \mug/ml. Las
bandas correspondientes a las proteínas expresadas pudieron
observarse tras la SDS PAGE del medio de cultivo de levaduras no
fraccionado (por ejemplo, figura 5). No se emprendió desarrollo con
el objetivo de mejorar los niveles de expresión. Estos datos
sugirieron que el orden de los dominios variables en la porción de
scFv no afectó de manera significativa a los niveles de expresión de
la proteína de fusión.
La SDS PAGE en condiciones reductoras (figura 5)
de proteínas de fusión preparadas tras sólo cromatografía en Blue
sepharose mostró que cada una contenía una banda principal y una
minoritaria, en la que las especies principales representaban el
91% de toda la proteína en la preparación de
scFv-HSA, el 75% en la preparación de
scFv-G4S-HSA, el 80% en
scFv-UHL-HSA, y el 83% en la
preparación de scFv-CK-HSA, según se
estimó mediante exploración de geles teñidos con azul brillante G.
La banda principal en cada preparación tenía un peso molecular
aparente igual al peso molecular teórico calculado a partir de la
secuencia de ADN traducida. La banda minoritaria en cada una migró
con la albúmina sérica humana patrón en el mismo gel, indicando
acontecimiento(s) de escisión minoritario(s) en la
secuencia entre la albúmina y scFv o
scFv-bisagra/secuencia espaciadora. La secuenciación
del extremo N-terminal de este producto minoritario
en la preparación de scFv-G4S-HSA
mostró que de hecho tiene el extremo N-terminal de
HSA madura. El análisis de la secuencia del extremo
N-terminal de las proteínas de fusión mostró que
tienen el extremo N-terminal de scFv esperado,
precedido en cada caso por la secuencia de EAEA, que se había
incluido en la proteína de fusión con el fin de aliviar
posible(s) problema(s) de impedimento estérico que
volviese(n) ineficaz la escisión de la
pro-secuencia (según lo tratado por Sreekrishna, K.
et al (1997) Gene, 190, 55-62). Sin embargo,
esta secuencia espaciadora EAEA no se eliminó posteriormente
mediante la actividad diaminopeptidasa de levaduras. No obstante,
esta extensión de EAEA del extremo N-terminal no
inhibió de manera obvia la expresión y secreción de las proteínas
heterólogas. Es probable que la secuencia de EAEA pudiese
delecionarse de la proteína de fusión con el fin de generar una
proteína de extremo N-terminal de scFv (u otro)
auténtico.
Se mostró que la cromatografía en Blue sepharose
era eficaz en la purificación de proteínas que contienen albúmina
en una única etapa. Estas proteínas incluían productos minoritarios
de proteolisis en los presentes casos, pero no se emprendió la
optimización en el presente documento. Por tanto, podría esperarse
que se redujese la proteolisis mediante tales medios de
optimización de las condiciones de cultivo, inclusión de inhibidores
de proteasas y/o expresión en cepas de levaduras deficientes en
proteasas (por ejemplo, según lo descrito por Gleeson, M. A. G.
et al en "Pichia Protocols" [eds. Higgins, D. R. y
Cregg, J. M.), pub. Humana Press, Totowa, New Jersey (1998), págs.
81-94]. En cuanto a los procesos industriales, el
coste de Blue sepharose en muy bajo, desde luego considerablemente
inferior que cualquier otra matriz de afinidad disponible
comercialmente. Por tanto, el uso de albúmina como parte de una
proteína de fusión es doblemente beneficioso, dado que no sólo
puede añadir a la proteína propiedades tales como larga semivida en
suero (véase el ejemplo 1 o a continuación), si no que también
permite una purificación rápida, de bajo coste. La capacidad de las
proteínas de fusión de unirse al ligando se confirmó mediante
análisis de Biacore. Esto mostró que las tasas de asociación y
disociación y K_{D} de los 4 tipos de proteína de fusión eran
similares entre sí y a otras formas del anticuerpo
anti-TNF, incluyendo IgG completa (tabla 1).
Se marcaron las proteínas de fusión
scFv-HSA,
scFv-G4S-HSA y
scFv-UHL-HSA con ^{125}I, al igual
que la HSA sola. El componente minoritario de la albúmina que
estaba presente en cada una de las preparaciones de proteína de
fusión se marcó también.
Los análisis de la distribución del marcador en
los componentes de proteína de fusión y albúmina de las
preparaciones mediante los dos procedimientos de autorradiografía y
mediante sistema de detección y cuantificación de la radiactividad
dieron resultados similares. La media de los dos procedimientos fue:
para scFv-HSA, un 76% del marcador estaba en la
proteína de fusión; para
scFv-G4S-HSA, un 80% del marcador
estaba en la proteína de fusión; para
scFv-UHL-HSA, un 40% del marcador
estaba en la proteína de fusión. El componente de albúmina de cada
preparación captó el marcador restante.
Se inyectaron estas proteínas en ratas (n=6). Se
tomaron muestras de plasma a intervalos para su análisis mediante
recuento de rayos gamma y mediante SDS PAGE seguido por el sistema
de detección y cuantificación de la radiactividad. La distribución
del marcador en las diferentes muestras se determinó durante las
primeras 48 h mediante el sistema de detección y cuantificación de
la radiactividad de muestras de una rata por grupo (número de
réplicas, n=2 ó 4). En cada caso, se encontró que no había un cambio
claro en la distribución del marcador durante el periodo de 48 h
(datos no mostrados). Por tanto, las proteínas de fusión no eran
propensas a degradación significativa in vivo. Se asumió que
esta estabilidad se mantuvo durante la duración total del
experimento, que fue de 144 h, y el análisis farmacocinético de las
proteínas se basó en los resultados del recuento de rayos gamma. La
farmacocinética era similar para todas las proteínas (véase la
figura 6), mostrando de ese modo que las proteínas de fusión se
comportaban de manera similar a la albúmina humana no modificada en
el plasma in vivo. Obsérvese que en ratas la HSA es sólo la
mitad (o menos) de persistente que la albúmina homóloga, de rata, y
no se esperaría necesariamente que una fusión de scFv con HSA
estuviese dotada de una semivida más larga que la propia HSA. No
obstante, las AUC para las proteínas de fusión marcadas con
^{125}I son aproximadamente 13 veces mayores que las de el control
Fab'-Cys marcado con ^{125}I (mostrado en la
figura 2).
Este ejemplo muestra que la albúmina sérica
puede fusionarse a otra(s) proteína(s) para generar
una fusión que presenta función(es) de otra(s)
proteína(s) junto con la semivida larga de la albúmina.
Además, dado que la fusión no implicaba tioles de cisteinilo de la
albúmina, se mantiene la posibilidad de usar una proteína de fusión
como un aceptor de una o más moléculas de Fab', unidas por medios
químicos, según se ejemplifica mediante los ejemplos 1 y 3. De
estas formas, podrían generarse moléculas poliespecíficas así como
polivalentes.
Se diseñó mediante ingeniería genética el
marcador anti-superficie celular como un Fab'. Se
expresó en E. coli y se extrajo del periplasma, según se
describe en la memoria descriptiva de la patente internacional
número WO98/25971.
El puente disulfuro intercatenario de Fab' se
redujo tal como sigue: se mezclaron 12 ml de Fab' a 20,93 mg/ml en
fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,0, EDTA 2 mM con 240 \muL de
2-mercaptoetilamina 250 mM en el mismo tampón, y se
incubaron durante 50 min a 38ºC. La diafiltración de la muestra
frente al mismo tampón eliminó el agente reductor. El rendimiento
de Fab' en esta fase fue del 85,1%. El ensayo de tiol mostró que
había un promedio de 0,83 tioles libres por molécula de Fab', y el
análisis mediante cromatografía de exclusión molecular GF250 indicó
que la proteína comprendía un 93,1% de monómeros de Fab' y un 6,9%
de F(ab')_{2} unidos por puentes disulfuro.
El agente de reticulación fue un compuesto de
trimaleimida, ilustrado en la figura 7. Esta molécula contenía
también una función quelante de metales. Se preparó una disolución
de 1 mg/ml de este compuesto en fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,0,
EDTA 2 mM, y se añadieron 5 alícuotas de 434,8 \mul cada una con
mezclado a intervalos de 5 min a la preparación de Fab' reducida
anterior. Esto proporcionó una proporción molar de
reticulante:Fab':1:2,56. Se incubó la mezcla a 21ºC durante 3 h,
momento en el que se añadieron 25 \mul de ácido acético glacial
para disminuir el pH hasta 4,5. Se añadieron 47 ml de agua para
disminuir la conductividad y se resolvió la mezcla mediante
cromatografía de intercambio iónico. Se aplicaron las proteínas a
una columna de d.i. de 2,6 cm x 15,5 cm (Pharmacia) que contenía
intercambiador catiónico de sulfonato de metilo
(SP-Sepharose HP) a un caudal de 10,5 ml/min, y se
eluyó mediante un gradiente de cloruro de sodio de 0 a 250 mM en
acetato 50 mM, pH 4,5. Se controló la elución mediante absorbancia
a 280 nm. Se identificaron los diversos productos de reacción
(monómero, dímero y trímero) mediante SDS PAGE y mediante
cromatografía de exclusión molecular GF250. Sólo se usó la fracción
que contenía el dímero de Fab' para la conjugación posterior con la
albúmina.
Se disolvieron 33,71 mg de RSA en 2,5 ml de
fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,0, EDTA 2 mM y se mezclaron con 25
\mul de 2-mercaptoetilamina 200 mM en el mismo
tampón, dando una concentración final de agente reductor de 2 mM.
Se incubó la mezcla a 37ºC durante 1 h. Se eliminó entonces el
agente reductor mediante cromatografía de exclusión molecular sobre
Sephadex G25M, usando una columna PD10 (Pharmacia, número de código
17-0851-01, usada según las
instrucciones del fabricante). El tampón fue entonces fosfato de
sodio, 0,1 M, pH 6, 2 mM (EDTA). La concentración de albúmina fue de
143 \muM.
Se incubó la albúmina reducida con dímero de
Fab' conjugado en una proporción molar de 1:1, y se incubó a 21ºC
durante 24 h. Se resolvió la mezcla de reacción mediante
cromatografía sobre Gammabind plus, según se describió en el
ejemplo 1 (anterior), usando una columna de 3 ml de volumen. La
albúmina no reaccionada no se unió a esta matriz. Se eluyó el
material unido mediante un tampón de ácido acético 0,5 M, pH 3. Se
neutralizaron inmediatamente las fracciones eluidas mediante la
adición de Trizma, 2 M, pH 8,8. Se purificó además este material
mediante cromatografía en Blue sepharose, según se describió en el
ejemplo 2. El dímero de Fab' no reaccionado no se unió a la matriz,
y se eluyó el material unido mediante tiocianato de sodio, 0,2 M en
solución salina tamponada con fosfato. Se concentraron las
fracciones eluidas y se intercambió el tampón por solución salina
tamponada con fosfato en una célula agitada (Amicon) con un filtro
de punto de corte de peso molecular nominal de 10 kDa. Se repitió
cada tipo de cromatografía con el fin de purificar completamente el
conjugado albúmina-dímero de Fab'.
Los procedimientos fueron según se describieron
en los ejemplos 1 y 2, excepto que para la determinación de la
secuencia N-terminal de la proteína, el secuenciador
automatizado usado fue un Procise 492 de PE Biosystems.
Adicionalmente, se determinaron las características de unión a
ligando del conjugado mediante análisis de Scatchard de su unión a
células completas, tal como sigue a continuación.
Se marcaron el conjugado y una proteína control
(un dímero de Fab' reticulado a través de tioles mediante
bis-maleimidohexano) mediante unión de fluoresceína.
Se realizó esto mediante incubación de un mg de proteína en 1 ml de
NaHCO_{3} 0,1 M con 100 \mug de isotiocianato de fluoresceína
(Sigma F7250) añadidos como una disolución de 10 \mul en
dimetilsulfóxido. La reacción se llevó a cabo durante 2 h a 21ºC. Se
paró la reacción mediante la adición de un exceso molar de lisina.
Se separó la proteína marcada de la fluoresceína libre mediante
cromatografía de exclusión molecular. Se recogió el anticuerpo
marcado con fluoresceína en solución salina tamponada con fosfato y
se cuantificó el componente proteico mediante absorción a 280 nm,
mientras que se estimó el grado de sustitución a partir de la
absorción a 495 nm. El coeficiente de extinción \muM usado para
DFM fue de 0,14, para RSA-(Fab')_{2} fue de 0,2 y para la
fluoresceína fue de 0,077. La proteína control marcada con
fluoresceína tenía una proporción molar de fluoresceína:proteína de
1,59, y el RSA-(Fab')_{2} marcado con fluoresceína tenía 3,08
moléculas de fluoresceína por molécula proteica.
Entonces, se diluyeron en serie los conjugados
de proteína fluorescentes (1:1,4) a partir de una concentración
superior de 2 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato que
contenía suero de ternero fetal al 5% (v/v). El volumen final por
tubo fue de 250 \mul. Se añadieron cuarenta mil células diana en
100 \mul por tubo para dar un volumen final de 350 \mul y una
concentración final de anticuerpo más alta de 1,43 \mug/ml. Se
incubaron las células con anticuerpo a 4ºC durante 3 h. Se realizó
entonces a las células el análisis de separación celular activada
por fluorescencia (FACS). Se convirtió la señal de fluorescencia en
moléculas de fluoresceína soluble equivalente a partir de una curva
patrón de perlas fluorescentes según el procedimiento de Krause
et al., (1990) Determination of Affinities of Murine and
Chimeric Anti-\alpha/\beta-T
Cell Receptor Antibodies by Flow Cytometry. Behring Inst. Mitt.
87,56-67). El número de moléculas de fluoresceína
unidas por célula se convirtió en el número de moléculas de
anticuerpo unidas por células mediante la proporción de
fluoresceína:proteína. La resta del número total de moléculas de
anticuerpo por tubo dio el número de moléculas libres por tubo. Se
realizó el análisis de Scatchard a estos datos.
En las condiciones no optimizadas usadas, los
rendimientos de productos a partir de la reacción de reticulación
química fueron: trímero de Fab', 30,6%; dímero de Fab', 30,7%;
monómero de Fab', 38,7%.
Se usó este dímero en reacciones posteriores con
la albúmina. Al producirse mediante reticulación con un agente
trifuncional, el dímero presentaba un grupo funcional restante en el
resto de enlace. Éste era una maleimida que podía reaccionar con un
tiol libre. Se generó un tiol libre en albúmina de rata mediante
reducción, mediante un procedimiento que era diferente al usado en
el ejemplo 1. El ensayo de tioles en la preparación de albúmina
reducida de esta forma mostró que había entonces un promedio de 0,97
tioles libres por molécula. Por tanto, puede generarse un único
tiol en la albúmina mediante más de un procedimiento.
La incubación del dímero de Fab' preparado con
la RSA reducida dio un rendimiento de 1 mg de conjugado
albúmina-dímero de Fab', según se estimó mediante
absorbancia a 280 nm, usando un coeficiente de absorción teórico
calculado mediante el programa ProtParam (ExPasy), tras la
purificación completa.
La SDS PAGE (reducida) del producto mostró la
presencia de dos bandas, de peso molecular aparente de
aproximadamente 150 kDa y aproximadamente 31 kDa (figura 8). La
secuenciación N-terminal mostró que éstas eran el
dímero albúmina-cadena pesada de Fab' y la cadena
ligera de Fab', respectivamente. La SDS PAGE en condiciones no
reductoras mostró una banda principal de peso molecular aparente de
aproximadamente 200 kDa. La secuenciación N-terminal
de la proteína mostró que esta banda era el dímero
albúmina-Fab' (es decir, cadenas pesadas más
ligeras). Se confirmó que el producto de la combinación de RSA y el
dímero de Fab' consistía en una molécula de albúmina y dos
moléculas de Fab' mediante la secuenciación
N-terminal también del producto final no
fraccionado. Esto mostró también que no se había disociado la
cadena ligera de Fab' durante la producción y que el enlace
covalente entre Fab' y la albúmina era solamente mediante la cadena
pesada de Fab'.
El conjugado conservó la actividad de unión a
ligando, según se mostró mediante el análisis de FACS de su unión a
células que portan ligando en su superficie. El análisis de
Scatchard de la unión dio una curva de 2 fases, con una K_{D} de
8 nM para la unión de uno de los dos Fab', y de 3 nM para la unión
de ambos Fab' en el constructo (figura 9). Esto valores fueron
similares a los de un control (Fab' dimerizado mediante reticulación
por bis-maleimidohexano, es decir, que carece del
resto de albúmina), siendo de 12 nM y de 3 nM, respectivamente.
Como en los otros dos ejemplos, el mantenimiento de la actividad de
unión total de Fab' a pesar de la unión de un resto de gran peso
molecular se debía probablemente a la selección como diana de la
bisagra de Fab' como el punto de unión, estando en el extremo
opuesto de la molécula respecto a la función de unión a antígeno.
En el presente ejemplo, la albúmina no interfirió con ningún Fab' al
que estaba unida.
Por tanto, este procedimiento produce un
producto muy específico, bivalente. A diferencia del ejemplo 1, esto
fue mediante modificación del resto de inmunoglobulina, en lugar de
la albúmina, antes de la fase final de conjugación. De nuevo a
diferencia de los otros ejemplos, se usó una inmunoglobulina
diferente, lo que ejemplifica la utilidad general del enfoque.
Usando tales enfoques, el enlace de la albúmina a otras
inmunoglobulinas poliespecíficas generaría claramente moléculas
poliespecíficas con una semivida prolongada in vivo.
Los presentes resultados también ejemplifican la
inclusión de una función extra en el conjugado. El presente ejemplo
es la inclusión de una función quelante de metales, tal como podría
ser útil para ensayos, diagnóstico y tratamiento. La función
quelante en este ejemplo está en el resto de enlace, y es un
macrociclo que se había encontrado anteriormente que se unía
fuertemente a metales, en particular indio, pero posiblemente como
alternativa cobre, gadolinio, hierro III, cobalto III, cromo III,
níquel o aluminio.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
Todas las inmunoglobulinas y derivados derivaban
del mismo anticuerpo anti-TNF, y se usó TNF como
ligando. Véase la figura 10 para el análisis de la unión de
RSA-F(ab')_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Una proteína híbrida que comprende un
fragmento de anticuerpo de unión a antígeno unido covalentemente a
una molécula de albúmina o un fragmento de la misma, en la que el
fragmento de anticuerpo y la albúmina están unidos indirectamente
mediante una molécula puente entre los grupos tiol de un residuo de
cisteína presente en el anticuerpo y otro presente en la albúmina
en la posición 34, en la que la molécula puente tiene de 10
\ring{A} a 20 \ring{A} de longitud.
2. Una proteína híbrida según la reivindicación
1, en la que la molécula puente es una cadena de hexileno con el
residuo de una maleimida en cada extremo.
3. Una proteína híbrida según las
reivindicaciones 1 y 2, en la que el fragmento de anticuerpo es un
fragmento Fab monovalente que contiene opcionalmente uno o más
aminoácidos adicionales unidos al extremo C-terminal
del dominio CH1.
4. Una proteína híbrida según la reivindicación
3, en la que el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab o Fab'
monovalente.
5. Una proteína híbrida según las
reivindicaciones 1-4 unida a uno o más grupos
efectores o indicadores.
6. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína híbrida según las reivindicaciones 1-5
junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
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