JP2008500945A - 修飾抗体フラグメント - Google Patents

Abstract

本発明は、抗体のＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントを含む新規なクラスの抗体フラグメントに関する。このフラグメントにおいて、重鎖は軽鎖に共有結合せず、且つ２つ以上のエフェクター分子がそのフラグメントに結合している。これらの分子の少なくとも１つが重鎖又は軽鎖の定常領域中のシステインに結合している。

Description

本発明は、改良された抗体フラグメント、より詳細には、２つ以上のエフェクター分子が結合する改良された抗体フラグメント、及びそれらの製造方法に関する。

抗体可変領域は特異性及び親和性が高いので、該領域は、特にタンパク質間相互作用を調節するための理想的な診断剤及び治療剤になる。抗体フラグメントは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）などの製品の最近の成功に見られるように、多用途の治療剤となることが判明しつつある。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、及び他の抗体フラグメントにコードされている標的対応官能基は、直接使用できるか、或いは効力を増加させるために、細胞毒性薬剤、毒素、又はポリマー分子などの１種又は複数のエフェクター分子に複合できる。例えば、これらのフラグメントはＦｃ領域を欠くために、動物中で短い循環半減期を有するが、これは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの特定の型のポリマーへの複合によって改良できる。複合したＰＥＧのサイズを増加させると、数分間から何時間までも循環半減期が増加することが判明しており、５ｋＤａから１００ｋＤａまでの範囲のＰＥＧを用いるＦａｂ’の修飾が実証された（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，７８０−７８３；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６，１０６−１１９；Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５）。ＰＥＧ化された抗体フラグメント（例えば、ＣＤＰ８７０）は現在臨床試験を受けており、ここでは、複合ＰＥＧの効果は、循環半減期を、治療のために許容可能なレベルにまで導くことである。

エフェクター分子は、多数の異なる方法によって抗体フラグメントに結合していることが可能であり、これには、アルデヒド糖を経由するもの、又はより一般的には、抗体フラグメント中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖、又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を経由するものが含まれる。エフェクター分子の結合の部位は、ランダムであるか、又は部位特異的のいずれかであってもよい。

ランダム結合は、しばしば、リジンのようなアミノ酸を経由して達成され、そしてこれは、リジンの位置に依存して、抗体フラグメント全体を通して多数の部位において結合しているエフェクター分子を生じる。これは、いくつかの場合において成功したが、結合するエフェクター分子の正確な位置及び数は制御不可能であり、且つこれは活性の損失（例えば、結合するエフェクター分子が少なすぎる場合）及び／又は親和性の損失（例えば、エフェクター分子が結合部位を妨害する）をもたらす可能性がある（Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５）。その結果、エフェクター分子の制御された部位特異的結合は、通常、選択方法である。

エフェクター分子の部位特異的結合は、最も一般的には、システイン残基に対する結合によって達成される。なぜなら、このような残基は、抗体フラグメントにおいて比較的一般的ではないからである。抗体のヒンジは、部位特異的結合のためのよく知られた領域である。なぜなら、これらはシステイン残基を含み、且つ抗原結合に関与するらしい抗体の他の領域から離れているからである。適切なヒンジはフラグメント中に天然に存在するか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して作製できるかのいずれかである（例えば、米国特許第５，６７７，４２５号；国際公開第９８／２５９７１号；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６，１０６−１１９；Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，７８０−７８３を参照のこと）。或いは、部位特異的システインは、例えば、表面に露出したシステインを作製するために抗体フラグメントに操作できる（米国特許第５，２１９，９９６号）。

エフェクター分子をシステインを介して部位特異的に結合しようとする場合、抗体フラグメント中の標的チオールは、しばしば、グルタチオンなどの小さな発酵関連ペプチド産物によってキャップするか、又は抗体フラグメントの抽出及び精製の間に使用する５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）などの化学的添加物によって意図的にキャップする。これらのキャッピング剤は、標的（ヒンジ又は表面）チオールを活性化するために除去する必要がある。抗体フラグメントは、重鎖の定常領域と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ１及びＣ_Ｌ）の間の未変性の鎖間ジスルフィド結合を有し、これは一般的には、抗体の安定性及び結合特性を維持する上で必須であると見なされてきた。その結果、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１間のジスルフィドが損なわれないように、標的ヒンジ又は表面チオールの活性化は、ある程度の注意を払って実行しなければならない。それゆえに「穏和な」還元条件を、エフェクター分子との反応の前に、チオールキャッピング剤を除去するために使用するのが都合が良い。これは通常、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール系還元剤を使用することによって達成される。しかし、これらの還元剤の各々は、還元するつもりのシステインと反応し、且つそれに結合したままとなり得るため、（Ｂｅｇｇ及びＳｐｅｉｃｈｅｒ，１９９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１０，１７−２０）エフェクター分子の結合効率を低下させることが知られている。したがって、還元及びエフェクター分子との反応の後、高い比率の抗体フラグメントが、エフェクター分子を全く結合せず、これらは、適数のエフェクター分子を結合した抗体フラグメントから除去しなければならない。この乏しい修飾効率は、最大限の生産効率を実現することが重要である、修飾された治療用抗体フラグメントの大規模生産中には明確に欠点となる。

重鎖及び軽鎖が共有結合していない抗体フラグメントは、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０９，１９３−２０２；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５１，６９５４−６９６１；欧州特許ＥＰ９６８２９１によって記載されてきた。本発明は、重鎖及び軽鎖が共有結合していない新規なクラスの修飾抗体フラグメントを提供する。重鎖と軽鎖の間に全く共有結合がなく、しかも２つ以上のエフェクター分子が結合しているにも関わらず、本発明のフラグメントは、多数のインビトロ及びインビボの試験において野生型フラグメントと比較し得る性能を示す。驚くべきことに、これらの新規なフラグメントは、野生型フラグメントと抗原に対する同じ親和性、及び野生型フラグメントと同様のインビボ及びインビトロ安定性を有する。本発明のフラグメントの特定の利点は、それらの製造の容易さ、及び特に、それらの製造の効率にある。したがって、本発明のフラグメントは、鎖間共有結合を有する現在利用可能なフラグメントに対する低コストの代替物を提供する。

したがって、本発明によれば、２つ以上のエフェクター分子がフラグメントに結合しており、且つこれらの分子の少なくとも１つが軽鎖又は重鎖の定常領域中のシステインに結合していることを特徴とする、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合していない抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントが提供される。

本発明の抗体フラグメントは、可変領域（Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ）及び定常領域（Ｃ_Ｈ／Ｃ_Ｌ）を有する任意の重鎖及び軽鎖の対であってもよい。この重鎖及び／又は軽鎖の定常領域は、そのＣ末端において１つ以上のアミノ酸が延長されてもよい。特定の例には、Ｆａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。

本発明に使用するための抗体フラグメントの出発物質は、任意の適切な酵素的な切断及び／又は消化の技術を使用して、例えば、ペプシンを用いる処理によって、任意の全体の抗体、とりわけ、全体のモノクローナル抗体から入手できる。代替的に、又は更に、抗体の出発物質は、抗体の可変領域及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用によって調製できる。標準的な分子生物学的技術が、所望されるようなアミノ酸又はドメインを修飾し、付加し、又は欠失させるために使用できる。可変領域又は定常領域に対する任意の変更が、本明細書で使用される用語「可変」領域及び「定常」領域によってなお包含される。

抗体フラグメントの出発物質は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から入手できる。抗体フラグメントの部分は１種又は複数の種から入手でき、例えば、抗体フラグメントはキメラであってもよい。一例では、定常領域は１つの種由来であり、且つ可変領域は別の種由来である。抗体フラグメントの出発物質はまた、修飾されてもよい。一例では、抗体フラグメントの可変領域は組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製される。このような操作して得た改変体には、例えば、天然の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失、又は置換によって天然の抗体の可変領域から作製されたものが含まれる。この型の特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲ、並びに場合により、１つの抗体からの１つ以上のフレームワークアミノ酸、及び第２の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む、可変領域ドメインが操作して得たものが含まれる。これらの抗体フラグメントを作製及び製造するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、以下を参照のこと：Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０２５５１号；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、国際公開第９１／０９９６７号；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ，１０，１−１４２；Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１）。

本発明に使用するためのＦａｂ’フラグメントは、重鎖のＣ末端が１アミノ酸以上延長される。代表的には、本発明に使用するためのＦａｂ’フラグメントは、未変性の又は修飾されたヒンジ領域を有する。未変性のヒンジ領域は、抗体分子のＣ_Ｈ１ドメインに通常結合しているヒンジ領域である。修飾ヒンジ領域は、未変性のヒンジ領域とは長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。このようなヒンジは、他の種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、又はヤギのヒンジ領域からのヒンジ領域を含み得る。他の修飾ヒンジ領域は、Ｃ_Ｈ１ドメインのそれとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含んでもよい。したがって、例えば、クラスγ１のＣ_Ｈ１ドメインはクラスγ４のヒンジ領域に結合できる。或いは、修飾ヒンジ領域は、天然のヒンジ又は反復単位の部分を含むことが可能であり、この反復中の各単位は、天然のヒンジ領域に由来する。さらなる代替において、この天然のヒンジ領域は、１つ以上のシステイン若しくは他の残基をアラニンなどの中性塩基に変換することによって、又は適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって変化できる。このような手段によって、ヒンジ領域中のシステイン残基の数は、増加又は減少できる。更に、ヒンジの他の特性、例えば、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステインの距離、ヒンジのシステイン間の距離、及び可動性などのヒンジの特性に影響を与える可能性があるヒンジ中の他のアミノ酸の組成（例えば、グリシンは回転可動性を増加させるためにヒンジに取り込まれることが可能であり、又はプロリンは可動性を減少させるために取り込まれることが可能である）が制御できる。或いは、荷電した残基又は疎水性残基の組み合わせがヒンジに取り込まれてマルチマー化特性を付与できる。他の修飾ヒンジ領域は全体的に合成性であってもよく、且つ長さ、組成、及び可動性などの所望の特性を有するように設計されてもよい。

多数の修飾ヒンジ領域が、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号、国際公開第９９１５５４９号、及び国際公開第９８２５９７１号においてすでに記載されており、これらは参照として本明細書に援用される。代表的には、本発明に使用するためのヒンジ領域は、１から１１個の間のシステインを含む。好ましくは、１から４個の間のシステイン、より好ましくは１個又は２個のシステインである。特に有用なヒンジには、１つのみのシステインが存在し、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）又はＤＫＴＨＴＣＡＡ（配列番号２）を含む修飾ヒトγ１ヒンジ、及び２つのシステインを含み、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号３）又はＤＫＴＨＴＣＡＡＣＰＡ（配列番号４）を含むものが含まれる。本発明に使用するための他の適切なヒンジには、配列番号５〜１１に示すものが含まれる。適切なマウスヒンジ領域は配列番号１２〜１４に示す。すべての配列及びそれらの配列番号は図７に示す。

本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合可能であろう。該抗原は、任意の細胞関連抗原、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面抗原であってもよく、又は可溶性抗原であってもよい。抗原はまた、疾患又は感染の間にアップレギュレートされた抗原などの任意の医学関連抗原、例えば、レセプター及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面抗原の特定の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン若しくはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合、これらのレセプターが含まれる。可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦα及びＰＤＧＦβなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合、これらのレセプターが含まれる。

用語エフェクター分子は、本明細書で使用される場合には、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素（例えば、細菌又は植物起源の酵素的に活性な毒素及びそのフラグメント、例えば、リシン及びそのフラグメント）、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然ポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレートされた金属、ナノ粒子、並びにレポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲスペクトル測定によって検出できる化合物を含む。

特定の抗新生物剤には、細胞毒性剤及び細胞増殖抑制剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロランブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミド、又はウラシルマスタード）及びその誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、又はシスプラチンなどのアルキル化剤；メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸又はフルオロクエン酸などの代謝拮抗剤、ブレオマイシン（例えば、硫酸ブレオマイシン）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリキマイシン及びその誘導体、又はエスペラマイシン及びその誘導体などの抗生物質、エトポシド、ビンクリスチン又はビンブラスチン、及びその誘導体などの分裂抑制剤；エリプシチンなどのアルカロイド；タキシン−Ｉ又はタキシン−ＩＩなどのポリオール；アンドロゲンなどのホルモン（例えば、ドロモスタノロン若しくはテストステロン）、プロゲスチン（例えば、酢酸メゲストロール若しくは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロール二リン酸、リン酸ポリエストラジオール、若しくはリン酸エストラムスチン）又は抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；ミトキサントロンなどのアントラキノン、ヒドロキシウレアなどのウレア；プロカルバジンなどのヒドラジン；又はデカルバジンなどのイミダゾールが含まれる。

キレートされた金属には、２から８まで（両端を含む）配位数を有する、２価又は３価の正電荷を有する金属のキレートが含まれる。このような金属の特定の例には、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）が含まれる。一般的に、この金属は好ましくは放射性核種である。特定の放射性核種には、^９９ｍＴｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５８Ｃｏ、^６０Ｃｏ、^６７Ｃｕ、^１９５Ａｕ、^１９９Ａｕ、^１１０Ａｇ、^２０３Ｐｂ、^２０６Ｂｉ、^２０７Ｂｉ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８８Ｙ、^９０Ｙ、^１６０Ｔｂ、^１５３Ｇｄ、及び^４７Ｓｃが含まれる。

キレートされた金属は、例えば、任意の適切な多座（ｐｏｌｙａｄｅｎｔａｔｅ）キレート剤、例えば、非環状又は環状ポリアミン、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテル及びその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；及び炭素環誘導体でキレートされた上記の型の金属の１つであってもよい。

一般的に、キレート剤の型は、使用する金属に依存する。しかし、本発明による結合体における、１つの特に有用なキレート剤の群は、非環状及び環状ポリアミン、とりわけポリアミノカルボン酸、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びその誘導体、並びに大環状アミン、例えば、環状トリアザ及びテトラアザ誘導体（例えば、国際特許明細書の国際特許公開第９２／２２５８３号に記載されているようなもの）；並びにポリアミド、とりわけデスフェリオックス−アミン及びその誘導体である。

他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象とする酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。対象とするタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤若しくは血管形成剤（例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン）、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、若しくは他の成長因子及び免疫グロブリンなどの生物学的応答調節剤が含まれるが、これらに限定されない。

他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用である検出可能な物質を含んでもよい。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、及び非放射活性常磁性金属イオンが含まれる。一般的には、診断剤としての使用のために抗体に複合され得る金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ；適切な蛍光物質には、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、及びフィコエリトリンが含まれ；適切な発光物質にはルミノールが含まれ；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエオクリンが含まれ；並びに適切な放射活性核種には^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、及び^９９Ｔｃが含まれる。

エフェクター分子としての使用のための合成又は天然ポリマーには、例えば、任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は直鎖若しくは分枝鎖の多糖類（例えば、ラクトース、アミロース、デキストラン、又はグリコーゲンなどのホモ若しくはヘテロ多糖類）が含まれる。

上述の合成ポリマー上に存在する可能性のある特定の任意選択の置換基には、１つ以上のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例には、任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、又はその誘導体、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などの任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）が含まれる。

「誘導体」は、本明細書で使用される場合には、反応性誘導体、例えば、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミドなどのチオール選択性反応基、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドマレイミドなどを含むことを意図する。反応基は、直接的に、又はポリマーへのリンカーセグメントを通して結合できる。このような基の残基は、いくつかの例においては、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基としての生成物の一部を形成することが理解されよう。

ポリマーのサイズは、所望通りに変化させてもよいが、一般的には、５００Ｄａから５０，０００Ｄａまで、好ましくは５，０００から４０，０００Ｄａまで、並びにより好ましくは１０，０００から４０，０００Ｄａまで、及び２０，０００から４０，０００Ｄａまでの範囲の平均分子量である。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図する用途、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在するか、又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択してもよい（概説としては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照のこと）。したがって、例えば、生成物が循環系を出て、組織に浸透することを意図する場合、例えば、腫瘍の治療に使用するために、低分子量ポリマー、例えば、約５，０００Ｄａの分子量を有するポリマーを使用することが有利となり得る。生成物が循環中に留まる用途に対しては、より高分子量ポリマー、例えば、２５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するポリマーを使用することが有利となり得る。

特定の好ましいポリマーには、ポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレンポリマー、又は、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、及びとりわけ、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーが含まれる。

本発明のポリマーは、市販品を入手してもよいし（例えば、Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｉｌ ａｎｄ Ｆａｔｓ；Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより）、又は市販の出発物質から、便利な化学的手順を使用して調製してもよい。

本発明のエフェクター分子は、該タンパク質を直接、又はカップリング剤を介してエフェクター分子へ連結する、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順を使用して結合してもよい。このようなエフェクター分子を抗体に複合するための技術は当該分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，制御薬物送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ），第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７，６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３）。特定の化学的手順には、例えば、国際特許明細書の国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第９０／０９１９５号、国際公開第８９／０１４７６号、国際公開第９９１５５４９号、及び国際公開第０３０３１５８１号に記載されるものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えば、欧州特許明細書第３９２７４５号に記載のような組換えＤＮＡ手順を使用して達成できる。

一例では、本発明のエフェクター分子は、抗体フラグメント中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通してタンパク質に結合できる。このようなアミノ酸は抗体フラグメント中に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を使用してフラグメントに操作して得られてもよい。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。本発明の好ましい態様では、エフェクター分子は、フラグメント中にあるシステイン残基のチオール基を通して共有結合している。この共有結合は、一般的にはジスルフィド結合であり、又は特に、硫黄−炭素結合である。一例では、チオール基が適切に活性化されたエフェクター分子の結合点として使用される場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が使用できる。

本発明の好ましい態様において、抗体フラグメントに結合した少なくとも１個のエフェクター分子は、ポリマー分子、好ましくはＰＥＧ又はその誘導体である。結合するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に関しては、一般的に、「ポリエチレングリコールの化学、生物技術的及び生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「ポリエチレングリコールの化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、並びに「生物医科学のための生物複合タンパク質カップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

本発明の一例では、すべてのエフェクター分子はＰＥＧであり、且つ各分子が、マレイミド基を介して、抗体フラグメント中の１個又は複数のチオール基に共有結合している。このＰＥＧは任意の直鎖又は分枝状分子であってもよい。分枝状ＰＥＧ分子を結合するために、リジン残基が、好ましくはマレイミド基に共有結合している。リジン残基上のアミン基の各々に、好ましくはメトキシ（ポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合している。一例では、各ポリマーの分子量は約２０，０００Ｄａであり、それゆえに全ポリマー分子の全分子量は約４０，０００Ｄａである。

本発明において、２つ以上のエフェクター分子が抗体フラグメントに結合しており、且つこれらの分子の少なくとも１つが軽鎖又は重鎖の定常領域に結合している。結合のための適切なシステインには、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域に存在する天然のシステイン、並びに組換えＤＮＡ技術を使用して定常領域に操作して得たシステインが含まれる。一例では、２つのシステインが、抗体フラグメント中に（重鎖及び軽鎖の定常領域の各々に１つずつ）操作して得られる。特定の一例では、これらのシステインは複数の位置に操作して得られ、それによって、これらのシステインは抗体出発物質中で互いにジスルフィド結合を形成できる。

本発明の一例では、少なくとも１個のエフェクター分子が鎖間システインに結合している。用語鎖間システインとは、本明細書で使用されるときには、天然の抗体分子における対応する重鎖又は軽鎖の定常領域中のシステインにジスルフィド結合すると思われる、重鎖又は軽鎖中の定常領域中のシステインをいう。特に、本明細書の鎖間システインは、天然の抗体において互いにジスルフィド結合している、軽鎖（Ｃ_Ｌ）定常領域中のシステイン、及び重鎖の第１の定常領域（Ｃ_Ｈ１）中のシステインである。このようなシステインの例は、代表的には、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７、免疫学的に興味が持たれるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡによって規定されるように、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の２１４位及び重鎖の２３３位において、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖の１２７位、並びにヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位において見い出すことができる。マウスＩｇＧ１において、鎖間システインは軽鎖の２１４位及び重鎖の２３５位において見い出し得る。これらのシステインの正確な位置は、任意の修飾、例えば、欠失、挿入、及び／又は置換が抗体出発物質になされた場合には、天然の抗体の位置から変化し得ることが理解されよう。したがって、本発明の一例では、２つ以上のエフェクター分子は抗体フラグメントに結合しており、且つこれらの分子の少なくとも１つがＣ_Ｌの鎖間システイン又はＣ_Ｈ１の鎖間システインに結合している。

２つ以上のエフェクター分子を結合する本発明の抗体フラグメントにおいて、重鎖は軽鎖に共有結合していない。これらのフラグメントにおいて、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合は存在せず、特に、天然の抗体において見い出されるＣ_Ｌの鎖間システインとＣ_Ｈ１の鎖間システインとの間のジスルフィド結合は存在しない。

本発明の一例では、２つの鎖間システインの間の共有結合は、別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含まないアミノ酸で鎖間システインの一方が置換された結果、存在していない。置換するとは、鎖間システインが通常なら抗体フラグメントに見い出される場合に、別のアミノ酸がその場所にあることを意味する。適切なアミノ酸の例は、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、又は任意の極性アミノ酸を含む。特に好ましいアミノ酸はセリンである。アミノ酸を置換するための方法は分子生物学の分野において周知である。このような方法には、例えば、ＰＣＲなどの方法を使用した、アミノ酸を欠失及び／又は置換するための部位特異的変異誘発、或いは合成配列の新規な設計が含まれる。鎖間システインの両方がセリンによって置換されているＦａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２は、すでに記載されている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０９，１９３−２０２；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５１，６９５４−６９６１）。したがって、本発明の一態様によれば、鎖間システインの一方が別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含まないアミノ酸、更により好ましくはセリンによって置換された抗体Ｆａｂ及びＦａｂ’フラグメントが提供される。本発明のこの態様に従う特定のフラグメントは以下の通りである。
（ｉ）Ｃ_Ｈ１の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることによって特徴付けられる抗体Ｆａｂ’フラグメント。
（ｉｉ）Ｃ_Ｌの鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることによって特徴付けられる抗体Ｆａｂ’フラグメント。
（ｉｉｉ）Ｃ_Ｈ１の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることによって特徴付けられる抗体Ｆａｂフラグメント。
（ｉｖ）Ｃ_Ｌの鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることによって特徴付けられる抗体Ｆａｂフラグメント。

２つ以上のエフェクター分子がこれらのフラグメントに結合してもよく、本発明の一態様によれば、１つのエフェクター分子はＣ_Ｌ又はＣ_Ｈ１の鎖間システインの一方に結合しており、追加のエフェクター分子は抗体フラグメント中の他の箇所、特に定常領域及び／又はヒンジ領域に結合している。好ましくは、追加のエフェクター分子はヒンジに結合している。

本発明のこの態様に従う特定のフラグメントは以下の場合のフラグメントである：
（ｉ）エフェクター分子がＣ_Ｌの鎖間システインに結合しており、且つＣ_Ｈ１の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されている、又は
（ｉｉ）エフェクター分子がＣ_Ｈ１の鎖間システインに結合しており、且つＣ_Ｌの鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されている。

本発明の別の例において、エフェクター分子は、軽鎖定常領域中の少なくとも１つのシステイン、及び重鎖定常領域中の少なくとも１つのシステインに結合している。上記のように、適切なシステインには、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域中に存在する天然に存在するシステイン、例えば、Ｃ_Ｈ１及びＣ_Ｌの鎖間システイン、並びに組換えＤＮＡ技術を使用して定常領域に操作して得たシステインが含まれる。特定の一例では、エフェクター分子が結合している各システインは、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合を介して、対応する重鎖又は軽鎖中のシステインに連結されている。この例において、２つのシステイン間の共有結合は、本明細書に記載されるように、還元剤を使用して、エフェクター分子の結合の間に除去される。追加のエフェクター分子は抗体フラグメント中の他の箇所、特に、定常領域及び／又はヒンジ領域に、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して結合できる。好ましい追加のエフェクター分子はヒンジに結合している。

本発明のこの態様に従う特定のフラグメントは以下の場合のフラグメントを含む：
（ｉ）エフェクター分子に結合した重鎖及び軽鎖定常領域中のシステイン残基は、エフェクター分子が結合していない場合には、ジスルフィド結合を介して互いに連結されている、又は
（ｉｉ）エフェクター分子が結合する軽鎖システインはＣ_Ｌの鎖間システインであり、且つエフェクター分子が結合する重鎖システインはＣ_Ｈ１の鎖間システインである。

本発明の抗体フラグメントのいくつかを産生する際に有用である抗体Ｆａｂ’フラグメント中間体もまた、本発明によって提供される。驚くべきことに、Ｃ_Ｈ１の鎖間システインがチオールを含まないアミノ酸で置換されたときに、Ｃ_Ｌの鎖間システインがヒンジ領域中のシステインとジスルフィド結合を形成できることが判明した。ヒンジシステインとＣ_Ｌ鎖間システインとの間のジスルフィド結合の存在により、６０℃以上での熱抽出方法を使用してＦａｂ’フラグメントの抽出を可能にすることによって、修飾抗体Ｆａｂ’フラグメントが、未変性鎖間ジスルフィドを含むＦａｂ’フラグメントと同程度に効率的に精製することが可能である（米国特許第５，６６５，８６６号を参照されたい）。したがって、本発明のこの態様によれば、Ｃ_Ｈ１の鎖間システインがチオールを含有しないアミノ酸によって置換されており、且つＣ_Ｌ鎖間システインがヒンジ領域中のシステインに共有結合していることを特徴とする、抗体Ｆａｂ’フラグメントが提供される。前記の任意のヒンジをこの中間体において使用してもよいが、特に、前記中間体のヒンジ領域は、このヒンジ領域中のシステインがＣ_Ｌの鎖間システインとジスルフィド結合を形成することを可能にするのに十分な長さ及び可動性を有している。特に好ましいヒンジには、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号１）又はＤＫＴＨＴＣＡＡ（配列番号２）を含む、１つのみのシステインが存在する修飾ヒトγ１ヒンジが含まれる。或いは、ヒンジは、例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号３）又はＤＫＴＨＴＣＡＡＣＰＡ（配列番号４）についての２つのシステインを含んでもよい。これらの抗体フラグメントに使用するためのさらなるヒンジには、配列番号５から１１に示すもの、及びマウス定常領域、即ち配列番号１２〜１４に示す配列が含まれる。一例では、ヒンジシステインが共有結合する鎖間システインを含む、抗体Ｆａｂ’フラグメント中の軽鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１からのｃカッパ（配列番号１５）である。

ヒンジと軽鎖との間のジスルフィド結合をまた含む他の有用な中間体は、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、Ｃ_Ｈ１とＣ_Ｌの両方の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換され、且つ軽鎖定常領域中の操作して得たシステインがヒンジ領域中のシステインに共有結合していることを特徴とする抗体Ｆａｂ’フラグメントである。用語「操作して得たシステイン」とは、鎖間システインのもの以外の軽鎖定常領域中の位置におけるシステインをいう。アミノ酸を置換及び挿入するための方法は分子生物学の分野において周知である。このような方法には、例えば、ＰＣＲなどの方法を使用した、アミノ酸を欠失及び／若しくは置換するための部位特異的変異誘発又は合成配列の新規な設計が含まれる。本発明のこの態様に使用するための特定の軽鎖定常配列は、配列番号１６〜２０に示す。配列番号１６〜２０に示す軽鎖定常領域配列のいずれかを用いて使用できる特定のヒンジ配列は、配列番号１〜１１に示す。

２つ以上のエフェクター分子が、本発明のこの態様の抗体Ｆａｂ’フラグメントに結合できる。したがって、本発明の一態様によれば、１つのエフェクター分子が、Ｃ_Ｌの鎖間システイン又は軽鎖定常領域中の操作して得たシステインの、いずれか存在するものに結合しており、追加のエフェクター分子が、抗体フラグメント中の他の箇所、特にヒンジ領域に結合している。好ましい追加のエフェクター分子はヒンジに結合している。

したがって、一態様において、エフェクター分子は、エフェクター分子が結合する前には、Ｃ_Ｌの鎖間システインに共有結合したヒンジ中のシステインに結合している。別の態様において、エフェクター分子は、エフェクター分子が結合する前には、軽鎖定常領域中の操作して得たシステインに共有結合したヒンジ中のシステインに結合している。

上記の抗体Ｆａｂ’フラグメント中間体を発現する宿主細胞もまた、本発明によって提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体Ｆａｂ’中間体をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用できる。細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））及び他の微生物系が使用されてもよく、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系もまた、使用してもよい。本発明に使用するための適切なＥ．ｃｏｌｉ株は、天然株又は組換えタンパク質を産生できる変異株であってもよい。特定の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株の例には、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、及びＷ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞、又はハイブリドーマ細胞が含まれる。

本発明の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントにエフェクター分子を結合させるための方法もまた、本発明によって提供される。一般的に、この方法は以下の工程を含む：
ａ）抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを還元剤で処理する工程であって、この還元剤は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域のシステイン中の遊離チオール基を生成できる工程
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。

エフェクター分子の結合の前に、鎖間ジスルフィド結合が抗体フラグメント中に存在する本発明の一態様において、この方法は以下の工程を含む：
ａ）抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを還元剤で処理する工程であって、この還元剤は、少なくともＣ_Ｈ１の鎖間システイン及びＣ_Ｌの鎖間システイン中の遊離チオール基を生成できる工程
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。

上記の抗体Ｆａｂ’中間体の１つが使用される本発明の一態様において、抗体Ｆａｂ’中間体に２つ以上のエフェクター分子を結合させる方法が提供され、この方法は以下の工程を含む：
ａ）抗体Ｆａｂ’フラグメントを還元剤で処理する工程であって、この還元剤は、Ｃ_Ｌの鎖間システインとヒンジ領域中のシステインとの間の共有結合を還元できる工程
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。

上記の抗体Ｆａｂ’中間体の１つが使用される一態様において、抗体Ｆａｂ’中間体に２つ以上のエフェクター分子を結合させる方法が提供され、この方法は以下の工程を含む：
ａ）抗体Ｆａｂ’フラグメントを還元剤で処理する工程であって、この還元剤は、軽鎖定常領域中の操作して得たシステインとヒンジ領域中のシステインとの間の共有結合を還元できる、工程
ｂ）処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる工程。

本発明によって提供される方法は、１個又は複数のエフェクター分子が抗体フラグメント中のシステイン、特に定常領域及びヒンジ中のシステインに結合していることを可能にする。２つ以上のエフェクター分子は、本明細書に記載される方法を使用して、この方法を同時又は連続的にのいずれかで反復することによって、抗体フラグメントに結合できる。

本発明の方法はまた、上記の還元方法の前及び／又は後で１つ又は複数の工程に拡張され、ここでは、追加のエフェクター分子が、以前に記載された任意の適切な方法を使用して、例えば、アミノ基及びイミノ基などの他の利用可能なアミノ酸側鎖を介して抗体フラグメントに結合している。

本発明の方法に使用するための還元剤は、抗体フラグメント出発物質中のシステインを還元して、遊離チオールを産生できる任意の還元剤である。好ましくは、この還元剤はすべての利用可能なチオールを効率的に還元する。本発明の一態様において、還元剤は、システインへのエフェクター分子の結合を可能にするために、重鎖定常領域のシステインと軽鎖定常領域のシステインとの間の、例えば、Ｃ_Ｌの鎖間システインとＣ_Ｈ１の鎖間システインとの間の鎖間ジスルフィド結合を還元するために十分に強力である必要がある。鎖間ジスルフィド結合が鎖間システインの一方の非存在に起因して存在しない場合、還元剤は、抗体フラグメント中に残存しているシステイン、例えば、残存している鎖間システイン及び／又はヒンジ領域中のシステインから遊離チオールを効率的に遊離させることが可能でなくてはならない。本発明の抗体分子は、鎖間ジスルフィド結合についての要求性を有していないので、野生型抗体フラグメントで従来使用されるものよりも強力な還元剤が使用できる。その結果、より多くの数の遊離チオールが産生され、且つより高い割合の抗体フラグメントが正確に修飾され、即ち、正確な数のエフェクター分子が結合している。したがって、本発明の抗体フラグメントは、通常の抗体フラグメントよりも効率的且つ高いコスト効果で製造できる。適切な還元剤が、抗体フラグメントが還元剤で処理される後で産生される遊離チオールの数を決定することによって同定できることは当業者には明らかである。遊離チオールの数を決定するための方法は当該分野において周知であり、例えば、Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｅｅｒｉｎｇ，３，７０３を参照のこと。本発明に使用するための還元剤は当該分野において広範に公知である（例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５１，１６７−７３に記載されるもの）。特定の例には、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール系還元剤が含まれる。本発明の抗体フラグメントを還元するための他の方法には、電気分解的方法を使用すること（例えば、Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｄｉｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ，４，２３−２７において記載される方法）、及び光還元的方法を使用すること（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（２），３２４−３２６に記載される方法）が含まれる。しかし、好ましくは、本発明に使用するための還元剤は、抗体フラグメント中の１つ以上のチオールを遊離させることが可能である非チオール系還元剤である。好ましくは、非チオール系還元剤は、抗体フラグメント中のすべての利用可能なチオールを遊離させることが可能である。本発明に使用するための好ましい還元剤は、トリアルキルホスフィン還元剤である（Ｒｕｅｇｇ ＵＴ及びＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４７，１１１−１２６；Ｂｕｒｎｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，５６，２６４８−２６５０；Ｇｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０；Ｈａｎ及びＨａｎ、１９９４，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２０，５−１０；Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６，１２６５−１２７３）。これらの特定の例には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスブチルホスフィン（ＴＢＰ）、トリス−（２−シアノエチル）ホスフィン、トリス−（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、及びトリス−（２−ヒドロキシエチル）ホスフィンが含まれる。最も好ましくは、本発明に使用するため還元剤は、ＴＣＥＰ又はＴＨＰのいずれかである。本発明に使用するための還元剤の濃度は、例えば、還元剤の濃度を変化させること、及び産生した遊離チオールの数を測定することによって経験的に決定できることは当業者には明らかである。代表的には、本発明に使用するための還元剤は、抗体フラグメントよりも過剰で、例えば、２倍から１０００倍モル濃度過剰で使用される。好ましくは、この還元剤は、２、３、４、５、１０、１００、又は１０００倍過剰である。１つの好ましい例において、還元剤は４倍モル濃度過剰である。

本発明による修飾抗体フラグメントは、エフェクター分子、好ましくは、チオール選択性活性化エフェクター分子と、少なくとも１つの反応性システイン残基を含む抗体フラグメント（本明細書に記載されるようなもの）を反応細胞させることによって調製できる。上記の工程（ａ）及び（ｂ）における反応は、一般的に、溶媒、例えば、酢酸又はリン酸などの水性緩衝溶液中で、中性ｐＨ、例えば、約ｐＨ４．５から約ｐＨ８．０において実行できる。反応は、一般的に、任意の適切な温度、例えば、約５℃から約７０℃の間、例えば、室温で実行できる。溶媒は、場合により、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、又はＤＴＰＡなどのキレート剤を含んでもよい。好ましくは、溶媒は、ＥＤＴＡを、１から５ｍＭの間、好ましくは２ｍＭで含む。或いは、又は更に、溶媒は、クエン酸、シュウ酸、葉酸、ビシン、トリシン、トリス、又はＡＤＡなどのキレート剤緩衝液であってもよい。エフェクター分子は、一般的に、抗体フラグメントの濃度に比較して過剰の濃度で利用される。代表的には、エフェクター分子は、２から１００倍モル濃度過剰、好ましくは５、１０、又は５０倍過剰である。

必要である場合、所望の数のエフェクター分子を含む所望の生成物は、いずれかの開始物質、又は製造工程の間に生成され且つ望ましくない数のエフェクター分子を含む他の生成物から、通常の手段によって、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術によって分離できる。

本発明によって、２種以上のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含む混合物もまた提供され、この混合物はＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントで富化されており、ここでフラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、フラグメントが２つ以上のエフェクター分子を結合し、且つこれらの分子の少なくとも１つが軽鎖又は重鎖の定常領域中のシステインに結合していることを特徴とする。この混合物は、本発明によって提供される方法を使用して産生できる。「富化される」によって、本発明者らは、結合したエフェクター分子の所望の数を有する抗体フラグメントが、この混合物の５０％以上を占めることを意味する。好ましくは、結合したエフェクター分子の所望の数を有する抗体フラグメントは、この混合物の５０％から９９％の間を占める。好ましくは、この混合物は、５０％超、好ましくは６０％超、より好ましくは７０％超を占める。所望の数のエフェクター分子を有する抗体フラグメントを含むこのような混合物の割合は、本明細書に記載されるようなサイズ排除ＨＰＬＣ法を使用することによって決定できる。一例では、この混合物はＦａｂ’フラグメントで富化されており、ここで重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つ２種以上の結合したエフェクター分子がフラグメントに結合しており、ここで少なくとも１個のエフェクター分子が鎖間システインに結合しており、且つ少なくとも１個のエフェクター分子がヒンジ領域に結合している。

本発明による抗体フラグメントは、多数の疾患又は障害の検出又は治療において有用であってもよい。このような疾患又は障害には、感染性疾患、例えば、細菌感染；真菌感染；炎症性疾患／自己免疫、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患；癌；アレルギー性／アトピー性疾患、例えば、喘息、湿疹；先天性疾患、例えば、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血；皮膚科学的疾患、例えば、乾癬；神経学的疾患、例えば、多発性硬化症；移植、例えば、移植臓器拒絶、移植片対宿主疾患；及び代謝性／特発性疾患、例えば、糖尿病の一般的な標題の下で記載されるものが含まれる可能性がある。

本発明による抗体フラグメントは、治療及び／又は診断に使用するために製剤化でき、本発明のさらなる態様によれば、本発明者らは、２つ以上のエフェクター分子がフラグメントに結合しており、且つ少なくとも１つのこれらの分子が軽鎖又は重鎖の定常領域中のシステインに結合していることを特徴とする、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合していない抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体とともに含む、医薬組成物を提供する。

以下の図を参照して、本発明を例示のみのために以下に説明する。

Ｆａｂ’命名法及び一般的方法
以下の実施例において使用されるＦａｂ分子及びＦａｂ’分子は、ヒト細胞表面レセプターに結合するｇ１６５及びヒトサイトカインＩＬ−１βに結合するｇ８５１６である。各フラグメントについての命名法は、一文字コード、システインについてのＣ及びセリンについてのＳを使用して、軽鎖（ＬＣ）におけるＣ_Ｌの鎖間システインの部位、及び重鎖（ＨＣ）におけるＣ_Ｈ１の鎖間システインの部位におけるアミノ酸を示す。例えば、通常のＦａｂ’は「ｇ１６５ Ｆａｂ’ ＬＣ−Ｃ、ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ」であるのに対して、ＣＨ１の鎖間システインがセリンで置換されており、したがって鎖間ジスルフィドが存在しない改変体は、例えば、「ｇ１６５ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ」である。完全なγ１中間ヒンジは「ヒンジ−ＣＰＰＣＰＡ」と記述される。以下の実施例において使用されたプラスミドのリストを表１に示す。

Ｆａｂ’の産生
本発明のＦａｂ’分子は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０中で産生され、標準的な方法を使用して精製した（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６，３０９−３２０）。ＰＣＲ変異誘発を使用して、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１の鎖間システインをセリンに変化させた。

Ｆａｂ’の還元及びＰＥＧ化
すべての還元及びＰＥＧ化を、０．１Ｍリン酸ｐＨ６．０；２ｍＭ ＥＤＴＡ中で実行した。Ｆａｂ’及び還元剤の濃度は各実施例に記載される通りであった。すべての場合において、還元を室温（約２４℃）で３０分間行い、タンパク質をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、次いでＦａｂ’に対して５倍モル濃度過剰のＰＥＧ−マレイミドと混合した。４０ｋＤａ ＰＥＧはＮｅｋｔａｒからであり、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａ ＰＥＧはＮｉｐｐｏｎ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔｓ（ＮＯＦ）からであった。ＰＥＧ化したＦａｂ’を、ＰＥＧ化されていないＦａｂ’から、サイズ排除ＨＰＬＣによって、分析用Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０カラム及びＧＦ−２５０カラム上で、順次に分離した。これらを、０．２Ｍリン酸ｐＨ７．０＋１０％エタノールの３０分間の定組成グラジエントで、１ｍｌ／分にて展開し、Ｆａｂ’を２１４ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸収を使用して検出した。

実施例１：新規なＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントの作製
トリＰＥＧ化抗体Ｆａｂ’フラグメントを、抗体フラグメントｇ１６５ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡの鎖間ジスルフィドを還元すること、並びにＣ_Ｌの鎖間システイン及びＣ_Ｈ１の鎖間システイン及びヒンジシステインの利用可能なチオールにＰＥＧ分子を結合させることによって産生した。多数の異なる還元剤が試験された。チオール系還元剤は還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり、非チオール系還元剤はトリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）であった。

ｇ１６５ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡは１０ｍｇ／ｍｌであり、還元剤の濃度は５ｍＭであり、そしてフラグメントに結合したＰＥＧ分子の数はサイズ排除ＨＰＬＣによって決定された（図１）。ＰＥＧ化は、鎖間ジスルフィドが還元された場合に３つすべての利用可能なシステイン上で起こることが予測された。ＴＣＥＰは約６５％の複数−ＰＥＧ化を生じたのに対して、ＤＴＴは約１５％のみのＰＥＧ化物質を生じ、β−ＭＡ、β−ＭＥ、及びＧＳＨは痕跡量（１％未満）のみの複数−ＰＥＧ化を生じた。チオール系還元剤は、代表的には、モノＰＥＧ化されたＦａｂ’を生じた。なぜなら、これらの還元剤は、鎖間ジスルフィド結合を還元するために十分ではなかったからである。これらは、鎖間ジスルフィドが保持されるＰＥＧ化抗体フラグメントの産生において代表的に使用される還元剤である。これらの還元剤を使用して達成されるモノＰＥＧ化の低い効率がここで観察され、ＤＴＴについては５５％、βＭＡは５２％、βＭＥは２０％、及びＧＳＨは２２％であった。

別の例において、重鎖と軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は、Ｃ_Ｌの鎖間システイン又はＣ_Ｈ１の鎖間システインのいずれかをセリンで置換することによって除去された。１０ｍｇ／ｍｌの各抗体フラグメントを、５ｍＭ ＴＣＥＰで還元し、脱塩し、次いで４０ｋＤａ ＰＥＧ−マレイミドと反応させた。図２及び３における結果は、すべてのシステインが、ＰＥＧマレイミドに対して高度にアクセス可能であったことを示す。すべての場合において、予測されたチオールの数（２又は３）は、ＴＣＥＰを用いる還元後にアクセス可能であり、これは、効率的な部位特異的ＰＥＧ化が起こることを可能にした。図３ｂは、ＰＥＧ化されていない精製Ｆａｂ’フラグメントを示す。図３ａは、２つ以上のＰＥＧ分子の結合に関連する分子量の増加を図示する。レーン１はＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジＣＡＡに対応し、ここでは２つのＰＥＧ分子が重鎖に結合し、１つが軽鎖に結合している。レーン１における最大の分子量バンドは、結合した２つのＰＥＧ分子を有する重鎖であり、その次のバンドは、結合した１つのみのＰＥＧ分子を有する少量の重鎖であり、そしてその次のバンドは、結合した１つのみのＰＥＧ分子を有する軽鎖である。レーン３はＦａｂ’ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｃ、ヒンジＣＡＡに対応し、ここでは、重鎖に結合した２つのＰＥＧ分子が存在する。レーン３における最高の分子量のバンドは、結合した２つのＰＥＧ分子を有する重鎖であるのに対して、より低い分子量のバンドは、結合したＰＥＧ分子を有さない遊離の軽鎖である。レーン４はＦａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡに対応し、ここでは、重鎖及び軽鎖上に１つのＰＥＧが存在する。ともに非常に密接している２つの高分子量バンドは、結合した１つのＰＥＧ分子を有する重鎖及び軽鎖である。より低いバンドは、結合したＰＥＧを有さない、少量の推定の共有結合性軽鎖ダイマーである。レーン５は、単一のＰＥＧがＦａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジＳＡＡの各鎖に結合しているという点でレーン４と同じである。レーン６は、鎖間ジスルフィドが存在しない、結合したＰＥＧ分子が存在しない、Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｓ、ヒンジＳＡＡの対照である。観察された１つの主要なバンドは、重鎖及び軽鎖に非共有結合的に結合したものである。

すべての場合において、６５％超のＦａｂ’分子が、２つ又は３つのＰＥＧ分子で複数ＰＥＧ化された。したがって、本発明の修飾抗体フラグメントは、鎖間ジスルフィドが保持されている従来の抗体フラグメントよりも効率的に製造できる。

非チオール系還元剤、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）は、チオール系還元剤、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）よりも効率的な還元剤であることが示された。したがって、ＴＣＥＰは、本発明の修飾抗体フラグメントを産生するための有用な還元剤である。

実施例２：ＣＬ：Ｃ _Ｈ １間ジスルフィドを欠くＦａｂ’の安定性試験
Ｆａｂ’及びＦａｂ−ＰＥＧの物理的性能に対する、ＣＬ：Ｃ _Ｈ １間ジスルフィド結合の欠如の効果
ｉ）Ｆａｂ’の精製
Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生される抗体フラグメントは、通常、３０℃又は６０℃においてＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ中で一晩振盪させることによってペリプラズムから抽出される。高温熱抽出は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質からの抗体フラグメントの抽出及び部分精製を容易にする（米国特許第５，６６５，８６６号を参照のこと）。本発明者らは、システインをセリンに置換した軽鎖システインが、６０℃のインキュベーションが３０℃のインキュベーションに比較して行われた場合に、８０％のオーダーで減少した、Ｆａｂ’の収率を観察した（表１）。驚くべきことに、重鎖システインがセリンで置換された場合に、安定性は６０℃において９５％より高く、このことは、Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡが、Ｃ_Ｌとヒンジとの間のジスルフィドを効率的に形成するために十分に長く且つ可動性のあるヒンジを有し、このＦａｂ’を、ジＰＥＧ化Ｆａｂ’分子の製造において、これが上記の熱抽出を使用して精製できるような有用な中間体にすることを示した。このようなＦａｂ’の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン４、図３ｂ）もまた、ＬＣとＨＣとの間の共有結合を実証する。図３ｂは、レーン３において、ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｃ、ヒンジＣＡＡが遊離の重鎖及び軽鎖として存在するのに対して、レーン４においては、ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジＣＡＡの重鎖及び軽鎖は共有結合しており、このＦａｂ’は、未変性の鎖間ジスルフィドが存在するＦａｂ’、例えば、レーン１、Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジＣＡＡと同じ移動度を与えることを示す。

Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１間のジスルフィド結合を欠くように操作して得たＦａｂ’は、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１間のジスルフィド結合を含むＦａｂ’と正確に同じ様式で、プロテインＧ又はイオン交換を使用して精製された。これには、ｐＨ２．７での溶出（プロテインＧ）、又はｐＨ４．５での平衡化（イオン交換）を伴ったので、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１間のＦａｂ’相互作用は明確に物理化学的に安定であった。

ｉｉ）インビトロにおける抗原結合親和性
重鎖と軽鎖の間の共有結合の存在下又は非存在下における結合したＰＥＧ分子を有するｇ１６５ Ｆａｂ’を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を使用して抗原親和性について分析した。抗原はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）チップ上に捕捉され、抗体が溶液相中を通過し、親和性を決定した。

表２は、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１間のジスルフィドの欠如、又はモノ、ジ−若しくはトリ−ＰＥＧ化はいずれも実質的に結合親和性に影響を与えないことを示す。

実施例３：ラットにおけるＦａｂ−ＰＥＧの薬物動態
両方のペプチド上のＰＥＧ化Ｆａｂの動物における循環半減期
^１２５Ｉ標識されたＰＥＧ化Ｆａｂ’分子を、ラットに静脈内注射し、潜在的な治療的Ｆａｂ’の血清中での永続性を決定した。ＰＥＧ化されていないＦａｂ’の循環半減期は非常に短く（ｔ_１／２は約３０分間）、遊離のＬＣ又はＨＣのそれはなおより短いようである。

動物群あたり３００μｇのＦａｂ’−ＰＥＧを、Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、０．２２〜０．３３μＣｉ／μｇの比活性まで、^１２５Ｉ標識した。

２２０〜２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）を、ハロタン麻酔下に配置しながら、２０μｇの^１２５Ｉ−標識Ｆａｂ’−ＰＥＧ変異体を静脈内又は皮下に注射した（群あたりｎ＝６）。投与後、０．５、２、４、６、２４、４８、７２、及び１４４時間後に尾からの連続的動脈出血を採取した。試料を、ＣＯＢＲＡ（商標）Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して計数した。データをプロットし、曲線の下の面積を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を使用して計算し、％注射用量．時間（％ｉ．ｄ／時間）として表現する。ｔ１／２αを、０．５、２、４、及び６の時点で規定するのに対し、ｔ１／２βは、２４、４８、７２、及び１４４の時点で規定する。

Ｃ_ＬとＣ_Ｈ１との間の非共有結合的な結合が、マレイミドリンカー及びＰＥＧに関して立体的な問題によって妨害されるか否かを試験するために、ｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡを、ＴＣＥＰを強力な還元剤として使用して、２０ｋＤａと３０ｋＤａの両方のＰＥＧでジ−ＰＥＧ化した。更に、通常のｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡを、ＴＣＥＰを用いる非常に強力な還元によって、２０ｋＤａ ＰＥＧでトリＰＥＧ化した。表２及び図４におけるデータは、これらのＦａｂ’の最終的なＰＥＧ化型は非共有結合的に結合したＬＣ及びＨＣを有するが、循環半減期はモノＰＥＧ化対照のそれと比較し得るものであることを示す。

実施例４：マウス抗原結合効力モデル：動物モデルにおけるインビボ効力
静脈内投与されたｇ８５１６ Ｆａｂ’−ＰＥＧ及び腹腔内投与されたｈＩＬ−１β
雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２１ｇ）に、単回用量（１００μｌ ＰＢＳ中３ｍｇ／ｋｇ）のｇ８５１６ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡ−４０ｋＤａ ＰＥＧ、ｇ８５１６Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓヒンジ−ＣＡＡ−２×２０ｋＤａ ＰＥＧ、又はｇｈＡ３３ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃヒンジ−ＣＡＡ−４０ｋＤａ ＰＥＧ（関連性のない対照）を、ｈＩＬ−１β（１００μｌ ＰＢＳビヒクル中３ｎｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の７日及び１４日前に、静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。１２０分後、頸部脱臼によりマウスを屠殺し、腹腔洗浄を実行した（３ｍｌ ＰＢＳ＋０．２５％ ＢＳＡ、１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ）。全体の白血球計数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して実行した。好中球の同定のために、５０μｌの腹腔洗浄液を、抗ＣＤ４５−ＣｙＣｈｒｏｍｅ ｍＡｂの１：３００希釈、及び抗ＧＲ−１−ＰＥ ｍＡｂ（抗Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ）の１：３００希釈で２０分間（４℃、暗所で）染色した。白血球を１回ＰＢＳ（０．２５％ ＢＳＡ、１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中で洗浄し、３００μＬ ＰＢＳ（０．２５％ ＢＳＡ、１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。好中球をＣＤ４５^＋ＧＲ−１^ＨＩＧＨとして同定した。

図５は、いずれかの時点において、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１間のジスルフィド結合を有するか、又はそれを欠くｇ８５１６ Ｆａｂ−ＰＥＧの間で違いが存在しなかったことを示す。これは、効力が、１週間の間マウス循環中に保持されることを示し、ＬＣ及びＨＣがこの時間の間に結合したままであることの暗示を伴う。

実施例５：ヒンジ配列及び修飾軽鎖配列の設計及び試験
実施例２においてなされた観察の後で、Ｃ_Ｈ１の鎖間システインがセリンで置換された抗体Ｆａｂ’フラグメントの、ｃカッパの軽鎖システインとヒンジシステインの間の鎖間ジスルフィドを形成するための可動性の限界を調べるための構築物が作製され、且つ試験された。７つの異なるヒンジ配列（配列番号５〜１１）を含む種々の構築物が作製され、Ｅ．ｃｏｌｉ発現、６０℃におけるペリプラズム抽出、並びに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロットの間に、ＬＣとヒンジとの間の鎖間ジスルフィド結合を形成するそれらの能力について試験された。すべてのヒンジ変異体は、ＩｇＧ１（配列番号１５）からの標準的なｃカッパと合わせられた。本発明者らは、作製されたすべての変異体が（両方がより堅く、より可動性があり、且つより長い）、ｃκに対してジスルフィド結合を形成できることを見い出した（図６ａ及び６ｂ、レーン２〜８（それぞれ配列番号５〜１１））。陽性対照は、鎖間ジスルフィド結合を含むＦａｂ’であった。陰性対照は、鎖間ジスルフィド結合を欠くＦａｂ’であった（両方の鎖間システインがセリンで置換されている）。

Ｃ_ＬとＣ_Ｈ１の両方の鎖間システインがセリンによって置換された、抗体Ｆａｂ’フラグメント中のｃカッパ中の代替的なシステイン位置もまた調べられた。通常鎖間ジスルフィドを形成する末端ＣｙｓはＳｅｒに変異され、同時にＣｙｓはＮ末端に向かって１度に１アミノ酸移動した。５つの異なるｃカッパ配列が試験された（配列番号１６〜２０）。これらは、ｃカッパのシステインが異なる位置にあるときに結合がなお形成されるか否かを試験するために、２１４位の軽鎖の鎖間システインとジスルフィド結合を形成可能であることが知られているヒンジ（配列番号２）と対合された。本発明者らは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロットによって決定されるように、作製されたすべての変異体が、ヒンジとのジスルフィド結合を形成可能であることを見い出した（図６ａ及び６ｂ、レーン９〜１３ｃカッパ型６−２（それぞれ、配列番号２０、１９、１８、１７、及び１６））。陽性対照は、鎖間ジスルフィドを含むＦａｂ’であった。陰性対照は、鎖間ジスルフィド結合を含まないＦａｂ’であった（両方の鎖間システインがセリンに置換されている）。

上記の実施例より、本発明の新規なＰＥＧ化分子は、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１ジスルフィド結合を含むＰＥＧ化抗体よりも、より効率的に製造可能であることが明白に理解できる。この実施例はまた、鎖間ジスルフィド結合を欠くＦａｂ’のＰＥＧ化が、抗体Ｆａｂ’の生物活性又は安定性に有害作用を有さず、これらを、通常のＦａｂ’よりもより効率的に製造できる有用な治療用分子にすることを実証する。

サイズ排除ＨＰＬＣによって決定された、種々の還元剤を使用して製造された複数−ＰＥＧ化、モノ−ＰＥＧ化、及びＰＥＧ化されていないｇ１６５Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡの割合を示す図である。 サイズ排除ＨＰＬＣによって決定された、還元剤としてＴＣＥＰを使用して製造された複数−ＰＥＧ化、モノ−ＰＥＧ化、及びＰＥＧ化されていないｇ１６５Ｆａｂ’変異体の割合を示す図である。 ＰＥＧ化されたｇ１６５ Ｆａｂ’変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーン１ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ；レーン３ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ；レーン４ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ；レーン５ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＳＡＡ；レーン６ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＳＡＡ。 精製ｇ１６５ Ｆａｂ’変異体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。レーン１ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ；レーン３ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＣＡＡ；レーン４ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＣＡＡ；レーン５ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｃ ＨＣ−Ｃ、ヒンジ−ＳＡＡ；レーン６ Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ ＨＣ−Ｓ、ヒンジ−ＳＡＡ。 ラットにおいて静脈内投薬された^１２５Ｉ標識ＰＥＧ化Ｆａｂ’の薬物動態の図である。 マウスにおける腹腔内投与された抗原によって誘導された好中球の蓄積の、Ｆａｂ’−ＰＥＧの静脈内の事前の投薬による中和反応の図である。^＊＊＊対照抗体と比較してｐ＜０．００１。 軽鎖とヒンジ領域との間のジスルフィド結合を図示するための、ヒンジ及び軽鎖の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットの図である。 軽鎖とヒンジ領域との間のジスルフィド結合を図示するための、ヒンジ及び軽鎖の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットの図である。 ヒンジ及び軽鎖の配列の図である。

Claims (43)

1. Ｃ_Ｈ１の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることを特徴とする、抗体Ｆａｂ’フラグメント。
2. 修飾ヒンジ領域を含む、請求項１記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
3. ヒンジが配列番号１〜１４に示す配列のいずれか１つを含むか、又はそれからなる、請求項２記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
4. Ｃ_Ｌの鎖間システインがヒンジ領域中のシステインに共有結合している、請求項２又は３記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
5. Ｃ_Ｈ１の鎖間システインとＣ_Ｌの鎖間システインの両方が別のアミノ酸によって置換されており、軽鎖定常領域中の操作して得たシステインがヒンジ領域中のシステインに共有結合していることを特徴とする、抗体Ｆａｂ’フラグメント。
6. 軽鎖定常領域が配列番号１６〜２０に示す配列のいずれか１つを含むか、又はそれからなる、請求項５記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
7. ヒンジが配列番号１〜１１に示す配列のいずれか１つを含むか、又はそれからなる、請求項６記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
8. Ｃ_Ｌの鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることを特徴とする、抗体Ｆａｂ’フラグメント。
9. 修飾ヒンジ領域を含む、請求項８記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
10. Ｃ_Ｈ１の鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることを特徴とする、抗体Ｆａｂフラグメント。
11. Ｃ_Ｌの鎖間システインが別のアミノ酸によって置換されていることを特徴とする、抗体Ｆａｂフラグメント。
12. 置換された鎖間システインがチオールを含有しないアミノ酸によって置換されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
13. チオールを含有しないアミノ酸がセリンである、請求項１２記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
14. 少なくとも２つのエフェクター分子が結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
15. エフェクター分子が軽鎖定常領域中のシステイン及び／又は重鎖定常領域中のシステインに結合している、請求項１４記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
16. エフェクター分子が、軽鎖定常領域中のシステイン及び重鎖定常領域中のシステインに結合しており、前記の両システインは、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合を介して互いに連結されると見込まれる、請求項１５記載の抗体フラグメント。
17. エフェクター分子が、Ｃ_Ｌの鎖間システイン又はＣ_Ｈ１の鎖間システイン又は軽鎖定常領域中の操作して得たシステインの、いずれかフラグメント中に存在するものに結合している、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
18. エフェクター分子がヒンジ領域中の各システインに結合している、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
19. エフェクター分子がヒンジ中のシステインに結合しており、前記システインはエフェクター分子が結合する前にはＣ_Ｌの鎖間システインに共有結合していたものである、請求項１８記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
20. エフェクター分子がヒンジ中のシステインに結合しており、前記システインはエフェクター分子が結合する前には軽鎖定常領域中の操作して得たシステインに共有結合していたものである、請求項１８記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
21. 請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを産生する方法であって、
    ａ．請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３のいずれか一項記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを還元剤で処理し、前記還元剤が、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域及び／又は、存在する場合はヒンジ領域の、少なくとも１つのシステイン中に遊離チオール基を生成できる、
    ｂ．処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる、
    ことを含む方法。
22. 工程（ａ）が、存在する場合、Ｃ_Ｌ鎖間システインとヒンジ領域中のシステインとの間の共有結合を還元することを更に含む、請求項２１記載の方法。
23. 工程（ａ）が、存在する場合、軽鎖定常領域中の操作して得たシステインとヒンジ領域中のシステインとの間の共有結合を還元することを更に含む、請求項２１記載の方法。
24. フラグメントにおける重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、且つエフェクター分子がＣ_Ｌ及びＣ_Ｈ１の鎖間システインの各々に結合していることを特徴とする、２つ以上のエフェクター分子が結合している抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
25. 少なくとも１つの追加のエフェクター分子が、軽鎖定常領域中のシステイン及び／又は重鎖定常領域中のシステインに結合している、請求項２４記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
26. エフェクター分子が、軽鎖定常領域中のシステイン及び重鎖定常領域中のシステインに結合しており、前記の両システインは、エフェクター分子が結合していない場合、ジスルフィド結合を介して互いに連結されると見込まれる、請求項２５記載の抗体フラグメント。
27. 修飾ヒンジ領域を含む、請求項２６記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
28. ヒンジが配列番号１〜１４に示す配列のいずれか１つを含むか、又はそれからなる、請求項２７記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
29. エフェクター分子がヒンジ領域中の少なくとも１つのシステインに結合している、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ’フラグメント。
30. 請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを産生する方法であって、
    ａ．抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを還元剤で処理し、前記還元剤が、少なくともＣ_Ｈ１の鎖間システイン及びＣ_Ｌの鎖間システインにおける遊離チオール基を生成できる、
    ｂ．処理したフラグメントをエフェクター分子と反応させる、
    ことを含む方法。
31. Ｃ_Ｌの鎖間システインが軽鎖の２１４位であり、Ｃ_Ｈ１の鎖間システインが重鎖の２３３位である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
32. 還元剤が非チオール系還元剤である、請求項２１又は３０に記載の方法。
33. 還元剤がトリアルキルホスフィンである、請求項３２記載の方法。
34. トリアルキルホスフィン還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項３３記載の方法。
35. トリアルキルホスフィン還元剤がトリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、請求項３３記載の方法。
36. 工程（ａ）及び（ｂ）のいずれか又はその両方をキレート剤の存在下で実行する、請求項２１又は３０記載の方法。
37. キレート剤がＥＤＴＡである、請求項３６記載の方法。
38. 工程（ａ）及び（ｂ）の両方をＥＤＴＡの存在下で実行する、請求項３７記載の方法。
39. ２種以上の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントを含む混合物であって、混合物がＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントで富化されており、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、フラグメントが２種以上のエフェクター分子を結合し、且つ前記分子の少なくとも１つが軽鎖又は重鎖の定常領域中のシステインに結合していることを特徴とする混合物。
40. 混合物の５０％超がＦａｂ’又はＦａｂフラグメントを含み、フラグメント中の重鎖が軽鎖に共有結合しておらず、フラグメントが２種以上のエフェクター分子を結合し、且つ前記分子の少なくとも１つが軽鎖又は重鎖の定常領域中のシステインに結合している、請求項３９記載の混合物。
41. エフェクター分子がＰＥＧである、請求項１４〜３１及び３９〜４０のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
42. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体フラグメントを発現する宿主細胞。
43. 請求項１〜４２のいずれかに記載の抗体フラグメントを、１種又は複数の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体とともに含む、医薬組成物。

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