JP7351835B2 - 視神経脊髄炎の処置のための組換えＩｇＧ Ｆｃ多量体 - Google Patents

Description

本開示は、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）の処置のための組換えＩｇＧ Ｆｃ多量体の使用、およびそのような多量体を投与することによってＮＭＯを処置する方法を提供する。

病院では、原発性および二次性免疫不全を処置するために、血漿由来の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が使用される。この場合、ＩｇＧは、静脈内（ＩＶＩＧ）または皮下（ＳＣＩＧ）のいずれかに投与される。共に１０，０００を超えるドナーの大きな血漿プールから製造され、多様な抗体レパートリーを確保する。

免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、ギランバレー症候群、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、およびいくつかの他のまれな疾患などの慢性または急性の自己免疫性および炎症性疾患の患者の処置のために高用量のＩＶＩＧ投与（１～２ｇ／ｋｇ／用量）がますます使用されるようになってきた。さらに、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）の処置に対してなど、いくつかの他の兆候に対するＩＶＩＧの適応外使用が現在調査中である。

高用量ＩＶＩＧの抗炎症効果に関する作用の数々のメカニズムが提言されてきた。これらとしては、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）のブロック、自己抗体クリアランスを増大させるための胎児性ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）の飽和、抑制型ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）のアップレギュレーション、補体タンパク質フラグメントの捕捉および補体フラグメント沈着の抑制、ＩＶＩＧ中の抗イディオタイプ抗体（Ａｂ）、免疫のメディエーター（例えば、サイトカイン）の結合もしくは中和、または免疫細胞の調節（例えば、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞もしくは免疫寛容性樹状細胞の誘導）が挙げられる。

アストロサイト損傷、炎症および脱髄を特徴とする中枢神経系の自己免疫性脱髄疾患である視神経脊髄炎関連疾患（本明細書においてＮＭＯと呼ぶ）に対する効果的で安全な治療が必要とされている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。現行の治療法としては、免疫抑制剤、血漿交換およびＢ細胞除去が挙げられ、いくつかの薬物が、補体、ＩＬ－６受容体およびＮＭＯ自己抗体相互作用などのさまざまなＮＭＯ発病メカニズムを標的とした評価または前臨床開発の最中にある（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。大半のＮＭＯ患者は、アストロサイトに発現する水チャネルであるアクアポリン４（ＡＱＰ４）に対するＩｇＧ１自己抗体（ＡＱＰ４－ＩｇＧまたはＮＭＯ－ＩｇＧと呼ばれる）に関して血清陽性であり、この場合、ＡＱＰ４－ＩｇＧのＡＱＰ４との結合が補体によるアストロサイトに対する初期の損傷および細胞のエフェクター機構を引き起こして、炎症およびオリゴデンドロサイト損傷をもたらす（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。

いくつかの臨床試験は、大部分が裏付けに乏しいとはいえ、ＮＭＯにおけるＩＶＩＧの効果を裏付けている（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。ＩＶＩＧ処置したヒトの血清レベルと同等の血清レベルがもたらされる用量でＩＶＩＧが投与されたＮＭＯの実験マウスモデルにおいて病変の約５０％の低減がこれまでに実証された（非特許文献２３）。ＩＶＩＧによるＮＭＯ病変の低減は、補体および細胞を介したＡＱＰ４－ＩｇＧアストロサイト損傷の減少を伴った。最近、髄腔内経路によってヒトＮＭＯ患者の血清を投与されたラットにおいてＩＶＩＧの部分的な効果も報告された（非特許文献２４）。

興味深いことに、上記の特性のいくつかは、ＩｇＧのＦｃ部分を用いた場合にのみ再現することができた。Ｆｃ融合および多量体タンパク質を含むさまざまな組換えＦｃベースの治療法が開発中であり、これらは、関節炎、ＩＴＰおよび炎症性ニューロパチーの実験動物モデルにおいて効果を示した（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）。

複数のＦｃドメインを含む有望なＩＶＩＧ代替タンパク質が、特許文献１、特許文献２、または特許文献３に記載されている。複数のＦｃフラグメントを有するコンストラクトのさまざまな異なる構成が予想されるが、開示されているそのようなコンストラクトの主なクラスは、いわゆる、ストラドマー（ｓｔｒａｄｏｍｅｒ）であり、これは、ＩｇＧ２ヒンジ領域などの多量体化ドメインを有するＦｃフラグメントを含む。しかしながら、予想される多量体タンパク質の効果に関する実施例は、特許文献１に示されていない。

本発明において有用な可能性のある多量体化ドメインを有するその他のＦｃ多量体コンストラクトとしては、六量体コンストラクトが挙げられ、ここでは、ＩｇＧ Ｆｃフラグメントを多量体化するためにＩｇＭ尾部が使用される。例えば、特許文献４は、切断されたヒンジ領域、４アミノ酸リンカー、およびＩｇＭ尾部を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むＦｃ多量体コンストラクトを開示しており、これは、主として六量体構造に多量体化する。ＩｇＭの配列を模倣するためにＦｃ残基３０９および３１０に変異（Ｌ３０９ＣおよびＨ３１０Ｌ）が導入された。

特許文献５および特許文献６は、５アミノ酸ヒンジ領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＧ１とＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのハイブリッド由来のＦｃ領域ならびにＩｇＭまたはＩｇＡ尾部を含む、いくつかのＦｃ多量体コンストラクトを開示している。この開示は、融合ペプチドのＦｃ領域におけるアミノ酸の変化の導入によるＩｇＧ Ｆｃ多量体の安全性および有効性を改善することを対象としている。

最適化された六量体Ｆｃ－μＴＰコンストラクトが特許文献７に開示されており、これは、インビボ、エクスビボ、およびインビトロにおいて以前に示されたものを超えるいくつかの利点を有することが示された。Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ結合Ｃ１ｑは、補体タンパク質Ｃ２の切断を誘導しなかったため、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ）が形成されなかった。Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、完全な古典的補体経路の活性化を選択的に阻害し、代替経路への干渉は観察されなかった。

本発明者らは、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃなどの多量体化ドメインを有するＦｃ多量体が視神経脊髄炎（ＮＭＯ）の処置に有効であるという驚くべき発見をした。実証されたＦｃ多量体コンストラクトの驚くべき治療的有用性としては、以下のことが挙げられる：
・驚くべきことに、ＮＭＯのインビトロモデルにおいて補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害を抑制する。
・驚くべきことに、ＮＭＯの脊髄切片モデルにおいてエクスビボで補体依存性細胞傷害を抑制し、病変を調整する。
・驚くべきことに、ＮＭＯのラットモデルにおいてインビボで細胞傷害および病変を防ぐ。

ＷＯ２００８／１５１０８８ ＷＯ２０１２／０１６０７３ ＷＯ２０１７／０１９５６５ ＷＯ２０１４／０６０７１２ ＷＯ２０１５／１３２３６４ ＷＯ２０１５／１３２３６５ ＷＯ２０１７／１２９７３７

Ｈｅｎｇｓｔｍａｎら、２００７年、Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ． １３、６７９～６８２ページ Ｍｉｓｕら、２００７年 Ｂｒａｉｎ １３０、１２２４～１２３４ページ ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓおよびＶｅｒｋｍａｎ、２０１２年、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． １１、５３５～５４４ページ Ａｒａｋｉら、２０１４年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８２、１３０２～１３０６ページ Ｃｒｅｅら、２００５年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６４、１２７０～１２７２ページ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、２０１２年、Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ． １８、１０２２～１０２６ページ Ｋａｇｅｙａｍａら、２０１３年、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２６０、６２７～６３４ページ Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓら、２０１４年、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｌ． １０、４９３～５０６ページ Ｖｅｒｋｍａｎら、２０１３年、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ． ２３、８４～６９５ページ Ａｓｇａｒｉら、２０１３年、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ２５４、７６～８２ページ Ｇｒａｂｅｒら、２００８年、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍ． ５、２２ページ Ｊａｒｉｕｓら、２０１４年 ＪａｒｉｕｓおよびＷｉｌｄｅｍａｎｎ、２０１０年、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｌ． ６、３８３～３９２ページ Ｌｅｎｎｏｎら、２００５年、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２０２， ４７３～４７７ページ Ｌｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉら、２００２年、Ｂｒａｉｎ １２５、１４５０～１４６１ページ ＰａｒｒａｔｔおよびＰｒｉｎｅａｓ、２０１０年、Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ． １６、１１５６～１１７２ページ Ｂａｋｋｅｒら、２００４年、Ｃａｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． ３１、２６５～２６７ページ Ｅｌｓｏｎｅら、２０１４年、Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ． ２０、５０１～５０４ページ Ｍａｇｒａｎｅｒら、２０１３年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉａ ２８、６５～７２ページ Ｏｋａｄａら、２００７年、Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ４６、１６７１～１６７２ページ Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、２０１５年、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ２８２、９２～９６ページ Ｗｉｎｇｅｒｃｈｕｋ、２０１３年、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３、補遺１： Ｓ３３～３７ページ Ｒａｔｅｌａｄｅら、２０１４年、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６２、１０３～１１４ページ Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら、２０１６年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． １７、 ｐｉｉ： Ｅ１４０７． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０９１４０７ Ａｎｔｈｏｎｙら、２００８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０、３７３～３７６ページ Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙら、２０１５年、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ５、９５２６ページ Ｊａｉｎら、２０１２年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． １４、Ｒ１９２ページ Ｌｉｎら、２００７年、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １８６、１３３～１４０ページ Ｎｉｋｎａｍｉら、２０１３年、Ｊ． Ｐｅｒｉｐｈｅｒ． Ｎｅｒｖ． Ｓｙｓｔ． １８、１４１～１５２ページ Ｔｈｉｒｕｐｐａｔｈｉら、２０１４年、Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． ５２、６４～７３ページ

本開示は、多量体化ドメインを含むＦｃ多量体の投与を含む、視神経脊髄炎を処置する方法を提供する。

本発明の好適な実施形態において、本発明において使用されるＦｃ多量体は、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているものなどの２から６つのＩｇＧ Ｆｃ融合単量体を含む。ＩｇＧ Ｆｃ融合単量体のそれぞれは、２つのＦｃ融合ポリペプチド鎖を含み、各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧ ＦｃポリペプチドおよびＩｇＭ尾部を含む。好適な実施形態において、Ｆｃ多量体は、６つのＩｇＧ Ｆｃ融合単量体を含むＦｃ六量体である。

好適な別の実施形態において、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧヒンジ領域をさらに含み、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、Ｆａｂポリペプチドを含まない。

例えば、好適な一実施形態において、本発明において使用されるＦｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、およびＩｇＭ尾部を含み、Ｆａｂポリペプチドを含まない。好適な実施形態において、各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖におけるＩｇＭ尾部は、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドの定常領域のＣ末端において２３２アミノ酸と融合した１８アミノ酸を含む。別の好適な実施形態において、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、配列番号１であり、最大５つの保存的アミノ酸変化を有する。個々の好適な実施形態において、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、配列番号２（ＷＯ２０１７／１２９７３７の配列番号７と対応する）として表され、ここから、分泌および成熟Ｆｃ六量体の形成過程でシグナルペプチドが切り離される。

好適な実施形態において、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、およびＩｇＭ尾部を含み、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、（ＥＵナンバーリングに従って）位置３０９にロイシンの代わりにシステインを有し、Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｆａｂポリペプチドを含まず、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、（ＷＯ２０１７／１２９７３７の配列番号２と対応する）配列番号３である。さらに好適な実施形態において、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、最大５つの保存的アミノ酸変化を有する配列番号３である。個々の好適な実施形態において、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、（ＷＯ２０１７／１２９７３７の配列番号８と対応する）配列番号４として表され、ここから、分泌および成熟Ｆｃ六量体の形成過程でシグナルペプチドが切り離される。

本発明において使用されるさらに別の実施形態は、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは、Ｆｃ融合ポリペプチド鎖と連結されたシグナルペプチドもコードする。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、インビトロでＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞において濃度依存的様式で補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害をブロックする。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、インビトロでチャイニーズハムスター卵巣細胞において血清陽性の視神経脊髄炎患者由来の血清によって引き起こされる補体依存性細胞傷害をブロックする。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、視神経脊髄炎のエクスビボ脊髄切片モデルにおいて補体依存性細胞傷害および病変を防ぐ。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、視神経脊髄炎の実験ラットモデルにおいてＡＱＰ４－ＩｇＧおよびラット補体によってもたらされる補体依存性細胞傷害および病変を防ぐ。好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、視神経脊髄炎の実験ラットモデルにおいてアストロサイト損傷、脱髄、炎症および活性化補体の沈着を防ぐ。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、ＡＱＰ４－ＩｇＧまたはそのＡＱＰ４との結合ではなく補体成分Ｃ１ｑと結合する。一実施形態において、Ｃ１ｑと結合しているＦｃ六量体は、完全な古典的補体経路の活性化を誘導しない。

本開示はまた、治療有効量のＦｃ六量体の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによって対象の視神経脊髄炎を処置するための方法を提供する。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、静脈内または非静脈内投与される。一実施形態において、Ｆｃ六量体は、皮下投与される。一実施形態において、Ｆｃ六量体は、経口的、または髄腔内、または噴霧化によって肺内に適用される。

好適な実施形態において、Ｆｃ六量体は、約１０ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。一実施形態において、Ｆｃ六量体は、約２５ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。すべての用量は、Ｆｃ六量体が投与される対象の体重の１ｋｇあたりの用量である。

別の実施形態において、本発明において使用されるＦｃ多量体は、ストラドマーであり、この場合、ＩｇＧ Ｆｃフラグメントは、ＷＯ２００８／１５１０８８、ＷＯ２０１２／０１６０７３またはＷＯ２０１７／０１９５６５において開示されているとおり、多量体化ドメイン、好ましくは、ＩｇＧ２ヒンジ領域を備える。好適な実施形態において、Ｆｃ多量体は、配列番号５を含むポリペプチド鎖を発現させることによって作製され、それによって、成熟Ｆｃ多量体は、配列番号５の残基２１から２６４を含む。

前述の概括的な説明および以下の詳細な説明は、例となる説明のためのものに過ぎず、本開示の非限定的説明をさらに提供することを意図することが理解されるべきである。

試験した４つのＦｃ調製物の構造：（ａ）臨床グレードのＩＶＩＧ（プールされたヒトＩｇＧ）、（ｂ）Ｆｃ単量体、（ｃ）Ｆｃ－μＴＰ六量体、および（ｄ）Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体を示す図である。 Ｆｃ－μＴＰ（左）およびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ（右）Ｆｃタンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す図である。ｋＤａ単位で分子量マーカーを示す。 Ｆｃ－μＴＰ（左）およびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ（右）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示すグラフである。クロマトグラムは、２８０ｎｍ（Ａ２８０）における正規化された紫外線吸光度シグナルを示し、太線は、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって求められた、示した時間に溶出された材料の分子量（ｋＤａ単位）を示す。 Ｆｃ－μＴＰ（左）およびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ（右）の非対称フロー式フィールド・フロー・フラクショネーション（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｅｌｄ－ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（ＡＦ４）を示すグラフである。クロマトグラムは、正規化されたＡ２８０シグナルを示し、太線は、ＭＡＬＳによって求められた、示した時間に溶出された材料の分子量（ｋＤａ単位）を示す。 ＮＦκＢのＬＰＳによる活性化を示すが、Ｆｃタンパク質、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃによる活性化は示さないグラフであり、このことは、エンドトキシン汚染がないことを示す。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＦｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体による補体依存性細胞傷害の抑制パーセントを示すグラフである。細胞への添加の前に、Ｆｃ調製物を１％または０．５％ヒト補体とともにプレインキュベートした。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＦｃ単量体およびＩＶＩＧによる補体依存性細胞傷害の抑制パーセントを示すグラフである。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞における５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ濃度のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体による補体依存性細胞傷害の抑制パーセントを示すグラフである。 チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＦｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体による補体依存性細胞傷害の抑制パーセントを示すグラフであり、細胞傷害は、血清陽性の視神経脊髄炎患者由来の血清によって引き起こされる。 視神経脊髄炎のエクスビボ脊髄切片モデルの免疫蛍光染色を示す図である。脊髄切片を（ａ）対照ＩｇＧおよびヒト補体、（ｂ）ＡＱＰ４－ＩｇＧおよびヒト補体、（ｃ）ＡＱＰ４－ＩｇＧ、ヒト補体、およびＦｃ－μＴＰ、ならびに（ｄ）ＡＱＰ４－ＩｇＧ、ヒト補体、およびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃとともにインキュベートした。アストロサイト損傷は、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰ染色の減少によって示され、脱髄は、ＭＢＰ染色の減少によって示され、炎症は、Ｉｂａ－１染色の増加によって示され、補体終末膜侵襲複合体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）の沈着は、Ｃ５ｂ－９染色によって示される。 各処置群に関する脊髄切片モデルの病変スコアの概要を示す。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞における抗体依存性細胞傷害のＦｃ単量体、ＩＶＩＧ、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体による抑制パーセントを示すグラフである。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞の免疫蛍光染色を示す図である。細胞をＡＱＰ４－ＩｇＧとともにインキュベートして、Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体の存在下におけるＡＱＰ４との結合の可能性を確認した。 ＡＱＰ４結合ＡＱＰ４－ＩｇＧを伴うチャイニーズハムスター卵巣細胞の免疫蛍光染色を示す図である。細胞を、Ｃ１ｑとともにインキュベートして、２０μｇ／ｍｌのＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体、１００μｇ／ｍｌのＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体、および１００μｇ／ｍｌのＦｃ単量体の存在下におけるＡＱＰ４結合ＡＱＰ４－ＩｇＧとの結合の可能性を確認した。 さまざまな濃度のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体およびヒト補体の存在下における赤血球溶解のモデルにおいて古典的または代替補体経路の活性化によってもたらされた溶血％を示すグラフである。（ｉ）は、漸増濃度のヒト補体の存在下において古典的または代替補体経路の活性化によってもたらされた溶血％を示す。（ｉｉ）は、漸増濃度のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体および１％または５％のいずれかの濃度のヒト補体の存在下において古典的補体経路の活性化によってもたらされた溶血％を示す。（ｉｉｉ）は、漸増濃度のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体および５％または１０％のいずれかの濃度のヒト補体の存在下において代替補体経路の活性化によってもたらされた溶血％を示す。 １％または２％ラット血清の存在下での視神経脊髄炎の実験ラットモデルにおけるＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体による濃度依存的様式での補体依存性細胞傷害の抑制パーセントを示すグラフである。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるインビトロでの補体依存性細胞傷害の抑制パーセントを示すグラフである。０ｍｇ／ｋｇ、３．１２５ｍｇ／ｋｇ、６．２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇ用量のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体の投与の２時間後にラットから採取した血清に細胞を曝露した。 ＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるインビトロでの補体依存性細胞傷害の抑制パーセントの時間経過を示すグラフである。５０ｍｇ／ｋｇ用量のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体の投与後のさまざまな時点でラットから採取した血清に細胞を曝露した。 ＡＱＰ４－ＩｇＧ処置ラットの脳における免疫蛍光染色を示す図である。ＡＱＰ４をラットの脳内に注射した。ラットをＡＱＰ４および５０ｍｇ／ｋｇ用量のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体で同時に処置し、最初の処置の１２時間後に再び六量体で処置した。脳を採取し、切片を対照ＩｇＧまたはＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃとともにインキュベートした。注射していない反対側の半球の免疫蛍光を比較のために示す。アストロサイト損傷は、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰ染色の減少によって示され、脱髄は、ＭＢＰ染色の減少によって示され、炎症は、Ｉｂａ－１およびＣＤ４５染色の増加によって示され、補体終末膜侵襲複合体の沈着は、Ｃ５ｂ－９染色によって示される。 大量のＡＱＰ４－ＩｇＧで処置されたラットの脳における免疫蛍光染色を示す。ラットをＡＱＰ４および５０ｍｇ／ｋｇ用量のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体で同時に処置し、最初の処置の１２時間後に再び六量体で処置した。脳を採取し、切片を対照ＩｇＧまたはＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃとともにインキュベートした。注射していない反対側の半球の免疫蛍光を比較のために示す。アストロサイト損傷は、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰ染色の減少によって示され、脱髄は、ＭＢＰ染色の減少によって示される。 ＷＯ２０１７／１２９７３７の配列である。 本発明の実施形態において使用されるその他の六量体の配列である。 図１０－１の続き。 図１０－２の続き。 図１０－３の続き。 図１０－４の続き。 図１０－５の続き。 図１０－６の続き。 本発明の実施形態において使用されるストラドマーの配列である。 図１１－１の続き。 本発明の実施形態において使用されるＷＯ２０１７／１７２８５３に開示されている組換えＦｃ化合物の配列である。 本発明の実施形態において使用されるＦｃ多量体に使用される適したヒンジ領域の例の配列である。

以下の詳細な説明および実施例は、本開示の特定の実施形態を説明するものである。本開示の範囲に包含される本開示の多数の変形物および改変物が存在することを当業者は認識するであろう。したがって、特定の実施形態の説明は、限定するものと見なされるべきではない。

「Ｆｃ単量体」という用語は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントもしくはフラグメントを含むＩｇＧ重鎖定常領域の部分と定義される。ＩｇＧ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、それぞれＣγ２およびＣγ３ドメインとも呼ばれる。

Ｆｃ単量体は、ペプチドのＮ末端部分にあるシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される２つの同一のＦｃペプチドから構成することが可能である。ＩｇＧに関して記載されているジスルフィド結合の配置は、天然のヒト抗体に関連する。他の脊椎動物種由来の抗体間でいくつかの変形がある場合もあるが、そのような抗体は、本発明の状況に適している可能性もある。Ｆｃペプチドは、組換え発現技術により作製され、天然の抗体において生じるとおりのジスルフィド結合によって結合することが可能である。あるいは、１つまたはそれ以上の新しいシステイン残基をＦｃペプチドの適切な位置に導入して、ジスルフィド結合が生じるのを可能にすることができる。

一実施形態において、本発明において使用されるＦｃ単量体は、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの同一のペプチド鎖を含む。

別の実施形態において、本発明において使用されるＦｃ単量体は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン全体を含み、ＷＯ２０１７／１２９７３７に開示されているとおり、それぞれＣＨ２のＮ末端の端部またはＣＨ３のＣ末端の端部で切断される。一般に、Ｆｃ単量体は、免疫グロブリンのＦａｂポリペプチドがない。Ｆａｂポリペプチドは、ＣＨ１ドメインおよび重鎖可変領域ドメインから構成される。

本発明において使用されるＦｃ単量体は、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３部分を超えた部分を含むこともある。例えば、一実施形態において、単量体は、免疫グロブリンのヒンジ領域、そのフラグメントもしくはバリアント、または改変されたヒンジ領域を含む。天然のヒンジ領域は、天然の免疫グロブリンにおいてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に生じる免疫グロブリンの領域である。バリアントまたは改変されたヒンジ領域は、長さおよび／または組成が天然のヒンジ領域とは異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジは、他の種由来のヒンジ領域を含むことが可能である。その他の改変されたヒンジ領域は、Ｆｃ部分のそれとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体由来の完全なヒンジ領域を含む。あるいは、改変されたヒンジ領域は、天然のヒンジの一部または繰り返しのそれぞれの単位が天然のヒンジ領域由来である繰り返し単位を含む。別の代替物において、天然のヒンジ領域は、システイン残基の数を増加または減少させることによって改変される。その他の改変されたヒンジ領域は、完全に非天然のものであり、長さ、システイン組成、および柔軟性などの所望の特性を持つように設計される。

本発明において使用するための多くの改変されたヒンジ領域が、例えば、ＵＳ５，６７７，４２５、ＷＯ１９９８／２５９７１、ＷＯ１９９９／１５５４９、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、およびＷＯ２００５／００３１７１に記載されている。

本発明の一実施形態において使用されるＦｃ多量体中のＦｃポリペプチドは、そのＮ末端にヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を有する。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号１の残基１から１５の配列を有する。

本発明において使用される、ＷＯ２０１７／１２９７３７に開示されているとおりのシグナルペプチドを含むＦｃポリペプチド鎖が発現させられる。シグナルペプチドは、Ｆｃポリペプチド鎖の分泌を支配し、その後、残りのＦｃポリペプチド鎖から切断される。

本発明のある実施形態において使用されるＦｃポリペプチドは、ヒンジ領域のＮ末端に融合されたシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、配列番号２の残基１から１９の配列を有することが可能であるが、当業者は、哺乳動物細胞からのタンパク質の分泌を支配する他のシグナル配列も使用できることがわかるであろう。

２つまたはそれ以上のＦｃ単量体の多量体構造の形成を向上させるために、Ｆｃペプチドは、単量体単位を多量体に集合させる尾部と融合される。Ｆｃペプチドの尾部との融合の生成物は、本明細書中で使用される「Ｆｃ融合ペプチド」である。Ｆｃペプチドは、二量体になり、Ｆｃ単量体を形成するため、Ｆｃ融合ペプチドは、同様に二量体になり、Ｆｃ融合単量体を形成する。

したがって、「Ｆｃ融合単量体」は、本明細書中で使用される場合、２つのＦｃ融合ポリペプチド鎖を含み、各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧ ＦｃポリペプチドおよびＩｇＭ尾部を含む。

適した尾部は、ＩｇＭまたはＩｇＡ由来である。ＩｇＭおよびＩｇＡは、天然には一般的なＨ_２Ｌ_２抗体単位の共有結合性多量体としてヒトで生じる。ＩｇＭは、Ｊ鎖を含む場合に五量体として、またはＪ鎖がない場合に六量体として生じる。ＩｇＡは、単量体として生じ、二量体を形成する。ＩｇＭおよびＩｇＡそれぞれの重鎖は、Ｃ末端定常ドメインに延びるそれぞれ１８アミノ酸を有し、尾部として知られている。この尾部は、重合体の重鎖間にジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、重合に重要な役割を有すると考えられている。尾部は、グリコシル化部位も含む。

本開示の尾部は、任意の適したアミノ酸配列を含む。尾部は、天然に存在する抗体に見られる尾部であるか、あるいは、天然の尾部とは長さおよび／または組成が異なる改変された尾部である。その他の改変された尾部は、完全に非天然であり、長さ、柔軟性、およびシステイン組成など、多量体化に望ましい特性を持つよう設計される。

本発明のある実施形態において使用されるＦｃ多量体にある尾部は、配列番号１の残基２３３から２５０および配列番号１１に示されるとおりのヒトＩｇＭからの１８アミノ酸の配列のすべてまたは一部を含む。あるいは、尾部は、ヒトＩｇＭ尾部のフラグメントまたはバリアントが可能である。

本発明の一実施形態において使用されるＦｃ多量体にある尾部は、Ｆｃペプチドの定常領域のＣ末端に直接融合され、Ｆｃ融合ペプチドを形成する。あるいは、尾部は、Ｆｃペプチドの定常領域のＣ末端にある２３２アミノ酸のセグメントに融合される。あるいは、尾部は、介在アミノ酸配列によって間接的に融合される。例えば、尾部とＦｃペプチドの間に短いリンカー配列を設けることもできる。リンカー配列は、１から２０の間のアミノ酸長が可能である。

多量体構造の形成は、Ｆｃ融合ペプチドのＦｃ部分のロイシン３０９をシステインに変異させることによってさらに向上させることができる。Ｌ３０９Ｃ変異は、Ｆｃ融合単量体間に追加のジスルフィド結合の形成を可能にさせ、これは、Ｆｃ融合単量体の多量体化をさらに促進する。ＩｇＧ Ｆｃ部分の残基は、Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、（１９６９年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６３、７８～８５ページに記載されている、ＩｇＧに対するＥＵナンバーリングシステムに従ってナンバーリングされる；Ｋａｂａｔら、１９８３年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ワシントン、ＤＣも参照のこと。ＩｇＧのＬｅｕ３０９は、配列相同性によってＩｇＭのＣμ３ドメインにあるＣｙｓ４１４およびＩｇＡのＣα２ドメインにあるＣｙｓ３０９と対応する。

所望の効果を実現するために、さらにまたは代わりに他の変異がＦｃ融合ペプチドに導入される。「変異」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ融合ペプチドは、最大２０、最大１０、最大５、または最大２つのアミノ酸の変異を含む。

本発明の一実施形態において使用されるＦｃ多量体中の変異は、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されている保存的アミノ酸変化である。「保存的アミノ酸変化」という用語は、本明細書中で使用される場合、電荷、疎水性、構造、および／またはサイズなどの類似の生化学的特性を有する、あるアミノ酸の異なるアミノ酸への変化を指す。本発明のある実施形態において使用されるＦｃ融合ペプチドは、最大２０、最大１０、最大５、または最大２つの保存的アミノ酸変化を含む。例えば、Ｆｃ融合ペプチドは、最大５つの保存的アミノ酸変化を含む。

保存的アミノ酸変化は、以下の残基のグループ間の変化を含む：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。

「バリアント」は、ペプチド、タンパク質、またはそのフラグメントを示すために本明細書中で使用される場合、修飾アミノ酸を有する場合もある。適した修飾としては、アセチル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ヌクレオチジル化（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、ＡＤＰリボース化、および当該技術分野において知られているその他の修飾が挙げられる。そのような修飾は、翻訳後に行うことができ、この場合、ペプチドは、組換え技術によって作製される。別の方法では、当該技術分野において既知の技術を使用して合成ペプチドに修飾を行うこともできる。修飾は、アミノ酸のペプチドへの組み込みの前に含まれる場合もある。カルボン酸基は、エステル化することができ、またはアミドに変換することができ、アミノ基は、アルキル化、例えば、メチル化することができる。バリアントはまた、例えば、糖側鎖または個々の糖部分を除去または付加するよう翻訳後に修飾することができる。

「Ｆｃ多量体」という用語は、本明細書中で使用される場合、２つまたはそれ以上の重合化Ｆｃ融合単量体を示す。Ｆｃ多量体は、２から６つのＦｃ融合単量体を含み、Ｆｃ二量体、Ｆｃ三量体、Ｆｃ四量体、Ｆｃ五量体、およびＦｃ六量体をもたらす。Ｆｃ融合単量体は、さまざまな数の単量体単位を有する重合体に自然に集合する。

ＷＯ２０１７／１２９７３７に開示されているとおり、Ｆｃ多量体の大部分は、Ｆｃ六量体である。本明細書中で使用される場合、「大部分」という用語は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超を指す。一実施形態において、Ｆｃ多量体の８０％超は、Ｆｃ六量体である。

特定の数の単量体を含むＦｃ多量体が必要とされる場合、Ｆｃ多量体は、分子の大きさに従って、例えば、ゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー）によって分離することができる。

一実施形態において、本発明において使用されるＦｃ多量体は、例えば、ＷＯ２００８／１５１０８８、ＷＯ２０１２／０１６０７３、またはＷＯ２０１７／０１９５６５に記載されている複数のＦｃドメインを含む有望なＩＶＩＧ代替タンパク質である。

別の実施形態において、ＷＯ２００８／１５１０８８に記載されているとおり、多量体Ｆｃは、ＩｇＧ２ヒンジ領域などの多量体化ドメインを有するストラドマーである。

一実施形態において、本発明において使用されるＦｃ多量体は、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れるＷＯ２００８／１５１０８８、ＷＯ２０１２／０１６０７３、およびＷＯ２０１７／０１９５６５に開示されているとおり、２つまたはそれ以上の多量体化された単位を含む化合物であり、前記単位のそれぞれは、多量体化領域およびＦｃγ受容体と結合することができる少なくとも１つのＦｃドメインを含む領域を含み、前記単位のそれぞれは、多量体化領域単量体および少なくとも１つのＦｃドメイン単量体を含む領域を含み、２つの単量体の二量体化は、多量体化領域およびＦｃγ受容体と結合することができる少なくとも１つのＦｃドメインを含む領域を形成し、２つまたはそれ以上の単位の多量体化領域は、多量体化して、化合物を形成し、化合物は、第１のＦｃドメインにより第１のＦｃγ受容体とおよび第２のＦｃドメインにより第２のＦｃγ受容体と結合することができ、多量体化領域は、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＥ ＣＨ２ドメイン、ロイシンジッパー、イソロイシンジッパーおよび亜鉛フィンガーからなる群から選択され、Ｆｃγ受容体と結合することができる少なくとも１つのＦｃドメインを含む領域のそれぞれは、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。好ましくは、多量体化領域は、ＩｇＧ２ヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ２ １２アミノ酸ヒンジ領域ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号５の残基２５３から２６４）である。より好ましくは、Ｆｃ多量体は、ＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインにより自然に多量体化する配列番号５（ＷＯ２０１２／０１６０７３の配列番号４）のポリペプチドの発現によって得られる。より好ましくは、ＷＯ２０１７／０１９５６５に示されるとおり、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントには、Ｃ１ｑ結合および／またはＦｃγ受容体結合を最適化するために１つまたはそれ以上の点変異が導入される。

好ましくは、Ｆｃ多量体は、（ａ）ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの位置２６７、２６８、および／または３２４の少なくとも１つと対応する１つまたはそれ以上の点変異を有する少なくとも１つのＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ならびに（ｂ）少なくとも１つの多量体化ドメインを含むストラドマー単位を含む。好ましくは、点変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｅ、およびＳ３２４Ｔである。Ｆｃドメインは、位置２９７に点変異、例えば、Ｎ２９７Ａをさらに含むこともある。Ｆｃドメインは、位置２３４および２３５に点変異をさらに含むこともあり、例えば、Ｆｃドメインは、点変異Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、およびＳ３２４Ｔを含むこともある。

したがって、本発明のこれらの実施形態において、本発明において使用されるＦｃ多量体は、配列番号６の残基２１から２６４および配列番号７の残基２１から２６４から選択される配列を有するストラドマー単位を含み、最大１０個の付加的な点変異、好ましくは、最大８つの付加的な点変異、より好ましくは、最大６つの付加的な点変異を含む場合もある。好ましくは、それらの点変異は、ＷＯ２０１７／０１９５６５に開示されているものから選択される。本発明のさらに別の実施形態において、本発明において使用されるＦｃ多量体は、それぞれ（ＷＯ２０１７／０１９５６５の配列番号１０、１１、１２、１４、１５、２１および２２と対応する）配列番号９９から１０５の残基２１から２６４から選択される配列を有するストラドマー単位を含む。

別の代替的実施形態において、本発明において使用される組換えＦｃ化合物は、参照によってその全体を本明細書に組み入れるＷＯ２０１７／１７２８５３に開示されているとおりである。好ましくは、組換えＦｃ化合物は、２つのＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン、およびオリゴマー化ペプチドドメインを含む単鎖Ｆｃペプチドを含む。好ましくは、組換えＦｃ化合物は、配列番号８（ＷＯ２０１７１７２８５３の配列番号６）または配列番号９（ＷＯ２０１７１７２８５３の配列番号４）のタンパク質を含む。

ポリヌクレオチド
本開示は、Ｆｃ多量体に関するＦｃ融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドにさらに関する。「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に無改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡの場合もあるあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、単鎖または二本鎖ＤＮＡ、単鎖または二本鎖ＲＮＡが可能である。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語はまた、イノシンなどの１つまたはそれ以上の修飾塩基および／またはまれな塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも含む。当然のことながら、当業者に既知の多くの有用な用途に役立つＤＮＡおよびＲＮＡにさまざまな改変を行うことができる。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において利用される場合、そのようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態、ならびに、例えば、単純および複雑な細胞を含む、ウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの特徴を示す化学形態を含む。

当業者は、遺伝子コードの縮重のため、所与のポリペプチドがさまざまなポリヌクレオチドによってコードされる可能性があることを理解するであろう。これら「バリアント」は、本明細書中で開示されているＦｃ多量体に包含される。

Ｆｃ多量体のポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドが可能である。「単離」ポリヌクレオチドという用語は、その他の核酸配列、例えば、以下に限定されない、その他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡを実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製される。単離ポリヌクレオチドを得るために当業者に既知の従来の核酸精製方法を使用することができる。この用語はまた、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成ポリヌクレオチドも含む。

本開示の別の態様は、本開示によるポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。一実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に開示されているとおり、プラスミドまたはベクターは、発現ベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである。本開示の別の態様は、本開示のポリヌクレオチド、プラスミド、またはベクターを含む宿主細胞である。

本開示の宿主細胞は、Ｆｃ多量体を作製する方法に利用される。方法は、以下を含む：
（ａ）所望の挿入タンパク質が発現するような条件下において本開示の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）場合により、宿主細胞または培養培地から所望の挿入タンパク質を回収すること。

個別の実施形態において、Ｆｃ多量体は、汚染巨大分子、例えば、他のタンパク質および核酸に関して≧８０％の純度、≧９０％の純度、≧９５％の純度、≧９９％の純度、または≧９９．９％の純度にまで精製され、感染性および発熱性病原体を含まない。本開示の単離Ｆｃ多量体は、他の非関連ポリペプチドを実質的に含まない場合もある。

本発明の特定の実施形態において、Ｆｃ多量体は、ＷＯ２０１４／０６０７１２に記載されているものである。例としては、５、６または７つのポリペプチド単量体単位を含む高分子タンパク質が挙げられ、各ポリペプチド単量体単位は、２つの免疫グロブリンＧ重鎖定常領域を含むＦｃ受容体結合部分を含み、各免疫グロブリンＧ重鎖定常領域は、隣接するポリペプチド単量体単位の免疫グロブリンＧ重鎖定常領域のシステイン残基とのジスルフィド結合により連結されるシステイン残基を含み、高分子タンパク質は、哺乳動物対象に投与されると抗原特異的免疫抑制を引き起こす免疫調節部分または抗原部分をさらに含まない。特定の態様において、２つの免疫グロブリンＧ重鎖定常領域は、単鎖Ｆｃとしてポリペプチドリンカーにより連結される。他の態様において、ポリペプチド単量体単位は、Ｆｃ受容体結合部分および２つの免疫グロブリンＧ重鎖定常領域と融合した尾部領域からなり、これが、単量体単位が重合体に集合するのを容易にする。

別の実施形態において、免疫グロブリンＧ重鎖定常領域のそれぞれは、哺乳動物の重鎖定常領域、好ましくは、ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列；またはそのバリアントを含む。適したヒトＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１である。

Ｆｃ受容体結合部分は、免疫グロブリンのＦｃ部分を超えた部分を含む場合もある。例えば、ＷＯ２０１４／０６０７１２に記載されているとおり、これは、天然の免疫グロブリンにおいてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に生じる免疫グロブリンのヒンジ領域を含む場合もある。特定の免疫グロブリンに関しては、Ｆｃ受容体と結合するためにヒンジ領域が必須である。好ましくは、Ｆｃ受容体結合部分は、ＣＨ１ドメインおよび重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）がない。Ｆｃ受容体結合部分は、対応する免疫グロブリンのＦｃ部分と比較してＣおよび／またはＮ末端で切断されている場合もある。高分子タンパク質は、隣接するポリペプチド単量体単位の免疫グロブリンＧ重鎖定常領域のシステイン残基とのジスルフィド結合により連結されるシステイン残基を含む各免疫グロブリンＧ重鎖定常領域によって形成される。ＩｇＧ重鎖定常領域ベースの単量体単位の重合体を形成する能力は、ＩｇＧ重鎖定常領域の部分をよりＩｇＭまたはＩｇＡの対応する部分のように改変することによって向上させることができる。免疫グロブリン重鎖定常領域またはそのバリアントのそれぞれは、位置３０９にシステイン残基、好ましくは、位置３１０にロイシン残基を含むアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖定常領域である。

尾部領域が存在する本発明の態様について、各ポリペプチド単量体単位は、２つの免疫グロブリンＧ重鎖定常領域のそれぞれに融合された尾部領域を含み、各ポリペプチド単量体単位の尾部領域は、単量体単位が重合体に集合するのを促進し、例えば、ＷＯ２０１４／０６０７１２に記載されている。例えば、尾部領域は、２つの免疫グロブリン重鎖定常領域のそれぞれのＣ末端に融合される。尾部領域は、ＩｇＭもしくはＩｇＡ尾部、またはそのフラグメントもしくはバリアントが可能である。

一実施形態において、介在アミノ酸配列が重鎖定常領域と尾部の間に設けられるか、または尾部が、重鎖定常領域のＣ末端に直接融合されることもあり、例えば、ＷＯ２０１４／０６０７１２に開示されている。例えば、尾部領域と免疫グロブリン重鎖定常領域の間に短いリンカー配列を設けることもできる。典型的なリンカー配列は、１から２０の間のアミノ酸長、一般に２、３、４、５、６または最大８、１０、１２、または１６アミノ酸長である。重鎖領域と尾部領域の間に含まれるのに適したリンカーは、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）をコードする。好ましい尾部領域は、ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（配列番号１１）であるヒトＩｇＭの尾部領域である（Ｒａｂｂｉｔｔｓ ＴＨら、１９８１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９（１８）、４５０９～４５２４ページ；Ｓｍｉｔｈら、（１９９５年） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：２２２６～２２３６ページ）。この尾部は、元のＴｈｒをＰｒｏで置換することによってＮ末端で改変される場合もある。これは、単量体の重合を促進する尾部の能力に影響を及ぼさない。ヒトＩｇＭ尾部のさらに適したバリアントは、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（１９９６年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６：２８５８～２８６５ページに記載されている。さらなるＩｇＭ尾部配列は、齧歯類のＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＩＭＳＤＴＧＧＴＣＹ（配列番号１２）である。別の好ましい尾部領域は、ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ（配列番号１３）であるヒトＩｇＡの尾部領域である。その他の適した他の種のＩｇＭまたはＩｇＡ由来の尾部または、さらには単量体単位が重合体に集合するのを促進する合成配列を使用することもできる。免疫グロブリン重鎖定常領域が由来する同じ種からの免疫グロブリン尾部を使用することは必須ではないが、そうするのが好ましい。

特定の態様において、高分子タンパク質は、補体の古典的経路を活性化しないが、Ｃ１ｑと結合することができる可能性がある。高分子タンパク質は、一般に約２０ｎｍ、例えば、１５から２５ｎｍまたは最大３０ｎｍの直径を有する。分子の大きさおよび直径の結果として、高分子タンパク質は、一般に好適な程度の組織浸透性を有する。

ＷＯ２０１４／０６０７１２に記載されている好ましいＦｃ多量体は、配列番号１４（ＷＯ２０１４／０６０７１２の配列番号８）の六量体であり、成熟生成物が配列番号１４の残基２１から２６９を含むよう、分泌の過程でそこからシグナルペプチドが切り離される。

本発明の特定の実施形態において、使用されるＦｃ多量体は、ＷＯ２０１５／１３２３６４に記載されているものであり、これは、ヒトＦｃ受容体と結合する多量体融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、位置３０９にシステイン残基がない場合、尾部を含む。

一実施形態において、多量体融合タンパク質は、２つまたはそれ以上のポリペプチド単量体単位を含み、各ポリペプチド単量体単位は、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含む。各重鎖Ｆｃ領域は、位置３０９にシステイン以外の任意のアミノ酸残基を含み、そのＣ末端で単量体単位を多量体に集合させる尾部に融合される。各ポリペプチド単量体単位は、抗体可変領域を含まない。

特定の態様において、多量体融合タンパク質は、融合パートナーをさらに含み、これは、抗原、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、薬物、リガンド、受容体、サイトカインまたはケモカインが可能である。融合パートナーは、各重鎖Ｆｃ領域のＮ末端に直接またはヒンジなどの介在アミノ酸配列によって間接的に融合される。あるいは、融合パートナーと重鎖Ｆｃ領域の間に短いリンカー配列を設けることもできる。

他の態様において、多量体融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗体可変領域を含まない。一般に、分子は、ＶＨまたはＶＬ抗体可変領域のいずれも含まない。特定のさらなる態様において、ＷＯ２０１５／１３２３６４の多量体融合タンパク質は、Ｆａｂフラグメントを含まない。

別の実施形態において、多量体融合タンパク質の各ポリペプチド単量体単位は、抗体Ｆｃドメインを含み、例えば、ヒトを含む任意の適した種由来のものが可能である。さらに、抗体Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭを含む任意の適したクラスの抗体由来のものが可能である。

抗体Ｆｃドメインは、それぞれ重鎖Ｆｃ領域と呼ばれる２つのポリペプチド鎖を含む。２つの重鎖Ｆｃ領域は、二量体化して、抗体Ｆｃドメインを作成する。抗体Ｆｃドメイン内の２つの重鎖Ｆｃ領域は互いに異なることも可能であるが、一般に同じになる。

一般に、それぞれ重鎖Ｆｃ領域は、２つまたは３つの重鎖定常ドメインを含むか、またはそれらからなる。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧは、２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）から構成され、ＩｇＥおよびＩｇＭは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）から構成される。重鎖Ｆｃ領域は、１つまたはそれ以上の異なるクラスの抗体、例えば、１、２または３つの異なるクラスからの重鎖定常ドメインを含むことがある。

このように、本発明の一実施形態において使用されるＦｃ多量体中の重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを含み、例えば、ＷＯ２０１５／１３２３６４に開示されている。個別の実施形態において、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４由来のＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態において、重鎖Ｆｃ領域は、位置３５５にアルギニン残基を含む。他の実施形態において、重鎖Ｆｃ領域は、位置３５５にシステイン残基を含む。

本発明の一実施形態において使用されるＦｃ多量体中の重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＭ ＣＨ４ドメインは、一般にＣＨ３ドメインと尾部の間に位置する。

他の態様において、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む。

多量体融合タンパク質の尾部は、任意の適したアミノ酸配列を含むことができる。これは、天然に存在する抗体に見られる尾部である場合もあり、あるいは、天然の尾部とは長さおよび／または組成が異なる改変された尾部である場合もある。その他の改変された尾部は、完全に合成である場合もあり、長さ、柔軟性およびシステイン組成など、多量体化に望ましい特性を持つよう設計することができる。尾部は、ヒトを含む、任意の適した種由来のものが可能である。

尾部は、配列番号１１または配列番号１３に示されるとおりのヒトＩｇＭまたはＩｇＡ由来の１８アミノ酸の尾部配列のすべてまたは一部を含む場合もある。

尾部は、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に直接、あるいは、介在アミノ酸配列によって間接的に融合される。例えば、尾部と重鎖Ｆｃ領域の間に短いリンカー配列を設けることもできる。

尾部は、上記の天然の配列のバリアントまたはフラグメントを含む場合がある。ＩｇＭまたはＩｇＡ尾部のバリアントは、一般に１８アミノ酸の位置のうちの８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個が天然の配列と一致するアミノ酸配列を有する。フラグメントは、一般に８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７アミノ酸を含む。尾部は、ハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＡ尾部が可能である。

本発明のある実施形態において使用されるＦｃ多量体中の各重鎖Ｆｃ領域は、場合により、そのＮ末端に天然のヒンジ領域または改変されたヒンジ領域を有することがある。本発明において使用されるＦｃ多量体に組み込むことができる改変されたヒンジ領域のタイプは、ＷＯ２０１５／１３２３６４に開示されている。例えば、重鎖Ｆｃ領域は、そのＮ末端に完全なヒンジ領域を有する。特定の態様において、ＷＯ２０１５／１３２３６４に開示されているとおり、重鎖Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、ＩｇＧ４由来であり、ヒンジ領域は、変異した配列ＣＰＰＣ（配列番号１５）を含む。

適したヒンジ配列の例を配列番号１５から３７に示す。

例えば、多量体融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個またはそれ以上のポリペプチド単量体単位を含む場合もある。さらに、多量体融合タンパク質は、さまざまな数のポリペプチド単量体単位を有する、さまざまな大きさの多量体融合タンパク質の混合物を含む場合もある。

このように、特定の実施形態において、本発明において使用される多量体融合タンパク質は、６つのポリペプチド単量体単位からなり、各ポリペプチド単量体単位は、抗体Ｆｃドメインおよび尾部領域からなり、各抗体Ｆｃドメインは、位置３０９のアミノ酸残基がシステイン以外の任意のアミノ酸残基である２つの重鎖Ｆｃ領域からなり、場合により、各重鎖Ｆｃ領域は、Ｎ末端にヒンジ領域を有し、尾部領域は、各重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に融合され、単量体単位を多量体に集合させる。

同様に、個々の多量体融合タンパク質内のポリペプチド単量体単位は、互いに同じである場合も、互いに異なる場合もある。

特定の実施形態において、ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖は、配列番号３８から５９に示されるとおりのアミノ酸配列を含み、場合により、別のヒンジまたは尾部配列を有する。

別の例において、本発明において使用される多量体融合タンパク質は、２つまたはそれ以上、好ましくは、６つのポリペプチド単量体単位を含むか、またはそれらからなり、各ポリペプチド単量体単位は、各ポリペプチド鎖が上記配列番号３８から５９（ＷＯ２０１５／１３２３６４の配列番号２６から４７）のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド単量体単位は、抗体可変領域を含まない。

特定の実施形態において、多量体融合タンパク質は、無改変の多量体融合タンパク質と比較した場合に、サイトカイン放出を低減する、および／または血小板活性化を低減する、および／またはＣ１ｑ結合を低減する、および／または抗体被覆標的細胞のマクロファージ食作用の阻害の効力を増加させる、および／または１つもしくはそれ以上のＦｃ受容体との結合を変える１つまたはそれ以上の変異を含む。

本発明の特定の実施形態において、使用されるＦｃ多量体は、ＷＯ２０１５／１３２３６５に記載されているものであり、これは、ヒトＦｃ受容体と結合する多量体融合タンパク質に関する。

本発明のある実施形態において使用される多量体融合タンパク質は、２つまたはそれ以上のポリペプチド単量体単位を含み、各ポリペプチド単量体単位は、ＷＯ２０１５／１３２３６５に開示されているものなど、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含む。各重鎖Ｆｃ領域は、位置３０９にシステイン残基、およびＦｃＲ結合および／または補体結合を変える少なくとも１つのさらなる変異を含み、単量体単位を多量体に集合させる尾部にそのＣ末端において融合される。各ポリペプチド単量体単位は、抗体可変領域を含まない。

特定の態様において、多量体融合タンパク質は、上記のとおり、融合パートナーをさらに含む。他の態様において、多量体融合タンパク質は、上記のとおり、１つまたはそれ以上の抗体可変領域またはＦａｂフラグメントを含まない。一実施形態において、多量体融合タンパク質の各ポリペプチド単量体単位は、上記のとおり、重鎖Ｆｃ領域を有する抗体Ｆｃドメインを含む。本発明の多量体融合タンパク質の尾部、改変されたヒンジ領域、およびポリペプチド単量体単位は、上記の特性を含む。

本発明の特定の実施形態において使用される多量体融合タンパク質は、６つのポリペプチド単量体単位からなり、各ポリペプチド単量体単位は、抗体Ｆｃドメインおよび尾部領域からなり、各抗体Ｆｃドメインは、各重鎖Ｆｃ領域の位置３０９のアミノ酸残基がシステイン残基である２つの重鎖Ｆｃ領域からなり、各重鎖Ｆｃ領域は、ＦｃＲ結合および／または補体結合を変える少なくとも１つのさらなる変異を含み、場合により、各重鎖Ｆｃ領域は、Ｎ末端にヒンジ領域を有し、尾部領域は、各重鎖Ｆｃ領域のＣ末端に融合され、単量体単位を多量体に集合させる。

特定の実施形態において、ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖は、上記のとおりのアミノ酸配列を含む。

別の例において、多量体融合タンパク質は、２つまたはそれ以上、好ましくは、６つのポリペプチド単量体単位を含むか、またはそれらからなり、各ポリペプチド単量体単位は、各ポリペプチド鎖が配列番号６０から９６（ＷＯ２０１５／１３２３６５の配列番号２６から３２および５０から６４と対応する）のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる２つの同一のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド単量体単位は、抗体可変領域を含まない。

特定の実施形態において、ＷＯ２０１５／１３２３６５において教示されるとおり、本発明において使用される多量体融合タンパク質は、上記のとおりのそのような機能を可能にする１つまたはそれ以上の変異を含む。

本開示のさまざまな生成物は、薬剤として有用である。したがって、本開示は、Ｆｃ多量体、本開示のポリヌクレオチド、または本開示のプラスミドもしくはベクターを含む医薬組成物に関する。

本発明の態様は、視神経脊髄炎を処置することを必要とする対象を処置する方法である。方法は、前記対象に治療有効量のＦｃ多量体を投与することを含む。別の実施形態において、方法は、前記対象に治療有効量の本開示のポリヌクレオチドまたは本開示のプラスミドもしくはベクターを投与することを含む。

提示されたＦｃ多量体の発現
適切な宿主細胞において高レベルに組換えタンパク質を産生するには、上記の改変ｃＤＮＡを、当業者に既知の方法に従ってさまざまな発現系において増殖させることが可能な組換え発現ベクターの適した調節エレメントとともに有効な転写単位に構築する必要がある。有効な転写調節エレメントは、天然の宿主として動物細胞を有するウイルスまたは動物細胞の染色体ＤＮＡ由来のものが可能であろう。例えば、サルウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくはラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）由来のプロモーター・エンハンサーの組み合わせ、またはベータ－アクチンもしくはＧＲＰ７８のような動物細胞において強く構成的に転写される遺伝子を含むプロモーター・エンハンサーの組み合わせを使用することができる。ｃＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの安定した高レベルを達成するために、転写単位は、３’－近位部分に転写終結ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むべきである。例えば、この配列は、サルウイルス４０初期転写領域、ウサギベータグロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノーゲン活性化遺伝子由来のものが可能である。

ｃＤＮＡは、その後、Ｆｃ多量体の発現に適した宿主細胞株のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、この細胞株は、正しいフォールディング、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合型グリコシル化および他の翻訳後修飾ならびに培養培地への分泌を確実にするために脊椎動物由来の動物細胞株でなければならない。他の翻訳後修飾の例は、新生のポリペプチド鎖のチロシンＯ－硫酸化およびタンパク質分解プロセシングである。使用可能な細胞株の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ－細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ－２１細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、およびハムスターＣＨＯ細胞である。

対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターをいくつかの異なる方法で動物細胞株に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、さまざまな動物ウイルスに基づくベクターから作り出すことができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、およびウシパピローマウイルスに基づくベクターである。

組換えＤＮＡをそのゲノムに組み込んだ特定の細胞クローンの単離を容易にするために、対応するＤＮＡをコードする転写単位はまた、これらの細胞中で優性選択マーカーとして機能することが可能な別の組換え遺伝子とともに動物細胞に導入することができる。このタイプの優性選択マーカー遺伝子の例は、ジェネテシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与するＴＮ４アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。そのような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするものと同じベクターに存在しているか、またはそれは、同時に導入され、宿主細胞のゲノムに組み込まれる別個のベクターにコードされるかのいずれかが可能であり、結果として高い頻度で異なる転写単位間に密接な物理的連鎖が生じる。

所望のタンパク質のｃＤＮＡとともに使用可能な他の種類の選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードするさまざまな転写単位に基づく。このタイプの遺伝子を内因性ｄｈｆｒ活性のない細胞、例えば、ＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ－Ｂ１１、ＤＧ－４４）に導入後、それが、ヌクレオシドがない培地においてこれらの細胞が増殖することを可能にする。そのような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、およびグリシンを含まないＨａｍ’ｓ Ｆ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに連結された、ＩｇＧ Ｆｃ融合単量体をコードするｃＤＮＡとともに上記のタイプのＣＨＯ細胞に導入することができ、それにより、組換えタンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性細胞株を作り出す。

上記細胞株は、細胞傷害性ｄｈｆｒ阻害メトトレキサートの存在下において増殖させられると、メトトレキサートに対して耐性のある新しい細胞株が出現する。これらの細胞株は、組換えタンパク質を増加した速度で産生する。それは、増幅された数の連鎖したｄｈｆｒおよび所望のタンパク質の転写単位のためである。漸増濃度のメトトレキサート（１～１０，０００ｎＭ）中でこれらの細胞株を増殖させると、非常に高速に所望のタンパク質を産生する新しい細胞株を得ることができる。

所望のタンパク質を産生する上記細胞株は、懸濁培養で、またはさまざまな固体支持体上のいずれかで大規模に増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリックスベースのマイクロキャリア、またはホローファイバーの形態の固体支持体またはさまざまなセラミック材である。細胞懸濁培養物またはマイクロキャリアにおいて増殖させられる場合、上記細胞株の培養は、浴培養として、または長時間にわたる馴化培地の連続的な産生を伴う灌流培養としてのいずれかで行うことができる。このように、本開示によると、上記細胞株は、所望の組換えタンパク質を産生するための工業プロセスの開発に十分に適している。

精製および製剤化
組換えタンパク質は、宿主細胞または細胞培養培地中の所望のタンパク質とその他の物質の間のサイズ、電荷、疎水性、溶解度、特異親和性などの差を利用した方法を含む、さまざまな生化学的方法およびクロマトグラフィー法によって濃縮および精製することができる。

そのような精製の例は、固体支持体に固定された、例えば、Ｆｃ多量体のＦｃ部分または別のＦｃ結合リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）に対するモノクローナル抗体への組換えタンパク質の吸着である。Ｆｃ多量体の支持体への吸着、洗浄および脱着後に、タンパク質は、上記特性に基づくさまざまなクロマトグラフィー技術によってさらに精製することができる。精製段階の順序は、例えば、その段階の能力および選択性、支持体の安定性または他の性質により選択される。精製段階は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー段階、免疫アフィニティークロマトグラフィー段階、アフィニティークロマトグラフィー段階、色素クロマトグラフィー段階、およびサイズ排除クロマトグラフィー段階が可能であるが、これらに限定されるものではない。

ウイルス汚染の理論上のリスクを最小限にするために、ウイルスの効果的な不活化または除去を可能にする追加の段階をこのプロセスに含めることもできる。例えば、そのような段階は、液体もしくは固体状態における熱処理、溶媒および／または界面活性剤による処理、可視もしくはＵＶスペクトルの放射線、ガンマ放射線、精製中の分割、またはウイルスろ過（ナノろ過）を含むことが可能である。

本明細書に記載されるＦｃ多量体は、治療用の医薬調製物に製剤化することができる。医薬調製物の成分は、従来の生理学的に適合した水性緩衝液に再懸濁または溶解させることができ、これに、場合により、医薬品賦形剤を添加して、医薬調製物を提供することができる。医薬調製物の成分は、既にすべての必要な製薬の生理学的に適合した賦形剤を含むことが可能で、注射用水に溶解させて、医薬調製物を提供することができる。

適した医薬製剤のそのような医薬担体および賦形剤ならびに調製物は、当該技術分野において周知である（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、 Ｆｒｏｋｊａｅｒら、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００年）または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ｋｉｂｂｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照）。特定の実施形態において、医薬組成物は、増量剤、緩衝剤、または安定剤などの少なくとも１つの添加剤を含むことが可能である。標準的な医薬製剤化技術は、当業者に周知である（例えば、２００５ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ： Ｍｏｎｖａｌｅ、ＮＪ、２００４年；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００年を参照）。適した医薬添加剤としては、例えば、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、またはその他のような糖、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、プロリン、またはその他のようなアミノ酸、塩化ナトリウムまたはその他の塩のような等張条件を達成するための添加剤、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、塩化カルシウム、またはその他のような安定剤、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）のような生理的ｐＨ緩衝剤などが挙げられる。特定の実施形態において、医薬組成物は、ｐＨ緩衝試薬および湿潤剤または乳化剤を含むことが可能である。さらに別の実施形態において、組成物は、保存料または安定剤を含むことが可能である。特に、本明細書に記載されるＦｃ多量体を含む医薬調製物は、凍結乾燥形態または安定した可溶形態に製剤化することができる。Ｆｃ多量体因子は、当該技術分野において知られているさまざまな手順によって凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、注射用の滅菌水または滅菌生理的食塩水または適した緩衝液などの１つもしくはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤の添加によって使用前に再構成される。

Ｆｃ多量体の医薬調製物の組成物は、任意の薬学的に適した手段によって個体に送達することができる。さまざまな送達システムが知られており、任意の都合のよい経路によって組成物を投与するために使用することができる。Ｆｃ多量体の医薬調製物の組成物は、従来法に従って静脈内もしくは非静脈内注射用または経腸（例えば、口腔、経膣、もしくは直腸）送達用に製剤化することができる。非静脈内投与に関して、Ｆｃ多量体の組成物は、皮下、筋肉内、関節内、腹腔内、脳内、髄腔内、肺内（例えば、噴霧される）、鼻腔内、皮内、経口または経皮投与用に製剤化することができる。一実施形態において、Ｆｃ多量体の組成物は、静脈内注射用に製剤化される。他の実施形態において、Ｆｃ多量体の組成物は、皮下、筋肉内、または経皮投与用、好ましくは、皮下投与用に製剤化される。製剤は、輸注によって、またはボーラス輸注によって連続的に投与することができる。いくつかの製剤は、徐放系を含むことができる。

Ｆｃ多量体の医薬調製物の組成物は、患者に治療有効用量で投与される。「治療有効の」という用語は、本明細書中で使用される場合、容認できない有害な副作用をもたらす用量を教示することなく、所望の効果、視神経脊髄炎の重症度もしくは広がりの予防もしくは低減をもたらすか、または検出可能な治療もしくは予防効果を示すのに十分な用量を示す。正確な用量は、例えば、製剤および投与様式などの多くの要素によって決まる。治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイまたは動物モデル、例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくは霊長類モデルにおいて推定することができる。そのような情報を、その後、有用な用量およびヒトにおける投与経路を決定するために使用することができる。

一実施形態において、１本の静脈内または１本の非静脈内注射のためのＦｃ多量体の用量は、１，０００ｍｇ／ｋｇ体重未満、８００ｍｇ／ｋｇ体重未満、６００ｍｇ／ｋｇ体重未満、４００ｍｇ／ｋｇ体重未満、２００ｍｇ／ｋｇ体重未満、または１００ｍｇ／ｋｇ体重未満である。例えば、一実施形態において、Ｆｃ多量体の用量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重から約８００ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重から約７００ｍｇ／ｋｇ体重、約３０ｍｇ／ｋｇ体重から約６００ｍｇ／ｋｇ体重、約４０ｍｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重から約４００ｍｇ／ｋｇ体重、約７５ｍｇ／ｋｇ体重から約３００ｍｇ／ｋｇ体重、または約１００ｍｇ／ｋｇ体重から約２００ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態において、Ｆｃ多量体の用量は、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約８００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約６００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約４００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約２００ｍｇ／ｋｇ体重、または約２５ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

個別の実施形態において、Ｆｃ多量体の医薬組成物は、単独でまたはその他の治療用薬剤と合わせて投与される。一実施形態において、これらの薬剤は、同じ医薬品の一部として組み込まれる。一実施形態において、Ｆｃ多量体は、免疫抑制療法、例えば、ステロイドと合わせて投与される。別の実施形態において、Ｆｃ多量体は、任意のＢ細胞もしくはＴ細胞調節剤または免疫調節薬とともに投与される。

Ｆｃ多量体の投与頻度は、製剤、投与量、および投与様式などの多くの要素によって決まる。一実施形態において、Ｆｃ多量体の用量は、１日に複数回、１日に１回、２日に１回、３日に１回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または月に１回投与される。

治療効果
「治療効果」という用語は、本明細書中で使用される場合、それを特徴づけるパラメーターを改善することによって疾患または障害を処置すること、あるいは、それらの疾患／障害パラメーターを完全に予防することを示す。例えば、治療効果は、ある用量のＦｃ多量体を投与することによって、（１）インビトロで視神経脊髄炎の細胞培養モデルにおいて、（２）エクスビボで視神経脊髄炎の脊髄切片モデル、または（３）インビボで疾患のラットモデルにおいて判定することができる。Ｆｃ多量体の用量は、１０から１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば、２００ｍｇ／ｋｇが可能である。Ｆｃ多量体は、静脈内もしくは非静脈内注射または静脈内輸注によって投与することができる。動物の臨床的評価は、Ｆｃ多量体の投与後、最後の時点まで所定の時間に行うことが可能である。臨床的評価は、特定の疾患または障害の臨床所見に基づくスコア化を含む場合がある。生物学的サンプルはまた、Ｆｃ多量体の投与後、最後の時点まで所定の時間に動物から採取することができる。「生物学的サンプル」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、組織、血液、および尿を指す。生物学的サンプルは、その後、マーカーまたは視神経脊髄炎の指標の改善に関して評価することができる。

「誘導する」という用語は、本明細書中で使用される場合、引き起こす、もたらす、生じさせる、作り出す、生じる、つながる、または促進すると定義される。

好適な実施形態において、Ｆｃ多量体の治療効果は、ＩＶＩＧまたはＦｃ単量体による処理後に観察される効果に対する、ＡＱＰ４－ＩｇＧまたは血清陽性の視神経脊髄炎患者由来の血清とともにプレインキュベートされたチャイニーズハムスター卵巣細胞の補体依存性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害の減少の改善によって示すことができる。特定の実施形態において、Ｆｃ多量体は、１％または０．５％ヒト補体の存在下における細胞傷害の減少の促進と関連づけられる。他の実施形態において、Ｆｃ多量体は、５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度における細胞傷害の減少の促進と関連づけられる。

個々の好適な実施形態においては、Ｆｃ多量体の治療効果は、ラット脊髄のエクスビボ切片モデルにおいて観察される細胞傷害および病変の減少によって示すことができる。脊髄は、ＡＱＰ４－ＩｇＧおよびヒト補体とともにインキュベートして、神経脊髄炎切片モデルを作製し、その後、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰなどのアストロサイト損傷に対するマーカー、ＭＢＰなどの脱髄に対するマーカー、Ｉｂａ１などの炎症に対するマーカー、およびＣ５ｂ－９などの補体終末膜侵襲複合体の沈着に対するマーカーで免疫染色することができる。病変は、以下のとおり評価およびスコア化することができる：０ － 正常なＡＱＰ４、ＧＦＡＰ、およびＭＢＰ染色を有する完全な状態の切片；１ － ＡＱＰ４またはＧＦＡＰ染色の減少、ＭＢＰ染色の減少、Ｉｂａ１染色の増加、およびＣ５ｂ－９染色の増加によって実証される軽度のアストロサイト損傷、脱髄、炎症、および補体終末膜侵襲複合体の沈着；２ － ＡＱＰ４またはＧＦＡＰ染色の減少、ＭＢＰ染色の減少、Ｉｂａ１染色の増加、およびＣ５ｂ－９染色の増加を有する少なくとも１つの病変；３ － 切片面積の＜３０％を侵す複数の病変；４ － 切片面積の８０％を侵す病変。各切片に関するスコアは、全臨床スコアに合計することができる。Ｆｃ多量体の治療効果は、六量体を用いない処理と比較することができる。

好適な別の実施形態において、Ｆｃ多量体の治療効果は、ＡＱＰ４－ＩｇＧの脳内注射によって誘導される視神経脊髄炎の実験ラットモデルにおいて示すことが可能である。治療効果は、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、または５０ｍｇ／ｋｇの用量を静脈内投与し、投与の２時間後に血液を採取することによって評価することができる。血清は、ラット血液から採取し、ＡＱＰ４－ＩｇＧとともにプレインキュベートしたＡＱＰ４発現チャイニーズハムスター卵巣細胞とのインキュベーションによって細胞傷害性の評価をすることができる。一実施形態において、細胞傷害性は、Ｆｃ多量体の５０ｍｇ／ｋｇ用量の投与およびそれに続く、投与後のさまざまな時点におけるインビトロ試験のための血液の採取後に評価することが可能である。一実施形態において、視神経脊髄炎ラットの脳を採取し、薄片を作り、さまざまなマーカーで免疫染色して、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰなどのアストロサイト損傷に対するマーカー、ＭＢＰなどの脱髄に対するマーカー、Ｉｂａ１およびＣＤ４５などの炎症に対するマーカー、ならびにＣ５ｂ－９などの補体終末膜侵襲複合体の沈着に対するマーカーを含む、病態を評価することが可能である。比較のために、注射していない反対側の半球も染色することができる。

古典的補体経路の活性化
古典的補体経路は、特異抗体応答を仲介し、補体成分のカスケードによってもたらされる。カスケードは、主に抗原・抗体複合体によって活性化される。経路の最初の成分は、１つのＣ１ｑおよび２つのＣ１ｒ２ｓ２のサブユニットから構成されるタンパク質複合体Ｃ１である。免疫グロブリンのＣ１ｑとの結合は、触媒的に活性なサブユニットへのＣ１ｒ２ｓ２の活性化により古典的補体経路の活性化の最初の段階をもたらす。活性化Ｃ１は、Ｃ４をＣ４ａおよびＣ４ｂに、さらにＣ２をＣ２ａおよびＣ２ｂに切断する。Ｃ２ａは、その後、Ｃ４ｂと結合して、Ｃ３転換酵素としても知られているＣ４ｂ２ａを形成する。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断を触媒する。Ｃ３ｂは、その後、活性化Ｃ４ｂ２ａと結合することができ、Ｃ５転換酵素としても知られているＣ４ｂ２ａ３ｂを形成する。Ｃ５転換酵素は、Ｃ５をフラグメントＣ５ａおよびＣ５ｂに変換する。Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９成分とともにＣ５ｂ－９複合体として知られている複合体を形成する。この複合体は、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）または終末補体複合体（ＴＣＣ）としても知られており、標的細胞に膜貫通チャネルを形成して、細胞溶解に導く。

「完全な古典的補体経路の活性化」は、本明細書中で使用される場合、上記の古典的補体経路全体のすべての段階の活性化と定義される。完全な古典的補体経路の活性化は、古典的補体経路の活性化における最初の段階であるＦｃ多量体のＣ１ｑとの結合、および古典的補体経路における最後のエフェクターであるＣ４ａ、Ｃ５ａまたは可溶性もしくは膜結合Ｃ５ｂ－９複合体の形成を調査することによって判定できる。例えば、タンパク質がＣ１ｑと結合するが可溶性Ｃ５ｂ－９が基本的に形成されない、すなわち、それぞれの陽性対照の５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満だけ形成される場合、Ｆｃ多量体は、古典的補体経路の完全な活性化を誘導しない。古典的補体経路の活性化は、Ｃ４ａの形成、Ｃ２の切断、またはＣ３転換酵素の形成を評価することによっても判定することができる。例えば、Ｃ４ａの形成を誘導するが、Ｃ２の切断を誘導しないか、またはＣ３転換酵素の形成を誘導しないかのいずれかの場合、Ｆｃ多量体は、完全な古典的補体経路の活性化を誘導しない。「誘導しない」は、それぞれの陽性対照の５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満が形成されることを意味する。

Ｆｃ多量体のヒトＩｇＧおよびＡＱＰ４と結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって判定することができる。例えば、９６ウェルプレートのウェルをヒトＡＱＰ４－ＩｇＧでプレコートした後、Ｆｃ多量体の添加を行うことができる。精製ペルオキシダーゼ・標識抗ヒトＩｇＧ複合体を添加することが可能で、結合した複合体は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色ペルオキシダーゼ基質を使用することによって視覚化することができる。一実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣細胞は、Ｆｃ多量体の存在下においてＡＱＰ４－ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともに１時間インキュベートすることが可能である。その後、細胞は、蛍光を定量するために、抗ＡＱＰ４抗体および続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗体とともにインキュベートすることが可能である。

Ｆｃ多量体のＣ１ｑと結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって判定することができる。例えば、９６ウェルプレートのウェルをヒトＣ１ｑでプレコートした後、Ｆｃ多量体の添加を行うことができる。精製ペルオキシダーゼ・標識抗ヒトＩｇＧ複合体を添加することが可能で、結合した複合体は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色ペルオキシダーゼ基質を使用することによって視覚化することができる。一実施形態において、組換えヒトＣ１ｑは、Ｆｃ多量体とともに１時間プレインキュベートした後、ＡＱＰ４－ＩｇＧ被覆細胞に１時間添加することが可能である。Ｃ１ｑは、ＦＩＴＣ結合抗Ｃ１ｑ抗体で染色することができる。

Ｆｃ多量体による古典的補体経路の活性化は、インビトロアッセイによって判定し、Ｃ４ａおよび可溶性Ｃ５ｂ－９の形成によって示すことができる。例えば、さまざまな濃度のＦｃ多量体を全血または血清中で所定の時間インキュベートすることができ、いかなる生じたＣ４ａまたは可溶性Ｃ５ｂ－９（ｓＣ５ｂ－９）の形成もＥＬＩＳＡなどの免疫検出によって判定することができる。使用されるＦｃ多量体の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌが可能である。

Ｆｃ多量体によって誘導されるＣ４ａおよびｓＣ５ｂ－９の形成は、古典的補体経路の強力なアクチベーターである熱凝集ガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）によって誘導されるこれらの成分の形成に対して比較することができる。例えば、このアッセイは、全血中で行うことが可能である。一部の実施形態によると、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ多量体は、ＨＡＧＧによって誘導されるｓＣ５ｂ－９形成と比較して、５０％未満のｓＣ５ｂ－９形成、４０％未満のｓＣ５ｂ－９形成、３０％未満のｓＣ５ｂ－９形成、２０％未満のｓＣ５ｂ－９形成、または１０％未満のｓＣ５ｂ－９形成を誘導する。一実施形態において、Ｆｃ多量体は、全血においてＨＡＧＧによって誘導されるｓＣ５ｂ－９形成と比較して、全血において２０％未満のｓＣ５ｂ－９形成を誘導する。別の実施形態において、Ｆｃ多量体は、全血においてＨＡＧＧによって誘導されるｓＣ５ｂ－９形成と比較して、全血において１０％未満のｓＣ５ｂ－９形成を誘導する。さらに別の実施形態において、Ｆｃ多量体は、ｓＣ５ｂ－９形成を誘導しない。

「熱凝集ＩｇＧにより活性化される正常ヒト血清」という用語は、本明細書中で使用される場合、熱凝集ＩｇＧによりほぼすべてのＣ４の切断が誘導された正常ヒト血清サンプルを指す。

Ｆｃ多量体による古典的補体経路の活性化はまた、Ｃ２タンパク質を検出することによって判定することもできる。Ｃ２タンパク質がＣ２ａおよびＣ２ｂに切断されると、Ｃ２タンパク質のレベルが低下し、これが古典的補体経路の活性化を示す。さまざまな濃度のＦｃ多量体を全血または血清において所定の時間、例えば、２時間インキュベートすることができ、その後、Ｃ２タンパク質レベルをイムノブロッティングなどの免疫検出によって測定することができる。古典的補体経路の活性化は、Ｃ２タンパク質の切断によって示される。正常ヒト血清中のＣ２タンパク質のレベルを、Ｆｃ多量体とのプレインキュベーション後に生じるＣ２タンパク質のレベルと比較して、Ｃ２切断の量、したがって、古典的補体経路の活性化を判定することができる。ＨＡＧＧなどの古典的補体経路の既知のアクチベーターは、正常ヒト血清中における大部分のＣ２タンパク質の切断を誘導する陽性対照として使用することができる。「大部分」という用語は、本明細書中で使用される場合、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超を含むものと定義される。いくつかの実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ多量体は、大部分のＣ２タンパク質の切断を誘導しない。

Ｆｃ多量体による古典的補体経路の活性化はまた、Ｃ３転換酵素の形成を評価することによって判定することができる。上記のとおり、Ｃ３転換酵素は、Ｃ２ａおよびＣ４ｂサブユニット（Ｃ４ｂ２ａ）からなる。Ｃ２タンパク質がＣ２ａおよびＣ２ｂに切断されないと、Ｃ３転換酵素を形成することができない。したがって、Ｃ３転換酵素形成は、Ｃ２タンパク質切断を測定するために上記のとおり評価することができる。いくつかの実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ多量体は、Ｃ３転換酵素の形成を誘導しない。

古典的補体経路の阻害
Ｆｃ多量体による古典的補体経路の阻害は、Ｃ５ａおよびｓＣ５ｂ－９形成の阻害を判定することによって、またはＣ２タンパク質の切断の阻害を判定することによって、判定することができる。さまざまな濃度のＦｃ多量体は、全血または血清中において古典的補体経路の既知のアクチベーターとともにインキュベートすることが可能である。Ｆｃ多量体および古典的補体経路の既知のアクチベーターの存在下において形成されたｓＣ５ｂ－９のレベルは、その後、古典的補体経路の既知のアクチベーター単独により形成されたｓＣ５ｂ－９のレベルと比較することができる。形成されたｓＣ５ｂ－９のレベルは、上記のとおり測定することができる。使用されるＦｃ多量体の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌが可能である。古典的補体経路の既知のアクチベーターは、ＨＡＧＧが可能である。古典的補体経路のアクチベーター単独の存在下において形成されたｓＣ５ｂ－９のレベルと比較して、Ｆｃ多量体および古典的補体経路のアクチベーターの存在下において形成されたｓＣ５ｂ－９のレベルが低い程、Ｆｃ多量体によるｓＣ５ｂ－９形成の阻害が大きくなる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ多量体は、ＨＡＧＧによって誘導されたｓＣ５ｂ－９形成と比較して、５０％を超えるｓＣ５ｂ－９形成、６０％を超えるｓＣ５ｂ－９形成、７０％を超えるｓＣ５ｂ－９形成、８０％を超えるｓＣ５ｂ－９形成、または９０％を超えるｓＣ５ｂ－９形成を阻害する。一実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ多量体は、ＨＡＧＧによって誘導されるｓＣ５ｂ－９形成の８０％超を阻害する。

「阻害する」という用語は、本明細書中で使用される場合、抑制する、限定する、予防する、妨げる、止める、またはブロックすることと定義される。

Ｃ２タンパク質の切断の阻害は、同様に判定することができる。さまざまな濃度のＦｃ多量体は、全血または血清中において古典的補体経路の既知のアクチベーターとともにインキュベートすることが可能である。古典的補体経路の既知のアクチベーター単独の存在下におけるＣ２タンパク質のレベルと比較して、Ｆｃ多量体および古典的補体経路の既知のアクチベーターの存在下におけるＣ２タンパク質のレベルが高い程、Ｆｃ多量体によるＣ２切断の阻害が大きくなる。Ｃ２タンパク質のレベルは、上記のとおり測定することができる。使用されるＦｃ多量体の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌが可能である。古典的補体経路の既知のアクチベーターは、ＨＡＧＧが可能である。いくつかの実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ多量体は、ＨＡＧＧによる大部分のＣ２タンパク質の切断を阻害する。

古典的補体経路の阻害はまた、抗体感作、またはオプソニン化された赤血球を使用した古典的補体経路に対する溶血アッセイを使用して判定することもできる。例えば、ヒツジ赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ、すなわちｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）は、ウサギ抗ヒツジ抗体でオプソニン化することが可能である。正常ヒト血清（ＮＨＳ）は、オプソニン化赤血球の溶解を誘導する。Ｆｃタンパク質は、ＮＨＳとともにプレインキュベートした後、赤血球に添加され、３７℃で１時間インキュベートすることが可能である。Ｆｃコンストラクトの濃度は、１～１０００μｇ／ｍｌ、例えば、２．５、２５、５０、１２５、２５０、または５００μｇ／ｍｌが可能である。あるいは、Ｆｃ単量体はまた、Ｆｃコンストラクトに関して示したのと同じ濃度のＮＨＳとともにプレインキュベートすることも可能である。インキュベーション後に、混合物を遠心分離することが可能で、溶解の程度は、上清の放出されたヘモグロビンの４１２ｎｍにおける吸光度を測定することによって判定することが可能である。

Ｆｃ多量体による古典的補体経路の阻害は、ＮＨＳを含むが、Ｆｃ多量体を含まない混合物と比較して、Ｆｃ多量体を含む混合物中の赤血球の溶解の減少によって示すことができる。Ｆｃ多量体によるオプソニン化赤血球の溶解の抑制はまた、Ｆｃ単量体の存在下におけるオプソニン化赤血球の溶解と比較することが可能である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ多量体は、Ｆｃ単量体と比較してオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を抑制する。一実施形態において、ＷＯ２０１７／１２９７３７に記載されているとおり、Ｆｃ多量体は、Ｆｃ単量体と比較して７０％を超えてオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を抑制する。

本発明の好適な実施形態において、Ｆｃ多量体は、古典的補体経路の活性化を阻害するが、代替補体経路は阻害しないことによって視神経脊髄炎の発病を防ぐ。

ＩｇＧ１ Ｆｃ多量体の作製
ヒトＩｇＭ尾部の１８アミノ酸残基（ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ 配列番号１１）をヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント（アミノ酸残基２１６～４４７、ＥＵナンバーリング；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ０１８５７）の定常領域のＣ末端に融合することによってＦｃ－μＴＰ（図１Ａ、左図）を形成した。Ｆｃ－μＴＰの３０９番目（ＥＵナンバーリング）のＬｅｕ残基をＣｙｓに変異させることによってＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ（図１Ａ、右図）を形成した。Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９ＣをコードするＤＮＡフラグメントは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＭＡ、米国）によって合成され、ヒト細胞発現用にコドン最適化された。ＤＮＡフラグメントは、ＩｎＴａｇ正の選択法を使用して、ｐＲｈＧ４哺乳動物細胞発現ベクターのＡｐａＬＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化した（Ｃｈｅｎ， ＣＧら、（２０１４年）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２（４）：ｅ２６； Ｊｏｓｔｏｃｋ Ｔら、（２００４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２８９：６５～８０ページ）。簡単にいえば、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９ＣフラグメントをＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩ消化によって単離した。ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ付加部位（ＢＧＨｐＡ）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）から構成されるＣｍＲ ＩｎＴａｇアダプターも、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩ消化によって単離した（Ｃｈｅｎ， ＣＧら、（２０１４年）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２（４）：ｅ２６）。Ｆｃ分子およびＣｍＲ ＩｎＴａｇアダプターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してｐＲｈＧ４ベクターのＡｐａＬＩおよびＸｂａＩ部位に共にクローン化した。３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む寒天プレート上で陽性クローンを選択した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）およびＤＮＡ配列解析によって確認した配列を使用してミニプレッププラスミドＤＮＡを精製した。制限酵素およびＴ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＭＡ、米国）から購入した。

Ｅｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、米国）を使用した一過性トランスフェクションは、製造業者の取扱説明書に従って行った。簡単にいえば、プラスミドＤＮＡ（０．８μｇ）を０．４ ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて希釈し、穏やかに混合した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（２１．６μＬ）を０．４ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、希釈したＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを、希釈したＤＮＡに添加し、穏やかに混合し、室温で２０～３０分インキュベートして、ＤＮＡ－Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を形成させた。その後、ＤＮＡ・Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、６．８ｍｌのＥｘｐｉ２９３細胞（２×１０^７細胞）を含む５０ｍｌのバイオリアクターチューブに添加した。その細胞を、２５０ｒｐｍで振盪されている８％ ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターにおいておよそ１６～１８時間インキュベートした。エンハンサー１ ４０μｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、米国）、エンハンサー２ ４００μｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、米国）およびＬｕｃｒａＴｏｎｅ（商標）Ｌｕｐｉｎ ２００μｌからなるマスターミックスを調製し、各バイオリアクターチューブに添加した。その細胞を、２５０ｒｐｍで振盪されている８％ ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターにおいてさらに４日間インキュベートした。タンパク質を、４０００ｒｐｍでの２０分間の上清の遠心分離から採取し、ＨＰＬＣ定量および精製の前に０．２２μｍフィルターを使用してきれいなチューブにろ過した。

ＩｇＧ１ Ｆｃ多量体を作製するために、組換えヒトＩｇＧ１ ＦｃのＮ末端をＩｇＭの１８アミノ酸尾部に融合させた。ＩｇＭ尾部（μＴＰ）は、五量体および六量体の形成を促進する。野生型（ＷＴ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃペプチド（Ｆｃ－μＴＰ）または残基３０９にロイシンからシステインへの点変異を有するそのバリアント（Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ）のいずれかを用いてＦｃ融合タンパク質を作製した。ロイシン３０９のシステインへの点変異（Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ）は、Ｆｃ分子間における共有結合の形成のため、ＷＴ（Ｆｃ－μＴＰ）よりも安定した構造をもたらすことが予想された。

Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ融合単量体サブユニットは、以下の領域（残基番号は、それぞれ配列番号２および４中のものを指す）を含む２つのペプチドに由来する：
シグナルペプチド 残基１～１９
ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域 残基２０～３４
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域 残基３５～２５１
ヒトＩｇＭの尾部 残基２５２～２６９

Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃペプチドの成熟形態のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号３として示す。核酸コード配列を、それぞれ（ＷＯ２０１７１２９７３７の配列番号９と対応する）配列番号９７および（ＷＯ２０１７１２９７３７の配列番号１０と対応する）配列番号９８として示す。

発現の過程で、シグナルペプチドが切り離されて、成熟Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ融合ペプチドが形成される。未成熟融合ペプチドの配列を、それぞれ配列番号２および４に示す。

多量体Ｆｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｆｃコンストラクトの単量体、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体と対応する各調製物に関するラダーパターンを示した。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、予想された六量体の位置に顕著なバンドを有したが、Ｆｃ－μＴＰは有さず、これは、破壊的な電気泳動バッファー条件下におけるより安定した構造と一致した（図１Ｂ）。Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ六量体に関して予想される構造の図解を図１Ａに示す。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃに関して、六量体の二量体の可能性が最も高い高次構造もはっきりとわかった。

Ｆｃ多量体調製物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図１Ｃ）および非対称フロー式フィールド・フロー・フラクショネーション（Ａ４Ｆ）（図１Ｄ）に続いて、２８０ｎｍにおける紫外線吸光度測定（Ａ２８０、薄層クロマトグラム）および多角度光散乱（ＭＡＬＳ、太線）を用いて、Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９ＣおよびＦｃ－μＴＰの多量体化も調べた。各手順を用いたＦｃ多量体調製物（表１）のそれぞれに対して顕著な六量体ピーク（およそ８５％材料）を有する類似の分布パターンが観察された。これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる異なるプロフィール（図１Ｂ）とは対照的であり、このことは、Ｆｃ－μＴＰ調製物中の非共有結合性六量体の存在を示唆する。残りの材料は、主としてＦｃ－μＴＰに関する低次（単量体、二量体、三量体）およびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃに関する高次（六量体の二量体）のものであった。

組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃ単量体（配列番号１の残基１から２３２）も作製し、対照として使用した。

Ｆｃタンパク質（Ｆｃ、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ）は、ＴＨＰ１細胞においてＮＦ－κＢ活性化を刺激できないことに基づいてエンドトキシンがないと見なされた（図２）。ヒト単核球細胞株、ＴＨＰ１を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％（１００Ｕ／ｍｌ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中で培養した。細胞培養培地をおよそ３日に１回交換した。転写因子ＮＦ－κＢによって誘導可能なプロモーターの支配下において分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＳＥＡＰ）遺伝子を発現するレポータープラスミドを用いたＴＨＰ１細胞の安定したトランスフェクションによってＴＨＰ１ＸＢｌｕｅ細胞を誘導した。刺激時に、ＴＨＰ１ＸＢｌｕｅ細胞がＮＦ－κＢ、続いて、ＳＥＡＰの分泌を活性化する。ＳＥＡＰが存在する場合に培地が紫／青に変化するため、ＳＥＡＰは、ＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅを使用して容易に検出可能である。ＴＨＰ１ＸＢｌｕｅ細胞は、ＰＣＲによって確認した場合、すべてのＴＬＲを発現するが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ２／１、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５およびＴＬＲ８にだけ反応する。ＴＨＰ１ＸＢｌｕｅ細胞は、選択マーカーＺｅｏｃｉｎに耐性がある。１０％ＦＣＳ、０．５％（１００Ｕ／ｍｌ）ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）および２００μｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培養した。細胞培養培地をおよそ３日に１回交換した。ＮＦ－κＢ活性化に対する陽性対照としてリポ多糖（ＬＰＳ）を使用した。

Ｆｃ六量体はＡＱＰ４発現細胞培養物中において補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害を抑制する
記載されているとおり（Ｃｒａｎｅら、２０１１年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８６、１６５１６～１６５２４ページ）、安定してヒトＡＱＰ４－Ｍ２３を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞と呼ばれる）を、１０％ウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍｌジェネテシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＦ－１２ Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ培地中において５％ ＣＯ_２、９５％空気中３７℃で培養した。記載されているとおり（Ｙｕｓａら、２００２年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８、５０４７～５０５７ページ）、Ｆｃγ受容体の高親和性１７６Ｖバリアントを発現するヒトナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（フィラデルフィア、ＰＡ）から入手した。

ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞を、１ウェル当たり２５，０００細胞のコンフルエンスになるまで９６ウェルプレートにおいて増殖させた。細胞を１０μｇ／ｍｌのＡＱＰ４－ＩｇＧ（ｒＡｂ－５３）または視神経脊髄炎（ＮＭＯ）血清（１：５０）とともに２３℃で１時間プレインキュベートした。ＣＤＣのアッセイのために、ヒトまたはラット補体を、規定の濃度のＦｃ調製物とともに４℃で１時間プレインキュベートした後、ＡＱＰ４－ＩｇＧ被覆ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞に添加し、さらに２３℃で１時間した。反応速度の分析のために、ＡＱＰ４－ＩｇＧ被覆ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞への付加の前に、ヒト補体をＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃとともに規定の時間プレインキュベートした。ＡＤＣＣのアッセイのために、ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞を、Ｆｃ調製物を伴わず、または伴い、４：１のエフェクター：標的細胞比で５μｇ／ｍｌのＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＮＫ細胞とともに３７℃で２時間インキュベートした。ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞を、その後、ＰＢＳ中で徹底的に洗浄し、３７℃で４５分間、２０％ Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を添加することによって細胞生存率を測定し、記載されているとおりに細胞傷害パーセンテージを求めた（Ｐｈｕａｎら、２０１３年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． １２５、８２９～８４０ページ；Ｒａｔｅｌａｄｅら、２０１４年、Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２５、１４５～１５３ページ）。

これらの調査のために、ＡＱＰ４－ＩｇＧプレインキュベーション細胞への添加の前に、Ｆｃ調製物をヒト補体（ヒト血清）とインキュベートした。Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、濃度依存的様式で細胞傷害をブロックし、効力がＩＶＩＧよりも＞５００倍大きく、Ｆｃ単量体よりも＞３０００倍大きかった（図３Ａおよび３Ｂ）。

反応速度調査は、そのＩＣ_５０を超えるＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ濃度でＣＤＣの急速な抑制を示したが、低いＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ濃度でははるかに遅い抑制を示し（図３Ｃ）、これは、Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９ＣのＣ１ｑとの多価の相互作用を含む協同的結合メカニズムに一致した。

図３Ｄは、細胞傷害が組換えＡＱＰ４－ＩｇＧではなく血清陽性ＮＭＯ患者からの血清によって引き起こされた場合のＦｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９ＣによるＣＤＣの抑制を示す。見かけのＩＣ_５０値は、図３Ａのものと類似しており、このことは、Ｆｃ六量体がＡＱＰ４－ＩｇＧまたはそのＡＱＰ４との結合ではなく補体に作用するという結論を裏付ける。

Ｆｃ調製物を、ＡＱＰ４発現ＣＨＯ細胞のＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＮＫ細胞とのインキュベーションによってもたらされるＡＤＣＣの抑制におけるそれらの効果についても試験した（Ｐｈｕａｎら、２０１３年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． １２５、８２９～８４０ページ；Ｒａｔｅｌａｄｅら、２０１４年、Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２５、１４５～１５３年；Ｔｒａｄｔｒａｎｔｉｐら、２０１２年、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７１、３１４～３２２ページ）。ＡＤＣＣは、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃによって濃度依存的様式で抑制され、ＩＣ_５０は、それぞれ約８０μｇ／ｍｌ、および５０μｇ／ｍｌであり、試験した濃度範囲においてＩＶＩＧまたはＦｃ単量体に関してはほとんど抑制が見られなかった（図５）。

Ｆｃ六量体は視神経脊髄炎（ＮＭＯ）の脊髄切片モデルにおいて病変を防ぐ
マウスに関して以前に記載されたとおり（Ｚｈａｎｇら、２０１１年、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７０、９４３～９５４ページ）、脊髄を、７日齢ラットから得、ビブラトームを使用して３００μｍの厚さに切断した。横断切片を、１ｍｌの培養培地を含む６ウェルプレート中の透明な膜インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭ ０．４μｍ孔、３０ｍｍ径）に置き、培養培地の薄い層が切片を覆った。５０％ ＭＥＭ、２５％ ＨＢＳＳ、２５％ウマ血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．６５％グルコースおよび２５ｍＭヘペスにおいて５％ＣＯ_２、３７℃で７日間切片を培養した。７日後の切片を、Ｆｃ－μＴＰまたはＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）を伴わず、または伴い、ＡＱＰ４－ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）およびヒト補体（５％）とともに２４時間インキュベートした。細胞への添加の前に、Ｆｃ調製物をヒト補体とともに室温で１時間プレインキュベートした。脊髄をＡＱＰ４、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、Ｉｂａ１およびＣ５ｂ－９に対して免疫染色し、記載されているとおり（Ｚｈａｎｇら、２０１１年、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７０、９４３～９５４ページ）に撮影し、スコア化した：０、正常なＧＦＡＰおよびＡＱＰ４染色を有する完全な状態の切片；１、軽度のアストロサイト膨張およびまたはＡＱＰ４染色の減少；２、ＧＦＡＰおよびＡＱＰ４染色が減少した少なくとも１つの病変；３、切片面積の＞３０％を侵す複数の病変；４、切片面積の＞８０％を侵す複数の病変（Ｐｈｕａｎら、２０１３年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． １２５、８２９～８４０ページ；Ｒａｔｅｌａｄｅら、２０１４年、Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２５、１４５～１５３ページ；Ｚｈａｎｇら、２０１１年、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７０、９４３～９５４ページ）。

データは、平均±標準誤差として提示する。２つの群を比較する場合、ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を使用して統計的比較を行った。

ＮＭＯのエクスビボ脊髄切片モデルにおいてＣＤＣ抑制調査も行い、ここでは、７日培養したラット脊髄切片が、ＡＱＰ４－ＩｇＧおよびヒト補体との２４時間のインキュベーション後にアストロサイト損傷（ＡＱＰ４およびＧＦＡＰの減少）、脱髄（ＭＰＢ染色の減少）、炎症（Ｉｂａ－１染色の増加）および補体終末膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ－９）の沈着を示している（Ｐｈｕａｎら、２０１３年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． １２５、８２９～８４０ページ；Ｚｈａｎｇら、２０１１年、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７０、９４３～９５４ページ）。ＡＱＰ４－ＩｇＧ／補体処理脊髄切片の免疫蛍光は、予想された病理学的変化を示し、これは、Ｆｃ－μＴＰおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃによって大部分が防がれた（図４Ａ）。図４Ｂは、病変スコアの概要を示す。

Ｆｃ多量体は古典的補体経路による溶血を抑制する
古典的経路に対するＦｃタンパク質の効果を確かめるために、ヒツジ赤血球（Ｓｉｅｍｅｎｓ）をウサギ抗ヒツジ抗体（Ａｍｂｏｚｅｐｔｏｒ ６０００；Ｓｉｅｍｅｎｓ）で感作し、細胞４×１０^８個／ｍＬ ＧＶＢ^２＋（ＧＶＢ、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に希釈した。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃによる溶血の抑制を評価するために、組換えタンパク質を１％または５％ヒト補体中において室温で３０分間プレインキュベートした後、１／１（ｖ／ｖ）の比で赤血球に添加し、マイクロタイタープレート振盪装置において３７℃で１時間インキュベートした。試験したＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃの濃度は、０．１から５μｇ／ｍｌに及んだ。氷冷ＧＶＢＥ（ＧＶＢ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、遠心分離（１２５０×ｇ、４℃で５分）した後、放出されたヘモグロビンの４１２ｎｍにおける吸光度を測定することによって上清中の溶血を判定した。

代替経路に対するＦｃタンパク質の効果を確かめるために、ウサギ赤血球（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を洗浄し、細胞２×１０^８個／ｍＬ ＧＶＢ／ＭｇＥＧＴＡ（ＧＶＢ、５ｍＭ ＭｇＥＧＴＡ）に希釈した。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃによる溶血の抑制を評価するために、組換えタンパク質を、５％または１０％ヒト補体中において室温で３０分間プレインキュベートした後、２／１（ｖ／ｖ）の比で赤血球に添加し、マイクロタイタープレート振盪装置において３７℃で１時間インキュベートした。試験したＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃの濃度は、０．１から５μｇ／ｍｌに及んだ。氷冷ＧＶＢＥを添加し、遠心分離（１２５０×ｇで１０分）をした後、放出されたヘモグロビンの４１２ｎｍにおける吸光度を測定することによって上清中の溶血を判定した。

Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、ヒト補体の１％および５％の両方の濃度で古典的補体経路の溶血を大幅に抑制した（図６Ｃ（ｉｉ））。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、ウサギ赤血球における代替補体経路を阻害しなかった（図６Ｃ（ｉｉｉ））。

Ｆｃ多量体は結合したＡＱＰ４－ＩｇＧへのＣ１ｑの結合を妨げることによって視神経脊髄炎の発病を調整する
ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞を９６ウェルプレートにおいて２４時間増殖させた。ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡでブロックした後、細胞を、１００ｍｇ／ｍｌのＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃを伴わず、または伴いＡＱＰ４－ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともに２３℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４－ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体、Ｆ（ａｂ’）_２－フラグメント特異的（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ウエストグローヴ、ＰＡ）とともに１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、蛍光を５９１／６１４ｎｍの励起／蛍光波長でプレートリーダーを使用して定量した。ヒトＩｇＧおよびＡＱＰ４免疫染色のために、細胞を、１００μｇ／ｍｌのＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃの非存在下または存在下において１０μｇ／ｍｌのＡＱＰ４－ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともに２３℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を、４％ ＰＦＡ中で１５分間固定し、０．１％トリトンＸ１００で透過処理した。１％ ＢＳＡでブロックした後、細胞を、０．４μｇ／ｍｌのポリクローナル、ＡＱＰ４ Ｃ末端特異的ウサギ抗ＡＱＰ４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダラス、ＴＸ）とともに１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳですすぎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４・Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント特異抗体（１：４００）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：４００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１時間インキュベートした。Ｃ１ｑ結合をアッセイするために、ＣＨＯ－ＡＱＰ４細胞を、２０μｇ／ｍｌのＡＱＰ４－ＩｇＧとともに２３℃で１時間プレインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。組換えヒトＣ１ｑ（６０μｇ／ｍｌ）を、Ｆｃ単量体またはＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃとともに１時間プレインキュベートした後、ＡＱＰ４－ＩｇＧ被覆細胞に１時間添加した。細胞を洗浄し、固定し、Ｃ１ｑをウサギＦＩＴＣ結合抗Ｃ１ｑ抗体（１：５０；Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）で染色した。

視神経脊髄炎（ＮＭＯ）発病は、膜結合ＡＱＰ４とのＡＱＰ４－ＩｇＧ結合によって開始され、結合したＡＱＰ４－ＩｇＧのＦｃ領域への最初の補体タンパク質Ｃ１ｑの結合が続く。図６Ａは、一次抗体のＦ（ａｂ’）_２フラグメントを認識する蛍光二次抗体を使用してアッセイした場合、１００μｇ／ｍｌのＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９ＣがＣＨＯ細胞上でのＡＱＰ４－ＩｇＧのＡＱＰ４との結合を阻害しなかったことを示している。図６Ｂは、Ｃ１ｑ免疫蛍光法によってアッセイした場合、Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃが精製Ｃ１ｑのＡＱＰ４結合ＡＱＰ４－ＩｇＧとの結合を妨げたことを示しており、これは、水相Ｃ１ｑとの強い結合であるＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃの作用の１つと一致する。

Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは視神経脊髄炎（ＮＭＯ）の実験ラットモデルにおいて病変を防ぐ
実験は、体重が合う雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２５０～３００ｇ、９～１２週齢）を使用して行った。ラットの静脈内にＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃを３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ｍｇ／ｋｇで与え、血液を２時間の時点で採取した。血液を室温で３０分間凝血させ、２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、血清を採取し、－２０℃で一晩凍結した。血清を、上記のとおり、ＣＤＣアッセイに使用し、ここでは、２％ラット血清を、１．２５～１０μｇ／ｍｌのＡＱＰ４－ＩｇＧに２３℃で１時間添加した。一部の調査では、ラット血液を、５０ｍｇ／ｋｇのＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃの静脈内注射後の規定の時間に採取し、ＣＤＣアッセイに供した。

記載されているとおりに（ＹａｏおよびＶｅｒｋｍａｎ、２０１７年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌｐａｔｈｏｌ． Ｃｏｍｍｕｎ． ５、１５ページ）、脳内注射によってＡＱＰ４－ＩｇＧを送達した。簡単にいえば、ラットを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔した後、定位固定装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｆｒａｍｅ）に載せた。頭皮の正中切開後、ブレグマの前方０．５ｍｍおよび側方３．５ｍｍに直径１ｍｍの穿頭孔を開けた。４０μｍ径のガラス針を、５ｍｍの深さ挿入して、加圧注射によって１０分かけて総体積の３～６μＬ中の３０または４０μｇのＡＱＰ４－ＩｇＧを注入した。５日目にラットに深く麻酔をかけた後、ヘパリン化ＰＢＳを２００ｍｌ、その後、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）１００ｍｌを用いて左心室を介した経心的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を行った。脳を４％ ＰＦＡ中で固定し、３０％スクロース中、４℃で一晩置いて、ＯＣＴに包埋した。

固定した脳を、凍結し、薄片（１０μｍ厚さ）を作り、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン、０．２％トリトンＸ１００）中で１時間インキュベートした後、一次抗体：ＡＱＰ４（１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、ＣＡ）、ＧＦＡＰ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、イオン化カルシウム結合アダプター分子（ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）１（Ｉｂａ１；１：１０００；Ｗａｋｏ、リッチモンド、ＶＡ）、Ｃ５ｂ－９（１：５０、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウーデン、オランダ）またはＣＤ４５（１：１０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホゼ、ＣＡ）、続いて、適切な蛍光二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）との一晩のインキュベーション（４℃）を行った。Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡において視覚化するために、切片をＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、ＣＡ）を用いて標本にした。

インビボ効力調査を、ラットにおいて確立されたＮＭＯの実験モデルを使用して行った。このラットでは、ＡＱＰ４－ＩｇＧの脳内投与によってＮＭＯ病変が作り出される（Ａｓａｖａｐａｎｕｍａｓら、２０１４年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． １２７、５３９～５５１ページ；ＹａｏおよびＶｅｒｋｍａｎ、２０１７年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌｐａｔｈｏｌ． Ｃｏｍｍｕｎ． ５、１５ページ）。ラットはヒト様の補体活性を有するが、マウスは一般に、不活性の古典的補体系を有するため、このモデルは、マウスではなくラットで行った（ＲａｔｅｌａｄｅおよびＶｅｒｋｍａｎ、２０１４年、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６２、１０３～１１４ページ）。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、ＡＱＰ４－ＩｇＧおよびラット補体によってもたらされたＣＤＣを抑制する際に有効であり（図７Ａ）、図３Ａにおいてヒト補体で見出されたものより数倍効力が大きかった。

効力調査のために治療的血中濃度をもたらすＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ投与計画を確立するために、ラットの静脈内にさまざまな量のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃを投与し、２時間の時点で採取した血清の補体活性を、ラット血清およびＡＱＰ４－ＩｇＧとともにプレインキュベートしたＡＱＰ４発現ＣＨＯ細胞のＣＤＣを測定することによってインビトロでアッセイした（図７Ｂ）。１２．５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の用量でＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃを投与されたラットから２時間の時点で採取された血清中では細胞傷害が妨げられた。図７Ｃは、５０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ投与後のラット血清により誘導された細胞傷害の時間経過を示す。細胞傷害は、少なくとも８時間妨げられた。

ＡＱＰ４－ＩｇＧの脳内注射時および脳内注射の１２時間後にＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃを５０ｍｇ／ｋｇで投与した短期間効力調査を行った（図８Ａ）。ＡＱＰ４－ＩｇＧ処置ラットの免疫蛍光は、投与部位周辺領域におけるアストロサイト損傷（アストロサイトマーカーＡＱＰ４およびＧＦＡＰの減少）、ならびに脱髄（ＭＢＰ免疫蛍光の減少）、炎症（Ｉｂａ－１およびＣＤ４５）および活性化補体の沈着（Ｃ５ｂ－９）を示した（図８Ａ）。病変周辺のＧＦＡＰ発現の増加は、反応性グリオーシスを表す。注射していない反対側の半球の免疫蛍光を比較のために示す。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ処置ラットでは著しい病変の低減が認められ、これらのラットでは、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、Ｃ５ｂ－９およびＣＤ４５免疫蛍光が未処置ラットおよびＦｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃ処置ラットの反対側の半球のものと類似していた。さらなる調査では、同側の半球のほぼ全体に大きなＮＭＯ病変をもたらすために、より大量のＡＱＰ４－ＩｇＧを注射した（図８Ｂ）。Ｆｃ－μＴＰ－Ｌ３０９Ｃは、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰおよびＭＢＰ免疫蛍光の減少を完全に妨げた。

Claims (7)

1. Ｆｃ多量体タンパク質を含む、視神経脊髄炎の処置における使用のための医薬組成物であって、該Ｆｃ多量体タンパク質は、６つのＩｇＧ Ｆｃ融合単量体を含み、各Ｆｃ融合単量体は、２つのＦｃ融合ポリペプチド鎖を含み、各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧ
   ＦｃポリペプチドおよびＩｇＭ尾部を含み、
   各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧヒンジ領域をさらに含み、かつＦａｂポリペプチドを含まず、
   各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドを含み、ならびに
   各Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、
   （ｉ）配列番号１、
   （ｉｉ）配列番号２、
   （ｉｉｉ）配列番号３であって、該配列番号３は各ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドの位置３０９においてロイシンがシステインに変異している、または
   （ｉｖ）配列番号４であって、該配列番号４は各ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドの位置３０９においてロイシンがシステインに変異している、
   のいずれか１つによって表される、前記医薬組成物。
2. Ｆｃ多量体タンパク質が、１０ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. Ｆｃ融合ポリペプチド鎖は、最大５つの保存的アミノ酸変化を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. Ｆｃ多量体タンパク質は組換えヒトＦｃ六量体であり、該組換えヒトＦｃ六量体はＮＭ
   Ｏのインビトロモデルにおいて補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害を抑制する、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. Ｆｃ多量体タンパク質は組換えヒトＦｃ六量体であり、該組換えヒトＦｃ六量体は視神経脊髄炎の脊髄切片モデルにおいてエクスビボで補体依存性細胞傷害および病変を抑制する、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. Ｆｃ多量体タンパク質は組換えヒトＦｃ六量体であり、該組換えヒトＦｃ六量体は古典的補体経路の活性化を阻害するが、代替補体経路は阻害しないことによって視神経脊髄炎の発病を防ぐ、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. Ｆｃ多量体タンパク質は組換えヒトＦｃ六量体であり、該組換えヒトＦｃ六量体は視神経脊髄炎のラットモデルにおいてインビボで細胞傷害および病変を防ぐ、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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