PT1644412E

PT1644412E - Fragmentos de anticorpos fab modificados

Info

Publication number: PT1644412E
Application number: PT47431580T
Authority: PT
Inventors: David Paul Humphreys; Sam Philip Heywood
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2003-07-01
Filing date: 2004-07-01
Publication date: 2015-12-23
Also published as: HRP20151252T4; EP1644412A2; WO2005003169A2; DK1644412T4; DK1644412T3; EP1644412B2; WO2005003169A3; PL1644412T3; PL1644412T5; JP2007536898A; HRP20151252T1; US20060257394A1; AU2004253738A1; SI1644412T2; US7989594B2; CY1116913T1; HUE026278T2; ES2551439T5; SI1644412T1; EP1644412B1

Description

DESCRIÇÃO "FRAGMENTOS DE ANTICORPOS FAB MODIFICADOS" A presente invenção está relacionada com fragmentos de anticorpos melhorados e, mais especificamente, proporciona fragmentos de anticorpos melhorados aos quais uma ou mais, de preferência duas ou mais, moléculas efectoras estão ligadas e métodos para a sua produção.

As regiões variáveis de elevada especificidade e afinidade torna-as agentes de diagnóstico e terapêuticos ideais, particularmente para a modulação de interacções proteína:proteína. Os fragmentos de anticorpos proporcionam agentes terapêuticos versáteis, conforme observado pelo recente sucesso de produtos tais como ReoPro®. A expressão bacteriana de um fragmento Fab recombinante foi descrita em Tout N L et al., 1997, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, vol. 4, no. 2, 147-155. Fragmentos de anticorpos terapêuticos com semividas in vivo prolongadas foram descritos em Chapman A P et al., 1999, Nature Biotechnology, vol. 17, no. 8, 780-783. A função de direccionamento codificada em Fv, Fab, Fab', (F(ab)2 e outros fragmentos de anticorpos pode ser usada directamente ou pode ser conjugada com uma ou mais moléculas efectoras tais como fármacos citotóxicos, toxinas ou moléculas de polímeros para aumentar a eficácia. Por exemplo, uma vez que estes fragmentos não possuem região Fc, possuem uma semivida de circulação curta em animais, mas esta pode ser melhorada através da conjugação com determinado tipo de polímeros, como seja polietilenoglicol (PEG). Demonstrou-se que o aumento do tamanho do PEG conjugado aumenta a semivida em circulação de minutos para muitas horas e a modificação de um Fab' com PEG variando entre 5 kDa e 100 kDa foi demonstrada (Chapman et al., 1999, Nature Biotechnology, 17, 780-783; Leong et al., 2001, Cytokine, 16, 106-119; Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) . Os fragmentos de anticorpo PEGuilados tais como CDP870 estão actualmente em ensaios clínicos onde ο efeito do PEG conjugado é aumentar a semivida de circulação para níveis aceitáveis em terapia.

As moléculas efectoras podem ser ligadas a fragmentos de anticorpos através de uma série de diferentes métodos, incluindo através de açúcares de aldeído ou mais frequentemente através de qualquer grupo funcional disponível nas cadeias laterais dos aminoácidos ou do aminoácido terminal situado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxilo ou carboxilo livre. O local de ligação das moléculas efectoras pode ser aleatório ou específico. A ligação aleatória é frequentemente conseguida através de aminoácidos como a lisina e isto resulta em moléculas efectoras ligadas a uma série de locais ao longo do fragmento de anticorpo dependendo da posição das lisinas. Se bem que isto tenha tido êxito nalguns casos, a localização exacta e o número de moléculas efectoras ligadas não podem ser controlados e tal pode levar à perda de actividade, por exemplo, se demasiado poucas forem ligadas e/ou perda de afinidade se, por exemplo, interferirem com o local de ligação (Chapman 2002 Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Como resultado, a ligação controlada especifica de local das moléculas efectoras é, geralmente, o método de eleição. A ligação especifica de local das moléculas efectoras é normalmente conseguida através da ligação aos resíduos de cisteina uma vez que tais resíduos são relativamente invulgares nos fragmentos de anticorpos. As charneiras dos anticorpos são regiões populares para a ligação especifica de local, uma vez que estas possuem resíduos de cisteina e são remotas relativamente a outras regiões do anticorpo envolvidas na ligação ao antigénio.

Regiões de charneira adequadas ocorrem naturalmente no fragmento ou podem ser criadas usando técnicas de DNA recombinante (Ver por exemplo US 5,677,425; W098/25971;

Leong et al., 2001 Cytokine, 16, 106-119; Chapman et al., 1999 Nature Biotechnology, 17, 780-783). Como alternativa, ou ainda, as cisteinas especificas de local podem ser manipuladas no fragmento de anticorpo, por exemplo, para criar cisteinas expostas (US 5,219,996).

Quando as moléculas efectoras se destinam a ser ligadas a um local especifico através de uma cisteina, o tiol alvo no fragmento de anticorpo é, frequentemente, protegido por um pequeno produto peptídico relacionado com a fermentação, como seja glutationa ou deliberadamente protegido por um aditivo químico usado durante a extracção e purificação do fragmento de anticorpo, como seja 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB). Estes agentes protectores necessitam de ser removidos para activar o tiol alvo (charneira ou superfície). Os fragmentos de anticorpo possuem uma ligação dissulfureto nativa intercadeias entre as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve (ChI e Cl) que, de um modo geral, tem sido considerada como crítica na manutenção das propriedades de estabilidade e ligação do anticorpo. Como resultado, a activação do tiol alvo da charneira ou da superfície deve ser realizada com algum cuidado para que o dissulfureto inter Cl:Ch1 permaneça intacto. Assim, condições redutoras "suaves" são convencionalmente usadas para remover o agente protector de tiol antes da reacção com a molécula efectora. Isto é geralmente conseguido usando agentes redutores baseados em tiol como sejam β-mercaptoetanol (β-ΜΕ), (β-mercaptoetil-amina (β-ΜΑ) e ditiotreitol (DTT). No entanto, sabe-se que cada um dos redutores é capaz de reagir com a cisteína e ligar-se-lhe, o que significa reduzi-la (Begg and Speicher, 1999 Journal of Biomolecular techniques, 10,17-20) reduzindo assim a eficiência da ligação da molécula efectora. Portanto, após redução e reacção com as moléculas efec-toras, uma grande proporção dos fragmentos de anticorpo não possui quaisquer moléculas efectoras ligadas. Esta fraca eficiência de modificação é claramente uma desvantagem durante a produção em larga escala de fragmentos de anticorpos terapêuticos modificados em que é importante que seja conseguida a eficiência de produção máxima. A presente invenção proporciona uma nova classe de fragmentos de anticorpos Fab aos quais podem ser ligadas moléculas efectoras. Uma vantagem particular destes fragmentos reside nos resíduos de cisteína presentes nestes fragmentos poderem ser usados para a ligação específica de local de moléculas efectoras, evitando a necessidade de manipular regiões de charneira para as modificar e/ou substituir aminoácidos de superfície. Quando as moléculas efectoras são ligadas aos fragmentos Fab de anticorpos da presente invenção não existem ligações covalentes intercadeias entre a cadeia leve e a cadeia pesada. Apesar da ausência de qualquer ligação covalente entre a cadeia pesada e a cadeia leve e a ligação de moléculas efectoras, os fragmentos da presente invenção têm um desempenho comparável aos fragmentos selvagens numa série de testes in vitro e in vivo. Surpreendentemente, estes novos fragmentos possuem a mesma afinidade para o antigénio e estabilidade in vivo e in vitro similar aos fragmentos selvagens. Uma outra vantagem destes fragmentos reside na facilidade de ligação das moléculas efectoras aos fragmentos e, em particular, na eficiência da ligação. Os fragmentos proporcionam assim uma alternativa de baixo custo aos fragmentos actualmente disponíveis em que as ligações covalentes intercadeias nativas são mantidas após ligação da molécula efectora.

Assim, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um fragmento de anticorpo Fab caracterizado por a região constante da cadeia pesada terminar na cisteina intercadeias de ChI · 0 anticorpo Fab da presente invenção pode ser qualquer par de cadeia pesada e de cadeia leve tendo uma região variável (VH/VL) e uma região constante (Ch/Cl). De preferência, o par de cadeias pesada e leve é Vh/Ch1 e Vi/Cl ligadas covalentemente através de cisteinas intercadeias nas regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve. 0 termo "cisteina intercadeias" como aqui usado refere-se a uma cisteina na região constante da cadeia pesada e da cadeia leve que será ligada por ligação dissulfureto a uma cisteina na correspondente região constante da cadeia pesada ou leve num gene de anticorpo da linha germinativa natural. Em particular, as cisteinas intercadeias da presente invenção são uma cisteina na região constante da cadeia leve (Cl) e uma cisteina na região constante da cadeia pesada (ChI) que estão ligadas por ligação dissulfureto uma à outra nos anticorpos naturais. Exemplos de tais cisteinas podem tipicamente ser encontrados na posição 14 da cadeia leve e 233 da cadeia pesada de IgGl humana, 127 da cadeia pesada de IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 humanas e 128 da cadeia pesada de IgD e IgA2B humanas, como definido por Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA. Em IgG murina, as cisteinas intercadeias podem ser encontradas na posição 214 da cadeia leve e 235 da cadeia pesada. Será apreciado que as posições exactas destas cisteinas podem variar relativamente aos anticorpos naturais se forem feitas quaisquer modificações, tais como deleções, inserções e/ou substituições no fragmento de anticorpo Fab.

No fragmento de anticorpo Fab da presente invenção, a região constante da cadeia pesada termina na cisteina intercadeias de ChI · Assim, o último aminoácido no domínio ChI do fragmento de anticorpo Fab da presente invenção é uma cisteina. 0 fragmento de anticorpo Fab da presente invenção em que o domínio ChI está truncado pode ser preparado por qualquer método adequado conhecido na arte. Por exemplo, o fragmento de anticorpo Fab da presente invenção pode ser obtido a partir de qualquer anticorpo completo, especialmente um anticorpo monoclonal completo, usando quaisquer técnicas de clivagem e/ou digestão enzimática adequadas, por exemplo através do tratamento com pepsina ou papaína e proteases C-terminais. De preferência, o fragmento de anticorpo Fab da presente invenção é preparado através do uso de técnicas de DNA recombinantes, envolvendo a manipulação e nova expressão do DNA codificador das regiões variável e constante do anticorpo. Caso se pretenda, podem ser usadas técnicas de biologia molecular para modificar, adicionar ou deletar mais aminoácidos ou domínios. Quaisquer alterações às regiões variáveis ou constantes são ainda englobadas pelos termos regiões "variável" e "constante" como aqui usado. De preferência, usa-se PCR para introduzir um codão de paragem imediatamente a seguir ao codão codificador da cisteina intercadeias de ChI, de modo que a tradução do dominio ChI para na cisteina intercadeias. Métodos para desenhar sequências iniciadoras de PCR adequadas são conhecidas na arte e as sequências dos domínios ChI de anticorpos são facilmente obtidas (Rabat et al., supra). Como alternativa, podem ser introduzidos codões de paragem usando técnicas de mutagénese dirigida tais como as descritas em White (Ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (1993). 0 material de partida dos fragmentos de anticorpos da presente invenção pode derivar de qualquer isotipo de anticorpo, incluindo por exemplo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE e suas subclasses incluindo, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. De preferência, o fragmento de anticorpo Fab da presente invenção deriva de IgGl. 0 material de partida do fragmento de anticorpo pode ser obtido a partir de qualquer espécie, incluindo, por exemplo, murganho, rato, coelho, porco, cobaio, camelo, lama, cabra ou ser humano. Partes do fragmento de anticorpo podem ser obtidas a partir de mais de uma espécie, por exemplo os fragmentos de anticorpos podem ser quiméricos. Num exemplo, as regiões constantes são de uma espécie e as regiões variáveis são de uma outra. 0 material de partida do fragmento de anticorpo pode também ser modificado. Num exemplo, a região variável do fragmento de anticorpo foi criada usando técnicas de DNA recombinante. Tais versões manipuladas incluem as criadas, por exemplo, a partir de regiões variáveis do anticorpo natural através de inserções, deleções ou alterações nas sequências de aminoácidos dos anticorpos naturais. Exemplos particulares deste tipo incluem os domínios das regiões variáveis manipulados contendo pelo menos uma CDR e facultativamente um ou mais aminoácidos estruturais de um anticorpo e o restante do domínio da região variável de um segundo anticorpo. Os métodos para a criação e produção destes fragmentos de anticorpo são conhecidos na arte (ver por exemplo, Boss et al., US 4,816,397; Cabilly et al., US 6,331,415; Shrader et al., WO 92/02551; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Queen et al., US 5,585,089; Adair, WO91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). O fragmento de anticorpo da presente invenção será, em gral, capaz de selectivamente se ligar a um antigénio. O antigénio pode ser qualquer antigénio associado a células, por exemplo um antigénio da superfície celular em células tais como células bacterianas, células de levedura, células T, células endoteliais ou células tumorais ou pode ser qualquer antigénio solúvel. Os antigénios podem também ser qualquer antigénio relevante em termos médicos, como sejam os antigénios regulados positivamente durante doença ou infecção, por exemplo receptores e/ou os seus ligandos correspondentes. Exemplos particulares de antigénios da superfície celular incluem moléculas de adesão, por exemplo integrinas tais como integrinas βΐ, e.g. VLA-4, selectina E, selectina P ou selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, Clla, CDllb, CDl8, CDl9, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, antigénio carcinoembrionário (CEA), globulina do leite gordo humano (HMFG1 e 2), antigénios MHC Classe I e MHC Classe II e VEGF e, sempre que adequado, seus receptores. Os antigénios solúveis incluem interleucinas tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 ou IL-17, antigénios virais, como por exemplo antigénios do vírus dos sincícios respiratórios ou de citomegalovírus, imunoglobulinas, tais como IgE, interfe-rões tais como interferão a, interferão β ou interferão y, factor de necrose tumoral-a, factor de necrose tumoral-β, factores estimuladores de colónias tais como G-CSF ou GM-CSF, e factores de crescimento derivados de plaquetas tais como PDGF-α e PDGF-β e, quando apropriado, os seus receptores. A presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo Fab caracterizado por a região constante da cadeia pesada terminar na cisteína intercadeias de ChI · Numa realização, as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve derivam de IgGl humana. Numa realização, a presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos proporcionada em SEQ ID N0:1. A presente invenção também proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos proporcionada em SEQ ID N0:1 e a região constante da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos proporcionada em SEQ ID NO: 2. Todas as sequências e os seus números de SEQ ID são proporcionados na Figura 5.

Numa outra realização, as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve derivam de IgGl murina. Neste aspecto, a presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste nas sequências de aminoácidos proporcionadas em SEQ ID NO:3. A presente invenção também proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos proporcionada em SEQ ID NO:3 e a região constante da cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácidos proporcionada em SEQ ID NO:4. A presente invenção também proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:l. "Identidade", como aqui usada, indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. "Similaridade", como aqui usada, indica que, em qualquer posição particular nas sequências linhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo semelhante entre as sequências. Por exemplo, a leucina pode ser substituída por isoleucina ou valina. Outros aminácidos que frequentemente podem ser substituídos uns pelos outros incluem mas não estão limitados a: lisina, arqinina e histidina (aminoácidos com cadeias laterais básicas); - aspartato e glutamato (aminoácidos com cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos com cadeias laterais amida); e - cisteína e metionina (aminoácidos com cadeias laterais com enxofre).

Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) .

De preferência, o fragmento de anticorpo Fab deste aspecto da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que a região constante da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:1. A presente invenção também proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:l e a região constante da cadeia leve compreende ou consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:2. De preferência, o fragmento fab do anticorpo deste aspecto da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que a região constante da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:2. A presente invenção também proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:3. Numa realização, a presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada compreende ou consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:3 e a região constante da cadeia leve compreende ou consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência dada em SEQ ID NO: 4. De preferência, o fragmento de anticorpo Fab deste aspecto da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que a região constante da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve em que a região constante da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:4.

Sequências de ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácidos proporcionadas em SEQ ID NOs 1-4 podem ser desenhadas usando métodos conhecidos na arte. Numa realização, a invenção proporciona sequências de DNA isoladas codificadoras das regiões constantes da cadeia leve e/ou pesada descritas em SEQ ID NOs 1-4. Numa realização, as sequências de ácido nucleico codificadoras das sequências de aminoácidos proporcionadas em SEQ ID NO:l, 2, 3 e 4 são as apresentadas em SEQ ID NOs 5, 6, 7 e 8, respectivamente. A presente invenção também está relacionada com um vector de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Assim, é proporcionado um vector de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA codificadoras de um fragmento de anticorpo Fab da presente invenção. Em particular, os vectores de clonagem ou expressão da presente invenção compreendem uma ou mais sequências de DNA codificadoras das regiões constantes do anticorpo da presente invenção, como proporcionado em SEQ ID NOs: 5-8.

Numa realização, o vector compreende a sequência apresentada em SEQ ID N0:5 e SEQ ID NO:6. Numa outra realização, o vector compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8. Métodos gerais através dos quais os vectores podem ser construídos, métodos de transfecção e cultura são conhecidos dos familiarizados com a arte. Neste contexto, é feita referência a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.

Também é proporcionada pela presente invenção uma célula hospedeira que expressa um fragmento de anticorpo Fab em que o domínio ChI termina na cisteína intercadeias. Qualquer sistema célula hospedeira/vector adequado pode ser usado para a expressão das sequências de DNA codificadoras do Fab de anticorpo da presente invenção. Assim, é igualmente proporcionada uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vectores de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA codificadoras de um fragmento de anticorpo da presente invenção, em particular, as células hospedeiras compreendendo os vectores de clonagem ou expressão da presente invenção compreendendo uma ou mais sequências de DNA codificadoras das regiões constantes do anticorpo da presente invenção, como apresentado em SEQ ID NOs: 5-8. Podem ser usados sistemas bacterianos, por exemplo E. coli ou outro, ou podem ser igualmente usados sistemas de expressão de células hospedeiras eucarióticas, por exemplo de mamífero. Estirpes de E. coli adequadas para usar na presente invenção podem ser estirpes naturais ou estirpe mutadas capazes de produzir proteínas recombinantes. Exemplos de estirpes de E. coli hospedeiras específicas incluem MC4100, TGI, TG2, DHB4, DH5a, DHl, BL21, XLlBlue e W3110 (ATCC 27,325). Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem CHO, células de mieloma ou de hibridoma. Também é proporcionado um método de produção do fragmento de anticorpo Fab da presente invenção compreendendo a cultura da célula hospedeira que expressa o fragmento de anticorpo Fab da presente invenção e isolamento do referido fragmento. Uma vez produzido na célula hospedeira, o fragmento de anticorpo Fab pode ser extraído e purificado usando qualquer método adequado conhecido na arte. A extracção pelo calor pode ser usada como descrito em US 5,665,866 devido à presença da ligação dissulfureto intercadeias. Métodos de purificação adequados incluem, mas não lhes estão limitados, exclusão pelo tamanho, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de afinidade com proteína A, G ou L e permuta iónica.

Caso se pretenda, o fragmento de anticorpo Fab da presente invenção pode ter uma ou mais moléculas efectoras que lhe estão ligadas. 0 termo molécula efectora como aqui usado inclui, por exemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas (tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana ou vegetal e seus fragmentos, e.g. rícino e seus fragmentos) proteínas biologicamente activas, por exemplo enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéticos ou naturais, ácidos nucleicos e fragmentos dos mesmos, e.g. DNA, RNA e seus fragmentos, radionuclidos, particularmente iodo radioactivo, isótopos radioactivos, metais quelatados, nanopartículas e grupos repórter tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por NMR ou espectroscopia ESR.

Agentes antineoplásicos particulares incluem agentes citotóxicos e citostáticos, por exemplo agentes de alquilação, tais como mostardas de azoto (e.g. clorambu-cilo, melfalano, mecloretamina, ciclosfofamida ou mostarda de uracilo) e seus derivados, trietilenofosforamida, tri-etilenotiofosforamida, busulfano, ou cisplatina; antime-tabolitos, tais como metotrexato, fluorouracilo, floxuri-dina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluo-roacético ou ácido fluorocítrico, antibióticos, tais como bleomicinas (e.g. sulfato de bleomicina), doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicinas (e.g. mitomicina C) , actino-micinas (e.g. dactinomicina) plicamicina, calicaemicina e seus derivados, ou esperamicina e seus derivados; inibidores mitóticos, tais como etopósido, vincristina ou vinblastina e seus derivados; alcaloides tais como eli-pticina; polióis tais como taxicina-I ou taxicina-II; hormonas, tais como androgénios (e.g. dromostanolona ou testolactona), progestinas (e.g. acetato de megestrol ou acetato de medroxiprogesterona), estrogénios (e.g. difos- fato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol ou fosfato de estramustina) ou antiestrogénios (e.g. tamo-xifeno); antraquinonas, tais como mitoxantrona, ureias, tais como hidroxiureia; hidrazinas, tais como procarbazina; ou imidazoles, tais como dacarbazina.

Metais quelatados incluem quelatos de metais dipositivos ou tripositivos tendo um número de coordenação entre 2 e 8 inclusive. Exemplos particulares de tais metais incluem tecnécio (Tc), rénio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), ouro (Au), prata (Ag), chumbo (Pb), bismuto (Bi) , indio (In), gálio (Ga), itrio (Y), gadolinio (Gd) escândio (Sc). Em geral, o metal é, de preferência, um radionuclido. Radionuclidos particulares incluem 99mTc, 186Re, 188Re, 58CO, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 711Ιη 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd e 47Sc. 0 metal quelatado pode ser por exemplo um dos tipos acima de metal quelatado com qualquer agente quelante polidentado adequado, por exemplo poliaminas aciclicas ou cíclicas, poliéteres (e.g. éteres de coroa e seus derivados); poliamidas; porfirinas; e derivados carbocíclicos.

Em geral, o tipo de agente quelante dependerá do metal usado. No entanto, um grupo particularmente útil de agentes quelantes em conjugados de acordo com a invenção são as poliaminas aciclicas e cíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por exemplo ácido dietileno-triaminopentacético e seus derivados e aminas macrocícli- cas, e.g. derivados cíclicos tri-aza e tetra-aza (por exemplo como descrito na Especificação de Patente Internacional N° WO 92/22583); e poliamidas, especialmente desferriox-amina e seus derivados.

Outras moléculas efectoras incluem proteínas, péptidos e enzimas. Enzimas de interesse incluem, mas não lhes estão limitadas, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. Proteínas, polipéptidos e péptidos de interesse incluem, mas não lhes estão limitados, imunoglobulinas, toxinas tais como abrina, rícino A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína como seja insulina, factor de necrose tumoral, α-interferão, β-interferão, factor de crescimento das células nervosas, factor de crescimento derivado de plaquetas ou activador do plasminogénio de tecido, um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, e.g. angiostatina ou endos-tatina, ou um modificador da resposta biológica como seja uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), factor estimulador das colónias de granulócitos (G-CSF), factor de crescimento das células nervosas (NGF) ou outro factor de crescimento e imunoglobulinas.

Outras moléculas efectoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo, em diagnóstico. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, matérias fluorescentes, materiais lumi- nescentes, materiais bioluminescentes, nuclidos radioacti-vos, metais emissores de positrões (para usar na tomografia de emissão de positrões) e iões de metais paramagnéticos não radioactivos. Ver, de um modo geral, U.S. Patent No. 4,741,900 para iões de metais que podem ser conjugados com anticorpos para usar como elementos de diagnóstico. Enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase: grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; materiais fluorescentes adequados incluem umbeli-ferona, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo e ficoeritrina; matérias luminescentes adequadas incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e nuclidos radioactivos adequados incluem 125I, 131I, 11]-In e "Tc.

Polímeros sintéticos ou naturais para usar como moléculas efectoras incluem, por exemplo, polímeros de polialquileno, polialcenileno ou polioxialquileno facultativamente substituídos, de cadeia linear ou ramificada ou polissacáridos ramificados ou não ramificados, e.g. um homopolissacárido ou heteropolissacárido como sejam lactose, amilose, dextrano ou glicogénio.

Substituintes facultativos particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos atrás mencionados incluem um ou mais grupos hidroxilo, metilo ou metoxilo. Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli (etilenoglicol), poli(propilenoglicol), álcool poli-vinílico ou seus derivados de cadeia linear ou ramificada, facultativamente substituídos, especialmente poli(etilenoglicol) facultativamente substituído como seja metoxipo-li (etilenoglicol) ou seus derivados. "Derivados" como aqui usado destina-se a incluir derivados reactivos, por exemplo grupos reactivos selec-tivos para tiol como sejam um ácido ou éster a-halocar-boxílico, e.g. iodoacetamida, uma imida, e.g. maleimida, uma vinilsulfona ou dissulfureto maleimida e similares. 0 grupo reactivo pode ser ligado directamente ou através de um segmento de ligação ao polímero. Será apreciado que o resíduo de tal grupo nalguns casos formará parte do produto como grupo de ligação entre o fragmento de anticorpos e o polímero. 0 tamanho do polímero pode variar consoante pretendido, mas será, de um modo geral, numa gama de massa molecular entre 500 Da e 50000 Da, de preferência entre 5000 e 40000 Da e, mais de preferência, entre 10000 e 40000 e 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero pode, em particular, ser seleccionado com base no uso pretendido para o produto, por exemplo capacidade para se localizar em determinados tecidos, tais como tumores, ou semivida circulante prolongada (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, quando o produto se destina a deixar a circulação e penetrar no tecido, por exemplo, para usar no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero com um peso molecular mais pequeno, por exemplo com uma massa molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicações em que o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de massa molecular mais elevada, por exemplo tendo uma massa molecular na gama de 20000 Da e 40000 Da.

Polímeros particularmente preferidos incluem um polímero de polialquileno, como seja um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou um seu derivado e especialmente com uma massa molecular na gama de aproximadamente 10000 Da a cerca de 40000 Da.

Os polímeros da presente invenção podem ser obtidos comercialmente (por exemplo da Nippon Oil and Fats; Nektar Therapeutics) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comerciais usando procedimentos químicos comerciais.

Moléculas efectoras podem ser ligadas usando procedimentos químicos convencionais ou DNA recombinante em que o fragmento de anticorpo é ligado directamente ou através de um agente acoplagem à molécula efectora. Técnicas para conjugação de tais moléculas efectoras aos anticorpos são bem conhecidas na arte (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al. , eds. , 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Imnunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik). Procedimentos químicos parti- culares incluem, por exemplo, os descritos nos Fascículos de Patente Internacional números WO 93/06231, W092/22583, W090/09195, WO89/01476, W09915549 e W003031581. Como alternativa, quando a molécula efectora é uma proteína ou polipéptido, a ligação pode ser conseguida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito na Fascículo de Patente Europeia No. 392745.

As moléculas efectoras podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo da presente invenção através de qualquer grupo funcional da cadeia lateral dos aminoácidos ou do aminoácido terminal situado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxilo ou carboxilo livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser manipulados no fragmento usando métodos de DNA recombinante. Ver por exemplo US 5219996. De preferência, as moléculas efectoras são ligadas covalentemente através de um grupo tiol de um resíduo cisteína situado no fragmento de anticorpo, natural ou manipulado. A ligação covalente será, de um modo geral, uma ligação dissulfureto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono. Quando um grupo tiol é usado como ponto de ligação de moléculas efectoras adequadamente activadas, podem ser usados, por exemplo, derivados selectivos de tiol tais como maleimidas e derivados de cisteína.

Será apreciado que quando existem duas ou mais moléculas efectoras ligadas ao fragmento de anticorpo estas podem ser idênticas ou diferentes e podem estar ligadas ao fragmento de anticorpo em locais diferentes. Também será apreciado que duas ou mais moléculas efectoras podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo num único local através do uso, por exemplo, de estrutura de ligação ramificada para ligar duas ou mais moléculas efectoras e que proporcionam um único local de ligação.

Num aspecto preferido da presente invenção, pelo menos uma das moléculas efectoras ligadas ao fragmento do anticorpo é uma molécula de polímero, de preferência PEG ou um seu derivado. Relativamente à ligação de fracções de polietilenoglicol (PEG) em geral, é feita referência a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J.Milton Harris (ed), Plenum Press, New York; "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S.Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.

De preferência, todas as moléculas efectoras ligadas ao fragmento Fab da presente invenção são PEG e cada molécula é ligada covalentemente através de um grupo maleimida a um ou mais grupos tiol no fragmento de anticorpo. 0 PEG pode ser qualquer molécula linear ou ramificada numa gama de massa molecular média de 50 0 Da a 50000 Da, de preferência 5000 a 40000 Da e mais de preferência de 10000 a 40000 Da e 20000 a 40000 Da. Para ligar moléculas de PEG ramificado, um resíduo de lisina é, de preferência, ligado a um polímero metoxipoli(etile-noglicol). Num exemplo, a massa molecular de cada polímero ligado à lisina é de aproximadamente 20000 Da e a massa molecular total da totalidade da molécula do polímero é assim de aproximadamente 40000 Da. De preferência, as moléculas de PEG ligadas ao fragmento Fab da presente invenção são lineares.

Uma ou mais moléculas efectoras podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo Fab da presente invenção. Num aspecto preferido, pelo menos duas moléculas efectoras são ligadas ao fragmento Fab, uma a uma cisteína na região constante da cadeia leve e uma a uma cisteína na região constante da cadeia pesada. De preferência, os resíduos cisteína aos quais as moléculas efectoras estão ligadas estariam ligados um ao outro através de uma ligação dissulfureto se as moléculas efectoras não estivessem ligadas. Cisteínas adequadas para a ligação incluem cisteínas naturais presentes na região constante da cadeia leve e/ou pesada, como sejam as cisteínas intercadeias. Num aspecto preferido da invenção, uma molécula efectora é ligada à cisteína intercadeias de Cl e a cisteína inter cadeias de ChI no fragmento de anticorpo Fab. Numa realização, a cisteína intercadeias de Cl à qual uma molécula efectora é ligada está na posição 214 da cadeia leve e a cisteína intercadeias de ChI à qual uma molécula efectora é ligada está na posição 233 da cadeia pesada. Numa outra realização, onde as regiões constantes derivam de IgGl murina, a cisteína intercadeias de Cl à qual uma molécula efectora é ligada está na posição 214 da cadeia leve e a cisteína intercadeias de ChI à qual uma molécula efectora está ligada está na posição 235 da cadeia pesada. Outras cisteínas adequadas incluem as que foram manipuladas nas regiões constantes usando técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, duas cisteínas podem ser manipuladas no fragmento de anticorpo, em cada uma das regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve, de preferência nas posições onde possam formar uma ligação dissulfureto uma com a outra.

Fragmentos particulares de acordo com este aspecto da invenção incluem aqueles em que: (i) os resíduos de cisteína nas regiões constantes da cadeia leve que estão ligados às moléculas efectoras estariam de outra forma ligados uns aos outros via uma ligação dissulfureto se as moléculas efectoras não estivessem ligadas ou (ii) a cisteína da cadeia leve à qual uma molécula efectora está ligada é a cisteína intercadeias de Cl e a cisteína da cadeia pesada à qual uma molécula efectora está ligada é a cisteína intercadeias de ChI.

Durante a ligação das moléculas efectoras às cisteínas no fragmento de anticorpo Fab da presente invenção quaisquer ligações covalentes entre as cisteínas são removidas, como aqui descrito, usando um agente de redução. Em tais fragmentos, a cadeia pesada deixa de estar ligada covalentemente à cadeia leve e a ligação dissul-fureto encontrada nos anticorpos naturais entre a cisteina intercadeias de Cl e a cisteina intercadeias de ChI deixa de existir. A presente invenção proporciona igualmente um método para ligação de moléculas efectoras aos fragmentos de anticorpo Fab da presente invenção, o referido método compreendendo: a) Tratamento de um fragmento de anticorpo Fab da presente invenção com um agente redutor capaz de gerar um grupo tiol livre numa cisteina da região constante da cadeia leve e da cadeia pesada b) reacção do fragmento tratado com uma molécula efectora.

Num aspecto preferido, o método compreende: a) redução da ligação dissulfureto intercadeias entre a cisteina intercadeias de ChI e a cisteina intercadeias de Cl no fragmento de anticorpo Fab da presente invenção b) reacção do fragmento tratado com uma molécula efectora

Os métodos proporcionados pela presente invenção permitem que uma ou mais moléculas sejam ligadas às cisteínas no fragmento de anticorpo, em particular às cisteinas na região constante. Duas ou mais moléculas efectoras podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo usando os métodos aqui descritos, repetindo o método simultaneamente ou sequencialmente.

Moléculas efectoras adicionais podem ser ligadas noutros locais do fragmento de anticorpo, em particular nas regiões constantes. Assim, os métodos da presente invenção também se estendem a um ou mais passos, antes e/ou após os métodos de redução atrás descritos, em que as moléculas efectoras são ligadas ao fragmento de anticorpo usando qualquer método adequado como descrito anteriormente, por exemplo através de outras cadeias laterais de aminoácidos disponíveis tais como grupos amino e imino. 0 agente redutor para usar nos métodos da presente invenção é qualquer agente redutor capaz de reduzir cisteínas no fragmento de anticorpo Fab da presente invenção para produzir tióis livres. De preferência, o agente redutor reduz a ligação dissulfureto intercadeias entre cisteínas das regiões constantes da cadeia pesada e leve, por exemplo, entre a cisteína intercadeias de Cl e a cisteína intercadeias de ChI, de modo a permitir a ligação de moléculas efectoras às referidas cisteínas. Como os fragmentos de anticorpo Fab da presente invenção surpreendentemente não necessitam da ligação dissulfureto intercadeias, podem ser usados agentes redutores mais fortes que os convencionalmente usados com os fragmentos de anticorpo selvagens que retêm a ligação dissulfureto intercadeias. Como resultado é produzido um número mais elevado de moléculas Fab com tióis livres e uma maior proporção de fragmentos de anticorpos é correctamente modificada, i.e. é ligado o número correcto de moléculas efectoras. Ainda, a cisteina intercadeias terminal de ChI nos fragmentos de anticorpo Fab da presente invenção está mais acessível para a ligação da molécula efectora e redução que os fragmentos Fab convencionais onde pode haver efeitos electrostáticos espaciais ou locais devido à presença da charneira superior ou outros aminoácidos C-terminais relativamente à cisteina intercadeias ChI. Os fragmentos de anticorpos da presente invenção podem assim ser modificados mais eficientemente e a menos custo que os fragmentos de anticorpo convencionais. Será óbvio para os familiarizados com a arte que agentes redutores adequados podem ser identificados através da determinação do número de tióis livres produzidos após o fragmento de anticorpo ser tratado com o agente redutor. Métodos para determinação do número de tióis livres são bem conhecidos na arte, ver por exemplo Lyons et ai., 1990, Protein Engineering, 3, 703. Os agentes redutores para usar na presente invenção são largamente conhecidos na arte, por exemplo os descritos em Singh et ai., 1995, Methods in Enzymology, 251, 167-73. Exemplos particulares incluem os agentes redutores baseados em tiol tais como glutationa reduzida (GSH), β-mercapto-etanol (β-ΜΕ), (β-mercaptoetilamina (β-ΜΑ) e ditiotreitol (DTT) . outros métodos para redução de fragmentos de anticorpos da presente invenção incluem a utilização de métodos electrolíticos, como seja o método descrito em Leach et al., 1965, Div. Protein. Chem, 4, 23-27 e usando métodos de foto-redução, como seja o método descrito em Ellison et al., 2000, Biotechniques, 28 (2), 324-326. De preferência, no entanto, o agente redutor para usar na presente invenção é um agente redutor não baseado em tiol capaz de libertar um ou mais tióis num fragmento de anticorpo, de preferência, o agente redutor não baseado em tiol é capaz de libertar os tióis intercadeias num fragmento de anticorpo. Agentes redutores preferidos para usar na presente invenção são agentes redutores trialquilfosfina (Ruegg UT and Rudinger, J., 1977, Methods in Enzymology, 47, 111-126; Bums J et al., 1991, J.Org.Chem, 56, 2648-2650; Getz et al., 1999, Analytical Biochemistry, 273, 73-80; Han and Han, 1994, Analytical Biochemistry, 220, 5-10; Seitz et al., 1999, Euro.J. Nuclear Medicine, 26, 1265-1273), exemplos particulares dos quais incluem tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris butilfosfina (TBP), tris-(2-cianoetil)fosfina, tris-(3-hidroxipropil)fosfina (THP) e tris-(2-hidroxietil) fosfina. Mais de preferência, o agente redutor para usar na presente invenção é TCEP ou THP. Será claro para os familiarizados com a arte que a concentração de agente redutor para usar na presente invenção é TCEP ou THP. Será claro para os familiarizados com a arte que a concentração de agente redutor para usar na presente invenção pode ser determinada empiricamente, por exemplo, através da variação da concentração de agente redutor e medição do número de tióis livres produzidos. Tipicamente, o agente redutor para usar na presente invenção é usado em excesso relativamente ao fragmento de anticorpo, por exemplo um excesso molar entre 2 e 1000 vezes. De preferência, o agente redutor está num excesso molar de 2, 3, 4, 5, 10, 100 ou mais vezes. Numa realização, o agente redutor é usado entre 2 e 5 mM.

Os fragmentos de anticorpo Fab modificados de acordo com a invenção podem ser preparados através da reacção de um fragmento de anticorpo Fab, como aqui descrito, contendo pelo menos um resíduo de cisteína reactivo com uma molécula efectora, de preferência uma molécula efectora activada selectiva para tiol. As reacções nos passo (a) e (b) do método atrás descrito podem, de um modo geral, ser efectuadas num solvente, por exemplo uma solução tampão aquosa como seja de acetato ou fosfato, à volta de pH neutro, por exemplo à volta de pH 4,5 a pH 8,5, tipicamente pH 4,5 a 8, adequadamente pH 6 a 7. A reacção pode, de um modo geral, ser realizada a qualquer temperatura adequada, por exemplo ente cerca de 5°C e cerca de 70°C, por exemplo à temperatura ambiente. O solvente pode facultativamente conter um agente quelante, como seja EDTA, EGTA, CDTA ou DTPA. De preferência, o solvente possui EDTA entre 1 e 5 mM, de preferência 2 mM. Como alternativa, ou adicionalmente, o solvente pode ser um tampão quelante, como seja ácido cítrico, ácido oxálico, ácido fólico, bicina, tricina, tris ou ADA. A molécula efectora, de um modo geral, será empregue numa concentração em excesso relativamente à concentração do fragmento de anticorpo. Tipicamente, a molécula efectora está num excesso molar entre 2 e 100 vezes, de preferência num excesso de 5, 10 ou 50 vezes.

Sempre que necessário, o produto pretendido contendo o número pretendido de moléculas efectoras pode ser separado de quaisquer materiais de partida ou de outros produtos gerados durante o processo de produção através de meios convencionais, por exemplo através de técnicas de cromatografia como sejam permuta iónica, exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade com proteína A, G ou L ou cromatografia de interacção hidrofóbica. É igualmente proporcionada pela invenção uma mistura contendo dois ou mais fragmentos de anticorpo Fab, caracterizados por a mistura estar enriquecida em fragmentos Fab nos quais o domínio constante da cadeia pesada termina na cisteína intercadeias de ChI, as cadeias pesadas nos fragmentos não estão covalentemente ligadas às cadeias leves e os fragmentos possuem uma molécula efectora ligada a uma cisteína na cadeia leve e à região constante da cadeia pesada. A referida mistura pode ser produzida usando os métodos proporcionados pela presente invenção. Por "enriquecido" pretendemos significar que o fragmento Fab do anticorpo com o número pretendido de moléculas efectoras ligadas constitui 50% ou mais da mistura. De preferência, o fragmento de anticorpo Fab com o número pretendido de moléculas efectoras ligadas constitui entre 50 e 99% da mistura. De preferência, as misturas são enriquecidas em mais de 50%, de preferência mais de 60%, mais de preferência mais de 70%. A proporção de tais misturas contendo o fragmento de anticorpo Fab com o número pretendido de moléculas efectoras pode ser determinada usando os métodos HPLC de exclusão por tamanho aqui descritos.

Os fragmentos de anticorpos de acordo com a invenção podem ser úteis na detecção ou tratamento de uma série de doenças ou distúrbios. Tais doenças ou distúrbios podem incluir os descritos com o titulo genérico de doenças infecciosas, e.g. infecção bacteriana; infecção fúngica; doença inflamatória/auto-imunidade, e.g. artrite reumatói-de, osteoartrite, doença inflamatória intestinal; cancro; doença alérgica/atópica e.g. asma, eczema; doença congénita; e.g. fibrose cística, anemia das células falciformes; doença dermatológica e.g. psoríase; doença neurológica, e.g. esclerose múltipla; transplantes, e.g. rejeição de transplantes de órgãos, doença de enxerto versus hospedeiro; e doença metabólica/idiopática, e.g. diabetes.

Os fragmentos de anticorpos de acordo com a invenção podem ser formulados para usar em terapia e/ou diagnóstico e, de acordo com um outro aspecto da invenção, proporcionam uma composição farmacêutica compreendendo um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada termina na cisteína intercadeias de ChI juntamente com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos aceitáveis em termos farmacêuticos. É igualmente proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um fragmento de anticorpo Fab em que a região constante da cadeia pesada termina na cisteína intercadeias de ChI, a cadeia pesada não está ligada covalentemente à cadeia leve e o fragmento possui uma molécula efectora ligada a uma cisteina na região constante da cadeia leve e da cadeia pesada, juntamente com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos aceitáveis em termos farmacêuticos.

EXEMPLOS A presente invenção será agora descrita apenas a título de exemplo, onde é feita referência a:

Figura 1: SDS-PAGE não redutor de Fab gl63 PEGuilado em que a região constante da cadeia pesada termina na cisteina intercadeias de ChI· A pista B mostra Fab gl63 com PEG ligado após redução com TCEP, Pista D mostra Fab gl63 com PEG ligado após redução com THP. Figura 2: Comparação dos agentes redutores THP e TCEP na eficiência de PEGuilação de Fab(B).

Figura 3: SDS-PAGE de Fab murino PEGuilado, ml3.

Figura 4: Farmacocinética de Fab ml3 marcado com 125I-DiPEG(2x20kDa) em murganhos.

Exemplo 1 Criação de vim novo fragmento Fab "truncado" A molécula de anticorpo Fab no Exemplo 2 foi gl63, a qual se liga ao receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas de babuíno (PDGFr). A molécula de anticorpo Fab nos Exemplos 3-6 foi um Fab humano (daqui em diante referido como FAB (B) ) que se liga a uma citocina solúvel. A molécula de anticorpo Fab nos Exemplos 7-8 foi um Fab murino, ml3, que se liga a uma citocina solúvel. Para produzir gl63 e Fab(B), foram projectadas sequências iniciadoras de PCR baseadas na região ChI de IgGl humana e usou-se mutagénese por PCR para inserir um codão de paragem imediatamente a seguir à cisteína intercadeias de ChI. Para produzir ml3, foram projectadas sequências iniciadoras de PCR baseadas na região ChI de IgGl murina e mutagénese por PCR usada para inserir um codão de paragem imediatamente a seguir à cisteína intercadeias de ChI. As sequências das regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada estão mostradas abaixo e na Figura 5:

Regiões constantes de Fab γΐ humana selvagem:

Kappa (Seq ID NO:2)

&RTVAAPSVTSWSDEQLKSÇTASVVC1XNNFYPRBA&VQWKVD&AU}SGNSQES YTEQI>SKI')STYSLSSTiTlJSKAX>YEKilKV'VACBVTiiQGLíSSPVTKi>FKilC‘EC* CHI (Seq ID NO:9)

AMKCiP.SVFH AYSEKM SiYHAALCCLVXDYFPEPYTVSWNYGÀt rSGVHTFPAVL QSSOtAlCLSSiYTWSSSlAlTOTVlCNYKHRPSNTFXBBKVhPK.SúDKTHrCAA^

Regiões constantes de Fab γΐ humana "truncada" usadas em g!63 e Fab(B): kappa (Seq ID NO:2) KR rv AAhSYMFPPSDIiQÍ KSCTASYVOIJLNNFYPRE AKVQWKVDMALQSONSQES YTEQDSKliSIYSLSSTIiTIiíKAôYFKHKA' YACfi VI HQGLSSFVTK5FNRGE£* CHI (SEQ ID NO:1) A S TKGPSVFHAÍ*SSKÉíl SCniAAUltXVKDYFTBPV ΓV S WKSGAL i'SGYHI FPA'VL QSS(jLYSLSSVVTV^SSSLGTQn'tCNtV‘ífltCKJ?S^TKVÍ)KKVEPECÍSC*

Regiões constantes de Fab γΐ murina "truncada" usadas em m!3: kappa (SEQ ID NO:4) daaítvsipppsseqltsggaswc^nnfypkx>in^kwkidgsbrqnovlnswtdq DSKDSn'SMS&TXTLTKXJEViaiMNsrrCBATtiKrSTSm'KSFNRGEe* CHI(SEQ ID NO:3)

KTTPPSVYPLAPCSAAQfTNSMVTLGCLVKGYFPEFV'rVTWNSGSLSSGYHTFPAVL OSDÍATi.,SSSV1^VPSSI\¥PSHl\íTaWAflPASST?vVDKICÍVPR.D(;^

Os resíduos cisteína sublinhados indicam as cisteínas intercadeias às quais as moléculas efectoras podem ser ligadas.

Os fragmentos Fab foram produzidos em E. coli estirpe W3110 e purificados usando métodos convencionais (Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320).

Exemplo 2: PEGuilação de g!63

Todas as reduções e PEGuilações foram realizadas em tampão fosfato 0,1M pH 6,0; 2 mM EDTA. A concentração de Fab foi 5 mg/ml e o agente redutor tinha uma concentração final de 40 mM. Em todos os casos a redução foi realizada à temperatura ambiente (-24°C) durante 30 minutos, as proteínas foram dessalinizadas numa coluna PD-10 (Pharmacia) e depois misturadas com um excesso molar de 5 vezes de PEG 20kDa-maleimida relativamente a Fab. O PEG 20 kDa foi da Nippon Oils and Fats (NOF) . Fab PEGuilado foi separado de Fab não PEGuilado através de HPLC por exclusão de tamanho em colunas analíticas em série Zorbax GF-450 e GF-250. Estas foram tratadas com um gradiente isocrático de 30 min de fosfato 0,2 M, pH 7,0 + 10% etanol a 1 ml/min e Fab foi detectado usando absorvância a 214 nm e 280 nm.

Fab gl63 foi reduzido usando dois agentes redutores não baseados em tiol, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris butilfosfina (TBP) e duas moléculas de PEG 20kDa ligadas às cisteínas intercadeias. Esperava-se que a PEGuilação ocorresse em ambas as cisteínas se a ligação dissulfureto intercadeias fosse reduzida. A PEGuilação de ambos os locais foi confirmada através de SDS-PAGE não redutora (Figura 1) . A pista B corresponde a Fab gl63 truncado com duas moléculas PEG ligadas após redução com TCEP. As duas bandas de alto peso molecular, muito perto uma da outra, à volta de 100 kDa são compostas por cadeias pesada e leve com uma molécula PEG ligada. A banda inferior à volta de 45 kDa é uma pequena quantidade de Fab não modificada sem PEG ligado. A banda mais baixa à volta de 25 kDa não tem cadeias pesadas e leves. A pista D é o mesmo fragmento reduzido usando TBP que é menos compatível com tampões aquosos e proteínas. A percentagem do Fab gl63 truncado a ser diPEGuilada usando TCEP e TBP como agentes redutores foi 76% e 21% respectivamente, conforme determinado por HPLC. TCEP é portanto um agente redutor útil para a produção dos fragmentos de anticorpos modificados da presente invenção.

Exemplo 3: Comparação da eficiência de PEGuilação de Fab(B) usando os agentes redutores TCEP e THP

Neste exemplo, as reduções e PEGuilações foram conduzidas em 50 mM MPS, 2 mM EDTA, pH 6,8. A redução de Fab (B) (20 mg/ml) foi realizada usando os agentes redutores TCEP ou THP a 10 mM, durante 1 hr à temperatura ambiente. O agente redutor foi removido em colunas de remoção do sal PD10 (Pharmacia) com um corte restringente para prevenir contaminação do agente redutor. A PEGuilação foi conduzida usando um excesso molar de 3 vezes de PEG 20 kDa-maleimida relativamente a Fab, durante a noite à temperatura ambiente. A Figura 2 mostra que THP é também um agente redutor útil para ligação de PEG aos fragmentos de anticorpo da presente invenção.

Exemplo 4: Di-Peguilação de um Fab murino, m!3.

As cisteínas intercadeias de um Fab murino truncado, ml3, foram PEGuiladas usando PEG linear de 20 kDa. As reduções e PEGuilações foram realizadas em 50mM

Tris.HCl 5mM EDTA pH 7,14 com Fab a 20,06mg/ml, lOmM TCEP (final) e excesso molar de 4 vezes de PEG linear de 20kDa, temperatura ambiente. A PEGuilação de ambos os locais foi confirmada por SDS-PAGE (Figure 3) . Pista 1, ml3 diPeguilado (não reduzido); Pista 2, ml3 diPeguilado reduzido; Pista 3, ml3 não reduzido (sem PEG); Pista 4, ml3 reduzido (sem PEG).

Exemplo 5: Farmacocinética de Fab m!3-PEG (2x20kDa) em murganhos

Determinou-se a semivida em circulação de ml3Fab PEGuilado em ambos os polipéptidos (como no Exemplo 4) em animais. Moléculas de Fab PEGuiladas marcadas com 125I foram injectadas subcutaneamente ou intravenosamente em murganhos e determinada a sua permanência no soro.

Os murganhos foram injectados subcutaneamente na parte superior do pescoço ou intravenosamente na veia da cauda sob anestesia ligeira. 0 volume de injecção foi de 100 μΐ por murganho que foi equivalente a 13 yg de proteína e 1,2 yCi de dose de isótopo (actividade específica (0,1 yCi/yg). 4 murganhos foram sangrados por punção cardíaca m cada ponto de tempo. O sangue heparinizado foi colhido para tubos pré-pesados. O peso do sangue foi determinado antes da contagem da radioactividade num contador gama. Pontos de tempo estudados: iv; 0,5, 2, 4, 6, 24, 48, 72 e 144 h pós-injecção. sc; 3, 6, 24, 30, 48, 72 e 144 h pós-injecção.

Os resultados na Tabela 1 e na Figura 4 mostram que, apesar das cadeias pesada e leve em Fab PEGuilado estarem associadas não covalentemente, a semivida em circulação é superior à de Fab Não PEGuilado (t^p ~ 30 minutos) e à de LC ou HC livre que é provavelmente ainda mais curta.

Lisboa, 1 de dezembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um fragmento de anticorpo Fab caracterizado por a região constante da cadeia pesada terminar na cisteina intercadeias de ChI · 2. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivin dicação 1, em que a cisteina intercadeias de ChI está ligada covalentemente à cisteina intercadeias de Cl. 3. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, em que a cisteina intercadeias de ChI está na posição 233 da cadeia pesada. 4. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, em que a cisteina intercadeias de ChI está na posição 127 da cadeia pesada. 5. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivin dicação 1 ou da reivindicação 2, em que a cisteina intercadeias de ChI está na posição 128 da cadeia pesada. 6. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivin dicação 1 ou da reivindicação 2, em que a cisteina intercadeias de ChI está na posição 253 da cadeia pesada. 7. 0 fragmento de anticorpo Fab das reivin- dicações 1-5, em que a cisteína intercadeias da região constante da cadeia leve está na posição 214 da cadeia leve. 8. 0 fragmento de anticorpo Fab das reivin dicações 1-3, em que a região constante da cadeia pesada consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:l.
9. O fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 8, em que a região constante da cadeia leve consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:2.
10. O fragmento de anticorpo Fab das reivindicações 1, 2 e 6, em que a região constante da cadeia pesada consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:3.
11. O fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 10, em que a região constante da cadeia leve consiste numa sequência tendo pelo menos 90% de identidade ou similaridade com a sequência apresentada em SEQ ID NO:4.
12. O fragmento de anticorpo Fab das reivindicações 1 a 11 ao qual uma ou mais moléculas efectoras estão ligadas. 13. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivin dicação 12 ao qual duas ou mais moléculas efectoras estão ligadas. 14. 0 fragmento de anticorpo da reivindicação 13, em que uma molécula efectora está ligada a uma cisteina na região constante da cadeia leve e a uma cisteina na região constante da cadeia pesada. 15. 0 fragmento de anticorpo da reivindicação 14, em que os resíduos de cisteina nas regiões constantes da cadeia pesada e leve estão ligados a moléculas efectoras que de outra forma estariam ligadas uma à outra através de uma ligação dissulfureto se as moléculas efectoras não estivessem ligadas. 16. 0 fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 15, em que a cisteina da cadeia leve à qual uma molécula efectora está ligada é a cisteina intercadeias de Cl e a cisteina da cadeia pesada à qual uma molécula efectora está ligada é a cisteina intercadeias de ChI · 17. 0 fragmento de anticorpo Fab das reivin dicações 12-16, em que a molécula efectora é PEG.
18. Um método da produção de um anticorpo Fab de acordo com as reivindicações 12-17 compreendendo: a. Tratamento de um fragmento de anticorpo Fab de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 com um agente redutor capaz de gerar um grupo tiol livre numa cisteina da região constante da cadeia pesada e da cadeia leve b. Reacção do fragmento tratado com uma molécula efectora.
19. O método de acordo com a reivindicação 18, em que o agente redutor é um redutor não baseado em tiol.
20. O método de acordo com a reivindicação 19, em que o redutor é um trialquilfosfina.
21. O método de acordo com a reivindicação 20, em que o redutor não baseado em tiol é tris(2-carboxi-etil)fosfina (TCEP).
22. O método de acordo com a reivindicação 20, em que o redutor não baseado em tiol é tris (3-hidroxipro-pil)fosfina (THP).
23. O método de acordo com a reivindicação 18, em que um ou ambos os passos (a) e (b) são realizados na presença de um agente quelante. 24. 0 método de acordo com a reivindicação 23, em que o agente quelante é EDTA. 25. 0 método de acordo com a reivindicação 24, em que ambos os passos (a) e (b) são realizados na presença de EDTA.
26. Uma mistura contendo dois ou mais fragmentos de anticorpo Fab, caracterizada por a mistura estar enriquecida em fragmentos Fab em que o dominio ChI termina na cisteina intercadeias, as cadeias pesadas nos fragmentos não estarem ligadas às cadeias leves e os fragmentos possuírem uma molécula efectora ligada a uma cisteina na cadeia leve e na região constante da cadeia pesada.
27. A mistura da reivindicação 26, em que mais de 50% da mistura compreende um fragmento Fab em que o domínio ChI termina na cisteina intercadeias, as cadeias pesadas nos fragmentos não estão ligadas covalentemente às cadeias leves e os fragmentos possuem uma molécula efectora ligada a uma cisteina na região constante da cadeia leve e da cadeia pesada.
28. Uma sequência de DNA isolada codificadora das regiões constantes da cadeia pesada e/ou leve de um fragmento de anticorpo Fab de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-11.
29. Um vector de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA de acordo com a reivindicação 28.
30. O vector de acordo com a reivindicação 29, em que o vector compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO:5.
31. O vector de acordo com a reivindicação 30 compreendendo ainda a sequência apresentada em SEQ ID NO:6.
32. O vector de acordo com a reivindicação 29, em que o vector compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO:7.
33. O vector de acordo com a reivindicação 32 compreendendo ainda a sequência apresentada em SEQ ID NO:8.
34. Uma célula hospedeira que expressa o fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11.
35. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 34 compreendendo um ou mais vectores de clonagem ou expressão de acordo com as reivindicações 29-33.
36. Um processo para a produção do fragmento de anticorpo Fab da reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 34 e isolamento do referido fragmento.
37. Uma composição farmacêutica compreendendo um fragmento de anticorpo Fab de acordo com as reivindicações 1-17 e 26-27, juntamente com um ou mais excipientes, diluentes ou veiculos aceitáveis em termos farmacêuticos. Lisboa, 1 de dezembro de 2015