ES2967272T3 - Expresión de miARNs en tejido placentario - Google Patents

Abstract

Se proporcionan miARN humanos asociados con la generación de tolerancia inmunológica durante el embarazo así como fragmentos, derivados y variantes de los mismos para su uso en inmunomodulación. Dichos miARN se pueden usar en el diagnóstico y tratamiento de trastornos asociados con una respuesta inmune desregulada, trastornos autoinmunes, enfermedades asociadas al embarazo, fallas o problemas de placentación y complicaciones resultantes de alotrasplantes. Además, se describen nuevas composiciones farmacéuticas y de diagnóstico para su uso en el diagnóstico y terapia de dichos trastornos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión de miARNs en tejido placentario

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a Exosomas que comprenden miARNs humanos como se caracterizan en las reivindicaciones para uso en la modulación del sistema inmune materno para tratar trastornos relacionados con un sistema inmune mal regulado tales como enfermedades asociadas al embarazo, fallas o problemas de placentación. Antecedentes de la invención

Para un embarazo exitoso, es necesaria la modulación del sistema inmune materno. Se sabe que la parte embrionaria/fetal de la placenta y en particular su trofoblasto es capaz de producir factores que pueden prevenir el rechazo del embrión al interactuar con el sistema inmune materno localmente, es decir, dentro de la decidua, así como en la periferia. Sin embargo, la inmunomodulación debe estar funcionando de forma eficaz durante las etapas tempranas del embarazo. En el primer trimestre del embarazo, no menos del 30-40% de la decidua está formada por células inmunes maternas, la mayoría de las cuales (alrededor del 70%) son células NK, pero se sabe que también se encuentran macrófagos y células T en porcentajes considerables (Warning et al., 2011).

Si bien se conocen algunos de estos factores que median la inmunomodulación, otros aún quedan por ser identificados. La capacidad de modular el sistema inmune materno no se limita al trofoblasto, sino que las células del estroma fetal también son capaces de ejecutar una comunicación-cruzada eficiente con las células del sistema inmune materno (Roelen et al., 2009). Los experimentos dirigidos a la identificación de los mecanismos responsables de la modulación del sistema inmune materno parecen indicar que tanto los factores solubles como las partículas juegan un papel importante en este proceso. Entre estos últimos se encuentran los exosomas, es decir, pequeñas vesículas de membrana que pueden liberarse de una variedad de tipos celulares y contienen una carga diversa que consiste en proteínas, lípidos, así como ARNm y microARNs (Valadi et al., 2007). WO 2011127625 A1 describe un método para la obtención de exosomas y su uso para modular el contenido de miARN en los seres vivos. US 2010/0151480 A1 describe el aislamiento de exosomas y su uso con fines de diagnóstico. Durante el embarazo, las células del trofoblasto pueden secretar exosomas que parecen suprimir el sistema inmune materno (Southcombe et al., 2011). Sin embargo, no se sabe cómo se consigue realmente esta supresión y qué factores influyen exactamente en la misma. La identificación de tales factores proporcionaría nuevos medios para estrategias terapéuticas y diagnósticas dentro del campo de los trastornos o complicaciones asociados al embarazo y podría ser útil también en el tratamiento de varias enfermedades asociadas con un sistema inmune desregulado o hiperactivo.

Este problema técnico se ha resuelto mediante las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones y se describen más adelante.

Sumario de la invención

En la presente, se presentan datos que sorprendentemente señalan una función temprana de los miARNs C19MC en el embarazo temprano y en las células del estroma placentario. Estos datos implican que los miARNs del C19MC, así como del agrupamiento miR-371-3 son inmunomoduladores importantes. Los genes que codifican para ambos agrupamientos se han asignado en proximidad cercana entre sí en el brazo largo del cromosoma 19 (Fig. 1). Con respecto a los datos proporcionados en la presente, la presente invención se refiere generalmente a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Esquema de la región cromosómica 19q13 con los dos agrupamientos de microARN C19MC y miR-371-3 Figura 2: Expresión relativa del miARN miR-520c-3p en 52 tejidos de placenta en relación con la semana de gestación. Figura 3: Microdisección de vellosidades coriónicas. De las vellosidades coriónicas (A), primero se extirpó el núcleo estromal (B) y luego la capa del trofoblasto (C).

Figura 4: Expresión relativa de miARNs: miR-371-3p, miR-372, miR-373 y miR-520c-3p en células estromales y trofoblásticas.

Figura 5: Expresión relativa de miR-520c-3p y miR-517a-3p en células de la decidua y del trofoblasto.

Figura 6: Esquema que ilustra los miARNs dirigidos a transcritos de genes que actúan como inhibidores de la apoptosis inducida por Fas -FasL. Las dianas se han identificado de acuerdo con miRBase (Versión 18).

Figura 7: Proliferación celular medida mediante el ensayo BrdU en PBMCs cocultivadas con células JEG-3 y bAMCs a las 96h y 120h, respectivamente.

Figura 8: Proliferación celular medida mediante ensayo BrdU en PBMCs solas, en reacciones mixtas de linfocitos y estimuladas con Con A, a las 96h y 120h, respectivamente.

Figura 9: Localización genómica de BC280723.

Figura 10: Expresión relativa de miR-517a-3p en células derivadas de la membrana amniótica bovina transfectadas con un vector BAC que codifica para C19MC en comparación con células transfectadas simuladas a las 24h, 48h y 6d después de la transfección. Para las 24h y 6d la transfección se realizó por duplicado.

Figura 11: (A) Expresión relativa de miR-520c-3p en células HCT-116 y JEG-3 (para una descripción de RT-PCR cuantitativa, véase el Ejemplo 1). (B) Expresión relativa de c-FLIP en células Jurkat tratadas con sobrenadantes de células JEG-3 y células HCT-116, respectivamente.

Descripción detallada

Mientras que el agrupamiento miR-371-373 (371-3) contiene solamente siete microARNs, C19MC es el agrupamiento de miARN humano más grande conocido actualmente con aproximadamente 60 miARNs diferentes (Tabla 1). Se ha reportado que los miembros de C19MC se expresan abundantemente en el trofoblasto, pero no en la parte estromal de la placenta y que tienen una mayor expresión durante el embarazo (Luo et al., 2009). Con respecto a la expresión del agrupamiento miR371-373 en la placenta, no se conocen aún los detalles.

Sin embargo, los microARNs de ambos agrupamientos no se han discutido aún como candidatos que puedan modular al sistema inmune materno. De la literatura existente surgen fuertes argumentos que hablan en contra de su implicación en la inmunomodulación materna. En primer lugar, la expresión de los miembros del agrupamiento C19MC parece estar confinada al trofoblasto (Luo et al., 2009), pero también se ha descrito que las células del estroma de la placenta tienen funciones inmunosupresoras (Roelen et al., 2009). En segundo lugar, el aumento de la expresión de los miembros miARN del agrupamiento C19MC (Luo et al., 2009) lleva a la conclusión de que estos miARNs tienen funciones más bien relacionadas con las etapas tardías del embarazo.

Sin embargo, los datos presentados dentro la presente invención señalan, en contraste con lo anterior, una función temprana de los miARNs C19MC en el embarazo temprano y en las células del estroma placentario (véase Ejemplos 1 al 4). Con respecto a estos resultados experimentales que se describen en detalle más adelante, los miARNs del C19MC, así como del agrupamiento miR-371-3 se proporcionan aquí como moduladores importantes del sistema inmune materno. En particular, la presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Debido a la capacidad de un único miARN para interactuar con más de una diana, así como debido a la variedad de diferentes miARNs en el miR-371-3 y -en una medida aún mucho mayor- en el agrupamiento C19MC, las funciones inmunomoduladoras de los miARNs pueden basarse en una variedad de mecanismos. Solamente como ejemplo, sin desear estar limitado por la teoría, en el Ejemplo 8 se han representado funciones pro-apoptóticas que muestran que los miembros del agrupamiento C19MC interactúan con diferentes ARNm que antagonizan la apoptosis inducida por Fas-FasL. Sin embargo, otros mecanismos relevantes, incluida la inducción de la senescencia celular, así como la detención del ciclo celular reversible y anergia también pueden afectarse por los miARNs. Por lo tanto, en cuanto a las implicaciones terapéuticas de estos hallazgos, en una realización de la presente invención se utilizan miARNs únicos del agrupamiento C19MC, así como sus diferentes combinaciones, para cumplir el propósito terapéutico previsto, tal como se caracteriza en las reivindicaciones.

Tabla 1: MicroARNs del agrupamiento C19MC y miR371-3 asignados a la banda cromosómica 19q13 (cf. Fig. 1). Números ID de acuerdo con las entradas de miRBase Versión 18 (Noviembre 2011); véase también Bentwich et al., Nat Genet. 37 (2005), 766-770 y Landgraf et al., Cell 129 (2007), 1401-1414. Las secuencias de los precursores de los miARNs alistados en la tabla se pueden obtener a partir de las entradas de la miRBase de los respectivos miARNs.

Sobre la base de estos datos experimentales, la presente divulgación se refiere generalmente a exosomas que comprenden miARNs para uso en inmunomodulación, en el que el miARN se selecciona de los miARNs codificados por una cualquiera de las unidades de transcripción comprendidas en el agolpamiento C19MC como se alista en la Tabla 1 anterior y como se especifica detalladamente en las reivindicaciones.

Los microARNs mencionados anteriormente se seleccionan del grupo que consiste en: hsa-miR-517-5p, hsa-miR-517a-3p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-517c-3p, que tienen las SEQ ID Nos.: 10 a 13.

La secuencia semilla es esencial para la unión del miARN al ARNm. La "secuencia semilla" o "región semilla", como se refiere en la presente invención, es una secuencia heptamétrica conservada que está situada principalmente en las posiciones 2-7 del extremo 5' del miARN. Aunque el emparejamiento de bases del miARN y su ARNm diana no coincide perfectamente, la "secuencia semilla" tiene que ser perfectamente complementaria. Por lo tanto, los descritos en la presente también son miARNs que tienen secuencias semillas comunes con miARNs codificados a partir del agrupamiento C19MC o miR-371-3, en el que el microARN:

a.) se selecciona del grupo que consiste en hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302a-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302b5p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302c-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-302d-5p que tienen las SEQ ID Nos: 67 a 78; y/o

b.) se caracteriza por la secuencia semilla consenso AAGTGC.

miARNs y sus precursores del grupo mencionado anteriormente que consiste en hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302a-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302b-5p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302c-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-302d-5p están codificados a partir del agrupamiento miR302-367, sus secuencias y números de acceso se alistan en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2: miARNs y sus precursores del agrupamiento miR302-367 con la secuencia semilla AAGTGC común con las secuencias semilla de miARNs codificados a partir del agrupamiento C19MC o miR-371-3; véase también Landgraf et al., Cell 129 (2007), 1401-1414 y Suh et al., Dev Biol. 270 (2004), 488-498

Como se explica con más detalle más adelante, los miARNs se producen en la célula a partir de transcritos primarios más largos, moléculas precursoras de ARN, las cuales pueden comprender la secuencia de varios miARNs maduros (Kim, Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 6 (2005), 376-385). Por lo tanto, en la presente también se describe un precursor de miARN que comprende la secuencia de ácido nucleico del miARN como se definió anteriormente en la presente para su uso en inmunomodulación. Las secuencias de los respectivos precursores de miARN de los miARNs indicados en las Tablas 1 y 2 pueden, si no se indica ya en la presente, obtenerse de las respectivas entradas en la miRBase.

Los miARN regulan la expresión génica uniéndose al ARNm de genes diana. Se sabe en la técnica que esta región también puede ser la diana de otras moléculas de unión, para lograr el efecto regulatorio inducido en el caso normal por el miARN, tal como imitadores de miARN sintético, moléculas de ARN, anticuerpos, aptámeros y espejómeros

En la presente también se describe un ácido nucleico de doble-hebra que comprende la secuencia de ácido nucleico del miARN, o precursor de miARN o de la molécula de unión como se define anteriormente en la presente.

Además, en la presente también se describe uno o más de los ácidos nucleicos de doble-hebra definidos anteriormente de una secuencia como se define anteriormente, en el que el miARN, precursor de miARN y/u otras moléculas de unión que codifican para secuencias de nucleótidos están operativamente unidos a al menos una secuencia de control de la expresión. Ejemplos de dichas secuencias de control de la expresión son secuencias de promotor, operador, potenciador, silenciador, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación y otras secuencias de ácidos nucleicos conocidas en la técnica que pueden utilizarse para la expresión de miARN, precursor de miARN y/u otras moléculas de unión descritas en la presente.

Dichas secuencias de control de la expresión pueden mejorar o regular negativamente los niveles de expresión del miARN que codifica para las secuencias de nucleótidos operativamente unidas. Se pueden utilizar una o varias secuencias de control de expresión en combinación entre sí y/o en combinación con uno o más de los miARN, precursor de miARN y/u otras moléculas de unión descritas en la presente que codifican para ácidos nucleicos de doble-hebra (secuencias de nucleótidos) como se describen en la presente dependiendo del tipo de célula (por ejemplo, procariotas o eucariotas) u organismo utilizado para la expresión del miARN, precursor de miARN y/u otras moléculas de unión que codifican para secuencias de nucleótidos. Las secuencias reguladoras de la expresión también pueden elegirse con respecto al tiempo (es decir, etapa del desarrollo), tipo de célula y/o circunstancias generales, por ejemplo, la presencia y/o ausencia de una o más sustancias específicas, en el que el miARN y/o la molécula precursora de miARN codificada por las secuencias de nucleótidos como se describe anteriormente se expresan cuando dichas secuencias reguladoras unidas operativamente al polipéptido y/o péptido que codifica para secuencias de nucleótidos permiten su expresión porque una o más de las condiciones mencionadas se cumplen o no se expresan, cuando no se cumplen las circunstancias que permiten la expresión.

Las secuencias de control de la expresión utilizadas pueden originarse del mismo organismo que el miARN, precursor de miARN y/u otras moléculas de unión que codifican para secuencias de nucleótidos como se define anteriormente o pueden ser externas, es decir, se originan de otro organismo en el sentido de una taxonomía o filogenia diferente. En la presente también se describe una molécula de ácido nucleico que comprende el polipéptido y/o péptido que codifica para secuencias de nucleótidos, en el que al menos una secuencia de control de la expresión es externa al polipéptido y/o péptido que codifica para las secuencias de nucleótidos.

El polinucleótido que codifica para el miARN, precursor de miARN y/u otras moléculas de unión descritos anteriormente puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN o ADN o ARN producido sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérica producida recombinantemente que comprende cualquiera de estos polinucleótidos ya sea solos o en combinación. Preferiblemente, los polinucleótidos están unidos operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los detalles que describen la expresión de los polinucleótidos se describirán más adelante en esta descripción.

En este respecto, en la presente se describe un vector que comprende el ácido nucleico de doble-hebra como se define anteriormente. Además, en la presente se describe una célula hospedera que comprende el vector. La célula hospedera tal como se define anteriormente y a continuación es preferiblemente una célula humana, preferiblemente en el que la célula se selecciona del grupo de células autólogas del paciente.

En la presente también se describe una composición farmacéutica o un agente de diagnóstico comprendiendo como un agente al menos un miARN, el precursor de miARN, la molécula de unión, el ácido nucleico de doble-hebra, el vector y/o la célula hospedera como se define anteriormente y a continuación.

De acuerdo con la invención, el agente activo está embebido en exosomas artificiales (véase también el Ejemplo 4).

La presente invención proporciona los exosomas que comprenden el miARN como se define anteriormente para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada al embarazo.

En una realización del uso en el tratamiento de una enfermedad asociada al embarazo como se define anteriormente, la enfermedad asociada al embarazo se selecciona del grupo de enfermedades que consiste en eclampsia, pre eclampsia, síndrome-HELLP y fallo o problemas de placentación o implantación. En la técnica se sabe que la eclampsia, la pre-eclampsia y el síndrome-HELLP están asociados con disfunción placentaria; véase, por ejemplo, Benedetto et al., Adv Clin Chem 53 (2011), 85-104.

La divulgación proporciona los exosomas que comprenden el miARN, como se define anteriormente y a continuación para uso en el tratamiento ex vivo y/o in vivo de células o tejidos atacados por enfermedades autoinmunes.

Los exosomas que comprenden el miARN como se define anteriormente pueden aplicarse en diferentes formas como se conoce en la técnica y pueden diseñarse para diferentes formas de administración. En una realización de la presente invención, los exosomas que comprenden el miARN, como se define anteriormente, están diseñados para administración local. Sin embargo, en otra realización, están diseñados para administración sistémica.

En la presente también se describen métodos y materiales novedosos para obtener, generar, aislar y/o purificar exosomas de muestras biológicas tales como células, tejido, sangre, aspirado, líquido amniótico y sobrenadantes de, por ejemplo, células o cultivos de células. En la técnica se conocen métodos generales para el aislamiento y purificación de exosomas y su contenido, tal y como miARNs. Además, de forma análoga o alternativa a los métodos mencionados en la sección "Exosomas" más adelante y descritos en WO99/03499, WO00/44389 y WO97/05900, por ejemplo, los exosomas pueden aislarse de muestras biológicas mediante ultracentrifugación y su contenido, es decir, miARNs pueden purificarse con el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante e identificarse después de la transcripción reversa a ADNc mediante PCR utilizando cebadores de miARN específicos como se describe en las subsecciones "Aislamiento de exosomas" y "Extracción de ARN y transcripción reversa" en las páginas 4 a 5 de Gallo et al. (2012), PLoS One.;7(3):e30679. La cuantificación de miARN se puede realizar como se describe en la subsección "cuantificación de miARN" en la página 5 de Gallo et al. (2012). Alternativamente, los miARNs se pueden aislar mediante Kits de Aislamiento de ARN de Exosomas ofrecidos por varios fabricantes, tales como Norgen Biotek Corp (Thorold, CANADÁ), por ejemplo, el Kit de Aislamiento de ARN de Exosomas en Orina de Norgen (Norgen; Cat. No. 47200) para el aislamiento y enriquecimiento de exosomas a partir de medios de cultivo de orina y tejidos, o el Kit de Aislamiento de ARN de Exosomas en Plasma/Suero (Norgen; Cat. No. 49200) para el aislamiento y enriquecimiento de ARN exosomal a partir de plasma, suero y líquido ascítico de acuerdo con el manual del proveedor. Además, los exosomas se pueden aislar en lugar de ultracentrifugación mediante el uso de kits adicionales, como ExoQuick-TC™ de Gentaur (Kampenhout, Bélgica) de acuerdo con el manual del proveedor.

Estas muestras enriquecidas se pueden utilizar para determinar la presencia o ausencia de tipos particulares de exosomas o para determinar la cantidad de tipos particulares de exosomas presentes dentro de un mamífero (por ejemplo, un humano). La presencia o cantidad de tipos particulares de productos de expresión distintos, tal y como miARNs dentro de una muestra que comprende exosomas, puede indicar que el mamífero tiene una enfermedad o trastorno particular. Como se indicó anteriormente, para un embarazo exitoso, es necesaria la modulación del sistema inmune materno. Los resultados experimentales que se describen en detalle más adelante indican que los miARNs específicos, tal y como los miARNs del C19MC, así como los del agrupamiento miR-371-3, son moduladores muy importantes del sistema inmune materno. La presencia o cantidad de tipos particulares de estos miARNs dentro de una muestra que comprende exosomas puede utilizarse así para la estimación de la capacidad del embrión para implantarse o de una muestra de esperma para fertilizar si los exosomas se aislaron de un sobrenadante del medio de cultivo celular de blastocistos o embriones. Por lo tanto, en la presente también se describe un método para obtener exosomas para uso en inmunomodulación que comprende el aislamiento y purificación de exosomas de un sobrenadante de cultivos celulares de células embrionarias o fetales que expresan miARNs del agrupamiento C19MC, el agrupamiento miR-371-373 y/o el agrupamiento miR302-367 como se definen anteriormente y a continuación y como se alista en las Tablas 1 y 2 anteriores.

Mediante los métodos descritos en la presente, los exosomas se pueden aislar de cultivos celulares de diferentes tipos de células, incluidos tipos de células asociadas con la implantación embrionaria y desarrollo. Los métodos de aislamiento, purificación y cultivo de células del cordón umbilical, amnióticas, placentarias y coriónicas a partir de una muestra biológica son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en solicitudes internacionales WO2005/001081, WO 2000/073421, WO2002/046373 y WO2003/042405 y puede utilizarse para obtener cultivos celulares de interés para el aislamiento de exosomas. Por ejemplo, los cultivos de células pueden seleccionarse del grupo de células que comprende células del cordón umbilical, la membrana amniótica, la placenta y la membrana coriónica.

Además, en la presente también se describe un método para obtener exosomas para uso en inmunomodulación a partir de una muestra biológica que comprende los pasos de establecer un cultivo de células a partir de la muestra biológica, recolectar el sobrenadante del cultivo de células y aislar y purificar los exosomas del mismo.

Las muestras biológicas para obtener exosomas pueden aislarse de células, cultivos de células, tejidos, pacientes animales o humanos con los mismos antecedentes genéticos que los previstos para el tratamiento inmunomodulador con los exosomas obtenidos o su contenido, o de células, cultivos de células, tejidos, organismo, paciente animal o humano con antecedentes genéticos diferentes que los previstos para el tratamiento. En este respecto, en la presente también se describe el método para obtener exosomas para uso en inmunomodulación a partir de una muestra biológica, en el que la muestra biológica comprende células autólogas, muestra de tejido o aspirado. Además, en la presente se describe el método para obtener exosomas para uso en inmunomodulación a partir de una muestra biológica, en el que la muestra biológica comprende células alogénicas, muestra de tejido o aspirado.

En la presente se describe además un método para la generación in vitro de exosomas que comprenden miARNs, moléculas de unión y/o ácidos nucleicos de doble-hebra como se definen anteriormente y a continuación y exosomas obtenidos de acuerdo con los métodos antes mencionados para uso en inmunomodulación. También se conocen en la técnica métodos para producir exosomas artificiales. Dichos exosomas artificiales pueden derivarse de liposomas recubiertos como se describe en De La Peña et al., J. Immunol. Methods. 344 (2009), 121-132.

Los exosomas obtenidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente se pueden utilizar en inmunomodulación en pacientes que padecen varias enfermedades y tipos de enfermedades. Los exosomas obtenidos de acuerdo con los métodos antes mencionados se proporcionan para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

En lo que respecta al tratamiento de una enfermedad particular, los exosomas pueden administrarse por distintas vías de administración dependiendo de la intención, ya sea que el efecto sea local (en administración "tópica") o sistémico (en administración "enteral" o "parenteral") y pueden formularse de acuerdo con los requisitos específicos de la vía de administración. Por lo tanto, en un caso, los exosomas obtenidos de acuerdo con los métodos antes mencionados se proporcionan preparados para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediante administración local. En otro caso, los exosomas preparados para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune se administran mediante inyección conjunta, preferiblemente inyección intra-articular o aplicación intra-nasal. En un caso adicional, los exosomas obtenidos de acuerdo con los métodos antes mencionados se preparan para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediante administración sistémica.

Previo al aislamiento de los exosomas, las células, tejidos, órganos o animales de los que se aíslan los exosomas pueden ser modificados genéticamente para expresar o sobreexpresar miARNs específicos tales como los miARNs antes mencionados y/o pueden exponerse a uno o más agentes, tales como Azacitidina (5-Aza-2'-desoxicitidina) u otros agentes desmetilantes del ADN, que también son capaces de mejorar la capacidad de las células para secretar exosomas (véase, por ejemplo, Xiao et al., (2010) "Effect of 5-aza-2'-deoxycytidine on immune-associated proteins in exosomes from hepatoma.". World J Gastroenterol. 16, 2371-2377.). La exposición a dichos agentes se puede realizar como se describe para Azacitidina en la página 2372 en la subsección "Cultivo celular" de la sección "Materiales y métodos" de Xiao et al., (2010).

Por lo tanto, lo descrito en la presente es también el uso de Azacitidina u otros agentes desmetilantes del ADN para el tratamiento de cultivos celulares en los métodos antes mencionados para la obtención o generación de exosomas para mejorar la capacidad de las células para secretar exosomas.

Además, en la presente también se describe Azacitidina u otros agentes desmetilantes del ADN para su uso en el tratamiento de tejidos in vivo para mejorar su capacidad de secretar exosomas mejorados para los miARNs del agrupamiento C19MC, miR-371-373 y/o miR302-367 como se definió anteriormente y a continuación y alistado en las Tablas 1 y 2.

Como se indicó anteriormente, la presencia o cantidad de tipos particulares de estos miARNs dentro de una muestra que comprende exosomas se puede utilizar para la estimación de la capacidad del embrión para implantarse. En este respecto, por ejemplo, se puede aislar un sobrenadante del medio de cultivo celular respectivo y analizarse para determinar la presencia y cantidad de miARNs de los agrupamientos miR-371-3 y C19MC como se define en la Tabla 1 anteriormente. Los resultados de este análisis se pueden utilizar para estimar la probabilidad de implantación de un embrión.

Definiciones y realizaciones:

Cabe señalar que el término "un" o "uno, una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un polipéptido" representa uno o más polipéptidos. Como tal, los términos "un" (o "uno, una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden utilizarse indistintamente en la presente.

A menos que se indique lo contrario, los términos "trastorno" y "enfermedad" se utilizan indistintamente en la presente.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para quien se desea diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.

Los términos "microARN" (miARN) como se utilizan en la presente invención se refieren a ARNs codificantes noproteicos, los cuales pueden comprender 13-35, 18-25 o 21-24 nucleótidos, generalmente de entre alrededor de 19 a alrededor de 25 nucleótidos, preferiblemente de alrededor de 22 nucleótidos como la mayoría de los miARNs que ocurren naturalmente, que guían la escisión en trans de los transcritos diana, regulando negativamente la expresión de genes implicados en diversas vías de regulación y desarrollo (Bartel DP, Cell 116 (2004), 281-297; He and Hannon, Nat. Rev. Genet. 5 (2004), 522-531; Lagos-Quintana et al., Science 294 (2001), 853-858; Ambros V., Cell, 113 (2003), 673-676). Las bases 2-8 del miARN maduro se definen en la presente como la "secuencia semilla de miARN". La complementariedad completa de 6 a 8 pb entre la secuencia diana de ARN y la secuencia semilla de miARN es un determinante importante del reconocimiento de la diana de miARN. Younger and Corey, Nucleic Acids Res. 39 (2011), 5682-5691. Los requisitos de secuencia para la unión del miARN maduro a un sitio de reconocimiento y los métodos para predecir la unión de miARN a una secuencia determinada se discuten, por ejemplo, en Lewis et al., Cell 115 (2003), 787-798.; John et al., PLoS Biol 2(11): e363 (2004)

Algunos genes de miARN (genes MIR) se han identificado y se han puesto a disposición del público en una base de datos ('miRBase", disponible en línea en microrna.sanger.ac.uk/ sequences). También se describen genes MIR adicionales y miARNs maduros en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 2005/0120415. Se ha reportado que los genes MIR se encuentran en regiones inter-génicas, tanto aislados como en agolpamientos en el genoma, pero también pueden ubicarse total o parcialmente dentro de intrones de otros genes (tanto codificantes para proteínas como no-codificantes para proteínas; Saini et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (2007), 17719-17724). Para una revisión reciente de la biogénesis de miARN, véase Kim VN., Nature Rev. Cell Biol. 6 (2005), 376-385. La transcripción de genes MIR puede estar, al menos en algunos casos, bajo el control del promotor del propio promotor de un gen MIR. La transcripción probablemente esté generalmente mediada por la ARN polimerasa II entonces (Lee et al., Embo J 23 (2004), 4051-4060). El transcrito primario (el cual puede ser policistrónico) se denomina "pri-miARN", una molécula precursora de miARN que puede ser bastante grande (varias kilobases) y contiene una o más regiones locales de doble-hebra u "horquilla", además de la habitual "tapa" 5' y cola poliadenilada de un ARNm. Véase, por ejemplo, la FIG. 1 en Kim, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6 (2005), 376-385.

Se cree que este pri-miARN es "recortado" por la RNasa nuclear III Drosha para producir una molécula precursora de miARN más corta (~70 nucleótidos) conocida como un "pre-miARN". Después del procesamiento nuclear de Drosha, los pre-miARNs se exportan al núcleo donde la enzima Dicer genera los miARNs cortos y maduros. Véase, por ejemplo, Lee et al. E<m>B<o>Journal 21 (2002), 4663-4670; Reinhart et al., Genes & Dev., 16 (2002):1616-1626; Lund et al., Science 303 (2004), 95-98; y Millar and Waterhouse, Funct. Integr Genomics 5 (2005), 129-135. Por lo tanto, los microARNs pueden describirse en términos de ARN (por ejemplo, secuencia de ARN de un miARN maduro o una molécula de ARN precursora de miARN), o en términos de ADN (por ejemplo, secuencia de ADN correspondiente a un miARN maduro, secuencia de ARN o secuencia de ADN que codifica para un gen MIR o fragmento de un gen MIR o un precursor de miARN).

Las familias de los genes MIR parecen ser sustanciales, se estima que representan el 1% de al menos algunos genomas y son capaces de influir o regular la expresión de alrededor de un tercio de todos los genes (véase, por ejemplo, Tomari et al., Curr. Biol., 15(2005), R61-64; Tang G., Trends Biochem. Sci., 30 (2005), 106-14; Kim Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6 (2005), 376-385). Los miARNs están involucrados, por ejemplo, en la regulación de la diferenciación, proliferación y apoptosis celular, y probablemente estén implicados en la patología de al menos algunas enfermedades, incluido el cáncer, donde los miARNs pueden funcionar de diversas formas como oncogenes o como supresores de tumores. Véase, por ejemplo, O'Donnell et al., Nature 435 (2005), 839-843; Cai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (2005), 5570-5575; Morris and McManus (2005) Sci. s Tk E, pe41 (disponible en línea en stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans;2005/297/pe41.pdf). Los genes de microARN (MIR) tienen características de identificación, incluida la conservación entre especies de plantas, una estructura de plegamiento estable y el procesamiento de un dúplex específico de miARN/ miARN* por enzimas tipo-Dicer (Ambros et al. (2003) RNA, 9:277-279). Estas características se han utilizado para identificar miARNs y sus genes correspondientes complementando la clonación molecular mediante aproximaciones computacionales sistemáticas que identifican genes de miARN conservados evolutivamente mediante la búsqueda de patrones de secuencia y conservación de estructura secundaria que son características de los precursores de miARN en horquilla de metazoos (Ambros et al., Curr. Biol., 13 (2003), 807-818; Grad et al., Mol. Cell 11 (2003), 1253-1263; Lai et al., Curr. Biol. 13 (2003), R925-R936; Lim et al., Science 299 (2003), 1540 y Lim et al., Genes Dev., 17 (2003), 991-1008. Los genes de microARN disponibles públicamente están catalogados en miRBase (Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441). De acuerdo con la presente invención, el término "precursor de miARN" se refiere indistintamente a todas las formas precursoras de un miARN maduro, es decir, pri-miARN y pre-miARN.

Los sitios de reconocimiento de miARNs se han validado en todas las regiones de un ARNm, incluyendo la región 5' no traducida, la región codificante y la región 3' no traducida, lo que indica que la posición del sitio diana del miARN en relación con la secuencia codificante puede no necesariamente afectar la supresión (véase, por ejemplo, Rhoades et al. (2002) Cell, 110:513-520; Yekta et al., Science 304 (2004), pp. 594-596; Davis et al. Curr. Biol., 15 (2005), 743 749; Lewis et al., Cell 115 (2003), 787-798; Lewis et al., Cell 120 (2005), 15-20; Baek et al., Nature 455 (2008), 64-71 y Selbach et al., Nature 455 (2008), 58-63.

La unión entre el ARNm y el miARN no tiene que ser perfecta; se han observado algunas faltas de coincidencia sin ningún efecto en la eficiencia de los miARNs. En este respecto, los sitios diana de miARN verificados experimentalmente indican que el extremo 5' del miARN tiende a tener más bases complementarias a la diana que su extremo 3' (Moss et al., Cell 88 (1997), 637-646.; Johnston and Hobert, Nature 426 (2003), 845-849; John et al., PLoS Biol 2(11): e363 (2004)). Por lo tanto, como un micro-ARN de la presente divulgación, un micro-ARN que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 80% o más con la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID. NO 1 a 66 y 68, 69, 71, 72, 74, 75, 77 y 78, preferiblemente un micro-ARN que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 90% o más, más preferiblemente 95% o más, puede mencionarse y denominarse como una variante del mismo.

Como un precursor de micro-ARN de la presente divulgación, un precursor de micro-ARN que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 80% o más con la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera del precursor de miARN de SEQ ID. NO 1 a 66 como se indica en la miRBase dentro de las entradas de las respectivas moléculas de miARN de la presente divulgación indicadas en la Tabla 1 y de las SEQ ID Nos.:

67, 70, 73 o 76, preferiblemente un micro-ARN que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 90% o más, más preferiblemente 95 % o más, puede mencionarse y denominarse como una variante del mismo.

La variante también puede ser una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones estrictas con la secuencia de nucleótidos de referencia, complementos de la misma o secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a la misma. Como apreciarán los expertos en la técnica, la representación de una hebra única también define la secuencia de la hebra complementaria. Por tanto, un ácido nucleico también abarca la hebra complementaria de una hebra única representada. Como también apreciarán los expertos en la técnica, se pueden utilizar muchas variantes de un ácido nucleico para el mismo propósito que un ácido nucleico determinado. Por tanto, un ácido nucleico también abarca ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de los mismos. Como también apreciarán los expertos en la técnica, una única hebra proporciona una sonda que puede hibridarse con la secuencia diana bajo condiciones de hibridación estrictas. Por tanto, un ácido nucleico también abarca una sonda que se hibrida en condiciones de hibridación estrictas.

"Sonda", como se utiliza en la presente, puede significar un oligonucleótido capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, generalmente a través del apareamiento de bases complementario, generalmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo del rigor de las condiciones de hibridación. Puede haber cualquier número de faltas de coincidencia de pares de bases que van a interferir con la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos de hebra única de la presente divulgación. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que no puede producirse hibridación ni siquiera bajo las condiciones de hibridación menos estrictas, la secuencia no es una secuencia diana complementaria.

"Condiciones de hibridación estrictas" utilizadas en la presente puede significar condiciones bajo las cuales una primera secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, sonda) se hibridará con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, diana), tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones estrictas son secuencia-dependientes y serán diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean alrededor de 5-10° C. más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. El Tm puede ser la temperatura (bajo fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones estrictas pueden ser aquellas en las que la concentración de sal es inferior a alrededor de 1.0 M de ion sodio, típicamente una concentración de alrededor de 0.01-1.0 M de ion sodio (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos alrededor de 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, alrededor de 10-50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de alrededor de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones estrictas con la adición de agentes desestabilizantes tal y como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos de 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación estrictas ejemplares incluyen las siguientes: 50% de formamida, 5 x SSC y 1% de SDS, incubando a 42°C, o, 5 x SSC, 1% de SDS, incubando a 65° C, con lavado en 0.2 x SSC y 0.1% de SDS a 65 °C.

"Sustancialmente complementario" utilizado en la presente puede significar que una primera secuencia es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica al complemento de una segunda secuencia sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o que las dos secuencias se hibriden bajo condiciones de hibridación estrictas.

"Sustancialmente idéntico" utilizado en la presente puede significar que una primera y una segunda secuencia son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia.

Como se utiliza en la presente, el término "molécula de unión" se refiere a cualquier agente (por ejemplo, péptido, proteína, polímero de ácido nucleico, aptámero, espejómero o molécula pequeña) que se une específicamente a una diana de interés. Como se describe en la presente, el término "molécula de unión" en el sentido de la presente invención incluye imitadores de miARN sintéticos, moléculas de ARN, anticuerpos, aptámeros, espejómeros y variantes modificadas de ARNip, miARN o una variante de los mismos. Una variante de este tipo puede sintetizarse químicamente y puede tener ventajas para los procesos relacionados con el silenciamiento del ARN. Algunas de estas modificaciones pueden ayudar a proteger a la molécula miARN-relacionada de la degradación, tal como una modificación de 2'-o-metilo, 2'-o-alilo, 2'-desoxi-fluorouridina o fosforotioatos. Otras modificaciones también pueden ayudar a aumentar la afinidad de la molécula miARN-relacionada por su diana o reducir sus efectos fuera de la diana, como la modificación del ácido nucleico-bloqueado, en la que un puente de metileno conecta el oxígeno-2' con el carbono-4' del anillo de ribosa. Otras modificaciones pueden mejorar la carga de la hebra correcta de un ARNip o miARN en el complejo Argonauta (Hammell CM., RNABiol. 5 (2008), 123-127), como al añadir un fosfato 5' o metilo a una hebra de un complejo de miARN/miARN* de doble hebra (miARN* es la hebra asociada del miARN que surge del brazo opuesto en el precursor).

La diana de interés se define en la presente como el sitio de reconocimiento de las moléculas de miARN como se define anteriormente, preferiblemente dentro de un ácido nucleico, más preferiblemente un pre-ARNm o una molécula-ARNm. El efecto global de tales interferencias con la función de los ácidos nucleicos diana es una modulación específica de la expresión de dicho gen. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa ya sea un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, en particular en lo que respecta a "inmunomodulación", inhibición es la forma preferible de modulación de la expresión génica. Debido a que un ARNm que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a los nucleótidos 2 a 8 en el lado terminal 5' de un microARN (la secuencia semilla) sufre supresión de la traducción del mismo por el micro-ARN (Current Biology, 15, R458-R460 (2005)), se puede mencionar una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia semilla de un micro-ARN de la presente divulgación como secuencia de nucleótidos diana del micro-ARN o molécula de unión de la presente divulgación. Los "imitadores de miARN" son fragmentos de ARN de doble-hebra tipo-miARN no naturales. Están diseñados para tener al extremo-5' que lleva un motivo parcialmente complementario a la secuencia seleccionada en la UTR3' exclusiva del gen diana. Introducido en las células, un imitador de miARN puede unirse específicamente a su gen diana y producir represión postranscripcional, más específicamente inhibición traduccional, del gen. A diferencia de los miARNs endógenos que pueden dirigirse a varios genes a la vez, los Imitadores-miR actúan de una manera específica para cada gen (Wang, Methods Mol Biol.

676 (2011), 211-223; Xiao et al., J Cell Physiol 212 (2007), 285-292).

Polinucleótidos:

Se pretende que el término "polinucleótido" abarque un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace noconvencional (por ejemplo, un enlace amida, como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" o "ácido nucleico de doble-hebra" se refiere a uno o más segmentos cualquiera de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido, que comprende preferiblemente la secuencia que codifica para al menos para una molécula de miARN de la presente divulgación.

Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido retirada de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica para al menos un miARN o un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospederas heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARNin vivooin vitrode polinucleótidos de la presente divulgación.

Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente divulgación incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulatorio tal como un promotor, un sitio de unión a ribosomas o un terminador de la transcripción.

Como se utiliza en la presente, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consta de codones traducidos en aminoácidos o que comprenden la secuencia de un ARN funcional, tal como ARNt, ARNr, ARN catalítico, precursor de una molécula de ARNmi, ARNip, y ARN antisentido. Aunque un "codón de detención" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia que esté flanqueando, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores de la transcripción, intrones y similares no forman parte de una región codificante. Por supuesto, esta distinción no se refiere a secuencias que codifican para miARNs que se han extraído de sus loci originales en este tipo de secuencias, por ejemplo, secuencias intrónicas de genes que codifican para proteínas, sino a la función de las secuencias en las construcciones de polinucleótidos de la presente divulgación.

Una región codificante también puede ser un ARNm o ADNc correspondiente a las regiones codificantes (por ejemplo, exones y miARN) que comprenden opcionalmente secuencias no traducidas en 5'- o 3'- unidas a las mismas. Una región codificante también puede ser una molécula de ácido nucleico amplificada producida in vitro que comprende toda o una parte de la región codificante y/o secuencias no traducidas en 5'- o 3'- unidas a la misma.

Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes en una única construcción de polinucleótidos, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótidos separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado para una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la divulgación puede codificar regiones codificantes heterólogas, ya sea fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica para una molécula de unión, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos especializados o motivos, tales como un péptido señal de secreción o un dominio funcional heterólogo.

El polinucleótido o ácido nucleico puede ser ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un miARN o polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operable existe cuando una región codificante de un producto genético, por ejemplo, un polipéptido, está asociado con una o más secuencias regulatorias de tal manera que coloque la expresión del producto del gen bajo la influencia o el control de la(s) secuencia(s) regulatoria(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de miARN/polipéptido y un promotor asociado al mismo) están "asociados operativamente" o "unidos operativamente" si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción del ARNm que codifica para el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de expresión de las secuencias regulatorias para dirigir la expresión del producto del gen ni interfiere con la capacidad del templado de ADN para transcribirse. Por lo tanto, una región promotora estaría operativamente asociada con un ácido nucleico que codifica para un miARN/polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor célula-específico que dirige la transcripción sustancial del ADN solamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además del promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción célula-específica. En la presente se describen promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción.

Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estos incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero no limitados a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus de simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tal como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de vertebrados como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovino y p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores tejido-específicos, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas). De manera similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosomas, codones de inicio y terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (en particular, un sitio de entrada a ribosomas interno, o IRES, también denominado como secuencia CITE).

En una realización particularmente preferida, un polinucleótido de la presente divulgación es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), micro ARN (miARN), precursor de miARN, ARN en horquilla pequeña (ARNsh), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN.

Determinación de similitud y/o identidad de moléculas:

La "similitud" entre dos péptidos se determina mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos de un péptido con la secuencia de un segundo péptido. Un aminoácido de un péptido es similar al aminoácido correspondiente de un segundo péptido si es idéntico o tiene una sustitución de aminoácido conservada. Las sustituciones conservadas incluyen las descritas en Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), y en Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785. Por ejemplo, los aminoácidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios o sustituciones conservadas: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; and -Asp, Glu.

La determinación del porcentaje de identidad o similitud entre dos secuencias se logra preferiblemente utilizando el algoritmo matemático de Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 90: 5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora a los programas BLASTn y BLASTp de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 disponible en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge).

La determinación del porcentaje de identidad o similitud se realiza con los parámetros estándar de los programas BLASTn y BLASTp, como se recomienda en la página web del NCBI y en la "Guía de selección de programas BLAST" con respecto a secuencias de una longitud y composición específicas.

Las búsquedas de polinucleótidos BLAST se realizan con el programa BLASTn.

Para los parámetros generales, la casilla "Secuencias Diana Max" se puede configurar en 100, la casilla "Consultas cortas" se puede marcar, la casilla "Umbral esperado" se puede configurar en 1000 y la casilla "Tamaño de palabra" se puede configurar en 7 como se recomienda para secuencias cortas (menos de 20 bases) en la página web del NCBI. Para secuencias más largas, la casilla "Umbral esperado" se puede configurar en 10 y la casilla "Tamaño de palabra" se puede configurar en 11. Para los parámetros de puntuación, las "Puntuaciones de coincidencia/falta de coincidencia" se pueden configurar en 1, -2 y la casilla "Costes de brecha" se puede configurar en lineal. Para los parámetros de Filtros y Enmascaramiento, la casilla "Regiones de baja complejidad" puede no estar marcada, la casilla "Repeticiones especie-específicas" puede no estar marcada, la casilla "Enmascaramiento solo para tabla de búsqueda" puede estar marcada, la "Configuración del filtro DUST" puede estar marcada y la casilla "Enmascaramiento de letras minúsculas" puede no estar marcada. En general, en este respecto se puede utilizar la "Búsqueda de coincidencias breves y casi exactas", que proporciona la mayoría de las configuraciones indicadas anteriormente. Se puede encontrar más información en este respecto en la "Guía de Selección de Programas BLAST" publicada en la página web del NCBI.

Las búsquedas de proteínas BLAST se realizan con el programa BLASTp. Para los parámetros generales, la casilla "Secuencias Diana Max" se puede configurar en 100, la casilla "Consultas cortas" se puede marcar, la casilla "Umbral esperado" se puede configurar en 10 y la casilla "Tamaño de palabra" se puede configurar en "3". Para los parámetros de puntuación, la casilla "Matriz" se puede configurar en "BLOSUM62", la casilla "Costes de brecha" se puede configurar en "Existencia: 11 Extensión: 1", la casilla "Ajustes de composición" se puede configurar en "Ajuste de matriz de puntuación de composición condicional". Para los parámetros de Filtros y Enmascaramiento, la casilla "Regiones de baja complejidad" puede no estar marcada, la casilla "Enmascaramiento solo para tabla de búsqueda" puede no estar marcada y la casilla "Enmascaramiento de letras minúsculas” puede no estar marcada.

Las modificaciones de ambos programas, por ejemplo, con respecto a la longitud de las secuencias buscadas, se realizan de acuerdo con las recomendaciones de la "Guía de selección de programas BLAST" publicada en una versión HTML y PDF en la página web del NCBI.

Enfermedades y trastornos:

A menos que se indique lo contrario, los términos "trastorno" y "enfermedad" se utilizan indistintamente en la presente. El término "trastorno autoinmune" como se utiliza en la presente es una enfermedad o trastorno que surge de y está dirigido contra los propios tejidos u órganos de un individuo o un co-segregado o manifestación de los mismos o una condición resultante de los mismos. Las enfermedades autoinmunes son causadas principalmente por la desregulación de las respuestas inmunes adaptativas y se forman autoanticuerpos o células T autorreactivas contra las propias-estructuras. Casi todas las enfermedades autoinmunes también tienen un componente inflamatorio. Las enfermedades autoinflamatorias son principalmente inflamatorias y algunas enfermedades autoinflamatorias clásicas son causadas por defectos genéticos en las vías inflamatorias innatas. En las enfermedades autoinflamatorias no se encuentran células T autorreactivas ni autoanticuerpos. En muchos de estos trastornos autoinmunes y autoinflamatorios, pueden existir una serie de marcadores clínicos y de laboratorio, que incluyen, pero no se limitan a, hipergammaglobulinemia, niveles elevados de autoanticuerpos, depósitos de complejos antígeno-anticuerpo en los tejidos, beneficio de tratamientos con corticosteroides o inmunosupresores y agregados celulares linfoides en los tejidos afectados. Sin limitarse a una teoría sobre el trastorno autoinmune mediado por células-B, se cree que las células B demuestran un efecto patogénico en enfermedades autoinmunes humanas a través de una multitud de vías mecanicistas, incluyendo la producción de autoanticuerpos, formación de complejos inmunes, activación dendrítica y de células-T, síntesis de citocinas, liberación directa de quimiocinas y provisión de un nido para la neo-linfogénesis ectópica. Cada una de estas vías puede participar en diferentes grados en la patología de las enfermedades autoinmunes.

Como se utiliza en la presente, un "trastorno autoinmune" puede ser una enfermedad órgano-específica (es decir, la respuesta inmune se dirige específicamente contra un sistema de órganos tal como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinal y hepático, el sistema renal, la tiroides, los oídos, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar sistemas de órganos múltiples (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide, polimiositis, síndrome de poliendocrinopatía autoinmune, etc. Tales enfermedades preferibles incluyen Encefalomielitis aguda diseminada (ADEM), Alopecia areata, Espondilitis Anquilosante, Síndrome antifosfolípido (APS), Miocardiopatía autoinmune, Anemia hemolítica autoinmune, Hepatitis autoinmune, Enfermedad autoinmune del oído interno, Síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), Neuropatía periférica autoinmune, Pancreatitis autoinmune, Síndrome poliendocrino autoinmune, Dermatitis de progesterona autoinmune, Trombocitopénica autoinmune purpura, Urticaria autoinmune, Uveítis autoinmune, Enfermedad celiaca, Enfermedad de aglutininas frías, Enfermedad de Crohn, Dermatomiositis, Diabetes mellitus tipo 1, Endometriosis, Fascitis osinofílica, Pénfigoide gastrointestinal, Síndrome de Goodpasture, Enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barré (GBS), Encefalopatía de Hashimoto, Tiroiditis de Hashimoto, Trombocitopénica idiopática púrpura (Trombocitopénica autoinmune púrpura), Lupus eritematoso, Síndrome de Miller-Fisher (síndrome-Guillain-Barré), Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo, Miastenia gravis, Pénfigo vulgaris, Anemia perniciosa, Polimiositis, Cirrosis biliar primaria, Psoriasis, Artritis psoriásica, Policondritis recurrente, Artritis reumatoide, Síndrome de Sjogren, Arteritis temporal ("arteritis de células gigantes"), Mielitis transversa, Colitis ulcerosa, Enfermedad no diferenciada del tejido conectivo (Enfermedad mixta del tejido conectivo), Vasculitis, Granulomatosis de Wegener.

Tratamiento y fármacos:

Como se utiliza en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo de una enfermedad autoinmune y/o autoinflamatoria. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan del tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno, así como aquellos propensos a padecer la afección o trastorno o aquellos en quienes se debe prevenir la manifestación de la afección o trastorno.

Si no se indica lo contrario, los términos "fármaco", "medicina" o "medicamento" se utilizan indistintamente en la presente e incluirán, sin limitarse a, todos (A) artículos, medicinas y preparaciones para uso interno o externo, y cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a ser utilizadas para diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades ya sea del hombre o de otros animales; y (B) artículos, medicinas y preparaciones (distintos de los alimentos) destinados a afectar la estructura o cualquier función del cuerpo del hombre o de otros animales; y (C) artículos destinados a ser utilizados como componente de cualquier artículo especificado en las cláusulas (A) y (B). El término "fármaco", "medicina" o "medicamento" incluirá la fórmula completa de la preparación destinada a ser utilizada ya sea en el hombre o en otros animales que contenga uno o más "agentes", "compuestos", "sustancias" o "(composiciones) químicas" como y en algún otro contexto también otros excipientes farmacéuticamente inactivos como rellenos, desintegrantes, lubricantes, deslizantes, aglutinantes o que garanticen un transporte fácil, desintegración, desagregación, disolución y disponibilidad biológica del "fármaco", "medicina" o "medicamento" en un lugar diana previsto dentro del cuerpo del hombre o de otros animales, por ejemplo, en la piel, en el estómago o el intestino. Los términos "agente", "compuesto" o "sustancia" se utilizan indistintamente en la presente e incluirán, en un contexto más particular, pero no se limitan a todos los agentes farmacológicamente activos, es decir, agentes que inducen un efecto biológico o farmacológico deseado o que se investigan o prueban para determinar la capacidad de inducir tal posible efecto farmacológico mediante los métodos de la presente divulgación.

El término "inmunomodulación" tal como se utiliza de acuerdo con la presente invención se refiere a una alteración de la respuesta inmune aumentando (inmunopotenciación) o reduciendo (inmunosupresión) la capacidad del sistema inmune para producir anticuerpos o células sensibilizadas que reconocen y reaccionan con el antígeno que inició su producción. En la técnica se conocen varias sustancias adecuadas para la inmunomodulación, por ejemplo, corticosteroides, agentes citotóxicos, timosina e inmunoglobulinas.

Portadores farmacéuticos:

Los portadores y vías de administración farmacéuticamente aceptables se pueden tomar de la literatura correspondiente conocida por el experto en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden formular de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica; véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) de la University of Sciences in Philadelphia, I<s>B<n>0-683-306472, Vaccine Protocols.

2nd Edition by Robinson et al., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2nd Edition de Taylor and Francis. (2006), ISBN: 0-8493 1630-8. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos portadores pueden formularse por métodos convencionales bien-conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede realizarse de diferentes maneras. Los ejemplos incluyen la administración de una composición que contiene un portador farmacéuticamente aceptable por métodos orales, intranasales, rectales, tópicos, intraperitoneales, intravenosos, intramusculares, subcutáneos, subdérmicos, transdérmicos, intratecales e intracraneales. Las formulaciones en aerosol, tales como formulaciones de pulverización nasal, incluyen soluciones acuosas purificadas u otras soluciones del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Preferentemente, tales formulaciones se ajustan a un pH y estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales. Las composiciones farmacéuticas para administración oral, tales como moléculas de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, "nanocuerpos™") etc también están previstos en la presente invención. Dichas formulaciones orales pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Una tableta puede comprender un portador sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las formulaciones para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un portador adecuado; véase también O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735. Se puede encontrar más orientación sobre las formulaciones que son adecuadas para diversos tipos de administración en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) y actualizaciones correspondientes. Para una breve revisión de los métodos de administración de fármacos, véase Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.

Se reportó que las moléculas antisentido desnudas y no modificadas son internalizadas pobremente por las células, ya sea que estén o no cargadas negativamente. (Grey et al., Biochem. Pharmacol. 53 (1997). 1465-1476, Stein et al., Biochemistry 32 (1993), 4855-4861. Bennet et al., Mol. Pharmacol. 41 (1992), 1023-1033). Por lo tanto, los oligonucleótidos pueden modificarse o utilizarse en composiciones con otros agentes tales como portadores lipídicos (Fattal et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 56 (2004), 931-946), micropartículas (Khan et al., J. Drug Target 12 (2004), 393 404) vesículas tales como exosomas (véase Ejemplo 4) o mediante conjugación covalente con péptidos célulapenetrantes (CPP) que permiten la translocación de las moléculas antisentido a través de la membrana celular; véase para una revisión Lysik and Wu-Pong, J. Pharm. Science. 92 (2003), 1559-1573.

Exosomas:

En este respecto se utilizan vesículas o exosomas. Los "exosomas" son vesículas de origen endosomal de alrededor de 30-100 nm que se secretan en el medio extracelular tras la fusión de cuerpos multivesiculares endosomales tardíos con la membrana plasmática (Garin et al., J Cell Biol 152 (2001), 165-180). Se ha demostrado que las células de diversos tipos de tejidos secretan exosomas, tales como células dendríticas, linfocitos B, células tumorales y mastocitos, por ejemplo. Los exosomas de diferente origen exhiben conjuntos discretos de proteínas y restos lipídicos (J Thery et al., Cell Biol 147 (1999), 599-610; Thery et al., J Immunol 166 (2001), 7309-7318). Estos notablemente, contienen proteínas involucradas en la presentación de antígenos e inmunomodulación, lo que sugiere que los exosomas juegan un papel en la comunicación célula-célula (Simons and Raposo, Curr. Opin. Cell Biol. 21 (2009), 575-581; Thery et al., Nat. Rev. Immunol. 9 (2009), 581-593) lo que conduce a la modulación de las respuestas inmunes. Los métodos para producir, purificar o utilizar exosomas con propósitos terapéuticos o como herramientas de investigación se han descrito, por ejemplo, en WO99/03499, WO00/44389 y WO97/05900. Además, también se conocen en la técnica métodos para producir exosomas artificiales. Dichos endosomas artificiales pueden derivarse de liposomas recubiertos como se describe en De La Peña et al., J Immunol Methods. 344 (2009), 121-132.

Teniendo en cuenta sus propiedades inmunogénicas y terapéuticas, sería particularmente útil poder modificar el contenido de los exosomas para poder alterar sus propiedades. En este respecto, se han descrito en la técnica exosomas recombinantes, que derivan de células transfectadas con plásmidos que codifican para proteínas recombinantes. Estos exosomas recombinantes contienen la proteína recombinante codificada por el plásmido (WO00/28001).

Expresión:

El término "expresión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un bioquímico, por ejemplo, un ARN, un miARN o un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluyendo, sin limitación, la desactivación del gen, así como tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Esto incluye, sin limitación, la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN en horquilla pequeña (ARNsh), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de dicho ARNm en polipéptido(s). Si el producto final deseado es un bioquímico, la expresión incluye la creación de ese bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se utiliza en la presente, el producto génico puede ser, ya sea un ácido nucleico, por ejemplo, micro ARN (miARN), un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce a partir de un transcrito. Los productos génicos descritos en la presente incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glicosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteínas, escisión proteolítica y similares.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vector/hospedero de expresión para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos o vectores cósmidos de expresión de ADN; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); sistemas celulares animales o humanos.

Para expresar el miARN, péptido, polipéptido o proteína de fusión (en lo sucesivo denominado como "producto") en una célula hospedera, se puede utilizar un procedimiento como el siguiente. Un fragmento de restricción que contiene una secuencia de ADN que codifica para dicho producto puede clonarse en un plásmido recombinante apropiado que contiene un origen de replicación que funciona en la célula hospedera y un marcador seleccionable apropiado. El plásmido puede incluir un promotor para la expresión inducible del producto (por ejemplo, pTrc (Amann et al, Gene 69 (1988), 301 315.) y pETI Id (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 6089). El plásmido recombinante puede introducirse en la célula hospedera mediante, por ejemplo, electroporación y las células que contienen el plásmido recombinante pueden identificarse mediante selección del marcador en el plásmido. La expresión del producto puede inducirse y detectarse en la célula hospedera utilizando un ensayo específico para el producto.

El ADN que codifica para el producto/miARN/polipéptido puede optimizarse para su expresión en la célula hospedera. Por ejemplo, el ADN puede incluir codones para uno o más aminoácidos que son predominantes en la célula hospedera con respecto a otros codones para el mismo aminoácido.

Un ejemplo de promotores inducibles es la combinación de promotores mínimos, como el promotor CMV sin la secuencia potenciadora río arriba (secuencia de 75 a -53 del promotor CMV original; véase Gossen and Bujard, Proc Natl Acad Sci US A. 89 (1992), 5547-5551) con promotor de secuencias de operones de resistencia para tetraciclina, el cual muestra una actividad dependiente de la concentración de la presencia de diversas concentraciones de Tetraciclina/Doxiciclina. El promotor de CMV no-modificado puede utilizarse para la expresión constitutiva.

El uso de un promotor inducible puede conducir a una citotoxicidad reducida de la acumulación de ARN o a una sobre saturación en las células que expresan miARN. Alternativamente, se puede utilizar un sistema de expresión constitutivo capaz de expresar consistentemente a los efectores de miARNs deseados durante un cierto período de tiempo. Preferiblemente, la expresión de miARNs o sus análogos está impulsada por un promotor de CMV, que a menudo se silencia después de aproximadamente un-mes de activación en células humanas debido a la metilación del ADN. Tal mecanismo de activación de un-mes de este tipo puede resultar beneficioso al prevenir la acumulación de ARN o la sobre-saturación en las células tratadas.

La administración de la composición del ácido nucleico que expresa miARN a las células humanas se puede lograr utilizando un método transgénico o no transgénico seleccionado del grupo de transfección liposomal/polisómica/química, recombinación de ADN, electroporación, penetración de pistola génica, inserción de transposón/retrotransposón, integración del gen saltarín, microinyección, infección viral, infección retroviral/lentiviral y una combinación de las mismas. Para prevenir los riesgos de inserción transgénica aleatoria y mutación celular, se puede utilizar transfección liposomal o polisomal para administrar la secuencia de miARN que comprende el vector en las células humanas diana (por ejemplo, las células autólogas del paciente). De acuerdo con la presente invención, se utilizan exosomas artificiales; véase también el Ejemplo 4 en este respecto. La expresión del al menos un miARN elegido, un precursor, variante o análogo del mismo es dependiente del promotor elegido y puede ser, por ejemplo, constitutiva, inducible o temporal.

En la presente también se describen kits que comprenden un ácido nucleico de la divulgación junto con cualquiera o todos los siguientes: reactivos de ensayo, tampones, sondas y/o cebadores, y solución salina estéril u otro portador farmacéuticamente aceptable. Además, los kits pueden incluir materiales instructivos que contienen instrucciones (por ejemplo, protocolos) para la práctica de los métodos de esta divulgación.

Estas y otras realizaciones se divulgan y abarcan en la descripción y ejemplos de la presente divulgación. Se puede recuperar literatura adicional de bibliotecas públicas y bases de datos sobre uno cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a emplear de acuerdo con la presente invención, utilizando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", que está alojada en el Centro Nacional de Información Biotecnológica y/o la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud. El experto en la técnica conoce otras bases de datos y direcciones web adicionales, como las del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), que forma parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), y también pueden obtenerse mediante motores de búsqueda de internet. Una visión general de la información sobre patentes en biotecnología y un estudio de las fuentes pertinentes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual se proporcionan en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

La divulgación anterior describe en general la presente invención. A menos que se indique lo contrario, un término tal como se utiliza en la presente recibe la definición proporcionada en el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, ISBN 0198506732. Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta especificación. Las citas bibliográficas completas se pueden encontrar al final de la especificación inmediatamente antes de las reivindicaciones; sin embargo, no se admite que ningún documento citado sea en realidad el estado de la técnica en lo que respecta a la presente invención.

Se puede obtener una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en la presente únicamente con propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Los ejemplos a continuación ilustran mejor la invención, pero no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera. Los siguientes experimentos en los Ejemplos 1 a 12 se ilustran y describen con respecto a los agrupamientos de genes-miARN, los genes de miARN individuales como se identifican en las muestras placentarias y los nuevos usos de estos miARNs, sus precursores, variantes y análogos en el tratamiento y diagnóstico de varias enfermedades asociadas con una respuesta inmune desregulada, por ejemplo, durante el embarazo; véase también las Figuras y las Tablas 1 a 3 en este respecto.

Ejemplo 1: Expresión relativa de miR-520c-3p en tejido placentario en relación con la semana de gestación

Materiales y métodos

Aislamiento de ARN

Se aisló ARN total de 52 tejidos de placenta fijados con formalina y embebidos en parafina (FFPE) de abortos espontáneos e inducidos que ocurrieron entre las semanas 7 y 33 de gestación. El aislamiento de ARN se realizó utilizando el Kit innuPREP Micro RNA (Analytik Jena AG, Jena, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación para tejidos FFPE: la lisis de las secciones de parafina se realizó incubando las secciones en Solución de Lisis-TLS y Proteinasa K del Micro Kit innuPREP DNA (Analytik Jena) durante 1 h a 60°C y 15 min a 80°C.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

Se utilizaron 200 ng de ARN total para generar ADNc específico para miR-520c y RNU6B (el cual sirvió como control interno para la cuantificación relativa; CGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAAGCGTTCCATATTTTT SEQ ID NO 79) con el Kit TaqMan de Transcripción Reversa de microARN y cebadores RT de los Ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Las reacciones de PCR en tiempo-real se configuraron utilizando sondas y cebadores específicos para miARN incluidos en los Ensayos de microARN TaqMan y la Mezcla Maestra de PCR Universal TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.u U.). Las reacciones se incubaron en placas de 96-pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un minuto a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen, 2001).RNU6Bsirvió como control endógeno para la normalización.

Resultados

La expresión relativa de miR-520c-3p se trazó contra a la semana de gestación (Fig. 2). Los datos indican una ligera disminución de la expresión de miR-520c-3p a medida que avanza el embarazo, lo cual contrasta con Luo et al. (2009) quienes observaron un aumento de la expresión de los miARNs del cromosoma 19 a medida que avanza el embarazo.

Referencias

Livak, K. J. and T D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.

Luo, S. S., O. Ishibashi, et al. (2009). "Human villous trophoblasts express and secrete placenta-specific microRNAs into maternal circulation via exosomes." Biol Reprod 81(4): 717-729.

Ejemplo 2: Correlación de la expresión relativa de miR-371-3p, miR-372 y miR-373 con miR-520c-3p en tejido placentario

Materiales y métodos

Aislamiento de ARN

Se aisló ARN total de 52 tejidos placentarios fijados con formalina y embebidos en parafina (FFPE) de abortos espontáneos e inducidos. El aislamiento de ARN se realizó utilizando el Kit innuPREP Micro RNA (Analytik Jena AG, Jena, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación para tejidos FFPE: la lisis de las secciones de parafina se realizó incubando las secciones en Solución de Lisis-TLS y proteinasa K del Micro Kit innuPREP DNA (Analytik Jena) durante 1h a 60°C y 15 min a 80°C.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

Se utilizaron 200 ng de ARN total para generar ADNc específico para miR-520c, miR-371-3p, miR-372, miR-373 y RNU6B (el cual sirvió como control interno para la cuantificación relativa) con el Kit TaqMan de Transcripción Reversa de microARN y cebadores RT de los Ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Las reacciones de PCR en tiempo-real se configuraron utilizando sondas y cebadores específicos para miARN incluidos en los Ensayos de microARN TaqMan y la Mezcla Maestra de PCR<Universal TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA,>E<e>.<UU.). Las reacciones se incubaron en placas de 96->pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un minuto a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen, 2001).RNU6Bsirvió como control endógeno para la normalización.

Análisis estadístico

El análisis de regresión de los datos de expresión se realizó mediante una prueba-t de regresión lineal.

Resultados

Los resultados del análisis de regresión se resumen en la Tabla 3. La expresión relativa de miR-371-3p, miR-372 y miR-373 se correlacionó de manera altamente significativa con la expresión de miR-520c-3p, respectivamente. Esta correlación indica una expresión coordinada de estos miARNs y, por tanto, sugiere que comparten funciones similares.

Tabla 3: Correlación altamente significativa entre la expresión de miR-371-3p, miR-372, y miR-373 y miR-520c-3p.

Referencias

Livak, K. J. and T D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.

Ejemplo 3: Comparación de la expresión relativa de miR-371-3p, miR-372, miR-373 y miR-520c-3p en células estromales y de trofoblasto

Materiales y métodos

Microdisección

Se utilizó una muestra fijada con formalina y embebida en parafina de una placenta aparentemente normal del primer trimestre (8va semana de gestación) para el análisis por separado del compartimento estromal y de trofoblasto.

Utilizando procedimientos estándar para microdisección láser descritos por el fabricante (http://www.leicamicrosystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/laser-microdissection/details/product/leicalmd7000/downloads/ consultado el 17 de noviembre de 2011) se separaron el núcleo estromal y la capa de trofoblasto (Fig. 3). En este respecto, la microdisección láser también se puede realizar como se describe en Grundemann et al. Nucleic Acids Res 36 (2008), e38, en particular en la página 3 en la sección "Microdisección-láser-UV y síntesis de ADNc de células microdisecadas".

Aislamiento de ARN

El ARN total se aisló de las células estromales y de trofoblasto utilizando el Mini Kit QIAGEN miRNEasy (QIAGEN, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

Se utilizaron 10 ng de ARN total para generar ADNc específico para miR-520c, miR-371-3p, miR-372, miR-373 y RNU6B (el cual sirvió como control interno para la cuantificación relativa) el Kit TaqMan de Transcripción Reversa de microARN y cebadores RT de los Ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Las reacciones de PCR en tiempo-real se configuraron utilizando sondas y cebadores específicos para miARN incluidos en Ensayos de microARN TaqMan y la Mezcla Maestra de PCR Universal TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. u U.). Las reacciones se incubaron en placas de 96-pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un minuto a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen, 2001).RNU6Bsirvió como control endógeno para la normalización.

Resultados

En contraste con los resultados obtenidos anteriormente por Luo et al., (2009), quienes detectaron miARNs C19MC solamente en la capa de trofoblasto y no en las células estromales, los resultados presentados en la presente muestran que la expresión de miR-520c-3p es comparativamente alta en las células estromales como en las células del trofoblasto. Lo mismo ocurre con los niveles de expresión de miR-371-3p y miR-372. miR-373 se expresa aún más en las células estromales que en las células del trofoblasto (Figura 4).

Ejemplo 4: Prueba de las propiedades inmunomoduladoras de los miARNs y moléculas de unión de la presente divulgación.

La capacidad de los microARNs o moléculas de unión de la presente divulgación, tal como se define en la presente anteriormente, para suprimir el sistema inmune se prueba transfectando células madre mesenquimales o células del trofoblasto con microARNs y aislamiento de exosomas liberados por estas células para uso en experimentos dirigidos a la inmunomodulación de células diana de estos exosomas. Los métodos para la extracción de exosomas se conocen en la técnica y se utilizan como se describen, por ejemplo, en Hedlund et al. (2009), en la parte Materiales y Métodos, en particular en las páginas 342 a 343 en la sección "Aislamiento de exosomas a partir de sobrenadantes de cultivos de explantes placentarios", o como se describe en Taylor et al. (2006) en la página 1535 en la sección "Aislamiento de exosomas circulantes". Alternativamente, los microARNs se utilizan directamente para transfectar a las células diana que pueden ser, por ejemplo, linfocitos o células dendríticas siguiendo métodos rutinarios como es descrito, por ejemplo, por Marasa et al. (2010) en la página 340 en la sección "Cultivo celular, transfecciones y tinción de bgalactosidasa" de manera análoga para las células HeLa y los fibroblastos. Hay varias formas para probar la capacidad inmunomoduladora de los microARNs a nivel de las células receptoras. Las células diana relevantes, los métodos de transfección y los parámetros utilizados para evaluar el potencial de los microARNs para suprimir el sistema inmune se conocen en la técnica y se utilizan como es descrito, por ejemplo, por Sabapatha et al., 2006; Taylor et al., 2006; Hegmans et al., 2008; Hedlund et al., 2009; Ren et al., 2011; Zhang et al., 2011, en particular en las respectivas secciones de Materiales y Métodos.

Ejemplo 5: Uso de imitadores de miARN para suprimir la actividad de las células-T

Se utilizó electroporación para transfectar células-T y líneas celulares derivadas de células-T con imitadores de miARNs de C19MC (Qiagen, Hilden, Alemania) en concentraciones apropiadas para probar su capacidad proliferativa y expresión de citoquinas. Como control negativo se utilizan ARNip mezclados (Qiagen). La eficacia de la transfección se prueba utilizando ARNip de Muerte Celular AllStars Hs (Qiagen).

Ejemplo 6: Expresión relativa de miR-517a-3p, miR-519a-3p y miR-520c-3p en placenta a término y tejido de membrana amniótica

Las células mesenquimales de la membrana amniótica parecen tener fuertes propiedades inmunomoduladoras, por ejemplo, al suprimir activamente la proliferación de células-T inducida por aloantígenos (Wolbank et al., 2007). Por lo tanto, la expresión de miR-517a-3p, miR-519a-3p y miR-520c-3p se midió en una membrana amniótica a término y se comparó con los niveles de expresión del tejido placentario correspondiente.

Materiales y métodos

Aislamiento de ARN

El ARN total se aisló del tejido de placenta a término fijado con formalina y embebido en parafina (FFPE) y del tejido de la membrana amniótica adyacente obtenido poco después del parto. El aislamiento de ARN se realizó utilizando el Kit innuPREP Micro RNA (Analytik Jena AG, Jena, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación para tejidos FFPE: la lisis de las secciones de parafina se realizó incubando las secciones en Solución de Lisis-TLS y proteinasa K del Micro Kit innuPREP DNA (Analytik Jena) durante 1h a 60°C y 15 min a 80 °C.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

Se utilizaron 200 ng de ARN total para generar ADNc específico para miR-517a-3p, miR-519a-3p, miR-520c-3p y RNU6B (el cual sirvió como control interno para la cuantificación relativa) con el Kit TaqMan de Transcripción Reversa de microARN y cebadores RT de los Ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Las reacciones de PCR en tiempo-real se configuraron utilizando sondas y cebadores específicos para miARN incluidos en los Ensayos de microARN TaqMan y la Mezcla Maestra de PCR<Universal TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA,>E<e>.<UU.). Las reacciones se incubaron en placas de 96->pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un min a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen, 2001).RNU6Bsirvió como control endógeno para la normalización.

Resultados

La expresión relativa de miR-517a-3p, miR-519a-3p y miR-520c-3p se midió en tejido de membrana amniótica a término y se comparó con el tejido de placenta correspondiente. Los valores de RQ (cuantificación relativa) obtenidos se proporcionan en la Tabla 4, a continuación.

Tabla 4: Valores de cuantificación relativa (RQ) de miR-517a-3p, miR-519a-3p y miR-520c-3p obtenidos en tejido de placenta y de membrana amniótica.

Estos datos muestran que la expresión de miR-517a-3p, miR-519a-3p y miR-520c-3p es comparablemente alta en la membrana amniótica como en el tejido de la placenta.

Referencias:

Hedlund, M., A. C. Stenqvist, et al. (2009). "Human placenta expresses and secretes NKG2D ligands via exosomes that down-modulate the cognate receptor expression: evidence for immunosuppressive function." J Immunol 183(1): 340-351.

Hegmans, J. P, P J. Gerber, et al. (2008). "Exosomes." Methods Mol Biol 484: 97-109.

Livak, K. J. and T D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.

Marasa, B. S., S. Srikantan, et al. (2010). "MicroRNA profiling in human diploid fibroblasts uncovers miR-519 role in replicative senescence." Aging (Albany NY) 2(6): 333-343.

Ren, Y, J. Yang, et al. (2011). "Exosomal-like vesicles with immune-modulatory features are present in human plasma and can induce CD4+ T-cell apoptosis in vitro." Transfusion 51(5): 1002-1011.

Sabapatha, A., C. Gercel-Taylor, et al. (2006). "Specific isolation of placenta-derived exosomes from the circulation of pregnant women and their immunoregulatory consequences." Am J Reprod Immunol 56(5-6): 345-355.

Taylor, D. D., S. Akyol, et al. (2006). "Pregnancy-associated exosomes and their modulation of T cell signaling." J Immunol 176(3): 1534-1542.

Wolbank, S., A. Peterbauer, et al. (2007). "Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane: a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue." Tissue Engineering 13(6): 1173-1183.

Zhang, H., Y. Xie, et al. (2011). "CD4(+) T cell-released exosomes inhibit CD8(+) cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumor immunity." Cell Mol Immunol 8(1): 23-30.

Ejemplo 7: Comparación de la expresión relativa de miR-520c-3p y miR-517a-3p en células de la decidua y del trofoblasto

Materiales y métodos

Microdisección

Se utilizó una muestra fijada con formalina y embebida en parafina de una placenta aparentemente normal del primer trimestre (9na semana de gestación) para el análisis por separado del trofoblasto y las deciduas.

Utilizando procedimientos estándar para la microdisección láser de acuerdo con lo descrito por el fabricante. (http://www.leica-microsvstems.com/products/light-microscopes/life-science-research/lasermicrodissection/details/product/leica-lmd7000/downloads/ consultado el 17 de noviembre de 2011; o en la sección "Materiales y métodos", subsección "Microdisección láser" en la columna izquierda de la página 303 de Asztalos et al., (2010).) se separaron el trofoblasto y el tejido de la decidua. Se separaron el núcleo estromal y la capa del trofoblasto (Fig. 3). En este respecto, la microdisección láser también se puede realizar como se describe en Grundemann et al. Nucleic Acids Res 36 (2008), e38, en particular en la página 3 en la sección "Microdisección-láser-UV y síntesis de ADNc de células microdisecadas".

Aislamiento de ARN

El ARN total se aisló de las células deciduales y del trofoblasto utilizando el Mini Kit QIAGEN miRNEasy (QIAGEN, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

Se utilizaron 10 ng de ARN total para generar ADNc específico para miR-520c-3p, miR-517a-3p y RNU6B (el cual sirvió como control interno para la cuantificación relativa) con el Kit TaqMan de Transcripción Reversa de microARN y cebadores RT de los Ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Las reacciones de PCR en tiempo-real se configuraron utilizando sondas y cebadores específicos para miARN incluidos en los Ensayos de microARN TaqMan y la Mezcla Maestra de PCR Universal TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. Uu .). Las reacciones se incubaron en placas de 96-pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un min a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen, 2001).RNU6Bsirvió como control endógeno para la normalización. La expresión se comparó con un tumor de tiroides que expresa miR-520c-3p y miR-517a-3p en niveles bajos.

Resultados

Los resultados presentados en la presente muestran que miR-520c-3p y miR-517a-3p no solo están presentes en las células del trofoblasto sino también en las células deciduales (Figura 5). La decidua está formada por células maternas con un patrón de metilación materna que no expresan microARNs C19MC. Por lo tanto, los datos presentados en la presente muestran que la presencia de células miR-517a-3p y miR-520c-3p en este tejido se debe a la captación de miARNs (liberados originalmente a través de exosomas por células placentarias) por células deciduales o, más específicamente, células inmunes deciduales.

Ejemplo 8: Análisis in silico de microARNs C19MC, sus dianas validadas y su papel potencial en la inmunomodulación Materiales y métodos

En el registro de microARN miRBase (http://www.mirbase.org/) se buscaron objetivos dianas validadas de microARNs de C19MC. Luego se buscaron en la literatura relevante funciones conocidas de estas dianas validadas.

Resultados

Los resultados presentados en la presente muestran que una alta proporción de los genes diana de los microARNs de C19MC está asociada con apoptosis e inmunomodulación. Como un ejemplo, existen dianas validadas que actúan como inhibidores de la apoptosis inducida por Fas - FasL. Estas dianas y los miARNs correspondientes del agrupamiento C19MC se muestran esquemáticamente en la Fig. 6.

Referencias

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Asztalos S, Gann PH, Hayes MK, Nonn L, Beam CA, Dai Y, Wiley EL, Tonetti DA: "Gene expression patterns in the human breast after pregnancy" Cancer Prev Res (Phila). 2010 Mar;3(3):301-11

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Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. (2006). "miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature." Nucl. Acids Res. 34 (suppl 1) (Database Issue):D140-D144

Griffiths-Jones S. (2004). "The microRNA Registry." Nucl. Acids Res. 32 (suppl 1) (Database Issue):D 109-D 111 Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. (2008). "miRBase: tools for microRNA genomics." Nucl. Acids Res. 36 (suppl 1) (Database Issue):D154-D158

Kozomara A, Griffiths-Jones S. (2011). "miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data." Nucl. Acids Res. 39 (suppl 1) (Database Issue):D152-D157

Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, lovino N, Aravin A, Pfeffer S, Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C, Socci ND, Hermida L, Fulci V, Chiaretti S, Foa R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel A, Muller RU, Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M (2007). "A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing" Cell. 129:1401-1414.

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Pandolfi F, Cianci R, Pagliari D, Casciano F, Bagala C, Astone A, Landolfi R, Barone C. "The immune response to tumors as a tool toward immunotherapy." Clin Dev Immunol.; 2011:894704. Epub 2011 Dec 5.

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Ejemplo 9: Las células de la membrana amniótica bovina no logran inhibir la reacción mixta de los linfocitos.

Se sabe que las células de la membrana amniótica humana inducen un efecto inhibidor sobre las reacciones mixtas de linfocitos (MLR) (Magatti et al., 2008). Los experimentos proporcionados en la presente invención demuestran que estas células también expresan abundantemente microARNs C19MC (véase Ejemplo 6). Las células de la membrana amniótica bovina (bAMC) que no expresan microARNs C19MC no deberían ejercer ningún efecto inhibidor o uno menos pronunciado. Por lo tanto, MLR se realizó en presencia de bAMC y la proliferación de las PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) se midió mediante el ensayo BrdU.

Materiales y métodos

Cultivos celulares

Se cocultivaron células derivadas de membrana amniótica bovina (bAMC) en medio completo RPMI con ya sea PBMC de un donante (donante A)

PBMC de otro donante (donante B)

PBMCs de ambos donantes (donante A donante B) (reacción mixta de linfocitos (MLR))

PBMC del donante A+ conA estimulante de células-T (concanavalina A); o

PBMC del donante B conA estimulante de células-T

Como control positivo se realizó la misma configuración experimental con células JEG-3 en lugar de bAMC. La línea celular JEG-3 coriocarcinoma- derivada expresa abundantemente microARNs C19MC (Morales-Prieto et al., 2012). Además, se sabe que esta línea celular ejerce un efecto inhibidor sobre las células T (Hammer et al., 2002). La línea celular S40.2 se deriva de un adenoma de tiroides y se sabe que sobreexpresa los microARNs de los agrupamientos C19MC y miR-371-373 (Rippe et al., 2010).

Se irradiaron JEG-3 y bAMC con 3000 Gy para garantizar que la proliferación observada pudiera atribuirse a los linfocitos. Para controlar el potencial estimulante de las PBMCs, se configuró una reacción mixta de linfocitos (MLR) utilizando PBMCs de dos donantes diferentes A y B sin la adición de células bAMC o JEG-3. Todos los experimentos se realizaron durante 96 h y 120h y todos los cultivos se realizaron por triplicado.

Ensayo BrdU

24h antes del final de los experimentos, se añadió BrdU a los cultivos celulares. Después de 96h y 72h, respectivamente, se recolectó el sobrenadante (que contenía las PBMCs en suspensión) y se midió la proliferación de las PBMCs mediante el ensayo BrdU (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania).

Resultados

Las bAMC no lograron inducir un efecto inhibidor sobre la MLR o las PBMC estimuladas con Con A, mientras que las células JEG-3 suprimieron eficazmente la activación de las PBMC (Fig. 7). Las PBMCs utilizadas en la presente invención se activaron suficientemente en MLR y mediante estimulación con Con A (Fig. 8). Asimismo, se pueden utilizar células de la línea celular de adenoma de tiroides S40.2 en lugar de células JEG-3 para demostrar su capacidad para suprimir la reacción de linfocitos mixtos.

Referencias:

Hammer, A., M. Hartmann, et al. (2002). "Expression of functional Fas ligand in choriocarcinoma." American Journal of Reproductive Immunology 48(4): 226-234.

Magatti, M., S. De Munari, et al. (2008). "Human amnion mesenchyme harbors cells with allogeneic T-cell suppression and stimulation capabilities." Stem Cells 26(1): 182-192.

Morales-Prieto, D. M., W. Chaiwangyen, et al. (2012). "MicroRNA expression profiles of trophoblastic cells." Placenta. Rippe, V., L. Dittberner, et al. (2010). "The two stem cell microRNA gene clusters C19MC and miR-371-3 are activated by specific chromosomal rearrangements in a subgroup of thyroid adenomas." PLoS One 5(3): e9485.

Ejemplo 10: Un clon de BAC que contiene el agrupamientoC19MC

El clon BAC BC280723 (no. de acceso de GenBank Ac011453) abarca toda la región cromosómica de C19MC, incluida la isla CpG adyacente, es decir, su supuesta región promotora (BC280723) (Fig. 9). Esta secuencia se inserta en un vector pBACe3.6.

Ejemplo 11: Expresión de miARNs C19MC de un clon BAC que contiene el agrupamiento C19MC completo transfectado en células de la membrana amniótica bovina

Materiales y métodos

Transfección

Se transfectaron cultivos de células derivadas de membrana amniótica bovina utilizando técnicas/procedimientos de cultivos celulares estándar con un vector BAC que contenía el agrupamiento C19MC como inserto (véase Ejemplo 10, anteriormente). La transfección se realizó utilizando el Reactivo de Transfección Atracteno de QIAGEN (Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como control negativo, las células se transfectaron de forma simulada con un complejo de transfección que no contenía ADN del vector BAC. Las células se cosecharon a las 24h, 48h y 6 días (144 h) después de la transfección.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

Se utilizaron 200 ng de ARN total para generar ADNc específico para miR-517a-3p y RNU6B (que sirvió como control interno para la cuantificación relativa) con el Kit TaqMan de Transcripción Reversa de microARN y cebadores RT de los Ensayos de microARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en un ciclador térmico durante 30 min a 16°C, 30 min a 42°C y 5 min a 85°C. Las reacciones de PCR en tiempo-real se configuraron utilizando sondas y cebadores específicos para miARN incluidos en los Ensayos de microARN TaqMan y la Mezcla Maestra de PCR Universal TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Las reacciones se incubaron en placas de 96-pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un min a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen, 2001). RNU6B sirvió como control endógeno para la normalización.

Resultados

Como el agrupamiento de microARN C19MC es primate- específico, no se expresa en células bovinas. La transfección de células derivadas de la membrana amniótica bovina con el vector BAC conduce a una alta expresión de miR-517a-3p en comparación con las células transfectadas simuladas que dura hasta seis días como mínimo; véase también Fig. 10.

Estos resultados indican que la expresión de microARNs C19MC se puede lograr en células que no expresan estos microARNs y que el vector BAC disponible es un ejemplo de un vector adecuado para este propósito.

Ejemplo 12: Regulación negativa del ARNm de cFLIP en células Jurkat incubadas con sobrenadante de cultivos de células JEG-3

Varios microARNs C19MC parecen dirigirse a genes anti-apoptóticos implicados en la apoptosis inducida por Fas-FasL (véase el Ejemplo 8, anteriormente). Una de las dianas es c-FLIP (CFLAR). Los microARNs C19MC a menudo se empaquetan en exosomas que son secretados por las células. En cultivo celular estos exosomas se acumulan en el medio de cultivo.

Materiales y métodos

Cultivo celular

JEG-3 es una línea celular coriocarcinoma- derivada que expresa altamente microARNs C19MC. HCT-116 es una línea celular del colon carcinoma- derivada que no expresa significativamente microARNs C19MC (véase fig. 11A). Jurkat es una línea celular derivada de leucemia de células T que tampoco expresa significativamente microARNs C19MC. Las tres líneas celulares utilizadas están disponibles comercialmente. Todas las líneas celulares se crecieron en RPMI suplementado con suero fetal de ternera al 10% y antibióticos (penicilina/estreptomicina).

Los sobrenadantes de cultivos los celulares de células JEG-3 y HCT-116 se recolectaron después de tres días de cultivo. Luego se añadieron 4 ml del sobrenadante de JEG-3 recolectado a células Jurkat crecidas en 3 ml de medio. Un cultivo de células Jurkat incubado con sobrenadante de células HCT-116 sirvió como control. Se cosecharon las células Jurkat de ambas preparaciones 24 h después de la adición del sobrenadante.

Aislamiento de ARN

El ARN total se aisló de las células Jurkat utilizando el Mini Kit QIAGEN miRNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Transcripción reversa y PCR en Tiempo-real

La transcripción reversa se realizó con 250 ng del ARN total utilizando la Transcriptasa Reversa M-MLV (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con 150 ng de hexámeros aleatorios e Inhibidor de Ribonucleasa Recombinante RNaseOUT™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La PCR en tiempo-real para c-FLIP (CFLAR) se realizó utilizando el Ensayo de Expresión Genética TaqMan CFLAR (Hs00153439_m1) (Life Technologies, Darmstadt, Alemania; Cat # 4331182) y la Mezcla Maestra de<p>C<r>Universal TaqMan (Life Technologies, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se incubaron en placas de 96-pocillos a 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y un min a 60°C. Todas las reacciones se corrieron por triplicado en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido Applied Biosystems 7300. La cuantificación relativa (RQ) se calculó utilizando el método AACt (Livak and Schmittgen 2001). HPRT sirvió como control endógeno para la normalización.

Resultados

Las células Jurkat tratadas con sobrenadantes de células JEG-3 mostraron una expresión disminuida de c-FLIP en comparación con las células Jurkat tratadas con sobrenadante de HCT-116 (Fig. 11B). Las células JEG-3 sobreexpresan miARNs C19MC y el sobrenadante contiene exosomas con estos microARNs que en el presente ejemplo se administran a las células Jurkat. En consecuencia, el ARNm de c-FLIP se regula negativamente.

Referencias:

Livak, K. J. and T. D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-408.

Wolbank, S., A. Peterbauer, et al. (2007). "Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane: a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue." Tissue Engineering 13(6): 1173-1183.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Exosomas que comprenden miARNs, en el que el miARN está codificado por una cualquiera de las unidades de transcripción comprendidas en el C19MC y seleccionadas del grupo que consiste en miR-517a-3p, miR-517b-3p, hsamiR-517c-3p y hsa-miR-517-5p que tiene las SEQ ID NO: 10 a 13 para uso en inmunomodulación en una enfermedad asociada al embarazo vinculada a un sistema inmune desregulado.

2. Exosomas para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad asociada al embarazo se selecciona del grupo de enfermedades que consiste en eclampsia, pre-eclampsia, síndrome-HELLP y fallo o problemas de placentación o implantación.

3. Exosomas para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en

(i) el tratamiento de una enfermedad autoinmune;

(ii) el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediante una administración local, preferentemente en el que los exosomas se administran utilizando inyección conjunta, preferentemente inyección intra-articular o aplicación intranasal; o

(iii) el tratamiento de una enfermedad autoinmune por una administración sistémica.