CN106191236B - 一种用于研究Graves’病miR-4443的检测方法 - Google Patents

一种用于研究Graves’病miR-4443的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于研究Graves’病miR‑4443的检测方法，包括：(1)提取CD4+T淋巴细胞的RNA作为样品，将样品与芯片杂交，杂交完成后洗涤芯片，对芯片进行扫描，筛选出miR‑4443的表达水平；(2)将上述样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进行miR‑4443特异性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值并对步骤(1)中芯片反映的结果进一步验证，即可。本发明检测方法提高了灵敏度，揭示了miR‑4443在GD免疫致病过程中的作用，为miR‑4443及其靶基因成为GD新的生物标志物、新靶点的研究提供了基础。

Description

一种用于研究Graves’病miR-4443的检测方法
技术领域
本发明属于肥胖症诊断生物学标志物领域，特别涉及一种用于研究Graves’病miR-4443的检测方法。
背景技术
Graves’病(Graves’disease,GD)是一种常见的抗体介导的器官特异性自身免疫性疾病，占甲状腺功能亢进病因的70-80％。GD临床症状明显，一旦患病持续多年，经常反复。目前GD的治疗方法主要包括抗甲状腺药物(antithyroid drug，ATD)、放射性I131和手术治疗。80％患者I131治疗十年内会发展为永久性甲减，手术为有创性治疗，存在神经血管损伤和麻醉并发症，故GD以ATD药物治疗为首选。但药物治疗有出现严重粒细胞缺少、肝损和过敏等不良反应的风险，并且存在疗程长、复发率高、病人依从性差等问题。促甲状腺激素受体抗体(thyrotrophin receptor antibody，TRAb)模拟TSH作用引起T3、T4合成和分泌增加是GD临床症状产生的原因，也是治疗棘手的关键问题。因此，GD作为一种自身免疫性疾病，探索其免疫致病机制及TRAb产生的过程，对于缩短疗程、降低复发率及提高治疗的安全性尤为必要。
GD的发生是源于自身反应性T淋巴细胞逃逸免疫耐受，在甲状腺局部浸润并活化B淋巴细胞产生TRAb。CD4+T淋巴细胞激活与多种自身免疫性和炎症性疾病的病理过程密切相关，主要包括Th1、Th2、Th17、Treg、Th22和Th9等多种细胞亚型。研究发现Th1/Th2细胞比例失调，Treg细胞/Th17细胞的调节作用紊乱，引起促炎因子与抗炎因子的失衡，导致B淋巴细胞的活化以及甲状腺自身抗体的产生，从而参与GD的发生、发展。激活的Th1可产生和分泌IFN-γ，而IFN-γ可促进甲状腺细胞分泌多种趋化因子，使局部免疫炎症反应放大，在GD发病初期发挥重要作用。Th2细胞主要通过表达IL-4、IL-5、IL-10和共刺激分子，继而促进B淋巴细胞激活、分化为浆细胞和抗体产生。研究报道Th17细胞在AITD的发生发展中起着重要的作用，GD和HT患者外周血Th17细胞比例均显著高于正常对照者。还有研究发现在AITD中Treg细胞对效应性T淋巴细胞的抑制作用减弱。虽然已证实多种因素通过影响CD4+T淋巴细胞的功能来参与GD病理过程，但GDCD4+T淋巴细胞功能异常的机制尚待进一步完善和阐明。
miRNA是一类长度约22个核苷酸，进化上高度保守的、短小的非编码RNA，能够在转录后水平调节基因表达，广泛参与多种病理生理过程。近年来多有研究报道miRNA对Th细胞分化及功能的作用。在T淋巴细胞成熟过程中miR-150表达水平明显升高，但在向Th1、Th2分化时其表达水平迅速下降。而miR-146在T淋巴细胞成熟过程中，在Th1细胞亚群中表达升高，Th2细胞亚群中则表达下降。在DGCR8敲除的CD4+T淋巴细胞中，miR-29b可抑制向Th1分化及IFNγ生成。相反，miR-155通过抑制细胞因子通路的负调控因子促进Th1和Th17依赖的组织炎症反应，同时可下调活化CD4+T淋巴细胞表面的IFNγ受体以促进Th1细胞分化，而miR-155缺乏的T淋巴细胞有向Th2分化的趋势。我国科学家研究发现，miR-326通过作用于负调控Th17分化的转录因子Ets以促进Th17分化及IL-17的产生。多项研究表明包括miR-155，miR-146a，miR-17～92和miR-10a在内的多种miRNAs在Treg细胞发育及其功能发挥方面起着非常重要的作用。比如，miR-146a在Treg细胞中表达量很高，其选择性调控由Treg细胞介导的免疫抑制作用，此作用可抑制IFNλ依赖性Th1反应活性和炎症反应过程。miRNAs通过影响T淋巴细胞功能或分化参与了包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)在内的多种自身免疫性疾病发生。但是尚无研究筛查GD患者CD4+T淋巴细胞中miRNAs表达情况，且特定miRNA在GD病理生理过程中的作用及机制也鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于研究Graves’病miR-4443的检测方法，该检测方法提高了灵敏度，揭示了miR-4443在GD免疫致病过程中的作用，为miR-4443及其靶基因成为GD新的生物标志物、新靶点的研究提供了基础。
本发明的一种用于研究Graves’病miR-4443的检测方法，包括：
(1)提取CD4+T淋巴细胞的RNA作为样品，将样品与芯片杂交，杂交完成后洗涤芯片，对芯片进行扫描，筛选出miR-4443的表达水平；
(2)将上述样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进行miR-4443特异性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值并对步骤(1)中芯片反映的结果进一步验证，即可。
所述步骤(1)中的杂交具体为：在滚动杂交炉中55℃、20rpm滚动杂交20h。
所述步骤(1)中的洗涤采用基因表达洗涤缓冲液洗涤。
所述步骤(2)中逆转录采用的逆转录混合液的组成为：总体积20μl，5×Hispecbuffer 4μl，10×miscript Mix 2μl，Reverse Transcriptase Mix 2μl，Template RNA500ng，其余为DEPC水(5×Hispec缓冲液4μl，10×miscript预混液2μl，逆转录酶混合液2μl，RNA模板500ng，其余为DEPC水)。
所述步骤(2)中逆转录条件为：37℃反应1h，95℃反应5min，随后降至4℃。
所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应体系为：cDNA模板1μl，上下游引物各1μl，SYBR 5μl，DEPC水2μl。
所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性15min；94℃10s，55℃30s，70℃30s，45个循环。
所述miR-4443用于制备GD的生物标志物。
有益效果
本发明检测方法提高了灵敏度，揭示了miR-4443在GD免疫致病过程中的作用，为miR-4443及其靶基因成为GD新的生物标志物、新靶点的研究提供了基础。
附图说明
图1为PCR扩大样本验证芯片结果，40例uGD患者与30例hCD的比较；
图2为miR-4443、miR-31-3P、miR-10a和miR-125b-5p在40例uGD、30例eGD、18例nGD和30例hCD中的表达情况；
图3为miR-4443对CD4+T淋巴细胞增殖的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.microRNA芯片分析
(1)选取样本：选取3例新诊断的GD患者和3例正常志愿者的CD4+T淋巴细胞的RNA进行芯片检测。
(2)RNA的纯化与质控：采用miRNeasy Mini试剂盒进行样品的总RNA抽提，抽提所得总RNA经安捷伦生物分析仪2100电泳质检合格后备用。RNA质控结果说明：2100RIN＜6.0说明样品已降解；2100RIN≧6.0并且28S/18S≧0.7，表明样品合格，可以进行下一步实验。
(3)样品RNA的标记：实验样品RNA采用安捷伦miRNA芯片配套的试剂盒，按照标准操作流程的标记部分对样品中的miRNA分子进行荧光标记。
(4)芯片杂交：按照安捷伦miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，55℃，20rpm，滚动杂交20小时。杂交完成后在洗缸中洗片，洗片所用的试剂为基因表达洗涤缓冲液。
(5)芯片扫描与数据分析：芯片结果采用安捷伦微阵列扫描仪进行扫描，用FeatureExtraction software 10.7读取数据，软件设置扫描分辨率＝5μm,PMT 100％，5％最后采用Gene Spring
Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Quantile。标化后的芯片数据，按照GD组和正常志愿者组进行分组，采用成组t检验进行比较分析。
2.microRNA的逆转录及实时荧光定量PCR
(1)依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20μl的逆转录体系。
反应体系：
Figure BDA0001042560630000041
反应条件：37℃60min，95℃5min，4℃保存。
(2)反应完毕后cDNA产物加入DEPC水200μl稀释，冻于-20℃保存备用。
(3)引物设计与合成：均购买自qiagen的miScript Primer Assay，包括hsa-miR-10a，
hsa-miR-125b-5p，hsa-miR-4443，hsa-miR-31-3P，RUN6。
(4)realtime PCR反应体系：
Figure BDA0001042560630000042
(5)realtime PCR反应条件：
a)预孵育95℃15分钟；
b)扩增程序94℃15秒；
55℃30秒；
70℃30秒45个循环；
c)溶解曲线95℃5秒；
65℃1分钟；
d)冷却50℃30秒。
实验数据用2-△△CT方法分析相对基因表达差异，RUN6作为内参。
(6)Sequence Detector 1.7软件分析其Ct值，Ct阈值(阈值＝基线信号的标准偏差×10)。Ct值反映了模板扩增到一定量拷贝数时(处于指数上升期)所需反应循环数大小。Ct值越大，参与反应的起始模板量就越小，反之则越大。并计算△△Ct及RQ(relativequantity)值。
3.GD患者及正常对照组CD4+T淋巴细胞中microRNA表达谱
运用microRNA microarray芯片检测miRNAs在3个初诊断GD患者及3个正常志愿者CD4+T淋巴细胞中的表达谱。芯片中，共检测了2006个miRNAs的表达情况(表1)。根据两组间miRNA表达差异倍数大于1.8或小于-1.8，p值<0.05，以及miRNA的相对表达量，发现miR-10a，iR-125b和miR-4443在GD组中表达显著改变。其中miR-10a和miR-125b表达下调，倍数改变分别为-2.7倍和-1.9倍，P值分别为0.0004和0.047。GD组中miR-4443表达上调，差异倍数为1.9倍，P值为0.02。
表1GD中表达差异明显的miRNAs
Figure BDA0001042560630000051
为了验证microarray芯片结果，以RNU6-2为内参，real-time PCR检测40例uGD患者，30例eGD患者，18例nGD患者，以及30例hCD者CD4+T淋巴细胞中的miR-10a，miR-125b和miR-4443表达水平。同时考虑到芯片筛查时样本量小，可能存在假阴性的情况，结合芯片数据，检测了既往报道GD患者外周血PBMCs或T淋巴细胞中存在差异表达的miR-31-3p，miR-142-3p，miR-146a，miR-200a和miR-155。与芯片结果一致，和正常对照组相比，初诊断GD组中miR-31-3p，miR-10a，miR-125b表达下调，miR-4443表达增加(p值均小于0.01)，miR-142-3p略有下调(p＝0.053)，其余miRNAs表达均无明显差异(图1)。同时随着治疗的进展，除了miR-125b外，miR-31-3p，miR-10a和miR-4443表达水平均逐渐恢复正常，nGD组miRNAs表达与正常对照组无显著差异(p值均大于0.05)(图2)。
4.miRNAs表达水平与临床参数的相关关系
将40个初诊断GD患者的miR-31-3P，miR-10a，miR-125b和miR-4443表达水平与GD诊断相关临床指标：FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb及TGAb水平进行Spearman相关分析。结果显示仅miR-4443与FT3(r＝0.350；p＝0.025)、FT4(r＝0.328；p＝0.036)和TRAb(r＝0.338；p＝0.031)水平显著正相关。进一步以miR-4443为依赖变量，将p<0.20的FT3、FT4和TRAb为协变量进行多元逐步回归分析，结果显示miR-4443与TRAb(0.042±0.014；p＝0.005)显著正相关(表2)。这些数据提示miR-4443与GD的发生、发展密切相关，因此选择miR-4443进行深入研究。
表2
miR-31-3P、miR-10a、miR-125b-5p和miR-4443与GD相关临床参数的相关性和多元逐步回归分析
Figure BDA0001042560630000061
其中，r,相关系数；β,回归系数；SE,标准误差。
5.miR-4443对CD4+T淋巴细胞增殖和凋亡的作用
运用CCK8实验观察CD4+T淋巴细胞的增殖情况，发现正常CD4+T淋巴细胞转染miR-4443mimics并激活后可明显促进细胞增殖，而源自初诊断GD患者的CD4+T淋巴细胞转染miR-4443inhibitors并激活后可抑制增殖(图3)。
6.结论
本实施例通过miRNA芯片筛查及realtime-PCR扩大样本验证发现miR-4443、miR-31-3P、miR-10a和miR-125b在初诊断GD患者和正常志愿者中存在显著的表达差异，并随着疾病的缓解逐渐恢复正常。将miRNAs表达量与GD相关临床参数进行相关性分析，发现只有miR-4443表达水平与FT3、FT4和TRAb显著正相关。与治疗前相比，miR-4443表达水平在甲状腺功能恢复正常及TRAb转阴性患者中显著下调，逐步恢复正常水平。因此，选择miR-4443进行后续深入研究。
本实施例显示在T淋巴细胞活化和分化过程中，很多miRNAs的表达会发生改变。为了观察miR-4443表达增加是否继发于T淋巴细胞活化，用anti-CD3/CD28抗体刺激CD4+T淋巴细胞，结果发现miR-4443表达无明显变化。此外，血清甲状腺激素T3、T4水平的增加是造成GD临床症状和体征的原因，而其中T3对靶组织作用的活性是T4的4倍。之前的研究也发现T3可能影响GD PBMCs中特定miRNAs的表达，但此项研究发现T3并不会改变miR-4443的表达。因此认为，miR-4443表达改变并不是继发于GD，而可能是GD发生的原因。
本实施例中发现正常CD4+T淋巴细胞中高表达miR-4443后，细胞增殖增加；而降低新诊断GD患者CD4+T淋巴细胞中miR-4443表达，也下调细胞增殖。结合前述结果，认为miR-4443有促进CD4+T参与炎症反应的作用。
本实施例揭示了miR-4443在GD免疫致病过程中的作用，但miR-4443及其靶基因能否成为GD新的生物标志物、新靶点尚待更为深入的研究。

Claims (7)

1.一种检测miR-4443的芯片在制备诊断Graves’病的试剂中的用途，其特征在于：检测方法如下：
(1)提取CD4+T淋巴细胞的RNA作为样品，将样品与芯片杂交，杂交完成后洗涤芯片，对芯片进行扫描，筛选出miR-4443的表达水平；
(2)将上述样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进行miR-4443特异性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值并对步骤(1)中芯片反映的结果进一步验证，即可。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤(1)中的杂交具体为：在滚动杂交炉中55℃、20rpm滚动杂交20h。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤(1)中的洗涤采用基因表达洗涤缓冲液洗涤。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤(2)中逆转录采用的逆转录混合液的组成为：总体积20μl，5×Hispec缓冲液4μl，10×miscript预混液2μl，逆转录酶混合液2μl，RNA模板500ng，其余为DEPC水。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤(2)中逆转录条件为：37℃反应1h，95℃反应5min，随后降至4℃。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应试剂为：cDNA模板1μl，上下游引物各1μl，SYBR 5μl，DEPC水2μl。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤(2)中实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性15min；94℃10s，55℃30s，70℃30s，45个循环。
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