CN112004550A - 用于治疗视神经脊髓炎的重组IgG Fc多聚体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了重组IgG Fc多聚体用于治疗视神经脊髓炎(NMO)的用途，以及通过施用这类多聚体治疗NMO的方法。

Description

用于治疗视神经脊髓炎的重组IgG Fc多聚体
背景
本公开内容提供了重组IgG Fc多聚体在治疗视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica，NMO)中的用途，以及通过施用此类多聚体来治疗NMO的方法。
血浆来源的免疫球蛋白G(IgG)在临床中用于治疗原发性和继发性免疫缺陷。在这种情况下，可以静脉内(IVIG)或皮下(SCIG)施用IgG。两者都是从超过10,000个供体的大型血浆库中制备的，从而确保了多样化的抗体库。
施用高剂量的IVIG(1-2g/kg/剂量)已越来越多地用于治疗患有慢性或急性自身免疫和炎性疾病的患者，例如免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)，格林-巴雷综合征(Guillain–Barré syndrome)，川崎病(Kawasaki disease)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy，CIDP)，重症肌无力(MG)和其他几种罕见疾病。另外，目前正在探索IVIG在其他几种适应症中的标签外用途，例如用于治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)。
对于高剂量IVIG的抗炎作用，已经提出了许多作用机理。这些包括Fc受体(FcRs)的阻断，新生儿FcR(FcRn)的饱和以增强自身抗体清除，抑制性FcRIIB(CD32B)的上调，补体蛋白片段的清除和补体片段沉积的抑制，IVIG中的抗独特型抗体(Abs)，免疫介质(例如细胞因子)的结合或中和，或免疫细胞的调节(例如调节性T细胞，B细胞或致耐受性树突状细胞的诱导)。
需要有效和安全的治疗视神经脊髓炎谱类疾病(以下称为NMO)的方法，该疾病是一种以星形胶质细胞损伤、炎症和脱髓鞘为特征的中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病(Hengstman等人,2007.Mult.Scler.13,679-682；Misu等人,2007Brain 130,1224-1234；Papadopoulos and Verkman,2012,Lancet Neurol.11,535-544)。当前的治疗方法包括免疫抑制剂，血浆置换和B细胞耗竭，针对几种NMO发病机理(例如补体，IL-6受体和NMO自身抗体相互作用)的几种药物正在评估中或处于临床前开发阶段(Araki等人,2014,Neurology82,1302-1306；Cree等人,2005,Neurology 64,1270-1272；Greenberg等人,2012,Mult.Scler.18,1022-1026；Kageyama等人,2013,J.Neurol.260,627-634；Papadopoulos等人,2014,Nat.Rev.Neurol.10,493-506；Verkman等人,2013,Brain Pathol.23,84-695)。大多数NMO患者的抗aquaporin-4(AQP4，一种在星形胶质细胞上表达的水通道)的IgG1自身抗体(称为AQP4-IgG或NMO-IgG)呈血清阳性，其中AQP4-IgG与AQP4的结合会通过补体和细胞效应子机制对星形胶质细胞造成原发性损伤，产生炎症和少突胶质细胞损伤(Asgari等人,2013,J.Neuroimmunol.254,76-82；Graber等人,2008,J.Neuroinflam.5,22；Jarius等人,2014；Jarius和Wildemann,2010,Nat.Rev.Neurol.6,383-392；Lennon等人,2005,J.Exp.Med.202,473-477；Lucchinetti等人,2002,Brain 125,1450-1461；Parratt和Prineas,2010,Mult.Scler.16,1156-1172)。
尽管有很多传闻，但一些临床研究支持IVIG在NMO中的功效(Bakker等人,2004,Can.J.Neurol.Sci.31,265-267；Elsone等人,2014,Mult.Scler.20,501-504；Magraner等人,2013,Neurologia 28,65-72；Okada等人,2007,Intern.Med.46,1671-1672；Viswanathan等人,2015,J.Neuroimmunol.282,92-96；Wingerchuk 2013,J.Clin.Immunol.33,Suppl 1：S33-37)。先前在NMO的实验小鼠模型中证实了约50％的病理减少，其中以产生的血清水平与用IVIG治疗的人中的血清水平相当的剂量施用IVIG(Ratelade等人,2014,Mol.Immunol.62,103-114)。IVIG对NMO病理学的降低涉及补体和细胞介导的AQP4-IgG星形胶质细胞损伤的减少。最近还报道了在通过鞘内途径施用人NMO患者血清的大鼠中IVIG的部分疗效(Grünewald等人,2016,17,pii：E1407.doi：10.3390/ijms17091407)。
有趣的是，上面提到的几个特性只能用IgG的Fc部分概括。各种基于Fc的重组治疗剂正在开发中，包括Fc融合蛋白和多聚体蛋白，它们已在关节炎、ITP和炎症性神经病的实验动物模型中显示出功效(Anthony等人,2008,Science 320,373-376；Czajkowsky等人,2015,Sci.Rep.5,9526；Jain等人,2012,Arthritis Res.14,R192；Lin等人,2007,J.Neuroimmunol.186,133-140；Niknami等人,2013,J.Peripher.Nerv.Syst.18,141-152；Thiruppathi等人,2014,J.Autoimmun.52,64-73)。
在WO 2008/151088、WO 2012/016073或WO 2017/019565中描述了包含多个Fc结构域的预期IVIG替代蛋白。尽管设想了具有多个Fc片段的构建体的多种不同构型，但所公开的这类构建体的主要类别是所谓的斯塔都聚体(stradomers)，其包含具有多聚化结构域例如IgG2铰链区的Fc片段。然而，在WO 2008/151088中没有提供关于设想的多聚体蛋白的功效的有效实施例。
在本发明中可能有用的具有多聚化结构域的其他Fc多聚构建体包括六聚构建体，其中IgM尾端(tailpiece)用于使IgG Fc片段多聚化。例如，WO 2014/060712公开了一种Fc多聚体构建体，其包含具有截短的铰链区的IgG1Fc区，四氨基酸的接头和IgM尾端，其多聚化成主要为六聚的结构。引入Fc残基309和310处的突变(L309C和H310L)以模拟IgM的序列。
WO 2015/132364和WO 2015/132365公开了几种Fc多聚体构建体，其包含五个氨基酸的铰链区，衍生自IgG1、IgG4或IgG1和IgG4CH2和CH3结构域的杂合物的Fc区，以及IgM或IgA尾端。本公开涉及通过在融合肽的Fc区中引入氨基酸变化来提高IgG Fc多聚体的安全性和功效。
在WO 2017/129737中公开了优化的六聚Fc-TP构建体，其显示出在体内、离体和体外比先前所述的那些具有多种益处。Fc-μTP-和Fc-μTP-L309C结合的C1q不会诱导补体蛋白C2的裂解，因此没有形成C3转化酶(C4b2a)。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C选择性抑制整个经典补体途径的激活；没有观察到对替代途径的干扰。
发明人现已令人惊讶地发现具有多聚化结构域的Fc多聚体，例如Fc-μTP和Fc-μTP-L309C，在治疗视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)方面是有效的。已证明的FC多聚体构建体的令人惊讶的治疗用途包括：
*令人惊讶地在NMO的体外模型中抑制补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞的细胞毒性。
*在NMO的脊髓切片模型中令人惊讶地抑制补体依赖性细胞毒性并调节离体病理学。
*出人意料地在NMO大鼠模型中预防了体内的细胞毒性和病理学。
概述
本公开提供了一种治疗视神经脊髓炎的方法，其包括施用包含多聚化结构域的Fc多聚体。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明中使用的Fc多聚体包含2至6个IgG Fc融合单体，例如WO 2017/129737中所述的那些。每个IgG Fc融合单体包含两条Fc融合多肽链，并且每个Fc融合多肽链包含IgG Fc多肽和IgM尾端。在一个优选的实施方案中，所述Fc多聚体是Fc六聚体，其包含六个IgG Fc融合单体。
在另一个优选的实施方案中，所述Fc融合多肽链还包含IgG铰链区，并且Fc融合多肽链不包含Fab多肽。
例如，在一个优选的实施方案中，用于本发明的Fc融合多肽链包含IgG1铰链区，IgG1Fc结构域和IgM尾端，并且不包含Fab多肽。在一个优选的实施方案中，每个Fc融合多肽链中的IgM尾端在IgG1Fc多肽的恒定区的C-末端包含与232个氨基酸融合的18个氨基酸。在另一个优选的实施方案中，Fc融合多肽链是SEQ ID NO：1，并且具有多达5个保守氨基酸变化。在一个单独的优选实施方案中，Fc融合多肽链表达为SEQ ID NO：2(对应于WO 2017/129737的SEQ ID NO：7)，在分泌和形成成熟Fc六聚体的过程中从中切割了信号肽。
在一个优选的实施方案中，所述Fc融合多肽链包含IgG1铰链区，IgG1Fc结构域和IgM尾端，其中所述IgG1Fc结构域在位置309(根据EU编号)具有半胱氨酸而不是亮氨酸，并且其中Fc融合多肽不包含Fab多肽，且Fc融合多肽链为SEQ ID NO：3(对应于WO 2017/129737的SEQ ID NO：2)。在另一个优选的实施方案中，Fc融合多肽链是具有最多5个保守氨基酸变化的SEQ ID NO：3。在一个单独的优选实施方案中，Fc融合多肽链表达为SEQ ID NO：4(对应于WO 2017/129737的SEQ ID NO：8)，在分泌和形成成熟Fc六聚体的过程中，从中切除掉信号肽。
用于本发明的另一个实施方案是编码Fc融合多肽链的多核苷酸，优选地，该多核苷酸还编码连接至所述Fc融合多肽链的信号肽。
在一个优选的实施方案中，所述Fc六聚体在体外在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中以浓度依赖的方式阻断补体依赖性的细胞毒性和抗体依赖性的细胞毒性。
在一个优选的实施方案中，Fc六聚体阻断了来自血清阳性的视神经脊髓炎患者的血清在体外在中国仓鼠卵巢细胞中引发的补体依赖性细胞毒性。
在一个优选的实施方案中，所述Fc六聚体在视神经脊髓炎的离体脊髓切片模型中防止补体依赖性细胞毒性和病理学。
在一个优选的实施方案中，Fc六聚体在由视神经脊髓炎的实验大鼠模型中防止由AQP4-IgG和大鼠补体产生的补体依赖性细胞毒性和病理学。在一个优选的实施方案中，Fc六聚体在视神经脊髓炎的实验大鼠模型中防止星形胶质细胞损伤、脱髓鞘、炎症和活化补体的沉积。
在一个优选的实施方案中，所述Fc六聚体结合补体成分C1q而不是AQP4-IgG或其与AQP4的结合。在一个实施方案中，与C1q结合的所述Fc六聚体不诱导完整经典补体途径的活化。
本公开还提供了通过将治疗有效量的Fc六聚体的药物组合物施用于有需要的受试者来治疗受试者的视神经脊髓炎的方法。
在一个优选的实施方案中，所述Fc六聚体通过静脉内或非静脉内施用。在一个实施方案中，所述Fc六聚体皮下施用。在一个实施方案中，通过经口、鞘内或雾化肺内施用所述Fc六聚体。
在一个优选的实施方案中，以约10mg/kg至约200mg/kg的量施用所述Fc六聚体。在一个实施方案中，以约25mg/kg至约500mg/kg的量施用Fc六聚体。所有剂量均是每公斤受试者体重所给予的Fc六聚体的剂量。
在一个可选的实施方案中，本发明中使用的Fc多聚体是斯塔都聚体，其中IgG Fc片段具有多聚化结构域，优选IgG2铰链区，如WO 2008/151088、WO 2012/016073或WO 2017/019565中所公开的。在一个优选的实施方案中，通过表达包含SEQ ID NO：5的多肽链来产生Fc多聚体，其中成熟的Fc多聚体包含SEQ ID NO：5的残基21至264。
应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅是示例性和说明性的，并且旨在提供本公开的进一步的非限制性解释。
附图的简要说明
图1A显示了所测试的四种Fc制剂的结构：(a)临床级IVIG(合并的人IgG)，(b)Fc单体，(c)Fc-μTP六聚体，和(d)Fc-μTP-L309C六聚体。
图1B显示Fc-μTP(左)和Fc-μTP-L309C(右)Fc蛋白的SDSPAGE。显示了以kDa为单位的分子量标记。
图1C显示了Fc-μTP(左)和Fc-μTP-L309C(右)的尺寸排阻色谱(SEC)。色谱图显示归一化的280nm处的U.V.吸光度信号(A280)，粗黑线显示了在指定时间洗脱的物质的分子量(kDa)，由多角度光散射(MALS)确定。
图1D显示了Fc-μTP(左)和Fc-μTP-L309C(右)的不对称流场流分馏(asymmetricalflow field-flow fractionation，AF4)。色谱图显示归一化的A280信号，粗黑线显示在指定时间洗脱的物质的分子量(kDa)，由MALS确定。
图2显示了LPS对NFB的激活，但Fc蛋白Fc-μTP和Fc-μTP-L309C不激活，表明没有内毒素污染。
图3A显示了在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体的补体依赖性细胞毒性的抑制百分比。在加入细胞之前，将Fc制品与1％或0.5％人补体预温育。
图3B显示了Fc单体和IVIG在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中对补体依赖性细胞毒性的抑制百分比。
图3C显示50μg/ml和100μg/ml浓度的Fc-μTP-L309C六聚体在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中对补体依赖性细胞毒性的抑制百分比。
图3D显示了Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体在中国仓鼠卵巢细胞中对补体依赖性细胞毒性的抑制百分比，其中来自血清阳性的视神经脊髓炎患者的血清引发了细胞毒性。
图4A显示了视神经脊髓炎的离体脊髓切片模型的免疫荧光染色。脊髓切片与(a)对照IgG和人补体，(b)AQP4-IgG和人补体，(c)AQP4-IgG、人补体和Fc-μTP以及(d)AQP4-IgG、人补体和Fc-μTP-L309C一起孵育。AQP4和GFAP染色缺失指示星形胶质细胞损伤，MBP染色减少指示脱髓鞘，Iba-1染色增加指示炎症，C5b-9染色指示补体末端膜攻击复合物的沉积。
图4B总结了每个治疗组的脊髓切片模型的病理学评分。
图5显示Fc单体，IVIG，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中对抗体依赖性细胞的细胞毒性的抑制百分比。
图6A显示了表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞的免疫荧光染色。将细胞与AQP4-IgG孵育，以确定在Fc-μTP-L309C六聚体存在下与AQP4结合的潜力。
图6B显示了用AQP4结合的AQP4-IgG对中国仓鼠卵巢细胞进行的免疫荧光染色。在20μg/mlFc-μTP-L309C六聚体、100μg/mlFc-μTP-L309C六聚体和100μg/ml Fc单体存在下，将细胞与C1q孵育以确定结合与AQP4结合的AQP4-IgG的潜力。
图6C显示了在存在各种浓度的Fc-μTP-L309C六聚体和人补体的情况下，在红细胞裂解模型中激活经典或替代补体途径所产生的溶血百分比。(i)显示了在升高浓度的人补体情况下，经典或替代补体途径的激活所产生的溶血百分比。(ii)显示了在升高浓度的Fc-μTP-L309C六聚体和1％或5％浓度的人类补体存在下，经典补体途径的激活所产生的溶血百分比。(iii)显示了在升高浓度的Fc-μTP-L309C六聚体和5％或10％浓度的人类补体存在下，通过激活替代补体途径而产生的溶血百分比。
图7A显示了在1％或2％大鼠血清存在下，在视神经脊髓炎的实验大鼠模型中，Fc-μTP-L309C六聚体以浓度依赖性方式对补体依赖性细胞毒性进行抑制的百分数。
图7B显示了在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中体外补体依赖性细胞毒性的抑制百分比。将细胞暴露于在两小时服用0mg/kg、3.125mg/kg、6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg剂量的Fc-μTP-L309C六聚体后从大鼠收集的血清。
图7C显示了在表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞中体外对补体依赖性细胞毒性的抑制百分比的时间进程。将细胞暴露于在施用50mg/kg剂量的Fc-μTP-L309C六聚体后的不同时间点从大鼠收集的血清。
图8A显示了用AQP4-IgG治疗的大鼠的大脑中的免疫荧光染色。AQP4通过脑内注射给大鼠。大鼠同时接受AQP4和50mg/kg剂量的Fc-μTP-L309C六聚体治疗，并在初始治疗后12小时再次用六聚体治疗。收获大脑，并将切片与对照IgG或Fc-μTP-L309C孵育。显示了未注射的对侧半球的免疫荧光进行比较。AQP4和GFAP染色缺失指示星形胶质细胞损伤，MBP染色降低指示脱髓鞘，Iba-1和CD45染色增加指示炎症，C5b-9染色指示补体末端膜攻击复合物的沉积。
图8B显示了用大量AQP4-IgG处理的大鼠脑中的免疫荧光染色。大鼠同时接受AQP4和50mg/kg剂量的Fc-μTP-L309C六聚体治疗，并在初始治疗后12小时再次用六聚体治疗。收获大脑，并将切片与对照IgG或Fc-μTP-L309C孵育。显示了未注射的对侧半球的免疫荧光进行比较。AQP4和GFAP染色的缺失指示星形胶质细胞损伤，MBP染色减少指示脱髓鞘。
图9：来自WO2017/129737的序列
图10：在本发明的实施方案中使用的其他六聚体序列
图11：在本发明的实施方案中使用的斯塔都聚体序列
图12：用于本发明的实施方案中的如WO 2017/172853中所公开的重组Fc化合物。
图13：用于本发明实施方案的Fc多聚体中使用的合适的铰链区的实例。
详细描述
以下详细描述和实施例示出了本公开的某些实施方式。本领域技术人员将认识到，本公开的范围涵盖了本公开的许多变化和修改。因此，某些实施方式的描述不应被认为是限制性的。
如本文所用，术语“Fc单体”被定义为包含IgG的重链CH2和CH3结构域的免疫球蛋白G(IgG)重链恒定区的一部分或其变体或片段。IgG CH2和CH3域也分别称为C2和C3域。
Fc单体可以由两个相同的Fc肽组成，它们通过肽的N-末端部分中的半胱氨酸残基之间的二硫键连接。针对IgG描述的二硫键的排列适合天然人抗体。来自其他脊椎动物物种的抗体之间可能会有一些差异，尽管这种抗体可能适用于本发明。Fc肽可以通过重组表达技术产生，并且如天然抗体中那样通过二硫键缔合。或者，可以在Fc肽的适当位置引入一个或多个新的半胱氨酸残基，以使得能够形成二硫键。
在一个实施方案中，用于本发明的Fc单体包含两条相同的肽链，它们含有如WO2017/129737中所述的人IgG1CH2和CH3结构域。
在另一个实施方案中，用于本发明的Fc单体包括完整的CH2和CH3结构域，并且分别在CH2的N-末端或CH3的C-末端截短，如WO 2017/129737中所公开的。通常，Fc单体缺乏免疫球蛋白的Fab多肽。Fab多肽由CH1结构域和重链可变区结构域组成。
用于本发明的Fc单体可包含多于免疫球蛋白的CH2和CH3部分。例如，在一个实施方案中，单体包括免疫球蛋白的铰链区，其片段或变体，或者修饰的铰链区。天然铰链区是免疫球蛋白的区域，其存在于天然免疫球蛋白的CH1和CH2结构域之间。变体或修饰的铰链区是长度和/或组成与天然铰链区不同的任何铰链。这样的铰链可以包括来自其他物种的铰链区。其他修饰的铰链区包含源自与Fc部分的抗体不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。备选地，修饰的铰链区包括天然铰链或重复单元的一部分，其中重复中的每个单元均来自天然铰链区。在另一替代方案中，通过增加或减少半胱氨酸残基的数目来改变天然铰链区。其他修饰的铰链区完全是非天然的，并且被设计为具有所需的特性，例如长度、半胱氨酸组成和柔韧性。
可用于本发明的许多修饰的铰链区已经有描述，例如描述于US 5,677,425、WO1998/25971、WO 1999/15549、WO 2005/003169、WO 2005/003170和WO 2005/003171中。
在本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体中的Fc多肽在其N末端具有人IgG1铰链区。在一个实施方案中，铰链区具有SEQ ID NO：1的残基1至15的序列。
如WO 2017/129737中公开的表达用于本发明的包含信号肽的Fc多肽链。信号肽指导Fc多肽链的分泌，然后从Fc多肽链的其余部分切割下来。
在本发明的实施方式中使用的Fc多肽包括与铰链区的N-末端融合的信号肽。信号肽可具有SEQ ID NO：2的残基1至19的序列。然而，本领域技术人员将意识到，也可以使用指导蛋白质从哺乳动物细胞分泌的其他信号序列。
为了改善两个或多个Fc单体的多聚体结构的形成，将Fc肽于尾端融合，其使得单体单元组装成多聚体。Fc肽与尾端融合的产物是本文所用的“Fc融合肽”。如同Fc肽二聚形成Fc单体一样，Fc融合肽同样二聚形成Fc融合单体。
因此，本文所用的“Fc融合单体”包含两条Fc融合多肽链，并且每条Fc融合多肽链均包含IgG Fc多肽和IgM尾端。
合适的尾端源自IgM或IgA。IgM和IgA作为常见H2L2抗体单元的共价多聚体天然存在于人类中。IgM中掺入J链时会以五聚体的形式出现，而缺少J链时会以六聚体的形式出现。IgA以单体形式存在并形成二聚体。IgM和IgA的重链各自具有到C末端恒定结构域的各自的18个氨基酸延伸，被称为尾端(tailpiece)。该尾端包括在聚合物中的重链之间形成二硫键的半胱氨酸残基，并且据信在聚合中具有重要作用。尾端还包含一个糖基化位点。
本公开的尾端包含任何合适的氨基酸序列。尾端是在天然存在的抗体中发现的尾端，或者替代地，它是长度和/或组成上与天然尾端不同的修饰的尾端。其他修饰的尾端是完全非天然的，并且被设计为具有多聚化所需的性质，例如长度、柔韧性和半胱氨酸组成。
本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体的尾端包含如SEQ ID NO：1的残基233至250和SEQ ID NO：11所示的人IgM的18个氨基酸序列的全部或部分。或者，尾端可以是人IgM尾端的片段或变体。
在本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体中的尾端直接融合至Fc肽恒定区的C末端以形成Fc融合肽。或者，将尾端融合至Fc肽恒定区C端的232个氨基酸区段。或者，通过插入的氨基酸序列将尾端间接融合。例如，可以在尾端和Fc肽之间提供短的接头序列。接头序列的长度可以在1至20个氨基酸之间。
通过将Fc融合肽的Fc部分的亮氨酸309突变为半胱氨酸，可以进一步改善多聚体结构的形成。L309C突变允许在Fc融合单体之间形成额外的二硫键，从而进一步促进Fc融合单体的多聚化。IgG Fc部分的残基根据Edelman GM等人(1969)，Proc Natl Acad Sci 63，78-85所述的IgG的EU编号系统编号。还参见Kabat等人,1983,Sequences of proteins ofimmunological interest,US Department of Health and Human Services,NationalInstitutes of Health,Washington,DC。IgG的Leu 309通过序列同源性对应于IgM的Cμ3结构域中的Cys414和IgA的Cα2结构域中的Cys 309。
将其他突变另外或替代地引入Fc融合肽中以实现期望的效果。如本文所用，术语“突变”包括一个或多个氨基酸的取代\添加或缺失。在一些实施方案中，如WO 2017/129737中所述，Fc融合肽包含最多20个、最多10个、最多5个或最多2个氨基酸突变。
如WO 2017/129737中所述，在本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体中的突变是保守的氨基酸变化。如本文所用，术语“保守氨基酸改变”是指氨基酸改变为具有相似生物化学性质(例如电荷，疏水性，结构和/或大小)的不同氨基酸。在本发明的一个实施方案中使用的Fc融合肽包含最多20个、最多10个、最多5个或最多2个保守氨基酸变化。例如，Fc融合肽包含多达5个保守氨基酸变化。
保守的氨基酸变化包括以下残基组内的变化：Val,Ile,Leu,Ala,Met；Asp,Glu；Asn,Gln；Ser,Thr,Gly,Ala；Lys,Arg,His；以及Phe,Tyr,Trp。
当本文中用于描述肽、蛋白质或其片段时，“变体”可以具有修饰的氨基酸。合适的修饰包括乙酰化、糖基化、羟基化、甲基化、核苷酸化、磷酸化、ADP-核糖基化和本领域已知的其他修饰。这样的修饰可以在翻译后发生，其中通过重组技术制备肽。另外，可以使用本领域已知的技术对合成肽进行修饰。在将氨基酸掺入肽之前可包括修饰。羧酸基团可以被酯化或可以转化为酰胺，氨基可以被烷基化，例如甲基化。还可以在翻译后修饰变体，例如以去除或添加碳水化合物侧链或单个糖部分。
如本文所用，术语“Fc多聚体”描述了两个或更多个聚合的Fc融合单体。Fc多聚体包含2至6个Fc融合单体，产生Fc二聚体、Fc三聚体、Fc四聚体、Fc五聚体和Fc六聚体。Fc融合单体自然地缔合成具有不同数量单体单元的聚合物。
如WO 2017/129737中所公开的，大多数Fc多聚体是Fc六聚体。如本文所用，术语“大多数”是指大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。在一个实施方案中，大于80％的Fc多聚体是Fc六聚体。
如果需要包含特定数量的单体的Fc多聚体，则可以根据分子大小，例如通过凝胶过滤(尺寸排阻色谱法)分离Fc多聚体。
在一个实施方案中，本发明中使用的Fc多聚体是包含多个Fc结构域的前瞻性IVIG置换蛋白，如例如在WO 2008/151088、WO 2012/016073或WO 2017/019565中所述。
在另一个实施方案中，如WO 2008/151088中所述，多聚体Fc是具有多聚化结构域例如IgG2铰链区的斯塔都聚体。
在一个实施方案中，本发明中使用的Fc多聚体是包含两个或更多个多聚化单元的化合物，其中每个所述单元包括多聚化区和包含能够与Fc受体结合的至少一个Fc结构域的区域，其中每个所述单元包括多聚化区单体和含有至少一个Fc结构域单体的区域，其中所述两个单体的二聚化形成一个多聚区和一个包含至少一个能够与Fc受体结合的Fc结构域的区域，其中所述两个或多个单元的多聚化发生区多聚化以形成所述化合物，并且其中所述化合物能够通过第一Fc结构域结合至第一Fc受体和通过第二Fc结构域结合至第二Fc受体，其中所述多聚化区选自IgG2铰链、IgE CH2结构域、亮氨酸拉链、异亮氨酸拉链和锌指，并且其中包含能够与Fcγ受体结合的至少一个Fc结构域的每个所述区域包含IgG1铰链、IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域，如例如在WO 2008/151088、WO2012/016073和WO 2017/019565所公开的，其全部内容通过引用合并于此。优选地，所述多聚化区是IgG2铰链区，例如IgG2的12个氨基酸铰链区ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：5中的253至264位残基)。更优选地，通过表达SEQ ID NO：5的多肽(WO 2012/016073中的SEQ ID NO：4)获得Fc多聚体，其通过IgG2铰链多聚化结构域自发地多聚化。更优选地，如WO 2017/019565中提供的，将一个或多个点突变引入IgG1Fc片段中以优化C1q结合和/或Fc受体结合。
优选地，所述Fc多聚体包含斯塔都聚体单元，其包含(a)具有对应于IgG1Fc结构域的位置267、268和/或324中的至少一个的一个或多个点突变的至少一个IgG1 Fc结构域，和(b)至少一个多聚化结构域。优选地，点突变是S267E、H268E和S324T。Fc结构域可进一步在位置297处包含点突变，例如N297A。Fc结构域还可在位置234和235处包含点突变，例如，Fc结构域可包含点突变L234V，L235A，S267E，H268F和S324T。
因此，在本发明的这些实施方案中，用于本发明的Fc多聚体包含具有选自SEQ IDNO：6的残基21至264和SEQ ID NO：7的残基21至264的序列的斯塔都聚体单元，并且可以包含最多10个其他点突变，优选最多8个其他点突变，更优选最多6个其他点突变。优选地，那些点突变选自WO 2017/019565中公开的那些。在本发明的另外的实施方案中，本发明中使用的Fc多聚体包含具有分别选自SEQ ID NO：99至105的残基21至264(其对应于WO2017/019565中的SEQ ID NO：10、11、12、14、15、21和22)的斯塔都聚体单元。
在另一个替代的实施方案中，用于本发明的重组Fc化合物是如WO 2017/172853中所公开的，其通过引用整体并入本文。优选地，所述重组Fc化合物包含含有两个CH2-CH3Fc结构域和寡聚化肽结构域的单链Fc肽。优选地，所述重组Fc化合物包含SEQ ID NO：8(WO2017172853中的SEQ ID NO：6)或SEQ ID NO：9(WO2017172853中的SEQ ID NO：4)的蛋白质。
多核苷酸
本公开进一步涉及编码用于Fc多聚体的Fc融合肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”通常是指可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸。多核苷酸可以是单链或双链DNA，单链或双链RNA。如本文所用，术语“多核苷酸”还包括包含一个或多个修饰的碱基和/或非寻常碱基例如肌苷的DNA或RNA。应当理解，可以对DNA和RNA进行多种修饰，以实现本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语“多核苷酸”包括多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA的化学形式，包括例如简单和复杂细胞。
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，给定的多肽可以由不同的多核苷酸编码。这些“变体”被本文公开的Fc多聚体所涵盖。
Fc多聚体的多核苷酸可以是分离的多核苷酸。术语“分离的”多核苷酸是指基本上不含其他核酸序列(例如但不限于其他染色体和染色体外DNA和RNA)的多核苷酸。在一个实施方案中，所述分离的多核苷酸是从宿主细胞中纯化的。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
本公开的另一方面是包含根据本公开的多核苷酸的质粒或载体。在一个实施方案中，如WO 2017/129737中公开的，质粒或载体包含表达载体。在一个实施方案中，载体是用于人类基因治疗的转移载体。本公开的另一方面是包含本公开的多核苷酸、质粒或载体的宿主细胞。
本发明的宿主细胞被用于产生Fc多聚体的方法中。该方法包括：
(a)在表达所需插入蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞；和
(b)任选地从宿主细胞或培养基中回收所需的插入蛋白。
在一个单独的实施方案中，所述Fc多聚体被纯化至相对于污染的大分子(例如其他蛋白质和核酸)而言≥80％纯度，≥90％纯度，≥95％纯度，≥99％纯度或≥99.9％纯度，并且不含传染性和热原性物质。本公开内容的分离的Fc多聚体可以基本上不含其他非相关多肽。
在本发明的某些实施方案中，所述Fc多聚体是WO 2014/060712中描述的那些。实例包括包含五个、六个或七个多肽单体单元的聚合蛋白，其中每个多肽单体单元包含含有两个免疫球蛋白G重链恒定区的Fc受体结合部分，其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基通过二硫键与相邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基连接，其中当施用于哺乳动物受试者时，所述聚合蛋白不包含引起抗原特异性的免疫抑制的其他免疫调节部分或抗原部分。在某些方面，所述两个免疫球蛋白G重链恒定区通过多肽接头连接成单链Fc。在其他方面，所述多肽单体单元由Fc受体结合部分和与所述两个免疫球蛋白G重链恒定区融合的尾端区组成，后者有助于将单体单元组装成聚合物。
在另一个实施方案中，每个免疫球蛋白G重链恒定区包含哺乳动物重链恒定区(优选人重链恒定区)的氨基酸序列；或其变体。合适的人IgG亚型是IgG1。
Fc受体结合部分可以不仅包含免疫球蛋白的Fc部分。例如，如WO 2014/060712中所述，其可以包括发生在天然免疫球蛋白的CH1和CH2结构域之间的免疫球蛋白铰链区。对于某些免疫球蛋白，铰链区对于结合Fc受体是必需的。优选地，Fc受体结合部分缺乏CH1结构域和重链可变区结构域(VH)。与相应免疫球蛋白的Fc部分相比，所述Fc受体结合部分可以在C-和/或N-末端被截短。所述聚合蛋白是通过包含半胱氨酸残基的每个免疫球蛋白G重链恒定区形成的，所述半胱氨酸残基通过二硫键与相邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基连接。通过将IgG重链恒定区的部分修饰为更类似于IgM或IgA的相应部分，可以提高基于IgG重链恒定区的单体单元形成聚合物的能力。每个免疫球蛋白重链恒定区或其变体是IgG重链恒定区，其包含在309位具有半胱氨酸残基、并且优选地在310位具有亮氨酸残基的氨基酸序列。
对于存在尾端区域的本发明的方面，每个多肽单体单元包含与两个免疫球蛋白G重链恒定区的每一个融合的尾端区域，其中每个多肽单体单元的尾端区域有助于单体单元的组装成聚合物，例如WO2014/060712中所述的。例如，尾端区域在两个免疫球蛋白重链恒定区的每一个的C末端融合。所述尾端区域可以是IgM或IgA尾端，或者其片段或变体。
在一个实施方案中，可在重链恒定区和尾端之间提供间插的氨基酸序列，或可将尾端直接融合至重链恒定区的C-末端，如WO2014/060712中所公开的。例如，可以在尾端区域和免疫球蛋白重链恒定区之间提供短的接头序列。典型的接头序列长度为1至20个氨基酸，通常长度为2、3、4、5、6或至多8、10、12或16个氨基酸。包括在重链区和尾端区之间的合适的接头编码Leu-Val-Leu-Gly(SEQ ID NO：10)。一个优选的尾端区域是人IgM的尾端区域，其是PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO：11)(Rabbitts TH等人,1981.Nucleic AcidsRes.9(18),4509-4524；Smith等人(1995)J Immunol 154：2226-2236)。通过用Pro取代初始Thr，可以在N端修饰此尾端。这不影响尾端促进单体聚合的能力。人IgM尾端的其他合适的变体在Sorensen等人(1996)J Immunol 156：2858-2865中描述。另一个IgM尾端序列是来自啮齿动物的GKPTLYNVSLIMSDTGGTCY(SEQ ID NO：12)。备选的优选尾端区域是人IgA的尾端区域，其是PTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO：13)。可以使用来自其他物种的IgM或IgA的其他合适的尾端，或者甚至是促进将单体单元组装成聚合物的合成序列。尽管优选使用衍生免疫球蛋白重链恒定区的相同物种的免疫球蛋白尾端，但不必这样做。
在某些方面，尽管聚合蛋白可能能够结合C1q，但是它不激活补体的经典途径。聚合蛋白的直径通常为约20nm，例如15至25nm或至多30nm。由于分子大小和直径的原因，聚合蛋白通常具有良好的组织渗透度。
WO 2014/060712中描述的优选Fc多聚体是SEQ ID NO：14的六聚体(WO 2014/060712中的SEQ ID NO：8)，在分泌过程中从中切除信号肽，使成熟产物包含SEQ ID NO：14的残基21至269。
在本发明的某些实施方案中，所使用的Fc多聚体是WO2015/132364中描述的那些，其涉及与人Fc受体结合的多聚融合蛋白。融合蛋白在没有309位的半胱氨酸残基的情况下包含尾端。
在一个实施方案中，所述多聚体融合蛋白包含两个或更多个多肽单体单元，其中每个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域。每个重链Fc区在位置309处包含除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基，并且在其C端与尾端融合，该尾端使单体单元组装成多聚体。每个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在某些方面，所述多聚体融合蛋白还包含融合伴侣，其可以是抗原，病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，药物，配体，受体，细胞因子或趋化因子。融合伴侣直接地或通过间插的氨基酸序列例如铰链间接地融合到每个重链Fc区的N端。或者，可以在融合伴侣和重链Fc区之间提供短的接头序列。
在其他方面，所述多聚体融合蛋白不包含一个或多个抗体可变区。通常，所述分子不包含VH或VL抗体可变区。在某些其他方面，WO2015/132364的多聚体融合蛋白不包含Fab片段。
在另一个实施方案中，所述多聚体融合蛋白的每个多肽单体单元包含抗体Fc结构域，其可以衍生自任何合适的物种，例如包括人。另外，所述抗体Fc结构域可衍生自任何合适类别的抗体，包括IgA(包括亚类IgG1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。
所述抗体Fc结构域包含两条多肽链，每条称为重链Fc区。所述两个重链Fc区二聚化以产生抗体Fc结构域。抗体Fc结构域内的所述两个重链Fc区可以彼此不同，但是通常是相同的。
通常，每个重链Fc区包含两个或三个重链恒定结构域或由其组成。例如，IgA、IgD和IgG由两个重链恒定域(CH2和CH3)组成，而IgE和IgM由三个重链恒定域(CH2、CH3和CH4)组成。重链Fc区可包含来自一个或多个不同类别的抗体(例如一个、两个或三个不同类别)的重链恒定结构域。
因此，本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体中的重链Fc区包含衍生自IgG1的CH3结构域，例如WO 2015/132364中公开的。在一个单独的实施方案中，重链Fc区包含衍生自IgG4的CH2结构域和衍生自IgG1的CH3结构域。在某些实施方案中，重链Fc区在位置355处包含精氨酸残基。在其他实施方案中，重链Fc区在位置355处包含半胱氨酸残基。
在本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体中的重链Fc区包含来自IgM的CH4结构域。IgM CH4结构域通常位于CH3结构域和尾端之间。
在其他方面，重链Fc区包含衍生自IgG的CH2和CH3结构域以及衍生自IgM的CH4结构域。
所述多聚体融合蛋白的尾端可以包含任何合适的氨基酸序列。它可以是天然存在的抗体中发现的尾端，或者可以是长度和/或组成上与天然尾端不同的修饰的尾端。其他修饰的尾端可以是完全合成的，并且可以设计成具有多聚化所需的性质，例如长度、柔韧性和半胱氨酸组成。尾端可以源自任何合适的物种，包括人类。
所述尾端可包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示的来自人IgM或IgA的18个氨基酸的尾端序列的全部或部分。
尾端可以直接与重链Fc区的C末端融合，或者可以通过间插的氨基酸序列间接融合。例如，可以在尾端和重链Fc区之间提供短的接头序列。
尾端可包括上述天然序列的变体或片段。IgM或IgA尾端的变体通常具有在所述18个氨基酸位置中的8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个位置与天然序列相同的氨基酸序列。片段通常包含8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸。尾端可以是IgM/IgA杂合尾端。
在本发明的一个实施方案中使用的Fc多聚体中的每个重链Fc区可以任选地在其N端具有天然或修饰的铰链区。可以掺入在本发明中使用的Fc多聚体中的修饰的铰链区的类型在WO 2015/132364中公开。例如，重链Fc区在其N端具有完整的铰链区。在某些方面，如WO2015/132364中公开的，重链Fc区和铰链区衍生自IgG4，并且铰链区包含突变序列CPPC(SEQ ID NO：15)。
合适的铰链序列的实例显示在SEQ ID Nos：15至37中。
例如，所述多聚体融合蛋白可包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个或更多个多肽单体单元。另外，所述多聚体融合蛋白可包含具有一定范围的多肽单体单元数目的不同大小的多聚体融合蛋白的混合物。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明中使用的多聚体融合蛋白由六个多肽单体单元组成，其中每个多肽单体单元由抗体Fc结构域和尾端区域组成，其中每个抗体Fc结构域由两个重链Fc区组成，其中在309位的氨基酸残基是除半胱氨酸以外的任何氨基酸残基，并且任选地，每个重链Fc区在N端具有铰链区，并且其中尾端区与每个重链Fc区的C末端融合，导致单体单元组装成多聚体。
类似地，特定的多聚体融合蛋白内的多肽单体单元可以彼此相同或彼此不同。
在某些实施方案中，多肽单体单元的多肽链包含SEQ ID NO：38至59中提供的氨基酸序列，任选地具有替代的铰链或尾端序列。
在另一个实例中，用于本发明的多聚体融合蛋白包含两个或多个、优选六个多肽单体单元或由其组成，其中每个多肽单体单元包含两个相同的多肽链，每个多肽链包含SEQID NO：38-59(WO 2015/132364的SEQ ID NO：26-47)中任何一个给出的序列或由其组成，并且其中每个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在某些实施方案中，所述多聚体融合蛋白包含与未修饰的多聚体融合蛋白相比降低细胞因子释放和/或降低血小板活化和/或降低C1q结合和/或增加抑制抗体包被的靶细胞的巨噬细胞吞噬作用的能力和/或改变与一种或多种Fc受体的结合的一个或多个突变。
在本发明的某些实施方案中，所用的Fc多聚体是WO 2015/132365中描述的那些，其涉及与人Fc受体结合的多聚体融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中使用的多聚体融合蛋白包含两个或更多个多肽单体单元，其中每个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域，例如WO 2015/132365中公开的那些。每个重链Fc区在309位包含半胱氨酸残基，并具有至少一个改变FcR结合和/或补体结合的额外突变，并在其C末端与导致单体单元组装成多聚体的尾端融合。每个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在某些方面，如上所述，多聚体融合蛋白还包含融合伴侣。在其他方面，如上所述，所述多聚体融合蛋白不包含一个或多个抗体可变区或Fab片段。在一个实施方案中，如上所述，多聚体融合蛋白的每个多肽单体单元包含具有重链Fc区的抗体Fc结构域。本发明的多聚体融合蛋白的尾端、修饰的铰链区和多肽单体单元具有上述特征。
在本发明的一个具体实施方式中使用的多聚体融合蛋白由六个多肽单体单元组成，其中每个多肽单体单元由抗体Fc结构域和尾端区域组成，其中每个抗体Fc结构域由两个重链Fc区域组成，其中每个重链Fc区中309位的氨基酸残基是半胱氨酸残基，并且每个重链Fc区包含至少一个会改变FcR结合和/或补体结合的其他突变，并且可选地每个重链Fc区在N末端具有铰链区，并且其中尾端区与每个重链Fc区的C末端融合，使单体单元组装成多聚体。
在某些实施方案中，所述多肽单体单元的多肽链包含如上所述的氨基酸序列。
在另一个实施例中，多聚体融合蛋白包含两个或多个、优选六个多肽单体单元，或由其组成，其中每个多肽单体单元包含两个相同的多肽链，每个多肽链包含SEQ ID NOs 60至96(对应于WO 2015/132365的SEQ ID NOs：26至32和50至64)中任一个给出的序列或由其组成，并且其中每个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在某些实施方案中，如WO 2015/132365中教导的，本发明中使用的多聚体融合蛋白包含一个或多个能够实现上述功能的突变。
本公开的各种产品可用作药物。因此，本公开涉及包含Fc多聚体、本公开的多核苷酸或者本公开的质粒或载体的药物组合物。
本发明的一个方面是一种在有此需要的受试者中治疗视神经脊髓炎的方法。该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Fc多聚体。在另一个实施方案中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的多核苷酸或者本发明的质粒或载体。
推荐的Fc多聚体的表达
在合适的宿主细胞中高水平产生重组蛋白质需要将上述经修饰的cDNA与合适的调控元件一起装配入重组表达载体的有效转录单元中，所述载体可以依照本领域技术人员已知的方法在各种各样的表达系统中增殖。有效的转录调控元件可来源于以动物细胞作为其天然宿主的病毒或者来源于动物细胞的染色体。例如，可以使用来自猿猴病毒40、腺病毒、BK多瘤病毒、人巨细胞病毒、或劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列的启动子-增强子组合，或包括动物细胞中强的组成型转录基因类似β-肌动蛋白或GRP78的启动子-增强子组合。为了实现自cDNA的稳定高水平的mRNA转录，转录单元应在其3’-近端部分包含编码转录终止-聚腺苷酸化序列的DNA区。例如，此序列可来自猿猴病毒40早期转录区、兔β珠蛋白基因或人组织型纤溶酶原激活剂基因。
然后可将cDNA整合入适于表达Fc多聚体的宿主细胞系的基因组中。在一些实施方案中，此细胞系应是脊椎动物来源的动物细胞系以确保正确的折叠、二硫键形成、天冬酰胺连接的糖基化和其他翻译后修饰以及分泌入培养基中。其他翻译后修饰的例子是新生多肽链的酪氨酸O-硫酸化和蛋白水解加工。可使用的细胞系的例子是猴COS-细胞、小鼠L-细胞、小鼠C127-细胞、仓鼠BHK-21细胞、人胚肾293细胞和仓鼠CHO-细胞。
可将编码相应cDNA的重组表达载体以数种不同方式引入动物细胞系中。例如，可自基于不同动物病毒的载体创建重组表达载体。其例子有基于杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒和牛乳头瘤病毒的载体。
编码相应DNA的转录单元也可与在动物细胞中起显性选择标记作用的另一重组基因一起引入这些细胞中以方便分离已将重组DNA整合入它们的基因组中的特定细胞克隆。此类型显性选择标记基因的例子是赋予遗传霉素(geneticin)(G418)抗性的TN4氨基糖苷磷酸转移酶、赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶、赋予嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素乙酰转移酶。编码此类选择标记的重组表达载体可以与编码所需蛋白质的cDNA位于同一载体上，或者它可以在同时引入并整合入宿主细胞基因组的不同载体上编码，常常导致不同转录单元之间的紧密物理连锁。
可与所需蛋白质的cDNA一起使用的其他类型选择标记基因是基于编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的各种转录单元。在将此类基因引入缺乏内源性dhfr活性的细胞例如CHO-细胞(DUKX-B11,DG-44)中后，它会使这些细胞能在缺乏核苷的培养基中生长。此类培养基的一个例子是无次黄嘌呤、胸腺嘧啶和甘氨酸的Ham’s F12。这些dhfr基因可以与编码IgG Fc融合单体的cDNA一起引入以上类型的CHO细胞中，它们或者连接在同一载体上或者位于不同载体上，由此建立生产重组蛋白质的dhfr阳性细胞系。
如果在细胞毒性dhfr抑制剂氨甲蝶呤存在下培养以上细胞系，则会出现抗氨甲蝶呤的新细胞系。由于所连接dhfr和期望蛋白质的转录单元的数目扩充，这些细胞系可以以提高的速率产生重组蛋白质。当在浓度增加的氨甲蝶呤(1-10,000nM)中增殖这些细胞系时，可获得以非常高的速率产生期望蛋白质的新细胞系。
可大规模培养生产期望蛋白质的上述细胞系，或者悬浮培养或者在各种固体支持物上。这些支持物的例子是基于右旋糖酐或胶原基质的微载体，或者中空纤维或各种陶瓷材料形式的固体支持物。当在细胞悬浮培养物中或在微载体上生长时，可以在延长的时间期间作为浸浴培养物或作为灌注培养物进行上述细胞系的培养，连续生产条件化培养基。由此，依照本公开内容，上述细胞系很好的适合于开发用于生产期望的重组蛋白质的工业方法。
纯化和配制
可通过多种生化和层析方法浓缩和纯化所述重组蛋白质，包括利用期望蛋白质和宿主细胞或细胞培养基中其他物质之间的大小、电荷、疏水性、溶解度、特性亲和力的差异等的方法。
此类纯化的一个例子是重组蛋白质吸附至针对例如Fc多聚体的Fc部分或另一Fc结合配体(例如蛋白A或蛋白G)的单克隆抗体，其固定于固体支持物上。在Fc多聚体吸附至支持物上、清洗和解吸附后，可通过基于上述特性的多种层析技术进一步纯化蛋白质。例如，依照各步骤的容量和选择性、支持物的稳定性或其他方面选择纯化步骤的次序。例如，纯化步骤可以是但不限于离子交换层析步骤、免疫亲和力层析步骤、亲和力层析步骤、染料层析步骤和大小排阻层析步骤。
为了使病毒污染的理论风险最小化，可在工艺中包括允许有效灭活或消除病毒的额外的步骤。例如，此类步骤可包括液态或固态热处理、用溶剂和/或去垢剂处理、在可见或UV光谱中照射、γ-线照射、在纯化期间分配或病毒过滤(纳米过滤)。
本文所述的Fc多聚体可配制成治疗用药物制剂。药物制剂的成分可再悬浮或溶解于常规生理学相容的水性缓冲溶液中，其中可任选地添加药物赋形剂以提供药物制剂。药物制剂的成分可能已经包含所有必需的药物、生理学相容性赋形剂，并且可以溶解在注射用水中以提供药物制剂。
此类药物载体和赋形剂以及合适药物制剂的制备在本领域中是众所周知的(参见例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”Frokjaer等人，Taylor&Francis(2000)，或“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第3版，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。在某些实施方案中，药物组合物可包含至少一种诸如膨胀剂、缓冲剂或稳定剂之类的添加剂。标准药物配方技术为本领域技术人员所熟知(参见例如2005 Physicians’Desk
Figure BDA0002536690740000251
Thomson Healthcare：Monvale,NJ,2004；Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Gennaro等编辑Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia,PA,2000)。合适的药物添加剂包括例如糖，如甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖或其他；氨基酸，如组氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苯丙氨酸、脯氨酸或其他；实现等张条件的添加剂，如氯化钠或其他盐；稳定剂如聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚乙二醇、丙二醇、氯化钙或其他；生理性pH缓冲剂如三羟甲基氨基甲烷等。在某些实施方案中，药物组合物可包含pH缓冲试剂和润湿剂或乳化剂。在进一步的实施方案中，所述组合物可包含防腐剂或稳定剂。特别地，包含本文所述Fc多聚体的药物制剂可以冻干或稳定可溶性形式配制。Fc多聚体因子可通过本领域已知的各种程序冻干。冻干配制剂在使用前通过添加一种或多种制药学上可接受的稀释剂(例如注射用无菌水或无菌生理盐水溶液或适当的缓冲溶液)来重构。
Fc多聚体的药物制剂的组合物可通过任何制药学上合适的途径递送至个体。各种递送系统是已知的，可用于通过任何方便的路径施用所述组合物。可配制Fc多聚体的药物制剂的组合物用于依照常规方法静脉内或非静脉内注射或用于肠内(例如口服、阴道或直肠)递送。对于非静脉内施用，可配制Fc多聚体的组合物用于皮下、肌肉内、关节内、腹膜内、脑内、鞘内、肺内(例如雾化)、鼻内、皮内、经口或经皮施用。在一个实施方案中，Fc多聚体的组合物被配制用于静脉内注射。在其它实施方案中，Fc多聚体的组合物被配制用于皮下、肌肉内或经皮施用，优选用于皮下施用。该配制剂可通过输注持续施用或通过推注(bolusinjection)施用。一些配方可以包含缓释系统。
将Fc多聚体的药物制剂的组合物以治疗有效剂量施用于患者。本文所用术语“治疗有效的”描述足以产生预期效果，防止或减轻视神脊髓炎的严重程度或扩散，或显示可检测的治疗或预防效果的剂量，而不教授产生不可容忍的不利副作用的剂量。确切的剂量取决于许多因素，例如，配制剂和施用方式。治疗有效量可在细胞培养测定法或动物模型(例如啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物模型)中初步估计。然后，这些信息可用于确定人类给药的有用剂量和途径。
在一个实施方案中，用于一次静脉内注射或一次非静脉内注射的Fc多聚体的剂量小于1000mg/kg体重、小于800mg/kg体重、小于600mg/kg体重、小于400mg/kg体重、小于200mg/kg体重或小于100mg/kg体重。例如，在一个实施方案中，Fc多聚体的剂量从约1mg/kg体重至约1000mg/kg体重，从约10mg/kg体重至约800mg/kg体重，从约20mg/kg体重至约700mg/kg体重，从约30mg/kg体重至约600mg/kg体重，从约40mg/kg体重至约500mg/kg体重，从约50mg/kg体重至约400mg/kg体重，从约75mg/kg体重至约300mg/kg体重，或从约100mg/kg体重至约200mg/kg体重。在一个实施方案中，Fc多聚体的剂量从约25mg/kg体重至约1000mg/kg体重，从约25mg/kg体重至约800mg/kg体重，从约25mg/kg体重至约600mg/kg体重，从约25mg/kg体重至约500mg/kg体重，从约25mg/kg体重至约400mg/kg体重，从约25mg/kg体重至约300mg/kg体重，从约25mg/kg体重至约200mg/kg体重，或从约25mg/kg体重至约100mg/kg体重。
在一个单独的实施方案中，单独或连同其他治疗剂一起施用Fc多聚体的药物组合物。在一个实施方案中，这些治疗剂作为同一药物的一部分掺入。在一个实施方案中，Fc多聚体与免疫抑制疗法(例如类固醇)一起施用。在另一实施方案中，Fc多聚体与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起施用。
Fc多聚体的施用频率取决于许多因素，如配制剂、剂量和施用方式。在一个实施方案中，每天多次，每天一次，每隔一天一次，每三天一次，每周两次，每周一次，每两周一次，每三周一次，或每月一次施用Fc多聚体剂量。
治疗效果
如本文所使用的术语“治疗效果”描述通过改善表征该疾病或病症的参数来治疗该疾病或病症，或者，替代地，完全预防这些疾病/病症参数。例如，可以通过施用Fc多聚体的剂量以下述方式确定治疗效果：(1)在体外在视神经脊髓炎的细胞培养模型中；(2)离体在视神经脊髓炎的脊髓切片模型中；(3)在体内在大鼠疾病模型中。Fc多聚体的剂量可为10至1000mg/kg，例如200mg/kg。可通过静脉内注射或非静脉内注射或静脉内输注施用Fc多聚体。可以在预定的时间直至施用Fc多聚体后最终的时间点进行动物的临床评估。临床评估可以包括基于特定疾病或紊乱的临床表现的评分。也可以在预定时间直至施用Fc多聚体后的最终时间点从动物采集生物样品。本文所用术语“生物学样品”指例如组织、血液和尿液。然后可以对生物学样品评估视神经脊髓炎的标志物或指标的改善情况。
本文所使用的术语“诱导”被定义为引起、产生、实现、创造、产生、导致或促进。
在一个优选实施方案中，可以通过相对于用IVIG或Fc单体治疗后观察到的效果而言，与AQP4-IgG或来自血清阳性视神经脊髓炎患者的血清一起预孵育的中国仓鼠卵巢细胞中补体依赖性细胞毒性或抗体依赖性细胞的细胞毒性降低的改善来指示Fc多聚体的治疗效果。在某些实施方案中，Fc多聚体与在1％或0.5％人类补体存在下细胞毒性的加速降低相关。在其它实施方案中，Fc多聚体与50μg/ml或100μg/ml浓度下细胞毒性的加速降低相关。
在一个单独的优选实施方案中，Fc多聚体的治疗效果可以通过在大鼠脊髓离体切片模型中观察到的细胞毒性和病理学降低来指示。脊髓可与AQP4-IgG和人补体一起孵育，产生神经脊髓炎切片模型，然后用星形胶质细胞损伤标记物(如AQP4和GFAP)、脱髓鞘标记物(如MBP)、炎症标记物(如Iba1)和补体终末端膜附着复合物沉积标记物例如C5b-9进行免疫染色。病理学评估和评分如下：0-完整切片，具有正常AQP4、GFAP和MBP染色；1-轻度星形胶质细胞损伤、脱髓鞘、炎症和补体末端膜攻击复合物沉积，如AQP4或GFAP染色减少、MBP染色减少、Iba1染色增加和C5b-9染色增加所示的；2-具有AQP4或GFAP染色减少、MBP染色减少、Iba1染色增加和C5b-9染色增加的至少一处病变；3-影响<30％切片面积的多处病变；4-影响80％切片面积的病变。每个切片的得分可以相加作为临床总得分。Fc多聚体的治疗效果可与不使用六聚体的治疗进行比较。
在另一优选实施方案中，可在由脑内注射AQP4-IgG诱导的视神经脊髓炎实验性大鼠模型中指示Fc多聚体的治疗效果。可通过静脉内施用3.125、6.25、12.5、25或50mg/kg的剂量并在施用后2小时采血来评估治疗效果。可以从大鼠血液采集血清并通过与用AQP4-IgG预孵育的表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞一起孵育来评估细胞毒性。在一个实施方案中，可在施用50mg/kg剂量的Fc多聚体并随后在施用后不同时间点收集血液用于体外测试来评估细胞毒性。在一个实施方案中，可以收获来自视神经脊髓炎大鼠的大脑、切片并用各种标记物进行免疫染色以评估病理学，包括星形胶质细胞损伤标记物诸如AQP4和GFAP，脱髓鞘标记物诸如MBP，炎症标记物诸如Iba1和CD45，以及补体末端膜附着复合物沉积的标记物，如C5b-9。为了比较，也可以对未注射的对侧半球进行染色。
经典补体途径的激活
经典补体途径介导特异性抗体应答，其由补体成分的级联介导。级联反应主要由抗原抗体复合物激活。该途径的初始成分是蛋白质复合物C1，它由一个C1q和两个C1r2s2亚基组成。免疫球蛋白与C1q的结合经由激活C1r2s2成为催化活性亚基而实现经典补体途径激活的第一步。激活的C1s将C4裂解为C4a和C4b，将C2裂解为C2a和C2b。然后C2a结合C4b形成C4b2a，也被称为C3转化酶。C3转化酶催化C3裂解为C3a和C3b。然后C3b可以与活化的C4b2a结合形成C4b2a3b，又称为C5转化酶。C5转化酶将C5转化为C5a和C5b片段。C5b与C6、C7、C8和C9成分一起形成一种称为C5b-9复合物的复合物。这种复合物也称为膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)或末端补体复合物(terminal complement complex，TCC)，在靶细胞内形成跨膜通道，导致细胞溶解。
本文所用的“完全经典补体途径的激活”定义为如上所述的整个经典补体途径的每个步骤的激活。通过研究Fc多聚体与C1q的结合(经典补体途径激活的第一步)和C4a、C5a或者可溶性或膜结合的C5b-9复合物(经典补体途径的最终效应物)的形成可以确定完全经典补体途径的激活。例如，如果蛋白质结合C1q但基本上不形成可溶性C5b-9，即仅形成少于相应阳性对照的50％，优选少于40％，优选少于30％，优选少于20％，优选少于10％，更优选少于5％，则Fc多聚体不诱导经典补体途径的完全激活。经典补体途径的激活也可以通过评估C4a的生成、C2的裂解或C3转化酶的形成来确定。例如，如果Fc多聚体诱导C4a的产生，但不诱导C2的裂解或不诱导C3转化酶的形成，则该Fc多聚体不诱导完全经典补体途径的激活。“不诱导”意指形成少于相应阳性对照的50％、优选少于40％、优选少于30％、优选少于20％、优选少于10％、更优选少于5％。
Fc多聚体结合人IgG和AQP4的能力可以通过体外结合测定法来测定，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。例如，96孔板的孔可以用人AQP4-IgG预包被，之后添加Fc多聚体。可添加纯化的过氧化物酶标记的抗人IgG缀合物，并通过使用诸如3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB)等产色过氧化物酶底物显现结合的缀合物。在一个实施方案中，可在Fc多聚体存在下将中国仓鼠卵巢细胞与AQP4-IgG或对照IgG一起孵育1小时。然后将细胞与抗AQP4抗体孵育、随后与Alexa-Fluor抗体孵育以量化荧光。
Fc多聚体结合C1q的能力可以通过体外结合测定法来确定，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。例如，可以用人C1q预包被96孔板的孔，然后添加Fc多聚体。可添加纯化的过氧化物酶标记的抗人IgG缀合物，并通过使用诸如3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB)等产色过氧化物酶底物显现结合的缀合物。在一个实施方案中，可将重组人C1q与Fc多聚体一起预孵育一小时，然后将其添加至AQP4IgG包被的细胞一小时。可用FITC缀合的抗C1q抗体对C1q进行染色。
Fc多聚体对经典补体途径的激活可通过体外测定法确定，并通过C4a和可溶性C5b-9的产生来指示。例如，可将不同浓度的Fc多聚体在全血或血清中孵育一段预先确定的时间，并可通过免疫检测(例如ELISA)来确定由此产生的任何C4a或可溶性C5b-9(sC5b-9)。使用的Fc多聚体浓度可为0.01mg/ml至2mg/ml，例如0.04mg/ml、0.2mg/ml或1.0mg/ml。
由Fc多聚体诱导的C4a和sC5b-9的生成可相对于由热聚集丙种球蛋白(HAGG)诱导的这些成分的生成进行比较，HAGG是经典补体途径的一种有效激活剂。例如，可以在全血中进行此测定法。依据一些实施方案，如WO 2017/129737中所述，与HAGG诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体诱导少于50％的sC5b-9产生、少于40％的sC5b-9产生、少于30％的sC5b-9产生、少于20％的sC5b-9产生或少于10％的sC5b-9产生。在一个实施方案中，与HAGG在全血中诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体在全血中诱导少于20％的sC5b-9产生。在另一实施例方案中，与HAGG在全血中诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体在全血中诱导少于10％的sC5b-9产生。在又一实施方案中，Fc多聚体不诱导sC5b-9产生。
本文所用术语“用热聚集IgG激活的正常人血清”是指用热聚集IgG诱导几乎所有C4裂解的正常人血清样品。
通过检测C2蛋白也可以确定Fc多聚体对经典补体途径的激活。如果C2蛋白被切割成C2a和C2b，则C2蛋白水平降低，表明经典补体途径的激活。看将不同浓度的Fc多聚体在全血或血清中孵育一段预先确定的时间，例如2小时，随后可通过免疫检测(如免疫印迹)测定C2蛋白水平。经典补体途径的激活是通过C2蛋白的裂解来指示的。可将正常人血清中C2蛋白的水平与用Fc多聚体预孵育后的C2蛋白水平相比较，以确定C2裂解的量，由此确定经典补体途径的激活。经典补体途径的一种已知激活剂，如HAGG，可用作诱导正常人血清中大多数C2蛋白裂解的阳性对照。本文中使用的术语“大多数”定义为包括大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。在一些实施方案中，如WO 2017/129737中所述，Fc多聚体不会诱导大多数C2蛋白质的裂解。
Fc多聚体对经典补体途径的激活也可以通过评估C3转化酶的形成来确定。如上所述，C3转化酶由C2a和C4b亚基(C4b2a)组成。如果C2蛋白不裂解为C2a和C2b，就不能形成C3转化酶。因此，可以如上所述评估C3转化酶的形成以测定C2蛋白的裂解。在一些实施方案中，如WO 2017/129737中所述，Fc多聚体不诱导C3转化酶的形成。
经典补体途径的抑制
Fc多聚体对经典补体途径的抑制可通过测定C5a和sC5b-9产生的抑制或通过测定C2蛋白切割的抑制来确定。不同浓度的Fc多聚体可与经典补体途径的已知激活剂一起在全血或血清中孵育。然后，可以将在Fc多聚体和经典补体途径的已知激活剂存在下生成的sC5b-9水平与仅用经典补体途径的已知激活剂生成的sC5b-9水平进行比较。生成的sC5b-9的水平可以如上所述测定。所用Fc多聚体的浓度可为0.01mg/ml至2mg/ml，例如0.04mg/ml、0.2mg/ml或1.0mg/ml。经典补体途径的已知激活剂可以是HAGG。与仅存在经典补体途径激活剂的情况下生成的sC5b-9水平相比在存在Fc多聚体和经典补体途径激活剂的情况下生成的sC5b-9水平越低，则Fc多聚体对sC5b-9生成的抑制作用越大。在一些实施方案中，与由HAGG诱导的sC5b-9产生相比，Fc多聚体抑制大于50％的sC5b-9产生、大于60％的sC5b-9产生、大于70％的sC5b-9产生、大于80％的sC5b-9产生或大于90％的sC5b-9产生。在一个实施方案中，如WO 2017/129737所述，Fc多聚体抑制由HAGG诱导的sC5b-9产生的80％以上。
本文所使用的术语“抑制”被定义为遏制、限制、防止、干扰、停止或阻断。
也可以同样测定对C2蛋白裂解的抑制作用。可将不同浓度的Fc多聚体与经典补体途径的已知激活剂一起在全血或血清中孵育。与仅存在经典补体途径的已知激活剂情况下的C2蛋白水平相比在存在Fc多聚体和经典补体途径的已知激活剂情况下的C2蛋白水平越高，则Fc多聚体对C2裂解的抑制作用越大。C2蛋白的水平可以如上所述测定。所用Fc多聚体的浓度可以是0.01mg/ml至2mg/ml，例如0.04mg/ml、0.2mg/ml或1.0mg/ml。经典补体途径的已知激活剂可以是HAGG。在一些实施方案中，如WO 2017/129737所述，Fc多聚体抑制HAGG对大多数C2蛋白的切割。
经典补体途径的抑制也可以使用抗体增敏或调理的红细胞通过用于经典补体途径的溶血测定法来确定。例如，绵羊红细胞(erythrocyte)或红细胞(red blood cell)可以用兔抗绵羊抗体调理。正常人血清(NHS)会诱导经调理的红细胞裂解。可以将Fc蛋白与NHS一起预孵育，然后添加到红细胞中，并在37℃孵育1h。Fc构建物的浓度可以是1-1000μg/ml，例如2.5、25、50、125、250或500μg/ml。或者，Fc单体也可以与NHS一起预孵育，其浓度与对Fc构建物所示的浓度相同。孵育后，离心混合物，通过在412nm测量上清液中释放的血红蛋白的吸光度来测定裂解程度。
Fc多聚体对经典补体途径的抑制可通过与具有NHS但不具有Fc多聚体的混合物相比，含有Fc多聚体的混合物中红细胞裂解的减少来指示。Fc多聚体对经调理红细胞的裂解的抑制作用也可与Fc单体存在下经调理的红细胞的裂解相比较。在一些实施方案中，与Fc单体相比，Fc多聚体抑制经调理的绵羊红细胞的裂解。在一个实施方案中，如WO 2017/129737中所述，与Fc单体相比，Fc多聚体抑制经调理的绵羊红细胞的裂解超过70％。
在本发明的一个优选实施方案中，Fc多聚体通过抑制经典补体途径的激活而不抑制替代补体途径的激活来阻止视神经脊髓炎的发病。
实施例
实施例1：IgG1Fc多聚体的制备
通过将人IgM尾端的18个氨基酸残基(PTLYNVSLVMSDTAGTCY SEQ ID NO：11)与人IgG1Fc片段恒定区的C-末端(氨基酸残基216-447，EU编号方式；UniProtKB-P01857)融合，生成Fc-μTP(图1A，左图)。Fc-μTP-L309C(图1A，右图)是通过将Fc-μTP的309位(EU编号方式)的Leu残基突变为Cys而产生的。利用ThermoFisher Scientific(MA，USA)合成编码Fc-μTP和Fc-μTP-L309C的DNA片段，并针对人细胞表达进行了密码子优化。用InTag阳性选择法(Chen,CG等,(2014).Nucleic Acids Res 42(4)：e26；Jostock T等人(2004).J.Immunol.Methods.289：65-80)将DNA片段克隆入pRhG4哺乳动物细胞表达载体的ApaLI和XbaI位点。简单地说，通过ApaLI和AscI消化分离出Fc-μTP和Fc-μTP-L309C片段。还通过AscI和SpeI消化分离包含BGH polyA添加位点(BGHpA)和氯霉素抗性基因(CmR)的CmR-InTag衔接子(Chen,CG等,(2014).Nucleic Acids Res 42(4)：e26)。使用T4-DNA连接酶将Fc分子与CmR-InTag衔接子共克隆入pRhG4载体的ApaLI和XbaI位点。在含有34μg/ml氯霉素的琼脂平板上筛选阳性克隆。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)纯化小量制备的质粒DNA，并通过DNA测序分析确认序列。限制性内切酶和T4DNA连接酶购自New England BioLabs(MA,USA)。
使用Expi293TMExpression System(Life Technologies,NY,USA)依照制造商的说明书进行瞬时转染。简言之，将质粒DNA(0.8μg)稀释于0.4ml Opti-MEM中并轻轻混合。将Expifectamine 293Reagent(21.6μL)稀释于0.4ml Opti-MEM中，轻轻混合并于室温孵育5分钟。然后将经稀释的Expifectamine添加至稀释的DNA中，轻轻混合并于室温孵育20-30分钟以允许形成DNA-Expifectamine复合物。然后将DNA-Expifectamine复合物添加至含有6.8ml Expi293细胞(2x 107个细胞)的50ml生物反应器(Bioreactor)管中。将细胞在具有8％CO2的37℃培养箱中以250rpm振荡孵育大约16-18h。制备由40μl Enhancer 1(LifeTechnologies,NY,USA),400μlEnhancer 2(Life Technologies,NY,USA)和200μlLucraToneTMLupin组成的主混合物并加入每个生物反应器管中。将细胞在具有8％CO2的37℃培养箱中以250rpm再振荡孵育4天。以4000rpm离心20分钟从上清液收获蛋白质并使用0.22μm滤器过滤入干净的管中，之后进行HPLC定量和纯化。
为了生产IgG1Fc多聚体，将重组人IgG1Fc的N-端融合至IgM的18氨基酸尾端。IgM尾端(μTP)促进了五聚体和六聚体的形成。Fc融合蛋白采用野生型(WT)人IgG1-Fc肽(Fc-μTP)或其具有残基309处亮氨酸至半胱氨酸的点突变的变体(Fc-μTP-L309C)产生。由于Fc分子间共价键的形成，亮氨酸309至半胱氨酸的点突变(Fc-μTP-L309C)有望提供比WT(Fc-μTP)更稳定的结构。
Fc-μTP和Fc-μTP-L309C融合单体亚基由包含以下区域的两个肽产生(残基编号分别指SEQ ID NOs：2和4中的残基号)：
信号肽 残基1-19
人IgG1的铰链区 残基20-34
人IgG1的Fc区 残基35-251
人IgM的尾端 残基252-269
成熟形式的Fc-μTP和Fc-μTP-L309C肽的氨基酸序列分别以SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3提供。核酸编码序列分别以SEQ ID NO：97(对应于WO 2017129737的SEQ ID NO：9)和SEQ ID NO：98(对应于WO 2017129737的SEQ ID NO：10)提供。
在表达期间，切去信号肽以形成成熟的Fc-μTP和Fc-μTP-L309C融合肽。未成熟融合肽的序列分别在SEQ ID NOs：2和4中提供。
多聚的Fc蛋白的SDS-PAGE显示了每种制备物的阶梯状模式，对应于Fc构建物的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。Fc-μTP-L309C在预期的六聚体位置有一个显著条带，而Fc-μTP没有，这与在破坏性电泳缓冲条件下更稳定的结构一致(图1B)。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C六聚体的预期结构图如图1A中所示。Fc-μTP-L309C的高阶结构，最可能是六聚体的二聚体，也是明显的。
还用Fc多聚体制剂的尺寸排阻层析(SEC)(图1C)和非对称流场流动分馏(A4F)(图1D)检查Fc-TP-L309C和Fc-μTP的多聚化，然后在280nm(A280，薄层层析)和多角度光散射(MALS，粗体线)下进行了U.V.吸光度测量。对每个步骤的每种Fc多聚体制备物观察到具有主要六聚体峰(约85％物质)的类似分布模式(表1)。这与SDS-PAGE(图1B)所示的独特概况形成对比，表明在Fc-μTP制备中存在非共价的六聚体。剩余的材料对于Fc-μTP主要是较低阶的(单体、二聚体、三聚体)，对于Fc-μTP-L309C主要是较高阶的(六聚体的二聚物)。
表1
Figure BDA0002536690740000361
还制备了重组人IgG1Fc单体(SEQ ID NO：1的残基1至232)并用作对照。
基于它们不能刺激THP1细胞中的NF-κB活化，Fc蛋白(Fc，Fc-μTP和Fc-μTP-L309C)被认为是无内毒素的(图2)。在含有10％胎牛血清(FCS)、1％(100u/ml)青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中培养人单核细胞系THP1。细胞培养基大约每3天更换一次。通过用在转录因子NF-κB可诱导的启动子调控下表达分泌性胚胎碱性磷酸酶(secreted embryonic alkaline phosphatase，SEAP)基因的报告质粒稳定转染THP1细胞而衍生得到THP1XBlue细胞。刺激后，THP1XBlue细胞激活NF-κB，随后分泌SEAP，这种分泌很容易使用QUANTI blue检测到，因为培养基在其存在下变成紫色/蓝色。经PCR测定，THP1XBlue细胞表达所有TLR，但仅对TLR2、TLR2/1、TLR2/6、TLR4、TLR5和TLR8有响应。THP1XBlue细胞对选择标记Zeocin具有抗性。在含有10％FCS、0.5％(100U/ml)青霉素/链霉素、100μg/ml Normocin(Invivogen，San Diego，CA)和200μg/mlZeocin(Invivogen)的RPMI1640培养基中培养细胞。细胞培养基大约每3天更换一次。用脂多糖(LPS)作为NF-κB活化的阳性对照。
实施例2：Fc六聚体在表达AQP4的细胞培养物中抑制补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性的细胞性细胞毒性
将Crane等,2011,J.Biol.Chem.286,16516-16524中描述的稳定表达人AQP4-M23的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(称为CHO-AQP4细胞)在37℃、5％CO2、95％空气中在补充有10％胎牛血清、200μg/ml遗传霉素(geneticin)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的F-12Ham’s营养混合培养基中培养。Yusa等,2002,J.Immunol.168,5047-5057中描述的表达Fcγ受体的高亲和力176V变体的人自然杀伤细胞(NK细胞)获自Fox Chase癌症中心(Philadelphia,PA)。
CHO-AQP4细胞在96孔板中生长直至每孔25,000个细胞汇合。将细胞与10μg/mlAQP4-IgG(rAb-53)或视神经脊髓炎(NMO)血清(1：50)一起在23℃下预孵育1h。对于CDC测定法，将人或大鼠补体与指定浓度的Fc制剂一起在4℃预孵育1h，然后在23℃添加到AQP4-IgG包被的CHO-AQP4细胞中再孵育1h。对于动力学分析，将人补体与Fc-μTP-L309C一起预孵育指定时间，之后添加到AQP4-IgG包被的CHO-AQP4细胞中。为了ADCC测定，将CHO-AQP4细胞与5μg/mlAQP4IgG一起在37℃下孵育2小时，其中有或没有Fc制剂，NK细胞处于效应器：靶细胞比例4：1。然后在PBS中充分洗涤CHO-AQP4细胞，在37℃下添加20％Alamar Blue(Invitrogen，Carlsbad，CA)45分钟检测细胞存活力，并如(Phuan等,2013,ActaNeuropathol.125,829-840；Ratelade等,2014,Exp.Neurol.225,145-153)所述测定细胞毒性百分比。
对于这些研究，在加入AQP4-IgG预孵育的细胞之前将Fc制剂与人补体(人血清)一起孵育。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C以浓度依赖的方式阻断细胞毒性，其效力比IVIG高500倍以上，比Fc单体高3000倍以上(图.3A和3B)。
动力学研究显示了在高于其IC50的Fc-μTP-L309C浓度下对CDC的快速抑制，而在较低的Fc-μTP-L309C浓度下抑制要慢得多(图3C)，这与牵涉Fc-μTP-L309C与C1q多价相互作用的协同结合机制一致。
图3D显示了由血清阳性的NMO患者的血清而不是由重组AQP4-IgG引起细胞毒性时Fc-μTP和Fc-μTP-L309C对CDC的抑制。表观IC50值与图3A中的相似，支持Fc六聚体作用于补体而不是AQP4-IgG或其与AQP4的结合的结论。
还测试了Fc制剂对表达AQP4的CHO细胞与AQP4-IgG和NK细胞孵育产生的ADCC的抑制作用的功效(Phuan等,2013,Acta Neuropathol.125,829-840；Ratelade等,2014,Exp.Neurol.225,145-153；Tradtrantip等,2012,Ann.Neurol.71,314-322)。Fc-μTP和Fc-μTP-L309C以浓度依赖的方式抑制ADCC，IC50分别为约80μg/ml和50μg/ml，在所测浓度范围内，对IVIG或Fc单体几乎没有观察到抑制作用(图5)。
实施例3：在视神经脊髓炎(NMO)的脊髓切片模型中Fc-六聚体阻止病理
从7日龄大鼠获得脊髓，并使用振动切片机以300μm的厚度切割，如之前关于小鼠所述(Zhang等,2011,Ann.Neurol.70,943-954)。将横切切片放置在含有1ml培养基的6孔板中的透明膜插入物(Millipore,Millicell-CM 0.4μm孔，直径30mm)上，并在切片上覆盖一薄层培养培养基。切片在37℃的5％CO2中在50％MEM、25％HBSS、25％马血清、1％青霉素-链霉素、0.65％葡萄糖和25mM HEPES中培养7天。用AQP4-IgG(5μg/ml)和人补体(5％)在不加或加Fc-μTP或Fc-μTP-L309C(50μg/ml)的情况下将7日龄大鼠的切片孵育24小时。在加入细胞前将Fc制剂与人补体一起于室温下孵育1小时。对脊髓进行AQP4、GFAP、MBP、Iba1和C5b-9的免疫染色，并如所述进行拍摄(Zhang等,2011,Ann.Neurol.70,943-954)和评分：0，完整切片，具有正常GFAP和AQP4染色；1，星形胶质细胞轻度肿胀和/或AQP4染色减少；2，至少有一处具有GFAP和AQP4染色丢失的病变；3，影响>30％的切片面积的多处病变；4，影响>80％的切片面积的病变(Phuan等,2013,Acta Neuropathol.125,829-840；Ratelade等,2014,Exp.Neurol.225,145-153；Zhang等,2011,Ann.Neurol.70,943-954)。
数据以均值±S.E.M.表示。当比较两组时，使用非参数Mann-Whitney检验进行统计比较。
在NMO的离体脊髓切片模型中也进行了CDC抑制研究，其中与AQP4-IgG和人补体孵育24小时后，7天培养的大鼠脊髓切片显示星形胶质细胞损伤(AQP4和GFAP丢失)、脱髓鞘(MPB染色减少)，炎症(Iba-1染色增强)和补体终末端膜攻击复合物的沉积(C5b-9)(Phuan等,2013,Acta Neuropathol.125,829-840；Zhang等,2011,Ann.Neurol.70,943-954)。AQP4-IgG/补体处理的脊髓切片的免疫荧光显示出预期的病理变化，而Fc-μTP和Fc-μTP-L309C在很大程度上阻止了这些变化(图4A)。图4B汇总了病理评分。
实施例4：Fc多聚体抑制经典补体途径造成的溶血
为了研究Fc蛋白对经典途径的影响，用兔抗绵羊抗体(Ambozeptor 6000；Siemens)对绵羊红细胞(Siemens)进行致敏，并稀释至4x108个细胞/mL GVB2+(GVB,0.15mMCaCl2,0.5mM MgCl2)。为了评估Fc-μTP-L309C对溶血的抑制作用，将重组蛋白在1％或5％人补体中于室温预孵育30分钟，随后以1/1(v/v)的比率添加到红细胞中，并在微量滴定板振荡装置中于37℃孵育1小时。所测试的Fc-μTP-L309C的浓度范围为0.1至5μg/ml。在加入冰冷GVBE(GVB，10mM EDTA)并离心(1250x g，4℃下5分钟)后，通过测量412nm处释放的血红蛋白的吸光度来测定上清液中的溶血。
为了研究Fc蛋白对替代途径的影响，将兔红细胞(Jackson Laboratories)洗涤并稀释至2x108个细胞/mL GVB/MgEGTA(GVB，5mMMgEGTA)。为了评估Fc-μTP-L309C对溶血的抑制作用，将重组蛋白在5％或10％人补体中于室温预孵育30分钟，随后以2/1(v/v)的比率添加到红细胞中，并在微量滴定板振荡装置中于37℃孵育1小时。所测试Fc-μTP-L309C的浓度范围为0.1至5μg/ml。加入冰冷的GVBE并离心(1250x g，10分钟)后，通过测量412nm处释放血红蛋白的吸光度来测定上清液中的溶血。
Fc-μTP-L309C在人补体浓度为1％和5％时均显著抑制经典补体途径的溶血(图6C(ii))。Fc-μTP-L309C不抑制兔红细胞中的替代补体途径(图6C(iii))。
实施例5：Fc多聚体通过阻止C1q与结合的AQP4-IgG结合来调节视神经脊髓炎的发病机制
将CHO-AQP4细胞在96孔板上培养24小时。用PBS中的1％BSA封闭后，将细胞与AQP4-IgG或对照IgG(不加或加100mg/ml Fc-μTP-L309C)于23℃孵育1小时。然后将细胞用PBS洗涤并与F(ab')2片段特异性的Alexa Fluor 594山羊抗人IgG二抗(1：500；JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)孵育1小时。然后用PBS清洗细胞三次，并用读板仪在591/614nm的激发/发射波长下进行荧光定量。对于人IgG和AQP4免疫染色，将细胞与10μg/mlAQP4IgG或对照IgG一起在100μg/ml Fc-μTP-L309C缺失或存在的情况下于23℃孵育1小时。然后将细胞在4％PFA中固定15分钟，并用0.1％Triton X-100透化。用1％BSA封闭后，将细胞与0.4μg/ml多克隆AQP4C末端特异性兔抗AQP4抗体(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)一起孵育1小时。将细胞用PBS清洗并与Alexa Fluor 594-F(ab’)2片段特异性抗体(1：400)和Alexa Fluor-488山羊抗兔IgG二抗(1：400；Invitrogen)一起孵育1小时。为了测定C1q结合，将CHO-AQP4细胞与20μg/ml AQP4-IgG在23℃下预孵育1小时，然后用PBS洗涤。将重组人C1q(60μg/ml)与Fc单体或Fc-μTP-L309C预孵育1小时，然后加入AQP4-IgG包被的细胞中1小时。清洗、固定细胞，用兔FITC缀合的抗C1q抗体(1：50；Abcam,Cambridge,MA)染色C1q。
视神经脊髓炎(NMO)的发病机制是通过AQP4-IgG与膜结合的AQP4结合、然后初始补体蛋白C1q与结合的AQP4-IgG的Fc区结合启动的。图6A显示，100μg/ml的Fc-μTP-L309C不抑制AQP4-IgG与CHO细胞上的AQP4结合，如使用识别一抗F(ab’)2片段的荧光二抗所检测的。图6B显示，如通过C1q免疫荧光所测定的，Fc-μTP-L309C阻止纯化的C1q与AQP4结合的AQP4-IgG结合，这与Fc-μTP-L309C的一种作用是与水相C1q的亲和结合一致。
实施例6：Fc-μTP-L309C在视神经脊髓炎(NMO)的实验大鼠模型中阻止病理
使用体重匹配的雌性Sprague-Dawley大鼠(250-300g，9-12周龄)进行实验。将大鼠静脉内接受3.125、6.25、12.5、25、50mg/kg的Fc-μTP-L309C，并于2小时采血。于室温下使血液凝血30分钟，于4℃以2,000x g离心10分钟，采集血清并于20℃下冷冻过夜。如上所述，在CDC测定法中使用血清，其中于23℃将2％的大鼠血清加入1.25-10μg/ml AQP4IgG1小时。在一些研究中，在静脉内注射50mg/kgFc-μTP-L309C后的指定时间采集大鼠血液，并进行CDC测定。
如所述(Yao和Verkman,2017,Acta Neurolpathol.Commun.5,15)通过脑内注射递送AQP4-IgG。简单地说，用氯胺酮(100mg/kg)和二甲苯嗪(10mg/kg)麻醉大鼠，然后将其封固在立体定向框架上。头皮中线切开后，在bregma前方0.5mm和外侧3.5mm处产生直径1mm的毛刺孔。将直径为40μm的玻璃针插入5mm深，以通过压力注射在10分钟内输注总体积3-6μL的30或40μg AQP4IgG。在第5天，大鼠被深度麻醉，随后用200ml肝素化PBS、然后用100mlPBS中的4％多聚甲醛(PFA)经左心室进行心脏灌流。大脑被固定在4％的PFA中，在30％的蔗糖中4℃下放置过夜，并于OCT内包埋。
将经固定的大脑进行冷冻、切片(10μm厚)并在封闭溶液(PBS，1％牛血清白蛋白，0.2％Triton X-100)中孵育1小时，然后用一抗：AQP4(1：200，Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)，GFAP(1：100，Millipore)，髓鞘碱性蛋白(MBP)(1：200，Santa CruzBiotechnology)，离子化钙结合衔接子分子-1(ionized calcium-binding adaptormolecule-1，Iba1；1：1000；Wako，Richmond，VA)，C5b-9(1：50，Hycult Biotechnology，Uden，The Netherlands)或CD45(1：10，BD Biosciences，San Jose，CA)，然后是适当的荧光二抗(1：200，Invitrogen，Carlsbad，CA)孵育过夜(4℃)。用VECTASHIELD(VectorLaboratories，Burlingame，CA)封固切片用于在Leica荧光显微镜上进行可视化。
使用已建立的大鼠NMO实验模型进行体内疗效研究，其中通过脑内施用AQP4IgG建立NMO病理学(Asavapanumas等,2014,Acta Neuropathol.127,539-551；Yao和Verkman2017,Acta Neurolpathol.Commun.5,15)。该模型是在大鼠而不是小鼠中进行的，因为大鼠具有类似人的补体活性，而小鼠具有在很大程度上不活跃的经典补体系统(Ratelade和Verkman,2014,Mol.Immunol.62,103-114)。Fc-μTP-L309C能有效抑制AQP4-IgG和大鼠补体产生的CDC(图7A)，其效力比图3A中人补体的效力高数倍。
为了建立一个Fc-μTP-L309C给药方案以给出治疗性血液水平供疗效研究，对大鼠静脉内施用不同量的Fc-μTP-L309C，并通过测量与大鼠血清和AQP4-IgG预孵育的表达AQP4的CHO细胞中的CDC在体外测定在2小时时采集的血清的补体活性(图7B)。在2小时时自施用12.5mg/kg或更高剂量Fc-μTP-L309C的大鼠所取的血清中细胞毒性被阻止。图7C显示了单剂静脉内施用50mg/kg Fc-μTP-L309C后大鼠血清诱导的细胞毒性的时间过程。细胞毒性被阻止至少8小时。
进行了一项短期疗效研究，其中在脑内注射AQP4-IgG时和12小时后，以50mg/kg施用Fc-μTP-L309C(图8A)。AQP4-IgG治疗的大鼠的免疫荧光显示施用部位周围区域中星形胶质细胞损伤(星形胶质细胞标记物AQP4和GFAP丢失)，以及脱髓鞘(MBP免疫荧光降低)、炎症(Iba-1和CD45)和活化补体沉积(C5b-9)(图8A)。病变周围GFAP的表达增加代表反应性胶质化。显示非注射的对侧半球的免疫荧光进行比较。在Fc-μTP-L309C治疗的大鼠中观察到明显的病理学减轻，其中AQP4、GFAP、MBP、C5b-9和CD45免疫荧光与未处理大鼠和Fc-μTP-L309C处理组大鼠对侧半球中的相似。在进一步的研究中，注射了大量的AQP4-IgG，以便在几乎整个同侧半球中产生大量的NMO病理(图8B)。Fc-μTP-L309C完全阻止了AQP4、GFAP和MBP免疫荧光的丢失。
序列表
<110> CSL Behring Lengnau AG; The Regents of the University of
California
<120> 用于治疗视神经脊髓炎的重组 IgG Fc多聚体
<130> 2017_L003_A285
<150> US 62/598,592
<151> 2017-12-14
<150> EP18168448
<151> 2018-04-20
<160> 105
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
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50 55 60
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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<223> 合成的
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 6
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
35 40 45
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn Lys Ala
130 135 140
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260
<210> 7
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
35 40 45
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn Lys Ala
130 135 140
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260
<210> 8
<211> 796
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala Val Ile
1 5 10 15
Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg
20 25 30
Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly
35 40 45
Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro
50 55 60
Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr
85 90 95
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
100 105 110
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
115 120 125
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
130 135 140
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
165 170 175
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
180 185 190
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
210 215 220
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
225 230 235 240
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
245 250 255
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
260 265 270
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
275 280 285
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
290 295 300
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
305 310 315 320
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
325 330 335
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
340 345 350
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
355 360 365
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
370 375 380
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
385 390 395 400
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
405 410 415
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
420 425 430
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
435 440 445
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
450 455 460
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
465 470 475 480
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
485 490 495
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
500 505 510
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
515 520 525
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
530 535 540
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
545 550 555 560
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
565 570 575
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
580 585 590
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
595 600 605
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
610 615 620
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
625 630 635 640
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
645 650 655
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
660 665 670
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
675 680 685
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
690 695 700
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
705 710 715 720
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
725 730 735
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
740 745 750
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
755 760 765
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
770 775 780
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
785 790 795
<210> 9
<211> 768
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
1 5 10 15
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
20 25 30
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
35 40 45
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
50 55 60
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
85 90 95
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys
465 470 475 480
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
485 490 495
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
500 505 510
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
515 520 525
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
530 535 540
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
545 550 555 560
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
565 570 575
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
580 585 590
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
595 600 605
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
610 615 620
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
625 630 635 640
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
645 650 655
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
660 665 670
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
675 680 685
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
690 695 700
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Pro Gly Ile Ser Gly Pro Pro
705 710 715 720
Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Asp His Gly Lys Pro Gly
725 730 735
Ile Gln Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Asp Pro Ser Leu Cys
740 745 750
Phe Ser Val Ile Ala Arg Arg Asp Pro Phe Arg Lys Gly Pro Asn Tyr
755 760 765
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Leu Val Leu Gly
1
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 11
Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr
1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly
1 5 10 15
Gly Thr Cys Tyr
20
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 13
Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr
1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 14
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys Leu Gln Asp
100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Val Leu Gly Pro Pro Leu Tyr Asn
245 250 255
Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
260 265
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人
<400> 16
Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ser
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Val Pro Pro Pro Pro Pro
1 5
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213> 人
<400> 18
Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro
50 55
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人
<400> 19
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 20
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 21
<211> 62
<212> PRT
<213> 人
<400> 21
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<400> 23
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Cys Pro Ser Cys
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Cys Pro Arg Cys
1
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Ser Pro Pro Cys
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Cys Pro Pro Ser
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Ser Pro Pro Ser
1
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 34
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 36
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<400> 51
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
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<220>
<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<400> 59
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 65
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<210> 67
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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<220>
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<400> 96
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50 55 60
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ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttt 180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag 240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc 360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg 420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctaccccagc 480
gacattgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc 600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660
tacacccaga agtcactgag cctgagcccc ggcaagccca ccctgtacaa tgtgtccctc 720
gtgatgagcg acaccgccgg cacctgttac 750
<210> 98
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 60
ggcggaccta gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttt 180
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag 240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgt gccaccagga ctggctgaac 300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgagaaaacc 360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg 420
gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaagggctt ctaccccagc 480
gacattgccg tggaatggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc 600
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660
tacacccaga agtcactgag cctgagcccc ggcaagccca ccctgtacaa tgtgtccctc 720
gtgatgagcg acaccgccgg cacctgttac 750
<210> 99
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 100
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 101
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 102
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 103
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 104
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210> 105
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65 70 75 80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115 120 125
Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130 135 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145 150 155 160
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180 185 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245 250 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260

Claims (32)

1.一种用于治疗视神经脊髓炎的Fc多聚蛋白，其中所述Fc多聚蛋白包含两个到六个IgG-Fc融合单体，其中每个Fc融合单体包含两个Fc融合多肽链，并且每个Fc融合多肽链包含IgG-Fc多肽和IgM尾端。
2.根据权利要求1使用的Fc多聚蛋白，其中所述Fc多聚蛋白是包含六个IgG-Fc融合单体的六聚体。
3.根据权利要求1-2使用的Fc多聚蛋白，其中每个Fc融合多肽链进一步包含IgG铰链区且不包含Fab多肽。
4.根据权利要求1-3使用的Fc多聚蛋白，其中所述Fc融合多肽链包含IgG1铰链区和IgG1 Fc多肽。
5.根据权利要求1-4使用的Fc多聚蛋白,其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：1表示。
6.根据权利要求1-4使用的Fc多聚蛋白,其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：2表示。
7.根据权利要求1-4使用的Fc多聚蛋白,其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：3表示，并且在每个IgG1 Fc多肽的第309位，亮氨酸被突变成半胱氨酸。
8.根据权利要求1-4使用的Fc多聚蛋白,其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：4表示，并且在每个IgG1 Fc多肽的第309位，亮氨酸被突变成半胱氨酸。
9.根据权利要求1-8使用的Fc多聚蛋白,其中所述Fc融合多肽链有多达5个保守氨基酸变化。
10.用于治疗视神经脊髓炎的重组人Fc六聚体,其中所述重组人Fc六聚体包含六个人IgG1-Fc融合单体，其中每个Fc融合单体包含两个人Fc融合多肽链，并且每个Fc融合多肽链包含人IgG1Fc多肽和人IgM尾端，此外，其中每个Fc融合多肽链中的所述IgM尾端包含18个氨基酸，其在IgG1Fc多肽的恒定区的C端与232个氨基酸融合。
11.根据权利要求10的重组人Fc六聚体，其中每个Fc融合多肽链进一步包含IgG1铰链区，且不包含Fab多肽。
12.根据权利要求10-11的重组人Fc六聚体，其中每个IgG1 Fc多肽包含在第309位的亮氨酸至半胱氨酸突变。
13.根据权利要求1-12的Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体在NMO体外模型中抑制补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞的细胞毒性。
14.根据权利要求1-13的Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体在视神经脊髓炎的脊髓切片模型中离体抑制补体依赖性细胞毒性和病理。
15.根据权利要求1-14的Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体，其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体通过抑制经典补体途径的激活而不抑制替代补体途径的激活来阻止视神经脊髓炎的发病。
16.根据权利要求1-15的Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体在视神经脊髓炎大鼠模型中体内阻止细胞毒性和病理。
17.一种治疗视神经脊髓炎的方法，包括施用Fc多聚蛋白，其中所述Fc多聚蛋白包含2-6个IgGFc融合单体，其中每个Fc融合单体包含两个Fc融合多肽链，并且每个Fc融合多肽链包含IgGFc多肽和IgM尾端。
18.根据权利要求17的方法，其中所述Fc多聚蛋白是包含6个IgG Fc融合单体的六聚体。
19.根据权利要求17-18的方法，其中每个Fc融合多肽链还进一步包含IgG铰链区，并且不包含Fab多肽。
20.根据权利要求17-19的方法，其中所述Fc融合多肽链包含IgG1铰链区和IgG1 Fc多肽。
21.根据权利要求17-20的方法，其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：1表示。
22.根据权利要求17-20的方法，其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：2表示。
23.根据权利要求17-20的方法,其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：3表示，并且在每个IgG1 Fc多肽的第309位，亮氨酸被突变成半胱氨酸。
24.根据权利要求17-20的方法,其中所述Fc融合多肽链由SEQ ID NO：4表示，并且在每个IgG1 Fc多肽的第309位，亮氨酸被突变成半胱氨酸。
25.根据权利要求17-24的方法,其中所述Fc融合多肽链有多达5个保守氨基酸变化。
26.一种治疗视神经脊髓炎的方法，包括施用重组人Fc六聚体，其中所述重组人Fc六聚体包含6个人IgG1Fc融合单体，其中每个Fc融合单体包含两个人Fc融合多肽链，并且每个Fc融合多肽链包含人IgG1Fc多肽和人IgM尾端，进一步地其中每个Fc融合多肽链中的IgM尾端包含18个氨基酸，其在IgG1Fc多肽恒定区的C端与232个氨基酸融合。
27.根据权利要求26的方法,其中每个Fc融合多肽链进一步包含IgG1铰链区，并且不包含Fab多肽。
28.根据权利要求26-27的方法,其中每个IgG1 Fc多肽包含第309位的亮氨酸至半胱氨酸突变。
29.根据权利要求17-28的方法,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体在NMO体外模型中抑制补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞的细胞毒性。
30.根据权利要求17-29的方法,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体在视神经脊髓炎的脊髓切片模型中离体抑制补体依赖性细胞毒性和病理。
31.根据权利要求17-30的方法,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体通过抑制经典补体途的激活而不抑制替代补体途径的激活来阻止视神经脊髓炎的发病。
32.根据权利要求17-31的方法,其中所述Fc多聚蛋白或重组人Fc六聚体在视神经脊髓炎大鼠模型中体内阻止细胞毒性和病理。
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