BR112021005831A2 - proteína de fusão de fator viii de coagulação humana de cadeia simples mutado, método de preparação para isso e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE FUSÃO DE FATOR VIII DE COAGULAÇÃO HUMANA DE CADEIA SIMPLES MUTADO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO PARA ISSO E USO DO MESMO. É divulgada uma proteína de fusão de um fator VIII de coagulação humana de cadeia simples recombinante mutado (FVIII), um método de preparação para isso e um uso do mesmo. A proteína de fusão compreende sequencialmente, de um N-terminal a um Cterminal, um FVIII humano de cadeia simples mutado tendo um domínio B parcialmente excluído, um ligante de peptídeo flexível, pelo menos, uma unidade rígida de um peptídeo terminal carboxil de uma subunidade beta gonadotropina coriônica humana e uma meação de prolongamento de meia-vida (preferencialmente uma variante Fc IgG). A proteína de fusão tem uma atividade biológica semelhante a um FVIII recombinante, uma meia-vida ativa prolongada in vivo e melhor estabilidade in vitro e in vivo e, assim, melhora a farmacocinética e a eficácia da proteína de fusão.

Description

PROTEÍNA DE FUSÃO DE FATOR VIII DE COAGULAÇÃO HUMANA DE CADEIA SIMPLES MUTADO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO PARA ISSO E USO DO MESMO Campo técnico

[001] A presente divulgação refere-se ao campo das proteínas de fusão e, em particular, a uma proteína de fusão de um fator VIII de coagulação humana mutante (FVIII), um método de preparação do mesmo e uso do mesmo, especialmente uso para tratamento de uma variedade de doenças relacionadas à coagulação.

Antecedentes

[002] O fator VIII de coagulação (FVIII), também referido como fator anti-hemofílico, desempenha um papel importante em um sistema de coagulação endógena. Os resultados de numerosos estudos sobre o FVIII em genética molecular mostram que a deficiência de FVIII em genes ligados ao cromossomo sexual X resulta em hemofilia A. De acordo com estatísticas, a prevalência de hemofilia A em homens é de 1/5000 e representa mais de 80% do total de pacientes com hemofilia. Atualmente, um tratamento comum para hemofilia A é a terapia de reposição, ou seja, o suplemento de FVIII que falta aos pacientes com hemofilia.

[003] O FVIII maduro consiste em cadeias leves e pesadas com um peso molecular de aproximadamente 280 kDa e possui domínios A1-A2-B-A3-C1-C2. Nas células, a proteólise do resíduo Arg-1648 no domínio B produz uma cadeia pesada (A1-A2-B) com diferentes tamanhos variando de 90 a 200 kDa e uma cadeia leve (domínios A3-C1-C2) de 80 kDa. A cadeia pesada e a cadeia leve ligam-se para formar um heterodímero via ligações dependentes de íons de metal bivalente. No plasma, o dímero consistindo em uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em seguida, liga-se ao Fator de von Willebrand (vWF) com alta afinidade para ser protegido de ser degradado antes da maturação. A meia-vida do FVIII não ativado que se liga ao vWF é de aproximadamente 12 horas no plasma. O FVIII é ativado através da clivagem hidrolítica de Arg372 e Arg740 na cadeia pesada e Arg1689 na cadeia leve pelo fator de coagulação ativado FX (FXa) e trombina FII (FIIa), para que o fator vWF seja liberado e dímeros FVIII ativados (FVIIIa) são gerados. O FVIIIa forma um complexo compacto com fator de coagulação ativado FIX (FIXa) e FX na superfície do fosfolipídio na presença de Ca2+. O FX é então ativado pelo FIXa. O FX ativado é dissociado do complexo e converte a protrombina em trombina, onde a trombina pode converter diretamente o fibrinogênio em fibrina. Como um cofator no sistema de coagulação, o FVIII pode aumentar a eficiência catalítica do FIXa para ativar o FX em várias ordens de magnitude.

[004] Devido a uma estrutura complexa e um grande peso molecular da proteína FVIII, o FVIII é muito instável e fácil de desativar em processos, tais como coleta de plasma e purificação e preparação recombinantes. O FVIII tem efeito dentro de um período relativamente curto, especialmente em uma solução aquosa. Fatores, tais como temperatura de armazenamento, íons de sais inorgânicos, traços de proteases e outras proteínas envolvidas na coagulação (especialmente vWF e albumina), afetam a estabilidade das moléculas de FVIII. Durante a administração de injeção após a reconstituição de liofilizados de FVIII, a segurança e a esterilidade devem ser garantidas, e a infusão deve ser concluída dentro do tempo especificado, que geralmente não é superior a 4 horas. Por outro lado, oscilações violentas quando os liofilizados de FVIII são reconstituídos também resultarão em danos à estrutura das proteínas, o que desativa o FVIII. Portanto, o desenvolvimento de moléculas de FVIII com melhor estabilidade pode melhorar a flexibilidade dos produtos FVIII em aplicações clínicas e é essencial para melhorar muito a segurança da medicação e a qualidade de vida dos pacientes.

[005] O domínio B do FVIII contém 18 locais de N-glicosilação, não tem função conhecida relacionada à coagulação e não é homólogo de outras proteínas. As moléculas de FVIII com o domínio B excluído ainda têm boa atividade pró-coagulante. Eaton et al. divulgam que uma molécula de FVIII que carece de 766 aminoácidos (797 a 1562) no domínio B central retém atividade biológica; além disso, o FVIII com o domínio B excluído é expresso em quantidades maiores do que moléculas de comprimento completo em células de mamíferos e exibe uma taxa de ativação mais rápida e mais alta do que as moléculas de comprimento completo (Eaton et al., Biochemistry, 1986, 25: 8343-8347). Outros estudos também mostram que a exclusão da porção principal do domínio B (Ser743 a Gln1638) não tem efeito sobre a atividade funcional do FVIII, mas diminui significativamente o peso molecular (em 38%) e aumenta um nível de expressão do FVIII em células eucarióticas (Peters R T et al., J Thromb Haemost, 2013, 11(1): 132- 141; Sandberg H et al., Semin Hematol, 2001, 38: 4-12).

[006] Afstyla é um novo produto FVIII humano de cadeia simples recombinante e é o único produto de fator de coagulação de cadeia simples com uma cadeia leve e uma cadeia pesada fundidas, que está atualmente aprovado para o tratamento de hemofilia A. Afstyla tem estabilidade molecular mais alta e maior duração de eficácia devido à sua forte afinidade com o fator de von Willebrand (vWF). Em estudos clínicos, a Afstyla demonstra excelentes efeitos de hemostasia e profilaxia de sangramento tanto na profilaxia quanto no tratamento sob demanda, com dosagem relativamente baixa e segurança muito boa em ambos os esquemas de administração. Comparado com um medicamento de cuidados padrão Octocog alfa, a Afstyla é mais estável na configuração de proteínas e tem eficácia relativamente durável, mas ainda precisa ser injetado de 2 a 3 vezes por semana.

[007] Para estender a meia-vida funcional in vivo do FVIII, na técnica existente, o FVIII está ligado a uma meação de prolongamento de meia-vida, tais como PEG, albumina de soro humano (HSA), transferrina ou IgG Fc. Atualmente, Novo Nordisk (N8-GP), Bayer (BAY94-9027) e Baxter (BAX 855) desenvolveram produtos FVIII PEGuilados de longa duração que entraram no estágio de estudos clínicos. No entanto, uma etapa adicional de conjugar quimicamente o PEG ao FVIII é adicionada a um processo de preparação de proteína, reduzindo o rendimento final e aumentando o custo de preparação. Por outro lado, dados de estudos farmacocinéticos mostram que o FVIII PEGuilado não alcançou uma meia-vida significativamente prolongada (Tiede A et al., J Thromb Haemost, 2013, 11: 670-678; Turecek PL et al., Hamostaseologie, 2012, 32 Suppl 1: S29-38). O documento WO2013106789 divulgou um polipeptídeo quimérico (FVIIIFc) contendo uma meação de FVIII e uma meação de Fc, onde a meia-vida terminal do polipeptídeo FVIII quimérico é estendida para duas vezes mais que a de rFVIII. Na profilaxia, é administrada duas vezes por semana para manter o nível de atividade do FVIII em 1-3%.

[008] CTP é um peptídeo curto derivado do terminal carboxil da subunidade β gonadotropina coriônica humana (hCG) e contém vários locais de O-glicosilação. Este peptídeo carregado negativamente e altamente sializado está covalentamente ligado ao

C-terminal de outras proteínas de modo a ser resistente à depuração renal, estendendo assim a meia-vida de uma proteína-alvo à qual o CTP está ligado in vivo. Alguns documentos de patente divulgam que o CTP pode ser usado como uma meação de prolongamento de meia-vida incluída em uma proteína de fusão. A presente divulgação usa criativamente um polipeptídeo CTP com múltiplos locais de O-glicosilação como parte de um peptídeo ligante para ligar o FVIII de cadeia simples e um fragmento Fc em vez de ser ligado ao C-terminal para funcionar como um ligante de fusão. Uma vez que possui locais de glicosilação naturais, o polipeptídeo CTP pode não apenas prolongar ainda mais a meia-vida da proteína de fusão e melhorar a biodisponibilidade, mas também cooperar com um peptídeo ligante flexível GS convencional para formar uma conformação estéreo estável, assim, estimulando o FVIII de cadeia simples e o fragmento Fc a ser dobrado independentemente para formar uma conformação tridimensional correta, reduzindo consideravelmente o efeito de impedimento estérico do ligante de fusão Fc no FVIII de cadeia simples e permitindo que o FVIII de cadeia simples mantenha atividade biológica relativamente alta. Além disso, o efeito protetor das cadeias laterais de glicosil CTP pode reduzir a suscetibilidade do peptídeo ligante às proteases.

[009] Em resumo, embora atualmente muitos estudos forneçam esquemas efetivos para preparar de proteínas FVIII recombinantes, o número heterólogo, estruturas e a ativação de trombina instável de derivados de FVIII em comparação com o FVIII de comprimento completo ainda são um problema sério. Além disso, uma vez que uma variedade de domínio B excluído do FVIII são expressos como proteínas de fusão, as sequências de aminoácidos não naturais podem causar nova imunogenicidade quando administradas. A estabilidade das moléculas de FVIII também é crítica para o armazenamento e aplicações clínicas. Neste caso, é desejável desenvolver derivados de FVIII ativados, estáveis e seguros que possam ter a mesma atividade de trombina, um rendimento aumentado e uma meia-vida mais longa para que a profilaxia possa ser mantida reduzindo a frequência de injeções, ajudando a melhorar os efeitos do tratamento.

Resumo

[010] A presente divulgação fornece uma proteína de fusão Fc de um fator VIII de coagulação de cadeia simples mutante recombinante, que tem uma meia-vida de atividade estendida in vivo e atividade biológica semelhante à do FVIII recombinante. Além disso, a presente divulgação fornece um método para expressar de forma eficiente e estável a proteína de fusão. A proteína de fusão expressa pelo método tem as vantagens de alto rendimento, boa estabilidade nos processos de preparação e armazenamento e atividade biológica semelhante à do FVIII recombinante no mercado. Os inventores do presente pedido descobriram surpreendentemente que a proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante recombinante construída tem estabilidade substancialmente aumentada, a proteína de fusão pode evitar ser clivada por proteases nas células e a proteína de fusão obtida exibe melhor estabilidade após ser purificada e boa biodisponibilidade quando administrada por via subcutânea.

[011] Em um primeiro aspecto da presente divulgação, a presente divulgação refere- se a uma proteína de fusão de fator VIII de coagulação de cadeia simples mutante recombinante. A proteína de fusão inclui, sequencialmente a partir do N-terminal ao C- terminal, um FVIII humano de cadeia simples com um domínio B parcialmente excluído (scFVIII), um ligante de peptídeo flexível (L), pelo menos uma unidade rígida de peptídeo de terminal carboxil da subunidade β gonadotropina coriônica humana (doravante referida como “unidade rígida CTP” e expressa como (CTP)n, em que n é preferencialmente 1, 2, 3, 4, ou 5), e uma meação de prolongamento de meia-vida (tais como um fragmento Fc de imunoglobulina, albumina, transferrina ou PEG, preferencialmente uma variante IgG Fc humana (expressa como vFc)). Em algumas concretizações preferidas da presente divulgação, a proteína de fusão é expressa como scFVIII-L-CTP-vFc.

[012] O scFVIII carece de aminoácidos 765 a 1651 em comparação com a sequência de aminoácidos do FVIII de tipo selvagem humano de comprimento completo, como mostrado em SEQ ID NO: 1. Especificamente, o scFVIII tem uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 2.

[013] O ligante de peptídeo flexível é preferencialmente não imunogênico e produz uma distância espacial suficiente entre o scFVIII e o Fc para minimizar o impedimento estérico entre eles. Preferencialmente, é usado aqui um ligante de peptídeo flexível consistindo em dois ou mais resíduos de aminoácidos que são selecionados a partir dos seguintes aminoácidos: Gly(G), Ser(S), Ala(A) e Thr(T).

[014] Mais preferencialmente, o ligante de peptídeo flexível inclui resíduos G e S. O comprimento de um peptídeo ligante é muito importante para a atividade da proteína de fusão. Para a presente divulgação, o ligante de peptídeo pode preferencialmente ter uma fórmula geral de sequência de aminoácidos formada pela combinação de unidades cíclicas (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d, em que a, b, c e d são inteiros maiores ou iguais a 0 e a+b+c+d ≥ 1.

[015] Especificamente, em uma concretização da presente divulgação, o ligante de peptídeo pode, preferencialmente, incluir uma sequência a seguir: (i) L1: GSGGGSGGGGSGGGGS; (ii) L2: GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; (iii) L3: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; (iv) L4: GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; (v) L5: GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS.

[016] A unidade rígida CTP é selecionada a partir de uma sequência de comprimento completo consistindo nos aminoácidos 113 a 145 no terminal carboxil da subunidade β gonadotropina coriônica humana ou um fragmento da mesma. Especificamente, a unidade rígida CTP inclui uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 3 ou uma sequência truncada da mesma. Em primeiro lugar, esse polipeptídeo CTP que contém múltiplos locais de glicosilação e existe naturalmente em corpos humanos é não imunogênico. Em segundo lugar, em comparação com o peptídeo ligante flexível que se enrola irregularmente, um peptídeo ligante rígido CTP contendo múltiplos locais de glicosilação pode formar uma conformação estéreo estável e promover o scFVIII e o fragmento Fc a serem dobrados independentemente para formar uma conformação tridimensional correta sem afetar suas respectivas atividades biológicas. Além disso, o efeito protetor das cadeias laterais de glicosil CTP pode reduzir a suscetibilidade do peptídeo ligante às proteases.

[017] Preferencialmente, a unidade rígida CTP inclui pelo menos dois locais de glicosilação. Por exemplo, em uma concretização preferida da presente divulgação, a unidade rígida CTP inclui dois locais de glicosilação. Exemplarmente, a unidade rígida CTP inclui 10 aminoácidos no N-terminal da SEQ ID NO: 3, ou seja, SSSS*KAPPPS*. Alternativamente, a unidade rígida CTP inclui 14 aminoácidos no C-terminal da SEQ ID NO: 3, ou seja, S*RLPGPS*DTPILPQ. Para outro exemplo, em outra concretização, a unidade rígida CTP inclui três locais de glicosilação. Exemplarmente, a unidade rígida CTP inclui 16 aminoácidos no N-terminal da SEQ ID NO: 3, ou seja, SSSS*KAPPPS*LPSPS*R. Para outro exemplo, em algumas outras concretizações, a unidade rígida CTP inclui quatro locais de glicosilação. Exemplarmente, a unidade rígida CTP inclui 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 aminoácidos das posições 113, 114, 115, 116, 117 ou 118 para a posição 145 da subunidade β gonadotropina coriônica humana. Especificamente, a unidade rígida CTP inclui 28 aminoácidos no N-terminal da SEQ ID NO: 3, ou seja, SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ. Aqui, * representa um local de glicosilação. Cada possibilidade representa uma concretização independente da presente divulgação.

[018] Em algumas outras concretizações, a unidade rígida CTP fornecida pela presente divulgação é pelo menos 70% homóloga a uma sequência de aminoácidos CTP nativo. Em algumas outras concretizações, a unidade rígida CTP fornecida pela presente divulgação é pelo menos 80% homóloga a uma sequência de aminoácidos CTP nativo. Em algumas outras concretizações, a unidade rígida CTP fornecida pela presente divulgação é pelo menos 90% homóloga a uma sequência de aminoácidos CTP nativo. Em algumas outras concretizações, a unidade rígida CTP fornecida pela presente divulgação é pelo menos 95% homóloga a uma sequência de aminoácidos CTP nativo.

[019] Em uma concretização específica da presente divulgação, a unidade rígida CTP pode, preferencialmente, incluir uma sequência a seguir: (i) CTP1: PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ; (ii) CTP2: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ; (iii) CTP3: SSSSKAPPPS; (iv) CTP4: SRLPGPSDTPILPQ.

[020] Em algumas concretizações da presente divulgação, a proteína de fusão inclui uma unidade rígida CTP descrita acima. Em algumas outras concretizações da presente divulgação, a proteína de fusão inclui duas ou mais unidades rígidas de CTP descritas acima, preferencialmente 2, 3, 4 ou 5 unidades rígidas CTP descritas acima.

[021] A meação de prolongamento de meia-vida é preferencialmente selecionada a partir de um fragmento Fc de imunoglobulina IgG, IgM ou IgA, mais preferencialmente selecionado a partir de um fragmento Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano ou uma variante do mesmo. Além disso, a variante IgG Fc humana inclui pelo menos uma modificação de aminoácidos no IgG Fc de tipo selvagem humano e a variante tem uma função efetora reduzida (efeitos ADCC e/ou CDC) e/ou afinidade de ligação aumentada para um receptor neonatal FcRn. Além disso, a variante IgG Fc humana pode ser selecionada a partir do seguinte grupo: (i) vFcγ1: região dobradiça IgG1 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Leu234Val, Leu235Ala e Pro331Ser (tal como uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 4); (ii) vFcγ2-1: região dobradiça IgG2 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutação Pro331Ser (tal como uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 5); (iii) vFcγ2-2: região dobradiça IgG2 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Thr250Gln e Met428Leu (tal como uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 6); (iv) vFcγ2-3: região dobradiça IgG2 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Pro331Ser, Thr250Gln e Met428Leu (tal como uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 7); (v) vFcγ4: região dobradiça IgG4 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Ser228Pro e Leu235Ala (tal como uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 8).

[022] A variante IgG Fc fornecida pela presente divulgação inclui, mas não está limitada a, as cinco variantes acima de (i) a (v) e também pode ser uma combinação ou superposição de locais de mutação em dois tipos de variantes funcionais de isotipos de IgG. Por exemplo, a variante em (iv) é uma nova variante combinada de IgG2 Fc obtida por superposição de locais de mutação em (ii) e (iii).

[023] A variante Fc (vFc) na proteína de fusão da presente divulgação contém a região dobradiça, região CH2 e região CH3 do IgG humano, tais como IgG1, IgG2 ou IgG4 humano. A região CH2 contém mutações de aminoácidos nas posições 228, 234, 235 e 331 (determinadas por um sistema de contagem EU). Acredita-se que essas mutações de aminoácidos podem reduzir a função efetora do Fc. O IgG2 humano não se liga ao FcγR, mas mostra atividade de complemento muito baixa. Uma variante Fcγ2 com mutação Pro331Ser deve ter atividade de complemento menor que a Fcγ2 natural e permanece não ligada a FcγR. O IgG4 Fc é deficiente na ativação de complemento de cascata e sua afinidade de ligação com FcγR é cerca de uma ordem de magnitude menor que o IgG1. Uma variante Fcγ4 com mutação Leu235Ala deve exibir uma função efetora mínima em comparação com Fcγ4 natural. O Fcγ1 com mutações Leu234Val, Leu235Ala e Pro331Ser também exibe função efetora reduzida em comparação com Fcγ1 natural. Estas variantes de Fc são todas mais adequadas para a preparação de uma proteína de fusão FVIII do que o IgG Fc humano natural. Enquanto isso, as mutações de aminoácidos nas posições 250 e 428 (determinadas por um sistema de numeração EU) aumentam a afinidade de ligação de uma região Fc ao receptor neonatal FcRn, estendendo ainda mais a meia-vida (Paul R et al., J Biol Chem, 2004, 279: 6213-6216). A combinação ou superposição dos dois tipos de variantes funcionais acima dá uma nova variante combinada que não só reduz a função efetora, mas também estende a meia-vida. A variante Fc da presente divulgação inclui, mas não está limitada a, mutações nos vários locais acima. Substituições em outros locais também podem ser introduzidas para que o Fc tenha a função efetora reduzida e/ou ligação aumentada a um receptor FcRn sem causar uma diminuição na função/atividade da variante Fc ou causar uma alteração conformacional adversa. Para locais comuns de mutação, ver Shields RL et al., J Biol Chem, 2001, 276(9): 6591-604.

[024] Em uma concretização preferida da presente divulgação, a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos como mostrado por SEQ ID NO: 9.

[025] Em outro aspecto da presente divulgação, o DNA para codificar a proteína de fusão descrita acima é fornecido.

[026] Em uma concretização preferida da presente divulgação, o DNA para codificar a proteína de fusão tem uma sequência como mostrado na SEQ ID NO: 10.

[027] Em outro aspecto da presente divulgação, um vetor é fornecido. O vetor inclui o DNA descrito acima.

[028] Em outro aspecto da presente divulgação, uma célula hospedeira é fornecida. A célula hospedeira inclui o vetor descrito acima ou foi transfectada com o vetor descrito acima.

[029] Em uma concretização específica da presente divulgação, a célula hospedeira é uma cepa de células DXB-11 derivadas de CHO.

[030] Em um quinto aspecto da presente divulgação, uma composição farmacêutica é fornecida. A composição farmacêutica inclui um portador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável e uma quantidade efetiva da proteína de fusão descrita acima.

[031] Em outro aspecto da presente divulgação, um método para preparar ou produzir a proteína de fusão de uma linha celular de mamífero, tal como uma linha celular derivada de CHO, é fornecido, incluindo as seguintes etapas: (a) introduzir DNA para codificar uma proteína de fusão em uma célula CHO para produzir uma linha celular derivada de CHO; (b) rastrear na etapa (a) uma cepa de células de alto rendimento que expressa mais que 1 UI/106 células a cada 24 horas em um meio de crescimento das mesmas; (c) cultivar a cepa de células rastreada na etapa (b) para expressar a proteína de fusão; (d) colher um caldo de fermentação obtido na etapa (c) e separar e purificar a proteína de fusão.

[032] Além disso, a linha celular derivada de CHO na etapa (a) é DXB-11.

[033] Além disso, a cultura de células na etapa (c) pode ser cultura em lote, cultura de perfusão ou cultura de lote alimentado.

[034] Além disso, na etapa (d), a proteína de fusão é purificada por cromatografia de quatro etapas, ou seja, cromatografia de afinidade, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de troca de ânion e cromatografia de peneira molecular. As condições preferidas são descritas ainda na presente divulgação em conjunto com o Exemplo 5.

[035] Em uma concretização preferida da presente divulgação, a proteína de fusão preparada pelo método acima tem atividade superior a 6000 UI/mg.

[036] Em um sexto aspecto da presente divulgação, o uso da proteína de fusão para preparar um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença ou evento hemorrágico devido a uma deficiência de FVIII ou uma deficiência funcional é fornecido.

[037] Além disso, a doença inclui hemofilia A. A proteína de fusão da presente divulgação desempenha um papel no controle ou prevenção da ocorrência de sangramento no evento de sangramento espontâneo, profilaxia cirúrgica, gestão perioperatória ou tratamento cirúrgico de um paciente com hemofilia A.

[038] A proteína de fusão divulgada e/ou descrita e o método de preparação da mesma da presente divulgação têm as seguintes vantagens:

1. O fragmento Fc na proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante construída na presente divulgação é não-lítico. Ou seja, o complemento e os domínios de ligação de receptor de fragmento Fc são mutados para regular a afinidade de ligação de Fc ao correspondente receptor de modo a reduzir ou eliminar os efeitos ADCC e CDC, tal que o fragmento Fc estenda a meia-vida in vivo de proteínas ativas sem produzir citotoxicidade.

2. A proteína de fusão FVIII mutante de cadeia simples fornecida pela presente divulgação inclui um polipeptídeo CTP rígido com múltiplas cadeias laterais de glicosil. Comparado a um peptídeo ligante flexível, tal como (GGGGS)n que se enrola irregularmente, o polipeptídeo CTP rígido pode formar uma conformação estéreo estável. Este papel de “separação” promove o FVIII e o fragmento Fc a serem dobrados independentemente para formar a conformação tridimensional correta sem afetar suas respectivas atividades biológicas. O CTP contém múltiplos oligossacarídeos O- modificados. O CTP carregado negativamente e altamente sializado pode resistir à depuração renal e estender ainda mais a meia-vida da proteína de fusão. Por outro lado,

o efeito protetor das cadeias laterais de glicosil CTP pode reduzir a suscetibilidade do peptídeo ligante a proteases para que a proteína de fusão não seja facilmente degradada na região ligante.

3. A proteína de fusão da presente divulgação tem boa estabilidade in vitro durante a fermentação, purificação e armazenamento. Após o armazenamento em temperatura ambiente, ou seja, 25 °C por sete dias, a atividade da proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante é significativamente maior do que a de um medicamento de uma proteína de fusão FVIII Fc de cadeia dupla recombinante onde os locais de clivagem de protease da proteína de fusão entre Arg1648 e Glu1649 não são inativados (codificados por uma sequência de comprimento completo de tipo selvagem humano, ou seja, SEQ ID NO: 1), e a perda da atividade é inferior a 20%.

4. O método para preparar a proteína de fusão fornecido pela presente divulgação pode alcançar um alto rendimento. Um rendimento acumulado pode chegar a pelo menos 200 mg/L após incubação em um frasco de agitação de 300 mL por 14 dias. O processo pode ser ampliado para alcançar a produção industrial em grande escala.

Descrição detalhada da divulgação Peptídeo de terminal carboxil (CTP) de hCG-β

[039] CTP é um peptídeo curto derivado do terminal carboxil da subunidade β gonadotropina coriônica humana (hCG). Quatro hormônios de polipeptídeo relacionados à reprodução compreendendo o hormônio folículo-estimulante (FSH), o hormônio luteinizante (LH), hormônio estimulante da tireoide (TSH) e gonadotropina coriônica humana (hCG), contêm a mesma subunidade α e suas respectivas subunidades β específicas. A meia-vida in vivo do hCG é significativamente maior do que a dos outros três hormônios, principalmente devido ao peptídeo de terminal carboxil (CTP) específico de sua subunidade β (Fares FA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(10): 4304-4308). Um CTP natural contém 37 resíduos de aminoácidos, quatro locais de O-glicosilação e um resíduo de ácido siálico terminal. O CTP carregado negativamente e altamente sializado pode resistir à depuração renal e, assim, estender a meia-vida de circulação in vivo (Fares F A et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(10): 4304-4308). No entanto, a presente divulgação liga criativamente pelo menos um polipeptídeo CTP com um peptídeo ligante flexível com um comprimento apropriado, que juntos servem como um peptídeo ligante para ligar o FVIII a uma meação de prolongamento de meia-vida (tal como um fragmento Fc de imunoglobulina).

[040] A presente divulgação constatou que a adição do CTP entre o FVIII e uma variante Fc é equivalente à adição de um peptídeo ligante rígido. Isso, por um lado, garante que o FVIII fundido no N-terminal não afete um local de ligação da variante Fc ao FcRn para que a meia-vida não seja afetada. Além disso, o local de ligação da proteína A em Fc é importante para a purificação em um processo de preparação. A ligação de CTP garante que o FVIII fundido no N-terminal não “cubra” seu local de ligação com proteína A para que enchimentos mais baratos e adequados possam ser selecionados para purificar a proteína de fusão, reduzindo o custo de purificação. Por outro lado, a adição do CTP permite que o fragmento Fc de 25 kDa não interfira na dobra correta do FVIII fundido no N-terminal para que a atividade/função biológica do FVIII não seja diminuída ou perdida. Comparado com um peptídeo ligante flexível, tal como (GGGGS)n que se enrola irregularmente, o polipeptídeo CTP rígido com múltiplas cadeias laterais de glicosil pode formar uma conformação estéreo estável. Este papel de “separação” promove o FVIII e o fragmento Fc a serem dobrados independentemente para formar a conformação tridimensional correta sem afetar suas respectivas atividades biológicas. Por outro lado ainda, o efeito protetor das cadeias laterais de glicosil CTP pode reduzir a suscetibilidade do peptídeo ligante às proteases para que a proteína de fusão não seja facilmente degradada na região ligante.

Variante IgG Fc Variante Fc não-lítico

[041] O elemento Fc é derivado de um fragmento Fc em uma região constante de imunoglobulina IgG e desempenha um papel importante na defesa imunológica contra um patógeno. A função efetora do IgG mediada por Fc é realizada através dos dois mecanismos a seguir: (1) Fc liga-se a receptores Fc (FcγRs) na superfície celular, para que o patógeno seja digerido por fagocitose ou lise ou por células assassinas via um caminho de citotoxicidade dependente de anticorpos (ADCC) ou (2) Fc liga-se ao C1q de um primeiro componente de complemento C1 e desencadeia um caminho de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) para lisar o patógeno. Entre quatro subtipos de IgG humano, o IgG1 e o IgG3 podem ligar-se efetivamente a FcγRs, o IgG4 tem menor afinidade de ligação com o FcγRs e o IgG2 tem afinidade de ligação muito baixa com o FcγRs a ser determinado. Portanto, o IgG2 humano quase não tem efeito ADCC. Além disso, o IgG1 e o IgG3 humanos podem efetivamente ligar-se ao C1q para ativar o complemento de cascata. O IgG2 humano liga-se fracamente ao C1q e o IgG4 não se liga ao C1q (Jefferis R et al., Immunol Rev,1998, 163: 59-76). Portanto, o IgG2 humano tem um efeito CDC fraco. Aparentemente, nenhum dos subtipos IgG naturais é ideal para a construção de uma proteína de fusão FVIII-Fc. Para obter Fc não-lítico sem função efetora, o método mais efetivo é mutar o complemento e os domínios de ligação de receptor de fragmento Fc para regular a afinidade de ligação de Fc aos receptores correspondentes, reduzir ou eliminar os efeitos ADCC e CDC e reter a atividade biológica da proteína funcional e a meia-vida estendida in vivo do fragmento Fc sem produzir citotoxicidade. Para mais locais de mutação incluídos na variante Fc não-lítico, ver Shields RL et al., J Biol Chem, 2001, 276(9): 6591-604 ou patente chinesa No. CN

201280031137.2.

Variante Fc com afinidade de ligação aumentada ao receptor neonatal (FcRn)

[042] A meia-vida plasmática do IgG depende de sua ligação com o FcRn, onde o IgG geralmente se liga a um pH de 6,0 e se dissocia a um pH de 7,4 (o pH do plasma). Através de estudos sobre os locais de ligação, os locais de ligação do IgG ao FcRn foram modificados para aumentar a capacidade de ligação em pH 6,0. Foi provado que mutações de alguns resíduos de um domínio Fcγ humano importante para a ligação ao FcRn podem aumentar a meia-vida de soro. Foi relatado que mutações em T250, M252, S254, T256, V308, E380, M428 e N434 podem aumentar ou diminuir a afinidade de ligação ao FcRn (Roopenian et al., Nat. Rview Immunology, 7: 715-725, 2007). A patente coreana No. KR 10-1027427 divulga variantes de trastuzumabe (Herceptin, Genentech) com afinidade de ligação aumentada ao FcRn, onde essas variantes incluem uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas a partir de 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279Q, 279Y, 308F e 308Y. A publicação de patente coreana No. KR 2010-0099179 fornece variantes de bevacizumabe (Avastin, Genentech), onde essas variantes exibem uma meia-vida in vivo aumentada, por conter modificações de aminoácidos em N434S,

M252Y/M428L, M252Y/N434S e M428L/N434S. Além disso, Hinton et al. descobriram que os mutantes T250Q e M428L aumentam a ligação ao FcRn em 3 e 7 vezes, respectivamente. Quando dois locais são mutados simultaneamente, a ligação é aumentada 28 vezes. Em macacos rhesus, o mutante M428L ou T250QM/428L exibe a meia-vida de plasma aumentada 2 vezes (Paul R. Hinton et al., J Immunol, 2006, 176: 346-356). Para mais locais de mutação incluídos na variante Fc com a afinidade de ligação aumentada ao receptor neonatal (FcRn), ver a patente chinesa No. CN201280066663.2. Além disso, estudos mostram que a mutação T250Q/M428L no fragmento Fc de cinco anticorpos humanizados melhora a interação entre Fc e FcRn e também mostram que, em ensaios farmacocinéticos in vivo subsequentes, os anticorpos mutantes Fc, quando administrados por injeção subcutânea, tem melhorado os parâmetros farmacocinéticos, tais como aumento de exposição in vivo, redução de eliminação e aumento de biodisponibilidade subcutânea em comparação com um anticorpo de tipo selvagem (Datta-Mannan A et al., MAbs. Taylor & Francis, 2012, 4: 267-273).

Proteína de fusão e método de preparação da mesma

[043] Genes da proteína de fusão da presente divulgação são preparados por um método de síntese artificial com códons otimizados. De acordo com uma sequência de nucleotídeos na presente divulgação, os técnicos no assunto podem preparar convenientemente ácidos nucleicos de codificação da presente divulgação por vários métodos conhecidos. Esses métodos não estão limitados a uma síntese artificial ou subclonagem tradicional, etc. Para métodos específicos, ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual de J. Sambrook. Como uma concretização da presente divulgação, uma sequência de ácido nucleico de codificação da presente divulgação é construída sintetizando segmentos da sequência de nucleotídeos e subclonagem.

[044] A presente divulgação fornece ainda um vetor de expressão de células de mamífero, que inclui uma sequência para codificar a proteína de fusão da presente divulgação e uma sequência reguladora de expressão operativamente ligada a ela. O termo “operativamente ligado” ou “operavelmente ligado” refere-se a um caso onde uma determinada porção de uma sequência de DNA linear pode regular ou controlar a atividade de outras porções da mesma sequência de DNA linear. Por exemplo, se um promotor controla a transcrição de uma sequência, o promotor está operativamente ligado à sequência de codificação.

[045] O vetor de expressão de células de mamífero pode usar vetores disponíveis comercialmente, tais como, mas não limitados a, pcDNA3, pIRES, pDR, pBK e pSPORT que podem ser usados para a expressão em um sistema de células eucarióticas. Os técnicos no assunto também podem selecionar um vetor de expressão apropriado de acordo com a célula hospedeira.

[046] De acordo com o mapa de restrição do vetor de expressão vazio conhecido, os técnicos no assunto podem inserir a sequência de codificação da proteína de fusão da presente divulgação em locais de restrição apropriados através de enzima de restrição de clivagem e junção de acordo com um método convencional para obter um vetor de expressão recombinante da presente divulgação.

[047] A presente divulgação fornece ainda uma célula hospedeira que expressa a proteína de fusão da presente divulgação e contém a sequência de codificação da proteína de fusão da presente divulgação. As células hospedeiras são preferencialmente células eucarióticas, tais como, mas não limitadas a, células CHO, células COS, células 293 e células RSF. Como uma concretização preferida da presente divulgação, as células são células CHO que podem, preferencialmente, expressar a proteína de fusão da presente divulgação para que a proteína de fusão com boa atividade e estabilidade possa ser obtida.

[048] A presente divulgação fornece ainda um método para preparar a proteína de fusão da presente divulgação usando uma tecnologia de DNA recombinante, compreendendo as seguintes etapas: (1) fornecer uma sequência de ácido nucleico para codificar a proteína de fusão; (2) inserir a sequência de ácido nucleico em (1) em um vetor de expressão apropriado para obter um vetor de expressão recombinante; (3) introduzir o vetor de expressão recombinante em (2) em uma célula hospedeira apropriada; (4) cultivar a célula hospedeira transfectada em condições adequadas para expressão; e

(5) coletar um sobrenadante e purificar um produto de proteína de fusão.

[049] A sequência de codificação pode ser introduzida na célula hospedeira usando várias tecnologias conhecidas na técnica, tais como, mas não limitadas a, precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, eletroporação, microinjeção, infecção viral e íons de metal alcalino.

[050] Para a cultura e expressão de células hospedeiras, ver Olander RM et al., Dev Biol Stand, 1996, 86: 338. As células e os resíduos em uma suspensão podem ser removidos por centrifugação para coletar o sobrenadante.

[051] A proteína de fusão preparada acima pode ser purificada para obter propriedades substancialmente homogêneas, tal como uma banda única ou particular em eletroforese SDS-PAGE. Primeiro, o sobrenadante de expressão é concentrado e a solução concentrada pode ser ainda purificada através de cromatografia em gel ou cromatografia de troca de íons, tal como cromatografia de troca de ânions ou cromatografia de troca de cátions. A matriz de gel pode ser um meio comumente usado para purificação de proteínas, tais como agarose, dextrano e poliamida. Os grupos Q ou SP são grupos de troca de íons relativamente ideais. Finalmente, o produto purificado pode ser ainda mais refinado por métodos, tais como cromatografia de adsorção de hidroxiapatita, cromatografia de quelação metálica, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia líquida de alto desempenho de fase inversa. Em todas as etapas de purificação acima, diferentes combinações podem ser usadas para alcançar uma pureza de proteína substancialmente uniforme. A proteína de fusão expressada também pode ser purificada usando uma coluna de cromatografia de afinidade contendo um anticorpo, receptor ou ligante específico para a proteína de fusão. De acordo com as propriedades da coluna de afinidade usada, os polipeptídeos de fusão que se ligam à coluna de afinidade podem ser eluídos por métodos convencionais, tais como um tampão de alto teor de sal e uma alteração de pH.

Composição farmacêutica

[052] A presente divulgação fornece ainda uma composição farmacêutica contendo uma dose efetiva da proteína de fusão da presente divulgação e um portador farmaceuticamente aceitável. Geralmente, uma quantidade efetiva da proteína de fusão da presente divulgação pode ser formulada em um meio portador aquoso não tóxico, inerte e farmaceuticamente aceitável, onde o pH é geralmente cerca de 5-8, preferencialmente, o pH é cerca de 6-8. O termo “quantidade efetiva” ou “dose efetiva” refere-se a uma quantidade que pode ser funcional ou ativa e aceitável por humanos e/ou animais. Ingredientes “farmaceuticamente aceitáveis” são aqueles que são aplicáveis a humanos e/ou mamíferos sem efeitos colaterais adversos excessivos (tais como toxicidade, irritação e reações alérgicas),ou seja, substâncias com uma relação benefício/risco razoável. O termo “portador farmaceuticamente aceitável’ refere-se a um portador para a administração de um agente terapêutico, que inclui vários excipientes e diluentes.

[053] Portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem (mas não limitados a): solução salina, tampão, glicose, água, glicerol, etanol e combinações dos mesmos. Geralmente, uma preparação farmacêutica deve combinar com o modo de administração. A composição farmacêutica da presente divulgação pode ser feita na forma de injeções, por exemplo, preparadas por métodos convencionais usando solução salina ou solução aquosa normais contendo glicose e outros adjuvantes. A composição farmacêutica é preferencialmente produzida sob uma condição estéril. A quantidade de ingrediente ativo administrado é uma quantidade terapeuticamente efetiva. A preparação farmacêutica da presente divulgação também pode ser feita em uma preparação de liberação sustentada.

[054] A quantidade efetiva da proteína de fusão da presente divulgação pode variar dependendo do modo de administração e da gravidade de uma doença a ser tratada. A seleção de uma quantidade efetiva preferida pode ser determinada por técnicos no assunto de acordo com vários fatores (por exemplo, através de ensaios clínicos). Os fatores incluem, mas não estão limitados a, os parâmetros farmacocinéticos da proteína de fusão, tais como a biodisponibilidade, o metabolismo e a meia-vida, etc; a gravidade da doença a ser tratada, o peso de um paciente, o estado imunológico do paciente e a via de administração, etc.

Breve descrição dos desenhos

[055] A FIG. 1 é um diagrama de espectrograma SEC-HPLC de uma proteína de fusão purificada SS-F8.

[056] A FIG. 2 é um diagrama de eletroforese SDS-PAGE de uma proteína de fusão purificada SS-F8.

[057] A FIG. 3 mostra um efeito de uma proteína de fusão SS-F8 no tempo de sangramento de artérias safenas em ratos SD.

[058] A FIG. 4 mostra um efeito de uma proteína de fusão SS-F8 em APTT de plasma em ratos SD.

[059] A FIG. 5 é um diagrama estatístico de volume de sangramento em camundongos, onde *p < 0,05, **** p < 0,0001.

[060] A FIG. 6 é um diagrama estatístico de tempo de sangramento em camundongos, onde ns p > 0,05, **** p < 0,0001.

Descrição detalhada Exemplo 1. Construção de plasmídeos de expressão para codificar proteínas de fusão FVIII de cadeia simples mutante

[061] Sequências de gene para codificar um peptídeo líder FVIII, proteína FVIII com um domínio B parcialmente excluído, um ligante de peptídeo flexível, uma unidade rígida CTP e uma variante IgG vFc humana foram códons otimizados artificialmente que as células CHO preferem e foram sintetizados artificialmente. O fragmento de DNA de comprimento completo sintetizado da proteína de fusão incluiu um local de endonuclease de restrição, SpeI e EcoRI, nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente. O fragmento de DNA de comprimento completo foi inserido entre os locais de restrição correspondentes do vetor de transferência pUC57 e sua sequência foi verificada através de sequenciamento de DNA.

[062] O fragmento de gene de comprimento completo obtido acima da proteína de fusão foi transferido do vetor intermediário para um plasmídeo de expressão auto- fabricado PXY1A1M entre os locais de restrição correspondentes para obter um plasmídeo que expressa alto nível da proteína de fusão. O plasmídeo PXY1A1M incluía, mas não estava limitado a, os seguintes elementos de expressão importantes: (1) um promotor precoce citomegalovírus humano e um melhorador necessário para a alta expressão exógena em células de mamíferos; (2) um marcador de triagem dupla com resistência à canamicina em bactérias e resistência a G418 em células de mamífero; (3) cassete de expressão de gene de di-hidrofolato redutase murino (DHFR). O metotrexato (MTX) pode co-amplificar genes de fusão e genes DHFR quando uma célula hospedeira é deficiente nos genes DHFR (ver documento US 4.399.216). O plasmídeo de expressão da proteína de fusão foi transfectado em uma linha celular hospedeira de mamífero. Para alcançar uma expressão estável e de alto nível, uma linha celular hospedeira preferida é uma célula CHO deficiente de enzima DHFR (ver patente US No. 4.818.679). Após dois dias de transfecção, o meio foi substituído por um meio de triagem contendo 0,6 mg/mL de G418 e as células foram semeadas em uma placa de 96 poços em uma certa concentração (5000-10000 células viáveis/poço) e cultivadas por 10-14 dias até que grandes clones de células discretas aparecessem. Os transfectantes resistentes a medicamentos selecionados foram rastreados através do método de análise ELISA. Os poços com proteínas de fusão de alto nível foram subclonados através da diluição extrema da placa de cultura de 96 poços.

[063] Uma série de proteínas de fusão FVIII de cadeia simples mutantes foi construída na presente divulgação, que continha ligantes de peptídeo de diferentes comprimentos, unidades rígidas CTP de diferentes composições e vários subtipos diferentes de variantes IgG Fc (vFc), para verificar o efeito de peptídeos ligantes e variantes Fc na atividade das proteínas de fusão FVIII de cadeia simples mutantes. Os detalhes são mostrados na Tabela 1. As sequências de aminoácidos de cada componente são encontradas na LISTAGEM DE SEQUÊNCIA.

Tabela 1 Composições de várias proteínas FVIII de cadeia simples Composições de uma série de proteínas de fusão FVIII Código (do N-terminal ao C-terminal) SS-F4 scFVIII-L3-CTP1-vFcγ1 SS-F5 scFVIII-L5-CTP4-vFcγ4 SS-F6 scFVIII-L1-CTP3-CTP3-vFcγ2-2 SS-F7 scFVIII-L4-CTP3-vFcγ2-1

SS-F8 scFVIII-L2-CTP2-vFcγ2-3 SS-F9 scFVIII-L2-vFcγ2-3-CTP2 SS-F10 scFVIII-L1-vFcγ2-3 SS-F11 scFVIII-L4-vFcγ2-3 Exemplo 2. Triagem de uma linha celular transfectada estavelmente com alta expressão de proteína de fusão

[064] O plasmídeo de expressão acima de uma proteína de fusão foi transfectado em uma linha celular hospedeira de mamífero para expressar a proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante. Para manter a expressão estável e de alto nível, uma célula hospedeira preferida é uma célula CHO deficiente de DHFR (ver patente US No.

4.818.679). Um método de transfecção preferido é a eletroporação. Outros métodos podem ser usados, tais como co-precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção e microinjeção. O método de eletroporação usou o Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories) com uma tensão de 300 V e uma capacitância de 1050 μF e 50 μg de plasmídeos de expressão linearizados PvuI foram adicionados a 2 a 3 × 107 células colocadas em uma cubeta e as células após a eletroporação foram transferidas para um frasco de agitação contendo 30 mL de meio de crescimento. Após dois dias de transfecção, o meio foi substituído por um meio de crescimento contendo 0,6 mg/mL de G418 e as células foram semeadas em uma placa de 96 poços em uma certa concentração e cultivadas por 10-12 dias até que grandes clones de células discretas aparecessem. Os transfectantes resistentes a medicamentos selecionados foram rastreados através do método de análise ELISA contra o IgG Fc humano. Os poços com alto nível de expressão de proteínas de fusão foram subclonados através de diluição extrema.

[065] Para alcançar a expressão de alto nível de proteínas de fusão, o gene DHFR suprimido por MTX deve ser usado para a co-amplificação. Os genes de proteína de fusão transfectada foram co-amplificados com o gene DHFR em meio de crescimento contendo MTX com concentrações aumentadas. Os subclones positivos que expressaram DHFR foram submetidos a diluição limitante e a pressão foi aumentada gradualmente para filtrar os transfectantes que poderiam crescer em meio com MTX de até 6 μM. As taxas de secreção dos transfectantes foram determinadas e as linhas celulares com alta expressão de proteína exógena foram rastreadas. As linhas celulares com uma taxa de secreção maior que cerca de 1 (preferencialmente cerca de três) UI/106 (milhões) células /24 h foram suspensas adaptativamente usando um meio sem soro e as proteínas de fusão foram então purificadas usando um meio condicionado.

Exemplo 3. Produção de proteínas de fusão

[066] As cepas de células de alto rendimento obtidas preferencialmente no Exemplo 2 foram primeiro submetidas à aclimatação e cultura sem soro em uma placa de petri e, em seguida, transferidas para um frasco de agitação para aclimatação em suspensão e cultura. Após as células serem aclimatadas a essas condições de cultura, a cultura do lote alimentado foi realizada em um frasco de agitação de 300 mL ou a cultura de perfusão foi simulada por troca de meio diariamente. Uma cepa de células derivada de CHO que foi rastreada no Exemplo 2 para a produção de proteína de fusão SS-F8 foi submetida à cultura de lote alimentado por 14 dias em um frasco de agitação de 300 mL, onde um rendimento cumulativo de proteínas de fusão recombinantes expressas atingiu 200 mg/L e uma densidade de células viáveis máxima atingiu 15 × 106/mL. Para obter mais proteínas de fusão, um frasco de agitação de 1000 mL também pode ser usado para cultura. Em outro método de cultura, a cepa de células derivadas de CHO mencionada acima foi cultivada em um frasco de agitação de 100 mL com o meio trocado diariamente, onde um rendimento cumulativo diário de proteínas de fusão recombinantes expressas era de cerca de 20 mg/L e uma densidade de células viáveis máxima no frasco de agitação atingiu 30 × 106/mL. A atividade biológica das proteínas de fusão recombinantes produzidas pelos dois métodos acima foi determinada como comparável.

Exemplo 4. Purificação e qualificação de proteínas de fusão

[067] A proteína de fusão SS-F8 foi purificada principalmente através de cromatografia de quatro etapas na presente divulgação. A cromatografia de quatro etapas foi, respectivamente, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de ânion, cromatografia hidrofóbica e cromatografia de peneira molecular (o purificador de proteínas usado neste exemplo foi o AKTA pure 25 M da GE, EUA; e os reagentes usados neste exemplo foram adquiridos da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd e tinham pureza em grau analítico).

[068] Em uma primeira etapa, foi realizada a cromatografia de afinidade. Captação de amostra, concentração e remoção de poluentes parciais foram realizadas usando o VIII Select Affinity Chromatography Media da GE. Primeiro, a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 25 mM de CaCl2 e 0,05% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h. O caldo de fermentação clarificado foi carregado a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h com uma carga não superior a 50000 UI/mL. Após o carregamento, a coluna cromatografia foi equilibrada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2 e 0,05% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h e componentes não vinculados foram lavados. A coluna de cromatografia foi lavada com 3-5 volumes de coluna de um tampão de descontaminação 1 contendo 10 mM de HEPES, 1 M de NaCl, 25 mM de CaCl2 e 0,05% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h para remover poluentes parciais. A coluna cromatografia foi equilibrada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 25 mM de CaCl2 e 0,05% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h. Em seguida, o produto-alvo foi eluído a uma taxa de fluxo linear não superior a 50 cm/h usando um tampão de eluição contendo 20 mM de His-HCl, 25 mM de CaCl2, 0,02% de Tween-80 e 45% de propilenoglicol e com um pH de 6,8-7,2 e os picos alvo coletados.

[069] Em uma segunda etapa, foi realizada cromatografia de troca de ânion. A purificação intermediária foi conduzida usando Q-HP de Bestchrom ou outros meios de cromatografia de troca de ânion disponíveis comercialmente (tais como Q HP de GE, Toyopearl GigaCap Q-650 de TOSOH, DEAE Beads 6FF de Smart-Lifesciences, Generik MC-Q de Sepax Technologies, Inc, Fractogel EMD TMAE de Merck e Q Ceramic HyperD F de Pall) para separar variantes estruturais e remover ainda mais poluentes, tais como HCP e DNA. Primeiro, a coluna de cromatografia foi lavada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 20 mM de His-HCl,100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 7,0-7,5 a uma taxa de fluxo linear de 50- 100 cm/h. As proteínas-alvo separadas através de cromatografia de afinidade na primeira etapa foram diluídas 5-10 vezes para reduzir a concentração de orgânicos. Em seguida, as amostras foram carregadas com a carga sendo controlada dentro de 5000- 10000 UI/mL. Após o carregamento, a coluna de cromatografia foi lavada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 20 mM de His-HCl, 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 7,0-7,5 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h. Em seguida, a coluna de cromatografia foi lavada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de lavagem contendo 20 mM de His-HCl, 500 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 7,0-7,5 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h para remover proteínas de impureza parcial. A coluna de cromatografia foi então eluída com concentrações de gradiente de sal usando um tampão de eluição contendo 20 mM de His-HCl, 1 M de NaCl, 10 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 7,0-7,5, onde a condição era tampão de eluição de 50% e 60%, 3-5 volumes de coluna (CVs) e uma taxa de fluxo linear não superior a 50 cm/h. As frações eluídas foram coletadas. As amostras foram enviadas para detectar o teor de proteína, SEC-HPLC, atividade e teor de HCP separadamente. Uma concentração de proteína e atividade de proteína foram determinadas.

[070] Em uma terceira etapa, foi realizada a cromatografia hidrofóbica. A purificação intermediária foi conduzida usando Butyl HP de Bestchrom ou outros meios de cromatografia hidrofóbica disponíveis comercialmente (tais como Butyl HP de GE, Toyopearl Butyl-650 de TOSOH, Butyl Beads 4FF de Smart-Lifesciences, Generik MC30- HIC Butyl de Sepax Technologies, Inc, e Fractogel EMD Propyl de Merck) para reduzir o teor de polímeros. O eluato obtido após a cromatografia de troca de ânion na segunda etapa ainda continha uma certa proporção de polímeros. Devido a várias razões para a formação dos polímeros, tais como polimerização com estruturas inalteradas e polimerização com estruturas alteradas, a atividade biológica dos polímeros varia muito e, portanto, causa grande interferência na análise da atividade biológica. Quando as proteínas alvo são polimerizadas, os polímeros e monômeros diferem em propriedades, incluindo características de carga e hidrofobicidade. Polímeros e monômeros foram separados usando diferenças na hidrofobicidade. Uma vez que a etapa final de purificação seria a cromatografia de peneira molecular, a purificação foi realizada usando Butyl HP para remover polímeros parciais para um teor inferior a 10%. Primeiro, a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 20 mM de His-HCl, 1,5 M de NaCl, 5 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h. A condutividade das proteínas-alvo separadas por cromatografia de troca de ânion na segunda etapa foi ajustada usando um tampão contendo 2 M de (NH4)2SO4. Em seguida, as amostras foram carregadas com uma carga controlada abaixo de 20000 UI/mL. Após o carregamento, a coluna de cromatografia foi lavada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 20 mM de His-HCl, 1,5 M de NaCl, 5 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h. Em seguida, a coluna de cromatografia foi lavada com 3-5 volumes de coluna (CVs) de um tampão de lavagem contendo 20 mM de His-HCl, 1,5 M de NaCl, 5 mM de CaCl2 e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 50-100 cm/h para remover polímeros parciais. Finalmente, as proteínas-alvo foram eluídas respectivamente com 3-5 volumes de coluna (CVs) de 20%, 40% e 100% de um tampão de eluição contendo 20 mM de His-HCl, 5 mM de CaCl2, 0,02% de Tween-80 e 50% de etilenoglicol e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear não superior a 60 cm/h. As frações eluídas foram coletadas e enviadas para detectar SEC-HPLC separadamente. Os componentes-alvo, com a porcentagem de monômeros sendo superior a 90% foram combinados por cromatografia na etapa seguinte.

[071] Em uma quarta etapa, foi realizada cromatografia de peneira molecular. A separação foi conduzida usando o superdex 200 de GE ou outros meios de peneiras moleculares disponíveis comercialmente (tais como Chromdex 200 prep grade de Bestchrom) para reduzir o teor de polímeros para ser inferior a 5% e reduzir ainda mais o teor de poluentes-chave. A coluna de cromatografia foi lavada com 2 volumes de coluna (CVs) de um tampão de equilíbrio contendo 10 mM de His-HCl, 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 10 mM de sacarose e 0,02% de Tween-80 e com um pH de 6,8-7,2 a uma taxa de fluxo linear de 20-40 cm/h. A carga não foi superior a 3% do volume da coluna e as amostras foram lavadas a uma taxa de fluxo linear de 20 cm/h. Os componentes de eluição foram coletados sequencialmente e combinados para detecção de SEC.

[072] O resultado de pureza SEC-HPLC e o resultado da eletroforese SDS-PAGE das amostras são mostrados em FIG. 1 e FIG. 2, respectivamente. O resultado da SEC-HPLC mostra que a pureza dos picos principais das proteínas de fusão purificadas foi superior a 98,0%. O padrão eletroforético SDS-PAGE foi o esperado. A eletroforese não redutora inclui bandas de uma proteína de fusão não processada (cerca de 390 kDa), um fragmento de dímero (LC-L-CTP-Fc)2 (cerca de 210 kDa) formado após o derramamento de dois fragmentos de cadeia pesada após clivagem em outro local comum de clivagem E720, um fragmento de cadeia simples LC-L-CTP-Fc (cerca de 100 kDa) e um fragmento HC (cerca de 90 kDa). Após a redução, foram obtidas bandas claras de cadeia simples HC-LC-L-CTP-Fc (cerca de 190 kDa), LC-L-CTP-Fc (cerca de 105 kDa) e HC (cerca de 90 kDa). A atividade específica dos componentes de proteína obtidos foi de 6000-8000 UI/mg.

Exemplo 5. Determinação indireta da atividade da proteína de fusão in vitro por um método de substrato cromogênico

[073] A atividade da proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante pode ser determinada pelo método de substrato cromogênico. Neste exemplo, a atividade foi determinada usando o kit Biophen FVIII: C (HYPHEN BioMed, Ref. 221402) com base no seguinte princípio: quando ativado por trombina, FVIII: C se liga ao FIXa na presença de fosfolipídios e íons de cálcio para formar um complexo de enzimas que, por sua vez, pode ativar o fator X para se transformar em sua forma ativa Xa. O fator ativo Xa pode causar a clivagem de seu substrato cromogênico específico (SXa-11) para liberar pNA do grupo cromogênico. A atividade de FXa diretamente proporcional à quantidade de pNA pode ser obtida determinando a quantidade de pNA produzida a 405 nm. Neste sistema, os teores do fator IXa e do fator X são certos e excessivos, e a atividade do FXa só está diretamente relacionada ao teor do FVIIIa. A atividade específica da proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante determinada por este método foi de cerca de 6000- 8000 UI/mg.

Exemplo 6. Estudos sobre a estabilidade da proteína de fusão purificada

[074] Para verificar ainda mais a estabilidade da proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante à temperatura ambiente de 25°C, a proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante foi armazenada à temperatura ambiente de 25°C por vários dias para investigar o efeito sobre a atividade da proteína de fusão.

[075] Uma câmara de teste de estabilidade de medicamentos (adquirida da Shanghai Yiheng Scientific Instrument instruments Co., Ltd.) foi usada para definir uma temperatura de teste de 25°C e uma umidade de 75%. Oito cópias do SS-F8 e do medicamento de referência de fator VIII de cadeia dupla DS-F8 (uma proteína de fusão que retém o local de clivagem de protease entre Arg1648 e Glu1649 de FVIII de tipo selvagem humano e tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 11) que foram diluídos na mesma concentração, 200 μL para cada cópia, foram armazenados na câmara de teste de estabilidade de medicamentos. Uma cópia do SS- F8 e uma cópia do DS-F8 foram retiradas e a atividade das proteínas de fusão foi avaliada de acordo com o método no Exemplo 5 e registrada como valores de atividade no primeiro dia (d1). Em seguida, a atividade da proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante foi avaliada separadamente em d3, d5, d7 e d14 após as proteínas de fusão serem colocadas à temperatura ambiente (temperatura: 25°C, umidade: 75%). Os resultados mostram que a atividade de proteína de SS-F8 diminuiu apenas em cerca de 10% e a atividade de proteína de DS-F8 diminuiu em mais de 25% após 5 dias em temperatura ambiente; a atividade do DS-F8 diminuiu a uma taxa significativamente maior que a do SS-F8 após 7 dias à temperatura ambiente; e a atividade de proteína de SS-F8 ainda permanecia 80% após 7 dias. Pode ser visto que a proteína de fusão SS-F8 tem estabilidade significativamente melhor que o DS-F8.

Exemplo 7. Estudo farmacodinâmico da proteína de fusão

[076] A coagulação do sangue é, de fato, reações enzimáticas de uma série de fatores de coagulação. Todo o processo de coagulação é dividido em três estágios: o primeiro estágio é a formação de tromboplastina sanguínea; o segundo estágio é a formação de trombina; e o terceiro estágio é a formação de fibrina, onde FVIII e FIX são fatores de coagulação endógena e FVII é um fator de coagulação exógeno. O tempo de sangramento é o tempo desde o sangramento natural até a hemostasia natural após os capilares da pele serem perfurados. O efeito pró-coagulante da proteína de fusão foi detectado pela observação do efeito da proteína de fusão FVIII de cadeia simples mutante no tempo de sangramento das artérias safenas em ratos SD.

[077] Os ratos SD de sete semanas de idade (adquiridos de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd) foram selecionados e divididos aleatoriamente em dois grupos. O grupo de administração foi administrado por via intravenosa com SS-F8 em uma única dosagem de 200 UI/rato e o grupo de controle foi administrado com o mesmo volume de solução salina normal. Três horas após a administração, os ratos foram induzidos a serem anestesiados. Após a posição cirúrgica ser desinfetada, a pele foi cortada cerca de 1 cm acima do maléolo medial através da articulação do joelho até a artéria na raiz da perna; os tecidos subcutâneos foram separados da membrana protetora supra- vascular; e vasos venosos, vasos arteriais e nervos foram expostos em sequência. A artéria safena e seus ramos foram encontrados na posição da articulação do joelho. As posições dos músculos dentro de 5 mm*1 mm perto dos vasos venosos foram dissecadas com fórceps retos microscópicos e as veias, artérias e nervos foram levantados do lado medial. A veia safena e a artéria safena foram cortadas com uma micro-tesoura e os nervos não foram tocados ou lesados. O tempo de sangramento inicial foi o momento em que o sangue jorrou e foi registrado como t1. O local de sangramento foi observado a cada 30 segundos até que nenhum sangramento foi visto. O tempo foi registrado como tempo de hemostasia t2. O tempo de sangramento foi registrado através de um cálculo de t2-t1. Uma análise estatística foi realizada em dados experimentais que foram expressos como média ± um desvio padrão (SD). Se os dados seguirem a distribuição normal, o software SPSS 18.0 foi usado para análise de variância unilateral ou teste de student. No caso de distribuição não normal, um teste não paramétrico, tal como o teste de Kruskal-Wallis ou o teste Mann-Whitney foi usado, onde P ≤ 0,05 denota uma diferença significativa e P ≤ 0,01 denota uma diferença muito significativa.

[078] Os resultados experimentais são mostrados na FIG. 3. Após a administração da profilaxia, o tempo de sangramento do grupo de SS-F8 foi significativamente diferente do grupo de solução salina normal nas estatísticas após o sangramento da artéria safena causada por uma cirurgia em ratos SD. Na dosagem de 200 UI/rato, a administração profilática do SS-F8 tem um efeito hemostático significativo no modelo de sangramento.

Exemplo 8. Determinação direta da atividade biológica da proteína de fusão por um método de coagulação

[079] O efeito anticoagulante in vitro do SS-F8 no plasma de rato SD foi observado pela determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT).

[080] Os ratos SD de sete semanas de idade (adquiridos de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd) foram selecionados e divididos aleatoriamente em 12 grupos. Após induzidos à anestesia, os ratos foram cortados ao longo da linha mediana do abdômen com um bisturi sob anestesia contínua e 10-12 mL de sangue foram retirados da aorta abdominal. As amostras de sangue acima foram centrifugadas a 20°C e 1500 rpm por 30 minutos, e o plasma sobrenadante foi separado e adicionado a tubos de centrífuga de 1,5 mL rotulados separadamente. Todo o plasma e os medicamentos de teste SS-F8 e DS-F8 foram preparados a uma proporção de volume de 6:1 em amostras de teste com concentrações de 25-1000 UI/mL, respectivamente. Em um grupo de controle, um diluente foi adicionado em uma proporção de volume de 6:1. Os valores APTT das amostras acima foram testados com um coagulador totalmente automatizado (CS- 2000i, Sysmex). A taxa de mudança APTT foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: a taxa de mudança APTT = (o valor APTT do grupo de administração – o valor APTT do grupo de controle)/o valor APTT do grupo de controle. Os dados experimentais foram expressos como média ± um desvio padrão (SD). Se os dados seguirem a distribuição normal, o software SPSS 18.0 foi usado para análise de variância unilateral ou teste de student. No caso de distribuição não normal, um teste não paramétrico, tal como o teste de Kruskal-Wallis ou o teste de Mann-Whitney foi usado, onde P ≤ 0,05 denota uma diferença significativa e P ≤ 0,01 denota uma diferença muito significativa.

[081] Pode ser visto a partir da FIG. 4 que os medicamentos de teste SS-F8 e DS-F8 tiveram efeito anticoagulante no plasma de ratos normais; o APTT dos medicamentos de teste DS-F8 e SS-F8 em uma alta concentração de 1000 UI/mL diminuiu em 33,65% e 31,86%, respectivamente, em comparação com o grupo de controle do veículo; os valores EC50 de DS-F8 e SS-F8 foram de 139,4 UI/mL e 115,6 UI/mL, respectivamente; e o valor EC50 do SS-F8 foi inferior ao do DS-F8, o que sugere uma dosagem menor. Com o aumento da concentração dos medicamentos de teste, o APTT foi significativamente reduzido e houve uma relação dose-efeito.

Exemplo 9. Efeito hemostático da proteína de fusão em hemorragia aguda em camundongos com hemofilia A

[082] O efeito hemostático agudo do SS-F8 em camundongos com hemofilia A foi avaliado através de um modelo de sangramento de corte de cauda de hemofilia A (HA) homozigótica de nocaute de gene de fator VIII. Camundongos HA machos com idade de 6-7 semanas (de Shanghai Model Organisms Center, Inc.) foram selecionados, alimentados adaptativamente por uma semana e divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo de controle de veículo vazio de camundongo HA e um grupo de administração SS-F8. Os camundongos C57BL/6 machos (adquiridos de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd) foram selecionados como um grupo de controle normal. Os camundongos foram anestesiados através de injeção intraperitoneal de 1% de pentobarbital de sódio (Merck & Co.) na dosagem de 7,5 mL/kg. O grupo de controle normal de camundongo C57BL/6 e o grupo de controle de veículo vazio de camundongo HA foram administrados por via intravenosa nas veias da cauda com um veículo na dosagem de 10 mL/kg e o grupo de administração foi administrado por via intravenosa nas veias da cauda com SS-F8 na dosagem de 112 UI/kg. As caudas dos camundongos foram cortadas a 15 mm das extremidades das caudas usando uma lâmina de bisturi, 15 minutos após a administração. As feridas foram rapidamente imersas em 13 mL de solução salina normal pré-aquecida a 37°C. A cronometragem foi iniciada e o sangue foi coletado. O tempo de sangramento total e o volume de sangramento dentro de 30 minutos após as caudas serem cortadas foram registrados. Volume de sangramento (mL) = (o peso de um tubo de centrífuga após a coleta de sangue (g) – o peso do tubo de centrífuga antes da coleta de sangue (g))/1,0. Os grupos experimentais foram comparados através de testes T e software de análise foi Graphpad Prism 8.0, onde p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os resultados detalhados são mostrados na Tabela 2.

[083] A partir da análise dos resultados estatísticos do volume de sangramento e da soma do tempo de sangramento de cada grupo de animais nas FIGS. 5 e 6, as medianas do volume de sangramento do grupo de controle de veículo vazio de camundongo HA e do grupo de controle normal de camundongo C57BL/6 foram 790,00 μL e 141,15 μL, com uma diferença extremamente significativa (P< 0,0001) e as medianas do tempo de sangramento foram 1800 s e 497 s, com uma diferença extremamente significativa (P< 0,0001), o que indica que os camundongos HA têm uma característica de sangramento óbvia em comparação com os camundongos normais no modelo de corte de cauda. Após a administração do SS-F8 na dosagem de 112 UI/kg, as medianas do volume de sangramento do grupo de administração e do grupo de controle de veículo vazio de camundongo HA foram de 438,9 μL e 790,00 μL (p < 0,0001) e as medianas do tempo de sangramento do grupo de administração e do grupo de controle de veículo vazio de camundongo HA foram de 739 s e 1800 s (p< 0,0001), o que indica um efeito coagulante significativo e indica que o SS-F8 pode ser usado como um coagulante efetivo para a hemorragia aguda na hemofilia A, ou seja, deficiência do fator VIII de coagulação.

Tabela 2 Dados estatísticos do volume de sangramento e tempo de sangramento de cada grupo Camundongo Camundongo HA Grupo de Grupo C57BL/6 Grupo de Grupo de Controle de Administração de Controle Normal Veículo Vazio SS-F8 Volume de 141,15 790,00 438,90 sangramento (μL) Tempo de 497 1800 739 sangramento(s)

[084] Embora os exemplos preferidos da presente divulgação sejam ilustrados e descritos, deve-se entender que técnicos no assunto podem fazer várias alterações de acordo com os ensinamentos aqui e essas alterações não violam o escopo da presente divulgação.

[085] Todas as publicações mencionadas na presente divulgação são incorporadas aqui por referência, como se cada publicação fosse incorporada aqui separadamente por referência. Além disso, deve-se entender que técnicos no assunto, que leram o conteúdo anterior da presente divulgação, podem fazer várias alterações ou modificações na presente divulgação e essas formas equivalentes estão dentro do escopo das reivindicações anexadas.

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1) Uma proteína de fusão de fator VIII de coagulação humana, caracterizada pelo fato de que compreende sequencialmente do N-terminal ao C-terminal um fator VIII de coagulação humana de cadeia simples mutante com um domínio B parcialmente excluído, um ligante de peptídeo flexível, pelo menos, uma unidade rígida de peptídeo terminal carboxil de β-subunidade gonadotropina coriônica humana e uma meação de prolongamento de meia-vida; em que o fator VIII de coagulação humana de cadeia simples tem uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2 e a meação de prolongamento de meia-vida é selecionada a partir de um fragmento Fc de imunoglobulina, albumina, transferrina ou PEG, preferencialmente uma variante IgG Fc humana.
2. 2) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é glicosilada, preferencialmente, glicosilada por ser expressa em células de mamíferos, tal como células de ovário de hamster chinês.
3. 3) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fator VIII de coagulação humana de cadeia simples mutante com um domínio B parcialmente excluído compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2, ou o fator VIII de coagulação humana de cadeia simples tem uma sequência de aminoácidos que compartilha, pelo menos, 90% de identidade com a sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2.
4. 4) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante de peptídeo flexível contém dois ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos G, S, A e T; preferencialmente, o ligante de peptídeo flexível tem uma fórmula geral de sequência de aminoácidos formada pela combinação de unidade cíclica (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d, em que a, b, c e d são números inteiros maiores ou iguais a 0 e a+b+c+d ≥ 1; mais preferencialmente, o ligante de peptídeo flexível é preferencialmente selecionado a partir do seguinte grupo: (i) GSGGGSGGGGSGGGGS;

   (ii) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; (iii) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; (iv) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; (v) GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS.
5. 5) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a unidade rígida de peptídeo terminal carboxil de β-subunidade gonadotropina coriônica humana compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 3 ou uma sequência truncada da mesma, em que a sequência truncada compreende, pelo menos, dois locais de glicosilação; preferencialmente, a unidade rígida de peptídeo terminal carboxil de β-subunidade gonadotropina coriônica humana compreende a seguinte sequência de aminoácidos: (i) PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ; (ii) SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ; (iii) SSSSKAPPPS; (iv) SRLPGPSDTPILPQ.
6. 6) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a unidade rígida de peptídeo terminal carboxil de β-subunidade gonadotropina coriônica humana compartilha, pelo menos, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos de uma unidade rígida de peptídeo terminal carboxil na proteína de fusão de acordo com a reivindicação 5.
7. 7) A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 unidades rígidas de peptídeo terminal carboxil de β-subunidade gonadotropina coriônica humana.
8. 8) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante Fc IgG humana tem um efeito ADCC reduzido e/ou efeito CDC e/ou afinidade de ligação melhorada com um receptor FcRn; preferencialmente, a variante Fc é selecionada a partir de: (i) região dobradiça de IgG1 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Leu234Val, Leu235Ala e Pro331Ser;

   (ii) região dobradiça de IgG2 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutação Pro331Ser; (iii) região dobradiça de IgG2 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Thr250Gln e Met428Leu; (iv) região dobradiça de IgG2 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Pro331Ser, Thr250Gln e Met428Leu; (v) região dobradiça de IgG4 humana, região CH2 e região CH3 contendo mutações Ser228Pro e Leu235Ala.
9. 9) A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO:

   9.
10. 10) A proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem atividade superior a 6000 UI/mg.
11. 11) DNA para codificar a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que, preferencialmente, o DNA tem uma sequência como mostrado na SEQ ID NO: 10.
12. 12) Um vetor caracterizado pelo fato de que compreende o DNA de acordo com a reivindicação 11.
13. 13) Uma célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende ou foi transfectada com o vetor, de acordo com a reivindicação 12.
14. 14) Uma composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um portador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável e uma dose efetiva da proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
15. 15) Um método para preparar a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir a sequência de DNA para codificar uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 11 em uma célula CHO para produzir uma linha celular derivada de CHO;

    (b) rastrear na etapa (a) uma cepa de células de alto rendimento que expressa mais que 1 UI/106 (milhões) células a cada 24 horas em um meio de crescimento das mesmas; (c) cultivar a cepa de células rastreada na etapa (b) para expressar a proteína de fusão; (d) colher um caldo de fermentação obtido na etapa (c) e separar e purificar a proteína de fusão.
16. 16) O método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que um processo de purificação da proteína de fusão na etapa (d) compreende cromatografia de afinidade, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de troca de ânions e cromatografia de permeação molecular.
17. 17) Uso da proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que prepara um medicamento para prevenção ou tratamento de uma doença hemorrágica, tal como uma doença hemorrágica em um paciente com deficiência de FVIII congênita ou adquirida, ou sangramento espontâneo ou cirúrgico em um paciente com hemofilia A.