CN102311495A - 新型重组人凝血因子ⅷ及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型重组人凝血因子VIII及其生产方法。更具体地说，本发明涉及人源凝血因子VIII基因的改建，通过分子生物学技术，构建含弱化的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，简称为“IRES”)序列及双重筛选标记的新型表达载体，本载体可用来高效重组表达人凝血因子VIII，使其在哺乳动物细胞表达体系中的表达量增加。

Description

新型重组人凝血因子Ⅷ及其生产方法

技术领域

本发明涉及本发明涉及新的重组凝血因子VIII(简称为“FVIII”，又称为抗血友病因子(AHF))及其生产方法。

背景技术

甲型血友病是一种常见的X性连锁遗传性出血性疾病，在男性中的发病率为1∶10,000，在所有血友病中占85％。其致病因素是由于凝血因子VIII(FactorVIII-related Antigen，简称为“FVIII”)的数量不足或质量异常所致。凝血因子VIII是一血浆高分子糖蛋白，由2332个氨基酸残基组成，凝血因子VIII在内源性凝血体系中起了十分重要的作用，它是激活凝血因子IX的辅助因子。FVIII基因定位于Xq28，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。

目前对该病的主要治疗方法是从人血浆中提取的浓缩FVIII制剂。但经常输入血液制品，患者极易感染病毒性肝炎及爱滋病等传染性疾病，治疗费用亦十分昂贵，在发达国家，一个病人每年的治疗费用通常在美金10,000元以上。同时，由于FVIII极不稳定，且在血浆中的含量甚微，1升血浆仅含150微克FVIII，而且从冰冻血浆中提取FVIII的效率不高，因此目前提供的FVIII浓制剂仅可用于治疗，而极少作为常规预防用药。另外，有些患者容易对FVIII浓制剂产生急性过敏反应，且有15％患者会产生FVIII抗体，更加增加了治疗难度。

自1984年FVIII cDNA克隆以来，已分别在CHO，3T3等体系中成功地获得有生物活性的rFVIII，FDA已经批准应用于临床。初步的临床试验表明：重组FVIII具有与血液来源的FVIII相同的生化、免疫及药理学特性，能有效纠正血友病患者的出血倾向，临床得到了满意的结果。

FVIII在体外的表达量明显低于与其性质类似的基因，如FVIII的表达水平只有FIX的1％，这说明细胞内存在对FVIII表达的负调控机制，使FVIII在细胞内的水平保持在一较低的状态。这可能是机体对FVIII需求的反映，但对通过体外重组表达FVIII来讲是一主要障碍。除此之外，目前国际上对血友病的基因治疗的尝试中也发现维持FVIII的表达量在治疗水平有较大的难度，其原因也是人工构建的FVIII表达体系中FVIII表达量不能满足治疗所需.这对大规模工业生产质优、价廉的FVIII造成了很大的困难。

发明内容

本发明的目的是通过基因的改建，从而构建新型的重组FVIII表达质粒，建立表达体系，并进行稳定表达株的全面筛选，有效地提高在哺乳动物细胞中的FVIII的表达量，

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高重组人凝血因子VIII表达量的方法，包括如下步骤：

将内部核糖体进入位点序列IRES进行弱化处理；

弱化后的所述序列一端连接目的基因，另一端连接筛选标记基因，构建含有双重筛选标记的表达载体，其中，所述目的基因和筛选标记基因共用一个启动子。

优选的，所述筛选标记基因是二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表达载体是pIRES-DHFR。进一步的，通过氨甲喋呤或MSX加压扩增筛选标记基因两翼的基因。

进一步的，还包括构建不同的凝血因子VIII表达系统，包括B domain缺失但包含新颖的Linker序列的VIII因子[凝血因子VIII(ΔB)]，和凝血因子VIII重、轻链共表达的VIII因子[凝血因子VIII(HL)].

将以上不同基因结构的FVIII cDNA(FVIII全长cDNA，FVIII(ΔB)cDNA，，FVIII-HL)克隆于表达载体pIRES-dhfr中，转染CHO、BHK细胞，48小时收集培养液，离心后测定FVIII的生物活性和抗原量。

本发明通过一系列的基因结构改建以及含弱化的内部核糖体进入位点序列的含有双重筛选标记的表达载体来表达重组FVIII，极大地简化筛选过程，提高筛选效率，获得高表达稳定株，，FVIII的表达量有所提高，特别是将FVIII重、轻链共表达后，表达量有明显的增加，BHK细胞表达体系活性最高，达到1.27U/ml/day/10⁶cells。

附图说明

图1是本发明中具有双重筛选标记的表达载体pIRES-DHFR/GS示意图。

图2是不同的FVIII表达质粒的构建示意图。

图3是不同的FVIII表达质粒分别克隆进入pIRES-DHFR/GS的示意图。

图4是FVIII-HC/FVIII-LC双表达质粒示意图。

具体实施方式

实施例1凝血因子VIII基因序列的获得

(1)DNA及RNA的制备

高分子量DNA是从一正常人的外周血的细胞中按常规方法进行抽提。总RNA从新鲜胚胎组织中提取，用异硫氰酸胍-氯化铯梯度法进行，并用寡聚脱氧腺苷酸(Oligo-dT)纤维素柱分离mRNA。

(2)寡聚核苷酸引物的设计和聚合酶链反应

设计并合成七对引物，为了便于整个分子的克隆，每对引物所扩增出的片段两侧均含有相应的限制性内切酶位点。对引物采用逆转录聚合酶链反应(RT/PCR)进行扩增，其中各对引物的第二个引物作为逆转录反应的引物。逆转录反应体系：在40ul体积中进行。包括mRNA 1.5ug，逆转录引物100ng及MMLV逆转录酶(BRL)200U。

PCR反应体系：在100ul体积中进行，包括逆转录酶反应产物10ul(第7对引物进行PCR扩增所用的模板为基因组DNA，2ug)，寡核苷酸引物各100pmol，dNTPs各为200mmol；Tris-HCl pH 8.410mmol；MgCl 21.5mmol；BSA 20ug/ml；KCl 50mmol。

扩增条件：变性：94℃45秒；退火：55℃45秒；延伸：72℃1分种，反应30个周期第一周期变性条件为94℃4分钟，最后一个周期延伸时间增至10分钟。

FVIII基因的14号外显子是目前所克隆的人类最大的外显子之一，长为3.1kb。为克隆这部分DNA，用一RT/PCR产物(长800bp，含有外显子14的部分序列)作为探针。筛选基因组文库，得到一含外显子14序列阳性克隆。从中分离得到两个cDNA片段，分别为2.5kb的EcoR I-BamH I片段及420bp的BamHI-Pst I片段。序列分析后分别将这两个片段亚克隆至pBluscript SK+质粒中，按FVIII cDNA顺序将片段进行FVIII cDNA组装。

(3)全长FVIII cDNA的克隆

利用pGEM-3Z及pBluscript SK+的的多个限制性内切酶位点，将PCR产物片段及2个来自基因组文库克隆的外显子14的片段，按照FVIII cDNA顺序进行组装。拼接后，得到了FVIII全部编码序列的cDNA分子，长7828bp，包括5′端非翻译区82bp，FVIII编码序列7053bp及3′端非翻译区693bp。在该分子的5′及3′端分别附加有Sal I和Not I人工接头，这两个限制性酶切位点在整个分子中并不存在，因此可用于克隆到表达载体中。(图2B)

实施例2凝血因子VIII B结构域缺失cDNA(FVIII(ΔB))的构建

设计寡核苷酸引物四条，应用PCR(聚合酶链式反应)对FVIII大部分B结构域进行缺失突变。得到PCR产物A，B分别对应于FVIII的1868-2334bp和4974-5164bp。产物A，B经过变性、再退火后，有16bp的核酸序列可以杂交，这种杂交产物可作为模板，扩增得到产物C(658bp)，对应于FVIII基因的1868-2334bp和4974-5164bp。用BamHI和PstI限制性酶切PCR产物C和FVIII金长cDNA，用PCR产物C替代FVIII全长cDNA的相应片段，这样就产生了B结构域缺失的FVIII cDNA(参见图2)，命名为FVIII(ΔB)。这种FVIII(ΔB)相比全长FVIII cDNA而言，缺少了FVIII cDNA中2334-4974bp的碱基序列。(图2A)

实施例3FVIII cDNA表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

将以上FVIII cDNA(FVIII全长cDNA，FVIII(ΔB)cDNA，，FVIII-HL)克隆于表达载体pIRES-dhfr中。图2是不同的FVIII表达质粒的构建示意图，图3是不同的FVIII表达质粒分别克隆进入pIRES-DHFR/GS的示意图，图4是FVIII-HC/FVIII-LC双表达质粒示意图，如图2、图3、图4所示，构建不同的FVIII表达质粒，包括B domain缺失和FVIII重、轻链共表达质粒，克隆FVIII全长cDNA(FVIII-W)，在此基础上，构建完成多种分子改建体，包括B结构域缺失的FVIII(FVIII-ΔB)，FVIII的重链部分(FVIII-HC)和FVIII的轻链部分(FVIII-LC)，并将其分别克隆进入pIRES-DHFR/GS的A多克隆位点，将克隆进入pIRES-DHFR/GS的FVIII-HC和FVIII-LC，分别酶切克隆到pBudCE4.1质粒中，构建双表达质粒。转染CHO、BHK细胞，48小时收集培养液，离心后测定FVIII的生物活性和抗原量。

从下表中可以看到，通过一系列的基因结构改建，FVIII的表达量有所提高，特别是将FVIII重、轻链共表达后，表达量有很明显的增加，BHK细胞表达体系活性最高，达到1.27U/ml/day/106cells。

表：不同基因结构、细胞表达系对凝血因子VIII表达的影响

实施例4FVIII生物活性测定和抗原含量

(1)生物活性的测定

FVIII生物活性测定采用一步法。主要原理是利用FVIII缺陷的甲型血友病患者的血浆，加入待测定样品后，测定凝血现象出现的时间，再与不同比例稀释的正常人血浆加入后凝血现象出现的时间进行比较，计算其活力单位(1ml正常人血浆所含FVIII量定为1单位，1U)。

(2)竞争性ELISA测定FVIII抗原含量

在酶标板上包被一定量的FVIII抗原(50ng/孔)，将已知浓度的FVIII标准样品作一定的稀释倍数(0-150ng)，和单抗一起加入酶标板中，由于游离的FVIII标准品和被固定的FVIII和FVIII的单抗竞争结合，洗板后去除和游离FVIII结合的单抗，依次加入酶标二抗和底物，读数，所测得的光吸收反映的是固定于酶标板的FVIII所结合单抗的量。将游离FVIII的量和光吸收作一标准曲线，待测样品恰当稀释后也与单抗一起加入酶标板，反应后所得吸收值和标准曲线对比，换算得出所含FVIII抗原量。

实施例5：重组FVIII产物的纯化

FVIII-HL共表达的细胞培养上清中纯化重组FVIII。培养上清经高速离心，取上清上样于阴离子交换层析(DEAE-52)，层析柱经过平衡缓冲液洗脱(pH7.0，50mM的磷酸缓冲液)后，进行盐梯度洗脱，梯度为经10个柱体积，洗脱液由A液转变成B液(A液为平衡缓冲液，B液为含1M NaCl的平衡缓冲液)。根据FVIII的活性测定和抗原测定，收集含重组FVIII的吸收峰。将收集到的重组FVIII经凝胶过滤层析柱(Sephacryl S-200)进一步分离纯化，得到rFVIII及rFVIII-HL。

Claims (7)

1.一种凝血因子VIII重链；一种凝血因子VIII轻链；一种B结构域缺失的FVIII(FVIII-ΔB)。

2.一种提高基因重组人凝血因子VIII表达量的方法，其特征是：包括如下步骤：将内部核糖体进入位点序列IRES进行弱化处理；弱化后的所述序列一端连接目的基因，另一端连接筛选标记基因，构建含有双重筛选标记的表达载体，其中，所述目的基因和筛选标记基因共用一个启动子。

3.如权利要求2所述的一种提高基因重组凝血因子VIII表达量的方法，其特征是：所述筛选标记基因是二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因，所述表达载体是pIRES-DHFR或pIRES-GS。还包括通过氨甲喋呤或MSX加压扩增筛选标记基因两翼的基因。

4.一种表达载体，其特征是：它含有权利要求1所述的DNA，权利3的载体所构建含所述表达载体的凝血因子VIII表达系统，包括B domain缺失的含Linker序列的VIII因子[凝血因子VIII(ΔB)]、凝血因子VIII重、轻链共表达的VIII因子[凝血因子VIII(HL)]。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体。

6.如权利要求5所示的宿主细胞，其特征在于，它是幼仓鼠肾细胞。

7.一种产生凝血因子VIII的方法，其特征在于，

(1)在适合表达所述凝血因子VIII重链和轻链的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出所述的凝血因子VIII的重链和轻链，形成重组的凝血因子VIII；和(2)分离所述的凝血因子VIII。

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