CN104830822B

CN104830822B - 一种重组人血管舒缓素

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Publication number: CN104830822B
Application number: CN201510161743.1A
Authority: CN
Inventors: 张玉杰; 黄虎; 李强
Original assignee: GUANGZHOU YOULIANKANG PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangzhou best Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-04-03
Also published as: CN104830822A

Abstract

本发明涉及一种高分子量重组人血管舒缓素、制备方法及应用。更具体地，本发明涉及利用哺乳动物细胞培养生产方法和特定的纯化工艺首次获得高分子量重组人血管舒缓素。本发明的高分子量重组人血管舒缓素经SDS‑PAGE电泳测定分子量为43－49KDa糖蛋白，含3个N‑Link糖基化结合位点，分别位于Asn78、Asn84及Asn141，比现有的人尿来源血管舒缓素具有更复杂和更完整的糖基化水平，且具有明显降低了的脱酰胺化水平。本发明获得的高分子量重组人血管舒缓素能显著延长体内半衰期和减少副作用。本发明还涉及高分子量重组人血管舒缓素在治疗脑梗塞的应用研究。

Description

一种重组人血管舒缓素

技术领域

本发明涉及一种重组人血管舒缓素、其制备方法及应用。更具体地，本发明涉及利用分子生物学和宿主细胞生产方法制备重组蛋白，并通过特定纯化工艺首次获得高分子量重组人血管舒缓素。本发明获得的高分子量重组人血管舒缓素能显著延长体内半衰期和减少副作用，本发明还涉及重组人血管舒缓素在治疗脑梗塞的应用研究。

背景技术

人血管舒缓素(Kininogenase)是一种含有238个氨基酸的糖蛋白，它能使激肽原降解成激肽，激肽与靶器官上特定受体结合能产生一系列生物效应，如扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用。

目前世界上仅有中国批准上市了人尿来源的血管舒缓素产品，众所周知，从人尿中提取的产品具有潜在的病毒污染及生产质量不可控等缺陷，在欧美日等发达国家普遍不接受人尿来源产品上市。日本企业最早从人尿中分离提取血管舒缓素并用于人的临床研究，但人尿血管舒缓素药物副作用大，特别是血压下降明显，因此日本最终没能批准人尿血管舒缓素上市。

相比而言，重组蛋白在其纯度、抗原性、安全性、无自身尿源性病毒感染等方面具有尿源产品无法比拟的优点，展示出广阔的医用前景，但迄今国内外尚未有重组人血管舒缓素药物上市。

用基因重组技术来获得重组人血管舒缓素成为更好的选择，而要制备具有体内活性的重组糖蛋白，现有的原核细胞(如大肠杆菌)和酵母细胞表达系统均无法实现，只有在哺乳动物宿主细胞中表达重组蛋白才能实现较完整的糖基化，事实上，蛋白的糖基化程度与蛋白体内活性和半衰期等功能密切相关，重组蛋白糖基化水平又取决于细胞培养条件和纯化工艺。

另一方面，现有的尿来源人血管舒缓素及重组人血管舒缓素由于其均采用的特殊纯化工艺步骤(60℃恒温加热10小时)易导致其蛋白脱酰胺化程度较高，蛋白在体内易进一步水解、异构化，从而影响蛋白整体的稳定性及产生副反应，进一步放大了其半衰期短和副作用大等缺点；基于须去除潜在的病毒污染风险等考虑，已上市的尿来源人血管舒缓素及重组人血管舒缓素均采用了60℃恒温加热10小时的加热灭活病毒的方法，此工艺方法导致蛋白脱酰胺反应会相当剧烈，而我们的实验也印证了这一点，市售尿来源的人血管舒缓素脱酰胺水平接近50％。由传统方法生产的尿来源人血管舒缓素或重组人血管舒缓素导致N糖链的天冬酰胺位点脱酰胺化，影响蛋白纯度及稳定性，对于人血管舒缓素这种带有复杂糖链的蛋白具有潜在的风险，因此，现有的尿来源人血管舒缓素或重组人血管舒缓素存在半衰期短和副作用大等缺点。基于高温(60℃恒温加热10小时)加热灭方法的缺陷，现代主流技术对含多个糖链蛋白纯化采用深层膜过滤等温和方法去除病毒。前期已发表的诸多文献已证实多个糖链蛋白脱酰胺化与温度和PH具有密切关系，在重组人血管内皮抑制素和抗体等生物工程领域前期研究都证明了温度越高，脱酰胺作用越明显，目前上市的抗体药物已经将脱酰胺水平作为一个重要的质控标准，因为其对产品潜在的安全性、副作用等方面具有重要意义。

有报道重组人血管舒缓素与人尿血管舒缓素分子量相近，迄今国内外尚未有高分子量重组人血管舒缓素的研究报导。

发明内容

本发明旨在提供一种高分子量重组人血管舒缓素、制备方法及其应用，该重组人血管舒缓素脱酰胺水平不到10％，显著减少了副作用并延长了半衰期。优选，本发明提供一种SDS-PAGE电泳测定分子量为43-49KD的高分子量重组人血管舒缓素、制备方法及其在治疗脑梗塞中的应用。本发明的高分子量重组人血管舒缓素能显著延长体内半衰期和减少降血压等副作用。

本发明的一个目的是提供一种高分子量重组人血管舒缓素。该重组人血管舒缓素是由238个氨基酸残基组成一条单链(见序列1)，N—末端和C—末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，通过SDS-PAGE电泳测定，其分子量为43－49KDa。该重组人血管舒缓素是一种糖蛋白，含3个N-Link糖基化结合位点，分别位于Asn78、Asn84及Asn141，该重组人血管舒缓素分子中含有5对S－S键，分别为Cys7－Cys150，Cys26－Cys42，Cys129－Cys196，Cysl61－Cys175以及Cys186－Cys211，等电点约为4.0。

本发明的另一个目的是提供一种高分子量重组人血管舒缓素的制备方法。该制备方法包括：

1.构建编码重组人血管舒缓素的基因表达载体：

采用人工合成方法获得编码人血管舒缓素的前导肽和成熟蛋白基因(序列No.1)，插入到哺乳动物细胞表达载体(如pCMV/ZEO)或改进的表达载体(如pCMV-DHFR)，获得含有人血管舒缓素目的基因表达载体pCMV-人血管舒缓素-DHFR。

2.重组人血管舒缓素在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：

将含有人血管舒缓素蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

3.高密度细胞培养生产重组人血管舒缓素：

将上述筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到1×10⁷个/mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加。

4.高分子量重组人血管舒缓素的纯化：

(1)上层析柱前预处理：将上述含有重组人血管舒缓素的培养液进行离心去除细胞碎片，收集细胞上清液调节pH并离心去除沉淀。

(2)阴离子交换柱层析：用同一根阴离子层析柱，使用不同NaCl浓度的Tris-HCl缓冲液，0.2-0.4M NaCl穿柱，0.05-0.15M NaCl挂柱，先后使重组人血管舒缓素蛋白穿柱和挂柱，所述的阴离子交换柱包括：Q Sepharose H.P，Q Sepharose F.F，Q Sepharose 4 F.F，QSepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50，STREAMLINE Q XL。优选，QAESephadex A-25，QAE Sephadex A-50。

(3)亲和层析柱分步洗脱：采用亲和层析柱(Benzamidine Sepharose 4 FastFlow，GE)纯化，通过不同盐浓度的洗脱条件，在0.3-0.8M NaCl pH7.5低盐浓度下，得到含有高分子量重组蛋白的洗脱液，优选低盐浓度为0.5M NaCl pH7.5；在1.0-2.0M NaClpH7.5高盐浓度下，去除低分子量重组蛋白，优选1.5M NaCl pH7.5高盐浓度,该方法可有效分离高分子量和低分子量重组人血管舒缓素。

(4)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，处理上述(3)中得到的高分子量重组人血管舒缓素，利用高低分子量的差别，采用GE-AKTA系统梯度洗脱的方法，进一步去除低分子量重组人血管舒缓素及其他杂质。

所述的疏水柱包括Butyl Sepharose 4 Fast Flow，Octyl Sepharose 4 FastFlow，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow，ButylSepharose 4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，PhenylSepharose 6 Fast Flow。

(5)低PH灭火病毒：将上述含有高分子量重组蛋白溶液调节PH至3.8,4℃恒温静置1小时，实现病毒的灭活。

(6)阴离子交换柱层析：调节上述含有高分子量重组蛋白溶液的pH，使之带负电荷，使目标蛋白结合到阴离子交换柱，实现高分子量重组蛋白的浓缩。

所述的阴离子交换柱包括Q Sepharose H.P，Q Sepharose F.F，Q Sepharose 4F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50，STREAMLINE Q XL。优选，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50。

(7)分子筛凝胶柱纯化：通过凝胶柱纯化，使得高分子量重组人血管舒缓素蛋白得到充分分离。

(8)将上述凝胶柱所得溶液通过深层过滤膜，去除病毒残留。

最后将分离得到的高纯度高分子量重组人血管舒缓素蛋白用0.22μm微孔滤膜除菌过滤。所述的凝胶柱包括Sephadx G75，Sephadx G100，Superdex30 prep grade，Superdex75 prep grade，Superdex200 prep grade，Superose 6 prep grade，Superose12 prep grade，Sephacryl S-100HR，Sephacryl S-200HR，Sephacryl S-400HR，Sepharose2B，Sepharose 4B，Sepharose 6B。优选，Sephadex G75。

本发明方法中步骤1中，构建编码重组人血管舒缓素的基因表达载体的步骤包括：采用人工合成方法获得编码人血管舒缓素的前导肽和成熟蛋白基因(序列No.1)，插入到哺乳动物细胞表达载体(如pCMV/ZEO)或改进的表达载体(如pCMV-DHFR)，获得含有人血管舒缓素目的基因表达载体pCMV-人血管舒缓素-DHFR(图2)。

所述的哺乳动物细胞表达载体可采用市售的但不限于，如：pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。优选，pCMV-DHFR(图2)。

本发明方法中步骤2中，重组人血管舒缓素在哺乳动物宿主细胞中稳定表达的步骤包括:将含有人血管舒缓素蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

所述的细胞转染方法包括电穿孔转染方法(electroporation)、磷酸钙转染、脂质体转染和原生质融合，优选，电穿孔转染方法。

所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293、BHK、NS0和Sp2/0细胞，优选，CHO细胞；更优选，已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞(DHFR-CHO)。

本发明方法中步骤3中，高密度细胞培养生产重组人血管舒缓素的步骤包括：将上述筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，特别是，通过对细胞培养条件的优化，获得高表达重组人血管舒缓素的细胞培养液。本发明的细胞培养方法可实现高密度细胞培养、质量和产量提升以及重组蛋白的糖基化复杂程度提高。

所述细胞培养条件的优化包括降温培养法，具体来说，当细胞密度达到1×10⁷个/mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加。该方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。

所述细胞培养条件的优化方法还包括在培养基中加入特殊的添加剂，优选，在基础培养基T300加入100μM Cu²⁺，喂饲培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。该方法可使重组人血管舒缓素的糖基化程度增加，糖基化分支及侧链等复杂程度明显增加。

所述细胞培养条件的优化方法还包括独有的动态溶氧算法，在培养的不同阶段根据细胞的不同状态补充溶氧，优选，在细胞培养初期保持40％以上的溶氧率，在细胞培养中期保持60％-70％溶氧率，在整个生产过程中保持溶氧率线性增加曲线，有利于增加蛋白进入高尔基体的速率，从而可使重组人血管舒缓素的糖基化程度明显增加。

本发明方法中步骤4中，本发明高分子量重组人血管舒缓素的纯化制备步骤为：本发明采用特定的层析法纯化制备得到高分子量重组人血管舒缓素，该层析方法克服了现有尿来源人血管舒缓素或重组人血管舒缓素由于其均采用的特殊纯化工艺步骤(60℃恒温加热10小时)易导致其蛋白脱酰胺化程度较高的缺陷，所得到的高分子量重组人血管舒缓素稳定性更好，副作用明显降低。具体包括以下八个步骤：

(2)阴离子交换柱层析：用同一根阴离子层析柱，使用不同NaCl浓度的Tris-HCl缓冲液，0.2-0.4M NaCl穿柱，0.05-0.15M NaCl挂柱，先后使重组人血管舒缓素蛋白穿柱和挂柱。

所述的阴离子交换柱包括：Q Sepharose H.P，Q Sepharose F.F，Q Sepharose 4F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50，STREAMLINE Q XL。优选，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50。

(3)亲和层析柱分步洗脱：采用亲和层析柱(Benzamidine Sepharose 4 FastFlow，GE)纯化，通过不同盐浓度的洗脱条件，在0.3-0.8M NaCl pH7.5低盐浓度下，得到含有高分子量重组人血管舒缓素蛋白的洗脱液，优选低盐浓度为0.5M NaCl pH7.5；在1.0-2.0M NaCl pH7.5高盐浓度下，去除低分子量重组蛋白，优选1.5M NaCl pH7.5高盐浓度。该方法可有效分离高分子量和低分子量重组人血管舒缓素。

(4)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，根据高低分子量重组人血管舒缓素的疏水性不同，进一步去除上述(3)得到的高分子量重组人血管舒缓素中的低分子量重组人血管舒缓素及其他杂质。

所述的疏水柱包括Butyl Sepharose 4 Fast Flow，Octyl Sepharose 4 FastFlow，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow，ButylSepharose 4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，PhenylSepharose 6Fast Flow。

(8)将上述凝胶柱所得溶液通过深层过滤膜，去除病毒残留。

最后将分离得到的高纯度高分子量重组人血管舒缓素蛋白用0.22μm微孔滤膜除菌过滤。

所述的凝胶柱包括Sephadx G75，Sephadx G100，Superdex30 prep grade，Superdex75 prep grade，Superdex200 prep grade，Superose 6 prep grade，Superose12 prep grade，Sephacryl S-100HR，Sephacryl S-200HR，Sephacryl S-400HR，Sepharose2B，Sepharose 4B，Sepharose 6B。优选，Sephadex G75。

用本发明方法制备的高分子量重组人血管舒缓素具有下列特征：

(1)通过SDS-PAGE电泳方法测定，本发明高分子量重组人血管舒缓素分子量43.0－49.0KDa，大于人尿血管舒缓素分子量为39.0－43.0KDa。

(2)本发明高分子量重组人血管舒缓素含有高分子量蛋白比例99％以上，常规制备的人尿人血管舒缓素和重组人血管舒缓素中高分子量蛋白比例仅为40％。

(3)本发明高分子量重组人血管舒缓素含有的3个N-linked糖基化位点其糖型复杂程度大大高于人尿血管舒缓素(参考表2糖基化结构组成比较结果)。

(4)本发明通过改进纯化工艺使得高分子量重组人血管舒缓素第Asn84位点的脱酰胺化水平控制在约为5％-15％，优选为8.7％，远低于人尿血管舒缓素的脱酰胺化水平(48.6％)。

本发明的再一个目的是上述高分子量重组人血管舒缓素在治疗脑梗塞中的应用。

本发明由于采用了特定的大规模培养条件和纯化方法，从而使得到的高分子量重组人血管舒缓素的糖基化和脱酰胺化程度与现有的人尿血管舒缓素有所不同，在临床应用上副作用明显减小，尤其是对体内血压下降较为缓和。

本发明高分子量重组人血管舒缓素及其制备方法的优势在于：

本发明的重组人血管舒缓素分子量为43.0－49.0KDa，高分子蛋白比例远大于人尿血管舒缓素；含有3个N-linked糖基化位点，其糖型复杂程度远高于人尿血管舒缓素；第Asn84位点的脱酰胺化水平约为5％-15％，优选为8.7％，远低于人尿血管舒缓素(48.6％)。本发明的高分子量重组人血管舒缓素结合了以上多种优势，能够显著延长体内半衰期和减少副作用。

1)宿主细胞系是已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞(DHFR-CHO)。这种驯化适应中悬浮CHO细胞不仅能避免以前常规方法表达目标基因细胞从有血清到无血清驯化适应耗时和产量降低，而且可使其在无血清培养基中生长高密度并直线放大生产。

2)细胞生产工程中添加一些物质和优化的溶氧方案能使重组人血管舒缓素的糖基化水平增加。这种降温培养的方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。

3)高分子量蛋白纯化：相对常规分离方法的四个步骤，本发明另外增加了3个步骤并优化亲和柱及独有的疏水柱纯化条件，成功分离得到高纯度的高分子量重组人血管舒缓素。

4)纯化关键工艺控制蛋白脱酰胺化水平：相对于已发表的尿来源人血管舒缓素或普通重组人血管舒缓素其均采用的特殊纯化工艺易导致其蛋白脱酰胺化程度较高，影响蛋白整体的稳定性和均一性，进一步放大了其半衰期短和副作用大等缺点，本发明在整个纯化工艺未采用加热等剧烈条件，并始终控制PH等关键参数在常温下完成整个流程，最终蛋白脱酰胺水平得到有效控制。

附图说明

附图强调了本发明的原则，不一定成比例。

图1显示了在表达载体pCMV-人血管舒缓素-DHFR中人血管舒缓素(人血管舒缓素)的核苷酸序列(同SEQ ID：1)及推导的氨基酸序列(同SEQ ID：2):含信号肽(1-18)和成熟蛋白(19-256)。

图2显示了所构建表达重组蛋白人血管舒缓素的pCMV-人血管舒缓素-DHFR真核表达质粒的基因图谱。该表达质粒全长5820bp，含有10个主要基因片断，包括1.CMV启动子；2.目标基因人血管舒缓素；3.IRES元件；4.博来霉素抗性基因(zeocin)；5.BGH终止子；6.SV40启动子；7.mDHFR筛选基因；8.SV40终止子；9.氨苄霉素抗性基因(ampicillin)；10.pUC复制子；

图3显示了人血管舒缓素成熟蛋白氨基酸序列

图4显示了重组人血管舒缓素在7L生物反应器中的生长和表达情况

图5显示了分子量标准品(M)、人尿血管舒缓素(u人血管舒缓素)和本发明高分子量重组血管舒缓素(重组人血管舒缓素)的SDS-PAGE蛋白电泳图谱。人尿血管舒缓素(Lane2)和本发明高分子量重组血管舒缓素(Lane 3)分子量分别约为39-43KDa和43-49KDa

图6显示了人血管舒缓素在大鼠体内单次静脉注射药时曲线(n＝5)

具体实施方式

实施例1构建编码人血管舒缓素重组蛋白的基因表达载体

采用人工合成方法获得编码人血管舒缓素的前导肽和成熟蛋白基因，全长771bp(序列1和图1)，将此DNA片段插入载体如pUC57中的限制性酶切位点KpnI间，获得了质粒pUC-人血管舒缓素。通过DNA测序来验证合成片段的准确性。

采用人工合成方法获得含酶切位点EcoRI(5’末端)和HindIII(3’末端)的小鼠DHFR基因及启动子和终止子片段，将其插入到哺乳动物细胞表达载体pCMV/ZEO(Invitrogen)相应的酶切位点中，获得载体pCMV-DHFR，其所含DHFR及启动子和终止子序列可由DNA测序验证。

将获得的完整的编码人血管舒缓素重组蛋白的基因序列经NheI和BamHI酶切后，插入到哺乳动物细胞表达载体的相应酶切位点间。如图2所示，最终获得的基因表达质粒pCMV-人血管舒缓素-DHFR。该质粒含有能够保证人血管舒缓素能够稳定高效表达的巨细胞病毒启动子CMV。同时，在该质粒中还含有两种类型的选择性标记物，其中Zeocin(博来霉素)抗性基因是用来筛选转化成功的哺乳动物细胞，而氨苄抗性基因用于载体在细菌中的克隆筛选。此外，该载体中含有的DHFR基因可以便于技术人员在进行筛选稳定高表达的哺乳细胞克隆时，利用MTX(氨甲喋呤)来共扩增目标蛋白基因人血管舒缓素和DHFR 基因，从而实现目标基因人血管舒缓素的高表达。

实施例2.重组人血管舒缓素在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达

为了表达人血管舒缓素重组蛋白，将构建好的编码人血管舒缓素重组蛋白的基因表达载体pBudCE4.1-DHFR-人血管舒缓素转染入哺乳动物宿主细胞系。优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(DHFR--CHO)，而为了宿主细胞更适合表达分泌型蛋白，并且细胞可以达到更高密度，我们将DHFR--CHO细胞进行改进，改进方法包括转染蛋白酶和改变细胞代谢途径。细胞转染方法优选电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂质体转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为250V电场和960μFd电容的Gene PulserElectroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的2～5×107个细胞中加入10μg用PvuI线性化的质粒DNA。

转染两天后，将培养基改成含25μg/mL Zeocin的生长培养基进行种板，培养10天后，用抗人血管舒缓素的ELISA分析方法对96孔板里的每个孔进行表达重组人血管舒缓素的定量，筛选出表达量较高克隆。为了实现重组人血管舒缓素蛋白高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。用极限稀释法种96孔板，在含有递增浓度MTX的生长培养基中，随着DHFR基因的扩增，转染的人血管舒缓素基因也扩增。本方法最终产生的亚克隆能在高达10μM MTX培养基中生长。对亚克隆细胞系的分泌率作进一步分析。筛选分泌水平超过约300(较佳地约500)ng/10⁶(即百万)个细胞/24小时的细胞系，并使其在无血清培养基中悬浮生长。

实施例3.重组人血管舒缓素蛋白的细胞生产

实施例2获得的细胞株，首先适应了在摇瓶中悬浮培养。人血管舒缓素为糖基化蛋白，蛋白的糖基化水平直接关系到其活性，及成药后的副作用等，为了使构建的人血管舒缓素细胞株能表达更高质量的人血管舒缓素糖蛋白，我们进行培养基的优化，通过在小摇瓶培养的对比试验，添加一些物质能使重组人血管舒缓素的糖基化水平增加。基础培养基T300加入100μM Cu²⁺，喂饲培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)能增加糖基化水平。当细胞的摇瓶培养稳定后，为了获得更多的人血管舒缓素重组蛋白，将细胞扩增至足够量，进行7L生物反应器批次培养。生物反应器设定参数为：温度37℃，pH6.90，溶氧50％，转速100rpm。当细胞密度达到1×10⁷个/mL时，将温度降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加，这种降温培养的方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。图4显示了其表达的人血管舒缓素累积产量为10.6mg/L。

实施例4高分子量重组人血管舒缓素的制备

从上述生产的细胞培养液，经过以下八个步骤纯化，可获得纯度>99％的高分子量重组蛋白，具体包括：

1)上层析柱前预处理：收集5L含有重组人血管舒缓素的CHO细胞培养液,离心去除细胞碎片，收集离心上清；将离心上清用Millipore PELLICON20.5m²10K膜包进行超滤浓缩，调pH至4.0后置4℃放置1小时，离心去除沉淀，收集上清并调pH和电导与Q柱平衡液相同，进入下一步柱层析纯化步骤。重组人血管舒缓素培养液柱前纯化收率为90％以上。

2)Q Sepharose柱层析：用50mM Tris-HCl-0.3M NaCl pH7.5缓冲液将Q柱(QSepharose Fast Flow，GE)充分平衡，调节培养上清pH值与Q柱平衡液一致后上样，收集穿柱液。取穿柱液调节盐浓度至与低盐平衡液(50mM Tris-HCl-0.1M NaCl pH7.5)一致后再次上Q Sepharose柱，用低盐平衡液淋洗至基线后用50mM Tris-HCl 0.5M NaCl洗脱，收集重组人血管舒缓素活性洗脱峰。

3)亲和柱层析(Benzamidine Sepharose)：用Benzamidine Sepharose 4FastFlow平衡液50mM Tris-HCl-0.35M NaCl pH7.5平衡液充分平衡柱；取活性收集液上柱，用50mM Tris-HCl-0.5M NaCl pH7.5缓冲液淋洗；分别用50mM Tris-HCl-0.7M NaCl pH7.5和50mM Tris-HCl-1.5M NaCl pH7.5洗脱，分别收集含高分子量重组人血管舒缓素和低分子量重组人血管舒缓素的洗脱液。

4)疏水柱层析(Phenyl Sepharose)：用50mM Tris-HCl-0.9M硫酸铵，pH7.0充分平衡疏水柱；取亲和层析活性收集液上柱，收集含有重组蛋白的穿透液。

5)将上述收集液调节PH至3.8,4℃恒温保存1小时。

6)Q Sepharose柱浓缩：用50mM Tris-HCl－0.15M NaCl pH7.5平衡液将Q柱(QSepharose Fast Flow，GE)充分平衡，调节上述穿透液调节pH和电导后上柱，用50mM Tris-HCl-0.35M NaCl pH7.5的缓冲液洗脱，收集重组人血管舒缓素活性峰。

7)分子筛凝胶柱层析：流动相为20mM PB，pH7.0，流速1ml/min，充分平衡SephadexG75柱后上样，收集重组人血管舒缓素活性峰。

8)将所得溶液通过33平方厘米的深层过滤膜，去除病毒残留，用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，从中取样品A。

本实施例4的纯化方法可有效分离出高分子量重组蛋白，如图5所示，经SDS-PAGE电泳分析，获得纯度>99％的高分子量重组人血管舒缓素。经N端氨基酸序列测定，结果表明高分子量重组人血管舒缓素序列与序列3和图3相同。

实施例5高分子量重组人血管舒缓素结构分析

N－末端15个氨基酸残基测定：采用Edman降解法，对实施例4高分子量重组人血管舒缓素进行了N-末端15个氨基酸残基的序列测定。序列为：Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu-Cys-Glu-Gln-His-Ser-Gln-Pro-Trp-Gln与文献报导相同。

氨基酸组成分析：准确量取样品入水解管中，加入6mol/L盐酸，于110℃水解24小时，冷却定容，过滤，蒸发去掉过量的盐酸，用0.02mol/L定容，用氨基酸分析仪进行测定。

测定结果见表1，与文献报导值基本一致，高分子量重组人血管舒缓素的一级结构为含有238个氨基酸残基的单链，分别在Cys7-Cys150、Cys 26-Cys42、Cys129-Cys196、Cys161-Cys175和Cys186-Cys211有五对二硫键，在Asn78、Asn84及Asn141处存在糖基化。

表1氨基酸组成分析结果

糖基化结构比较：

通过蛋白酶酶解蛋白质得到糖基化修饰肽段、高精度LC-MS质谱检测以及质谱数据分析软件PepfinderTM进行糖肽水平的定性定量分析。

结果表明，含有3个N-Link糖基化位点：Asn78、Asn84及Asn141，在3个位点的糖基化复杂程度上均远高于人尿血管舒缓素(上市产品)，其中三个侧链和四个侧链的复杂N糖侧链人尿血管舒缓素几乎没有(表2)，而本发明高分子量重组人血管舒缓素在这方面得到深度加强，这也恰恰能印证半衰期大大延长的原因。

表2糖基化结构组成比较结果

实施例6重组人血管舒缓素脱酰胺化水平的测定

样品A：实施例4方法制备的高分子量重组人血管舒缓素

样品B:人尿血管舒缓素(上市产品)

脱酰胺化测定方法：通过蛋白酶酶解蛋白质得到糖基化修饰肽段、高精度LC-MS质谱检测以及质谱数据分析软件PepfinderTM进行糖肽水平的定性定量分析。

实验结果：

如表3所示，经LC-MS质谱测定高分子量重组人血管舒缓素及人尿血管舒缓素在84位点的脱酰胺化水平分别为8.69％和48.64％，即人尿血管舒缓素脱酰胺化水平是高分子量重组人血管舒缓素的5倍以上。

表3脱酰胺化水平分析

将等重量1mg高分子量重组人血管舒缓素及人尿血管舒缓素分别溶解于10ml生理盐水中，置于37℃恒温密闭放置(模拟人体温度及环境)，每隔一周取样检测一次小鼠体内比活，结果发现在第9周时人尿血管舒缓素体内比活已降低至68％，而高分子量重组人血管舒缓素仍维持在96％以上(如下表4)。

表4重组人血管舒缓素和人尿血管舒缓素的稳定性

类别

第0周

第1周

第2周

第3周

第4周

第5周

第6周

第7周

第8周

第9周

高分子量重组人血管舒缓素

100％

103.50％

101.20％

106.80％

99.52％

98.21％

96.57％

98.25％

95.11％

96.01％

人尿血管舒缓素

100％

105.24％

100.89％

98.85％

102.00％

97.79％

96.68％

90.85％

72.35％

68.52％

以上实验表明通过本发明改进的生产工艺，产品的脱酰胺化水平大幅度降低，这有利于增加蛋白均一性及稳定性，降低产品的潜在副作用；而市售产品由于采用了长时间加热的工艺(60℃，10小时)，其脱酰胺化水平比本发明工艺高出了5倍，蛋白在体内环境下易发生水解等反应导致生物活性损失，这不但不利于蛋白本身保持稳定，而且影响产品的均一性，产生副作用的风险大大提升。

实施例7重组人血管舒缓素体外活性及其他理化性质测定

样品A：实施例4方法制备的高分子量重组人血管舒缓素

样品B:人尿血管舒缓素(上市产品)

酶活性测定方法：通过醇脱氢酶偶联法，采用底物Ac-Phe-Arg-OEt(参考文献：Geiger,R.,and Fritz,H.(1981)Methods Enzymol.80,466-492.)测定上述样品的酶活性。结果表明，高分子量重组人血管舒缓素(样品A)比活为1580U/mg蛋白，高于人尿血管舒缓素(比活为1010U/mg蛋白)。

实施例8重组人血管舒缓素的血浆半衰期测定

取SPF级雄性SD大鼠，按随机分组原则分成2组，分别为：本发明实施例4高分子量重组人血管舒缓素(1.0PANU/Kg)、人尿血管舒缓素组(1.0PANU/Kg)，每组5只动物，通过尾静脉单次注射给药。分别于给药后2min、5min、15min、30min、45min、60min、120min、360min、720min，眼眶采血0.5ml，并用肝素钠抗凝。4℃下将血液样品以4000rpm速度离心取血浆，并采用实施例6中体外活性检测方法检测血浆中血管舒缓素含量。以时间为横轴，血管舒缓素含量为纵轴，制作药时曲线如图6。

通过PKsolver 2.0药代动力学计算软件计算两组组动物的血浆半衰期，结果均符合二室模型，其中重组人血管舒缓素的α相和β相半衰期分别为8.37±2.75min和396.34±81.03min，人尿血管舒缓素的α相和β相半衰期分别为4.69±0.68min和144.21±33.45min。结果表明，高分子量重组血管舒缓素的血浆半衰期相对人尿血管舒缓素增长将近2倍(表5)。

表5血管舒缓素在大鼠体内单次静脉注射药代参数

实施例9重组人血管舒缓素对血压的影响

取健康普通级beagle犬，体重10-13kg，雌雄均有，随机分为生理盐水对照组(NS组)、本发明实施例4高分子量重组人血管舒缓素组(15×10^-3PANU/Kg)、人尿血管舒缓素组(15×10^-3PANU/Kg)，每组6只动物。3％戊巴比妥钠(35mg/kg)静脉注射行全身麻醉，背位固定。切开气管，插入气管套管，保持呼吸通畅。一侧股动脉插管并与压力换能器相连测量血压。分离左侧颈总动脉，插管至左心室连接换能器测左室内压。标准II导程导联记录心电图。分离出右颈外静脉并穿线，以备取血。于左侧第四、五肋间切开皮肤，分离肋间肌。开动人工呼吸机(16次/min)，去除该两根肋骨，用开胸器撑开胸腔切口，暴露心脏，做心包摇篮。分离冠状动脉左前降支主干备线，放置TANSONIC激光多普勒血流仪探头动态监测冠脉流量。手术损伤完毕，待所有观测指标稳定后，记录正常指标，然后静脉滴注给药(持续滴注30min)分别记录给药前及给药后5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、120min时的：收缩压(SAP)、舒张压(DAP)、平均动脉血压(MAP)。

结果：各组不同时间点动脉压值如表6、表7和表8。结果可见，给药组均可使血压明显下降(与给药前比较或与对照组比较P均有＜0.05)，于给药约20min降压最为明显，其中人尿血管舒缓素血压降低了26％，而本发明的高分子量重组人血管舒缓素只降低16％。说明高分子量重组人血管舒缓素和人尿血管舒缓素一样，具有降低血压的药理活性，但是由于半衰期的延长，在同等剂量下，高分子量重组人血管舒缓素对血压的降低作用相对人尿血管舒缓素更缓和，给患者带来的副作用更小。

表6血管舒缓素对正常犬动脉收缩压(SAP)的影响(n＝6)

t-test:与给药前比较，*为P<0.05..

表7血管舒缓素对正常犬动脉舒张压(DAP)的影响(n＝6)

t-test:与给药前比较，*为P<0.05.

表8血管舒缓素对正常犬动脉平均压(MAP)的影响(n＝6)

t-test:与给药前比较，*为P<0.05.

实施例10高分子量重组人血管舒缓素对大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)再灌注损伤模型的影响

取SPF级雄性SD大鼠，按随机分组原则分成4组，分别为：假手术组，模型组(注射生理盐水，0.2ml/100g体重)、本发明实施例4高分子量重组人血管舒缓素组(15×10^-3PANU/Kg，0.2ml/100g体重)和人尿血管舒缓素组(15×10^-3PANU/Kg，0.2ml/100g体重)。造模前10min尾静脉每组各给药1次，除高分子量重组人血管舒缓素组外，其他各组在造模后12h再给药1次。

将大鼠用10％水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入栓线，其深度为17-20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎备线，伤口以碘伏消毒，最后缝合皮肤，缺血2h后拔出栓线一部分实行再灌注，手术完毕回笼饲养。假手术组除不插线外，其余步骤同上。其余各组大鼠按上述手术方法造模。

造模成功的标准：动物手术后有明显手术侧(即左侧)Horner症(左侧眼睑下垂，眼球凹陷)及手术对侧偏瘫体症(不能完全伸展左前肢，行走时向对侧倾倒或转圈)；TTC染色有一定的白色梗死灶。

观察指标如下：

1)行为学评分

存活24h大鼠，观察大鼠行为学变化，进行神经病学评分。

参考Zea Longa的4分制评分标准：

0分，无神经损伤症状；

1分，不能完全伸展对侧前爪；

2分，向外侧转圈；

3分，向对侧倾倒；

4分，不能自发行走，意识丧失。

2)脑梗塞范围的测定

造模后24h每组大鼠，快速取全脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冰冻25分钟。然后均匀切成6片，接着迅速将脑片置1％红四氮唑(TTC)中，避光，37℃温孵20分钟，其间每隔7-8min翻动一次，染色后以4％多聚甲醛固定。染色结果：正常组织呈红色，梗塞组织呈白色。拍照并用BI2000医学图象分析系统计算脑梗塞面积百分比。

实验结果：

1)行为学评分结果

经过脑缺血再灌注损伤的大鼠麻醉清醒后即有偏瘫样症状出现。主要表现为不同程度的手术对侧前肢内收，肩内旋，肌张力降低，推右肩向对侧移动，抵抗阻力降低，甚至有些动物还出现不停地向一侧转圈现象。将24小时存活的大鼠进行神经病学评分，与模型组相比，高分子量重组人血管舒缓素能显著改善MCAO大鼠神经行为学评分(P<0.01)；人尿血管舒缓素可改善MCAO大鼠神经行为学评分且有统计学意义(P<0.05)，(见表9)。

表9对MCAO大鼠神经行为学评分的影响(x±s，n＝12)

t-test:与假手术组比较：^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

2)对大鼠脑梗塞范围的影响

由于TTC染色适合于脑缺血24-48h内检测脑梗塞情况，本实验是脑梗塞后24h利用TTC染色技术检查脑梗塞程度。由表10可以看出，脑缺血再灌注24h后脑组织梗塞程度明显，梗塞面积占总脑面积的23.45±7.31％。高分子量重组人血管舒缓素和人尿血管舒缓素组给药后，均可使脑梗塞面积百分比下降且有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，结果表明，高分子量重组人血管舒缓素对大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血有明显治疗作用，由于半衰期是人尿血管舒缓素的一倍以上，使其在同样剂量下对MCAO模型大鼠的疗效更持久，在同样的时间内只需给药一次就能达到人尿血管舒缓素给药2次的效果。由此可推算，在高分子量重组人血管舒缓素将来的临床应用中，由于其给药次数少，患者给药方便，依存性高，具有很好的开发前景。

表10对MCAO大鼠脑梗死面积的影响(x±s，n＝12)

t-test:与假手术组比较：^△△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05 。

Claims

1.一种高分子量重组人血管舒缓素的制备方法，其步骤包括：

1)构建编码重组人血管舒缓素的基因表达载体：

采用人工合成方法获得编码人血管舒缓素的如序列No.1所示的基因，所述序列No.1所示的基因包括前导肽和人血管舒缓素成熟蛋白基因，插入到哺乳动物细胞表达载体pCMV-DHFR中，获得含有人血管舒缓素目的基因表达载体；

2)重组人血管舒缓素在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：

将含有人血管舒缓素蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株；所述的细胞转染方法为电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿主细胞为DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞CHO；

3)高密度细胞培养生产重组人血管舒缓素：

将上述筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到1×10⁷个/mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加；细胞培养包括在培养基中加入100μM Cu²⁺，喂饲培养基加入2mM N-乙酰基-D-氨基甘露糖；

4)高分子量重组人血管舒缓素的纯化:

(1)上层析柱前预处理：将上述含有重组人血管舒缓素的培养液进行离心去除细胞碎片，收集细胞上清液调节pH并离心去除沉淀；

(2)阴离子交换柱层析：用同一根阴离子层析柱，使用不同盐浓度值Tris-HCl+NaCl缓冲液，0.2-0.4M NaCl穿柱，0.05-0.15M NaCl挂柱，先后使重组人血管舒缓素蛋白穿柱和挂柱；

所述的阴离子交换柱为QAE Sephadex A-25或QAE Sephadex A-50；

(3)亲和层析柱分步洗脱：采用亲和层析柱Benzamidine Sepharose 4Fast Flow，GE纯化，通过不同盐浓度的洗脱条件，在0.5M NaCl pH7.5低盐浓度下，得到含有高分子量重组蛋白的洗脱液，在1.5M NaCl pH7.5高盐浓度下，去除低分子量重组蛋白；

(4)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，处理上述(3)中得到的高分子量重组人血管舒缓素，利用高低分子量的差别，采用GE-AKTA系统梯度洗脱的方法，进一步去除低分子量重组人血管舒缓素及其他杂质；所述的疏水柱为Phenyl Sepharose 6Fast Flow；

(5)低PH灭活病毒：将上述含有高分子量重组蛋白溶液调节PH至3.8,4℃恒温静置1小时，实现病毒的灭活；

(6)阴离子交换柱层析：调节上述含有高分子量重组蛋白溶液的pH，使之带负电荷，使目标蛋白结合到阴离子交换柱，实现高分子量重组蛋白的浓缩；

所述的阴离子交换柱选自下组中的任一种：Q Sepharose H.P，Q Sepharose F.F，QSepharose 4F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50或STREAMLINEQ XL；

(7)分子筛凝胶柱纯化：通过凝胶柱纯化，使得高分子量重组人血管舒缓素蛋白得到充分分离；

(8)将上述凝胶柱所得溶液通过深层过滤膜，去除病毒残留；

最后将分离得到的高纯度高分子量重组人血管舒缓素蛋白用0.22μm微孔滤膜除菌过滤；所述的凝胶柱为Sephadex G75；

上述方法制备得到的重组人血管舒缓素具有如下理化指标：

由238个氨基酸残基组成一条单链蛋白，其氨基酸序列为序列3，N—末端和C—末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸；SDS-PAGE电泳测定其分子量为43－49KDa；含有5对S－S键，分别为Cys7－Cys150，Cys26－Cys42，Cys129－Cys196，Cysl61－Cys175以及Cys186－Cys211；

该重组人血管舒缓素含3个N-Link糖基化结合位点，分别位于Asn78、Asn84及Asn141，分子中第Asn84位点的脱酰胺化水平为8.7％，等电点为4.0；

该重组人血管舒缓素含有高分子量蛋白比例99％以上。