CN107753953B - 聚乙二醇化激肽原酶的制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含聚乙二醇化激肽原酶的注射剂及其应用，激肽原酶中不含有组分低度糖基化的KLK1，低度糖基化的KLK1是在猪胰脏来源的KLK1的SDS‑PAGE蛋白电泳时三条带中分子量最低的条带；所述PEG的结构通式如式(1)或式(2)所示。本发明的聚乙二醇化的激肽原酶制剂处方高度保持了聚乙二醇化激肽原酶的生物学活性，对其有较好的保护性作用，有效提高了药品的稳定性。

Description

聚乙二醇化激肽原酶的制剂及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白类药物的聚乙二醇修饰，特别是含组分更明确的激肽原酶的聚乙二醇修饰物的注射剂及其应用。

背景技术

激肽原酶，又称激肽释放酶(kininogenase)或血管舒缓素(kallidinogenase)，属于丝氨酸蛋白酶的一种，存在于各种组织和生物液体中，催化大分子前体物(激肽原，Kininogen)释放生物活性肽(激肽，Kinin)。激肽原酶的生理效应包括使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加，使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加，适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有治疗作用。同时，激肽原酶也可以作为活化因子，使纤溶酶原激活成纤溶酶，将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽，从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用，并用于治疗血栓、预防血栓再形成(G.M.Yousef,E.P.Diamandis Clin Biochem,2003(36):443-452)。

国内市场上现有的激肽原酶药物分为两类：一类是从猪胰脏中提取的激肽原酶(KLK1)，它来源广泛。另一类是从新鲜人尿中提取精制的人尿激肽原酶。其中从猪胰脏提取的激肽原酶的相关产品目前市场上主要有丽珠医药、上海第一生化、沈阳济世、河南灵佑、南昌万华、济南维尔康，常州千红。但是市售猪胰激肽原酶注射液使用时注射部位常有红肿、疼痛的症状，并且，申请人也在大鼠急性缺血性脑卒中实验中发现有大鼠在用药后死亡的情况，因此，申请人推测在现有市售产品中有副作用较大的成分存在。此外，这两类均存在生物稳定性差、半衰期短，需反复重复给药，具有免疫原性的问题。

为克服此类药用蛋白和多肽普遍存在的生物稳定性差、体内半衰期短和具免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行修饰改造，提高药用蛋白和多肽的体内生物稳定性，延长半衰期，降低或消除免疫原性。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG修饰技术在生物医学和生物技术领域得到了广泛的应用，PEG已经被广泛地应用于蛋白质，多肽类药物的修饰研究。目前蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一，且已通过FDA认证可用于药物、食品和化妆品。

发明内容

解决的技术问题：本发明旨在提供一种活性更高、免疫原性更低、半衰期更长、稳定性更优的聚乙二醇化激肽原酶注射剂。

技术方案：

本发明的第一目的是提供含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂，所述激肽原酶中不含有组分KLK1c(低度糖基化的KLK1)，所述KLK1c(低度糖基化的KLK1)是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量最低的条带。

优选的，上述激肽原酶(KLK1)，其由组分KLK1b(高度糖基化的KLK1)、KLK1a(中度糖基化的KLK1)中的一种或两种组成。所述组分KLK1b(高度糖基化的KLK1)是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量最高的条带，所述KLK1a(中度糖基化的KLK1)是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量第二的条带。

最优选的，上述激肽原酶，由KLK1b(高度糖基化的KLK1)组成。

本发明的第二目的是提供一种聚乙二醇化的激肽原酶注射液，PEG通过与激肽原酶的游离氨基形成酰胺键或脲烷键共价连接。所述游离氨基包括赖氨酸残基和/或N-末端氨基。所述激肽原酶可以是从猪胰脏中提取的激肽原酶，可以是从人尿中提取的激肽原酶，也可以是通过基因工程重组表达的激肽原酶。

作为优选，所述PEG的结构通式为

其中n为0-3整数，mPEG的分子量为5KDa-20KDa。

作为优选，所述PEG的结构通式为

其中，mPEG的分子量为5000Da。

作为优选，聚乙二醇化的激肽原酶的结构通式如下所示：

其中KLK1是激肽原酶，PEG是聚乙二醇部分，y是7-13的整数，13是KLK1所有可被修饰的游离氨基总数；n是0到3的整数，x是b或a。

优选的聚乙二醇是直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯。

上述含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂为注射液，由聚乙二醇化的激肽原酶、水、缓冲盐、其他辅料组成，聚乙二醇化的激肽原酶：缓冲盐：其他辅料：水＝0.1～50g:20～100mM:25～274g:1000g。缓冲盐优选磷酸盐，其他辅料选自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、精氨酸中的一种或几种。

上述含聚乙二醇化激肽原酶的注射剂为冻干粉针，由聚乙二醇化的激肽原酶、缓冲盐、其他辅料组成，缓冲盐优选磷酸盐，聚乙二醇化的激肽原酶：缓冲盐：其他辅料＝0.1～0.3g:50mM:40-40.3g。其他辅料选自山梨醇、甘露醇、精氨酸。

作为优选，含聚乙二醇化激肽原酶的注射剂为冻干粉针，所述其他辅料为甘露醇，聚乙二醇化的激肽原酶：磷酸盐：甘露醇＝0.3g:50mM:40g。

作为优选，含聚乙二醇化激肽原酶的注射剂为冻干粉针，所述其他辅料为山梨醇和精氨酸，聚乙二醇化的激肽原酶：磷酸盐：山梨醇：精氨酸＝0.1g:50mM:40g：0.3g。

本发明的第二目的是提供所述的含聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂在制备治疗脑卒中或者糖尿病引起的肾病药物中的应用。

有益效果：本发明提供的聚乙二醇化的激肽原酶制剂，和现有市场上的猪胰脏来源激肽原酶制剂比较：一方面，纯度更高，去除了副作用最大的KLK1c(低度糖基化的KLK1)组分，生物活性及药效更高，更具稳定性。同时，激肽原酶经过PEG修饰后，稳定性进一步提高、半衰期明显延长、免疫原性显著降低。另一方面，本研究结果显示即使在水针形式下也可保持活性稳定，降低了生产成本，具有较高的临床应用价值，由此可见，本发明的聚乙二醇化的激肽原酶制剂处方高度保持了聚乙二醇化激肽原酶的生物学活性，对其有较好的保护性作用，有效提高了药品的稳定性。

附图说明

图1：单组分KLK1b的纯化色谱图

图1a是经过第一步离子交换层析的色谱图，峰1的箭头部分区域为目的产物的收集范围。图1b是经过第二步离子交换层析的色谱图，图中的单个主峰即是目的产物KLK1b。

图2：单组分KLK1a的纯化色谱图

图2a是经过第一步离子交换层析的色谱图，峰2的箭头部分区域为目的产物的收集范围。图2b是经过第二步离子交换层析的色谱图，图中的箭头部分区域即是目的产物KLK1a。

图3：单组分KLK1c的纯化色谱图

图3a是经过第一步离子交换层析的色谱图，峰3的箭头部分区域为目的产物的收集范围。图3b是经过第二步离子交换层析的色谱图，图中的箭头部分区域即是目的产物KLK1c的收集峰。

图4：单组分KLK1的蛋白电泳纯度分析

图中第1-5泳道的样品分别是：蛋白Marker，KLK1，KLK1b，KLK1a，KLK1c。

图5：单组分KLK1的Western blot鉴定

图中第1-5泳道的样品分别是：蛋白Marker，KLK1，KLK1b，KLK1a，KLK1c。从图中可以看出，KLK1的单组分和KLK1一样，都能和KLK1的抗体很好的结合。

图6：KLK1糖型分析

图6a：KLK1b的糖型分析图。图6b：KLK1a的糖型分析图

图7：KLK1质谱分析图

图7a：KLK1b质谱分析图。图7b：KLK1a质谱分析图

图8：KLK1单组分的氨基酸覆盖谱图，由上至下分别为KLK1b、KLK1a、KLK1c三个单组分的氨基酸覆盖谱图。

图9：单组分KLK1的热稳定性比较

由图可知，在65℃水浴条件下，KLK1b，KLK1a的稳定性最高，放置2小时依然保留了75％以上的活性；含有KLK1b和KLK1a的混合物的稳定性和KLK1b或KLK1a基本无差别，均高于未精纯的KLK1原蛋白及KLK1c；而KLK1c的热稳定性最差，在放置2小时后只保留了50％的活性。

图10：单组分KLK1的PEG修饰产物的纯化色谱图

图10a、10b、10c分别是KLK1b、KLK1a、KLK1c的PEG修饰产物的纯化色谱图

图11：单组分KLK1的PEG修饰混合物及纯化产物的凝胶过滤色谱分析

图11a、11b、11c分别是KLK1b、KLK1a、KLK1c的PEG修饰纯化前后的凝胶过滤色谱分析图。

图12：KLK1单组分及其PEG修饰物的内源荧光图

图13:单组分KLK1的PEG修饰产物的蛋白电泳图

图中第1-5泳道的样品分别是：蛋白Marker，KLK1，PEG-KLK1b，PEG-KLK1a和PEG-KLK1c。其中泳道2上①②③分别是KLK1b、KLK1a、KLK1c。

图14：单组分KLK1的PEG修饰产物反相色谱图

图15：单组分KLK1的PEG修饰产物的Western blot鉴定图

图中第1-5泳道的样品分别是：蛋白Marker，KLK1，PEG-KLK1b，PEG-KLK1a和PEG-KLK1c。其中泳道2上①②③分别是KLK1b、KLK1a、KLK1c。

图16：不同单组分KLK1PEG修饰前后的免疫原性比较图

图17:不同单组分KLK1PEG修饰前后的药代动力学

图17a、17b分别是静脉注射、肌肉注射后的药代动力学

图18：KLK1b及其PEG修饰物对大鼠脑梗损伤的长期药效作用比较

具体实施方式

定义：

本发明使用以下缩写：

KLK1：猪胰脏中提取的激肽原酶，含有KLK1b(高度糖基化的KLK1),KLK1a(中度糖基化的KLK1),KLK1c(低度糖基化的KLK1)的混合物。

单组分KLK1：即KLK1b(高度糖基化的KLK1)或KLK1a(中度糖基化的KLK1)或KLK1c(低度糖基化的KLK1)，根据以下实施例进一步分析确定，该三种单组分KLK1都是猪胰脏激肽原酶，具有相同的氨基酸序列，KLK1b(高度糖基化的KLK1)、KLK1a(中度糖基化的KLK1)、KLK1c(低度糖基化的KLK1)，仅为由于糖基化修饰程度由高到低所致的分子量由高到低的含有相同氨基酸序列的蛋白。

PEG，聚乙二醇；PEG修饰剂，聚乙二醇修饰剂。

聚乙二醇(PEG，HO-(CH2CH2O)_n-CH2CH2OH)是一种两端带羟基的线型聚合物，聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成，有分支型，直链型和多臂型。PEG也被称为poly(ethyleneoxide)(PEO)，poly(oxy-ethylene)(POE)，或者polyoxirane。一般情况下，分子量低于20,000的被称为PEG，分子量更大的被称为PEO。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

聚乙二醇修饰剂，则是指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是指经过活化的聚乙二醇，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰，又叫修饰性聚乙二醇，修饰性PEG。

M-SPA-5000，M-SPA-10K分子量分别为5000Da，10000Da的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯；M-SC-10K，M-SC-5000,分子量分别为10KDa和5000Da的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯；M-SCM-20KDa，分子量为20KDa的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯；M-SBA-5000，分子量为5000Da的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯，它们的结构通式为

其中n为0时，mPEG的分子量为10KDa和5000Da时所对应的PEG类型分别是M-SC-10K，M-SC-5000；n为1时，mPEG的分子量为20KDa时所对应的PEG类型分别是M-SCM-20K；n为2时，mPEG的分子量为5000Da和2000Da时所对应的PEG类型分别是M-SPA-5000，M-SPA-2000；n为3时，mPEG的分子量为5000Da时所对应的PEG类型是M-SBA-5000；

M-NPC-5000，分子量为5000Da的直链聚乙二醇硝基苯碳酸酯；结构式如下

其中，mPEG的分子量为5000Da。

本申请中所用术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰胰肽原酶各组分后得到的修饰产物；

几种聚乙二醇修饰激肽原酶酶的修饰产物可在本申请中统称为PEG-KLK1或PEG修饰KLK1的偶联物。

PEG-KLK1b:PEG修饰KLK1b(高度糖基化的KLK1)后纯化得到的产品

PEG-KLK1a:PEG修饰KLK1a(中度糖基化的KLK1)后纯化得到的产品

PEG-KLK1c:PEG修饰KLK1c(低度糖基化的KLK1)后纯化得到的产品

本发明使用的聚乙二醇修饰剂优选下面几种：酯基活化的的聚乙二醇，更具体地，聚乙二醇修饰剂为琥珀酰亚胺丙酸酯活化的聚乙二醇。

在特定的实施方式中，所述蛋白为来源于猪胰脏的组织型KLK1。但这不应当理解为对本发明范围的限制，本发明的激肽原酶可以是从猪胰脏中提取的激肽原酶，可以是从人尿中提取的激肽原酶，也可以是通过基因工程重组表达的激肽原酶，任何来源的激肽原酶在适用本发明PEG修饰剂及修饰方法时都能获得纯度较高、活性较好的修饰产物，且稳定性进一步提高、半衰期明显延长、免疫原性显著降低。

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。

实施例1猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a以及KLK1c分离纯化

制备例1

用A液将猪胰激肽原酶(来自常州千红生化制药股份有限公司)稀释成6mg/mL，用离子交换色谱层析进行纯化。纯化的色谱法条件：离子交换介质(QFF)，A液：50mM的Tris-HCl(pH9.0)，B液：含1M NaCl的50mM的Tris-HCl(pH9.0)；流速10mL/min，检测波长为280nm。

上样：上述猪胰激肽原酶稀释液，结合至QFF离子交换柱。

平衡：A液冲洗5个柱体积。

洗脱：流动相配比为12％B，88％A，洗脱10个柱体积后，进行梯度洗脱。梯度条件为12％B～30％B,30个柱体积。

收集：收集峰1前部分洗脱产物作为KLK1b，如图1a所示；收集峰2后部分洗脱产物作为KLK1a，如图2a所示，收集峰3后部分洗脱产物作为KLK1c，如图3a所示。

用A液将第一次分离纯化收集到的3种洗脱产物分别稀释2倍后，用离子交换色谱层析分别进行第二次纯化。纯化的色谱法条件：离子交换介质(HP-Q)，A液：50mM的Tris-HCl(pH9.0)，B液：含1M NaCl的50mM的Tris-HCl(pH9.0)，流速10mL/min，检测波长为280nm。

上样：上述收集产物稀释液，结合至HP-Q离子交换柱。

平衡：A液冲洗5个柱体积。

洗脱：流动相配比为12％B，88％A，洗脱10个柱体积后，进行梯度洗脱。梯度条件为12％B～20％B，洗脱体积为20个柱体积。

收集：收集洗脱峰，KLK1b、KLK1a、KLK1c的洗脱峰，分别如图1b、2b、3b所示。

制备例2、3为在制备例1调整部分参数后的试验，如表1所示为调整的第一次分离纯化时的部分参数；如表2所示为调整的第二次分离纯化时的部分参数。

表1调整第一次分离纯化的部分参数

表2调整第二次分离纯化的部分参数

后续纯度检测试验显示制备例1-3均能够较好地分离出KLK1b、KLK1a,KLK1c组分，纯度可达95％以上。

实施例2猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a以及KLK1c分离产物纯度检测

SDS-PAGE法检测

(1)电泳：制备12％的聚丙烯酰胺凝胶后，上样运行。80V运行30min，待溴酚蓝指示剂跑出浓缩胶后改为150V运行30min。

(2)考马斯亮蓝染色：电泳结束后，将胶剥开置于考马斯亮蓝染液中，染色30min。

(3)脱色：染色结束后，将胶置于脱色液中，过夜脱色。

分析结果如图4所示。收率方面，KLK1b的收率可达到85％以上，KLK1a的收率可达到60％，而KLK1c的收率较低，但是分离纯化后KLK1各组分纯度均可达到95％。因此本实施例中的纯化方法，在用于纯化KLK1b时，有较高的收率，产品的纯度较高。

实施例3猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a以及KLK1c的Western Blot检测

(1)电泳：制备12％的聚丙烯酰胺凝胶后，上样运行。80V运行30min，待溴酚蓝指示剂跑出浓缩胶后改为150V运行30min。

(2)转膜(半干式电转印)：电泳结束后，取出凝胶。按照以下顺序放置滤纸，凝胶和PVDF膜到半干槽中：滤纸→PVDF膜→胶→滤纸。转膜电流为膜面积的0.8～2倍，本实验室的6x9cm的膜所用电流一般为100mA，1h。

(3)膜的封闭：加入封闭液(5％脱脂奶粉+TBST)，室温，摇床摇1h。用TBST洗三次，每次5min。

(4)一抗孵育：按照1:500比例用一抗稀释液稀释一抗，室温摇床上缓慢摇动孵育1h。TBST洗膜3次，每次5min。

(5)二抗孵育：按照1:5000比例用2.5％脱脂奶粉稀释羊抗鼠的IgG，常温摇床摇1h。TBST洗膜3次，每次5min。

(6)显色：剪取适当大小的膜于保鲜膜上，将膜上的TBST溶液去尽，加显色液(0.5mL鲁米诺/强剂溶液+0.5mL稳定型过氧化物溶液，一张膜用量)，显色1min，去尽显色液，置于凝胶成像系统曝光、显色。

分析结果如图5所示。制备例1、2、3中各个条带的位置和各样品在蛋白电泳中的相同。说明纯化的单组分KLK1均可以和KLK1的抗体很好结合，说明不同的单组分KLK1具有相同的氨基酸序列，而分子量的差异是由于糖基化修饰的不同产生的。

实施例4:KLK1单组分的糖型分析、质谱分析

样品处理步骤大致如下：把KLK1b，KLK1a样品分别用超滤管进行缓冲液置换，置换至酶解缓冲液中，然后加入PNGaseF(购自New England Biolabs)进行酶切。酶切结束后用HILIC固相萃取柱去除溶液中的蛋白和盐，真空离心冻干。冻干后的样品用2-AB进行荧光标记。根据FLR图谱(图6)结果可知，KLK1b的糖型较复杂，多为三天线及四天线糖型结构。丰度最高的糖型比例为14.04％，大于5％的糖型种类仅占4种，且这四种糖总比例仅为36％，其余70％左右的几十种糖型的单个比例均在5％以下。质谱检测其分子量约为29KDa。

而KLK1a中，丰度最高的糖型比例为10.3％，大于5％的糖型种类有七种，且这七种糖总比例占约50％，其余含量的十几种糖型单个比例均在5％以下。质谱检测其分子量约为27KDa。

由糖形分析的结果可知，猪胰脏来源的KLK1不同组分的糖基化不同。

由质谱图谱分析得出KLK1b和KLK1a的分子量分别为29427Da和27046.87Da。如图7a和7b所示。但由于猪胰激肽原酶的糖型会受到动物饲养环境，饲料等的影响而产生一定的变化，因此其分子量一般会有100Da的上下浮动。

KLK1b的分子量比KLK1a大2000Da左右，主要是由于其糖基化水平显著高于KLK1a造成的，这和蛋白电泳的分析结果以及糖型分析的结果是一致的。

实施例5 KLK1单组分的氨基酸覆盖率比较

为了比较分离纯化出的3种单组分的氨基酸序列是否一致，我们进行了氨基酸覆盖率的比较。3种单组分样品用胰蛋白酶酶解后，进行一定的处理然后用LC-MS(XEVO-G2S-Q-TOF)进行肽图分析检测，最终用BiopharmLynx，UNIFI，Proteinlynx分析软件进行数据分析。最终分析的结果见图8所示，由图8可看出，3个单组分中75％左右的肽段被鉴定出，三者之间无差异，并且和猪胰激肽原酶的理论序列一致，进一步验证了三种单组分仅仅是糖基化不同，氨基酸一级序列完全一致。图8中没有覆盖的个别肽段，可能是由于胰酶切后肽段太小而不能有效检测，但N端和C端区域的肽段都已覆盖，三者无差异，和理论序列一致。

实施例6：猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a以及KLK1c的药效比较

选择240～260g健康雄性SD大鼠作为实验动物，设置假手术组、溶媒对照组、KLK1组、KLK1b组、KLK1a组以及KLK1c组，动物随机分组，每组20只。大鼠麻醉后仰卧保定，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，结扎CCA近心端与ECA，在ICA处挂线备用；栓线经由ICA插入20mm至中动脉，结扎血管，逐层缝合肌肉和皮肤，将线栓线头留于皮肤外；假手术组仅分离血管，不插入栓线。手术操作结束后，肌注一定量的抗生素。1.5h后，轻轻拔出线栓进行再灌注，同时肌注各组相应受试药物，剂量分别为KLK1b组12μg/kg、KLK1a组12μg/kg以及KLK1c组12μg/kg,模型组和假手术组给予对应溶媒。给药24h后对大鼠进行采用改良型神经损伤严重程度评分(mNSS)；在整个试验过程中，进行一般情况观察，主要内容包括：死亡、昏迷、呼吸、大小便性状、毛色、精神状况、呕吐及呕吐物、出血、惊厥、抽搐等，剔除因意外因素导致异常的动物。mNSS评分结束后用10％的水合氯醛麻醉大鼠，取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于－20℃放置30min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于2％TTC染液中温育20min，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，4％甲醛溶液固定，吸干表面残留水迹，拍照，计算梗死面积。

脑梗死面积的计算采用如下的方法进行。SD大鼠大脑用TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑，SIGMA)染色后用图像分析软件对照片进行统计，按如下公式计算脑梗死面积的百分比。

试验结果表明，在神经缺陷症状评分及脑梗死面积计算实验中，KLK1c未有明显改善神经症状缺陷和脑梗死面积，并且死亡率比模型组更高；KLK1b组和KLK1a组相对于模型组均具有显著性差异，且死亡率较低。结果如表3所示。

表3KLK1b、KLK1a、KLK1c神经缺陷症状、脑梗死面积

从实验结果可以看出，KLK1b组，KLK1a组在治疗脑梗时，能够显著缩小脑梗死面积，改善神经缺陷症状，且老鼠死亡率低，总体药效优于KLK1对照组。而KLK1c组分，没有显示出显著药效，同时，动物的死亡率较高，说明该组分副作用较大。KLK1b组分和KLK1a组分的成药性最好，和原有的KLK1比较，有望开发出药效更好，副作用更小的药物。

实施例7：KLK1单组分的热稳定性

为了比较不同KLK1单组分的稳定性，本实施例分别检测了KLK1b、KLK1a、KLK1c及原蛋白在65℃水浴放置一段时间后的活性。具体方法如下：把PBS缓冲液溶解的蛋白浓度为1mg/mL的KLK1b、KLK1a、KLK1c、KLK1b和KLK1a的混合物(以下简称KLK1b&KLK1a)及原蛋白KLK1置于65℃水浴中，分别于一定时间内取样并放入4℃冰箱备用。取样结束后采用实施例9中的方法(即2005版《中华人民共和国药典》第三部的附录ⅨF所述方法)检测其生物活性。检测结果如下图9所示。

由图9可以看出，与原蛋白KLK1相比，KLK1b，KLK1a的热稳定性均有提高，含有KLK1b&KLK1a稳定性和KLK1b或KLK1a基本无差别，而KLK1c组分的稳定性显著较弱。说明糖基化的不同对组分的热稳定性有明显的影响，去除了KLK1c组分的猪激肽原酶稳定性较高。

实施例8：KLK1b、KLK1a、和KLK1c的PEG偶联物的制备及分析

制备例1，本发明中的聚乙二醇化胰激肽原酶各组分，通过如下方法制备、纯化、鉴定：

1.1制备

第一步：缓冲液置换

把实施例1制备的KLK1b、KLK1a或KLK1c配制成蛋白浓度为5mg/mL的溶液。然后把样品通过AKTA层析系统的上样泵进行上样，样品吸入到Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrapQ HP 5mL)上。上样结束后用平衡缓冲液A液平衡色谱柱，平衡5个柱体积后用洗脱缓冲液B液进行一步洗脱，收集洗脱峰。

(A液：20mM磷酸缓冲液(pH8.0)，B液：20mM磷酸缓冲液+0.2M氯化钠(pH7.5)

第二步：修饰反应及修饰产物纯化

将第一步所收集洗脱峰的溶液按蛋白:PEG修饰剂(M-SPA-10K)为1:100的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h。其中PEG修饰反应中胰激肽原酶各组分的蛋白浓度为5mg/mL。反应结束后，用HPLC检测修饰率。

1.2纯化

修饰反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化。纯化的色谱法条件：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)，平衡缓冲液C液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，洗脱缓冲液D液：含0.1M NaCl的20mM的磷酸缓冲液(pH8.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。

上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH 9.0，结合至Q离子交换柱。

平衡：C液冲洗5个柱体积。

洗脱：流动相配比为0-50％D液，洗脱体积为10个柱体积，洗脱时间为20分钟。

纯化的谱图如图10(a，b，c)所示。

1.3鉴定

胰激肽原酶各组分的PEG修饰混合物以及纯化后的产品进行凝胶过滤检测分析：用Waters的BEH200(4.6×300mm)的分析柱进行分析，缓冲液为含0.1M硫酸钠的0.02M磷酸缓冲液(pH 6.0)，充分平衡上样后，以0.3mL/min的流速洗脱，检测波长为280nm,一个样品检测时间为15min。结果如图11(a，b，c)所示。

由图11可以看出，制备的偶联物中没有明显杂质，纯度均大于98％。经过计算，本制备例中PEG-KLK1b，PEG-KLK1a，PEGKLK1c的收率分别是80％，82％，79％。

制备例2-7具体参数与得率如下表所示，表4未列出的步骤、参数与制备例1相同(所用离子交换层析柱都购自GE公司，所用修饰剂均购自北京键凯科技有限公司)：

表4

1.4 PEG平均修饰度测定

利用荧光胺法测定PEG修饰度。配制0.3％荧光胺(0.3mg/ml丙酮)：500mL丙酮加入20g五氧化二磷，静置过夜，次日56℃精馏。丙酮必须严格除水。6mg荧光胺溶解在20mL精馏后的丙酮中，避光保存。配制PEG-KLK1b、KLK1b、PEG-KLK1a、KLK1a以及PEG-KLK1c、KLK1c溶液(0.2M PB8.0)2、4、6、8、10μg/mL各1.5mL，加入0.5mL 0.3％的荧光胺丙酮溶液，在振荡混合器上剧烈振荡混合，室温放置7分钟后，测定荧光值(激发波长为390nm、发射波长为475nm)，得到荧光值与蛋白浓度的标准曲线。PEG平均修饰度＝1-(修饰蛋白斜率/未修饰蛋白斜率)。结果如下表所示。

	KLK1b	PEG-KLK1b	KLK1a	PEG-KLK1a	KLK1c	PEG-KLK1c
							斜率	672.7	81.85	681.7	67.22	663.7	83.13
PEG平均修饰度(％)	-	88	-	90	-	87
							PEG偶联数	-	7-13	-	7-13	-	7-13

1.5内源荧光测定

采用同步荧光光度法分别测定KLK1b、PEG-KLK1b、KLK1a、PEG-KLK1a、KLK1a、PEG-KLK1a的内源性荧光，用以检测PEG修饰是否对KLK1单组分原蛋白的结构产生影响。利用F-4600荧光分光光度计，设置激发波长280nm，发射波长285-400nm，扫描速度为240nm/min，分别对KLK1单组分原蛋白及PEG修饰物的内源荧光进行侦测。结果如图12所示，KLK1单组分原蛋白经过PEG修饰后，内源性荧光并无明显变化，说明此修饰工艺未对KLK1单组分原蛋白的结构产生变化。

实施例9猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a以及KLK1c的PEG偶联物的纯度检测

1.SDS-PAGE法检测：方法同实施例2

分析结果如图13所示。KLK1b、KLK1a和KLK1c的PEG修饰产物条带单一、均匀，说明修饰均一，纯度较高。本反应合成工艺可以对猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a和KLK1c进行充分地修饰，并得到纯度较高的产品。

2.反相色谱法检测

色谱法条件：ACQUITY UPLC，BEH 300C4(1.7μm，2.1×100mm)；流动相A相为含0.1％三氟乙酸的水，B相为含0.1％三氟乙酸的乙腈；流速为1mL/min，检测波长为280nm，进样量5μL，从95％A-100％B,检测时间为20min。

分析结果如图14所示。KLK1b、KLK1a和KLK1c的PEG修饰产物出峰单一，纯度可达99％以上。

实施例10PEG修饰的猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a、KLK1c的Western Blot检测

检测方法同实施例4。分析结果如图15所示。KLK1b、KLK1a和KLK1c的PEG修饰产物条带单一，均匀，说明样品均和抗体结合。

实施例11猪胰激肽原酶KLK1b、KLK1a以及KLK1c的PEG修饰前后的活性比较

具体测定方法参照2010版药典第二部第850页所述方法进行。检测的样品分别是未分离纯化的KLK1、猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a、KLK1c以及相应的PEG修饰产物，它们的活性比较结果如表5所示。由表中可以看出，KLK1b、KLK1a和KLK1c经PEG修饰后活性并未受到明显影响，活性保留率可达90％左右。本发明可在不影响原蛋白酶活的基础上对猪胰激肽原酶单一组分KLK1b、KLK1a和KLK1c进行充分修饰，为后续的体内以及临床试验提供保障。

此外，KLK1b较KLK1原蛋白比活高400个单位；KLK1a与KLK1原蛋白比活相近；而KLK1c纯化样品较KLK1原蛋白比活低近250个单位。由此可见，虽然猪胰激肽原酶的KLK1b、KLK1a以及KLK1c的氨基酸序列完全相同，但是由于其糖基化修饰程度的不同导致体外活性出现较大的差异。

表5单组分KLK1样品的比活

实施例12：猪胰激肽原酶KLK1b、KLK1a以及KLK1c的PEG修饰前后的免疫原性比较.

KLK1系列药物肌肉注射给予ICR小鼠的免疫原性试验,将6-7周龄的健康ICR小鼠按照体重随机分组，每组12，雌雄各半。给药组(KLK1b、KLK1a、PEG-KLK1b以及PEG-KLK1a)按照100μg/只的剂量肌注给药，每周2次，连续4周；对照组肌注同等体积的溶媒。分别在给药后第5天、9天、13天、17天、20天、23天、27天、41天，行眼眶采血，制备血清，检测血清抗体水平。从图16中可以看出，KLK1b，KLK1a的抗体滴度的曲线基本相同，最高达到了50000左右，而经PEG随机修饰后，抗体滴度均降低至10000以下。因为KLK1b与KLK1a糖基化程度不同，其氨基酸序列完全一致。说明KLK1样品的糖链对其产生抗体的影响较大，糖链上含有抗原表位，但PEG修饰可以掩盖这种抗原表位，使机体免疫系统识别不出，有效降低了原蛋白的免疫原性。

实施例13猪胰激肽原酶KLK1b、KLK1a以及KLK1c的PEG修饰前后的药代动力学比较

本试验主要采用TCA沉淀蛋白的方法结合SHPLC对经同位素(¹²⁵I)标记的¹²⁵I-KLK1a、¹²⁵I-KLK1b、¹²⁵I-KLK1c、¹²⁵I-PEG-KLK1a、¹²⁵I-PEG-KLK1b和¹²⁵I-PEG-KLK1c在SD大鼠体内药代动力学特征及生物利用度进行了研究。动物共分12组，每组均6只动物，雌雄各半，6组动物静脉注射给药，6组动物肌肉注射给药，静脉和肌肉给药剂量均为15μg/kg。

根据分组前测定的动物体重，选择检疫合格、体重相近的72只动物，使用计算机系统将动物按性别区段随机分为12组。每组6只，雌雄各半。

表6药物代谢动力学给药实验方案

给药后，每隔一定时间取血，取血前大鼠采用异氟烷麻醉，各时间点大鼠眼眶静脉丛取血，约200μL。立即加入有肝素钠抗凝的EP管中，反复颠倒5～10次。

血样采集后4000rpm离心5min分离出血浆。取50μL血浆，加入等体积的20％三氯乙酸(TCA)，涡旋混匀后，γ计数器计数1分钟测定总放射性。之后4500rpm，离心5min，弃上清，γ计数器计数1min测定沉淀部分放射性。

浓度计算：

所有动物在所有药代指标的血样留取后，采用3％戊巴比妥钠麻醉动物，然后用腹主动脉放血法将动物安乐死。

使用代谢动力学数据分析软件WinNonlin对血药物浓度数据进行分析。代谢参数计算使用理论采样时间点。利用非房室模型法(NCA)对相关动力学参数进行计算，并计算生物利用度。利用Microsoft EXCEL计算均值、标准差、变异系数等。

试验结果如图17和表7所示。

表7：KLK1各组分及修饰产物在大鼠体内药代动力学参数

与未修饰的KLK1单组分相比较，经PEG随机修饰的KLK1单组分在大鼠体内的半衰期、药时曲线下面积以及体内平均滞留时间都明显增加，而体内清除率大大降低。

实施例14：猪胰激肽原酶单一组分KLK1b以及相应的PEG修饰产物的药效比较

选择240～260g健康雄性SD大鼠作为实验动物，设置假手术组、溶媒对照组、KLK1b组以及PEG-KLK1b组，动物随机分组，每组20只。大鼠麻醉后仰卧绑定，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，结扎CCA近心端与ECA，在ICA处挂线备用；栓线经由ICA插入20mm至中动脉，结扎血管，逐层缝合肌肉和皮肤，将线栓线头留于皮肤外；假手术组仅分离血管，不插入栓线。手术操作结束后，肌注一定量的抗生素。1.5h后，轻轻拔出线栓进行再灌注，同时肌注各组相应受试药物，剂量分别为KLK1b组5μg/kg、PEG-KLK1b5μg/kg,模型组和假手术组给予对应溶媒。在整个试验过程中，进行一般情况观察，主要内容包括：死亡、昏迷、呼吸、大小便性状、毛色、精神状况、呕吐及呕吐物、出血、惊厥、抽搐等，剔除因意外因素导致异常的动物。给药后第三周利用水迷宫试验评估大鼠的学习记忆功能，以此判断药物对大鼠脑梗损伤的长期药效作用。分别在第三周的第1天、第2天、第3天、第4天以及第5天测定各组大鼠在水迷宫中的平均登台时间，平均登台时间越短说明大鼠的认知功能恢复得越好。结果如图18所示，与溶媒对照组相比，大鼠经KLK1b以及PEG-KLK1b治疗后，学习和记忆功能都有显著改善，平均登台时间低于溶媒对照组大鼠；而与KLK1b治疗组相比，经过PEG-KLK1b治疗的大鼠在测试后期平均登台时间明显优于KLK1b治疗组，说明PEG-KLK1b的长期药效更优于KLK1b原蛋白。

实施例15聚乙二醇化胰激肽原酶注射液处方(处方总量1000mL)及其制备工艺

制备方法：

配制缓冲液(称取缓冲盐适量，加水1000mL，搅拌溶解，即得)适量。将聚乙二醇化胰激肽原酶脱盐至500mL缓冲液中，浓度约1mg/mL，将处方量的其他辅料溶于500mL缓冲液中，加入脱盐后的聚乙二醇化胰激肽原酶溶液，混匀，药液经0.2um微孔滤器除菌过滤，灌装。

制备例1-15按处方(表8)配比配制溶液，其他溶液配制同实施例15。

表8

实施例16聚乙二醇化胰激肽原酶注射液处方(处方总量1000mL)及其制备工艺

制备例1-11按处方(表9)配比配制溶液，其他溶液配制和制备方法同实施例15。

表9

实施例17聚乙二醇化胰激肽原酶注射液不同处方的酶活性比较

上述实施例制备的样品采用中性硼硅玻璃管制注射剂瓶和溴化丁基复四氟乙烯膜包装。取包装好的样品各20瓶，分别置于高温试验条件(温度40℃±2℃，相对湿度75％±5％，10天)、光照试验条件(光照强度4500LX±500LX，温度25℃±2℃，相对湿度60％±5％，10天)储存，测定样品酶活性。

表10高温试验前后酶活性测定结果(单位：IU/mg)

样品来源	0天	高温10天	光照10天	高温酶活性变化	光照酶活性变化
						实施例15制备例1	1466	859	986	41％	33％
实施例15制备例2	1409	1316	1338	7％	5％
						实施例15制备例3	1411	1486	1409	0％	0％
实施例15制备例4	1450	1298	1287	10％	11％
						实施例15制备例6	1463	574	756	61％	48％
实施例15制备例7	1452	968	1055	33％	27％
						实施例15制备例8	1471	1359	1384	8％	6％
实施例15制备例9	1424	1297	1269	9％	11％
						实施例15制备例10	1413	1107	1208	22％	15％
实施例15制备例11	1415	946	1013	33％	28％
						实施例15制备例12	1465	1349	1352	8％	7％
实施例15制备例13	1428	1313	1382	8％	3％
						实施例15制备例14	1437	1288	1191	10％	17％
实施例15制备例15	1410	1123	1088	20％	23％

从表10可知，实施例15的样品中，缓冲体系pH值为6.0-8.0的制备例2-4的样品在高温和光照条件酶活性变化较小；缓冲体系浓度为20mM-100mM的制备例3、8、9的样品在高温和光照条件酶活性变化较小；聚乙二醇化胰激肽原酶含量为0.1-50mg/mL的制备例12-14的样品在高温和光照条件酶活性变化较小。

实施例18注射用聚乙二醇化胰激肽原酶制备工艺

1、溶液配制：配制磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钠和磷酸氢二钠适量，加水1000mL，搅拌溶解，即得)适量，将处方量的其他辅料加入1/2处方总量的磷酸盐缓冲液中，搅拌溶解，加入处方量的聚乙二醇化胰激肽原酶溶液，加入剩余处方量的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，检测中间体。药液经0.2um微孔滤器除菌过滤，灌装，半压塞，进冻干箱。

2、冷冻干燥工艺：

预冻阶段：预冻采用板层全速降温，制品温度降至-45～-60℃，保持3小时，使样品完全冻结。

升华阶段：开启真空泵，预抽真空至0.40mbar,开始升华，对隔板以每小时升温15-20℃的速度加热，控制样品温度接近但不超过共晶点，抽真空至0.01mbar,维持至样品水迹线消失，继续维持约2-4小时。

解析干燥：对隔板以每小时升温15-20℃的速度加热，升高板层温度至20℃，当制品温度达到20±5℃以后，停止真空控制，保温干燥2-5小时，达到干燥终点，结束整个干燥过程。

制备例1-3按处方(表11)配比配制溶液，其他溶液配制和制备方法同实施例18。

表11

实施例19聚乙二醇化胰激肽原酶注射液稳定性考察结果

将实施例15制备例3和实施例18制备例2中的样品进行加速试验(温度25±2℃，相对湿度60±10％)，并制备同处方体系的胰激肽原酶样品进行稳定性考察。

表12胰激肽原酶加速试验酶活性检测结果表(IU/mg)

从数据可以看出，未修饰的胰激肽原酶和聚乙二醇化的胰激肽原酶在加速6个月后均符合质量要求。但是从酶活性的降解速率可以看出，聚乙二醇化的胰激肽原酶的降解速率明显低于未修饰的胰激肽原酶。本实验数据可以证明聚乙二醇化的胰激肽原酶在稳定性上具有优势，同时也证明了本申请中所设计的处方对聚乙二醇化胰激肽原酶稳定性有保护性作用。

实施例20.聚乙二醇化胰激肽原酶注射液不同处方的冻融实验比较

将实施例18制备例1、2、3的样品进行冻融试验(冻融试验：包括三次循环，每次循环是先于-10℃～-20℃放置2天，再在20℃放置2天，取样检测)，检测三次冻融循环后样品的酶活，结果见表13所示。

表13冻融实验酶活性检测结果(单位：IU/mg)

从表13的数据可以看出，实施例18制备例1样品的活性显著降低，而实施例18制备例2的样品经过三次冻融循环后酶活性没有发生显著变化，说明蛋白含量的增加能提高聚乙二醇化胰激肽原酶冻融样品的稳定性；而蛋白含量较低的实施例18制备例3样品经三次冻融后酶活性亦没有发生显著变化，说明辅料山梨醇和精氨酸对于聚乙二醇化胰激肽原酶样品有显著的保护作用。

Claims (10)

1.含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂，所述激肽原酶由组分KLK1b、KLK1a中的一种或两种组成；所述组分KLK1b是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量最高的条带，所述KLK1a是在猪胰脏来源的KLK1的SDS-PAGE蛋白电泳时三条带中分子量第二的条带。

2.权利要求1所述的含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂，其特征在于所述激肽原酶由KLK1b组成。

3.含有权利要求1所述的聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂，其特征在于PEG通过与激肽原酶的游离氨基形成酰胺键或脲烷键共价连接，所述游离氨基包括赖氨酸残基和/或N-末端氨基。

4.权利要求3所述的含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂，其特征在于所述PEG的结构通式为

其中n为0-3整数，mPEG的分子量为5KDa-20KDa；或者所述PEG的结构通式为

其中，mPEG的分子量为5000Da。

5.权利要求3所述的含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂，其特征在于聚乙二醇化的激肽原酶的结构通式如式(3)或(4)所示：

其中KLK1是激肽原酶，PEG是聚乙二醇部分，y是7-13的整数；n是0到3的整数，x是b或a。

6.权利要求1至5任一项所述的含有聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂为注射液，由聚乙二醇化的激肽原酶、水、缓冲盐、其他辅料组成，聚乙二醇化的激肽原酶：其他辅料：水为0.1～50g:25～274g:1000g,缓冲盐浓度为20～100mM。

7.权利要求1至5任一项所述的含聚乙二醇化激肽原酶的注射剂为冻干粉针，由聚乙二醇化的激肽原酶、缓冲盐、其他辅料组成，聚乙二醇化的激肽原酶：其他辅料为0.1～0.3g:40-40.3g,缓冲盐浓度为50mM，所述缓冲盐为磷酸盐，所述其他辅料为山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖和/或精氨酸。

8.权利要求7所述的含聚乙二醇化激肽原酶的冻干粉针，所述其他辅料为甘露醇，聚乙二醇化的激肽原酶：甘露醇为0.3g:40g，磷酸盐浓度为50mM。

9.权利要求7所述的含聚乙二醇化激肽原酶的冻干粉针，所述其他辅料为山梨醇和精氨酸，聚乙二醇化的激肽原酶：山梨醇：精氨酸为0.1g:50mM:40g：0.3g，磷酸盐浓度为50mM。

10.权利要求1至9任一项所述的含聚乙二醇化的激肽原酶的注射剂在制备治疗脑卒中或者糖尿病引起的肾病药物中的应用。

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