CN116554267A - 聚乙二醇修饰的激肽或其变体和药物应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚乙二醇修饰的激肽及其变体和药物应用。一方面，本申请通过PEG修饰技术，显著延长激肽的半衰期，同时保留其生物活性，解决了单纯激肽半衰期极短而无法成药的问题。所用PEG修饰剂包括但不限于SPA、SCM、SS修饰剂；可以是直链型或分支型PEG修饰剂。另一方面，本申请通过优化激肽的氨基酸序列，进一步提升成药性。此外本申请的激肽PEG修饰物在多种给药方式下均能产生显著的药效，尤其是皮下注射、口服给药，临床使用便利，有效提高患者的顺应性，更适用于长期治疗给药，如脑卒中患者的恢复期治疗和预防复发等。

Description

聚乙二醇修饰的激肽或其变体和药物应用
技术领域
本发明涉及聚乙二醇修饰的激肽或其变体和药物应用。尤其是通过PEG修 饰技术，优化激肽成药性。
背景技术
激肽释放酶-激肽系统(简称KKS系统，Kinin-kallikrein system)，是机体重 要的调节系统，参与多种生理和病理过程，如心血管、肾脏和神经系统的功能调 节。KKS包括激肽释放酶(KLK)、激肽原、激肽、激肽受体(B1、B2受体)及 激肽酶，其中激肽释放酶、激肽为KKS的核心成分。激肽是一类活性多肽，在 人体内含量甚微，研究较清楚的激肽有赖氨酰缓激肽(Lys-BK)、缓激肽(BK) 和血管紧张素。
赖氨酰缓激肽主要是由KLK1催化低分子激肽原LMWK水解生成，由10 个氨基酸组成，序列为KRPPGFSPFR。赖氨酰缓激肽在体内可被氨肽酶裂解为 缓激肽(9肽单元RPPGFSPFR)，两者均具有调节血压、炎症反应等多种生理功 能，具体体现为与G蛋白偶联受体B2受体结合，激活胞外信号调节激酶 (extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、环磷腺苷效应元件结合蛋白 (cAMP-response element binding protein,CREB)的磷酸化，刺激第二信使如一 氧化氮NO、环磷酸腺苷cAMP和前列环素I2等的释放，与肾素-血管紧张素系 统RAS的作用相拮抗，从而发挥生物学效应，扩张小动脉、增加局部血流，增 加血管通透性及使血管舒张等。
赖氨酰缓激肽在体内的降解主要由氨肽酶、羧肽酶和血管紧张素ACEII参 与，基于激肽释放酶和降解酶系统实现缓激肽在体内的动态平衡，外源给予赖氨 酰缓激肽、缓激肽可使血管舒张，具有治疗心脑血管疾病的应用潜力。然而赖氨 酰缓激肽和缓激肽在体内的半衰期极短，仅数秒，很快被激肽酶水解而失活，生 物半衰期短极大限制了它们的成药性。通过氨基酸替换的方式去除酶切位点使多 肽不被降解是延长体内半衰期的一种有效方式。Lobradimil通过将BK第3位 Pro、第5位Phe、第8位Phe、第9位Arg分别突变为非天然氨基酸后，延长其 体内半衰期，其主要作用是增加血脑屏障的通透性与卡铂化疗联用治疗儿童脑瘤， 药物安全性较好，但有效性未达终点(Cancer Chemother.Pharmacol.2006,58:343- 347)，临床II期后项目中止。2011年FDA批准上市的艾替班特(Icatibant)也 是基于缓激肽分子，BK第3位Pro、第5位Phe、第7位Pro、第8位Phe分别 突变为非天然氨基酸，延长其体内半衰期，适应症为遗传性血管水肿罕见病，该 药物分子是B2受体的选择性竞争抑制剂，与缓激肽作用相反。目前暂未见通过 氨基酸突变延长LBK/BK体内半衰期、发挥舒血管生物学效应并成功用于临床 治疗的报道。
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰蛋白是延长体内半衰期，提高稳定性的重要方式，目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市。但是PEG修饰多 肽类药物较少，因为多肽往往是通过与体内受体结合而发挥生物学功能，由于多 肽分子小，PEG修饰后极有可能影响多肽与受体的结合造成生物学活性的丧失。 以缓激肽为例，仅由约10个氨基酸组成，分子结构较小，聚乙二醇化赖氨酰缓 激肽或缓激肽国内外未见相关研究报道。
发明内容
本申请解决的技术问题是延长赖氨酰缓激肽或缓激肽的半衰期，解决其成药 性问题。
一方面，本申请通过PEG修饰技术，显著延长赖氨酰缓激肽或缓激肽的半 衰期，同时保留其生物活性。
本发明提供的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰是N 端修饰，而非C端修饰。PEG修饰剂包括但不限于SPA、SCM、SS修饰剂；可 以是直链型或分支型PEG修饰剂。
作为优选，所述PEG修饰剂是直链型PEG修饰剂。
作为优选，所述PEG修饰剂分子量是2KD-20KD。
作为优选，所述PEG修饰剂分子量是2KD、10KD。
另一方面，本申请通过优化赖氨酰缓激肽或缓激肽的氨基酸序列，进一步提 升成药性。
本申请提供一种赖氨酰缓激肽或缓激肽的变体或其衍生物，在赖氨酰缓激肽 或缓激肽序列中任意位置引入半胱氨酸(Cys)。引入半胱氨酸后，在体内药效评 价中体现出显著性优势。优选的，将赖氨酰缓激肽首位Lys突变为Cys，即 CRPPGFSPFR。
本申请还提供一种赖氨酰缓激肽或缓激肽的变体或其衍生物，在赖氨酰缓激 肽N端第一位及第二位氨基酸残基之间插入任意氨基酸，即KXRPPGFSPFR， X表示任意氨基酸。在缓激肽N端第一位氨基酸残基前插入任意氨基酸，即 XRPPGFSPFR，X表示任意氨基酸。实验结果表明N端延长后活性更好。优选 的，X为精氨酸(Arg)。
本申请还提供一种赖氨酰缓激肽或缓激肽的变体或其衍生物，由2个或2个 以上赖氨酰缓激肽串联而成(如m14)，或者由2个或2个以上缓激肽串联而成， 或者由赖氨酰缓激肽及缓激肽串联而成(如m12)。所述赖氨酰缓激肽或缓激肽 单体可以突变，也可以未突变。
本申请还提供一种赖氨酰缓激肽或缓激肽的变体或其衍生物，该赖氨酰缓激 肽第6位Phe或缓激肽第5位Phe被突变为其他氨基酸，例如非天然氨基酸Igl(α -2-吲哚基甘氨酸)、THI(β-2-噻吩丙氨酸)。上述位点突变后的LBK或BK不易 被体内酶识别，从而有效延长其体内半衰期。
本申请还提供含有上述赖氨酰缓激肽或缓激肽变体的组合物。
赖氨酰缓激肽或缓激肽作用于相应B2受体，发挥一系列生理学作用。已有 大量研究表明，它们在神经系统、循环系统、呼吸系统、糖尿病、癌症、肾脏疾 病等均发挥作用。目前已上市的激肽原酶KLK1获批适应症有微循环障碍性疾 病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压的辅助治疗 等；还可用于轻-中度急性缺血性脑卒中；正在开展临床实验的适应症还有IgA肾 炎，慢性肾病等，激肽原酶KLK1发挥药理功能的效应分子即为缓激肽。本申请 的赖氨酰缓激肽/缓激肽变体相比天然赖氨酰缓激肽/缓激肽仅有个别氨基酸突变 或延长，具体实施例证明变体具有更优的稳定性及体内半衰期，在MCAO脑缺 血再灌注模型中也均能产生改善脑梗死症状的体内活性。本领域技术人员可以合 理预期本申请的赖氨酰缓激肽/缓激肽变体的PEG修饰物及其组合物也可用于缺 血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎、 慢性肾病的治疗、预防、愈后恢复、防止复发中的应用。
优选地，所述赖氨酰缓激肽或缓激肽变体及其PEG偶联物通过注射、口服 给药。
本申请相比现有技术具有如下优势：
第一个方面，本申请通过聚乙二醇化技术，有效延长了赖氨酰缓激肽或缓激 肽在体内的半衰期，解决了单纯赖氨酰缓激肽或缓激肽半衰期极短而无法成药的 问题。在体内药效方面，赖氨酰缓激肽或缓激肽及其变体的PEG修饰物在MCAO 脑缺血再灌注模型中对神经缺陷症状有显著的改善作用，对脑梗死面积有显著的 改善作用。
第二个方面，本申请改造后的赖氨酰缓激肽或缓激肽变体优势明显。在保持 与B2受体亲和活性的同时，在血清体系下的稳定性显著优于野生型，预示在体 内的半衰期延长，同时体内药效作用优于野生型赖氨酰缓激肽或缓激肽的PEG 修饰物。
第三个方面，本申请的赖氨酰缓激肽或缓激肽的PEG修饰物在多种给药方 式下均能产生显著的药效，如静脉注射、皮下注射、口服给药。尤其是皮下注射、 口服给药，临床使用便利，患者不需要定期到医院进行注射给药，只要在家自行 给药即可，有效提高患者的顺应性，更适用于长期治疗给药，如脑卒中患者的恢 复期治疗等。
附图说明
图1：Lys-BK及其变体激活下游ERK1/2和CREB蛋白的磷酸化，其中5个信号 中的β-actin是内参；p-代表相应蛋白的磷酸化；control是缓冲液空白对照；Lys- BK-M06-EH是m06与血清混和孵育后的样品
图2：Lys-BK及其变体PEG偶联物与B2受体亲和性检测(报告基因法)
图3：Lys-BK及其变体PEG偶联物激活下游ERK1/2和CREB蛋白的磷酸化， 其中5个信号中的β-actin是内参；p-代表相应蛋白的磷酸化；control是缓冲液 空白对照
图4：实施例6受试物对神经缺陷症状、脑梗死面积的影响
图5：实施例7受试物对神经缺陷症状、脑梗死面积的影响
图6：实施例8受试物对神经缺陷症状、脑梗死面积的影响
图7：实施例8动物脑部切片图
图8：实施例9受试物对神经缺陷症状、脑梗死面积的影响
图9：实施例10受试物对神经缺陷症状、脑梗死面积的影响
图10：实施例10动物脑部切片图
具体实施方式
除非特别指明，否则本申请的技术术语或简称具有下列含义：
Lys-BK：未突变的赖氨酰缓激肽，与天然人赖氨酰缓激肽的序列一致；氨基 酸序列为KRPPGFSPFR。
BK：未突变的缓激肽，与天然人赖氨酰缓激肽的序列一致；氨基酸序列为RPPGFSPFR。衍生物：不仅包括本申请Lys-BK/BK的变体，也包括在本申请Lys- BK/BK变体的基础上进一步突变获得的多肽、融合蛋白(包括但不限于白蛋白 融合、Fc融合等)、各种形式修饰物。
聚乙二醇：PEG，通常经环氧乙烷聚合而成，有分支型，直链型和多臂型。 普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇 (mPEG)。
聚乙二醇修饰剂：PEG修饰剂，指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是经过活 化的聚乙二醇，可用于蛋白质以及多肽药物修饰。本申请所用聚乙二醇修饰剂购 自江苏众红生物工程创药研究院有限公司或北京键凯科技股份有限公司。特定分 子量的PEG修饰剂实际分子量可以是标示值的90％～110％，如PEG5K分子量可 以是4.5kDa～5.5kDa。
M-SPA-5K：分子量约为5kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯， 结构如式(1)所示，n为98至120的整数，
M-SPA-2K：分子量约为2kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯， 结构如式(1)所示，n为37至45的整数。
M-SPA-10K：分子量约为10kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸 酯，结构如式(1)所示，n为200至245的整数。
M-SPA-20K：分子量约为20kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸 酯，结构如式(1)所示，n为405至495整数。
M-SCM-5K：分子量约为5kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯， 结构如式(2)所示，n为99至120的整数。
M-SS-5K：分子量约为5kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁二酸酯， 结构如式(3)所示，n为98至119的整数。
M-YNHS-10K：分子量约为10kDa的支链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯， 结构如式(4)所示，n为98至120的整数，
实施例1赖氨酰缓激肽/缓激肽变体的设计、合成
基于赖氨酰缓激肽/缓激肽的序列以及体内可能的降解途径设计了系列变体 (表1-1)，主要是替换为结构相似天然氨基酸以及非天然氨基酸(m01～m04、 m07，其中m02是BK的变体)；为了确认发挥生物学活性/功能的最小活性单位， 设计了部分截短或延长的多肽变体(m05、m06、m08～m11)；为了进一步提高变体 抗氧化性能，引入半胱氨酸(m13)；为了进一步提高多肽稳定性，将赖氨酰缓激 肽/缓激肽单体串联(m12是Lys-BK串联BK、m14是两个Lys-BK串联)。所有多 肽纯度>95％。
表1-1赖氨酰缓激肽/缓激肽变体序列
多肽名称 序列 SEQ ID NO
Lys-BK KRPPGFSPFR 1
Lys-BKm01 KRPPG{THI}SPFR 2
Lys-BKm02 RPPG{THI}SPFR 3
Lys-BKm03 KRPPGHSPFR 4
Lys-BKm04 KRPPGFSPHR 5
Lys-BKm05 KRPPG{THI}SPF 6
Lys-BKm06 KRPPG{THI}SPFRR 7
Lys-BKm07 KRPPG{THI}SP{THI}R 8
Lys-BKm08 PG{THI}SPFR 9
Lys-BKm09 {THI}SPFR 10
Lys-BKm10 SPFR 11
Lys-BKm11 KRRPPG{THI}SPFR 12
Lys-BKm12 KRPPG{THI}SPFRRPPG{THI}SPFR 13
Lys-BKm13 CRRPPG{THI}SPFR 14
Lys-BKm14 KRPPG{THI}SPFRKRPPG{THI}SPFR 15
实施例2赖氨酰缓激肽/缓激肽及其变体稳定性研究
通过评价体外血清体系下的稳定性来评估赖氨酰缓激肽/缓激肽的稳定性。 2mg/ml多肽和SD大鼠血清按照体积比85：15进行混和，37℃孵育30min、 60min、90min、120min、180min等不同时间点，通过添加3％三氯乙酸(按上述 多肽血清混和体系的50％体积)进行终止并可有效去除血清中的基质干扰。进一 步基于UPLC-RP-UV214nm方法监测多肽样品在血清体系下的降解情况来评价其 稳定性，RP分析方法：色谱柱Protein BEH C4 2.1x150mm，1.7μm，流动相A： 0.1％TFA/H2O，流动相B：0.1％TFA/ACN。
表2-1赖氨酰缓激肽及其变体在血清体系下的稳定性
表2-1结果表明：设计的多种多肽变体相比野生型赖氨酰缓激肽在血清中的 稳定性更优，也预示着在体内的稳定性及药效具有一定的优势。
实施例3赖氨酰缓激肽/缓激肽及其变体体外活性评价
一、基于报告基因法的B2受体亲和活性
赖氨酰缓激肽/缓激肽体内药理作用通过与B2受体结合激活下游信号通路 来实现，基于CHO-K1宿主细胞构建了B2报告基因稳转细胞株B2-NFAT-CHO- K1并完成细胞建库，应用于体外赖氨酰缓激肽/缓激肽或其变体，以及PEG修 饰物与B2结合活性的检测评价。
检测方法：将细胞按5×104个/孔的密度铺96孔板，37℃，5％CO2培养16- 20小时后加入梯度稀释的标准品和供试品溶液，5小时后加Bio-Lite荧光素酶检 测试剂测定化学发光强度，使用GraphPad作图，拟合四参数方程曲线按EC50值 计算相对活性，部分检测结果表3-1罗列了多肽变体与B2受体的相对亲和活性， 其中Lys-BKm11和Lys-BKm13变体的活性相比野生型赖氨酰缓激肽有一定提 高。
表3-1 Lys-BK及其变体与B2受体的相对亲和活性
多肽名称 相对活性 多肽名称 相对活性
Lys-BK 100％ Lys-BKm08 <10％
Lys-BKm01 100％ Lys-BKm09 0％
Lys-BKm02 100％ Lys-BKm10 0％
Lys-BKm03 <10％ Lys-BKm11 110％
Lys-BKm04 <10％ Lys-BKm12 100％
Lys-BKm05 <10％ Lys-BKm13 115％
Lys-BKm06 90％ Lys-BKm14 100％
Lys-BKm07 <10％
二、基于下游信号通路关键靶标蛋白的活性分析
以过表达B2R的CHO-K1细胞B2-NFAT-CHO-K1为基础，体外给予Lys- BK/BK及其不同变体干预后，通过WB方法检测B2R下游信号p-CREB、p- ERK1/2的变化以比较受试物的活性差异。胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP- response element binding protein,CREB)都是B2R激活后下游直接作用的信号分 子，在脑卒中发生后CREB与ERK1/2的激活可以防止缺血后的炎症反应与神经 元损伤的发生，故其表达的高低可一定程度反应受试物激活B2R的能力，同时 从侧面反应神经保护效应发挥的意义。
收集处于对数生长期的CHO-K1(B2R+)细胞，用培养基调整至3×106 cells/mL，接种于细胞培养板，3×105个/孔。37.0℃，5.0％CO2的CO2培养箱培 养24～48h。待细胞密度长到90％以上时，用PBS洗涤，每孔加入1ml1μM的Lys- BK/BK及其变体样品，对照组则为F12培养基。细胞培养板置于37.0℃、5.0％CO2培养箱中孵育5min，PBS洗涤细胞培养板。加入蛋白裂解液(RIPA、PMSF、磷 酸酶抑制剂)80μL/孔，刮棒来回研磨孔底以加速细胞裂解。将细胞碎片与裂解 液转移至离心管中，12000rpm，10min，4℃离心。吸取上清，与5×LoadingBuffer 以4:1体积比混匀，100℃金属浴煮沸10min。将等量的蛋白样品上样到10％SDS-PAGE中进行跑胶、转膜、封闭、抗体孵育、发光鉴定等操作。
Lys-BK/BK及其变体激活下游信号活性检测结果如图1所示，赖氨酰缓激 肽Lys-BK可以激活下游ERK1/2和CREB蛋白的磷酸化，与该药物作用机制存 在一致性，通过判断下游ERK1/2和CREB蛋白的磷酸化水平来定性评价样品的 体外生物学活性。评价结果显示，Lys-BKm05、Lys-BKm07变体已丧失了激活下 游通路活性，LBKm01、m02、m06、m11、m12、m13、m14均显示出激活下游 通路的活性。
基于上述两种体外活性评价结果可知：赖氨酰缓激肽多肽/缓激肽C端截短 后即丧失了与B2R亲和活性以及下游通路激活活性，缺失N端赖氨酸不影响它 们与B2R亲和活性以及下游通路激活活性，N端其他氨基酸缺失后丧失了与B2R 亲和活性以及下游通路激活活性，最小活性单位为RPPGFSPFR；N端延长(m11) 或引入半胱氨酸(m13)均有利于提高与B2R亲和活性。由图1d可知m12、13、 14组CREB蛋白的磷酸化显著高于LBK组，揭示m12、13、14能更好地激活下 游通路，显示出优于LBK的体外活性。
实施例4赖氨酰缓激肽/缓激肽及其变体的PEG偶联物制备
赖氨酰缓激肽/缓激肽及其变体的PEG修饰采用本领域常规的方法进行，具 体到特定变体及特定PEG修饰剂，部分参数有细微变动，本领域技术人员可以通 过有限次实验优化获得，不存在技术上的障碍。以M-SPA-5K修饰野生型BK为 例，制备工艺如下：
一、PEG偶联物样品制备
多肽样品用磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液pH7.0溶解，使得终浓度为 10mg/mL。按多肽与M-SPA-5K质量比1:7的比例，向多肽溶液中加入PEG，缓 慢搅拌至混合均匀后，于2～8℃条件下，反应1h。
二、反应混合物纯化
第一步纯化色谱法条件如下：
纯化填料选用GE公司Superdex75介质，纯化流动相为pH7.0-7.5、20mM磷 酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，含0.2M NaCl。
上样：取反应结束后的上述多肽-PEG修饰反应混合物直接上样。
洗脱：上样结束后使用流动相洗涤层析柱不少于1.5个柱床体积，根据 UV214nm趋势分步收集洗脱样品。
第二步纯化色谱法条件如下：
C18反相柱分离纯化方法，基于两者在极性的差异实现分离，产物纯化收率 可达80％以上，同时游离PEG可完全去除。
三、PEG偶联物样品纯度分析
(1)HPLC纯度分析
参考《中国药典》2020年版通则0512高效液相色谱法进行检测，检测色谱 类型为SEC(分子筛色谱)，流动相为20mM PB7.0+10％IPA，色谱柱TSK G2000， 采集条件为214nm。
RP纯度分析方法：色谱柱Protein BEH C4 2.1x150mm，1.7μm，流动相A： 0.1％TFA/H2O，流动相B：0.1％TFA/ACN。
纯度结果显示，制备的赖氨酰缓激肽变体系列PEG修饰物产物峰均一，未 见明显杂质峰，纯度>95％。
(2)SDS-PAGE纯度分析
按照2020版中国药典0541电泳法第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法开展 样品纯度测定，配置12.5％的SDS-PAGE开展样品检测。
电泳结果显示，制备的赖氨酰缓激肽变体系列PEG修饰物条带均一，未见 杂带，纯度>95％。
此外，赖氨酰缓激肽/缓激肽及其变体只有N端具有理论可能的修饰位点， 因此它们的PEG修饰物均为N端单修饰产物。
实施例5赖氨酰缓激肽/缓激肽及其变体的PEG偶联物的体外评价
一、稳定性
通过评价体外血清体系下的稳定性来评估赖氨酰缓激肽/缓激肽的稳定性。 赖氨酰缓激肽及其变体的PEG偶联物的稳定性通过评价体外血清体系下的稳定 性来间接评估其体内稳定性，检测方法如实施例2。赖氨酰缓激肽及其变体的 PEG偶联物在体外血清体系下的残留时间均大于6h(表5-1)，稳定性显著提升。 同样分子量PEG下，支链偶联物Lys-BKm01-YNHS10K稳定性优于直链偶联物 Lys-BKm01-SPA10K。
表5-1赖氨酰缓激肽及其变体的PEG偶联物在血清体系下的稳定性
多肽名称 血清体系残留时间
Lys-BK-SPA5K >6h
Lys-BKm01-SPA2K >6h
Lys-BKm01-SPA5K >6h
Lys-BKm01-SPA10K >6h
Lys-BKm01-YNHS10K >12h
Lys-BKm01-SCM5K >6h
Lys-BKm01-SS5K >6h
二、体外活性
赖氨酰缓激肽及其变体的PEG偶联物进行了体外与B2受体亲和活性以及 激活下游信号通路活性，检测方法同实施例3。赖氨酰缓激肽或其变体经PEG修 饰后仍然具有与B2受体的亲和活性(图2a、2b)，同时仍可以激活B2受体下游 信号通路关键蛋白的磷酸化(图3)。不同结构类型、不同分子量PEG修饰剂偶 联产物均仍保留了与B2受体的结合活性，PEG修饰剂包括：分子量从2K到 10K，直链和分支，不同结构(SPA、SCM、SS等)。结果表明在相同分子量下 直链PEG偶联物活性高于支链PEG偶联物，这一结果在10K和20K两种分子 量PEG上均成立。如图2a中所示，Lys-BKm01-SPA10K和Lys-BKm01-YNHS10K 的EC50值分别为90.8μg/ml、346.6μg/ml，直链PEG偶联物活性比支链PEG偶 联物高近4倍。另相同PEG结构类型下，2K、5K、10K、20K四种PEG中2K 和10K的PEG偶联物活性相对更高。
赖氨酰缓激肽及其变体的PEG偶联物激活下游信号通路活性结果结果(图 3)显示多肽经PEG偶联后激活B2受体下游ERK1/2和CREB磷酸化的活性相 比Lys-BK多肽有所下降，尤其是ERK1/2的磷酸化。相同SPA5K-PEG修饰剂 下，不同多肽变体中Lys-BKm13-SPA5K的活性相对最高；相同多肽变体Lys- BKm01下，Lys-BKm01-SPA2K的活性相对最高，同时直链PEG偶联物Lys- BKm01-SPA10K活性高于支链PEG偶联物Lys-BKm01-YNHS10K。
实施例6赖氨酰缓激肽(未突变)PEG偶联物的体内活性评价
一、模型制备
SD大鼠，雄性，SPF级，体重270～300g。采用大脑中动脉线栓法制备大脑 中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑缺血再灌注模型。动物 用异氟烷麻醉，仰卧位固定，消毒皮肤，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈 外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎并剪断颈外动脉。夹闭颈总动脉近 心端，从颈外动脉的结扎线的远端作一切口，插入的MCAO线栓(型号2438- A5，购自北京西浓科技有限公司)，经过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐 插入至有轻微阻力为止(自分叉处约20mm)，阻断大脑中动脉的血供，缝合颈 部皮肤，消毒，放回笼中。缺血90min后，再次将大鼠诱导麻醉，固定在鼠板 上，剪开颈部皮肤，找到线栓将其轻轻拔出，恢复血供进行再灌注，缝合颈部皮 肤，消毒，放回笼中饲养。
分组及给药：包括假手术组、模型组、依达拉奉组，赖氨酰缓激肽PEG偶 联物(静脉注射，3mg/kg)，给药组在再灌注2h后注射给药。
二、神经缺陷症状评价
用改良Bederson 5分制法进行神经缺陷症状评价。
三、脑梗死体积的测定
动物用10％的水合氯醛麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生 理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-80℃放置7min，取出后立即 于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于用 生理盐水新鲜配制的TTC(20g/L)染液中于37℃温育90min，正常脑组织染成 深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺 序排列，吸干表面残留水迹，拍照。用图像分析软件(Image Tool)对照片进行 统计，圈定右侧缺血面积(白色区域)和右侧面积，脑梗死面积％＝缺血总面积÷ 左侧总面积×100。
四、结果
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如图4a所示，阳性药组(依达拉奉)与模型组相比，对神经缺陷症状有显 著的改善作用。赖氨酰缓激肽PEG偶联物Lys-BK-SPA5K组与模型组相比，对 神经缺陷症状有一定的改善作用，有统计学差异。
表6-1 Lys-BK-SPA5K等对神经缺陷症状的影响
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
2、受试物对脑梗死面积的影响
如图4b所示，阳性药组(依达拉奉)与模型组相比，对脑梗死面积有显著 的改善作用。赖氨酰缓激肽PEG偶联物组与模型组相比，对脑梗死面积有显著 的改善作用，有统计学差异。
表6-2 Lys-BK-SPA5K等对脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
实施例7赖氨酰缓激肽/缓激肽变体PEG偶联物的体内活性评价
赖氨酰缓激肽变体的PEG偶联物同样开展MCAO模型的体内药效评价，结 果如图5、表7-1、7-2、7-3、7-4所示。不同赖氨酰缓激肽变体PEG偶联物的药 效存在一定差异，Lys-BKm01、Lys-BKm02、Lys-BKm11、Lys-BKm12和 Lys-BKm13变体的PEG偶联物与模型组相比，对神经缺陷症状、脑梗死面积有 显著的改善作用，有统计学差异，其中Lys-BKm13变体的PEG偶联物的药效最 优，Lys-BKm13与Lys-BKm11相比，仅首位氨基酸不同，说明首位突变为Cys体内药效有显著优势。Lys-BKm11与Lys-BKm01相比差异在于Lys-BKm11在 Lys-BKm01的首位和第二位氨基酸间插入了Arg，在改善脑梗死面积方面具有一 定的优势。Lys-BKm01与Lys-BK相比差异在于突变引入了非天然氨基酸，而 Lys-BKm01的PEG偶联物的药效要显著优于Lys-BK的PEG偶联物。Lys-BKm06 与Lys-BKm01差异在于C端延长，其体内药效作用显著下降，说明C端结构对 于缓激肽药效及活性发挥至关重要，这一结果与实施例1中最小活性单位确定结 果一致。
表7-1.受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较。
表7-2.受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较。
表7-3.受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较。
表7-4.受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较。
实施例8不同给药方式评价及不同PEG修饰剂偶联物体内活性评价
实施例7中所述SD大鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑缺血再灌注模型评价中药物给药方式为静脉注射，基于同一模型，考 察了皮下给药方式下赖氨酰缓激肽变体PEG偶联物的药效，给药剂量为4.5mg/kg， 结果如图6、图7、及表8-1所示。静脉注射、皮下注射方式下Lys-BKm13-SPA5K 组与模型组相比，对神经缺陷症状、脑梗死面积均有显著的改善作用，有统计学 差异。不同分子量PEG修饰剂偶联物评价结果显示Lys-BKm01-SPA2K体内药 效显著优于Lys-BKm01-SPA5K，可能是由于小分子量PEG易于体内药物吸收。
表8-1受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较。
实施例9赖氨酰缓激肽PEG偶联物口服给药的体内活性评价
赖氨酰缓激肽的PEG偶联物开展MCAO模型的口服给药体内药效评价，结 果如图8、表9-1所示。本实施例中赖氨酰缓激肽是野生型未突变，PEG为M- SPA-5K。高剂量组：6mg/kg，单次给药；低剂量组：2mg/kg，单次给药。
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如表9-1所示，与模型组相比，高剂量赖氨酰缓激肽PEG偶联物组对神经 缺陷症状有显著的改善作用。而低剂量组与模型组相比，对神经缺陷症状有一定 的改善作用，无统计学差异。
2、受试物对脑梗死面积的影响
如9-1所示，与模型组相比，高剂量赖氨酰缓激肽PEG偶联物组对脑梗死 面积有显著的改善作用。低剂量赖氨酰缓激肽PEG偶联物组对脑梗死面积有一 定的改善作用，但无统计学差异。
综合神经缺陷症状评分和脑梗死面积结果可以看出，两个剂量组的实验结 果呈现出一定的剂量依赖关系，且高剂量组口服给药后显示出了显著药效，验 证了口服给药的有效性。
表9-1受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 样本(只) 神经缺陷症状评分 脑梗死面积(％)
模型组 18 0 18 2.83±0.31 22.28±5.48
2mg/kg 18 1 17 2.54±0.22 19.49±3.41
6mg/kg 18 1 17 1.87±0.34* 12.24±1.47*
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
实施例10赖氨酰缓激肽/缓激肽变体PEG偶联物口服给药的体内活性评价
比较赖氨酰缓激肽的PEG偶联物与赖氨酰缓激肽变体的PEG偶联物MCAO 模型的口服给药体内药效。本实施例中赖氨酰缓激肽是野生型未突变，变体为 M01，PEG为M-SPA-5K。结果如图9、图10、表10-1所示。
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如表10-1所示，与模型组相比，赖氨酰缓激肽PEG偶联物组和突变体的 PEG偶联物均对神经缺陷症状有显著的改善作用。
2、受试物对脑梗死面积的影响
如表10-1所示，与模型组相比，赖氨酰缓激肽PEG偶联物组对脑梗死面积 有一定的改善作用，但无统计学差异。而突变体的PEG偶联物对脑梗死面积有 显著的改善作用。
综合神经缺陷症状评分和脑梗死面积结果可以看出，赖氨酰缓激肽的突变 体经过相同PEG修饰剂制备的偶联物的药效优于赖氨酰缓激肽。
表10-1受试物对神经缺陷症状和脑梗死面积(％)的影响
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
综合实施例6～9的数据，本申请的多种PEG修饰分子、不同给药方式均显 示出较优的体内药效；尤其是皮下注射、口服给药，临床使用便利，有效提高患 者的顺应性，更适用于长期治疗给药，如脑卒中患者的恢复期治疗和预防复发等。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 聚乙二醇修饰的激肽或其变体和药物应用
<130> Z131
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
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Lys Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Pro Xaa Arg
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Lys Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Pro Phe Arg Arg Pro Pro Gly Xaa Ser
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Pro Phe Arg
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<213> 人工序列
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=THI(β-2-噻吩丙氨酸)
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Cys Arg Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Pro Phe Arg
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<213> 人工序列
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<220>
<221> MUTAGEN
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<223> Xaa=THI(β-2-噻吩丙氨酸)
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Lys Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Pro Phe Arg Lys Arg Pro Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Ser Pro Phe Arg
20

Claims (15)

1.聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰是N端修饰，而非C端修饰。
2.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰剂包括但不限于SPA、SCM、SS修饰剂。
3.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰剂可以是直链型或分支型PEG修饰剂。
4.权利要求3所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰剂是直链型PEG修饰剂。
5.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰剂分子量是2KD-20KD。
6.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述PEG修饰剂分子量是2KD或10KD。
7.权利要求1-6任一项所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述赖氨酰缓激肽或缓激肽是突变体或其衍生物，在赖氨酰缓激肽或缓激肽序列中任意位置引入半胱氨酸。
8.权利要求7所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，赖氨酰缓激肽首位Lys突变为半胱氨酸。
9.权利要求1-6任一项所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽，所述赖氨酰缓激肽N端第一位及第二位氨基酸残基之间插入任意氨基酸。
10.权利要求1-6任一项所述的聚乙二醇修饰的缓激肽，所述缓激肽N端第一位氨基酸残基前插入任意氨基酸。
11.权利要求9或10所述聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述插入的氨基酸为精氨酸。
12.权利要求1-6任一项所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，由2个或2个以上赖氨酰缓激肽串联而成，或者由2个或2个以上缓激肽串联而成，或者由赖氨酰缓激肽及缓激肽串联而成。
13.权利要求1-6任一项所述的聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽，所述赖氨酰缓激肽第6位Phe或缓激肽第5位Phe被突变为其他任意氨基酸。
14.权利要求1-13任一项所述聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽在制备治疗、预防、愈后恢复、防止复发缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎、慢性肾病的药物中的应用。
15.权利要求1-13任一项所述聚乙二醇修饰的赖氨酰缓激肽或缓激肽通过注射、口服给药。
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