CN103897034A - 一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用。本发明还涉及所述小分子多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明小分子多肽具有多种优点，如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体中保持较高的浓度；合成简单、制备成本低等。

Description

一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用。

背景技术

炎症（inflammation）是一种具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症反应使血液中产生大量的促炎性细胞因子（proinflammatorycytokines），如IL-1，TNF-α，IFN-gamma，IL-6等，刺激内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞等活化，合成和分泌蛋白及细胞因子，参与炎症反应的各个阶段，如血管扩张，血管通透性增高，炎症细胞粘附、迁移及趋化，新生血管形成等过程。在此过程中，白细胞也通过释放蛋白水解酶、大量炎症介质和氧自由基等促进炎症反应，使病情加重，造成组织损伤。

眼部的葡萄膜炎是一类可反复发作的、临床常见、治疗棘手的严重眼部免疫原性疾病，可破坏血眼屏障，其渗出物和毒素等引起眼内组织的增生、变性，导致视网膜等组织损害、晶体混浊产生白内障、继发性青光眼等，致盲率高，严重影响患者的视觉质量和生活质量。在欧美国家，约有35％的葡萄膜炎患者出现不同程度的视力损害；国内葡萄膜炎致盲率为18.76％。

目前，葡萄膜炎的治疗方法主要是使用激素、免疫抑制剂和非甾体类消炎药。然而，长期、反复地使用激素，往往导致激素性青光眼等治疗棘手的并发症发生。而免疫抑制剂在全身及局部毒副作用大，限制了其应用；非甾体类消炎药则局部刺激性强、药物分子量大，难以透过血眼屏障从而限制了其在眼组织局部的有效浓度。

C型凝集素（C-type lectins）是一类依赖钙离子的凝集素大家族，包括许多细胞内吞受体、蛋白聚糖、所有的胶原凝集素和选择蛋白等。其糖识别域（carbohydrate-recognition domains,CRD）结构，即C型凝集素结构域（C-typelectin domain,CTLD）具有高度同源性，由约115-130个氨基酸组成，是C型凝集素的主要功能区域，参与介导各种生物学反应，如细胞间的黏附，凋亡，以及免疫反应等，其中免疫反应包括炎症、肿瘤免疫以及病毒感染的细胞等。研究表明，许多C型凝集素蛋白具有抑制炎症的作用，如血栓调节蛋白（Thrombomodulin,TM）、胰腺炎相关蛋白（Pancreatitis-associated protein，PAP）、甘露糖结合蛋白（Mannose-binding lectin,MBL）等。

甘露糖结合凝集素（mannose binding lectin,MBL）是一种由肝脏合成的C型凝集素，属于C型凝集素超家族III—胶原凝集素（collectin）亚家族。人类MBL多肽链由229个氨基酸残基组成，相对分子质量约为32kDa。MBL通过结合病原微生物表面的甘露糖等糖基配体，识别大多数细菌、病毒、真菌等，直接介导巨噬细胞调理吞噬作用和/或通过凝集素途径激活补体，在机体的天然免疫防御中发挥重要作用。

近年来，越来越多的生物制剂通过实验室或临床证实具有抑制眼部炎症的作用，然而，这些生物制剂分子量大，体外合成方法复杂，存在制备过程中重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足；且容易因蛋白构象以及修饰改变而导致生物学活性丧失；由于其分子量大，难以通过血眼屏障，需要经过反复玻璃体腔注射或者转基因等方法发挥抗炎的作用，存在组织损伤等严重并发症的风险。

在开发有效的眼部炎症抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。

第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。

第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。

第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，需加大给药的浓度。但高浓度药物的毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。

第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性炎症抑制剂被先后证实，如血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）、胰腺炎相关蛋白（Pancreatitis-associated protein，PAP）、甘露糖结合蛋白（Mannose-bindingprotein，MBP）等，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。

因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的安全有效的小分子炎症反应抑制剂。

发明内容

本发明的目的就是提供一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18](I)

式中，

Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Trp，Phe，Tyr，或无；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Asn，Gln，His，Lys，或Arg；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Asp，或Glu；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Val，Ile，Leu，Met，Phe，或Ala；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Pro，或Ala；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Cys，或Ser；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser，或Thr；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Thr，或Ser；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Ser，或Thr；

Xaa10是选自下组的氨基酸：His，Asn，Gln，Lys，或Arg；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Leu，Ile，Val，Met，Ala，或Phe；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Ala，Val，Leu，或Ile；

Xaa13是选自下组的氨基酸：Val，或Leu；

Xaa14是选自下组的氨基酸：Cys，或Ser；

Xaa15是选自下组的氨基酸：Glu，或Asp；

Xaa16是选自下组的氨基酸：Phe，Leu，Val，Ile，Ala，或Tyr；

Xaa17是选自下组的氨基酸：Pro，或Ala；

Xaa18是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制炎症的活性，且所述多肽的长度为17-23个氨基酸。

在另一优选例中，Xaa18是1-3个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中，Xaa0是1-3个氨基酸构成肽段。

在另一优选例中，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70%的SEQ ID NO:1的所示多肽的抑制炎症免疫反应的活性。

在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO:1的相同性≥80%，较佳地≥90%；更佳地≥95%。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码第一方面所述的多肽。

在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQ ID NO:2所示的序列。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(a)第一方面所述多肽或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括：(c)药学上可接受的抗炎药物。

在另一优选例中，抗炎药物选自下组：地塞米松、甲强龙等甾体类抗炎药；阿司匹林、吲哚美辛、水杨酸钠等非甾体类抗炎药；环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。

在本发明的第四方面，提供了第一方面所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，用于制备抑制炎症或治疗与炎症相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述的与炎症相关疾病的选自下组：眼部炎性疾病、胰腺炎、炎症性肠病、肺部炎症、接触性皮炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等。

在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物炎症的方法，给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述的炎症免疫反应是与葡萄膜炎相关的炎症反应。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了WP-17多肽的HPLC分析结果，WP-17多肽洗脱峰位于12.690分钟，纯度为99.61%。

图2显示了WP-17多肽的质谱分析结果，WP-17多肽分子量为1905，制备纯度大于95%。

图3显示了大鼠EIU临床观察结果；图3A显示正常对照组大鼠无明显炎症表现；图3B显示LPS组大鼠在LPS注射24小时后出现虹膜血管迂曲扩张、前房闪辉、瞳孔区膜状物、瞳孔膜闭等炎症表现；图3C显示20μg WP-17干预组炎症表现明显减轻，仅见虹膜血管轻度充血，未见渗出；图3D显示大鼠EIU临床评分结果。

图4显示大鼠房水炎性细胞浸润定量计数结果：正常对照组（NaCl）大鼠房水无明显炎性细胞浸润；LPS组大鼠房水炎性细胞对照组相比显著增多（P<0.01）；1μg、10μg和20μg WP-17干预组与LPS组相比，炎性细胞明显减少（P<0.01）。

图5显示大鼠房水蛋白定量结果：正常对照组（NaCl）大鼠房水仅含有少量蛋白；LPS组大鼠房水蛋白浓度与对照组相比有显著统计学差异；10μg和20μgWP-17干预组与LPS组相比，蛋白浓度逐步减少，与LPS组相比差异有统计学意义（P<0.01）。

图6显示了大鼠眼球组织病理学观察结果；图6A显示正常大鼠眼球组织；图6B显示LPS组可见前房大量噬伊红样无定形物质和炎症细胞浸润，大量白细胞分布于虹膜、睫状体基质内和前、后房；玻璃体腔近视网膜内表面有大量炎症细胞；视网膜增厚，可见炎症细胞浸润；图6C显示20μg WP-17干预组，虹膜及睫状体表面、基质内和玻璃体腔内细胞渗出明显减少，视网膜仅见少量炎症细胞浸润。

图7显示了WP-17对LPS诱导RAW264.7细胞促炎症细胞因子表达的影响结果；图7A显示各处理组RAW264.7细胞TNF-α浓度测定结果，空白对照组细胞上清液中仅含有少量的TNF-α；而LPS组细胞上清液中TNF-α的浓度约为空白对照组的190倍；WP-17的干预（1μM、10μM、50μM）明显抑制了细胞上清液中TNF-α的表达水平，且抑制作用呈剂量依赖性，与LPS相比差异有统计学意义（P₁<0.05，P₂<0.01，P₃<0.01）；图7B显示各处理组RAW264.7细胞IL-6浓度测定结果，空白对照组细胞上清液中几乎未测出IL-6；LPS组细胞上清液中PGE₂的水平明显升高；WP-17的干预明显抑制了细胞上清液中IL-6的表达水平，且抑制效果呈剂量依赖性，与LPS相比差异有统计学意义（P<0.01）。

图8显示了WP-17细胞安全性试验结果，各浓度组WP-17对细胞相对增殖率分别为100.52±7.27%，100.90±6.84%，101.02±5.78%，99.07±10.49%和99.87±5.85%，不同浓度组之间两两比较显示：WP-170.1、1、10μM、100μM、1mM组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

图9显示了多个候选序列WP-17、P1、P2抑制炎症效果；图9A显示多个候选序列WP-17、P1、P2EIU临床评分结果；图9B显示多个候选序列WP-17、P1、P2房水炎性细胞计数结果；图9C显示多个候选序列WP-17、P1、P2房水蛋白定量结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一种源自C型凝集素的具有抑制炎症功能的，分子量仅1.905KDa的小分子多肽。具体地，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，选定了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经内毒素诱导大鼠葡萄膜炎模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗眼部炎症功能的小分子多肽，即WP-17。

本发明的小肽WP-17的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。

活性多肽

在本发明中，术语“本发明多肽”、“WP-17多肽”、“WP-17小肽”或“肽WP-17”可互换使用，都指具有炎症抑制活性的肽WP-17氨基酸序列WNDVPCSTSHLAVCEFP(SEQ ID NO:1)的蛋白或多肽。

此外，所述术语还包括具有抑制炎症功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。

本发明还包括WP-17蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制炎症功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)WP-17多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明还提供了WP-17多肽的类似物。这些类似物与天然WP-17多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明提供了编码WP-17多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明一种优选的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

它编码SEQ ID NO:1所示的短肽。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:2中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的WP-17核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或WP-17蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

另一方面，本发明还包括对WP-17DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在另一优选例中，本发明多肽WP-17，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的WP-17多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码WP-17多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

药物组合物和施用方法

本发明还提供了一种药物组合物，它含有：

(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括(c)：药学上可接受的抗炎物。

所述的抗炎药物可以包括但不局限于：地塞米松、甲强龙等甾体类抗炎药；阿司匹林、吲哚美辛、水杨酸钠等非甾体类抗炎药；环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制剂。

本发明多肽的数量通常为5微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在糖皮质激素、免疫抑制剂或非甾体类消炎药等药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂、眼用凝胶和眼药膏。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，眼药水的配制可这样进行：将多肽WP-17或其药学上可接受的盐与基本物质一起通过加热溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，加入聚乙烯吡咯烷酮，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂和等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，多肽WP-17或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，多肽WP-17或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的多肽WP-17或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt%，较佳地1-5wt%，每日可2-6次给药，每次1-5滴。

工业应用性

含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对炎症有显著的抑制作用。经体内、体外试验证实，本发明多肽不仅可以抑制大鼠内毒素诱导的葡萄膜炎，而且可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞促炎症细胞因子和蛋白的表达，且对RAW264.7细胞无明显毒副作用。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明多肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；

(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；

(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；

(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。

因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗炎症性眼病及相关的炎性疾病，如炎症性肠病、皮肤炎症等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1多肽的合成

采用市售的SYMPHONY多肽合成仪合成序列为SEQ ID NO:1的WP-17多肽。步骤如下：

1.根据软件计算配制所需要的保护氨基酸溶液，和缩合试剂，切割试剂，在仪器相应的瓶里加入足量的DMF、DCM。

2.在反应器中加入100μmol FMOC-Ala-Wang-Resin。

3.在收集切割液的管道上放入15mg的离心管。

4.编辑程序，一般树脂的溶涨时间是30min，脱保护时间是5min、15min两次、缩合时间是30分钟，切割程序是2h。

5.开机按照程序合成。

6.最后将切割液用乙醚沉淀，离心，吹干，用HPLC纯化。

制得120mg多肽WP-17，为白色粉末(水溶性好)，纯度：>95%。密封，-20℃保存备用。

实施例2小肽WP-17的鉴定及保存

1.取少量成品小肽WP-17，做HPLC分析的纯度鉴定和质谱鉴定。

2.HPLC分析条件：A液为超纯水（含0.1%三氟乙酸），B液为乙腈（含0.1%三氟乙酸）。使用Kromasil公司的100-5C₁₈（4.6mm×250mm）进行梯度分析：B液10%-50%，流速1ml/min,时间共18分钟。

质谱分析条件：A液为超纯水（含0.1%甲酸），B液为乙腈（含0.1%甲酸）。流速0.2ml/min,时间共1分钟。

3.HPLC结果：

WP-17的洗脱峰位于12.690分钟，纯度为99.61%(图1)；

4.质谱分析结果：

WP-17的分子量为1905，纯度大于95%（图2）。

5.将白色粉末状的各小肽，密封包装，-20℃保存。

实施例3WP-17对EIU模型炎性细胞浸润和蛋白渗出的影响

1.材料与方法

1.1实验动物和材料

健康雄性Wistar大鼠，140-180g，8-10周龄，购自中国医学科学院动物中心；

内毒素脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS），来源于大肠埃希杆菌，购自美国SIGMA-Aldrich公司；

Bradford蛋白定量试剂盒（Bradford Protein Assay Kit），购自美国Bio-Rad公司。

1.2模型制作及干预试验

将Wistar大鼠随机分成4组，依次为LPS组、LPS+1μgWP-17干预组、LPS+10μgWP-17干预组、LPS+20μg WP-17干预组及正常对照组（0.9%NaCl组），每组9-15只。EIU模型通过对每只大鼠右足底皮下注射200μgLPS（2mg/ml，100μl，溶解于无菌生理盐水）来诱导建立，正常对照组每只大鼠右足底皮下注射100μl无菌生理盐水。LPS组、LPS+WP-17（1μg、10μg、20μg）干预组每只大鼠在右足底皮下注射200μgLPS的同时，玻璃体腔内分别注射含有0、1μg、10μg和20μg WP-17的PBS溶液10μl。

1.3大鼠EIU临床表现定性观察

LPS及药物干预24小时后对大鼠进行生物显微镜观察，参照Behar-Cohen等的方法由一名独立的观察者对大鼠的临床表现进行评估和计分。EIU的严重程度用0-4分表示：0：没有炎症反应；1：结膜和虹膜血管轻度扩张；2：结膜和虹膜血管中度扩张伴有前房闪辉；3：重度虹膜充血伴前房重度闪辉；4：在3分的程度上出现前房纤维素样渗出、虹膜后黏连、瞳孔缩小和前房积脓。

1.4大鼠房水炎性细胞浸润定量计数

LPS及药物干预24小时后对大鼠以过量麻醉处死，在手术显微镜下用30号微量进样器于大鼠角膜缘内1mm处行前房穿刺收集房水（30-40μl/双眼）。房水样本用等量台酚蓝染液对倍稀释，使用血细胞计数器在光学显微镜下进行房水细胞计数，由两名独立的技术员对每个区域（相当于0.1μl）的细胞进行计数，四个区域细胞数量的平均值即为每微升房水中所含的细胞数。

1.5大鼠房水蛋白定量

采用Bradford法测定，按照试剂盒说明，测定大鼠房水蛋白浓度。用牛血清白蛋白配置标准液，以590nm处的吸光度(A)值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制出标准曲线，根据样本的A值在标准曲线上读出其浓度。

1.6大鼠眼球组织病理学观察

各组大鼠均于LPS及药物干预24小时后摘取眼球，立即置于5%甲醛溶液内固定24小时，石蜡包埋，经瞳孔-视乳头轴作矢状切面组织切片（5μm），作常规HE染色。在光学显微镜下对前房、虹膜睫状体、玻璃体和视网膜行组织病理学观察。

1.7统计分析

实验数据以

表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分别比较各组大鼠炎性细胞浸润和蛋白浓度变化情况。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1大鼠EIU临床表现定性观察

正常对照组大鼠无明显炎症表现，EIU临床评分为0.75±0.50（图3A、3D）；LPS组大鼠在LPS注射24小时后出现虹膜血管迂曲扩张、前房闪辉、瞳孔区膜状物、瞳孔膜闭等炎症表现，EIU临床评分为3.80±0.27（图3B、3D）；20μg WP-17干预组与LPS组相比，炎症表现明显减轻，仅见虹膜血管轻度充血，未见渗出，EIU临床评分为1.40±0.42（P<0.01）（图3C、3D）。

2.2大鼠房水炎性细胞浸润定量计数

正常对照组大鼠房水无明显炎性细胞浸润；LPS组大鼠房水炎性细胞计数104.37±4.26×10⁵个细胞/ml，与对照组相比显著增多（P<0.01）；1μg、10μg和20μgWP-17干预组与LPS组相比，炎性细胞明显减少，依次为53.91±2.28×10⁵，47.69±5.23×10⁵个细胞/ml和12.59±1.92×10⁵个细胞/ml（P<0.01）(图4)。

2.3大鼠房水蛋白定量

正常对照组大鼠房水仅含有少量蛋白（2.39±0.93μg/ml）；LPS组大鼠房水蛋白浓度为39.34±2.04μg/ml，与对照组相比有显著统计学差异（P<0.01）；1μg、10μg和20μgWP-17干预组与LPS组相比，蛋白浓度逐步减少，分别为37.19±0.95μg/ml，28.47±1.52μg/ml和12.88±2.37μg/ml。其中10μg和20μgWP-17干预组蛋白浓度与LPS组相比具有统计学差异（P<0.01）(图5)。

2.4大鼠眼球组织病理学观察

LPS组可见前房大量噬伊红样无定形物质和炎症细胞浸润，大量白细胞分布于虹膜、睫状体基质内和前、后房；玻璃体腔近视网膜内表面有大量炎症细胞；视网膜增厚，可见炎症细胞浸润。20μgWP-17干预组，虹膜及睫状体表面、基质内和玻璃体腔内细胞渗出明显减少，视网膜仅见少量炎症细胞浸润(图6A、6B、6C)。

3.小结

通过建立内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型，经临床表现观察及评分、房水炎性细胞计数和蛋白定量，以及大鼠眼球组织病理学观察等实验，证实WP-17具有抑制炎性细胞浸润和蛋白渗出，从而减轻炎症反应、缓解临床症状的作用。

实施例4WP-17对LPS诱导RAW264.7细胞促炎症细胞因子表达的影响

1.实验方法

1.1实验细胞株和材料

小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

DMEM高糖培养基，购自美国GIBCO公司；

小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒购自美国R&D公司。

1.2模型制作及干预试验

RAW264.7细胞采用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）、100U/ml青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中进行扩增培养。取对数生长期细胞，调整密度为2.5×10⁵/ml接种于24孔板。待细胞贴壁良好且生长融合至80-90%时，更换不含10%胎牛血清的DMEM培养基进行血清饥饿培养24小时。将RAW264.7细胞随机分为空白对照组、LPS组、LPS+WP-17组，每组设六个复孔。LPS组和LPS+WP-17组加入不同浓度的WP-17（0、1、10、50μM）和LPS（100ng/ml）500μl，空白对照组加入等体积DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中常规培养，分别于6、16和24小时后收集细胞上清液。

1.3TNF-α和IL-6浓度测定

细胞经培养处理24小时后，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明分别测定RAW264.7细胞上清液中IL-6和TNF-α的浓度。以450nm处的吸光度(A)值为纵坐标，以试剂盒内标准品的浓度为横坐标，绘制出标准曲线，根据样本的A值在标准曲线上读出其浓度。

1.4统计学分析

实验数据以

表示，使用SPSS 11.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分别比较各组细胞上清液中TNF-α和IL-6的浓度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1TNF-α浓度测定

空白对照组细胞上清液中仅含有少量的TNF-α（1.50±1.72pg/ml）；而LPS组细胞上清液中TNF-α的浓度约为空白对照组的190倍，为286.64±15.39pg/ml；WP-17的干预（1、10、50μM）明显抑制了细胞上清液中TNF-α的表达水平，且抑制作用呈剂量依赖性，分别为236.40±15.14pg/ml，157.68±64.63pg/ml和61.76±21.76pg/ml，与LPS相比差异有统计学意义（P₁<0.05，P₂<0.01，P₃<0.01）（图7A）。

2.2IL-6浓度测定

空白对照组细胞上清液中几乎未测出IL-6（1.75±0.78pg/ml）；LPS组细胞上清液中PGE₂的水平明显升高（188.20±17.75pg/ml）；WP-17的干预明显抑制了细胞上清液中IL-6的表达水平，且抑制效果呈剂量依赖性，分别为161.60±18.64pg/ml，104.70±9.39pg/ml和51.38±4.79pg/ml，与LPS相比差异有统计学意义（P<0.01）（图7B）。

3.小结

巨噬细胞在机体的免疫系统中发挥着重要的作用，本实验通过LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7建立炎症细胞模型，用不同浓度的WP-17多肽进行干预，通过分析细胞上清液中炎性细胞因子TNF-α和IL-6的浓度，证实WP-17能够抑制炎性细胞因子的表达，且作用存在剂量依赖性。

实施例4WP-17细胞安全性试验

1.实验方法

1.1实验细胞株和材料

小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；

DMEM高糖培养基，购自美国GIBCO公司；

MTS购自Promega公司，用PBS(pH6.0)配成300mmol/L，于-20℃避光保存。

1.2模型制作及干预试验

RAW264.7细胞采用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）、100U/ml青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中进行扩增培养。取对数生长期细胞，调整密度为1×10⁵/ml接种于96孔板。待细胞贴壁良好且生长融合至80-90%时，更换不含10%胎牛血清的DMEM培养基进行血清饥饿培养24小时。

1.3细胞毒性试验（MTS比色法）

细胞经血清饥饿培养24小时后，每孔加入不同浓度的WP-17（0.1、1、10μM、100μM、1mM）100μl，每个浓度平行做6孔，空白对照组加入等体积DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养24小时，每孔加入20μlMTS溶液，继续培养4小时，在酶联免疫检测仪于490nm处测量各孔的吸光值，并计算细胞相对增殖率(Relative Growth Rate，RGR)。公式：RGR=实验组A值/空白对照组A值×100%。

1.4统计学分析

实验数据以

表示，使用SPSS 11.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分别比较各组细胞相对增殖率，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

各浓度组细胞相对增殖率分别为100.52±7.27%，100.90±6.84%，101.02±5.78%，99.07±10.49%和99.87±5.85%。不同浓度组之间两两比较显示：WP-170.1、1、10μM、100μM、1mM组之间差异无统计学意义（P>0.05）（图8）。

3.小结

通过检测不同浓度WP-17对细胞相对增殖率的影响，可见在0.1-1mM浓度范围内WP-17对细胞无明显毒性作用，实验中所使用的药物浓度（0.1-10μM）在安全浓度范围内。

实施例5多个候选序列效果比较

应用生物信息学的方法，在MBP的CTLD结构域中选定了另两个候选序列，重复实施例1，进行生物固相合成，并将合成的小肽命名为P1和P2（见表2）；重复实施例2的实验方法，将大鼠随机分为5组，依次为正常对照组、LPS组、LPS+20μgP1组、LPS+20μgP2组和LPS+20μg WP-17组，通过内毒素诱导的葡萄膜炎模型，对WP-17与两个小肽抑制炎症的效果进行比较。

表2

对EIU大鼠分别行三种小肽玻璃体腔注射治疗，24小时后进行EIU临床评分，房水炎性细胞计数以及房水蛋白定量检测，对三个小肽抑制炎症的效果进行比较。

表3

表3.各组EIU大鼠临床评分、房水炎性细胞计数以及房水蛋白定量值（n=6，##p<0.01vs正常对照组，^**p<0.01vs LPS组，$p<0.01vs LPS+20μg WP-17组）

结果表明：WP-17具有明显抑制炎症的作用，与LPS相比差异具有统计学意义（P<0.01）；P1、P2无明显抑制炎症的作用，各检测数据与LPS相比差异无统计学意义（P>0.05），且与WP-17相比差异具有统计学意义（P<0.01）（图9）。

小结

通过内毒素诱导葡萄膜炎模型进行多个小肽的筛选和抗炎作用的比较，证实WP-17抑制炎症的作用最显著，由此提示了WP-17所处的区域可能为CTLD发挥抗炎作用的核心区域。

实施例6

眼药水的制备

利用常规技术，混合以下组分，制得1%眼药水，其配方如下：

WP-17肽                    10mg

羟丙基甲基纤维素           0.03g

双蒸水                     加至10ml

调节渗透压至300Osm，酸碱度(pH)至6.8-7.1。

经3位志愿者试用一周，每日2次，每次2滴/眼。结果表明该眼药水可抑制眼部的炎症。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]   (I)

式中，

Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Trp，Phe，Tyr，或无；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Asn，Gln，His，Lys，或Arg；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Asp，或Glu；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Val，Ile，Leu，Met，Phe，或Ala；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Pro，或Ala；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Cys，或Ser；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser，或Thr；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Thr，或Ser；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Ser，或Thr；

Xaa10是选自下组的氨基酸：His，Asn，Gln，Lys，或Arg；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Leu，Ile，Val，Met，Ala，或Phe；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Ala，Val，Leu，或Ile；

Xaa13是选自下组的氨基酸：Val，或Leu；

Xaa14是选自下组的氨基酸：Cys，或Ser；

Xaa15是选自下组的氨基酸：Glu，或Asp；

Xaa16是选自下组的氨基酸：Phe，Leu，Val，Ile，Ala，或Tyr；

Xaa17是选自下组的氨基酸：Pro，或Ala；

Xaa18是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制炎症的活性，且所述多肽的长度为17-23个氨基酸。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa18是1-3个氨基酸构成的肽段。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa0是1-3个氨基酸构成肽段。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症功能的由(a)衍生的多肽。

5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。

6.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。

8.权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制炎症或治疗与炎症相关疾病的药物。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与炎症相关疾病的选自下组：眼部炎性疾病、胰腺炎、炎症性肠病、肺部炎症、接触性皮炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等。

10.一种抑制哺乳动物炎症的方法，其特征在于，给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。

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