CN104861058A - 一类新的具有神经保护功能的多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类新的具有神经保护功能的多肽。本发明还涉及所述多肽的衍生物及其应用，以及含有该多肽或其衍生物的药物组合物。本发明多肽分子量小，能够穿透各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一类新的具有神经保护功能的多肽。
背景技术
临床上许多眼部疾病，虽然它们的病因及发病机制不同，但它们最终都会引起视网膜神经细胞的损伤，导致视力不可逆的下降。这些疾病包括青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜动静脉阻塞等。例如青光眼，它是一组由病理性眼内压升高或者视神经血流灌注压减少等多种因素启动复杂的损伤机制，最终导致视网膜神经节细胞凋亡、视力不可逆性损伤的疾病。研究表明，控制眼内压并不能完全缓解青光眼视神经的损伤，青光眼甚至可以发生在正常眼压人群中，提示对于青光眼的治疗应当重视视神经的保护。同样，糖尿病性视网膜病变虽一直以来被认为是微血管病变，但神经细胞损伤在疾病发展中的作用越来越为人们所关注。
视神经保护的方法有多种，如通过药物口服、局部滴眼或玻璃体腔内注射以减缓、阻止甚至逆转神经细胞的死亡；还有基因疗法，即通过重组腺病毒相关病毒（rAAV）或慢病毒（lentiviral）等载体介导的抗凋亡蛋白或神经营养因子的表达来减缓RGCs的凋亡；此外，通过干细胞移植的方法可以利用干细胞分泌神经营养因子及其他调节因子减轻青光眼发病相关的神经营养因子剥夺、炎症反应、氧化应激、兴奋性毒性等从而保护RGCs。就药物而言，传统的化学药物毒副作用大，重组蛋白类药物生产成本高、免疫原性强，这些缺点都阻碍了其在临床上的广泛应用。
在开发有效的眼部炎症抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。
第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。
第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，需加大给药的浓度。但高浓度药物的毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。
因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的安全有效的小分子神经保护剂。
发明内容
本发明提供了一种新的具有神经保护功能的多肽，尤其是适用于眼球的组织的多肽。
本发明第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa12]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19](I)
式中，
Xaa0是无，或1-5个氨基酸构成肽段；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Lys、Arg、Gln或Asn；
Xaa19是无，或1-5个氨基酸构成肽段；
并且所述的多肽具有神经保护的活性。
在另一优选例中，所述的多肽长度≤28个氨基酸，较佳地，≤25个，更佳地，≤20个。
在另一优选例中，所述多肽至少具有12个固定氨基酸，较佳地为15个，更佳地为16个。
在另一优选例中，所述的多肽如SEQ ID NO.:1-16所示。
在另一优选例中，所述的多肽为：
Xaa0是无；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Leu或Ile；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Asn或Gln；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Asn或Gln；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Asn或Gln；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa19是无；
并且所述的多肽具有神经保护的活性,且所述的多肽经过至多1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个氨基酸取代。
在另一优选例中，所述的Xaa0是1～3个氨基酸构成的肽段；和/或所述的Xaa19是1～3个氨基酸构成的肽段。
本发明第二方面，提供了一种多肽，其特征在于，所述多肽是SEQ ID NO.:1所示多肽的衍生多肽，且选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1-5个(较佳地1-3，更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有神经保护功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，(a)所述多肽的长度≤28个氨基酸，较佳地，≤25个，更佳地，≤20个。
在另一优选例中，所述的多肽是由SEQ ID NO.:1所示多肽经过1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个氨基酸取代；和/或
经过1-3个，较佳地1-2个氨基酸缺失；和/或
所述多肽的两端分别经过1-5个，较佳地1-4个或1-3个，更佳地1-2个，氨基酸添加形成的。
在另一优选例中，所述的多肽根据表1中“代表性的取代”进行取代。
在另一优选例中，所述的多肽根据表1中“优选的取代”进行取代。
在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70%，较佳地80%，更佳地85%，最佳地90%或95%以上的SEQ ID NO:1的所示多肽的神经保护活性。
在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO:1的同源性≥80%，较佳地≥90%；更佳地≥95%。
本发明还提供了神经保护功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。
在另一优选例中，本发明还提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。
本发明第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(a)权利要求1-5任一的多肽或其药学上可接受的盐；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液，尤其是玻璃体腔内注射)、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。
本发明第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备神经保护或防治与神经细胞损伤疾病的药物。
在另一优选例中，所述的对象是人。
在另一优选例中，所述的神经细胞损伤是与眼部神经细胞损伤的神经细胞损伤。
在另一优选例中，所述的与神经细胞损伤相关疾病的选自下组：眼部神经细胞损伤相关疾病包括急性或慢性视网膜视神经细胞损伤性疾病。。
在另一优选例中，所述的急性或慢性视网膜视神经细胞损伤性疾病包括青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜动静脉阻塞。
在本发明的第五方面，提供了一种加强哺乳动物神经保护的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注射施用
在另一优选例中，所述的对象是人。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了MTS方法检测FK18对RGC-5细胞的存活率。NMDA诱导后细胞存活率下降50%左右，而FK18及BDNF处理后能减少NMDA诱导的细胞凋亡水平，并且FK18的保护作用呈浓度依赖性，10μg/ml浓度时FK18作用达到高峰，增加浓度并不能增强FK18的神经保护作用。数据均来自于三次独立实验，用均数±标准差表示（与对照组相比，***P<0.001，与NMDA组相比，##P<0.01，###P<0.001）
图2A显示了流式细胞分析FK18及BDNF对NMDA诱导RGC-5细胞凋亡的作用Annexin V(+)/PI(-)(第三象限)代表RGC-5细胞早期凋亡，AnnexinV(+)/PI(+)(第四象限)代表晚期凋亡。与空白对照组(a)相比，NMDA(b)能显著增加RGC-5细胞的凋亡，而FK18(c)或BDNF(d)处理后能减少细胞的凋亡。图2B显示了三次独立实验的统计学结果。所有数据都用均数±标准差表示(与空白对照组相比较，***P<0.001，与NMDA组相比较，##P<0.01，###P<0.001)
图3显示了RGC-5细胞的TUNEL染色。TUNEL阳性细胞显示为亮色(实为绿色)，DAPI阳性细胞显示为暗色(实为蓝色)。图3A显示了TUNEl染色检测FK18及BDNF对NMDA诱导RGC-5细胞凋亡的作用。与空白对照组(a)相比，NMDA(b)能显著诱导RGC-5细胞的凋亡水平，而FK18(c)或BDNF(d)处理后能显著减少细胞凋亡。图3B显示了三次独立实验的统计学结果。所有数据都用均数±标准差表达。(与空白对照组相比，***P<0.001，与NMDA组相比较##P<0.01，###P<0.001)
图4显示了FK18对凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。图4A显示了WesternBlot检测。NMDA损害能明显降低Bcl-2的表达而增加Bax的表达。给予FK18或BDNF处理后则能逆转上述NMDA所致改变。图4B显示了三次独立实验结果，用Bcl-2/Bax表示。所有数据都用均数±标准差表达。(与空白对照组相比，***P<0.001，与NMDA相比，#P<0.05，###P<0.001)
图5显示了FK18对p-Akt水平的影响。图5A显示了Western Blot检测。NMDA损伤能提高Akt磷酸化水平，而对总的Akt含量无明显影响。FK18或BDNF处理后能进一步增加Akt磷酸化水平，而对总的Akt水平无明显影响。图5B显示了三次独立实验结果统计学分析，用p-Akt/t-Akt表示。数据都用均数±标准差表示(与空白对照组相比，*P<0.05，与NMDA组相比，##P<0.01,###P<0.001)
图6显示了PI3K抑制剂LY294002能部分逆转FK18的保护作用。图6A显示了MTS检测结果。NMDA能显著减少RGC-5细胞存活率，而加入FK18后则能显著增加细胞存活率。然而经过LY294002预处理后，FK18的保护作用则会减弱。图6B显示了Western Blot检测。NMDA损伤后能提高Akt磷酸化水平，而对总的Akt含量影响不大。FK18能进一步提高Akt磷酸化水平，总Akt水平未见明显变化。LY294002预处理会减少磷酸化Akt表达水平。图6C显示了三次独立实验结果，用p-Akt/t-Akt表示。数据用均数±标准差表达。(与空白对照组相比，*P<0.05，***P<0.001，与NMDA组相比，##P<0.01，###P<0.001)
图7显示了视网膜H&E染色分析。图7A显示了大鼠视网膜显微镜照片。与PBS(a)处理相比，NMDA(b)能减少视网膜神经节细胞层细胞数目，FK18(c)或BDNF(d)能减轻NMDA诱导的损伤。图7B显示了三次独立实验结果的统计学分析，数据都用均数±标准差表达。(与空白对照组相比，***P<0.001，与NMDA相比，##P<0.01，###P<0.001)
图8显示了TUNEL染色显示大鼠视网膜神经节细胞层细胞凋亡数。图8A显示了TUNEL阳性细胞显示为亮色(绿色)而PI阳性显示为暗色(红色)。与PBS(a)处理组相比，NMDA(b)能显著诱导视网膜神经节细胞层细胞的凋亡(b)，而FK18(c)或BDNF(d)处理后能显著减少凋亡细胞数目。图8B显示了三次独立实验结果的统计学分析。所有数据都用均数±标准差表达。(与空白对照组相比，***P<0.001，与NMDA组相比，##P<0.01，###P<0.001)
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF,FGF-2）、具有神经保护活性的，分子量小于5kD的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的多肽FK18，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经体内外NMDA诱导凋亡的RGC细胞进行筛选，获得了一类新型的、具有神经保护作用的小分子多肽，在获得了该多肽的最佳有效浓度，发明人还根据该多肽的序列随机设计了一系列结构相近的衍生氨基酸序列，并证明该多肽的多种衍生多肽也具有神经保护作用。此外，本发明人还通过实验发现，本发明多肽FK18是通过提高p-Akt及Bcl-2蛋白浓度，降低Bax蛋白浓度来实现的。
本发明的多肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,FGF-2)
碱性成纤维细胞生长因子[basic F ib rob2last Grow th Facto r,bFCF]和其它细胞因子一样是哺乳动物和人体中一种非常微量的活性物质,具有广泛的生理功能和重要的临床应用价值。早在1940年Hoffman等人就发现在脑和垂体提取物中富含能刺激成纤维细胞生长的物质。1974年Go spodarow icz及其同事首次分离并纯化该物质,由于它对成纤维细胞有明显的促分裂作用,故将其命名为成纤维细胞生长因子。1986年首次从人的cDNA库中分离出bFGF基因并测定其序列,随后在大肠杆菌、酵母、昆虫及哺乳动物细胞等系统中表达出重组产物,使得bFGF生物功能及临床应用研究得以广泛开展。
bFGF含有155个氨基酸，分子量为17.8kDa。bFGF含有12个β折叠，其中β折叠10和11含有bFGF中肝素结合部位，而β折叠8和9则含有FGFR1结合部位，bFGF与肝素和FGFR1结合后构成FGF-FGFR1-肝素复合物从而激活细胞内信号传导通路。
目前，bFCF被认为能够在血管形成、创伤愈合、软骨修复、神经系统修复等各方面具有作用，当然，也有研究表明bFCF可能还是一种潜在的促进肿瘤生长的因子。
活性多肽
在本发明中，术语“本发明多肽”、“FK18多肽”、“FK18多肽”、“短肽FK18”或“肽FK18”可互换使用，都指具有神经保护活性的肽FK18氨基酸序列(FFFERLESNNYNTYRSRK，如SEQ ID NO:1所示)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有神经保护功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3-4个以内，更佳地为1-2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括FK18多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持神经保护功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)FK18多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3-4个，更佳地至多1-2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
发明还提供FK18多肽的类似物。这些类似物与天然FK18多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
另一方面，本发明还包括对FK18多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。
制备方法
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一优选例中，本发明多肽FK18，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的FK18多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码FK18多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的多肽。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼表、眼周、眼内(尤其是玻璃体腔内)、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂(尤其是玻璃体腔内注射剂)、眼用凝胶和眼药膏。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
例如，眼药水的配制可这样进行：将短肽FK18或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽FK18或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽FK18或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽FK18或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt%，较佳地1-5wt%，每日可2-6次给药，每次1-2滴。
实验动物模型
NMDA诱导凋亡的RGC细胞
本发明采用NMDA诱导凋亡的RGC细胞作为体内外实验的模型。谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，然而细胞外液中高浓度谷氨酸的蓄积则会通过NMDA受体对细胞产生毒性作用。兴奋性神经毒性作用被认为是许多神经疾病的共同发病通路，包括急性缺血性疾病以及慢性神经退行性疾病。过量的谷氨酸激活NMDA受体，使Ca2+大量内流，进而启动细胞内凋亡程序，诱导细胞凋亡。NMDA受体介导的细胞死亡也是多种眼病视网膜神经节细胞死亡的重要因素。因此，实验选择NMDA诱导视网膜神经节细胞层损伤来模拟多种眼部疾病的病理特征。
工业应用性
含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，具有显著的神经细胞保护功能。经动物试验证实，本发明多肽可以保护NMDA诱导凋亡的RGC细胞，提高RGC细胞的存活率，从而获得更佳的神经细胞保护作用。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明多肽FK18的分子量小，可透过眼组织屏障；
(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；
(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；并且眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用；
(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低；
(e)本发明多肽的稳定性好。
因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗神经细胞损伤相关的眼病及相关的其他疾病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1多肽的合成及鉴定
采用市售symphony多肽合成仪合成FK18（序列：FFFERLESNNYNTYRSRK）多肽，并用HPLC及MS方法进行纯化。合成和纯化后，多肽纯度大于95%，-20℃下保存备用。
实施例2FK18对NMDA诱导凋亡后RGC-5细胞存活率及凋亡率的影响：
实验细胞株和材料：
大鼠视网膜神经节细胞株RGC-5(购自复旦大学医学院)；DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司)；BDNF(购自R&D公司)；NMDA(购自Sigma公司)；MTS(购自Promega公司)，用PBS（PH6.0）配成300mmol/L，于-20℃避光保存；AnnexinV-FITC/PI试剂盒(购自Bender Medsystems公司)；DeadEndTM荧光测定TUNEL系统(购自Promega公司)。
统计学分析：
实验数据以表示，使用SPSS19.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分别比较各组细胞存活率及凋亡率情况，以P<0.05为差异有统计学意义。
实验方法：
2.1模型制作及干预试验：RGC-5细胞采用含10%胎牛血清（Fetal bovineserum，FBS）、100U/ml青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养。取对数生长期细胞，调整密度为2-4×104/ml接种于96孔板或是铺有消毒玻片的24孔板中或者6孔板。细胞培养24小时后，更换不含10%胎牛血清的DMEM培养基进行血清饥饿培养24小时。
将RGC-5细胞随机分为空白对照组、NMDA组、NMDA+FK18组、NMDA+bFGF组，每组设6个复孔。
NMDA+FK18组、NMDA+bFGF(阳性对照)组中分别加入不同浓度的FK18（0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml）以及bFGF（100ng/ml），30分钟后，NMDA组、NMDA+FK18组、NMDA+bFGF组加入100μMNMDA，空白对照组加入等体积DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养，24小时后再给予MTS测定或者流式细胞测定或者TUNEL染色。
2.2细胞活性试验（MTS比色法）：接种于96孔板中的细胞经培养处理24小时后，每孔加入20μlMTS溶液，继续培养4小时，在酶联免疫检测仪于490nm处测量各孔的吸光值，并计算细胞相对增值率（Relative Growth Rate,RGR）。公式：RGR=实验组A值/空白对照组A值×100%。
结果：相对于空白对照组（100±5.04%）而言，NMDA组细胞生存率下降一半以上，为47.81±5.46%，bFGF干预能明显提高细胞生存率，为78.18±4.33%。而FK18干预（1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml）细胞生存率较NMDA组提高，分别为：60.2±3.81%，67.58±3.21%，68.18±3.81%。0.1μg/ml FK18干预的细胞组存活率为54.52±6.14%。可见FK18的干预作用呈浓度依赖性，但当其浓度从10μg/ml提高十倍后，效果则并无明显提升，因此，后续的实验中都选择10μg/ml作为FK18的给药浓度。
2.3细胞凋亡试验（Annexin V-FITC/PI试验）：接种于24孔板中的细胞经培养处理24小时后，细胞经消化、离心、去上清后溶于缓冲液中，再向细胞溶液中加入3.8μl Annexin V-FITC和3.8μl PI。细胞在暗室常温环境下放置15分钟，用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。
结果：空白对照组中细胞凋亡较少，为3.99±0.52%，NMDA组细胞凋亡率明显增加，为15.43±0.65%，FK18干预后细胞凋亡率下降，为12.51±0.84%，bFGF干预后的凋亡率为9.71±0.45%。
2.4TUNEL染色：接种于6孔板中的细胞经培养处理24小时后，细胞用4%多聚甲醛在4℃环境下固定25分钟，用0.3%Triton X-100固定5分钟后用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入孵育缓冲液（内含平衡缓冲液、核苷酸混合物和rTdT酶），并在37℃孵育1小时，避免光照。将载玻片浸入2×SSC终止反应。加入PI染细胞核。用荧光显微镜检测定位凋亡细胞的绿色荧光。
结果：空白对照组中TUNEL染色阳性即凋亡的细胞比例较小，为2±1.06%，NMDA组TUNEL染色阳性的细胞明显增多，为44.03±0.96%，FK18干预后的TUNEL染色阳性的细胞比例下降，为38.63±1.15%，bFGF干预后的细胞比例为33.57±0.95%。
结论：
本实验通过NMDA诱导大鼠视网膜神经节细胞株RGC-5凋亡建立细胞凋亡的模型，用不同浓度的FK18多肽进行干预，并从中选择出最适浓度的FK18。通过进行MTS比色法、Annexin V-FITC/PI试验、TUNEL染色等实验方法，对RGC-5细胞的存活率及凋亡率进行分析比较，证实FK18对NMDA诱导的神经细胞损伤有保护作用。
实施例3FK18对NMDA诱导凋亡的大鼠模型中RGC细胞存活率和凋亡率的影响
实验动物和材料：
健康雄性Wistar大鼠，160-220g，8周龄，购自中国医学科学院动物中心。
统计学分析：
实验数据以表示，使用SPSS19.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分别比较各组细胞存活率及凋亡率情况，以P<0.05为差异有统计学意义。
实验方法：
3.1模型制作及干预试验：将Wistar大鼠随机分成3组，依次为NMDA组、NMDA+bFGF（20μg）组、NMDA+FK18（100μg）组，每组8-15只。bFGF或FK18与100nmol的NMDA混合溶于4μlPBS溶液中，注入每组大鼠左眼玻璃体腔内。右眼作为空白对照组，注入等量（4μl）PBS。
3.2大鼠眼球组织病理学观察：各组大鼠均于NMDA及药物干预7天后摘取眼球，立即置于4%多聚甲醛溶液内固定24小时，石蜡包埋，经瞳孔-视乳头轴作矢状切面组织切片（5μm），作常规HE染色。在光学显微镜下计算视网膜神经细胞层细胞数，每只大鼠左眼视网膜神经细胞层细胞数均以响应的右眼作为对照组，计算出左眼细胞数的百分比。
结果：相对于空白对照组（100%）而言，NMDA组视网膜神经节细胞层细胞数目显著下降，为33.33±6.028%，而FK18干预后细胞数目较NMDA组提高，为60.33±5.033%。bFGF干预能明显提高细胞数目，为73.33±5.508%。
3.3TUNEL染色：各组大鼠均于NMDA及药物干预24小时候摘取眼球，石蜡包埋的组织切片，经过脱蜡、洗涤、脱水等步骤后，将组织切片用4%多聚甲醛溶液固定，室温放置15分钟。用20μg/ml蛋白酶K溶液通透组织切片。加入孵育缓冲液（内含平衡缓冲液、核苷酸混合物和rTdT酶），并在37℃孵育1小时，避免光照。将载玻片浸入2×SSC终止反应。加入DAPI染细胞核。用荧光显微镜检测定位凋亡细胞的绿色荧光。
结果：空白对照组中TUNEL染色阳性即凋亡的细胞比例较小，为2.4±1.16%，NMDA组TUNEL染色阳性的细胞明显增多，为62.23±1.87%，FK18干预后的TUNEL染色阳性的细胞比例下降，为52.19±1.86%，这一作用较bFGF干预作用稍差，为43.32±1.84%。
结论：
本实验通过NMDA诱导凋亡的大鼠模型，用FK18多肽进行干预。通过进行视网膜神经节细胞数目的计算、视网膜TUNEL染色等实验方法，对RGC-5细胞的存活率及凋亡率进行分析比较，证实FK18对NMDA诱导的神经细胞损伤有保护作用。
实施例4FK18神经保护作用机制的研究
4.1材料与方法
材料：抗Akt抗体、抗p-Akt抗体、抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体购自CST公司，二抗购自Sigma公司；PI3K抑制剂LY294002购自德国Merk。
a.模型制作及干预试验：RGC-5细胞采用含10%胎牛血清（Fetal bovineserum，FBS）、100U/ml青霉素和链霉素双抗的高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养。取对数生长期细胞，调整密度为2-4×104/ml接种于大皿中。细胞培养24小时后，更换不含10%胎牛血清的DMEM培养基进行血清饥饿培养24小时。
将RGC-5细胞随机分为空白对照组、NMDA组、NMDA+FK18组、NMDA+bFGF组，每组设6个复孔。NMDA+FK18组、NMDA+FK18组以及NMDA+bFGF（100ng/ml），30分钟后，NMDA组、NMDA+FK18组、NMDA+bFGF组加入100M NMDA，空白对照组加入等体积DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养，24小时后进行蛋白水平的测定。
另外，细胞以同样的方法接种于大皿或者96孔板中，将RGC-5细胞随机分为空白对照组、NMDA组、NMDA+FK18组以及FK18+LY294002组。FK18+LY294002组，在加入FK18前2小时在培养基中加入LY294002（20M）。培养24小时后进行western blot检测以及MTS检测。
b.Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白水平的测定（Western Blotting）：
倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，用4℃预冷的PBS洗涤细胞。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。细胞中加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min。裂解完后，收集细胞并离心。蛋白浓度用Bradford方法进行测定。配10%分离胶和4%的浓缩胶。取20μL蛋白样品于干净的1.5mL离心管，经抽提纯化后行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白PBS液封闭PVDF膜。抗Akt、抗p-Akt以及抗Bcl-2、抗Bax一抗（浓度为1:1000）孵育，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（浓度为1:1000）孵育。条带经化学发光试剂显色，Image J软件对条带密度进行分析。actin为内参照,计算Akt、p-Akt以及Bcl-2、Bax的相对含量。
c.细胞活性试验（MTS比色法）：接种于96孔板中的细胞经培养处理24小时后，每孔加入20lMTS溶液，继续培养4小时，在酶联免疫检测仪于490nm处测量各孔的吸光值，并计算细胞相对增值率（Relative Growth Rate,RGR）。公式：RGR=实验组A值/空白对照组A值×100%。
d.统计学分析：实验数据以表示，使用SPSS19.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分别比较各组细胞p-Akt、Akt，Bcl-2、Bax蛋白浓度以及细胞存活率情况，以P<0.05为差异有统计学意义。
4.2.结果
4.2.1.p-Akt、Akt蛋白浓度测定：所有分组Akt蛋白浓度差别无统计学意义，空白对照组p-Akt浓度极低，NMDA组p-Akt浓度有所上升，而FK18及bFGF干预后p-Akt浓度则明显升高。空白对照组p-Akt/Akt为0.16±0.1，NMDA组为0.37±0.07，而FK18干预后该比例高于NMDA组，为0.73±0.09。bFGF干预同样也能提高p-Akt/Akt，为0.88±0.06。
4.2.2.Bcl-2、Bax蛋白浓度测定：Bcl-2浓度在空白对照组较高，NMDA处理后Bcl-2浓度明显下降，FK18及bFGF处理后Bcl-2浓度则有所回升，而Bax浓度在空白对照组较低，NMDA处理后Bax浓度明显升高，FK18及bFGF处理后Bax浓度有所下降。空白对照组Bcl-2/Bax为2.04±0.11，NMDA组为0.33±0.09，而FK18干预后该比例高于NMDA组，为0.66±0.09。bFGF干预同样也能提高p-Akt/Akt，为1.24±0.07。
4.2.3.LY294002对p-Akt、Akt蛋白浓度的影响：空白对照组p-Akt/Akt为0.19±0.06，NMDA组为0.44±0.06，而FK18干预后该比例高于NMDA组，为0.76±0.1。而LY294002干预后该比例则明显下降，为0.56±0.11。
4.2.4.LY294002对细胞活性的影响：相对于空白对照组（100±5.04%）而言，NMDA组细胞生存率显著下降，为47.8±5.46%，而FK18干预后细胞生存率较NMDA组提高，为67.58±3.21%。LY294002干预会抵消FK18的保护作用，降低细胞生存率，为53.77±7.85%。
结论：
本实验通过NMDA诱导大鼠视网膜神经节细胞株RGC-5凋亡建立细胞凋亡的模型，用FK18多肽进行干预，通过进行western blot检测法、MTS比色法等实验方法，对RGC-5细胞中p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax蛋白浓度及细胞生存率进行分析比较，发现了FK18的神经保护机制，即通过提高p-Akt及Bcl-2蛋白浓度，降低Bax蛋白浓度来实现的。
实施例5衍生多肽的制备和鉴定
按实施例1的方法，并根据表1在合理范围内取代、添加或缺失部分氨基酸，并制备了以下多肽，并进行了多肽鉴定：
表2
| 样品 | 序列 | SEQ ID NO.: |
| 衍生多肽1 | LLFERLESNQYNTYRSRK | 2 |
| 衍生多肽2 | FFFEKLESNNYNTYRSK | 3 |
| 衍生多肽3 | FFLDRLDSNNYNSYRSRK | 4 |
| 衍生多肽4 | FFERLETNNYNTYRSR | 5 |
| 衍生多肽5 | FFFEQLESNNYNTYRSRK | 6 |
| 衍生多肽6 | FFFERLESQNYNTYRTKR | 7 |
| 衍生多肽7 | IFFEKLESNNFNTYRSRK | 8 |
| 衍生多肽8 | FFFERIESNNYNTYK | 9 |
| 衍生多肽9 | FFFERLETNNYNSYRTRK | 10 |
| 衍生多肽10 | FFVERLESNNYNTFRSRK | 11 |
| 衍生多肽11 | DECFFFERLESNNYNTYRSRK | 12 |
| 衍生多肽12 | VTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYS | 13 |
| 衍生多肽13 | FFFERLESNNYNTYRSRKYSSWY | 14 |
| 衍生多肽14 | ISEECFFVERLESNNYNTFRSRKF | 15 |
实施例7
对实施例6中的多肽进行活性测试
按实施例2.2所示的方法，测定各FK18各衍生多肽1-14(SEQ ID NO.:2-15)在10ug/ml浓度时对NMDA诱导凋亡的RGC-5细胞存活率的影响，结果如表3所示。
表3
结果表明，上述衍生多肽1-14的处理组中，NMDA诱导凋亡的大鼠模型中RGC细胞数目均有一定上升。可见，表1中在合理范围内取代、添加或缺失部分氨基酸后获得的多肽均能使RGC-5的活性较NMDA组有所提高，因此均具有一定程度的神经保护作用。可以认为，根据本发明多肽在合理范围内进行一定取代、添加或缺失后的衍生多肽，虽然其活性高低各不相同，但几乎均能够具有一定的神经保护作用。
对比例1
取bFGF其他片段的短肽进行实验，其来自bFGF的31-155位，其序列如SEQ ID NO.:16(P1：KTGPGQKAILFLPMSAK)和SEQ ID NO.:17(P2：LYCKNGGFFLRIHPDGRVDG)所示的序列。采用实施例2.2的方法测定在10ug/ml浓度时对NMDA诱导凋亡的RGC-5细胞存活率的影响:
结果：
从结果可见，bFGF其他片段短肽并不具并不对NMDA诱导的RGC-5细胞具有保护作用，因此来源于bFGF的其他短肽并不有神经保护作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa12]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19](I)
式中，
Xaa0是无，或1-5个氨基酸构成肽段；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Lys、Arg、Gln或Asn；
Xaa19是无，或1-5个氨基酸构成肽段；
并且所述的多肽具有神经保护的活性。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽为：
Xaa0是无；
Xaa1是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；
Xaa2是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；
Xaa3是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；
Xaa4是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa5是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa6是选自下组的氨基酸：Leu或Ile；
Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；
Xaa8是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa9是选自下组的氨基酸：Asn或Gln；
Xaa10是选自下组的氨基酸：Asn或Gln；
Xaa11是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa12是选自下组的氨基酸：Asn或Gln；
Xaa13是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；
Xaa14是选自下组的氨基酸：Tyr或Phe；
Xaa15是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa16是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；
Xaa17是选自下组的氨基酸：Arg或Lys；
Xaa18是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；
Xaa19是无；
并且所述的多肽具有神经保护的活性,且所述的多肽经过至多1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个氨基酸取代。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的Xaa0是1～3个氨基酸构成的肽段；和/或所述的Xaa19是1～3个氨基酸构成的肽段。
4.一种多肽，其特征在于，所述多肽是SEQ ID NO.:1所示多肽的衍生多肽，且选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1-5个(较佳地1-3，更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有神经保护功能的由(a)衍生的多肽。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述的多肽是由SEQ ID NO.:1所示多肽经过1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个氨基酸取代；和/或
经过1-3个，较佳地1-2个氨基酸缺失；和/或
所述多肽的两端分别经过1-5个，较佳地1-4个或1-3个，更佳地1-2个，氨基酸添加形成的。
6.一种药物组合物，它含有：
(a)权利要求1-5任一的多肽或其药学上可接受的盐；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液，尤其是玻璃体腔内注射)、眼用凝胶或眼药膏。
8.一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备神经保护或防治与神经细胞损伤疾病的药物。
9.如权利要求8所述用途，其特征在于，所述的与神经细胞损伤相关疾病的选自下组：眼部神经细胞损伤相关疾病包括急性或慢性视网膜视神经细胞损伤性疾病。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的急性或慢性视网膜视神经细胞损伤性疾病包括青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜动静脉阻塞。
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Non-Patent Citations (2)
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