CN103159851B - 预防和抑制炎症的小分子多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防和抑制炎症的小分子多肽及其应用。本发明还涉及所述小分子多肽的制法以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体中保持较高的浓度；合成简单、制备成本低等。

Description

预防和抑制炎症的小分子多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及预防和抑制炎症的小分子多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用，以及含所述多肽的药物组合物。

背景技术

炎症是生物体对外界感染、外伤等损伤自身组织和细胞的一些因素所做的自然反应，牵涉到许多不同的细胞类型、介质和刺激物。急性炎症是一种短期反应，往往促使机体愈合。与之相反，慢性炎症是一种迁延的、功能失调的不良反应。事实上，慢性炎症牵涉到生物体全身及局部的许多病理学状态和疾病的发病机制，前者如脑神经失调，糖尿病，肝炎，风湿性关节炎以及人类不同部位肿瘤的发生；后者如眼葡萄膜炎，角膜炎症等。

流行病学调查显示，作为主要的致盲性眼病之一，葡萄膜炎的发病率及患病率呈上升态势。在美国和欧洲，葡萄膜炎大约占致盲性疾病的5-20％；在发展中国家，这个数字大约为25％。由于葡萄膜炎主要影响青壮年，治疗棘手，易于反复发作，治疗不及时或处理不当易导致失明，因此受到全球眼科学界的重视。

自身免疫性疾病和感染是葡萄膜炎主要的致病因素。当机体发生感染时，体内巨噬细胞被细菌性毒素(如脂多糖等)激活，诱导分泌一系列炎性相关的细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-a、白介素6(IL)-6、(MCP)-1等，这些炎性因子在众多慢性炎性疾病中起到至关重要的作用。

长久以来，皮质类固醇激素是治疗葡萄膜炎的首选药物。尤其在治疗顽固性葡萄膜炎时需长期用药以防止其复发。然而皮质类固醇激素的潜在副作用很多，如易造成高眼压、白内障、感染、伤口延期愈合等，使得药物的临床运用受到限制。免疫抑制剂(如环孢霉素A、FK506等)是抑制炎症的二线药物，同样也有着肝肾损伤等严重的毒副作用。目前利用单克隆抗体等生物制剂(如抗肿瘤坏死因子制剂和白细胞介素受体拮抗剂、抑制淋巴细胞活化制剂、免疫调节和抗炎性细胞因子制剂等)拮抗或封闭与发病相关的淋巴细胞、细胞因子或细胞因子受体，具有一定的治疗效果。然而由于生物制剂属于大分子蛋白，合成困难、价格昂贵，很难进行临床推广。此外，在开发有效的抗炎制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。

首先，眼球内多个解剖和生理性的屏障存在削弱甚至阻遏了许多有效的大分子拮抗剂到达眼内病灶。以最常用的眼表给药途径为例，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体结合的药物才能到达前房发挥作用。如果以口服途径给药，存在于虹膜的血-房水屏障和存在于视网膜-脉络膜的血-视网膜屏障会大大降低进入眼内的药物浓度。

其次，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。

最后，眼科用药的生物利用度很低，要使之提高，必须加大给药的浓度。

因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的安全有效的小分子抗炎制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制炎症反应的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种如式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]

[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]

-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20]-[Xaa21]-[Xaa22]-[Xaa23](I)

式(I)中，

Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Asp、Glu、Cys或Ser；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；

Xaa5是选自下组的氨基酸：His、Arg、Gl、Lys、Arg、Glu或Asp；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Thr、Ser、Lys、Arg、Cys或Ser；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser、Thr、Pro或Ala；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Ile、Leu、Val、Met、Ala或Phe；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Ser、Thr、Glu或Asp；

Xaa10是选自下组的氨基酸：Gln、Asn、Pro或Ala；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Glu、Asp、Pro或Ala；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；

Xaa13是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu或Ile；

Xaa14是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala、Phe、Thr或Ser；

Xaa15是选自下组的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr、Ser、Lys、Gln或Asn；

Xaa16是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；

Xaa17是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala、Phe、Cys或Ser；

Xaa18是选自下组的氨基酸：Glu、Asp、Ala、Val或Ile；

Xaa19是选自下组的氨基酸：Thr或Ser；

Xaa20是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；

Xaa21是选自下组的氨基酸：Pro、Ala、Lys或Arg；

Xaa22是选自下组的氨基酸：Ser、Thr、Asp或Glu；

Xaa23是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制炎症反应的活性。

在另一优选例中，所述多肽长度为22-25个氨基酸。

在另一优选例中，Xaa0和Xaa23为无。

在另一优选例中，Xaa0和Xaa23是1-3个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中，Xaa0选自下组：W、RK、K、LHQ、HQ或Q。

在另一优选例中，Xaa23选自下组：R、RA、RAK。

在另一优选例中，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQIDNO：1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽还包括(c)：将SEQIDNO：1所示氨基酸序列根据人以外物种的NLRC5蛋白中的氨基酸序列进行相应修改而形成的，且具有抑制炎症反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)的SEQIDNO：1的所示多肽的抑制炎症免疫反应的活性。

在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQIDNO：1的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％。

在本发明的第二方面，提供了一种抑制炎症免疫反应的、式I化合物(或其衍生多肽)的二聚体和多聚体形式。

在本发明的第三方面，提供了另一类具有抗炎抗性的多肽，它选自：

(a)具有SEQIDNO：3或5所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQIDNO：3或5所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第四方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明第一方面或第三方面所述的多肽。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(i)本发明第一方面或第三方面所述的多肽或其药学上可接受的盐；和

(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括：(iii)药学上可接受的抗炎或免疫抑制的药物。

在另一优选例中，抗炎或免疫抑制的药物选自下组：

泼尼松、地塞米松、倍氯米松等糖皮质激素药物；水杨酸类、布洛芬、塞来考昔和罗非考昔等非甾体类抗炎药；环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂或眼药膏。

在另一优选例中，所述的组合物为缓解剂型。

在另一优选例中，所述的针剂为球后和眼内注射液。

在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面或第三方面所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，(a)用于制备抑制炎症免疫反应或治疗炎症免疫反应相关疾病的药物；(b)用于制备炎性因子的抑制剂；或(c)用于制备抗感染药物。

在另一优选例中，所述的炎性因子为TNF-α和细胞因子，较佳地，所述的细胞因子为IL-6。

在另一优选例中，所述的与炎症相关疾病的选自下组：自身免疫性眼病、炎症性眼病、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、血清阴性脊柱关节炎、银屑病关节炎、银屑病和炎症性肠病。

在另一优选例中，所述的自身免疫性眼病包括：各类角结膜炎、虹膜睫状体炎症、中间部葡萄膜炎、后部葡萄膜炎、巩膜炎、视网膜脉络膜炎症、增殖性玻璃体视网膜病变；炎症因素参与其致病过程的疾病，包括糖尿病视网膜病变和老年性黄斑变性等。

在本发明的第七方面，提供了一种抑制哺乳动物炎症反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面或第三方面所述的多肽。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述的炎症反应是与葡萄膜炎相关的炎症反应。

在本发明的第八方面，提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：

将(i)本发明第一方面或第三方面所述的多肽或其药学上可接受的盐和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂进行混合，从而形成药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示实施例1中的LS22de鉴定结果，其中，图1a为HPLC鉴定图谱，图1b为MS鉴定图谱。

图2显示LS22对鼠葡萄膜炎具有显著的抑制作用，具体地，图2a显示，与空白对照组比较，LPS注射后的24小时，大鼠前房内渗出细胞计数明显上升，而在LS22给药组种，渗出细胞计数都有明显降低；图2b显示，与空白对照组比较，LPS注射后的24小时，大鼠房水蛋白浓度明显上升，而在LS22给药组种，房水蛋白浓度都有明显降低；图2c为病理组织学检查实验，结果显示，LPS后大鼠前房、睫状体及后段玻璃体腔内有大量细胞渗出；图2d显示，在LS22干预下，组织中炎性细胞数明显减少，抗炎作用明显。

图3显示LS22对TNF-a和IL-6的表达的作用结果，具体地，图3a显示，与空白对照组比较，LPS组细胞上清液中TNF-a水平明显升高，LS22组对LPS诱导的TNF-a水平有明显的抑制作用；图3b显示，与空白对照组比较，LPS组细胞上清液中IL-6水平明显升高，LS22组对LPS诱导的IL-6水平有明显的抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自NLRC5蛋白的、具有抑制炎症反应的，分子量不到3kDa(仅约2.4kDa)的小分子多肽。具体地，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了源自NLRC5蛋白的数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的小肽，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经葡萄膜炎模型、LPS诱导的小鼠巨噬细胞增值模型，获得了一类新型的、具有抗炎症作用的小分子多肽。

本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。

NLRC5和LRR

NLRC5蛋白是核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)家族成员，由caspase聚集区(acaspaserecruitmentdomain，CARD)、核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD)和亮氨酸重复序列(Leucine-richrepeatsdomain，LRR)组成。富亮氨酸重复序列(1eucine-richrepeat，LRR)在富亮氨酸a2糖蛋白中被首次发现并命名的，现已发现LRRs蛋白广泛存在于从病毒、酵母至哺乳动物的各种组织中。大部分富含LRRs的蛋白功能涉及到蛋白配体之间的相互作用。大部分的LRR大约20-30个氨基酸的长度，重复次数在2到52个。这些LRR蛋白被分为7个亚家族。所有的LRR重复序列可以分为高度保守序列和可变区域。高度保守序列由11个氨基酸LxxLxLxxNxL或12个氨基酸LxxLxLxxCxxL构架组成，并形成一个短的β折叠，在这些保守序列中，’L’是Leu、Ile、Val或Phe，‘N’是Asn，、Thr、Ser或Cys，’C’是Cys或Ser。

在含有LRRS序列蛋白中，NLRs代表着一个细胞内PRRs(patternrecognitionreceptors)的大家族，其特征性的含有保守的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD)和亮氨酸重复序列(Leucine-richrepeatsdomain，LRR)，其功能涉及到多种信号通路的激活。现已证实一些NLRs家族蛋白(如NOD1、NOD2、NLRX1和NALP3)一旦遇到特定的病原相关分子模式(PAMPs)就可以诱导信号通路的转导。

活性多肽

LS22多肽来源于核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)家族的成员-NLRC5。在本发明中，术语“本发明多肽”、“LS22多肽”、“LS22小肽”或“肽LS22”可互换使用，都指具有炎症反应抑制活性的肽LS22氨基酸序列(SEQIDNO：1)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制炎症免疫反应功能的、SEQIDNO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。例如，因此SEQIDNO：1的相邻上游残基为W(小鼠)，或LHQ(牛属)。

本发明还包括LS22蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制炎症免疫反应功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)LS22多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

发明还提供LS22多肽的类似物。这些类似物与天然LS22多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码LS22多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列是SEQIDNO：2和SEQIDNO：4，它们分别编码SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示的短肽。

在另一优选例中，本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式，DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。“简并的变异体”在本发明中可以是指编码具有SEQIDNO：1序列的蛋白质，但与SEQIDNO：2中相应编码区序列有差别的核酸序列，或是指编码具有SEQIDNO：3序列的蛋白质，但与SEQIDNO：4中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的LS22核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或LS22多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

另一方面，本发明还包括对LS22DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明多肽LS22，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉(水溶性好)，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的LS22多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码LS22多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；(b)药学上可接受的载体或赋形剂；以及(c)药学上可接受的抗炎或免疫抑制药物的混合制剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有滴眼液、针剂、眼用凝胶和眼药膏。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，眼部滴眼液的配制可这样进行：将短肽LS22或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽LS22或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽LS22或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽LS22或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1～10wt％，较佳地1～5wt％，每日可2～6次给药，每次1～5滴。

工业应用性

含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对炎症免疫反应有显著的抑制活性。经在体动物试验证实，本发明多肽可以抑制LPS诱导的实验性葡萄膜炎的眼内炎症反应。

本发明多肽的主要优点包括：

(a)分子量小，可透过各种眼组织屏障；

(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；

(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；

(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。

因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗炎症性眼病及相关的炎症性疾病，如风湿病、葡萄膜炎等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

小肽LS22的合成及分离鉴定

采用市售的SYMPHONY多肽合成仪(美国ProteinTechnologies公司)合成序列小肽(SEQIDNO：1)。具体步骤如下：

1.根据软件(Version.201版)计算配制所需要的保护氨基酸溶液，和缩合试剂，切割试剂，在仪器相应的瓶里加入足量的DMF(15ml/g)(Dikma)、DCM；

2.在反应器中加入100μmolFMOC-Ala-Wang-Resin；

3.在收集切割液的管道上放如15mg的离心管；

4.编辑程序，一般树脂的溶涨时间是30min，脱保护时间是5min、15min两次、缩合时间是30分钟，切割程序是2h；

5.开机按照程序合成；

6.最后将切割液用乙醚沉淀，离心，吹干，用HPLC纯化；图1显示了小肽LS22的鉴定结果，其中，图1a为HPLC纯化结果，图1b为MS鉴定结果。

7.制得120mg多肽LS22，为白色粉末(水溶性好)，纯度：＞95％。密封，-20℃保存备用。

实施例2

LS22对鼠葡萄膜炎的抑制作用

1.主要材料和仪器

取八周龄的雄性wistar大鼠，wistar大鼠体重160-220g，购自Sino-BrithishSIPPR/BK公司；Whatman滤纸购自Sigma公司；LPS(Escherichiacoli，055：B5购自Sigma公司)。

2.模型制作及干预试验

将八周龄的雄性wistar大鼠随机分成5组，依次为空白+PBS；LPS+PBS组、LPS+LS2210μg组、LPS+LS2250μg组、LPS+LS22100μg组，每组10只。大鼠腹腔内注射0.15ml的戊巴比妥(5.47g/100ml生理盐水)麻醉；治疗组和阳性对照组大鼠右后足垫皮下注射2μg/μl的LPS100μl，空白+PBS组大鼠同一部位注射等量生理盐水。5％的托吡卡胺及1％的丁卡因点眼散瞳并行局部麻醉，在手术显微镜下，行双侧实验眼玻璃腔内注射10μl多肽或同体积PBS，用29-gauge微量注射器在距离角膜缘1mm处垂直穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔，随后在直视下将药液注入大鼠玻璃体腔的中央，针头在玻璃体腔内停留数秒后迅速拔出。以上所有步骤均在无菌条件下进行。

注射部位未见明显液体渗漏，眼科检查未见明显外伤性白内障、玻璃体出血、视网膜出血和视网膜脱离等并发症。注射LPS后24小时，各实验组中6只大鼠在深度麻醉下用30G针头行前房穿刺，收集双侧实验眼房水；另4只大鼠在深度麻醉后行颈椎脱臼处死取眼球固定。

3.检测方法

3.1房水渗出细胞计数及总蛋白浓度检测

房水标本用台盼蓝以1∶5稀释后加入血细胞计数器，光学显微镜下进行人工计数，同时用BCA法进行总蛋白浓度测定。

3.2病理组织学检查

取下眼球，用10％中性甲醛固定，4℃保存。标本以石蜡包埋，近视神经处以5μm厚度做矢状面切片，HE染色，光镜下观察眼球虹膜睫状体、前房、玻璃体和视网膜。由同一病理学医生对前房及玻璃体腔内渗出细胞进行计数。

3.3统计分析

实验数据以表示，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分别比较各组房水渗出细胞数及总蛋白浓度，以P＜0.05为差异有统计学意义。

4.结果

4.1在LS22干预下，大鼠房水中细胞计数和房水蛋白浓度检测

与空白对照组比较，LPS注射后的24小时，大鼠前房内渗出细胞计数、房水蛋白浓度明显升高，而LS22给药组渗出细胞计数(图2a)、房水蛋白浓度都有明显下降(图2b)。

4.2病理组织学检查

病理组织学检查发现注射LPS后大鼠眼球前房、睫状体及后段玻璃体腔内有大量细胞渗出(图2c，箭头所示)，而LS22干预下，组织中炎性细胞数明显减少(图2d)。

结果表明，LS22对鼠葡萄膜炎具有显著的抑制作用。

实施例3

LS226对LPS诱导的体外培养小鼠巨噬细胞的影响

1.材料

小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自中国科学院细胞库，细胞活性检测试剂盒(MTS)购自美国Promega公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

2.细胞活性检测

RAW264.7细胞分别铺到96孔板中，贴壁培养24小时后各孔加入不同浓度多肽共培养24小时，对照组不进行干预。24小时后每孔加入20μl的MTS溶液，继续培养3小时，取出培养板，在490nm处检测各孔的吸光度。

3.细胞上清液TNF-a，、IL-6细胞因子水平检测

接种小鼠RAW264.7细胞于24孔细胞培养板(400μl/孔)。RAW264.7细胞经0.1-10μMLS22预处理30分钟后加入LPS(100ng/mL)共孵育24小时，收集各孔细胞上清液，EHSA试剂盒检测TNF-a，、IL-6水平。

4.统计学分析

实验数据以表示，使用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分别比较各组RAW264.7细胞活性检测结果，TNF-a、IL-6水平，以P＜0.05为差异有统计学意义。

5.结果

5.1LS22干预下细胞活性检测

RAW264.7细胞与LS22共同孵育24小时后，细胞活性检测与对照组比较无统计学差异，未发现对细胞的毒性作用。

5.2LS22抑制LPS诱导RAW264.7细胞TNF-a和IL-6的表达

LPS组RAW264.7细胞上清液中TNF-a和IL-6水平明显升高，而LS22组对LPS诱导的TNF-a(图3a)和IL-6水平有明显的抑制作用(图3b)。

实施例4

眼药水的制备

利用常规技术，混合以下组分，制得1％眼药水，其配方如下：

LS22肽10mg

羟丙基甲基纤维素0.03g

无菌水加至10ml

调节渗透压至300Osm，酸碱度(pH)至6.8-7.1。

经5位志愿者试用一周，每日3次，每次1滴/眼。结果表明，该眼药水可抑制眼部的炎症。

实施例5

其他衍生多肽的制备和活性

制备了以下数种衍生多肽，其中，按实施例1所示的方法制备各个多肽，按照实施例2-3的方法，测定各多肽对眼部炎症的抑制作用，测定结果如下。

多肽1：序列同SEQIDNO：1，其中Xaa8的Ile被Leu替换；

多肽2：序列同SEQIDNO：1，其中Xaa10的Gln被Asn替换；

多肽3：序列同SEQIDNO：1，其中Xaa12的Ser被Thr替换；

多肽4：序列同SEQIDNO：1，其中Xaa15的Tyr被Trp替换；

多肽5：序列同SEQIDNO：1，其中Xaa23为Arg；

多肽6：序列如SEQIDNO：3所示；

多肽7：序列如SEQIDNO：5所示。

结果表明，上述各多肽1-6的处理组(10μg组或10μM)，对LPS诱导的TNF-a和IL-6水平均有明显的抑制作用，具有显著的抗炎症效果。此外，多肽7虽然具有一定抗炎作用，但效果弱于LS22肽(约30％)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种如式I所示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8][Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20]-[Xaa21]-[Xaa22]-[Xaa23](I)

式(I)中，

Xaa0是无；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Leu；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Asp；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Leu；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Ser；

Xaa5是选自下组的氨基酸：His；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Asn；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Ser；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Ile或Leu；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Ser；

Xaa10是选自下组的氨基酸：Gln或Asn；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Glu；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Ser或Thr；

Xaa13是选自下组的氨基酸：Ala；

Xaa14是选自下组的氨基酸：Leu；

Xaa15是选自下组的氨基酸：Tyr或Trp；

Xaa16是选自下组的氨基酸：Leu；

Xaa17是选自下组的氨基酸：Leu；

Xaa18是选自下组的氨基酸：Glu；

Xaa19是选自下组的氨基酸：Thr；

Xaa20是选自下组的氨基酸：Leu；

Xaa21是选自下组的氨基酸：Pro或Ala；

Xaa22是选自下组的氨基酸：Ser；

Xaa23是无，或1个氨基酸构成肽段Arg；

并且所述的多肽具有抑制炎症反应的活性；

并且，所述的多肽为SEQIDNO.:1所示氨基酸序列的多肽，或者所述的多肽为将SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过1或2个氨基酸残基的取代或添加而形成的且具有抑制炎症功能的由SEQIDNO.:1所示多肽衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa0选自下组：W或Q；或Xaa23为R。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组：

(a)SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)多肽1：序列同SEQIDNO:1，其中Xaa8的Ile被Leu替换；或

多肽2：序列同SEQIDNO:1，其中Xaa10的Gln被Asn替换；或

多肽3：序列同SEQIDNO:1，其中Xaa12的Ser被Thr替换；或

多肽4：序列同SEQIDNO:1，其中Xaa15的Tyr被Trp替换；或

多肽5：序列同SEQIDNO:1，其中Xaa23为Arg。

4.一种多肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.:3或5所示。

5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1-4所述的多肽。

6.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(i)权利要求1-4所述多肽或其药学上可接受的盐；和

(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂或眼药膏。

8.权利要求1-4所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，(a)用于制备抑制炎症免疫反应或治疗炎症免疫反应相关疾病的药物；(b)用于制备炎性因子的抑制剂；或(c)用于制备抗感染药物。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与炎症相关疾病的选自下组：自身免疫性眼病、炎症性眼病、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、血清阴性脊柱关节炎、银屑病关节炎、银屑病和炎症性肠病。

10.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将(i)权利要求1-4所述的多肽或其药学上可接受的盐和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂进行混合，从而形成药物组合物。