CN102838660B - 一种抑制炎症免疫反应的小肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制炎症免疫反应的小肽及其应用。本发明还涉及所述小分子多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体中保持较高的浓度；合成简单、制备成本低等。

Description

一种抑制炎症免疫反应的小肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种抑制炎症免疫反应的小分子多肽，所述小肽是源于血栓调节蛋白的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。

背景技术

炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症反应使血液中产生大量的促炎性细胞因子(proinflammatorycytokines)，如IL-1，TNF-α，IFN-γ，IL-6等，刺激内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞等活化，合成和分泌蛋白及细胞因子，参与炎症反应的各个阶段，如血管扩张，血管通透性增高，炎症细胞粘附、迁移及趋化，新生血管形成等过程。在此过程中，白细胞也通过释放蛋白水解酶、大量炎症介质和氧自由基等促进炎症反应，使病情加重，造成组织损伤。

眼部炎症，如感染、过敏反应、自身免疫病等病理过程中一突出特征就是大量白细胞快速地向病变部位聚集，导致促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子之间稳态失衡，使组织遭到破坏。这也是许多全身性疾病炎症反应的重要病理特征，包括全身感染性疾病、风湿性疾病、肿瘤生长等。

葡萄膜炎是一类眼部最常见的眼病，由于其主要影响青壮年，治疗棘手，易于反复发作，治疗不及时或处理不当易导致盲目，因此受到全球眼科学界的重视。随着对葡萄膜炎认识的不断加深，现在它被认为是发生于葡萄膜、视网膜、视网膜血管、玻璃体的炎性疾病，甚至包括视乳头的炎性疾病，已被等同于眼内炎性疾病。

目前葡萄膜炎治疗主要是依靠局部和/或全身使用糖皮质激素和免疫抑制剂。这些药物通常可发挥较好的疗效，但由于此类疾病的复发性和顽固性，长期反复使用此类药物可能引起眼压升高、白内障、眼内炎、骨质疏松、肝肾功能损伤、糖尿病等严重并发症，并可影响机体对病原体的正常免疫功能。故临床上亟需一些特异性针对病理机制的，对正常免疫系统和全身器官无明显毒副作用的有效的治疗方法。

近年来，一些新生物制剂显示了治疗的有效性，主要为阻断重要炎症因子TNF-α的拮抗剂。抗TNF-α抗体-英利昔单抗(Infliximab)以及可溶性TNF受体-依那西普(Etanercept)，均可有效抑制眼部炎症和血管炎症，部分提高患者的视功能，目前被用于治疗 病等引起的葡萄膜炎。

血栓调节蛋白(Thrombomodulin，TM)具有明确的抗炎特性：TM可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的小鼠巨噬细胞IκB磷酸化和NF-κB活化，缓解LPS诱导的炎症损伤，发挥抗炎作用；TM的C型凝集素样结构域可通过抑制NF-κB和MAPK信号途径，减少粘附分子表达而干扰中性粒细胞粘附，达到保护血管和组织的作用。

虽然抗TNFα等这类药物与传统药物相比，毒性更小，作用靶点更明确，但是目前还存在很多局限性。首先，由于细胞因子的多样性，在自身免疫性疾病中的效应也尽相同，因此对细胞因子的干预治疗比较复杂。如小胶质细胞产生的TNF-α具有调节细胞周期和代谢的作用，对神经系统发育有重要的作用；它还可上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x表达，保护神经元；因此抗TNF-α抗体可能具有加重脱髓鞘疾病、双侧前部视神经病变、肺结核等严重副作用。其次，眼球是人体的一个特殊的免疫豁免器官，当反复的眼部炎症破坏血眼屏障，上述外源性的大分子蛋白药物多次进入眼球，可能会诱发抗原抗体反应，触发或加重眼部炎症损伤。其次，重组的生物大分子半衰期较短，全身使用到达眼部的量有限；而局部治疗可因血眼屏障的影响而受限。最后，这些生物治疗药物合成复杂、对生物技术下游工艺和生产要求高，因此价格昂贵，对广泛应用形成一定的障碍。

因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子炎症免疫反应抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于眼球组织的安全有效的可抑制炎症免疫反应的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-

[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-

[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19] (I)

式中，

Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Trp、Phe或Tyr；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Gln、Asn、Arg、Ala、Lys或Pro；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Gln或Asn；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Cys、Tyr或Ser；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu、Lys、Ala或Asp；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Val、Ile、Met、Phe、Ala或Leu；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Lys、Gln、Asn、Glu或Arg；

Xaa10是选自下组的氨基酸：Ala、Leu、Ile或Val；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Asp或Glu；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Gly、Pro或Ala；

Xaa13是选自下组的氨基酸：Phe、Val、Ile、Tyr、Ala或Leu；

Xaa14是选自下组的氨基酸：Leu、Val、Met、Ala、Phe或Ile；

Xaa15是选自下组的氨基酸：Cys或Ser；

Xaa16是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa17是选自下组的氨基酸：Phe、Val、Ile、Ala、Tyr或Leu；

Xaa18是选自下组的氨基酸：His、Asn、Gln、Lys或Arg；

Xaa19是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制炎症免疫反应的活性，且所述多肽的长度为18-24个氨基酸。

在另一优选例中，所述多肽长度为18-21个氨基酸。

在另一优选例中，Xaa0和Xaa19为无。

在另一优选例中，Xaa0是1-3个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中，Xaa0选自下组：I、PI、EPI、EPV、EPQ、EPS和EPA；更佳地，Xaa0选自下组：I、PI、EPI。

在另一优选例中，Xaa19是1-3个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中，Xaa19选自下组：F、FP、FPA。

在另一优选例中，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1-6个(较佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽还包括(c)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列根据人以外物种的血栓调节蛋白(TM)中的氨基酸序列进行相应修改而形成的，且具有抑制炎症免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70％的SEQ ID NO：1的所示多肽的抑制炎症免疫反应的活性。

在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO：1的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％。

本发明还提供了抑制炎症免疫反应的、式I化合物(或其衍生多肽)的二聚体和多聚体形式。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明第一方面所述的多肽。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(a)本发明第一方面所述多肽或其药学上可接受的盐；

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括：

(c)药学上可接受的抗炎或免疫抑制的药物。

在另一优选例中，抗炎或免疫抑制的药物选自下组：泼尼松、地塞米松、倍氯米松等糖皮质激素药物；水杨酸类、布洛芬、塞来考昔和罗非考昔等非甾体类抗炎药；环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为眼药水，注射针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。

在另一优选例中，所述药物组合物为缓释剂型。

在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被制备用于抑制炎症性免疫反应或防治与炎症免疫反应相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述的与炎症免疫反应相关疾病的选自下组：与免疫反应相关疾病的选自下组：自身免疫性眼病、炎症性眼病、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、血清阴性脊柱关节炎、银屑病关节炎、银屑病和炎症性肠病等。

在另一优选例中，所述的自身免疫性眼病包括各类角结膜炎、虹膜睫状体炎症、中间部葡萄膜炎、后部葡萄膜炎、巩膜炎、视网膜脉络膜炎症、增殖性玻璃体视网膜病变；炎症因素参与其致病过程的疾病，包括糖尿病视网膜病变和老年性黄斑变性等。

在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物炎症反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述的炎症免疫反应是与葡萄膜炎相关的炎症反应。

附图说明

图1显示了WH18多肽的HPLC分析结果，WH18洗脱峰位于12.449分钟，纯度为96.46％。

图2显示了WH18多肽的质谱分析结果，WH18分子量2198.42，纯度大于95％。

图3显示了对照组(control)、LPS组、LPS+DX(地塞米松)组、LPS+WH18组干预后大鼠的前节检验结果。LPS组的前房瞳孔区有大量纤维渗出，导致瞳孔膜闭；而WH18组和DX干预组中仅可见虹膜血管充血明显，但未见明显渗出膜。

图4显示了对照组、LPS组、LPS+DX组、LPS+WH18组处理大鼠后虹膜睫状体处组织切片结果。WH18干预组在前房角的细胞渗出较LPS组明显减少；并且WH18组的视乳头前细胞浸润也较LPS组明显好转；而空白对照组中未见到任何细胞浸润。

图5显示了对照组、LPS组、LPS+DX组、LPS+WH18组中，LPS造模后房水蛋白和房水中细胞渗出结果。

图5a中，LPS组房水蛋白含量为22.09±0.49mg/ml。当给予WH18或地塞米松干预后，房水中蛋白水平明显降低，较LPS组有显著差异。

图5b中，WH18组和地塞米松组房水中细胞渗出数量较LPS组明显减少。

图6显示了对照组、LPS组、LPS+DX组、LPS+WH18组分别在LPS造模后TNF-α和MCP-1浓度结果。

图6a显示WH18组房水中TNF-α较LPS组明显减少(p＜0.01)，同时与地塞米松组和对照组无统计学差异。

图6b显示MCP-1浓度检测显示虽然WH18组与地塞米松组和对照组比较有明显差异，但它较LPS组浓度明显下降。

图7显示了LPS和不同浓度WH18对细胞活力的影响。0.1μM、1μM和10μM WH18的MTS吸光度分别在统计学上与对照组无差异，LPS对RAW264.7细胞活力也无明显影响。但50μMWH18对细胞活力有明显地抑制作用。

图8显示了TNF-α和IL-6实时PCR检测结果。

图8a显示了LPS诱导6小时后，1μM组和10μM组TNF-αmRNA的表达较LPS组明显降低，0.1μM组无明显抑制TNF-α转录的作用。

图8b显示，1μM组和10μM组WH18可明显抑制IL-6炎症因子转录，而0.1μM组与LPS组无明显差异。

图9显示了培养基细胞因子TNF-α和IL-6在蛋白水平检测结果。

图9a显示了1μM组和10μM组WH18的TNF-α水平较LPS组明显降低，而0.1μM WH18TNF-α水平较LPS组无明显差异(P＞0.05)。

图9b显示，在IL-6方面，1μM组和10μM组较LPS组明显减少，而0.1μM组无明显抑制IL-6的作用。

图10显示了细胞免疫荧光结果。10μM WH18可明显抑制细胞内NF-κB活化后向细胞核内转位，而LPS组中可见细胞核中有大量的红色荧光的NF-κB聚集。

图11显示了SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的大鼠房水分析结果。

图11a显示SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4不能抑制房水蛋白渗出。

图11b显示SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4无明显细胞浸润的作用。

图12显示了衍生多肽1-6显著抑制了细胞的炎症免疫反应

图12a显示衍生多肽1-6显著抑制了造模后房水蛋白的渗出。

图12b显示衍生多肽1-6显著抑制了造模后房水细胞的渗出。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自血栓调节蛋白的、具有抑制炎症免疫反应功能的，分子量小于5KD(约2198D)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，选定了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经实验性内毒素诱导的葡萄膜炎模型筛选，获得了一类新型的、具有抑制眼部炎症免疫反应功能的小分子多肽。

本发明的小肽分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。

活性多肽

在本发明中，术语“本发明多肽”、“WH18多肽”、“WH18小肽”或“肽WH18”可互换使用，都指具有炎症反应抑制活性的肽WH18氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制炎症免疫反应功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-6个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。

例如，血栓调节蛋白中SEQ ID NO.：1的相邻上游残基为EPI(人)，或EPI和EPS(哺乳动物)，相邻下游序列为FPA(人)。

本发明还包括WH18蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制炎症免疫反应功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)WH18多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多6个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

发明还提供WH18多肽的类似物。这些类似物与天然WH18多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码WH18多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列是TGGGAGGAGCAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGATGGCTTCCTCTGCGAGTTCCAC(SEQ ID NO：2)。它编码SEQ ID NO：1所示的短肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：1序列的蛋白质，但与SEQ ID NO：2中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的WH18核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或WH18多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞

另一方面，本发明还包括对WH18DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明多肽WH18，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸用来表达或生产重组的WH18多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码WH18多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；(b)药学上可接受的载体或赋形剂；以及(c)药学上可接受的抗炎或免疫抑制药物的混合制剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有滴眼液、针剂、眼用凝胶和眼药膏。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，眼部滴眼液的配制可这样进行：将短肽WH18或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽WH18或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽WH18或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽WH18或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1～10wt％，较佳地1～5wt％，每日可2～6次给药，每次1～5滴。

工业应用性

含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对炎症免疫反应有显著的抑制活性。经在体动物试验证实，本发明多肽可以抑制内毒素诱导的实验性葡萄膜炎的眼内炎症反应。

本发明多肽的主要优点包括：

(a)分子量小，可透过各种眼组织屏障；

(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；

(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；

(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低。

因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗炎症性眼病及相关的炎症性疾病，如风湿病、葡萄膜炎等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

多肽的合成

采用市售的SYMPHONY多肽合成仪合成序列为SEQ ID NO：1所示的WH18多肽。步骤如下：

1.根据软件计算配制所需要的保护氨基酸溶液，和缩合试剂，切割试剂，在仪器相应的瓶里加入足量的DMF、DCM。

2.在反应器中加入100μmol FMOC-Ala-Wang-Resin。

3.在收集切割液的管道上放入15mg的离心管。

4.编辑程序，一般树脂的溶涨时间是30min，脱保护时间是5min、15min两次、缩合时间是30min，切割程序是2h。

5.开机按照程序合成。

6.最后将切割液用乙醚沉淀，离心，吹干，用HPLC纯化。

制得120mg多肽WH18，为白色粉末(水溶性好)，纯度：＞95％。密封，-20℃保存备用。

实施例2

小肽WH18的鉴定及保存

1.取少量成品小肽WH18，做HPLC分析的纯度鉴定和质谱鉴定。

2.HPLC分析条件：

A液为超纯水(含0.1％三氟乙酸)，B液为乙腈(含0.1％三氟乙酸)。使用Kromasil公司的100-5C₁₈(4.6mm×250mm)进行梯度分析：B液10％-50％，流速1ml/min，时间共16min。

质谱分析条件：A液为超纯水(含0.1％甲酸)，B液为乙腈(含0.1％甲酸)。流速0.2ml/min，时间共1min。

3.HPLC结果：

WH18的洗脱峰位于12.449分钟，纯度为96.46％(图1)；

质谱分析结果：

WH18的分子量2198.42，纯度大于95％(图2)。

4.将白色粉末状的各小肽，密封包装，-20℃保存。

实施例3

WH18对内毒素诱导的实验性葡萄膜炎的作用

1.材料和主要仪器设备：wistar大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；内毒素(LPS，E.coli 055：B5)购自Sigma公司；TNF-α、MCP-1ELISA试剂盒购自R&D公司。

2.模型制作及干预试验：将大鼠随机分成3组(n＝6)，依次为空白对照组、LPS造模组、40μgWH18玻璃体注射干预组、10μg地塞米松玻璃体注射干预组。大鼠给予腹腔注射5％戊巴比妥0.4ml/100g体重全身麻醉后，复方托比卡胺和丁卡因局部扩瞳和表麻。用胰岛素注射针抽取40μg/10μl WH18溶液，在手术显微镜下，从角巩缘附近避开血管进针，玻璃体腔内明确窥见注射针头后，缓慢注入小肽溶液，停留10秒后，缓慢拔出针头。30min后，用酒精棉球擦拭大鼠后足足底，用胰岛素针头注射200μg/100μl LPS溶液。

3.房水采集和检测：24小时后，麻醉动物后，给予手术显微镜照相。随后用微量注射器在角膜旁中央区穿刺，缓慢抽取双眼房水，放入EP管碎冰中存储，当天给予房水细胞因子水平(TNFα和MCP-1ELISA试剂盒)、蛋白浓度检测和炎症细胞计数。ELISA检测完全根据试剂盒说明书完成；蛋白浓度应用考马斯亮蓝(Bradford)法测定；细胞计数用台盼蓝染液稀释5倍后，在显微镜下用细胞计数板计数。

4.组织学分析：动物LPS注射24小时后，麻醉，摘取完整眼球，简单分离球壁筋膜后，立即放入特殊固定液中室温固定48小时，后通过石蜡切片和HE染色，分析虹膜睫状体和视网膜(尤其视乳头处)炎症细胞渗出情况。

5.统计分析：实验数据以±s表示，使用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析(one-wayANOVA)分别比较各组房水中炎症细胞和蛋白渗出情况，组织中炎症细胞渗出水平。以P＜0.05为差异有统计学意义。

6.组织学切片结果：

大鼠前节照片显示LPS组动物的前房瞳孔区有大量纤维渗出，导致瞳孔膜闭；而WH18组和地塞米松干预组中仅可见虹膜血管充血明显，但未见明显渗出膜(图3)。

虹膜睫状体处组织切片显示，WH18干预组在前房角的细胞渗出较LPS组明显减少；并且WH18组的视乳头前细胞浸润也较LPS组明显好转(图4)；而空白对照组中未见到任何细胞浸润。

7.房水总蛋白和细胞测定：

LPS造模24小时后，LPS组房水蛋白含量为22.09±0.49mg/ml。当给予WH18或地塞米松干预后，房水中蛋白水平明显降低，分别为14.15±0.95mg/ml和10.31±0.53mg/ml，较LPS组有显著差异(p＜0.01)(图5a)。同样地，WH18组和地塞米松组房水中细胞渗出数量(8.65±1.52×10⁵/ml和2.02±0.34×10⁵/ml)较LPS组(19.9±4.12×10⁵/ml)明显减少(p＜0.01)(图5b)。

8.房水细胞因子检测：

单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和TNF-α是炎症细胞活化和募集重要的细胞因子。

ANOVA分析显示WH18组房水中TNF-α(109.9±45.20pg/ml)较LPS组(458.5±94.03pg/ml)明显减少(p＜0.01)，同时与地塞米松组(19.59±16.14pg/ml)和对照组(2.8±0.28pg/ml)无统计学差异(p＞0.05)(图6a)。

MCP-1浓度检测显示虽然WH18组(53.0±12.4pg/ml)与地塞米松组(25.2±4.02pg/ml)和对照组(14.8±3.96pg/ml)比较有明显差异(p＜0.01)，但它较LPS组(114.4±8.38pg/ml)浓度明显下降(P＜0.01)，提示WH18可明显抑制促炎症性细胞因子的分泌(图6b)。

9.结论：

本实例通过从多方面显示了WH18短肽可明显地抑制实验性葡萄膜炎大鼠房水中蛋白的渗出、眼组织中炎症细胞的浸润，并且可减低眼内促炎症细胞因子的分泌，明显缓解眼部炎症。虽然WH18短肽的抗炎效果弱于经典的糖皮质激素(地塞米松)，但由于后者长期使用会导致激素性青光眼、药物性白内障，甚至骨质疏松、糖尿病等严重的全身副作用，因此具有特异抗炎活性的、良好生物相容性的、易通透的小分子多肽(WH18)在抑制炎症方面独特的优势和前景。

实施例4

WH18对RAW264.7小鼠巨噬细胞的抗炎作用

1.材料和主要仪器设备：

RAW264.7小鼠巨噬细胞株购自上海中科研细胞所；内毒素(LPS，E.coli055：B5)购自Sigma公司；CellTiter AQueous One S olution Cell ProliferationAssay(MTS)购自Promega公司。

2.细胞培养：

RAW细胞用高糖DMEM培养在37℃培养箱中孵育；细胞以不同浓度接种后，用含10％胎牛血清的培养基孵育24小时，密度约70～80％；随后给予无血清培养基饥饿24小时后，用100ng/ml LPS和不同浓度WH18处理各组细胞。

3.MTS细胞活力检测：

细胞以1×10⁵/孔接种于96孔板，分PBS组，LPS 100ng/ml组，WH180.1μM组，WH181μM组，WH1810μM组，WH1850μM组，每组做6个复孔，LPS或短肽处理24小时后，每孔加入20μl MTS溶液，37℃避光孵育3小时后，在酶标仪490nm处检测吸光度。

4.细胞Real-Time PCR检测：

细胞以5×10⁵/孔接种于6孔板，分PBS组，LPS组，LPS+WH180.1μM组，LPS+WH181μM组，LPS+WH1810μM组，每组做3个复孔。6小时后，去除细胞培养基，用预冷的PBS洗涤后彻底吸干，加入500μl Invitrogen Trizol裂解，进行RT-PCT检测TNF-α、IL-6和GAPDH核苷酸水平。

5.细胞培养基ELISA检测：

细胞以5×10⁵/孔接种于24孔板，分PBS组，LPS组，LPS+WH180.1μM组，LPS+WH181μM组，LPS+WH1810μM组，每组做3个复孔。24小时后，收集的培养基以16000g×10min×4℃高速离心后，收集上清，-80℃保存，用于TNF-α、IL-6检测。

6.NF-κB检测：

细胞以2×10⁴/mL接种于预置有载玻片的24孔板中，分PBS组，LPS组，LPS+WH1810μM组，37℃孵育60min后，取出载玻片，用预热的TBS洗涤5min三次，甲醛/丙酮(1∶1)固定20min，TBS洗涤5min三次，再用0.2％TritonX-100通透10min、正常山羊血清封闭，兔抗小鼠NF-κB抗体4℃孵育过夜，再用荧光二抗及细胞核荧光染料染色后，共聚焦显微镜下观察。

7.统计分析：

实验数据以±s表示，使用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分别比较各组房水中炎症细胞和蛋白渗出情况，组织中炎症细胞渗出水平。以P＜0.05为差异有统计学意义。

8.结果

8.1MTS细胞活力检测结果。

图7显示0.1μM、1μM和10μM WH18的MTS吸光度分别为0.65±0.058，0.65±0.029，0.64±0.049，统计学上与对照组(0.63±0.037)无差异(p＞0.05)，100ng/mL LPS(0.61±0.027)对RAW264.7细胞活力也无明显影响(p＝0.297)。但50μM WH18(0.50±0.024)对细胞活力有明显地抑制作用，提示可能存在细胞毒性。

8.2实时PCR检测结果。

TNF-α和IL-6是急性炎症早期关键的促炎症因子。

图8a显示，LPS诱导6小时后，1μM组和10μM组TNF-αmRNA POWER值(26.89±3.28和16.95±3.55)较LPS组(37.42±2.63)明显降低，0.1μM组(35.46±2.37)无明显抑制TNF-α转录的作用。

图8b显示，1μM组(1042.8±119.07)和10μM组(570.21±142.42)可明显抑制IL-6炎症因子转录(p＜0.01)，而0.1μM组(1796.7±41.63)与LPS组(1943.7±75.33)无明显差异。

8.3培养基细胞因子检测结果。

进一步检测TNF-α和IL-6在蛋白水平的合成和释放。

图9a显示，1μM组和10μM组TNF-α水平(259.67±25.66pg/ml和208.00±6.00pg/ml)较LPS组(314.33±3.51pg/ml)明显降低(*p＜0.05，**p＜0.01)，而0.1μM WH18TNF-α水平(307.00±2.00pg/ml)较LPS组无明显差异(P＞0.05)。

图9b显示，在IL-6方面，1μM组(321.00±8.48pg/ml)和10μM组(287.50±10.61pg/ml)也较LPS组(358.50±2.12pg/ml)明显减少(**p＜0.01)，而0.1μM组(352.50±3.54pg/ml)无明显抑制IL-6的作用(p＞0.05)。

8.4细胞免疫荧光结果。

图10显示10μM WH18可明显抑制细胞内NF-κB活化后向细胞核内转位，而LPS组中可见细胞核中有大量的红色荧光的NF-κB聚集，提示WH18可抑制核转录因子诱发炎症因子的合成。

9.结论：

从细胞实验结果发现，WH18可抑制炎症因子在细胞内的转录、合成，并呈剂量依赖性；并且通过对转录因子的初步研究提示，WH18可能通过抑制LPS诱导的细胞内核因子的向细胞核内转位，继而抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的转录和释放，进而发挥抗炎作用。

实施例5

无抗炎作用的血栓调节蛋白的多肽片段

从血栓调节蛋白(TM)的C型凝集素样结构域中截取SEQ ID NO：3(LRGFQWVTGDNNTSYSRW)和SEQ ID NO：4(VGRRRLWIGLQL)，重复实施例1、2、3，对大鼠房水分析发现，与WH18来自同一C型凝集素样结构域的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4无明显地抑制房水蛋白渗出(见图11a)和细胞浸润的作用(见图11b)，提示这两个序列无明显的抗炎作用。

实施例6

衍生多肽的制备和活性

按照实施例1的方法制备以下衍生多肽，测定各WH18衍生多肽对炎症免疫反应的的抑制作用。

衍生多肽1：序列同SEQ ID NO：1，其中第4位Gln被Asn替换；

衍生多肽2：序列同SEQ ID NO：1，其中第8位Val被Leu替换；

衍生多肽3：序列同SEQ ID NO：1，其中第14位Leu被Ile替换；

衍生多肽4：序列同SEQ ID NO：1，其中第17位Phe被Tyr替换；

衍生多肽5：序列同SEQ ID NO：1，其中第1位之前添加EPI(Glu Pro Ile)；

衍生多肽6：序列同SEQ ID NO：1，缺失了第8位的Val。

结果(图12)表明，显示了衍生多肽1-6显著抑制了细胞的炎症免疫反应。图12a为造模后空白对照、阳性对照DX、PBS以及各衍生多肽1-6对房水蛋白渗出的抑制结果。图12b为造模后空白对照、阳性对照DX、PBS以及各衍生多肽1-6对房水细胞渗出的抑制结果。

实施例7

按照实施例1的方法制备衍生多肽7，并测定衍生多肽7对炎症免疫反应的的抑制作用。

衍生多肽7：序列同SEQ ID NO：1，缺失第18位His。

衍生多肽8：序列同SEQ ID NO：1，其中在第1位之前添加I(Ile)。

结果表明，衍生多肽7和衍生多肽8显著抑制了细胞的炎症免疫反应。与对照相比，其对房水细胞渗出抑制率均大于45％。

实施例8

眼药水的制备

利用本领域技术人员熟知的常规技术，混合以下组分，制得1％眼部滴眼液，其配方如下：

WH18肽 10mg

羟丙基甲基纤维素 0.03g

无菌水 加至10ml

调节渗透压至300Osm，pH至6.8-7.1。

经3位志愿者试用一周，每日2次，每次2滴/眼。结果表明该滴眼液可以抑制眼部炎症反应。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种下式I表示的多肽

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19] (I)

式中，

Xaa0是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Trp或Tyr；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Gln或Asn；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Gln或Asn；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Cys或Ser；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Val或Leu；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Lys或Arg；

Xaa10是选自下组的氨基酸：Ala或Val；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Asp或Glu；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Gly或Ala；

Xaa13是选自下组的氨基酸：Phe或Leu；

Xaa14是选自下组的氨基酸：Leu或Ile；

Xaa15是选自下组的氨基酸：Cys或Ser；

Xaa16是选自下组的氨基酸：Glu或Asp；

Xaa17是选自下组的氨基酸：Phe、Tyr或Leu；

Xaa18是选自下组的氨基酸：His或Arg；

Xaa19是无，或1-3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制炎症免疫反应的活性，且所述多肽的长度为18-24个氨基酸；

并且所述多肽选自下组：

(a)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)衍生多肽1：序列同SEQ ID NO:1，其中第4位Gln被Asn替换；

(c)衍生多肽2：序列同SEQ ID NO:1，其中第8位Val被Leu替换；

(d)衍生多肽3：序列同SEQ ID NO:1，其中第14位Leu被Ile替换；

(e)衍生多肽4：序列同SEQ ID NO:1，其中第17位Phe被Tyr替换；和(f)衍生多肽5：序列同SEQ ID NO:1，其中第1位之前添加EPI。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。

3.一种多肽，其特征在于，所述多肽选自下组：

(i)衍生多肽6：序列同SEQ ID NO:1，缺失了第8位的Val；

(ii)衍生多肽7：序列同SEQ ID NO:1，缺失第18位His；和

(iii)衍生多肽8：序列同SEQ ID NO:1，其中在第1位之前添加I。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1或3所述的多肽。

5.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(a)权利要求1或3所述多肽；

(b)药学上可接受的赋形剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。

7.权利要求1或3所述的多肽的用途，其特征在于，用于制备用于抑制炎症免疫反应或治疗炎症免疫反应相关疾病的药物，其中，所述的与免疫反应相关疾病的选自下组：自身免疫性眼病、炎症性眼病、类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、血清阴性脊柱关节炎、银屑病关节炎、银屑病和炎症性肠病。