CN102205114B

CN102205114B - 促红细胞生成素来源肽在制备治疗神经系统自身免疫性疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN102205114B
Application number: CN 201110111406
Authority: CN
Inventors: 张志仁; 罗邦伟; 吴玉章
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: CN102205114A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及促红细胞生成素来源肽在制备治疗神经系统自身免疫性疾病的药物中的应用，通过促红细胞生成素来源肽及促红细胞生成素来源肽脂质体治疗神经系统自身免疫性疾病，发现治疗后大鼠的神经系统自身免疫性疾病运动能力恢复，肢体反射能力得到明显提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，更重要的是，促红细胞生成素来源肽脂质体的作用优于促红细胞生成素来源肽，且给药频率可以明显减少，并且促红细胞生成素来源肽及促红细胞生成素来源肽脂质体在使用期间，均不诱导造血功能。

Description

促红细胞生成素来源肽在制备治疗神经系统自身免疫性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及促红细胞生成素来源肽在制备治疗神经系统自身免疫性疾病中的应用。

背景技术

神经系统自身免疫性疾病包括外周和中枢神经系统自身免疫性疾病，其中急性外周神经自身免疫性疾病在临床称为格林-巴利综合征，其国际公认的常用动物模型为实验性自身免疫性神经炎(EAN)。而中枢自身免疫性疾病在临床称为多发性硬化综合症，其常用动物模型为EAE。

格林-巴利综合征(Guillain-Barre’Syndrome，GBS)，又称急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)，是一种外周神经系统的自身免疫性脱髓鞘性病变，为威害人们健康的常见疾病之一。该病通常急性起病，渐进性发展，患者常诉渐进性无力，肢体瘫痪往往始于下肢，然后逐渐上升，可有某些感觉障碍，可累及呼吸肌而致命。该疾病治疗通常有支持治疗(呼吸机支持等)、主动治疗(血浆置换和免疫球蛋白静脉滴注)和康复治疗，但在治疗后有4-15％患者死亡，20％左右患者在病后1年瘫痪，多数患者在病后长期感觉乏力。因此需要加强新治疗药物的开发。

目前认为GBS是由CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病，细胞因子通过改变Th1/Th2型细胞之间的平衡，主要是增强Th1型细胞的作用，在疾病的发生发展中起着重要的作用。实验性自身免疫性神经炎(EAN)是一类T细胞介导的周围神经系统自身免疫性疾病，其临床表现、免疫学发病机制、神经电生理及病理学改变诸多方面与人类GBS非常相似，是目前常用的研究GBS发病机制和治疗的动物模型。

多发性硬化(Multiple Sclerosis，M S)是以中枢神经系统(CentralNervous Sy stem，CNS)白质脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病，病理上主要表现为CNS白质部位血管周围淋巴细胞和浆细胞等炎性细胞呈袖套状浸润，可见吞噬细胞，髓鞘崩解等病理改变。大多数患者临床表现具有复发缓解的特点。目前，MS的病因、病理机制尚未明确。MS主要由T细胞介导的自身免疫性疾病，好发于青壮年，发病年龄多在20～40岁，女性多见，具有高致残率、高复发性的特点，部分患者病情呈进行性加重。迄今尚无肯定有效的治愈办法，需发展新的治疗药物。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)是研究MS的经典动物模型。其病理特征和MS相似，均表现为CNS白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。

促红细胞生成素是由肾脏分泌的分子量为30.4kD的细胞因子。它与促红细胞生成素受体结合后，刺激红系祖细胞增殖、分化、成熟、抑制其凋亡，增加成熟红细胞的数量从而参与机体的造血功能。研究显示促红细胞生成素不仅有促红细胞生成的作用，还具有抑制炎症和神经保护功能，在多种不同神经系统疾病模型，如神经系统自身免疫性疾病和脑损伤中均有治疗作用。促红细胞生成素在神经系统疾病的治疗方面有重要潜能，比如缺血性卒中、脑出血、蛛网膜下腔出血、脑外伤、帕金森病、自身免疫性脑脊髓炎等疾病。例如在脑外伤模型中，促红细胞生成素治疗相比空白组降低了脑水肿的严重程度和血脑屏障的破坏程度，减小损伤面积。然而大剂量、多次注射红细胞生成素会产生一系列不可避免的的潜在风险事件，包括红细胞生成以及红细胞比容增大带来的血液黏滞、血小板激活带来的血栓生成、可能的血压升高、促肿瘤生长、诱发抗促红细胞生成素抗体生成等诸多副作用限制了促红细胞生成素在许多情况下的使用。脂质体是由一层或多层的同心的脂质双分子层包裹而形成的球状体，可以包裹多种药物例如疫苗、抗肿瘤药、蛋白质、核酸等，其特点是延长药物的作用时间、增加其脂溶性、稳定性、减少毒副作用。因此，相比单独使用小分子多肽，使用脂质体包裹小分子多肽后可以使其延长半衰期、增加其稳定性、脂溶性，增加其给药途径。

发明内容

本发明的目的在于提供促红细胞生成素来源肽的运用，该运用为神经系统自身免疫性疾病提供了新的治疗思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

促红细胞生成素来源肽在制备治疗神经系统自身免疫性疾病的药物中的应用，所述促红细胞生成素来源肽含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

进一步，促红细胞生成素来源肽在制备治疗外周神经系统的自身免疫性脱髓鞘性病变的药物中的应用；

进一步，促红细胞生成素来源肽在制备治疗急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病的药物中的应用；

进一步，促红细胞生成素来源肽在制备治疗中枢神经系统自身免疫性疾病的药物中的应用；

进一步，促红细胞生成素来源肽在制备多发性硬化的药物中的应用；

进一步，促红细胞生成素来源肽为脂质体；

所述脂质体中软磷脂、胆固醇及小分子多肽的质量比为50∶50∶1。

上述目的的实现过程是通过：对促红细胞生成素的改造与合成，制得如SEQID NO：1所示的氨基酸序列的促红细胞生成素来源肽；而后将该促红细胞生成素来源肽采用逆向蒸发法与脂质体混合；同时建立大鼠实验性自身免疫性神经炎和实验性自身免疫性脑脊炎模型，将合成的促红细胞生成素来源肽脂质体及促红细胞生成素来源肽各自作为大鼠神经系统自身免疫性疾病的治疗药物，以PBS为空白对照，通过治疗神经系统自身免疫性疾病，发现促红细胞生成素来源肽及其脂质体治疗神经系统自身免疫性疾病大鼠的运动能力恢复，肢体反射能力得到明显提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，促红细胞生成素来源肽脂质体的作用优于促红细胞生成素来源肽，且给药频率可以明显减少。促红细胞生成素来源肽脂质体治疗神经系统自身免疫性疾病的作用优于促红细胞生成素来源肽。

有益效果：通过促红细胞生成素来源肽及促红细胞生成素来源肽脂质体治疗神经系统自身免疫性疾病，发现治疗后大鼠的神经系统自身免疫性疾病运动能力恢复，肢体反射能力得到明显提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，更重要的是，促红细胞生成素来源肽脂质体的作用优于促红细胞生成素来源肽，且给药频率可以明显减少。

附图说明

图1为经P2蛋白免疫及治疗后每日实验大鼠体重称量分析图；

图2为经P2蛋白免疫及治疗后大鼠行为评分的分析图；

图3为对照组及治疗组大鼠血红蛋白含量、红细胞数及红细胞压积分析图；

图4为对照组及治疗组大鼠巨噬细胞及T淋巴细胞数量的分析图；

图5为对照组及治疗组大鼠组织学评分分析图；

图6为经MBP68-84蛋白免疫及治疗后每日实验大鼠体重称量分析图；

图7为经MBP68-84蛋白免疫及治疗后大鼠行为评分的分析图；

图8为对照组及治疗组大鼠组织学评分分析图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸val V；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸pheF；组氨酸his H；脯氨酸pro P；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cys C；精氨酸arg R。

实施例1：促红细胞生成素来源肽的制备

促红细胞生成素来源肽的氨基酸序列如下：Gln Glu Gln Leu Glu Arg AlaLeu Asn Ser Ser(该段多肽依次来源于促红细胞生成素的第58位(谷氨酰胺)、第62位(谷氨酸)、第65位(谷氨酰胺)、第69位(亮氨酸)、第72位(谷氨酸)、第76位(精氨酸)、第79位(丙氨酸)、第80位(亮氨酸)、第83位(天冬酰胺)、第84位(丝氨酸)、第85位(丝氨酸)；

促红细胞生成素来源肽合成在ARI 431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4∶1.各种氨基酸的α-氨基酸为Fmoc保护，其余侧链保护基团为：Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲基吡啶，氨基酸活化用1-羟基苯并三唑和二环乙基碳，偶联后用体积分数为20％的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽粗品合成后，将树脂-粗肽在冰冷浴条件下混合于10ml切割液A(由结晶苯酚0.75g、1，2-乙二硫醇0.25ml、苯甲硫醚0.5ml、去离子水0.25ml和三氟乙酸10ml组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团，将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤后以除去树脂，先后用1ml三氟乙酸，10ml二氯甲烷反复冲洗反应瓶，树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至1-2ml，加入50ml预冷乙醚蒸发促红细胞生成素来源肽粗品，-20°保存备用。

将促红细胞生成素来源肽粗品用二甲基亚砜溶解成浓度为20mg/ml的溶液，经孔径为0.45um的绿孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典amerssam bioscience)上用SOURCE凝胶柱上纯化。流动相A有体积百分比为10％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成，流动相B由体积百分含量为90％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成。先用流动相A 1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液。(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷却干燥，即得促红细胞生成素来源肽纯品，用二甲基亚砜溶解，-20°保存备用。将促红细胞生成素来源肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪(美国waters公司)鉴定纯度，采用symmetry shield C18柱，流动相由体积百分含量为10％到60％的乙和体积百分含量为0.1％的三氟乙酸组成，梯度洗脱，流速为1ml/min。结果显示，合成多肽的纯度达到90％以上。同时，将促红细胞生成素来源肽纯品用API 2000LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成的促红细胞生成素来源肽的分子量与理论值相符。

实施例2促红细胞生成素来源肽脂质体的制备

采用逆向蒸发法制备促红细胞生成素来源肽脂质体。将软磷脂和胆固醇以1∶1质量比溶于乙醚中，减压蒸馏除去其中的有机溶剂，超声水浴5分钟使其形成为均匀的W/O型乳液，再加入适量的如SEQ ID NO：1所示的促红细胞生成素来源肽，在42°水浴和干冰中反复冻融，并且连续数次通过孔径为100nm的薄膜挤出器。利用如SEQ ID NO：1所示的促红细胞生成素来源肽与脂质体结合后体积变大，用琼脂糖凝胶CL-4B柱分离未与脂质体结合的促红细胞生成素来源肽。所述脂质体中软磷脂、胆固醇及小分子多肽的质量比为50∶50∶1。然后用透射电镜观察所得促红细胞生成素来源肽的形态结构：将促红细胞生成素来源肽脂质体混合物用浓度为3g/L的磷钨酸溶液负染后，滴至专用铜网并风干，用透射电镜观察促红细胞生成素来源肽脂质体的形态结构，结果如图所示，所得到的促红细胞生成素来源肽脂质体为球形囊泡，粒径范围为50-110nm，平均粒径为70nm。使用液相质谱测定小分子多肽脂质体的包封率：取0.5ml的促红细胞生成素来源肽脂质体溶液，加入等体积生理盐水混匀，600g离心10分钟，除去上清液，沉淀部分用10％的tritonX-100破膜并且稀释至10ml，采用液相质谱法测定，得到药物包封部分的浓度和相同体积不含促红细胞生成素来源肽脂质体的总浓度，两者之比为治疗脑损伤的小分子多肽脂质体的包封率为80％。

实施例3促红细胞生成素来源肽及其脂质体在自身免疫性外周神经炎中的运用

1、动物：

Lewis大鼠，雄性，8-10周龄、体重200-220克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2、药物：

促红细胞生成素来源肽脂质体的治疗组：给予治疗神经系统自身免疫性疾病的促红细胞生成素来源肽脂质体20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

促红细胞生成素来源肽治疗组：给予如SEQ ID NO：1所示的治疗神经系统自身免疫性疾病的促红细胞生成素来源肽20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

PBS组：给予与治疗组等体积的PBS进行腹腔注射，共计6只。

3、试验方法：

将大鼠外周神经髓鞘蛋白的P2蛋白的第57号氨基酸-第81号氨基酸(AlaPhe Lys Asn Thr Glu Ile Ser Phe Lys Leu Gly Gln Glu Phe Asp Glu ThrThr Ala Asp Asn Arg Lys Thr)作为自身免疫抗原对实验大鼠进行免疫。将P2抗原溶于磷酸盐缓冲液中，使其浓度为2毫克/毫升，得抗原溶液。取等量的抗原溶液和弗氏完全佐剂进行常规方法的乳化制备。实验动物用乙醚进行麻醉，而后双侧后脚掌进行皮下注射各50微升的抗原溶液-弗氏完全佐剂乳化制剂。免疫后每日进行动物体重称量(结果详见图1)和动物行为的评分(结果详见图2)。评分指标为：0分为正常、1分为尾部变软、2分为尾部无法抬起、3分为体位不能自行纠正、4分为共济失调、5分为后肢轻度麻痹、6分为后肢中度麻痹、7分为后肢重度麻痹、8分为四肢轻瘫、9分为垂死状态、10分为死亡；从免疫之后的第7天开始，使用促红细胞生成素来源肽脂质体的治疗组每两天注射一次，使用促红细胞生成素来源肽的治疗组、促红细胞生成素来源肽脂质体的治疗组和PBS组每天注射一次，以上各组连续注射10天。

对疾病大鼠神经行为学评分和体重影响

免疫及治疗之后的行为表现如下所示，相比PBS组，促红细胞生成素来源肽脂质体的治疗组和促红细胞生成素来源肽的治疗组的大鼠起病缓、病程短、高峰期严重程度降低、体重降低程度较小且恢复快，而且促红细胞生成素来源肽治疗组的治疗效果要优于促红细胞生成素来源肽的治疗组证实多肽治疗组相对于PBS组的疗效较明显；

对造血功能影响

为研究促红细胞生成素来源肽和促红细胞生成素来源肽脂质体的促造血功能，以雄性SD大鼠为研究对象，分别设立空白对照组(PBS组)，促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组(20nmol/kg，每天)、如SEQ ID NO：1所示的促红细胞生成素来源肽治疗组(20nmol/kg，每天)，阳性对照组(促红细胞生成素，20nmol/kg，每天)，每天注射一次，连续7天，每组大鼠5只。实验第8天取PBS组、小分子多肽脂质体的治疗组、如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽治疗组、阳性对照组大鼠作外周血按常规方法作血象分析。结果如图3所示：促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组和如SEQ ID NO：1所示的促红细胞生成素来源肽治疗组相对于PBS组并无明显差异，而阳性对照组的血红蛋白量明显升高、红细胞数明显升高、红细胞压积增大；说明如SEQ ID NO：1所示的促红细胞生成素来源肽和促红细胞生成素来源肽脂质体均无促红细胞生成作用。

对疾病大鼠炎症细胞浸润影响

为了考察外周神经系统炎症细胞浸润情况，用大鼠坐骨神经做免疫组化染色。用乙醚深度麻醉大鼠后心内灌注4℃遇冷，4％浓度多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。左、右侧坐骨神经被迅速拆除，后在4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，连续切片(3微米)、经过脱蜡，坐骨神经切片在柠檬酸缓冲液中煮沸15分钟以灭活内源性过氧化物酶。1％的甲醇15分钟抑制过氧化氢酶，孵育于10％的正常猪血清(Biochrom，柏林，德国)，以阻止非特异性免疫球蛋白的结合。使用的单克隆抗体为：W3/13(1∶50；Serotec，牛沣，英国)标记T淋巴细胞，ED1(1∶100；Serotec，牛沣，英国)标记激活的巨噬细胞。结果如图4所示。

大鼠坐骨神经免疫组化结果显示，经过促红细胞生成素来源肽脂质体或促红细胞生成素来源肽的治疗后，坐骨神经炎症浸润处T细胞和巨噬细胞都显著减少。这证实促红细胞生成素来源肽脂质体和促红细胞生成素来源肽多肽对神经系统的炎症有抑制作用，而且前者的效果要优于后者。

对炎症大鼠组织学评分影响

为了考察促红细胞生成素来源肽脂质体对髓鞘的影响作用，将大鼠坐骨神经切片做勒克斯监牢蓝快速染色而后用半定量的方法评价治疗组和对照组的髓鞘损伤情况。取大鼠双侧坐骨神经根部和中部两个横切面各四张切片，用半定量的评价其血管周围病理变化程度。评分标准如下：0＝血管周围地区正常，1＝血管邻近区轻度细胞浸润；2＝血管邻近区细胞浸润及脱髓鞘；3＝整个断面细胞浸润和脱髓鞘；结果如5所示，半定量结果显示促红细胞生成素来源肽脂质体和促红细胞生成素来源肽治疗组坐骨神经炎症浸润以及脱髓鞘程度与对照组相比显著减轻，且前者的效果优于后者。

小结：通过在大鼠实验性自身免疫性神经炎中的治疗验证促红细胞生成素来源肽脂质体不影响造血系统的同时对外周神经系统在自身免疫性疾病中的治疗作用，其治疗效果要优于促红细胞生成素来源肽。

实施例4促红细胞生成素来源太及其脂质体在自身免疫性脑脊炎中的应用

1、动物

雄性Lewis大鼠，8-10周龄，体重170-200克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2、药物

促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组：给予如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的促红细胞生成素来源肽肽脂质体20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

促红细胞生成素来源肽治疗组：给予如SEQ ID NO：1所示的促红细胞生成素来源肽20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

PBS组：给予与治疗组等体积的PBS进行腹腔注射，共计6只。

3、试验方法：

将大鼠MBP蛋白的第68号氨基酸到第84号氨基酸(Try Gly ser leu pro Glnlys ser gln arg ser gln asp glu asn pro val)作为免疫动物使用的自身免疫抗原，溶于磷酸盐缓冲液中，使其浓度为2毫克/毫升。取等量的抗原和弗氏完全佐剂进行常规方法的乳化制备。实验动物用乙醚进行麻醉，而后双侧后脚掌进行皮下注射各50微升的抗原肽-弗氏完全佐剂乳化制剂。免疫后每日进行动物体重称量(结果如图6所示)和动物行为的评分(结果如图7所示)。评分指标为：0分为无临床症状、1分为尾部力量减弱、2分为尾肌力减弱加上后肢轻度麻痹、3分为后肢中度麻痹、4分为四肢轻瘫、5分为垂死状态；从免疫之后的第6天开始，使用促红细胞生成素来源肽脂质体的治疗组每两天注射一次，使用促红细胞生成素来源肽的治疗组、促红细胞生成素来源肽脂质体的治疗组和使用PBS的空白对照组每天注射一次，以上各组连续注射10天。动物的行为学表现如下所示：相对于PBS组，促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组和促红细胞生成素来源肽治疗组的发病时间延迟、病程缩短、高峰期严重程度降低、体重恢复快，而且促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组的治疗效果要优于促红细胞生成素来源肽治疗组。

为了考察大鼠自身免疫性脑脊炎中大脑组织的损伤程度以及单个核细胞浸润程度，对其免疫组化结果进行半定量的分析，其评分标准为：0分为无单个核细胞浸润、1分为每个截面有1-5处血管周围区的浸润伴实质的轻度浸润、2分为每个截面有5-10处血管周围区病变伴中度实质浸润、3分为每个截面有10处以上血管周围区病变伴广泛的实质浸润；分析结果如图8所示：促红细胞生成素来源肽治疗组和促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组的病变程度及单个核细胞的浸润程度显著轻于PBS空白对照组，且促红细胞生成素来源肽脂质体治疗组的效果要比促红细胞生成素来源肽治疗组效果明显。

小结：通过在大鼠实验性自身免疫性脑脊炎模型中的治疗使用验证了小分子多肽脂质体对中枢神经系在自身免疫性炎症性疾病中的治疗作用，且这种治疗作用要优于单独使用小分子多肽。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.促红细胞生成素来源肽在制备治疗自身免疫性外周神经炎或自身免疫性脑脊炎的药物中的应用，所述促红细胞生成素来源肽的氨基酸序列为：Gln Glu Gln Leu Glu Arg Ala Leu Asn Ser Ser，所述促红细胞生成素来源肽以脂质体形式存在，所述脂质体中软磷脂、胆固醇及促红细胞生成素来源肽的质量比为50:50：1。