EA006423B1 - Олигопептид, обладающий биологической активностью модулятора рецептора тромбопоэтина, и способы его применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к олигопептиду с биологической активностью соединения, модулирующего рецептор тромбопоэтина, к нуклеотидным последовательностям, кодирующим олигопептид, к векторам, содержащим указанные нуклеотидные последовательности, к клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы, к антителам, реакционноспособным в отношении указанных олигопептидов, к фармацевтическим и диагностическим композициям, содержащим олигопептиды, нуклеотидные последовательности, антитела и/или клетки-хозяева, а также к способам генетической модификации клетки, к способам модуляции активности рецептора ТРО (TPO-R) и способам скрининга других соединений, модулирующих рецептор ТРО.

Description

Настоящее изобретение относится к олигопептиду с биологической активностью соединения, модулирующего рецептор тромбопоэтина (ТРО) к нуклеотидным последовательностям, кодирующим олигопептид, векторам, содержащим указанные нуклеотидные последовательности, клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы, антителам, реакционноспособным в отношении указанных олигопептидов, фармацевтическим и диагностическим композициям, содержащим олигопетиды, нулеотидные последовательности, антитела и/или клетки-хозяева, а также к способам генетической модификации клетки, способам модуляции активности рецептора ТРО (ТРО-В) и способам скринига других соединений, модулирующих рецептор ТРО.

Тромбоцитопения является распространенным тяжелым и опасным для жизни заболеванием, встречающимся как первичное гематологическое заболевание и как индуцированное расстройство. Пациенты, страдающие от тяжелой тромбоцитопении, имеют риск развития спонтанного кровотечения. Индуцированная тромбоцитопения может вызываться, например, трансфузиями костного мозга, химиотерапией или облучением при раке или аллергическими реакциями. Примерно 50% всех пациентов, которым впервые поставлен диагноз ракового заболевания, подвергаются какой-либо форме химиотерапии и получают трансфузии тромбоцитов. Тромбоцитопения поражает по меньшей мере 25% всех пациентов, подвергающихся химиотерапии. Из-за повторяющихся циклов интенсивной химиотерапии снижается число тромбоцитов, предупреждающих кровотечение и способствующих восстановлению поврежденных кровеносных сосудов, и лечение рака очень часто должно прерываться, чтобы восстановить число тромбоцитов. Неудача в восстановлении числа тромбоцитов приводит к отсрочке и/или ограниченному применению последующих циклов химиотерапии, снижая шансы успешного лечения.

Лечение тромбоцитопении осуществляют, главным образом, путем трансфузии свежих препаратов тромбоцитов, которые очень дороги и не являются легко доступными лекарственными средствами, которые путем инъекции или перорального введения могут повысить число тромбоцитов до нормального уровня. Каждый год только в США пациентам трансфузируют приблизительно 8 миллионов единиц тромбоцитов для того, чтобы уменьшить опасность тяжелых кровотечений. По меньшей мере 30% трансфузий приводят к осложнениям, как правило, лихорадочным состояниям, но иногда к бактериемии, реакции трансплантат против хозяина или острому повреждению легких. У 15-25% пациентов, которым требуются повторные трансфузии тромбоцитов, нарастающие реакции тромбоцитов являются неадекватными в результате НЬА-аллоиммунизации. Кроме того, трансфузии тромбоцитов являются дорогостоящими. В частности, тромбоцитопения, индуцированная химиотерапией, в настоящее время подавляется трансфузией тромбоцитов, и/или химиотерапия снижается или откладывается до повышения числа тромбоцитов. Однако трансфузии могут создать у пациента опасность инфекций, передаваемых через кровь, таких как гепатит В и гепатит С, ВИЧ-инфекции и заражение Т-лимфотропным вирусом человека, или иммунных реакций, таких как лихорадка. Снижение доз при химиотерапии и отсрочка или прекращение лечения теоретически могут позволить раковым клеткам расти и распространяться. Таким образом, существует крайняя необходимость в создании эффективных лекарственных средств для лечения тромбоцитопении, которая, однако, требует детального объяснения ее молекулярных и биохимических основ.

Мегакариоциты являются клетками, происходящими из костного мозга, которые ответственны за продуцирование тромбоцитов, циркулирующих в крови. Хотя они составляют только небольшую часть клеток костного мозга, они имеют объем, превышающий объем типичных клеток костного мозга более чем в 1 0 раз. Мегакариоциты проходят эндомитоз с репликацией ядер, при этом сами клетки не делятся, что приводит к возникновению полиплоидных клеток. В ответ на пониженное число тромбоцитов повышается скорость эндомитоза, образуются мегакариоциты с более высокой плоидностью, и число мегакариоцитов может возрасти до трех раз. Напротив, в ответ на повышенное число тромбоцитов скорость эндомитоза снижается, образуются мегакариоциты с меньшей плоидностью, и число мегакариоцитов может существенно снизиться.

Точный физиологический механизм ответной реакции, с помощью которого масса циркулирующих тромбоцитов регулирует скорость эндомитоза и число мегакариоцитов костного мозга, неизвестен. В настоящее время считается, что циркулирующим тромбопоэтическим фактором, вовлеченным в опосредование такой петли обратной реакции, является ТРО-гликопротеин, встречающийся по меньшей мере в двух формах с молекулярной массой 25 и 31 кДа, с обычным Ν-концом и регулирующий продуцирование красных кровяных клеток. Показано как ίη νινο, так и ίη νίίτο, что ТРО является основным регулятором мегакариоцитопоэза. ТРО инициирует свое биологическое действие посредством связывания с с-тр1 (далее также называемым ТРО-В), являющимся членом суперсемейства рецепторов гематопоэтина. Конкретнее, было показано, что ТРО является основным гуморальным регулятором, в которых имеет место тромбоцитопения. В ряде исследований показано, что ТРО повышает число тромбоцитов, увеличивает размер тромбоцитов и повышает включение изотопа в тромбоциты животных-реципиентов. Конкретно, полагают, что ТРО воздействует на мегакариоцитопоэз несколькими путями: (1) он вызывает увеличение размеров и повышение числа мегакариоцитов; (2) он вызывает повышение содержания ДНК в мегакариоцитах в форме полиплоидии; (3) он повышает эндомитоз мегакариоцитов; (4) он вызывает ускоренное созревание мегакариоцитов; (5) он вызывает повышение процентного содержание клеток

- 1 006423 предшественников в форме мелких клеток, положительных на ацетилхолинэстеразу, и в костном мозге.

Поскольку тромбоциты необходимы для свертывания крови, и когда их число является слишком низким, существует серьезная опасность гибели пациента от катастрофического кровотечения, ТРО потенциально полезен для применений как при диагностике, так и при лечении различных гематологических нарушении, например болезней из-за, главным образом, дефектов тромбоцитов. Кроме того, последние исследования дают основания для представления об эффективности ТРО-терапии при лечении тромбоцитопении и, в частности, тромбоцитопении, являющейся результатом химиотерапии, лучевой терапии или трансплантации костного мозга при лечении рака или лимфомы (МсЭона1й (1992), Ат. 1. Рей. Нета!о1оду/Опсо1оду, 14:8-21).

Ген, кодирующий ТРО, клонирован и охарактеризован (Ки1ет е! а1., (1994), Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А, 91:11104-11108; Ваг1еу е! а1., (1994), Се11, 77:1117-1124; КаизЬапвку е! а1., (1994), №Пиге. 369:568571; АепйЬпд е! а1., (1994); ЫаШге, 369:571-574; и 8ауаде е! а1., (1994); ЫаЩте, 369:533-538).

Рекомбинантный тромбопоэтин (далее также называемый гТРО) является единственным специально сконструированным соединением, полученным на сегодняшний день, которое, возможно, эффективно для лечения тромбоцитопении. Он действует во время тромбоцитопении как лекарственное средство индуктор тромбоцитов. Показано, что экзогенное введение однократной дозы гТРО, как правило, ассоциируется с повышением числа тромбоцитов. В некоторых случаях он может усилить реакцию мегакариоцитов и, следовательно, вызвать тромботические осложнения. Предполагается, что, хотя тромбоцитопения не вызывает агрегации тромбоцитов в отсутствие хорошо известных агонистов (тромбин, коллаген), она повышает чувствительность тромбоцитов к агрегирующему действию указанных веществ. Такое примирование также зарегистрировано ίη у1уо. Тромбоциты, полученные от животных, которых лечили от тромбоцитопении, имеют повышенную чувствительность к веществам, стимулирующим агрегацию тромбоцитов. Таким образом, ТРО может усилить условия тромбогенеза, и следует тщательно оценивать такую опасность перед тем, как вводить его пациентам. Также зрелые тромбоциты удаляют тромбопоэтин из раствора, и у животных с тромбоцитопенией содержание тромбопоэтина в плазме падает вскоре после трансфузии тромбоцитов и повышается только после того, как число тромбоцитов снова снижается. Такое открытие, что тромбоциты могут удалять ТРО из кровотока, имеет по меньшей мере два клинических последствия: ί) трансфузия тромбоцитов может ослабить восстановление мегакариоцитов; ίί) связывание ТРО с имеющимися тромбоцитами может ослабить реакцию эндогенного ТРО на миелосупрессивную терапию. Однако поскольку имеющиеся тромбоциты продолжают связываться с ТРО, повышение концентрации ТРО в плазме откладывается до вмешательства тромбоцитопении на много дней. Кроме того, когда укороченная форма гТРО давалась как единственная конъюгированная с РЕО группа, терапия в ряде случаев ассоциировалась с развитием тромбоцитопении и нейтрализующих антител.

Кроме гТРО некоторые другие рекомбинантные цитокины (1Ь-1, 1Ь-3, 1Ь-6, 1Б-11, ОМ-С8Е, фактор Стила и промегапоэтин слитый белок 1Ь-3-тромбопоэтин) оказывают прямое или косвенное стимулирующее действие ίη у1уо и ίη νίΙΐΌ на клетки линии дифференцировки мегакариоцитов. Однако большинство этих веществ не оказывает благоприятного действия на восстановление тромбоцитов после миелосупрессивной терапии или обладает неприемлемым токсическим действием. В противоположность этому, доказано, что 1Ь-11 является как эффективным, так и относительно безопасным. 1Ь-11 используют для снижения необходимости трансфузии тромбоцитов у больных раком, получающих химиотерапию. При ежедневном подкожном введении 1Ь-11 индуцирует повышение числа тромбоцитов у больных раком. Однако лекарственное средство имеет побочные эффекты, главным образом, из-за увеличения объема плазмы (предсердная аритмия, сердцебиение, периферический отек, головная боль, одышка, анемия, миалгия, увеличение массы, анорексия, тошнота), и у некоторых больных раком наблюдается образование антител (ниже они рассматриваются как нейтрализующие). Оказывается, что 1Ь-11 подходит только для пациентов, испытывающих тяжелую и ограниченную по терапии тромбоцитопению, или для пациентов, которым требуется предварительная трансфузия тромбоцитов. Он не рекомендуется для обычного применения при аттенюирующей тромбоцитопении.

Последовательности ДНК и кодирующие пептидные последовательности для ТРО-К человека также описаны (Уфон е! а1. (1992), Ргос. N111. Асай. δα. И8А, 89:5640-5644). ТРО-К является членом семейства рецепторов гематопоэтического фактора роста, семейства, характеризующегося обычным структурным построением внеклеточного домена, включающего четыре консервативных цистеиновых остатка в Ν-концевой части.

Доступность клонированных генов для ТРО-К облегчает поиск агонистов этого важного рецептора. Доступность рекомбинантного рецепторного белка делает возможным исследование взаимодействия рецептор-лиганд во множестве рандомизированных и полурандомизированных разнообразных системах генерации пептида.

В АО 99/42127 описывается ТРО-рецепторный пептид (в дальнейшем называемый ТРО-Кр дикого типа), состоящий из 23 аминокислот, соответствующих аминокислотам 444-466 ТРО-Кр человека. Описывается способ модуляции активности ТРО-Кр путем контактирования ТРО-Кр с рецептором. Однако конкретное лечение тромбоцитопении не описывается.

- 2 006423

Другие авторы сообщают о мутантах делеции ТРО-Вр, делающих возможным анализ соотношений структура-функция: ΌοτδεΗ е! а1., I. Ехр. Мей. (1997), 186, 1947-1955; Огасйшап аий Каикйапзку, Ргос. Ыа!1. Асай. 8сг И8А (1997), 94, 2350-2355; Ройеи е! а1., Мо1. Се11. Βίο1. (1996), 2473-2482; и ТакаШки е! а1., 1. Βίο1. Сйет. (1997), 272, 7259-7263. Известны другие пептиды-агонисты тромбопоэтиновых рецепторов, например, из работы К1шига е! а1. (1. Вюсйеш. (1997), 122, 1046-1051, Вюсйеш. Мо1. Βίο1. Ιη!. (1998), 44, 1203-1209), где описывается пептид из 15 аминокислот из рандомизированной фаговой пептидной библиотеки, стимулирующий пролиферацию тромбопоэтинзависимых клеток и дифференцировку клеток костного мозга мыши до мегакариоцитов. СМг1а е! а1. описывают пептид-агонист тромбопоэтинового рецептора из 14 аминокислот, стимулирующий ίη νίίτο пролиферацию и созревание мегакариоцитов из клеток костного мозга человека (8аепсе (1997), 276, 1696-1699).

Нет обсуждения того, доказана ли полезность таких мутантов делеции ТРО-В или пептидовагонистов в качестве средств, имитирующих тромбопоэтин, с возможностью доработки до устойчивого и фармацевтически эффективного лекарственного средства.

Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, должна привести к эффективному соединению, полезному для диагностики и лечения гематологических нарушений, таких как идиопатическая и индуцированная тромбоцитопения, в частности индуцированная химиотерапией, аллергией и облучением тромбоцитопения, причем в то же время являющемуся нетоксичным и устойчивым.

Настоящее изобретение решает описанную выше проблему с помощью выделенного и очищенного олигопептида с биологической активностью модулятора ТРО-В, содержащего, в частности, по существу состоящего из, предпочтительно состоящего из 15-18 аминокислот и имеющего общую формулу

X! СТЬЕЬХ₂РХ₃8ВУВЬОЬХ.₁.

где Х₁ представляет собой А В С или отсутствует,

Х₂ представляет собой В или А,

Х₃ представляет собой В или А и

Х₄ представляет собой В А В или отсутствует.

В особо предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения олигопептид содержит, в частности или предпочтительно, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, которые полностью включены в настоящую заявку.

Настоящее изобретение, среди прочего, основано на выводе, что вышеуказанные олигопептиды модулируют активность ТРО-В, в частности, прочно связывают и активируют ТРО-В, а также улучшают утилизацию эндогенного ТРО. Следовательно, олигопептиды настоящего изобретения показывают по меньшей мере две различные активности, а именно (ί) модулирующее действие на активность ТРО-В, например агонистическое действие, такое как ТРО-имитирующее действие, или антагонистическое действие, и (ίί) синергичное действие вместе с ТРО, в частности, когда оба соединения присутствуют в субмаксимальных концентрациях. Синергичное действие является особенно важным, так как предоставляет клинические преимущества по сравнению с применением только ТРО.

Кроме того, олигопептиды настоящего изобретения проявляют очень высокую силу и эффективность, т.е. активны в интервале концентраций нМ-мкМ. Олигопептиды настоящего изобретения можно применять одни или в сочетании с ТРО. В отличие от ТРО, олигопептиды настоящего изобретения не приводят к даун-регуляции ТРО-рецептора и, следовательно, не снижают чувствительности к ТРО. Напротив, экзогенное введение ТРО может привести к такой даун-регуляции рецептора и посредством этого к снижению чувствительности или индукции толерантности. Кроме того, олигопептиды настоящего изобретения очень избирательны в отношении ТРО-В и не показывают, например, перекрестной реактивности в отношении близкородственного рецептора эритропоэтина.

Олигопептиды настоящего изобретения связываются с ТРО-В в совершенно другом сайте, чем ТРО. Олигопептиды настоящего изобретения не влияют на связывание с ТРО, но скорее оба компонента могут связываться с одной и той же рецепторной молекулой. С точки зрения активности такие свойства связывания приводят к синергичному действию ТРО и олигопептидов настоящего изобретения, которое наблюдали при анализах передачи сигнала в клетках, где олигопептиды настоящего изобретения и ТРО, когда даются по отдельности в субмаксимальных концентрациях, производят около 20% максимального сигнала, измеряемого путем фосфорилирования субстрата, но когда вводятся вместе в тех же концентрациях, дают максимальный сигнал. Олигопептиды настоящего изобретения переключают в обратном направлении даун-регуляцию ТРО-В при очень высоких дозах ТРО. Добавление олигопептидов настоящего изобретения к высоким концентрациям ТРО приводит к сигнальной трансдукции ТРО-В. Посредством своего специфического связывания с ТРО-В олигопептиды настоящего изобретения способны к индукции конформации рецепторов, благоприятной для связывания, и, таким образом, активации субстрата на пути передачи сигнала. Таким образом, олигопептиды настоящего изобретения, помимо своего собственного агонистического действия на каскад передачи сигнала ТРО-В, при введении вместе с природным гормоном ТРО расширяют интервал ТРО-активности, действуют синергично с ТРО при субмаксимальных концентрациях соединения и изменяют направление эффекта колоколообразной кривой при высоких

- 3 006423 концентрациях гормона.

Настоящее изобретение также показывает, что ΤΡΟ-Βρ дикого типа также обладает активностями, полезными для специфического лечения гематологических нарушений и, в частности, тромбоцитопении. Таким образом, оказывается, что олигопептиды настоящего изобретения, так же как и ΤΡΟ-Βρ дикого типа, одни или вместе с ТРО или тромбоцитами особенно полезны для диагностики и лечения гематологических нарушений, например болезней, вызванных тромбоцитарными нарушениями, и всех различных типов тромбоцитопении. Из-за своего малого размера и высокой устойчивости в фармацевтических композициях олигопептиды настоящего изобретения также выгодны, постольку, поскольку они допускают, среди прочего, их пероральное применение. Они также показывают высокую степень устойчивости ίη νίνο.

Не вдаваясь в теорию, представляется, каким образом олигопептиды настоящего изобретения, среди прочего, модулируют ΤΡΟ-Β-активности. А именно, связывание ТРО приводит к димеризации рецепторов и активации внутриклеточных каскадов передачи сигнала. В ходе указанного события происходит специфическое фосфорилирование ассоциированных с рецепторами киназ семейства ΙΛΚ-киназ (ТАК2 и Тук2) и последующее фосфорилирование и димеризация фактора транскрипции 8ΤΑΤ5. Активированный белок 8ΤΑΤ5 входит в ядро и связывается с промоторной областью генов-мишеней, стимулируя пролиферацию клеток и повышая число тромбоцитов. Однако хотя описанный выше механизм действия дикого типа может быть действительным также для олигопептидов настоящего изобретения, нельзя исключить, что олигопептиды настоящего изобретения действуют иным образом, например через связывание с рецепторами-мономерами, и посредством этого имитирование второй цепи рецептора, или связывание по сайтам рецептора, по которым природный ТРО не связывается. Действительно, представляется, что олигопептиды настоящего изобретения действуют в ином, чем природный ТРО, участке.

Настоящее изобретение также относится к мутанту замещения Υ14Ρ, происходящему от ΤΡΟ-Βρ дикого типа, т.е. ΤΡΟ-Βρ дикого типа, где тирозин в положении 14 ΤΡΟ-Βρ дикого типа заменен на фенилаланин. Такой модифицированный пептид может оказаться особенно ценным для осуществления, например, исследований разложения пептидов, так как такой пептид можно специфически иодировать по его Ν- или С-концам.

Олигопептиды настоящего изобретения и ΤΡΟ-Βρ дикого типа также полезны для профилактики и лечения болезней, опосредуемых ТРО, и, в частности, для лечения гематологических нарушений, в том числе, но не только, тромбоцитарных нарушений и тромбоцитопении, являющейся результатом аллергических реакций, химиотерапии, лучевой терапии, или трансфузий костного мозга, или идиопатической тромбоцитопении. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу лечения вышеуказанного нарушения, когда пациент с таким нарушением, которое чувствительно к лечению соединением, модулирующим ΤΡΟ-Β, в частности агонистом ТРО, получает или ему вводят терапевтически эффективные дозу или количество олигопептида настоящего изобретения и/или ΤΡΟ-Βρ дикого типа.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим один или более представленных здесь олигопептидов и/или ΤΡΟ-Βρ дикого типа и физиологически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции могут быть представлены в различных формах, включая лекарственные формы для перорального применения, а также порошки и растворы для ингаляций и растворы для инъекций и инфузий.

В особенно предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения такие композиция и способ также включают применение ТРО в сочетании с ΤΡΟ-Βρ дикого типа и/или олигопептидами настоящего изобретения.

Далее приводятся определения для пояснения и определения значения и объема различных терминов, используемых в описании настоящего изобретения.

Термины трансформация или трансфекция обозначают действие, приводящее к тому, что клетка-хозяин приобретает с использованием способов, известных в технике, нужную молекулу нуклеиновой кислоты, включая или нуклеотдную последовательность нативного ΤΡΟ-Βρ, или нуклеотидную последовательность, кодирующую олигопептиды настоящего изобретения, изначально не являющуюся частью клетки или не находящуюся в естественном местоположении, число копий или ориентацию.

Функционально связанный означает, что ген и по меньшей мере одна регуляторная последовательность соединяются при смысловой или антисмысловой экспрессии таким образом, что обеспечивается экспрессия генов, когда соответствующие молекулы (например, белки-активаторы транскрипции) связываются с регуляторной последовательностью.

Термин вектор относится к конструкции рекомбинантной ДНК, которая может представлять собой плазмиду, вирус или автомно реплицирующуюся последовательность, фаг или нуклеотидную последовательность, линейную или кольцевую одноцепочечную или двухцепочечную ДНК или РНК, происходящие от любого источника, где ряд нуклеотидных последовательностей соединен или рекомбинирован в уникальную конструкцию, способную вводить в клетку промоторный фрагмент и последовательность ДНК для избранного генного продукта в смысловой или антисмысловой оринтации вместе с соответствующей З'-нетранслируемой последовательностью.

Плазмиды являются генетическими элементами, которые устойчиво наследуются, не являясь ча

- 4 006423 стью хромосомы своей клетки-хозяина. Они могут содержать ДНК или РНК и могут быть линейными или кольцевыми. Плазмиды кодируют молекулы, обеспечивающие их репликацию и устойчивое наследование во время репликации клетки, и могут кодировать продукты, имеющие разнообразное значение для медицины, сельского хозяйства и окружающей среды. Они также могут кодировать гены, придающие устойчивость к антибиоткам. Плазмиды широко применяются в молекулярной биологии как векторы для клонирования и экспрессии рекомбинантных генов. Исходные плазмиды, описанные в данном описании, являются или коммерчески доступными, или общедоступными, или их можно сконструировать из доступных плазмид, применяя самым обычным образом хорошо известные описанные в литературе методы. Многие плазмиды и другие клонирующие и экспрессирующие векторы, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, хорошо известны и легко доступны для специалистов в данной области техники. Кроме того, специалисты легко могут сконструировать ряд других плазмид, подходящих для применения в изобретении. Свойства, конструкция и применение таких плазмид, а также других векторов в настоящем изобретении станут весьма ясными для специалистов в данной области техники из данного описания.

Термин клетка-хозяин относится к клетке, генетически модифицированной путем переноса химерной, гетерологичной или аутологичной нуклеотидной последовательности, или к ее потомкам, содержащим указанную последовательность. Такие клетки также называют трансгенными клетками. В случае, когда перенесена аутологичная нуклеотидная последовательность, последовательность будет присутствовать в клетке-хозяине при более высоком числе копий, в другом генетическом окружении или в другой ориентации, чем встречающаяся в природе.

Твердым носителем (нерастворимой матрицей) называют или частицы, биологические по природе, такие как, без ограничений, клетка или бактериофаговая частица, или синтетические, такие как, без ограничений, частицы акриламидных производных, частицы нейлона, диоксида кремния и магнитные частицы, с которыми могут связываться или соединяться растворимые молекулы.

Термин антитело относится к полипептиду, по существу, кодируемому геном иммуноглобулина, или генами иммуноглобулина, или их фрагментами, специфически связывающимися и распознающими аналит (антиген). Известными генами иммуноглобулина являются гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также большое число генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Антитела существуют, например, в виде интактных иммуноглобулинов или в виде ряда хорошо охарактеризованных фрагментов, полученных путем расщепления различными пептидазами. Термин антитело также относится к модифицированным антителам (например, олигомерным, восстановленным, окисленным и меченным антителам). Термин антитело, используемый в данном описании, также включает фрагменты антител, полученные или модификацией полных антител, или антител, синтезированных вновь с использованием методологий рекомбинантных ДНК. Термин антитело включает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как РаЬ, Р(аЬ')₂ и Ρ_ν, способные к связыванию с эпитопной детерминантой. Такие фрагменты антител сохраняют некоторую способность селективно связываться со своим антигеном или рецептором и определяются следующим образом:

(1) РаЬ - фрагмент, содержащий одновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, можно получить расщеплением полного антитела ферментом папаином с образованием интактной легкой цепи и части тяжелой цепи;

(2) РаЬ' - фрагмент молекулы антитела, который можно получить обработкой полного антитела пепсином с последующим восстановлением с образованием интактной легкой цепи и части тяжелой цепи; на молекулу антитела получают два фрагмента РаЬ';

(3) (РаЬ')₂ - фрагмент молекулы антитела, который можно получить обработкой полного антитела пепсином без последующего восстановления; (РаЬ')₂ является димером двух фрагментов РаЬ', удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями;

(4) Ρ_ν определяется как генетически сконструированный фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессированной в виде двух цепей; и (5) одноцепочечное антитело (8СА) определяется как генетически сконструированная молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, соединенные подходящим полипептидным линкером в виде генетически слитой одноцепочечной молекулы.

Способы получения указанных фрагментов известны из уровня техники. (См., например, Нат1оте аиб Рапе. АпйЬоб1е8: А РаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог РаЬогаЮгу. №\ν Уогк (1988)).

Используемый в данном изобретении термин эпитоп обозначает любую антигенную детерминанту на антигене, с которой связывается паратоп антитела. Как правило, эпитопные детерминанты состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда.

Моноклональные антитела к белкам настоящего изобретения и к их фрагментам специалисты в данной области техники также могут легко получить. Общая методология получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна. Иммортализованные клеточные линии, продуцирующие антитела, можно создать путем слияния клеток, а также другими методами, та

- 5 006423 кими как прямая трансформация В-лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекция вирусом ЭпштейнаБарр. См., например, М. Бсйге1ег е! а1., НуЬпбоша Тесйпк|ие5 (1980); Нашшегйпд е! а1., Мопос1опа1 АпНЬоФек апб Т-се11 НуЬббошак (1981); Кеппе!! е! а1., Мопос1опа1 АпИЬоб1е8 (1980); см. также пат. США №№ 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4452570; 4466917; 4472500; 4491632 и 4493890. Панели моноклональных антител, полученных против представляющего интерес белка, в частности ТРО-Кр или олигопептидов настоящего изобретения или их фрагментов, можно скринировать на различные свойства; т.е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. С другой стороны, гены, кодирующие представляющие интерес моноклональные антитела, можно выделить из гибридом методами РСК, хорошо известными в технике, и клонировать и экспрессировать в соответсвующих векторах. Моноклональные антитела применимы при очистке с использованием иммуноаффинных методов отдельных белков, против которых они направлены. Кроме того, антитела данного изобретения, являются ли они поликлональными или моноклональными, полезны также в том отношении, что их можно использовать в качестве реагентов при иммуноанализах, К1А, ЕЬ1БА и т.п. Кроме того, их можно использовать для обнаружения и/или выделения полипептидов настоящего изобретения из клеточных экстрактов или клеток. Антитела можно использовать, например, для того, чтобы установить культуру ткани на основании анализа на обнаружение или для модификации новых соединений, модулирующих активность ТРО-К, например имитирующих ТРОактивность.

Гуманизированные или химерные антитела могут содержать части, полученные от двух разных видов (например, константную область человека и связывающую область мыши). Части, полученные от двух разных видов, можно соединить вместе химически с помощью обычных методов, или их можно получить в виде отдельного слитого белка с использованием методов генной инженерии. ДНК, кодирующие белки обеих частей химерного антитела, можно экспрессировать в виде единого слитого белка.

Антитело специфически связывается с или является иммунореактивным в отношении белка, когда антитело функционирует в реакции связывания, являющейся решающим фактором наличия белка в присутствии гетерогенной популяции белков и других биологических сущностей. Таким образом, в созданных условиях иммуноанализа специфические антитела связываются преимущественно с определенным белком и не связываются в значительном количестве с другими белками, присутствующими в образце. Для специфического связывания с белком в таких условиях требуются антитела, выбранные по своей специфичности в отношении конкретного белка. Для отбора антител, специфически иммунореактивных в отношении определенного белка, можно использовать различные форматы иммуноанализа. Например, для отбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных в отношении конкретного белка, обычно используют твердофазные иммуноанализы ЕЬ1§А. См. Наг1оте апб Йапе (1988), Ап!1Ьоб1е8, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б Брбпд НагЬог РиЬйсайопз, Ыете Уогк, на предмет описания форматов иммуноанализа и условий, которые можно использовать для определения специфической иммунореактивности.

Термин иммуноанализ относится к анализу, в котором используются антитела или антигены для специфического связывания с аналитом, который также может представлять собой антитело или антиген. Иммуноанализ характеризуется применением специфических свойств связывания конкретного антитела для обнаружения, выделения, мечения и/или количественного анализа аналита. Для того чтобы детекция была возможной, можно пометить или антитело, или антиген.

В контексте настоящего изобретения термин лечение относится к профилактическому и/или лечебному действию лекарственного средства или лечебного средства, которое, в свою очередь, определяется как композиция, содержащая фармацевтически или диагностически эффективное соединение в сочетании по меньшей мере с одной добавкой, такой как носитель.

Термин агонист относится к биологически активному лиганду, связывающемуся со своим комплементарно биологически активным рецептором и активирующим последний или вызывая биологический ответ в рецепторе или усиливая уже существующую биологическую активность рецептора. Агонист ТРО связывается с рецептором ТРО (ТРО-К). Агонист ТРО может действовать как имитатор ТРО. Однако агонист ТРО также может активировать или участвовать в активации ТРО-К путем использования сайтов связывания или механизмов, отличных от таковых у ТРО.

Термин антагонист относится к биологически активному лиганду, который связывается со своим комплементарно биологически активным рецептором и подавляет, уменьшает или устраняет активность ТРО-К, например, путем использования сайтов связывания или механизмов, отличных от таковых у ТРО.

Термин фармацевтически приемлемые соли относится к обычно используемым нетоксичным солям щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аммония, включая аммониевые, бариевые, кальциевые, литиевые, магниевые, калиевые, протаминцинковые соли и натриевые соли, которые получают способами, известными в технике. Термин также охватывает нетоксичные, т. е. фармацевтически приемлемые, аддитивные соли кислот, которые обычно получают взаимодействием олигопептидов настоящего изобретения с подходящей органической или неорганической кислотой, такие как ацетаты, бензоаты, бисульфаты, бораты, цитраты, фумараты, гидробромиды, гидрохлориды, лактаты, лаураты, малеаты, напсилаты, олеаты, оксалаты, фосфаты, сукцинаты, сульфаты, тартраты, тозилаты, валераты и т. п.

- 6 006423

Термин фармацевтически приемлемая аддитивная кислая соль относится к солям, сохраняющим биологическую эффективность и свойства свободных оснований и не являющимся биологически или иным образом нежелательными, образованным с неорганическими кислотами, такими как бромоводородная кислота, хлороводородная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, серная кислота, и органическими кислотами, такими как уксусная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, лимонная кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, гликолевая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, пропионовая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, винная кислота и т.п.

Термин фармацевтически приемлемый сложный эфир относится к эфирам, сохраняющим после гидролиза эфирной связи биологическую эффективность и свойства своих составляющих, а именно карбоновой кислоты или спирта, и не являющимся биологически или иным образом нежелательными. В настоящем изобретении также рассматривается применение таких композиций, которые представляют собой как эфиры, описанные выше, так в то же время и их фармацевтически приемлемые аддитивные кислые соли.

Соли изобретения можно получить путем растворения свободного олигопептида в водном или водно-спиртовом растворителе или в других подходящих растворителях вместе с соответствующим основанием и последующего выделения полученной соли изобретения путем упаривания раствора путем вымораживания и лиофилизации или путем добавления к водному и/или водно-спиртовому раствору соли олигопептида другого растворителя, например диэтилового эфира, и осуществления отделения нерастворимой сырой соли. Как правило, для образования соли используют один или максимум два моля основания, т.е. катиона, и один моль свободного олигопептида. Для получения солей олигопептидов и щелочных металлов используют предпочтительно карбонаты или гидрокарбонаты щелочных металлов. Полученные соли пептидов хорошо растворяются в воде. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения солей олигопептидов.

В контексте настоящего изобретения основание рассматривается как вещество, способное образовывать катион в растворе, в частности в водном и водно-спиртовом растворе.

Термин фармацевтически приемлемый амид относится к амидам, сохраняющим после гидролиза амидной связи биологическую эффективность и свойства карбоновой кислоты или амина и не являющимся биологически или иным образом нежелательными. Такие амиды, как правило, образуются из соответствующей карбоновой кислоты и амина. В данном изобретении также рассматривается применение таких композиций, которые представляют собой как амиды, описанные выше, так в то же время и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли кислот.

Методы получения фармацевтически приемлемых эфиров и амидов описываются, например, в Матей Айуапсей Отдашс СйетШгу, 3гй Ей., 1о1т Айсу & 8опк, Νο\ν Уогк (1985), р. 1152. Фармацевтически приемлемые эфиры и амиды, полезные в качестве пролекарств, описываются в Випйдаагй, Н., ей., (1985), Иеадп οί Ргойгийк, Е1кеу1ег 8аепсе РиЬйкйегк, АтДегйат.

Термин фармацевтически или терапевтически приемлемый носитель относится к среде носителя, не влияющей на эффективность биологической активности активных ингредиентов, которая нетоксична для хозяина или пациента.

Термин терапевтически или фармацевтически эффективное количество в применении к олигопептидам и композициям настоящего изобретения относится к количеству олигопептида или композиции, достаточному для получения нужного биологического результата. Таким результатом может быть облегчение признаков, симптомов или причин болезни или любое другое желательное изменение биологической системы. В настоящем изобретении результатом будет являться, например, в особо предпочтительном варианте воплощения активность, имитирующая ТРО, а именно селективное предупреждение, устранение и/или ослабление симптомов тромбоцитопении, например повышение числа тромбоцитов и/или предупреждение падения числа тромбоцитов.

Аминокислотные остатки олигопептидов настоящего изобретения представлены в виде аббревиатур так, как это обычно делается, следующим образом: фенилаланин - Рйе или Е; лейцин - Ьеи или Ь; изолейцин - 11е или I; метионин - Ме1 или М; валин - Уа1 или V; серин - 8ег или 8; пролин - Рго или Р; треонин - Тйг или Т; аланин - А1а или А; тирозин - Туг или Υ; гистидин - Н1к или Н; глутамин - О1п или О; аспарагин - Акп или Ν; лизин - Ьук или К; аспарагиновая кислота - Акр или Ό; глутаминовая кислота О1и или Е; цистеин - Сук или С; триптофан - Тгр или А; аргигин - Агд или К; глицин - О1у или О.

Таким образом, например, А К О представляет собой непрерывную цепочку, т.е. трипептид, состоящий из аланина, аргинина и глицина, в то время как К А К представляет собой непрерывную цепочку из аргинина, аланина и аргинина.

Настоящее изобретение относится не только к олигопептидам, представленным в 8ЕО Ш N0: 1-6, но также к биологическим эквивалентам, т.е. веществам с другой структурой, но проявляя подобные или сравнимые биологические действия, в частности, к их производным, обладающим сходной или сравнимой структурами и/или функциями и действующим как модуляторы ТРО-К. Такие биологические эквиваленты, в частности производные, могут отличаться от олигопептидов настоящего изобретения в отно

- 7 006423 шении чувствительности к гидролизу или протеолизу и/или в отношении других биологических свойств, таких как повышенная аффинность в отношении ТРО-рецептора. Таким образом, изобретение также относится, например, к фармацевтически приемлемым солям, амидам или эфирам олигопептидов настоящего изобретения.

Таким образом, кроме олигопептидов, состоящих только из природных аминокислот, речь идет также о пептидомиметиках или пептидных аналогах. Пептидные аналоги обычно используются как непептидные лекарственные средства со свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Такие типы непептидных соединений называют веществами, имитирующими пептид или пептидомиметиками. Пептидомиметики, схожие по строению с терапевтически полезными пептидами, можно использовать для получения эквивалентного или усиленного лечебного или профилактического действия. В целом, пептидомиметики схожи по строению с образцовым полипептидом (т.е. полипептидом, обладающим биологической или фармакологической активностью), таким как встречающийся в природе рецепторсвязывающий полипептид, но содержат одну или более пептидных связей, необязательно замененных способами, известными в технике, связью, выбранной из группы, состоящей из -ΟΗ₂-ΝΗ-ΝΗ-, -С-СН₂-§-, -СН₂-СН₂-, -СН=СН- (цис- и транс-), -СОСН₂-, -СН(ОН)-СН₂- и -СН₂-§0-. Особенно предпочтительной непептидной связью является -СН₂-ЫН-. Такие пептидомиметики могут иметь существенные преимущества перед вариантами полипептидов, в том числе, например, улучшенную химическую устойчивость, усиленные фармакологические свойства (период полужизни, поглощение, силу, эффективность и т.п.), более экономичное получение, измененную специфичность (например, широкий спектр биологических активностей), пониженную антигенность и т.п. Мечение пептидомиметиков обычно включает ковалентное присоединение одной или более меток, непосредственно или через спейсерную группу, например аминогруппу, в положениях, не влияющих на свойства пептидомиметика, которые определены предварительно по данным о строении и активности и/или методом молекулярного моделирования. Такие не влияющие на свойства положения, как правило, являются положениями, в которых не образуется прямых контактов с макромолекулами, например молекулами суперсемейства иммуноглобулинов, с которыми пептидомиметик связывается с проявлением лечебного действия. Дериватизация, например мечение, пептидомиметиков не должна существенно влиять на нужную биологическую или фармакологическую активность пептидомиметика. Как правило, пептидомиметики рецепторсвязывающих пептидов связываются с рецептором с высокой аффинностью и обладают детектируемой биологической активностью, т.е. являются агонистами или антагонистами в отношении одного или более опосредуемых рецептором фенотипических изменений.

В контексте настоящего изобретения замещение одной или более Ь-аминокислот на Όаминокислоту того же типа (например, Ό-лизин вместо Ь-лизина) можно использовать для получения более устойчивых пептидов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к олигопептидам, содержащим консенсусную последовательность, идентифицируемую одной из приведенных выше общих формул, или, по существу, идентичный вариант консенсусной последовательности, который можно получить способами, известными в технике, например путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных к образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков, которые циклизуют пептид.

Настоящее изобретение относится не только к вышеуказанным олигопептидам в линейной форме, но, конечно, также относится к циклизованным олигопептидам, например циклизованным с помощью амидной связи между первой и последней аминокислотами.

Определение синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты относится к аминокислотам, которые не встречаются в природе ίη νίνο, но которые, тем не менее, можно включить в олигопептид настоящего изобретения. К другим предпочтительным синтетическим аминокислотам относятся аминокислоты, в которых аминогруппа отделена от карбоксильной группы более чем одним атомом углерода, таким как β-аланин или γ-аминомасляная кислота. Особенно предпочтительными синтетическими аминокислотами являются Ό-аминокислоты естественных Ь-аминокислот, Ь-1-нафтилаланина, Ь2-нафтилаланина, Ь-циклогексилаланина, Ь-2-аминоизомасляная кислота, сульфоксидные и сульфоновые производные метионина.

Термин детектируемая метка относится к веществам, которые, когда они ковалентно связаны с олигопептидами, олигопептидомиметиками и/или антителами настоящего изобретения, позволяют детестировать олигопептид и олигопептидомиметики в системе ίη νίνο, например, у пациента, которому введен олигопептид или олигопептидомиметик, или ίη νίίτο. Подходящие детектируемые метки хорошо известны в технике, например радиоактивные изотопы и флуоресцентные метки (например, флуоресцеин).

Ковалентное присоединение детектируемой метки к олигопептиду или олигопептидомиметику осуществляют обычными способами, хорошо известными в технике. Например, когда в качестве детектируемой метки используют радиоактивный изотоп 125 I, ковалентного присоединения 125 I к олигопептиду или олигопептидомиметику можно достичь путем включения в олигопептид или олигопептидомиметик аминокислоты тирозина с последующим иодированием олигопептида. Также в олигопептид или олигопептидомиметик можно включить 32 Р в виде фосфорсодержащей группы через, например, гидро

- 8 006423 ксильную группу в пептиде или пептидомиметике.

Олигопептиды изобретения можно получить обычными способами, известными в технике, например, с использованием стандартных твердофазных методов. Стандартные методы включают, но не ограничиваются перечисленным, полностью твердофазный синтез, методы с частичным твердофазным синтезом, конденсацию фрагментов, классический синтез в растворе и технологию рекомбинантных ДНК. Таким образом, олигопептиды настоящего изобретения можно получить непосредственно рекомбинантными методами (см. 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу-Мапиа1, С8НЬ Рге88, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ 1989) или в виде слитого белка, например с белком, являющимся одним компонентом из пары при специфическом связывании, причем допускается очистка слитого белка с помощью аффинных реагентов с последующим протеолитическим расщеплением, как правило, в месте, созданном методами генной инженерии, с образованием нужного пептида.

Олигопептиды можно удлинить и получить удобные сайты присоединения, например цистеин или лизин, для повышения устойчивости, для связывания с определенными рецепторами, для обеспечения сайтнаправленного действия, для облегчения очистки, для изменения физических свойств (например, растворимости, заряда и т. п.), для стабилизации конформации и т. п. Олигопептиды можно соединить с фланкирующими областями недикого типа в виде слитых белков, соединить или с помощью линкерных групп, или ковалентно соединить через цистеин (дисульфид), или пептидных связей. Олигопептид можно присоединить через различные бифункциональные агенты, такие как малеимидобензойная кислота, метилдитиоуксусная кислота, меркаптобензойная кислота, 8-пиридилдитиопропионат и т.п. Олигопептиды можно соединить с одной аминокислотой по Ν- или С-концу аминокислотной цепи или можно осуществить внутреннее соединение. Например, олигопептиды настоящего изобретения можно соединить ковалентно с иммуногенным белком, таким как гемоцианин слизня, овальбумин и т. п., для облегчения получения антител к целевым олигопептидам.

Олигопептиды настоящего изобретения можно экспрессировать в сочетании с другими пептидами или белками, так что они являются частью цепи, или внутри цепи, или по Ν- или С-концу. Такой слитый олигопептид называют слитым или конъюгированным пептидом. Можно получить различные постэкспрессионные модификации, включая гликозилирование. Например, используя подходящие кодирующие последовательности, можно осуществить фарнезилирование или пренилирование так, что целевой пептид будет связан с липидной группой по одному концу и будет способен встраиваться в липидную мембрану, такую как липосома. Олигопептиды настоящего изобретения можно обработать полиэтиленглиголем, когда полиэтиленоксидная группа обеспечивает увеличенное время полужизни в кровотоке. Олигопептиды настоящего изобретения также можно связать с сывороточным белком, например альбуминами. Олигопептиды также можно соединить или с помощью слитого белка, или путем ассоциации с другими белками, такими как Рс изотипа 1дС. для усиления связывания комплемента, или с токсином, таким как рицин, абрин, дифтерийный токсин, или подобным токсином, в частности цепью А. Олигопептиды можно соединить с антителами для сайтнаправленного действия. Следовательно, настоящее изобретение также относится к пептидным конъюгатам, содержащим, помимо прочего, олигопептиды настоящего изобретения.

Олигопептиды настоящего изобретения могут служить в качестве структурных моделей для непетидных соединений с подобной биологической активностью. Специалисты в данной области техники знают, что доступно множество методов конструирования соединений с одинаковой или подобной нужной биологической активностью, таких как олигопептиды настоящего изобретения, но с более благоприятной активностью, чем у первых в отношении растворимости, устойчивости и чувствительности к гидролизу и протеолизу. Такие методы включают замену пептидного селета селетом, состоящим из фосфатов, амидов, карбонатов, сульфонамидов, вторичных аминов и Ν-метиламинокислот.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к рекомбинантному получению олигопептидов настоящего изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим олигопептиды, идентифицированные в 8ЕО Ш N0: 1-7, которые вследствие вырожденности генетического кода охватывают более чем шесть различных нуклеотидных последовательностей. Конечно, настоящее изобретение также относится к вышеуказанным нуклеотидным последовательностям, мутированным, например, путем присоединений, делеций, вставок или инверсий нуклеотидов до тех пор, пока кодированный олигопептид обладает нужным действием модулятора ТР0-К по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим вышеуказанные нуклеотидные последовательности, которые можно ввести и экспрессировать в системах клеток-хозяев с использованием обычных материалов и методов. Элементы ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сайты полиаденилирования, сигналы терминации транскрипции и т.п., должны ассоциироваться с нуклеотидными последовательностями с тем, чтобы стимулировать и регулировать экспрессию. Специфический используемый регуляторный элемент будет зависеть от системы клеток-хозяев, выбранной для экспрессии, когда желательна секреция или олигопептида, или конъюгированного пептида. Вектор в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения может быть бактериальным, вирусным, вектором млекопитаю

- 9 006423 щего или дрожжей, который в особенно предпочтительном варианте содержит идентифицированные выше 5'- и/или 3'-регуляторные элементы, способные управлять экспрессией нуклеотидной последовательности в подходящей клетке-хозяине.

Различные векторы можно использовать в качестве переносчика для введения и экспрессии олигопептидов настоящего изобретения в клетке-хозяине. Такие векторы, полезные в различных типах клетокхозяев, хорошо известны в технике и включают, например, экспрессирующие векторы млекопитающих р865 (81га1адспс). р-РК1 (Сепейск 1пк1йи1е), р-8УК3 (Рйатшас1а), р-ЕИК-С1 (С1оп1есй), рСЭМ (1пуйтодеп), рс ΌΝΆΙ (1пуйтодеи) и бактериальные экспрессирующие векторы рЕЬЛб-1 (ΙΒΙ), все плазмиды системы рЕТ (Цоуадеп), рТтсНк (1пуйтодеп), ряд рСЕХ (Рйатшааа) и рКК 233-2 (С1оп1есй). Указанные векторы могут сохраняться в клетке-хозяине в виде эписом и/или они могут облегчать интеграцию нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения в геном клетки-хозяина. Векторы также могут иметь другие полезные свойства, например, содержать гены, позволяющие отбирать или детектировать клетки, в которые их можно успешно ввести.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленным, прокариотических и эукариотических хозяев, таких как ВасШик киЬБШк, Е. со11, дрожжи, ооциты Хепорик 1аеу15. клетки насекомых, растительные клетки и множество типов клеток млекопитающих, включая, в частности, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки Не1а, клетки Ь(1к-), первичные культуры, клетки Сок17, клетки Сок1, клетки почек детеныша хомяка и клетки СУ1.

Клетки-хозяева, обеспечивающие гликозилирование, также включены в настоящее изобретение.

Настоящее изобретение также относится к способам генетической модификации клетки путем трансфицирования клетки идентифицированным выше вектором. Трансфекции можно достичь обычными способами, такими как трансфекция, индуцированная биологическими, физическими, химическими или электрическими факторами, в частности электропорацией, слиянием клеток, переносом генов, опосредуемым липосомами, или бомбардировкой частицами.

Настоящее изобретение также относится к способам получения животных-млекопитающих, не являющихся человеком, способных продуцировать олигопептиды настоящего изобретения в своих клетках, когда в клетку животного-млекопитающего, не являющегося человеком, вводят нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, в частности, на этапе не позднее 8 клеток, предпочтительно 1 клетки, которая, по существу, культивируется в соответствующих условиях с тем, чтобы получить взрослое дифференцированное животное. Такое животное может содержать в своих эмбриональных клетках или соматических клетках, в частности, в своей хромосоме, нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, способную экспрессировать олигопептид настоящего изобретения. В особенно предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения таким животным-млекопитающим является грызун или примат. Такой способ может допускать различные виды генной терапии, например соматическую генную терапию или генную терапию эмбриональной линии клеток.

Настоящее изобретение также охватывает генетически модифицированных, в частности, трансгенных, животных, в особенности млекопитающих, в частности приматов и мышей, и их клетки. Такие животные, содержащие, по меньшей мере, в некоторых своих клетках, например, трансфицированные смысловые или антисмысловые конструкции нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения под контролем регуляторных элементов, полезны для исследовательских и диагностических целей в силу модификации активности ТРО-Р. Модификация ТРО-Р в трансгенных животных возможна, например, путем использования смысловых или антисмысловых нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения или любых модификаций указанных последовательностей, таких как инверсии, делеции, вставки, присодинения и т.п., для трансформации и получения таких животных, являющихся генетически модифицированными. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения векторы или олигонуклеотиды настоящего изобретения трансфицируют и интегрируют в геном клетки млекопитающего, не являющегося человеком, с тем, чтобы экспрессировать олигопептид, способный модулировать активность ТРО-Р. В другом варианте воплощения настоящего изобретения векторы или олигонуклеотиды настоящего изобретения трансфецируют и встраивают в геном, в частности, в эндогенный ген ТРО-Р, путем гомологичной рекомбинации с тем, чтобы получить животных, экспрессирующих модифицированный ТРО-Р. Таким образом, настоящее изобретение также относится к животным, генетически модифицированным, которые, в отличие от животного дикого типа, проявляют функцию модифицированного ТРО-Р. Такая модифицированная функция млекопитающего, в частности, в клетке млекопитающего, не являющегося человеком, может иметь место из-за введения антисмысловых или смысловых конструкций настоящего изобретения, возможно содержащих изменения в нуклеотидных последовательностях, и/или из-за манипуляций в эндогенных нуклеотидных последовательностях ТРО-Р. В силу указанных модификаций, таких как вставки дополнительных мутированных или немутированных смысловых или антисмысловых копий последовательностей, кодирующих ТРО-Рр, созданных согласно настоящему изобретению, или модификаций в эндогенных генах возможно получение полезных животных для вышеуказанных целей. Таким образом, настоящее изобретение также относится к отдельным клеткам млекопитающего, не являющегося человеком, или клеточным культурам, содержащим вышеуказанные модифика

- 10 006423 ции.

Настоящее изобретение также относится к способу получения олигопептида настоящего изобретения, включающему трансфекцию клетки вектором по настоящему изобретению, культивирование клетки в культуральной среде в условиях, допускающих экспрессию олигопептида, и извлечение олигопептида из клетки или культуральной среды с использованием обычных методов.

Настоящее изобретение также относится к моноклональным или поликлональным антителам или их фрагментам, специфически связывающимся с олигопептидами настоящего изобретения. Такие антитела можно использовать для обнаружения и выделения олигопептидов настоящего изобретения, их структурных аналогов или даже самого ΤΡΘ-Κ. В случае, когда олигопептиды или ΤΡΟ-Ε присутствуют в содержащих ΤΡΟ-Ε или содержащих олигопептиды источниках, таких как клетка, часть клетки или клеточная органелла, могут быть необходимы дополнительные манипуляции перед детектированием или выделением, такие как обычные способы разрушения биологического материала, например ферментативный лизис клеток.

Изобретение также относится к моноклональным или поликлональным антителам, специфически распознающим описанные выше антитела и связывающимся с ними.

Настоящее изобретение также относится к иммуноанализу для детектирования олигопептидов настоящего изобретения и/или выделения олигопептидов по настоящему изобретению из смеси, содержащей олигопептиды, при котором антитела настоящего изобретения приводят в контакт со смесью, и детектируют и/или выделяют олигопептиды. Напротив, иммуноанализ можно использовать для детектирования антител настоящего изобретения, используя олигопептиды настоящего изобретения в качестве зонда.

Олигопептиды настоящего изобретения могут быть использованы ίη νίίτο как уникальные инструменты для анализа биологической роли ТРО, включая оценку многих факторов, вовлеченных в продуцирование ТРО и процесс связывания рецепторов. Олигопептиды настоящего изобретения также можно использовать при разработке других соединений, связывающихся с ΤΡΟ-Κ. и активирующих его, поскольку олигопептиды настоящего изобретения предоставляют важную информацию о соотношении между структурой и активностью.

Олигопептиды настоящего изобретения также можно использовать в качестве конкурирующих связующих при анализах для скрининга на другие агонисты ТРО-рецептора. Олигопептиды изобретения можно использовать без модификации, или их можно модифицировать, например, путем ковалентного или нековалентного присоединения метки, которая прямо или опосредованно обеспечивает детектируемый сигнал. Прямые метки включают такие группы-метки, как радиоактивные метки, ферменты, такие как пероксидаза и щелочная фосфатаза, и флуоресцентные метки, предоставляющие возможность контроля по изменению интенсивности флуоресценции, сдвигу длины волны или поляризации флуоресценции. К опосредованному мечению относится биотинилирование одной составляющей с последующим связыванием с авидином, присоединенным к одной из вышеуказанных меток. Соединения также могут содержать спейсерные группы в случаях, когда соединения присоединяются к твердой подложке.

На основании их способности связываться с ТРО-рецептором олигопептиды настоящего изобретения можно использовать в качестве реагентов для детектирования ТРО-рецепторов на мембранах, клеточных органеллах, компартментах, живых клетках, фиксированных клетках, в биологических жидкостях, в гомогенатах тканей, в очищенных природных биологических материалах, в неочищенных экстрактах и т. п. Например, путем мечения олигопептидов настоящего изобретения можно идентифицировать клетки, имеющие ΤΡΟ-Ε на своей поверхности. Кроме того, основываясь на их способности связываться с ΤΡΟ-Ε, олигопептиды настоящего изобретения можно использовать при окрашивании ίη 8Йи, РЛС8 (клеточном сортере с возбуждением флуоресценции), вестерн-блоттинге, ЕЫ8Л и т.п. Кроме того, основываясь на их способности связываться с ΤΡΟ-Ε, олигопептиды настоящего изобретения можно использовать в способах выделения и очистки ΤΡΟ-Ε или при выделении и очистке клеток, экспрессирующих ΤΡΟ-Ε на поверхности клетки или в проницаемых клетках.

Настоящее изобретение также относится к применению олигопептидов настоящего изобретения, иммобилизованных, например, на твердой подложке согласно обычным способам, для вышеуказанных процедур скрининга и выделения. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения, в частности в существующем анализе для отбора, олигопептиды связываются без диффузии с нерастворимой подложкой в отдельных областях, где находится образец, например, с титрационным микропланшетом. Нерастворимые подложки можно получить из любой композиции, с которой могут связываться олигопептид или рецептор, которая легко отделяется от растворимого материала и в других отношениях во всем совместима со способом скрининга. Поверхность таких подложек может быть твердой или пористой и любой удобной формы. Примерами подходящих нерастворимых подложек являются титрационные микропланшеты, мембраны и гранулы. Они, как правило, изготовляются из стекла, пластика, например полистирола, полисахаридов, нейлона или нитроцеллюлозы.

Конечно, настоящее изобретение также относится к описанным выше способам выделения и скрининга с использованием олигопептидов и/или антител против таких олигопептидов, при высокой производительности способов скрининга и/или выделения, например в растворе без использования иммобили

- 11 006423 зованных веществ.

Олигопептиды настоящего изобретения также можно использовать как коммерческие реагенты для различных применений в медицине при исследованиях и диагностике. К таким применениям относятся, но не ограничиваются перечисленным, (1) применение в качестве калибровочного стандарта для количественной оценки активностей ТРО или возможных агонистов ТРО при различных функциональных анализах; (2) применение для сохранения пролиферации и роста ТРО-зависимых клеточных линий; (3) применение при структурном анализе ТРО-рецептора с помощью сокристаллизации; (4) применение для исследования механизма активации сигнальной трансдукции/рецептора и (5) другие применения для поиска и диагностики, где ТРО-рецептор предпочтительно активируется или такая активация калибруется обычным образом против известного количества ТРО или агониста ТРО.

Олигопептиды настоящего изобретения можно использовать для размножения ίη νίίτο мегакариоцитов и их коммитированных предшественников как самих по себе, так и в сочетании с другими цитокинами, такими как ТРО. Химиотерапия и облучение вызывают тромбоцитопению путем уничтожения быстро делящихся более зрелых популяций мегакариоцитов. Однако такие методы лечения также могут снизить число и жизнеспособность незрелых митотически менее активных клеток предшественников мегакариоцитов. Соответственно, улучшение при тромбоцитопении с помощью олигопептидов настоящего изобретения в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения можно усилить использованием пациентами по завершении химиотерапии или лучевой терапии популяции их собственных клеток, обогащенных мегакариоцитами и незрелыми предшественниками за счет их культивирования ίη νίίτο.

Олигопептиды изобретения и/или ТРО-Рр дикого типа и/или антитела, специфически связывающиеся с ними, также можно вводить животным, в том числе млекопитающим, таким как грызуны и приматы, включая людей, для модуляции, в частности активации, ТРО-Р ίη νίνο и/или для повышения или сохранения существующего числа тромбоцитов. Таким образом, настоящее изобретение охватывает способы лечения связанных с ТРО расстройств, включающие введение олигопептида изобретения в количествах, достаточных для модуляции действия ТРО-Р ίη νίνο. Например, олигопептиды и композиции настоящего изобретения можно вводить для лечения различных гематологических нарушений, включая тромбоцитарные нарушения и тромбоцитопению, и других расстройств, в частности, связанных с трансфузиями костного мозга, лучевой терапией и химиотерапией. Такое введение также может включать применение ТРО.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам модуляции, в частности повышения или понижения активности, ТРО-Р, где олигопептиды настоящего изобретения или антитела, специфически связывающиеся с ними, применяют к ТРО-Р или в отсутствие, или в присутствии ТРО. Такой способ может представлять собой способ ίη νίνο или ίη νίίτο.

Олигопептиды и композиции настоящего изобретения в предпочтительном варианте будут вводиться профилактически до или одновременно с химиотерапией, лучевой терапией или пересадкой костного мозга или после такого воздействия.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента по меньшей мере один из олигопептидов изобретения и/или олигопептид ТРО-Рр дикого типа в сочетании с фармацевтическим носителем или разбавителем. Композиции данного изобретения можно вводить системно или местно, в частности внутрисосудистым, пероральным, легочным, парентеральным способом, например, внутримышечной, интраперитонеальной, внутривенной (IV) или подкожной инъекцией, или ингаляцией, например, композиции в виде мелкого порошка, трансдермальным, назальным, вагинальным, ректальным или подъязычным способом введения, и они могут быть составлены в лекарственных формах, соответствующих каждому способу введения. Олигопептиды настоящего изобретения и/или олигопептид ТРО-Рр дикого типа можно использовать в таких композициях в форме фармацевтически приемлемых соли, эфира, амида, и/или свободного основания предпочтительно в фармацевтически эффективном количестве.

К твердым лекарственным формам для перорального введения относятся капсулы, подъязычные таблетки, таблетки, пилюли, порошки, липосомы, пэтчи, таблетки с покрытием для пролонгированного действия и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешивается по меньшей мере с одним инертным фармацевтически приемлемым носителем, таким как лактоза, сахароза или крахмал. Такие лекарственные формы кроме инертных разбавителей также могут содержать другие вещества, например смазывающие вещества, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут содержать связующие и/или буферные вещества, а также корригенты. Таблетки и пилюли также могут быть получены с энтеросолюбильным покрытием.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно используемые в технике, такие как вода. Кроме таких инертных разбавителей композиции также могут содержать соли для изменения осмотического давления, соединения, регулирующие рН, средства, проникающие через кожу, смачивающие вещества, эмульгаторы и суспендирующие вещества и подсластители, вкусовые вещества и отдушки.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению для парентерального введения вклю

- 12 006423 чают стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей или носителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и пригодные для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Такие лекарственные формы также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергаторы. Их можно стерилизовать, например, фильтрацией через фильтр, задерживающий бактерии, путем включения в композиции стерилизующих веществ, посредством облучения композиций или нагреванием композиций. Их также можно получить непосредственно перед применением с использованием стерильной воды или какой-то другой стерильной среды для инъекций.

Композиции для инъекций будут содержать физиологически приемлемую среду, такую как вода, физиологический раствор, РВ8, водный этанол, водный этиленгликоль и подобные вещества. К водорастворимым консервантам, которые можно использовать, относятся бисульфит натрия, тиосульфат натрия, аскорбат, хлорид бензалкония, хлорбутанол, тимеросал, фенилртуть борат, парабены, бензиловый спирт и фенилэтанол. Такие агенты могут присутствовать в количествах от примерно 0,001 до примерно 5 мас.% и предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 2%. Подходящими водорастворимыми буферными веществами, которые можно использовать, являются карбонаты, фосфаты, бикарбонаты, цитраты, бораты, ацетаты, сукцинаты и т. п. щелочных или щелочно-земельных металлов, такие как фосфат, цитрат, борат, ацетат, бикарбонат и карбонат натрия. В качестве носителя можно использовать добавки, такие как карбометилцеллюлоза, в количестве от примерно 0,01 до примерно 5 мас.%. Состав будет изменяться в зависимости от назначения композиции, конкретного используемого способа модуляции активности рецептора, назначенного лечения и т.п.

Композициями для ректального или вагинального введения являются, предпочтительно, суппозитории, которые кроме активного вещества могут содержать эксципиенты, такие как масло какао или воск для суппозиториев. Композиции для назального или подъязычного введения также получают со стандартными эксципиентами, хорошо известными в технике.

Композиции, содержащие олигопептиды настоящего изобретения и/или ТРО-Вр дикого типа, можно вводить для профилактики и/или лечения. При лечебных применениях композиции вводят пациенту, уже страдающему описанными выше заболеваниями, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, для частичного устранения симптомов болезни и ее осложнений, т.е. терапевтически эффективном количестве.

При профилактических применениях композиции, содержащие олигопептиды настоящего изобретения и/или ТРО-Вр дикого типа, вводят пациенту, чувствительному к определенной болезни или с риском развития такого заболевания. Такое количество определяется как профилактически эффективная доза. При данном применении точное количество также зависит от состояния здоровья и массы пациента.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения также можно вводить в форме депо, такой как композиция с отсроченным высвобождением лекарственного средства. Такая композиция с отсроченным высвобождением может включать олигопептидсодержащие частицы в матрице, полученной, например, из коллагена.

Количества агониста ТРО настоящего изобретения, необходимые для эффективного лечения, будут зависеть от многих различных факторов, включая средства введения, цель, физиологическое состояние пациента и другие вводимые лечебные средства.

Олигопептиды настоящего изобретения и/или ТРО-Вр дикого типа эффективны при лечении опосредуемых ТРО состояний, когда вводятся в интервале доз от примерно 0,03 до примерно 10 мг на кг массы тела млекопитающего в сутки, в частности от примерно 0,3 до примерно 1 мг/кг. Конкретная используемая доза регулируется конкретным состоянием, от которого лечат, способом введения, а также предписанием лечащего врача, зависящим от факторов, таких как тяжесть состояния, и возраста и общего состояния пациента.

Олигопептид настоящего изобретения и/или ТРО-Вр дикого типа можно вводить отдельно или вместе с ТРО, причем дозу последнего можно снизить на 50 или 25% (в отличие от обычной дозы ТРО) благодаря усиливающему действию олигопептидов настоящего изобретения.

Композиция настоящего изобретения, предпочтительно водорастворимая композиция, также может содержать водорастворимый белок, при инъекции в жидкости организма не проявляющий какой-либо существенной фармакологической активности в используемой концентрации в стандартной лекарственной форме по настоящему изобретению (называемый далее водорастворимым белком). В качестве такого водорастворимого белка предпочтительны сывороточный альбумин, глобулин, коллаген и/или желатин. Такой белок можно добавлять в количествах, обычно используемых в фармацевтических композициях для инъекций. Так, например, массовое соотношение между водорастворимым белком и олигопептидом настоящего изобретения составляет примерно от 0,0001:1 до 100:1, предпочтительно от примерно 0,001:1 до примерно 10:1 или предпочтительнее от примерно 0,01:1 до примерно 1:1.

Далее, изобретение также относится к самим вышеуказанным олигопептидам и композициям, содержащим их, в частности, в высушенной и/или чистой форме или в форме водного или водно- 13 006423 спиртового раствора. Величина рН раствора, полученного из водорастворимой композиции или соли пептида настоящего изобретения, должна быть такой, чтобы указанный рН не оказывал какого-либо побочного действия на активность фармакологически активного пептида, но находился в интервале, вообще приемлемом для инъекций, и также такой, чтобы указанный рН не вызывал ни значительных изменений вязкости раствора, ни образования осадка или подобных явлений. Таким образом, раствор должен предпочтительно иметь рН примерно 4-7, предпочтительно 5-6, в частности 5,3-5,5.

Когда водорастворимую композицию изобретения превращают в водный раствор для введения, концентрация фармакологически активного олигопептида или его соли в указанном растворе должна составлять предпочтительно примерно 0,0000001-10% (мас./об.), предпочтительнее примерно 0,0000015% (мас./об.) или наиболее предпочтительно примерно 0,00001-1% (мас./об.).

Композиция настоящего изобретения должна предпочтительно иметь стандартную лекарственную форму, содержащую фармакологически активный олигопептид изобретения и, при необходимости, другие добавки, такие как указанный выше водорастворимый белок. Так, например, готовят два или три указанных выше компонента для помещения в ампулу или флакон, растворяя или суспендируя их в стерильной воде или стерильном физиологическом растворе. В таком случае способ получения может включать смешивание раствора соли фармакологически активного олигопептида и также, при необходимости, раствора добавки или добавление к раствору соли фармакологически активного олигопептида, добавки в форме порошка или любое другое сочетание адекватных процедур. Лекарственную форму также можно получить, добавляя стерильную воду или стерильный физиологический раствор к лиофилизованному или высушенному в вакууме порошку, в который входят соль фармакологически активного олигопептида и, при необходимости, добавка. Такая стандартная лекарственная форма может содержать одну или более обычных добавок, таких как регуляторы рН (например, глицин, соляная кислота, гидроксид натрия), местные анестетики (например, гидрохлорид ксилокаина, хлорбутанол), вещества для придания изотоничности (например, хлорид натрия, маннит, сорбит), эмульгаторы, ингибиторы адсорбции (например, Твин® 60 или 80), тальк, крахмал, лактоза и трагакант, стеарат магния, глицерин, пропиленгликоль, консерванты, бензиловый спирт, метилгидроксибензоат и/или арахидгидроген олеума. Такая стандартная лекарственная форма также может содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как полиэтиленгликоль 400 или декстран.

Композицию настоящего изобретения получают, смешивая указанные ингредиенты обычным способом. Задача смешивания ингредиентов данной композиции должна состоять в том, чтобы сохранилась активность фармакологически активного олигопептида и в процессе смешивания образовывалось минимальное количество пузырьков. Ингредиенты загружают в сосуд (например, в бутыль или барабан) или одновременно, или в любом порядке. Атмосферой в сосуде может быть, например, стерильно чистый воздух или стерильно чистый азот. Полученный раствор можно перенести в маленькие флаконы или ампулы и затем можно подвергнуть лиофилизации.

Жидкую форму или форму лиофилизованного порошка композиции настоящего изобретения можно растворить или диспергировать в растворе биоразрушаемого полимера, такого как сополимер молочной и гликолевой кислот, полигидроксимасляная кислота, сополимер гидроксимасляной и гликолевой кислот или их смесь, и затем можно ввести в состав, например, пленок, микрокапсул (микросфер) или нанокапсул (наносфер), в частности, в форму мягких или твердых капсул.

Кроме того, композицию настоящего изобретения, инкапсулированную в липосомах, содержащих фосфолипиды, холестерин или их производные, затем можно диспергировать в физиологическом растворе или в растворе гиалуроновой кислоты в физиологическом растворе.

Мягкую капсулу также можно наполнить жидкой формой композиции настоящего изобретения. Твердую капсулу можно наполнить лиофилизованным порошком композиции настоящего изобретения, лиофилизованный порошок композиции настоящего изобретения можно спрессовать в таблетки для ректального введения или перорального введения соответственно.

Конечно, композицию настоящего изобретения можно представить в предварительно заполненном шприце для самостоятельного введения.

Настоящее изобретение также относится к применению олигопептидов настоящего изобретения и ТРО-Вр дикого типа, нуклеотидной последовательности, кодирующей указанные олигопептиды, вектора настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения и/или антитела настоящего изобретения для получения лекарственного средства для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении.

Наконец, настоящее изобретение относится к диагностическим композициям для диагностики гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении, содержащим олигопептид настоящего изобретения или ТРО-Вр дикого типа, нуклеотидную последовательность, кодирующую указанные олигопептиды, векторы настоящего изобретения, клетку-хозяин настоящего изобретения и/или антитела настоящего изобретения, необязательно, в сочетании с приемлемым носителем. В особенно предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения вышеуказанные агенты, используемые в диагностических композициях настоящего изобретения, можно пометить согласно описанному выше. Таким образом, меченные олигопептиды, меченные нуклеотидные последовательности, меченные клетки и/или ме

- 14 006423 ченные антитела настоящего изобретения можно использовать для специфического детектирования состояний, связанных с ТРО-Я, в частности расстройств. Подобным образом, как пояснялось выше, меченные агенты можно использовать для идентификации и выделения возможных других лекарственных средств.

Хотя выше конкретно описываются только предпочтительные варианты воплощения изобретения, очевидно, что возможны модификации и варианты без отклонения от сущности и объема данного изобретения. Другие предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения охватываются формулой изобретения.

8ЕО ΙΌ N0: 1-7 представляют аминокислотные последовательности олигопептидов настоящего изобретения.

Длина пептида определяется по номеру положения первой и последней аминокислоты в полноразмерной последовательности ТРО-Яр (называемой также диким типом), как описывается в \УО 99/42127, касающейся аминокислотной последовательности ТРО-Яр дикого типа и ее получения, включенной в данное описание в качестве ссылки. Отдельные аминокислотные замены называются по обычной номенклатуре, например Я9А является описанием того, что исходный остаток аргинина в положении 9 ТРО-Яр дикого типа заменен на аланин.

Перечень фигур

Фиг. 1 - влияние олигопептидов настоящего изобретения на мышей, обработанных карбоплатином (180 мг/кг);

фиг. 2 - влияние олигопептидов настоящего изобретения на мышей, обработанных карбоплатином (200 мг/кг);

фиг. 3-6 - результаты исследований устойчивости в форме профилей ВЭЖХ, фиг. 3: день 0, 30 нммоль 1 мМ раствора, восстановленного из сухого порошка, фиг. 4А: день 2, образцы хранились в виде 1 мМ раствора, фиг. 4В: день 2, образцы хранились в виде сухого порошка, фиг. 5А: день 9, образцы хранились в виде 1 мМ раствора, фиг. 5В: день 9, образцы хранились в виде сухого порошка, фиг. 6А: день 1 4, образцы хранились в виде 1 мМ раствора, фиг. 6Б: день 14, образцы хранились в виде сухого порошка.

Пример 1. Влияние ТРО-Яр (дикого типа и олигопептидов настоящего изобретения) при лечении тромбоцитопении, вызванной карбоплатином I.

Методы.

Модель, используемая для экспериментов ίη νίνο, описана ранее (Лка1юп е! а1. (1996), 8!ет Се 115. 14:678-689; Лкайоп е! а1. (1996), Вг. 1. Наешо!о1., 94:722-728; 8ЫЬиуа е! а1. (1998), Β1οοά, 91:37-45; Апбге\\х е! а1. (1996), 8!ет Се1к, 14: 661-677). Усовершенствования и модификации, которые были сделаны, указываются ниже.

Схема дозирования.

Каждая испытуемая группа (с РВ8, ТРО или ТРО-Я) получает одну ежесуточную дозу, вводимую интраперитонеально. Ежесуточное введение доз начинают в день 0 и продолжают в течение всего эксперимента (день 10). Две ί.ρ. инъекции карбоплатина, каждая по 90 мг/кг (для группы 11 - РВ8), дают в дни 0 и 4.

Взятие образцов крови.

Образцы крови берут в дни 0 (базовый), 8, 11, 14 и 18. Образец крови получают путем забора крови у мышей (самцы мышей С57ВЬ/6У в возрасте 8 недель) из хвоста с последующей каутеризацией. Кровь в количестве 80 мкл от каждой мыши собирают в гепаринизированные пробирки для сбора крови. Затем 80 мкл крови смешивают со 160 мкл физиологического раствора, содержащего ЭДТА (0,225%) в количестве, достаточном для предотвращения свертывания.

Влияние ТРО-Яр с 8ЕО ΙΌ ЫО: 2 (ТРО-Яр, 1-18, Я9А, Я11А) и ЫО 4 (ТРО-Яр, 4-18, Я9А, Я11А) в сравнении с пептидом дикого типа (ТРО-Яр дикого типа, аминокислотная последовательность А Я О О Т Ь Е Ь Я Р Я 8 Я Υ Я Ь 0 Ь Я А Я Ь Ν) проверяют ίη νίνο на мышах с тромбоцитопенией, вызыванной карбоплатином. Карбоплатин используют для того, чтобы вызвать тромбоцитопению. Для того чтобы работать с моделью, напоминающей клинические ситуации настолько, насколько возможно, ранее описанную модель с карбоплатином (Αкайο^^ е! а1. (1996), 8!ет Се118, 14:678-689; Ака1юп е! а1. (1996), Вг. 1. Наетο!ο1., 94:722-728; 81Ьиуа е! а1. (1998), В^б, 91:37-45; Апбгете е! а1. (1996), 8!ет Се1к, 14: 661-677) тщательно исследовали и модифицировали соответствующим образом. Кроме того, тщательно исследовали способ забора крови для того, чтобы работать с животными, показывающими самую сильную реакцию на получаемое лекарственное средство, и которые в то же время испытывают минимальный стресс (см. выше раздел Методы). Так, дозу карбоплатина повышают до 180 мг/кг и дают ее путем двух интраперитонеальных (1.р.) инъекций в день 0 (половину дозы) и день 4 (вторую половину дозы). Карбоплатин вызывает тяжелую тромбоцитопению на восьмой день.

Используемые группы животных приводятся в табл. I.

- 15 006423

Общая доза

Таблица I

Экспериментальные группы при исследованиях ίη νινο

Группа Общая доза Животные

Карбоплатин³

Карбоплатин¹

Карбоплатин³

Карбоплатин³

Карбоплатин³

Карбоплатин³

ТРО-Вр

ТРО-Вр

ТРО-Вр дикого дикого дикого

ТРО-Кр 3Εβ

ТРО-Вр ЗЕО

ТРО-Вр ЗЕО

ГО

ГО типа, типа, типа,

0,03

0,30

0,90 мг/кг/сутки мг/кг/сутки мг/кг/сутки

N0:2, 0,03 мг/кг/сутки

N0:2, 0,30 мг/кг/сутки

N0:2, 0,90 мг/кг/сутки +

ГО

7	Карбогшатин3 + ТРО-кр ЗЕО Ю N0:4,	0,03 мг/кг/сутки	8
8	Карбоплатин3 + ТРО-Вр ЗЕО Ю N0:4,	0,30 мг/кг/сутки	8
9	Карбоплатин3 + ТГО-Кр ЗЕО 1Б N0:4,	0,90 мг/кг/сутки	8

Карбоплатин³ + ТРО, 2,4 мкг/кг/сутки

Без карбоплатина Только карбоплатин® ^а 90 мг/кг карбоплатина в дни 0 и 4

Фиг. 1 показывает существенное падение числа тромбоцитов у мышей, обработанных карбоплатином, и суммирует экспериментальные результаты для вышеуказанных различных экспериментальных групп. Результаты выражаются в процентах изменения от величин для базовых значений от конкретных животных. Фиг. 1 показывает, что пептид ТРО-Вр дикого типа в дозе 300 мкг/кг/сутки и 30 мкг/кг/сутки существенно повышает число тромбоцитов. Следует указать, что в случае очень высокой дозы карбоплатина ТРО в используемой концентрации (2,4 мкг/кг/сутки), которая ранее показывала действие, не может предотвратить падение числа тромбоцитов. Фиг. 1 также показывает, что укороченный пептид ТРО-Вр с 8ЕЭ Ш N0: 2, т.е. с остатками 1-18 и В9А, В11А, обладает сильным защитным действием от вызываемого карбоплатином падения числа тромбоцитов при двух дозах: 300 и 30 мкг/кг/сутки. Защитное действие, вызываемое двумя дозами, равно заметное; однако, на основании данных по уровню выживаемости (см. ниже) наименьшая доза 30 мкг/кг/сутки является особенно важной, в то время как доза 300 мкг/кг/сутки оказывает действие, сравнимое с ТРО-Вр дикого типа. Наивысшая доза пептида 0,9 мг/кг/сутки имеет очень низкое защитное действие для тромбоцитов, что, вероятно, связано с агрегацией пептида. Фиг. 1 также показывает, что самый короткий вариант пептида ТРО-Вр с ЗЕЦ Ш N0: 4, т.е. с остатками 4-18 и В9А, В11А, обладает некоторым действием на содержание тромбоцитов у животных, обработанных карбоплатином. Ни один из используемых пептидов - ТРО-Вр дикого типа, ТРО-Вр 1-18 (В9А, В11А) и ТРО-Вр 4-18 (В9А, В11А) не оказывает существенного влияния на другие компоненты крови. Кроме того, ни одна из обработок не влияет на массу тела животных.

Важно проверить коэффициент выживаемости обработанных животных. Статистическая оценка путем анализа методом СН1-квадратов показывает, что наиболее существенное действие и, таким образом, наивысший коэффициент выживаемости наблюдают с пептидом ТРО-Вр 1-18 (В9А, В11А). Обработка пептидом дикого типа также дает статистически существенный коэффициент выживаемости.

Все описанное выше ясно показывает, что пептид ТРО-Вр 1-18 (В9А, В11А) оказывает существенное восстанавливающее действие в случае тромбоцитопении, вызванной карбоплатином, и улучшает активность соединения ίη νινο в 10 раз.

Пример 2. Влияние ТРО-Вр (дикого типа и олигопептидов настоящего изобретения) при лечении тромбоцитопении, вызванной карбоплатином II.

Методы: схема дозирования.

Каждая испытываемая группа получает одну ежесуточную дозу, вводимую интраперитонеально. Ежесуточное введение доз начинают в день 0 и продолжают в течение всего эксперимента (день 13). В указанные дни 0 и 4; 0, 4 и 8; 0, 4, 8 и 12; дни 8-14 - дают минимальные дозы. Две 1.р. инъекции карбоплатина, каждая по 1 00 мг/кг, дают в дни 0 и 4.

Забор образцов крови.

Образцы крови берут в дни 0 (базовый), 8, 11, 1 4 и 1 8.

Образец крови получают путем забора крови у мышей (самцы мышей С57ВБ/6.Г в возрасте 8 недель) из хвоста с последующей каутеризацией. Кровь в количестве 80 мкл от каждой мыши собирают в гепаринизированные пробирки для сбора крови. Затем 80 мкл крови смешивают со 160 мкл физиологического раствора, содержащего ЭДТА (0,225%) в количестве, достаточном для предотвращения свертывания.

- 16 006423

Дозу карбоплатина повышают до 200 мг/кг и дают ее как кумулятивную дозу путем двух интраперитонеальных (ί.ρ.) инъекций в день 0 (половину дозы) и день 4 (вторую половину дозы). Карбоплатин вызывает тяжелую тромбоцитопению на одиннадцатый день.

Используемые группы животных приводятся в табл. II.

Таблица II

Экспериментальные группы при исследовании ш у1уо

Группа	Общая доза	Схема дозирования (дни)
1	Карбоплатин9 + ТРО-Вр 5Εζ} 10 N0:2, 0,3 мг/кг/сутки	0-13
2	Карбоплатин3 + ТРО-Кр ЗЕ<2 ГО N0:2, 0,3 мг/кг/сутки	0
3	Карбоплатин3 + ТРО-Кр 5Е£) ГО N0:2, 0,3 мг/кг/сутки	0 и 4
4	Карбоплатин3 + ТРО-Вр 5ΕΏ ГО N0:2, 0,3 мг/кг/сутки	0, 4 и 8
5	Карбоплатий3 + ΤΡΟ-Κρ 8Е0 ГО N0:2, 0,3 мг/кг/сутки	0, 4, 8 и 12
6	Карбоплатин3 + ТРО-Вр 5Е0 ГО N0:2, 0,3 мг/кг/сутки	8 и 14
7	Карбоплатин3 + ТРО, 2,4 мкг/кг/сутки	0-13
8	Карбоплатин3 + ТРО, 10 мкг/кг/сутки	0-13
9	Карбоплатин3 + ТРО, 10 мкг/кг/сутки	8-14
20	Без карбоплатина	-
11	Только карбоплатин3	0 и 4

^а 100 мг/кг карбоплатина в дни 0 и 4

Фиг. 2 суммирует результаты, полученные на обработанных карбоплатином мышах, для всех экспериментальных групп (КСЫ-О1303 представляет олигопептид с 8ЕЦ Ш N0:2). Результаты выражаются в процентах изменения от числа тромбоцитов в базовых образцах от конкретных животных.

Фиг. 2 показывает, что пептид в дозе 300 мкг/кг/сутки существенно повышает число тромбоцитов. Следует указать, что доза карбоплатина повышена по сравнению с примером 1 для того, чтобы проверить возможности соединений в случае тяжелой тромбоцитопении, являющейся обычной клинической ситуацией. Гормон ТРО, используемый в концентрации 2,4 мкг/кг/сутки, как в примере 1, при дозе карбоплатина 180 мг/кг также не может защитить от падения числа тромбоцитов. В более высокой дозе 10 мкг/кг/сутки ТРО показывает некоторое действие, статистически значимое. Однако защитное действие, вызываемое олигопептидом с 8ЕО Ш N0: 2, превышает действие, вызываемое ТРО на данной конкретной модели с карбоплатином.

Фиг. 2 также суммирует результаты при испытании возможности снижения дозы олигопептида. Олигопептид в концентрации 0,3 мг/кг/сутки давали только в день 0; дни 0 и 4; 0, 4 и 8 и в дни 0, 4, 8 и 12. Следует отметить, что, как оказывается, введения пептида только в дни 0 и 4 было достаточным для защиты мышей, обработанных карбоплатином. Статистически значимые уровни защиты наблюдают в дни 11 и 1 4. Интересно отметить, что указанные группы с минимальной обработкой показывают большую изменчивость реакции. Такая ситуация не является необычной, так как известно, что индивидуумы реагируют различно на одну и ту же обработку. Тем не менее, это является статистически значимым действием, вызываемым пептидом с 8Е0 Ш N0: 2, получаемым только в дни 0 и 4. Также введение дозы в дни 0, 4 и 8 или 0, 4, 8 и 12 показывает существенное влияние при тромбоцитопении. Влияние, наблюдаемое при таком минимальном введении, сравнимо с действием при непрерывном (дни 0-13) введении олигопептида. Такая возможность снижения дозировки с тем же лечебным действием может являться явным клиническим преимуществом.

Исследования с ТРО-Кр дикого типа и олигопептидами настоящего изобретения показывают, что механизм действия пептидов отличается от механизма действия природного гормона.

Представляется, что действие ТРО на пациентов, которые сначала получают химиотерапию, а через несколько дней получают ТРО, утрачивается. Соответственно, проводят эксперимент, описанный далее.

Группа животных, обработанных карбоплатином, получающих химиотерапевтическое средство со дня 0, получает ТРО в дозе 1 0 мкг/кг/сутки со дня 8 по день 1 4. Подобным образом, другая группа обработанных карбоплатином животных, обработка которых начинается в день 0, получает олигопептид с 8Е0 Ш N0: 2 в дозе 0,3 мкг/кг/сутки со дня 8 по день 14. Результаты также приводятся на фиг. 2. ТРО не показывает существенного действия на тромбоцитопению. Напротив, ТРО-Кр (8Е0 Ш N0: 2) показыва

- 17 006423 ет сохранение количества тромбоцитов, несмотря на тот факт, что его дают после начала лечения. Статистически значимое повышение уровня тромбоцитов у животных, обработанных олигопептидом, наводит на мысль, что его защитное действие проявляется не только тогда, когда его дают при начале лечения. Такой результат показывает не только способность олигопептида настоящего изобретения предотвращать вредное действие карбоплатина, когда его дают после начала лечения, но также показывает, что олигопептид имеет другой механизм действия, чем ТРО. Таким образом, оба эффекта: (ί) схема минимального дозирования и (и) другие механизмы действия - обеспечивают значительные преимущества.

Пример 3. Фармакокинетика олигопептидов ех νίνο.

Методы.

Профили разложения ΤΡΟ-Βρ дикого типа, ΤΡΟ-Βρ 1-18 (Β9Α, Β11Α, ЗЕО ΙΌ N0: 2) и ΤΡΟ-Βρ 4-18 (Β9Α, Β11Α, 8Е0 ΙΌ N0: 4) исследуют в сыворотке человека (пул сыворотки от 200 пациентов) и плазме крысы (пул плазмы от 50 животных). Для того чтобы осуществить детекцию разложения, используют пептиды, меченные ¹²⁵Ι (меченные по Υ14). Методом ВЭЖХ определяют только интактные пептиды и меченные продукты разложения. Поэтому такой анализ, осуществленный в разных точках, отчетливо детектирует, когда разлагается данный пептид. Инкубацию осуществляют при 37°С. Концентрация меченного пептида в таких исследованиях составляет ~1 мкМ.

Результаты.

Результаты разложения пептидов в смешанной плазме крысы приводятся в табл. ΙΙΙ. Видно, что время полужизни ΤΡΟ-Βρ составляет ~12 мин. ΤΡΟ-Βρ 1-18 с ЗЕО ΙΌ N0: 2 показывает в плазме крысы несколько более короткое время полужизни ~1,1 мин, в то время как олигопептид с ЗЕО ΙΌ N0: 4 показывает очень короткое время полужизни ~0,5 мин.

Таблица ΙΙΙ

Устойчивость полипептидов ех νίνο при 37°С. Время полужизни пептидов (мин)

Пептид	Смешанная плазма крысы	Смешанная1, сыворотка человека
ТРО-Кр, дмкий тип	12,1	1,9
ТРО-Нр (1-18; Р.9А, Н11А)	1,1	9,6
ТРО-Кр (4-18; К9А, РИА)	0,5	4,9

Результаты по разложению пептидов в смешанной сыворотке человека также приводятся в табл. ΙΙΙ. В отличие от плазмы крысы, в сыворотке человека ΤΡΟ-Βρ дикого типа имеет время полужизни ~1,9 мин. ΤΡΟ-Βρ 4-18 (Β9Α, Β11Α) имеет улучшенную устойчивость и время полужизни ~4,9 мин. Значительно большее время полужизни получают для олигопептида 1-18 (Β9Α, Β11Α), его время полужизни ~9,6 мин, что представляет устойчивость, повышенную в пять раз по сравнению с олигопептидом дикого типа. Такой факт представляет существенное улучшение, так как большинство пептидов имеет относительно короткое время полужизни ~ 2-3 мин. Следует отметить, что ΤΡΟ-Βρ 1-18, Β9Α, Β11Α показывает ίη νίνο улучшение активности по сравнению с ΤΡΟ-Βρ дикого типа, несмотря на более короткое время полужизни в плазме крысы.

Исследования разложения ΤΡΟ-Βρ 1-18, Β9Α, Β11Α (3 мг/кг) ίη νίνο на крысах после внутривенного введения болюса показывает вычисленное время полужизни в крови 7,3 мин.

Пример 4. Устойчивость пептидов.

Методы.

Используемый метод ВЭЖХ основан на УФ-детекции образца во время элюирования из колоночной системы с обращенной фазой, колонка С8 ΜΙΟΒΟ8ΟΒΒ МУ (Βαίηίη ШйгитеШ Сοтρаηу). Две буферные системы начинаются с 9,5% 5 мМ ТФК (буфер А) и 5% Α0Ν (буфер В). После впрыскивания образца процент В быстро повышают до 10% и затем постепенно в течение 10 мин повышают до 35%. За периодом элюирования образца следует промывка короткой колонки с повышением содержания буфера В до 90%.

Результаты.

Устойчивость ΤΡΟ-Βρ дикого типа, ΤΡΟ-Βρ 1-18 (Β9Α, Β11Α, ЗЕО ΙΌ N0: 2) и ΤΡΟ-Βρ 4-18 (Β9Α, Β11Α, ЗЕО ΙΌ N0: 4) оценивают с помощью анализа методом ВЭЖХ после хранения трех пептидов при следующих трех температурах: комнатной температуре (~20°С), 4°С и -20°С. Пептиды хранят или в виде 1 мг сухого порошка, или в виде 1 мМ раствора в воде в любом случае в отсутствие эксципиентов. После определения профилей элюирования при ВЭЖХ указанных трех пептидов на день 0 снова проводят испытания для получения профилей элюирования при ВЭЖХ в дни 2, 9 и 1 4.

Фиг. 3 показывает профили ВЭЖХ для 30 нмоль ΤΡΟ-Βρ дикого типа и более коротких олигопептидов в начале исследования, когда из сухого порошка получают 1 мМ растворы пептидов.

Фиг. 4 показывает профили ВЭЖХ пептидов, хранившихся в виде 1 мМ растворов (фиг. 4 А) или

- 18 006423 сухого порошка (фиг. 4В), на день 2 исследования. В день 9 исследования устойчивости пептидов, как видно на фиг. 5 А и 5В, не отмечается изменений профилей ВЭЖХ пептидов, что указывает на высокую устойчивость пептидов при хранении при комнатной температуре, 4°С или -20°С. Следует отметить, что на день 14 исследования устойчивости пептидов - фиг. 6 А и 6В - ТРО-Кр дикого типа и два олигопептида настоящего изобретения показывают неизменившиеся профили ВЭЖХ. Не обнаруживается никаких признаков разложения пептидов при хранении их в виде 1 мМ растворов или в виде сухого порошка при комнатной температуре, 4°С или -20°С. Можно сделать вывод, что ТРО-Кр и олигопептиды настоящего изобретения можно хранить в виде 1 мМ растворов в воде или в виде сухого порошка при комнатной температуре, 4°С или -20°С в течение двух недель без каких-либо признаков разложения пептидов.

Дополнительные исследования показывают, что олигопептид дикого типа ТРО-Кр и пептид с 8Е0 Ш N0: 2, полученные в виде 1 мМ растворов в воде, физиологическом растворе или физиологическом растворе с добавлением 0,1% альбумина человека, хранившиеся при -20°С, 4°С и комнатной температуре в течение 1, 3 и 4 недель, не проявляют признаков разложения при исследовании методом ВЭЖХ.

Пример 5. Композиция с ТРО-Кр 1-18, К9А, К11А и процедура ее получения.

5А). Раствор-носитель.

Ингредиенты	%, мае./об.	мг/мл 4-л партия
Ацетат натрия, тригидрат, ИЗР,	0,136	1,361	5,444 г
10 мМ (Ε.Ν. 136,08)
Вода для инъекций, иЗР, д.з.	100	1 мл	4 л

рН* 5,3±0,2 * (Юн НС1 и затем 1 н НС1 или 1 н раствор №аОН в случае, если требуется регулирование рН)

Маннит, ЦЗР 5,0 50 ' 200 г

Процедура получения.

1. В подходящую стеклянную емкость добавляют 90% (3,6 л) воды для инъекций (АР1).

2. В № 1 добавляют 5,444 г тригидрата ацетата натрия.

3. Регулируют рН в № 2 с помощью 10н. НС1 (приблизительно 600 мкл) и, при необходимости, дополнительно 1н. НС1 или 1н. раствором ХаОН до уровня рН 5,3±0,2.

4. В № 3 добавляют 200 г маннита и растворяют. Все осторожно перемешивают до полного растворения.

5. В № 4 добавляют достаточное количество АР1 до конечного объема 4 л. Все перемешивают до однородного состояния.

6. В асептических условиях раствор № 5 фильтруют через мембранный фильтр 0,2 мкм в стерильную емкость.

7. Раствором в асептических условиях наполняют семь флаконов из стекла типа I, подготовленных согласно процедуре стерилизации (100 мл/флакон). Кроме того, заполняют два флакона, стерилизованных таким же образом (10 мл на флакон), как начальный образец и образец для хранения. Флакон плотно закрывают пробкой из тефлона и серого бутилкаучука и алюминиевой изоляцией.

В). Раствор для инъекций (1 мг/мл).

Ингредиенты	%, мае./об.	мг/мл	партия 600 мл
ТРО-Кр 1-18, К9А, К11А	0,1	1	0,66 г*
(безводное свободное основание)
порошок*
Носитель, см. 5А	100	1 мл	600 мл

Примечание (для 5В, 5С, 5ϋ):

ТРО-Кр 1-18, К9А, К11А, поступает в виде безводной соли ацетата. Количество вычисляют следующим образом:

количество порошка петида (безводный ацетат) = требуемое количество свободного основания % содержания пептида * В расчете на содержание пептида 90,7%

- 19 006423

Процедура получения.

1. В подходящую стеклянную емкость добавляют точное количество раствора-носителя (600 мл).

2. В № 1 добавляют точное количество порошка олигопептида (0,66 г порошка) и растворяют и все тщательно перемешивают.

3. Измеряют рН раствора № 2 и при необходимости доводят рН до 5,3±0,2.

4. Раствор № 3 фильтруют стерильно в асептических условиях через мембрану 0,2 мкм (мембрана ΜίίίίροΐΌ ΌπΓΒροΐΌ или равноценная).

5. Раствором в асептических условиях наполняют семь стерильных флаконов из стекла типа I, полученных согласно процедуре стерилизации (75 мл/флакон). Кроме того, заполняют два флакона, стерилизованных таким же образом (10 мл на флакон), как начальный образец и образец для хранения. Герметизацию осуществляют пробкой из тефлона с покрытием из серого бутилкаучука и алюминиевой изоляцией.

С). Раствор для инъекций (5 мг/мл).

Ингредиенты %, мае./об. мг/мл партия 600 мл

ТРО-Рр 1-18, Р9А, РИА	0,5	5	3,3 г*
(безводное свободное основание)
порошок*
Носитель, см. 5А	100	1 мл	600 мл

Процедура получения: см. 5В с изменением количеств ингредиентов согласно приведенной выше таблице.

5Ό). Раствор для инъекций (9 мг/мл).

Ингредиенты	%, мае./об.	мг/мл	партия 650 мл
ТРО-Рр 1-18, Р9А, РИА	0,9	9	6,45 г*
(безводное свободное основание)
порошок*
Носитель, см. 5А	100	1 мл	650 мл

Процедура получения: см. 5В с изменением количеств ингредиентов согласно приведенной выше таблице.

Пример 6. Исследование передачи сигнала ίη νί!Γο.

Методы.

Обработка клеток. Клетки ТГ-1 выращивают до плотности приблизительно 1-10⁶ клеток в среде ВРМ1 1640, содержащей 1 х пенициллина/стрептомицина, 2 мМ глутамина, 10% плодной бычьей сыворотки (Нус^пе) и 1 нг/мл ОМ-С8Г, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в среде с добавлением 3% сыворотки и без ОМ-С8Г. Клетки голодают в течение 14-18 ч при 37°С (5% СО2), осаждают центрифугированием и ресуспендируют при плотности 1-10⁶ клеток/мл в среде без добавления сыворотки и ОМ-С8Г. Обрабатывают 2 мл клеточной суспензии олигопептидом или ТРО (как указывается в эксперименте) при 37°С в течение 30 мин (5% СО2). Добавляют охлажденный на льду буфер для промывки по 10 мл на флакон и быстро центрифугируют при 4°С и 3000 об./мин. Среду осторожно отсасывают и дважды повторяют промывку РВ8.

Следующие стадии проводят на льду. Среду отсасывают и добавляют 0,6 мл 2х буфера для лизиса на пробирку. Полученную смесь пипетируют сверху и снизу и переносят в пробирки Эппендорфа, помещают на лед примерно на 30 мин и центрифугируют при 14000хд в течение 10 мин. Супернатант (лизат) используют для иммунопреципитации.

Иммунопреципитация. Используют 20-40 мкл суспезии С-сефарозы, ОашшаВтй, на иммунопреципитацию. Гранулы белка С несколько раз промывают 0,5х буфером для лизиса в пробирках Эппендорфа, и добавляют 1-4 мкг антител РУ-99 (8ап!а Сшζ-Β^ο!есйηοίοду) на иммунопреципитацию. Пробирки инкубируют при вращении с донышка на крышку в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляют лизат и пробирки дополнительно инкубируют при вращении с донышка на крышку в течение ночи при 4°С. Гранулы 3 раза промывают 1х буфером для лизиса и один раз 0,5 М трис, рН 6,5. Добавляют 50 мкл буфера для 8Ό 8-образца и образцы кипятят в течение 3 мин перед внесением в гели.

Анализ методом вестерн-блоттинга. Примерно 10 мкл/образец наливают на 8% полиакриламидный минигель, переносят на мембрану из поливинилиденфторида (РУОГ) ^ΠΗροι^), блокируют в течение 1 ч в буфере для блокировки и инкубируют с антителами а8ТАТ5 (8ап!а Сшζ-Β^ο!есйηοίοду) в течение ночи при 4°С при разведении 1 :1 000. Мембрану промывают, инкубируют с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой, разведение 1 :2000, при комнатной температуре

- 20 006423 в течение 2 ч. Мембрану из РУЭЕ промывают Βίοίίο и проявляют ΝΒΤ/ВСЧР (Сарре1).

Результаты.

Оценивают, сохраняют ли все еще свою биологическую активность олигопептиды, не показывающие явного разложения при анализе методом ВЭЖХ (см. пример 4).

Активность олигопептидов настоящего изобретения и ТР0-Вр дикого типа проверяют с помощью анализов передачи сигнала ίη νίίτο. С использованием описанных выше процедур клетки ТЕ-1 стимулируют образцами пептидов, подвергавшихся ВЭЖХ-анализу. Измеряют фосфорилирование и, таким образом, активацию 8ТАТ5 -субстрата киназы 1ЛК2. активируемой сигнальной трансдукцией ТР0-В. Пептиды испытывают при концентрации 3 мкМ на день 18 исследования устойчивости и при 50 нМ и 5 мкМ на день 30 исследования устойчивости. Все пептиды оценивают три-четыре раза в независимых экспериментах. Все данные собирают, сканируют вестерн-блоты и определяют количественно фосфорилирозание 8ТАТ5.

Данные всех экспериментов (среднее +/- 8ЕМ) приводятся в табл. 1У-1Х (см. ниже) (А - вода, 8 физиологический раствор, Н - 0,1% Н8А). Результаты показывают некоторые различия в активности пептидов, когда они хранятся в разных условиях. На день 18 исследования устойчивости пептид ТР0Вр (1-18, В9А, К11А) показывает существенно сниженную активность, когда хранится при комнатной температуре. Активность сохраняется, когда соединение хранят при 4°С или -20°С. Хотя активность сохраняется, когда получают раствор пептида в воде или физиологическом растворе, активность соединений сохраняется заметно лучше при добавлении 0,1% Н8А. Такое наблюдение подтверждается результатами на день 30 исследования устойчивости. Пептид с 8ЕО ΙΌ N0: 2 остается активным через 30 дней, когда его растворяют в воде и хранят при -20°С. При хранении в физиологическом растворе или физиологическом растворе с добавлением 0,1% Н8А раствор соединения остается активным, когда хранится при обеих температурах 4°С и -20°С. При сравнении на день 30 исследования устойчивости ТР0-Кр дикого типа показывает существенное снижение активности при хранении в виде раствора в воде при -20°С.

Вышеописанные исследования устойчивости показывают, что ТР0-Кр (1-18, К9А, К11А, 8Е0 ΙΌ N0: 2) является довольно устойчивой молекулой, которая при хранении при -20°С в любом растворителе сохраняет активность в течение месяца. Интересно, что хотя картины разложения пептидов не наблюдают ни в каком растворителе и ни при какой температуре, анализ активности показывает некоторые различия.

Пример 7. Биологическая активность укороченных олигопептидов ТР0-Кр.

Методы.

Олигопептиды с 8Е0 ΙΌ N0: 1-7 синтезируют твердофазным синтезом и затем очищают препаративной ВЭЖХ до чистоты 90-95%. Идентичность олигопептида проверяют методом масс-спектрометрии и аминокислотным анализом. Указанную ММ (МА) получают из данных масс-спектрометрии (М+Н⁺) (8ЕС) ΙΌ N0: 1 - 2141, 8ЕС) ΙΌ N0: 2 - 1971, N0: 3 - 1857, N0: 4 - 1687, N0: 5 - 2240, N0: 6 - 2069, N0: 7 2736, дикий тип - 2755).

Получают кривые зависимости реакции от дозы для олигопептидов настоящего изобретения и сравнивают их активность с ТР0-Кр дикого типа.

Активность пептида в зависимости от дозы оценивают, главным образом, с помощью анализов передачи сигнала ίη νίίτο. Измеряют фосфорилирование и, таким образом, активацию 8ТАТ5 - субстрата киназы 1АК2, активируемой сигнальной трансдукцией ТР0-Кр. Активность каждого олигопептида оценивают в широком интервале концентраций. Пептиды испытывают при концентрациях 0,3, 3, 10, 30 нМ и 0,1, 0,3, 3 и 30 мкМ ТР0-Кр. Активность олигопептидов, измеренную в каждом эксперименте как фосфорилирование 8ТАТ5, сравнивают с активностью, полученной с 10 нг/мл ТРО - гормона в концентрации, которая дает максимальную активацию и передачу сигнала через ТР0-К. Оценку всех пептидов проводят четыре-пять раз в независимых экспериментах. Все данные собирают, сканируют вестернблоты и количественно определяют интенсивность фосфорилирования 8ТАТ5.

Результаты.

Активность каждого олигопептида оценивают как процент от его максимальной активности; таким образом, 100% активность приписывают показателю фосфорилирования белка 8ТАТ5, полученному при концентрации олигопептида 30 мкМ.

Результаты ясно показывают, что все олигопептиды сохраняют активность, сравнимую с активностью ТР0-Кр дикого типа. В табл. X (см. ниже) суммируются приблизительные величины ЕС₅₀ для всех испытываемых олигопептидов.

Первая группа олигопептидов (А1 - Ь18, 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 2) показывает не только активность, сравнимую с активностью ТР0-Вр дикого типа, но также улучшение возможностей в своей форме В9А, В11А (ЕС₅₀ приблизит. 10 нМ). Следует отметить, что эта часть олигопептида существенна для активности ТР0-Вр при оценке методом прогулки по аланину и структурным анализом. Повышение активности может иметь место из-за улучшения структуры олигопептида и/или его устойчивости.

Самый короткий олигопептид длиной в 15 аминокислот (С4-Ь18, 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4) сохраняет активность, сравнимую с активностью ТР0-Вр дикого типа, в обеих формах. Третья группа олигопептидов

- 21 006423 (О4-К21, 8Е0 Ш N0: 5 и 6) показывает активность, идентичную активности ТРО-Кр дикого типа, в обеих формах.

Пример 8. Исследование токсичности при 28-дневном внутривенном введения пептида с 8Е0 Ш N0: 2 на крысах.

Местную и системную токсичность пептида с 8Е0 Ш N0: 2 характеризуют при исследовании при 28-дневном внутривенном введении на крысах Сг1:СИ®(8И)Ю8 ВК. Восстановление от действия в группе, получившей высокую дозу, оценивают при последующем 28-дневном периоде восстановления. Пептид вводят животным болюсными внутривенными инъекциями в латеральную хвостовую вену в трех токсикологических группах (группы 2, 3 и 4) и в трех токсикокинетических группах (группы 2 А, ЗА и

А) в дозах 5, 15 и 45 мг/кг/сутки, соответственно, в течение минимум 28 дней подряд. Соответствующая контрольная группа (группа 1) получает 5% раствор маннита, 10 мМ раствор ацетата натрия в сравнимом режиме. Контрольная группа и группа с 45 мг/кг/сутки состоит из 1 5 самцов и 1 5 самок, каждая группа с и 15 мг/кг/сутки состоит из 10 самцов и 10 самок, и каждая токсикокинетическая группа состоит из 9 самцов и 9 самок. Объем дозы для всех групп составляет 5 мл/кг.

Всех животных, распределенных в токсикологические группы, обследуют на клинические признаки токсичности до введения доз, сразу же после введения доз, через час после введения доз и один раз ежедневно в течение периода восстановления. Осуществляют подробное обследование физического состояния и еженедельно регистрируют массу тела и потребление корма отдельными животными. Параметры клинической патологии (гематология, химия сыворотки и анализ мочи) оценивают до начала введения доз, в средней точке периода обработки и при первичной аутопсии и аутопсии после восстановления. Мазки костного мозга берут в период, предшествующий испытаниям, и при аутопсии по схеме. При первичной аутопсии собирают сыворотку для определения антител. Офтальмические обследования проводят до начала введения доз, во время исследования на неделе 3 и во время периода восстановления на наделе 7. Полную аутопсию осуществляют на всех животных. Отобранные органы взвешивают при первичной аутопсии и аутопсии после восстановления. Отобранные ткани, взятые при первичной аутопсии, обследуют с помощью микроскопа.

Образцы крови берут для определения содержания испытываемого соединения в плазме в дни 0, 6, 14, 20 и 27 у отдельной группы животных, предназначенных для испытаний в токсикокинетической части исследования.

Обработка пептидом не оказывает влияния на выживаемость, массу тела, потребление корма, параметры клинической патологии, массу органов и цитологию костного мозга. Нет каких-либо офтальмологических, макроскопических или микроскопических данных, связанных с пептидом.

Пептид с 8Е0 Ш N0: 2 хорошо переносится, когда его вводят самцам и самкам крыс в течение 28 дней. На основании снижения массы предстательной железы у самцов крыс, доза, не вызывающая видимого эффекта (Ν0ΕΕ) у самок, составляет 45 мг/кг/сутки.

Пример 9. Исследование токсичности при 28-дневном внутривенном введения пептида с 8Е0 Ш N0: 2 на обезьянах.

Местную и системную токсичность пептида с 8Е0 Ш N0: 2 характеризуют при исследовании при 28-дневном внутривенном введении на обезьянах Супото1дик. Обратимость действия пептида оценивают при последующем 28-дневном периоде восстановления. Пептид вводят трем группам животных болюсными внутривенными инъекциями через подкожную вену ноги при дозах 5, 15 и 30 мг/кг/сутки в течение 28 дней подряд. Самкам обезьян схему введения начинают на другой день после начала обработки самцов обезьян. Контрольная группа получает носитель 5% раствор маннита, 10 мМ раствор ацетата натрия в сравнимом режиме. Контрольная группа, получающая носитель, и группа, получающая 30 мг/кг/сутки, состоит из пяти самцов и 5 самок обезьян каждая. Каждая группа, получающая 5 и 1 5 мг/кг/сутки, состоит из трех самцов и трех самок обезьян. Объем дозы для всех групп составляет 5 мл/кг.

Всех обезьян обследуют так, как описывается в примере 8. Берут образцы крови у трех животных каждого пола в группе в дни 0, 7, 14, 21 и 27 для определения концентрации в плазме пептида с 8Е0 Ш N0: 2 и вычисления токсикокинетических параметров.

Не было случаев гибели животных при данном исследовании. Изменение в клинических признаках после внутривенной инъекции пептида имеет место у большинства обезьян в большинстве групп с дозой. У самцов, которым вводят 5 мг/кг/сутки пептида, клинических признаков, связанных с соединением, не наблюдается. У самцов, которым вводят 15 мг/кг/сутки, наблюдается покраснение лица (3/3) и слюноотделение (1/3). У самцов, которым вводят 30 мг/кг/сутки, наблюдается покраснение лица (4/5), покраснение поверхности тела (3/5), слюноотделение (3/5), рвота (1/5) и пониженный мышечный тонус (1/5). У самок, которым вводят 5 мг/кг/сутки, наблюдается покраснение лица (2/3). У самок, которым вводят 15 мг/кг/сутки, наблюдается покраснение лица (3/3), покраснение поверхности тела (2/3) и слюноотделение (1/3). У самок, которым вводят 30 мг/кг/сутки, наблюдается явное покраснение лица (5/5), покраснение поверхности тела (4/5), слюноотделение (4/5), рвота (2/5) и пониженный мышечный тонус (1/5). Все клинические признаки смягчаются и наблюдаются не долее одного часа после введения пептида. Ни один из указанных клинических признаков не наблюдается в период восстановления.

Обработка пептидом не оказывает влияния на массу тела, параметры клинической патологии (гема

- 22 006423 тология, химия сыворотки и анализ мочи), физиологические параметры (температура тела, частота сердечных сокращений, кровяное давление и частота дыхания), электрокардиографические данные и массу органов. Нет каких-либо офтальмологических, макроскопических или микроскопических данных, связанных с пептидом. Нет явных различий в данных, связанных с пептидом, у самцов и самок.

Пептид с 8ЕЦ ГО N0: 2 хорошо переносится, когда его вводят самцам и самкам обезьян в течение 28 дней в дозах до 30 мг/кг/сутки. На основании покраснения лица непосредственно после введения дозы доза, не вызывающая видимого эффекта (Ν0ΕΕ) у самцов обезьян, составляет 5 мг/кг/сутки. Ν0ΕΕ для самок не установлена. Так как клинические признаки и мышечная слабость (наблюдаемые при исследовании на день 1 только у 1 /5 самцов и 1 /5 самок) временные, и других связанных с испытываемым соединением эффектов не наблюдается, доза, не вызывающая видимого эффекта (Ν0ΕΕ), устанавливается в 30 мг/кг/сутки для обезьян обоего пола.

Пример 10. Влияние пептида с 8ЕЦ ГО N0: 2 на высвобождение гистамина.

Влияние пептида с 8ЕЦ ГО N0: 2 на высвобождение гистамина проверяют ίη νίΙΐΌ на мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС).

Испытывают РВМС от четырех разных субъектов. Суспензию лейкоцитов инкубируют с разными концентрациями пептида с 8ЕЦ ГО N0: 2 в интервале от 3 мкМ до 10 мМ. В качестве положительного и отрицательного контроля используют только антитела против 1дЕ человека и буфер, соответственно.. Количество высвобожденного гистамина определяют с помощью ЕЬ18А (1ВЬ, каталожный № НЕ 59221). Чувствительность анализа 2,4 нг/мл.

Выбирают интервал концентраций пептида от 3 мкМ до 10 мМ для оценки высвобождения гистамина при уровнях, получаемых ί.ν. инъекцией. Так, концентрация 30 мг/кг соответствует непосредственно после инъекции ~38 мкМ, предполагая объем распределения 400 мл на кг тканей. Известно, что пептид свободно распределяется во внеклеточных жидкостях. Таким образом, наивысшая концентрация пептида 10 мМ такова, что она приблизительно в 100 раз выше самой высокой концентрации во внеклеточных жидкостях.

При самой высокой концентрации 1 0 мМ пептид дает относительно небольшое, но существенное высвобождение гистамина в 1 5 нг/мл. Такая величина примерно в 1 0 раз ниже, чем в случае положительного контроля (антитела против 1дЕ). Пептид при концентрации 3,3 нМ или меньше не действует на высвобождение гистамина из РВМС человека. Интервал содержит все лечебные концентрации ίη νί\Ό. Небольшое, но существенное высвобождение гистамина наблюдают при самой высокой концентрации 10 мМ ίη νίΙΐΌ. Такая концентрация значительно выше, чем лечебная доза.

Пример 11. Образцы сывороток обезьян и крыс анализируют для обнаружения наличия 1§С у обезьян Супото1ди8 и крыс, подвергаемых испытаниям в примерах 8 и 9. Ни в одном из образцов сывороток от 32 обезьян и 80 крыс аутоантитела против пептида с 8ЕЦ ГО N0: 2 не обнаруживаются.

Список последовательностей <210> 5 <211> 18 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 5

61у ТЬг Ьеи С1и Ьеи Агд Рго Агд Зег Агд Туг Агд Ьеи С1п Ьеи Агд .1 5 10 15

А1а Агд <210> 6 <211> 18 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> б у ТНг Ьеи 61и Ьеи А1а Рго А1а Зег Агд Туг Агд Ьеи 01п Ьеи Агд 15 10 15

А1а Агд <210> 7 <211> 23 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 7

А1а Агд 61у С1у ТЬг Ьеи 61 и Ьеи Агд Рго Асд Зег Агд РЬе Агд Ьеи

1 5	10	15
61г. Ьеи Агд А1а Агд Ьеи Азп 20

Claims (37)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Олигопептид, обладающий биологической активностью модулятора рецептора тромбопоэтина (ТРО-К), состоящий из 15-18 аминокислот и имеющий общую формулу

   X! СТБЕЕХ₂РХ₃8КУКЕОЕХ.₁.

   где Х₁ представляет собой А К О или отсутствует,

   Х₂ представляет собой К или А,

   Х₃ представляет собой К или А и

   Х₄ представляет собой К А К или отсутствует.
2. 2. Олигопептид по п.1, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 Ш NО: 1-6.
3. 3. Мутантный олигопептид, являющийся производным олигопептида по любому из пп. 1 или 2, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 Ш NО: 7.
4. 4. Нуклеотидная последовательность, кодирующая олигопептид по любому из пп.1, 2 или 3.
5. 5. Вектор, включающий нуклеотидную последовательность по п.4.
6. 6. Вектор по п.5, отличающийся тем, что является бактериальным, вирусным вектором, вектором млекопитающего или дрожжевым вектором.
7. 7. Вектор по п.5 или 6, дополнительно включающий 5'- и/или З'-регуляторные элементы, способные управлять экспрессией нуклеотидной последовательности в подходящей клетке-хозяине.
8. 8. Клетка-хозяин, включающая вектор по любому из пп.5-7, способная в подходящих условиях экспрессировать олигопептид по п. 1 или 2.
9. 9. Клетка-хозяин по п.8, отличающаяся тем, что является клеткой млекопитающего, дрожжевой или бактериальной клеткой.
10. 10. Способ генетической модификации клетки, включающий трансфекцию клетки вектором по любому из пп.5-7.
11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что клетку модифицируют химически или электрически индуцированной трансфекцией, в частности электропорацией или слиянием клеток, путем переноса генов, опосредуемого вирусом, в частности ретровирусом, или липосомами, или путем бомбардировки частицами.
12. 12. Способ получения млекопитающего, не являющегося человеком, способного вырабатывать олигопептид по любому из пп.1, 2 или 3, включающий введение в клетку млекопитающего, не являющегося человеком, нуклеотидной последовательности по п.4.
13. 13. Млекопитающее, не являющееся человеком, в эмбриональные и/или соматические клетки которого включена нуклеотидная последовательность по п.4, содержащее, в частности, клетку-хозяин по п.8 или 9.
14. 14. Млекопитающее, не являющееся человеком, по п. 13, отличающееся тем, что является грызуном или приматом.
15. 15. Способ получения олигопептида по любому из пп.1, 2 или 3, включающий трансфекцию клетки вектором по любому из пп.5-7, культивирование клетки в культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию олигопептида, и выделение олигопептида из клетки или культуральной среды.
16. 16. Антитело, специфически связывающееся с олигопептидом по любому из пп.1, 2 или 3.
17. 17. Антитело по п.16, отличающееся тем, что является моноклональным или поликлональным антителом или фрагментом моноклонального антитела.
18. 18. Антитело, специфически связывающееся с антителом по п. 16 или 17.
19. 19. Фармацевтическая композиция для лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении, включающая олигопептид по любому из пп.1, 2 или 3, нуклеотидную последовательность по п.4, вектор по любому из пп.5-7, клетку-хозяин по п.8 или 9 или антитело по любому из пп. 16, 17 или 18, необязательно, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
20. 20. Композиция для диагностики гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении, включающая олигопептид по любому из пп.1, 2 или 3, нуклеотидную последовательность по п.4, вектор по любому из пп.5-7, клетку-хозяин по п.8 или 9 или антитело по любому из пп.16, 17 или 18, необязательно, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
21. 21. Фармацевтическая или диагностическая композиция по п.19 или 20, дополнительно включающая тромбопоэтин.
22. 22. Фармацевтическая или диагностическая композиция по любому из пп.19-21, отличающаяся тем, что находится в форме таблетки, пилюли, капсулы, гранулы, суппозитория, порошка, пэтча, липосомы, формы с покрытием, раствора для инъекции, инфузии или перорального введения, сиропа, суспензии, эмульсии, спрея, ингаляции, аэрозоля, пасты, мази или лосьона.
23. 23. Применение олигопептида по любому из пп.1, 2 или 3 для получения лекарственного средства для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении.
24. 24. Применение нуклеотидной последовательности по п.4 для получения лекарственного средства для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении.

    - 24 006423
25. 25. Применение вектора по любому из пп.5-7 для получения лекарственного средства для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении.
26. 26. Применение клетки-хозяина по п.8 или 9 для получения лекарственного средства для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении.
27. 27. Применение антитела по любому из пп. 16, 17 или 18 для получения лекарственного средства для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении.
28. 28. Применение по любому из пп.23-27, отличающееся тем, что лекарственное средство дополнительно содержит тромбопоэтин.
29. 29. Способ модуляции активности ΤΡΟ-Κ., включающий обеспечение контактирования олигопептида по любому из пп.1, 2 или 3 или антитела по любому из пп. 16, 17 или 18 с ΤΡΟ-Κ. в отсутствие или в присутствии тромбопоэтина.
30. 30. Способ по п.29, отличающийся тем, что модуляцией является повышение или понижение активности.
31. 31. Способ скрининга лекарственных средств, эффективных для диагностики или лечения гематологических нарушений, в частности тромбоцитопении, включающий скрининг потенциальных лекарственных средств на их способность конкурировать с олигопептидами по любому из пп. 1 , 2 или 3 за связывание с ΤΡΟ-Κ..
32. 32. Способ по п.31, отличающийся тем, что нарушения представляют собой гематологические нарушения или тромбоцитопению, являющиеся результатом трансфузии костного мозга, лучевой терапии, химиотерапии, аллергических реакций или являющиеся идиопатическими.
33. 33. Способ по п.31 или 32, дополнительно включающий введение тромбопоэтина.
34. 34. Способ лечения пациента, страдающего заболеванием, чувствительным к воздействию агониста тромбопоэтина, включающий введение пациенту терапевтически эффективной дозы или количества олигопептида по любому из пп.1, 2 или 3.
35. 35. Способ по п.34, дополнительно включающий введение тромбопоэтина.
36. 36. Способ детектирования или выделения ΤΡΟ-Κ из ΤΡΟ-Κ-содержащего источника, включающий обеспечение контактирования олигопептида по любому из пп. 1, 2 или 3 с ΤΡΟ-Κ-содержащим источником в условиях, обеспечивающих связывание ΤΡΟ-Κ с олигопептидом и выделение ΤΡΟ-Κ.
37. 37. Иммуноанализ для детектирования и/или выделения олигопептида по любому из пп.1-3, включающий обеспечение контактирования антитела по любому из пп.16 или 17 и детектирование и/или выделение олигопептидов, связанных с антителами.