EA014528B1 - Составы, содержащие пептиды, стимулирующие рецептор эритропоэтина и их применение - Google Patents

Составы, содержащие пептиды, стимулирующие рецептор эритропоэтина и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA014528B1
EA014528B1 EA200702656A EA200702656A EA014528B1 EA 014528 B1 EA014528 B1 EA 014528B1 EA 200702656 A EA200702656 A EA 200702656A EA 200702656 A EA200702656 A EA 200702656A EA 014528 B1 EA014528 B1 EA 014528B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
peg
test
epo
linker
Prior art date
Application number
EA200702656A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200702656A1 (ru
Inventor
Анне-мария Делиг
Ричард Стед
Керстин Лезер
Катерин Вудберн
Роберт Барнетт Насо
Original Assignee
Афимакс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Афимакс, Инк. filed Critical Афимакс, Инк.
Publication of EA200702656A1 publication Critical patent/EA200702656A1/ru
Publication of EA014528B1 publication Critical patent/EA014528B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединениям на основе пептидов, которые представляют собой агонисты рецептора эритропоэтина (EPO-R). Изобретение также относится к способам терапии, в которых указанные пептидные соединения применяют для лечения расстройств, связанных с низким или недостаточным кроветворением. Изобретение также распространяется на фармацевтические составы, которые содержат указанные пептидные соединения, и формы их дозирования.

Description

Данная заявка испрашивает приоритет на основании заявки И8 № 60/687655, поданной 3 июня 2005 г. Содержание этой приоритетной заявки включено в настоящую заявку во всей своей полноте посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к соединениям на основе пептидов, которые представляют собой агонисты рецептора эритропоэтина (ЕРО-К). Изобретение также относится к способам терапии, в которых указанные пептидные соединения применяют для лечения расстройств, связанных с низким или недостаточным кроветворением. Изобретение также распространяется на фармацевтические составы, которые содержат указанные пептидные соединения.
Предшествующий уровень техники
Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеидный гормон, состоящий из 165 аминокислот с молекулярной массой около 34 килодальтон (кДа) и предпочтительными сайтами гликозилирования в положениях аминокислот 24, 38, 83 и 126. Эритропоэтин первоначально синтезируется в виде белка предшественника с сигнальным пептидом из 23 аминокислот. ЕРО может существовать в трех формах: α, β и несиалированной форме. α и β формы немного отличаются своими углеводными компонентами, но обладают одинаковым действием, биологической активностью и молекулярным весом. Несиалированная форма представляет α или β форму, у которой удален концевой углевод (сиаловая кислота). Последовательности ДНК, кодирующие ЕРО, описаны в [И8 Ра!. № 4703008 !о Ьш].
ЕРО стимулирует митотическое деление и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов и таким образом обеспечивает образование эритроцитов. ЕРО синтезируется в почках в случае преобладания условий гипоксии. В ходе вызванной ЕРО дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов индуцируется синтез глобина; стимулируется синтез комплекса гема и увеличивается число ферритиновых рецепторов. Эти изменения позволяют клетке получать больше железа и синтезировать функциональный гемоглобин, который связывает кислород в зрелых эритроцитах. Таким образом, эритроциты и их гемоглобин играют ключевую роль в снабжении тела кислородом. Указанные изменения инициируются взаимодействием ЕРО с соответствующим рецептором на поверхности клетокпредшественников эритроцитов [См. н.р. СтаЬет апб КгапЛ (1978) Апп. Кеч. Меб. 29.51-66].
ЕРО присутствует в плазме крови в очень низкой концентрации, когда организм находится в здоровом состоянии, при этом ткани получают достаточное снабжение кислородом от существующего количества эритроцитов. Такая нормальная низкая концентрация достаточна для того, чтобы стимулировать замещение красных клеток крови, которые в норме стареют и гибнут.
Количество ЕРО в крови повышается в условиях гипоксии, когда уменьшается транспорт кислорода циркулирующими клетками крови. Гипоксия может быть вызвана, например, существенной кровопотерей из-за кровотечения, разрушением красных кровяных клеток под действием излучения, уменьшением поступления кислорода из-за высокой высоты или продолжительного беспамятства, или различных форм анемии. В ответ на такой гипоксический стресс повышение уровня ЕРО усиливает образование красных кровяных клеток за счет стимуляции пролиферации клеток-предшественников эритроидного ряда. Если количество циркулирующих красных кровяных клеток больше, чем это необходимо для потребностей в кислороде нормальной ткани, уровень ЕРО в крови уменьшается.
Поскольку ЕРО необходим для процесса образования красных кровяных клеток, этот гормон имеет потенциально полезные приложения, как в диагностике, так и в лечении гематологических заболеваний, характеризующихся низким или недостаточным формированием красных кровяных клеток. Исследования последних лет предоставили позволяют предположить эффективность терапии ЕРО для ряда болезненных состояний, расстройств и нарушений кровеносной системы, включая бета-талассемию [см. Уебоча!о, е! а1. (1984) Ас1а. Наета!о1. 71:211-213]; кистозный фиброз [см. У1сЫпбку е! а1. (1984) 1. Реб1а1г1с 105:15-21]; беременность и нарушения менструального цикла [см. Со!ез е! а1. (193) Βτί!. 1. Об!е!. Супеасо1. 90:304-311]; раннюю подростковую анемию [см. Нада, е! а1. (1983) Ас!а Реб1а!г. 8сапб. 72; 827-831]; повреждение спинного мозга [см. С1аи8-^а1кет, е! а1. (1984) Агс1. Рйуз. Меб. КейаЬб. 65:370-374]; космический полет [см. Бипп, е! а1. (1984) Еиг. 1. Арр1. РЬ.у8ю1. 52:178-182]; острое малокровие [см. МШет е! а1. (1982) Βτί! 1. Наета!о1. 52:545-590]; старение [см. Ибира е! а1. (1984) 1. ЬаЬ. С1ш. Меб. 103:574-580 и 581588 апб Ыр8с1Шх е! а1. (1983) В1ооб 63:502-509]; различные новообразования, сопровождающиеся нарушениями эритропоэза [см. Баш1ак е! а1. (1983) Сапсег 5:1101-1106 и 8с11\\'аПх е! а1. (1983) О!о1агупдо1. 109:269-272]; и почечную недостаточность [см. ЕбсйЬасй. е! а1. (1987) N. Епд. 1. Меб. 316:73-78].
Очищенный гомогенный ЕРО был описан в [ϋδ Ра!. № 4677195 !о Не\\зск|. Последовательность ΟΝΛ. кодирующая ЕРО, очистили, клонировали и экспрессировали для получения рекомбинантного белка с теми же биохимическими и иммунологическими свойствами, что и нативный ЕРО. Также были получены молекулы рекомбинантного ЕРО с олигосахаридами, идентичным олигосахаридам нативного ЕРО [см. 8абак1, е! а1. (1987) 1. Вю1. С1ет. 262:12059-12076].
Биологическое действие ЕРО по-видимому частично обусловлено взаимодействием с рецептором, находящимся на мембране клетки. В первоначальных исследованиях с использованием незрелых клеток эритроидного ряда, выделенных из селезёнки мыши, было показано, что поверхностные белки ЕРО
- 1 014528 связывающих клеток включают два полипептида, которые имеют молекулярную массу примерно 85000 Да и 100000 Да, соответственно [8атеуег е! а1. (1987) Ргос. Иа!1. Асаб. δα. США 84:3690-3694]. По оценкам число ЕРО-связывающих сайтов на поверхности одной клетки составляет в среднем от 800 до 1000. Из числа этих связывающих сайтов приблизительно 300 связывают ЕРО с Кб приблизительно 90 пМ (пикомоль), тогда как остальные связывают ЕРО с уменьшенной аффинностью приблизительно 570 пМ |8а\\уег. е! а1. (1987) 1. Бю1. Сйеш. 262:5554-5562]. В независимых исследованиях было показано, что ЕРО-чувствительные эритробласты селезенки, выделенные из мышей, которым инъенцировали вызывающий анемию вирус лейкемии Рпепб-а (РУА), содержали в итоге приблизительно 400 связывающих ЕРО сайтов высокой и низкой аффинности со значениями Кб приблизительно 100 и 800 пМ, соответственно [Ьапббсйик, е! а1. (1989) В1ооб 73:1476-1486].
Последующие исследования показали, что две формы рецептора ЕРО (ЕРО-К) кодируются единственным геном. Этот ген был клонирован [См., н.р., 1опе§, е! а1. (1990) В1ооб 76, 31-35; ИодисЫ, е! а1. (1991) В1ооб 78:2548-2556; Маоисйе, е! а1. (1991) В1ооб 78:2557-2563]. Например, последовательности ДНК и кодируемые ими последовательности белка ЕРО-К мыши и человека описаны в РСТ РиЬ. № \¥О 90/08822 !о Э'Апбтеа, е! а1. Современные модели предполагают, что связывание ЕРО с ЕРО-К приводит к димеризации и активации двух молекул ЕРО-К, что запускает последующие этапы передачи сигнала [см., н.р., \Уа1о\\'1ск е! а1. (1992) Ргос. Иа!1. Асаб. 8сг И8А 89:2140-2144].
Доступность клонированных генов ЕРО-К облегчает поиск агонистов и антагонистов этого важного рецептора. Доступность рекомбинантного белка рецептора позволяет изучать взаимодействия рецепторлиганд в ряде систем случайной и полуслучайной генерации разнообразия пептидов. Такие системы включают в себя систему пептиды на плазмиде [описана в ϋδ Ра!. № 6270170]; систему пептиды на бактериофаге [описана в И8 Ра!. № 5432018 и Стей1а, е! а1. (1990) Ргос. Иа!1. Асаб. 8сг И8А 87:63786382]; систему кодирующая синтетическая библиотека (епсобеб 8уп1йебс йЬгагу, Е8Ь) [описана в патентном приложении США 8ег. № 946239, подано 16 сентября 1992 г.]; и систему широкомасштабного синтеза иммобилизованных полимеров [описана в υδ Ра!. № 5143854; РСТ РиЬ. № 90/15070; Робот е! а1. (1991) δ№ι^ 251:767-773; Эотеет апб Робот (1991) Апп. Кер. Меб. Сйеш. 26:271-180; и υδ Ра! № 5424186].
Пептиды, которые хотя бы в некоторой степени взаимодействуют с ЕРО-К, были идентифицированы и описаны, например, в патентах υδ Ра!. №-№ 5773569; 5830851; и 5986047 !о ХУпдЫоп, е! а1.; РСТ РиЬ. № \¥О 96/40749 !о ХУпдЫоп, е! а1.; υδ Ра!. № 5767078 и РСТ РиЬ. № 96/40772 !о 1о11п5оп апб ΖΕΡι; РСТ РиЬ. № \¥О 01/38342 !о Ва1и; и № \¥О 01/91780 !о δт^!й-δте^п!о8ку е! а1. В частности, была выявлена группа пептидов, содержащих общий пептидный мотив, члены которой связываются с ЕРО-К и стимулируют ЕРО-зависимую клеточную пролиферацию. Однако идентифицированные к настоящему времени пептиды содержат мотив, стимулирующий ЕРО-зависимую пролиферацию клеток ш \'бго с величиной ЕС50 от около 20 наномолей/л (нМ) до около 250 нМ. Таким образом, для стимулирования 50% от максимальной клеточной пролиферации, стимулируемой ЕРО, требуется концентрация пептида от 20 нМ до 250 нМ. Также были описаны другие пептиды и конструкции, которые связываются с рецептором ЕРО, например, в предварительных заявках υδ δе^^аI №-№ 60/470244, 60/470245, и 60/469993, все поданы 12 мая 2003 г.; предварительных заявках υδ δе^^аI №-№ 60/627432 и 60/627433, оба поданы 11 ноября 2004 г.; заявке υδ δе^^а1 № 310/844968, подано 12 мая 2004 г.; и Международные заявки РС’Т/№2004/14886 и РСТ/^2004/014889, поданы 12 мая 2004 г., опубликованы как \УО 2004/101611 и \УО 2004/101606, соответственно. Содержание каждой из указанных заявок полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Поскольку агонисты ЕРО-К обладают огромным потенциалом, как для исследований важных биологичесих активностей, опосредованных этим рецептором, так и для лечения заболеваний, остается необходимость в обнаружении пептидных агонистов ЕРО-К, которые обладают усиленными действием и активностью. Настоящее изобретение обеспечивает такие соединения.
Цитирование и/или обсуждение приведенных в этом разделе и на протяжении всего настоящего текста ссылок предложено лишь для того, чтобы пояснить описание настоящего изобретения, но не допускает трактовки, что одна из приведенных ссылок, представляет собой предшествующий уровень техники для настоящего изобретения.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает новые пептидные соединения, которые представляют собой агонисты ЕРО-К существенно увеличенной силы действия и активности. Указанные пептидные соединения представляют собой гомодимеры мономеров пептида, который имеет аминокислотную последовательность: (АсС)СЕУАСНМСР1Т(1-па1)УСрРЕКК (ЬЕО Ш ИО: 1), или гомодимерами мономеров пептида, который имеет аминокислотную последовательность (АсС)СЕУАСНМСР1Т(1-па1)УСрРЕК(МеС)К (ЬЕС Ш ИО: 2), гомодимерами мономеров пептида, который имеет аминокислотную последовательность (АсС)СЕУАСНМСР1Т(1-па1)УСрРЕК(МеС) (ЯЕР Ш ИО: 3); в которых каждая аминокислота обозначена стандартным однобуквенным сокращением, (АсС) обозначает Ν-ацетилглицин, (1-па1) обозначает 1нафтилаланин, и (МеС) обозначает Ν-метилглицин, также известный как саркозин. Каждый пептидный мономер димера содержит внутримолекулярную дисульфидную связь между остатками цистеина ука
- 2 014528 занного мономера.
Пептидные мономеры можно димеризовать с применением ковалентно присоединенного линкера на основе третичного разветвленного амида. Линкерный третичный амид может быть представлен как -С1О-СН2-Х-СН2-С2Огде X является ЫСО-(СН2)2-№Н-; С1атом линкера образует амидную связь с ε-аминогруппой Сконцевого остатка лизина первого пептидного мономера; С2атом линкера образует амидную связь с εаминогруппой С-концевого остатка лизина второго пептидного мономера; и атом Ν1 группировки X соединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля (ро1ус111у1спс д1усо1, РЕ6, ПЭГ), причем ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 40000 Да (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы обладают молекулярным весом больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес).
В случае, если каждый мономер в составе гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СЕУАСНМСР1Т(1-па1)УСОРкК1< (8ЕЦ ГО N0:1) и атом Ν1 линкера соединен карбаматной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля (ПЭГ), новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СГУАСНМСР1Т(1-па1)УСОРГК1< (8ЕЦ ГО N0:1) и атом Ν1 линкера соединен амидной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (Ас6)6ЕуАсНМ6Р1Т (1-па1) УСрРЬК.(Ме6)К (8ЕЦ ГО N0: 2) и атом Ν1 линкера соединен карбаматной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
- 3 014528
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СБУАСНМСР1Т(1-па1)УСОРБК(МсС)1< (8ЕЦ ГО N0: 2) и атом Ν1 линкера соединен амидной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
Пептидные мономеры также можно димеризовать с применением ковалентно присоединенного третичного разветвленного амида в качестве линкера. Линкерный третичный амид может быть представлен как:
где X является ^0-(СН2)2-№-С30-;
С1 атом линкера образует амидную связь с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина первого пептидного мономера;
С2атом линкера образует амидную связь с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина второго пептидного мономера. Пептидный димер согласно настоящему изобретению дополнительно содержит спейсерный фрагмент следующей структуры:
-М*Н-(СН2)4-С4Н-№Нгде атом С4 спейсера ковалентно связан с С3 групы X;
атом Ν1 спейсера ковалентно соединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля; и атом Ν2 спейсера соединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля, причем указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 10000 до 50000 Да (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес). Каждая субъединица ПЭГ может иметь молекулярную массу, соответственно, 10000 Да (10 кДа), 20, 30, 40 или 50 кДа.
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СРУАСНМСР1Т(1-па1)УС0РБВ1< (8ЕЦ ГО N0:1) и как Ν1, так и Ν2 атомы спейсера ковалентно соединены карбаматной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть изображены следующим образом:
- 4 014528
В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения С-концевой лизин двух пептидных мономеров представляет собой Ь-лизин. Специалистам в данной области из вышеуказанных химических структур также будет понятно, что указанные два линейных фрагмента ПЭГ соединены посредством лизина (например, как тРЕ62-Ьу5-ПН§ или как тРЕО2-Ьу8то1-№С), который предпочтительно представляет собой Ь-лизин, что дает следующую стереохимию соединения.
Альтернативно. один или более остатков лизина может представлять собой Ό-лизин, что приводит к альтернативной стереохимии, которая может быть легко определена специалистами в данной области.
В случае, если каждый мономер в составе указанного гомодимера имеет аминокислотную последовательность, (АсС)СЬУАСНМСР1Т(1-па1)УСОРЬР1< (8ЕО ГО N0:1) и как атом Ν1, так и атом Ν2 спейсера ковалентно соединены амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
Кроме того, предподтительно все молекулы лизина в этом соединении предпочтительно представляют собой Ь-лизин, что приводит к следующей стереохимии.
- 5 014528
В качестве альтернативы, один или более из остатков лизина может представлять собой Ό-лизин, что приводит к альтернативной стереохимии, которая может быть легко определена специалистами в данной области. В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность, (Ас6)6Ь¥АСНМ6Р1Т(1-иа1)УСрРЬК(Ме6)К (8ЕЭ ГО N0: 2) и как атом Ν1, так и атом Ν2 спейсера ковалентно соединены карбаматной связью с фрагментом активированного ПЭГ, где Υ является карбаматной группой, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
Предподтительно, все остатки лизина, соединяющие пептидные мономеры и линейные фрагменты ПЭГ в указанной молекуле, представляют собой Ь-лизин, что приводит к следующей стереохимии.
Кроме того, один или более из остатков лизина может представлять собой Ό-лизин, что приводит к альтернативной стереохимиии, которая может быть легко определена специалистами в данной области.
В случае, если каждый мономер указанного гомодимера имеет аминокислотную последовательность, (Ас6)6^ΥАСНМ6РIТ(1-ηа1)VС^Р^Κ(Ме6)К (8ЕЭ ГО N0: 2) и как атом Ν1, так и атом Ν2 спейсера ковалентно соединены амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, где Υ является карбаматной группой, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
- 6 014528
Предпочтительно все остатки лизина, объединяющие пептидные мономеры и линейные субъединицы ПЭГ в этой молекуле, представляют собой Ь-лизин, что приводит к следующей стереохимии.
В другом варианте реализации настоящего изобретения один или более остатков лизина может представлять собой Ό-лизин, что приводит к альтернативной стереохимии, которая может быть легко определена специалистами в данной области.
Пептидные мономеры также можно димеризовать посредством присоединения лизинового линкера, в который связан через ε-аминогруппу лизина с С-концом одного пептидного мономера и через αаминогруппу лизина с С-концом второго пептидного мономера.
Пептидный димер согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать фрагмент спейсера следующей структуры:
-ΝιΗ-(€Η2)2-Ο-(αΗ2)2-Ο-(€Η2)2-Ν2ΗНа одном конце спейсера атом Ν1 соединен амидной связью с карбонильным углеродом лизинового линкера. На противоположном конце спейсера атом Ν2 соединен карбаматной или амидной связью с сфрагментом активированного полиэтиленгликоля, причем указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 40000 Да (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес).
В случае, когда спейсер соединен карбаматной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля (ПЭГ), новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3) могут быть представлены следующим образом:
В случае, когда спейсер соединен амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3) могут быть представлены следующим образом:
- 7 014528
Изобретение также обеспечивает способы лечения различных медицинских состояний с применением указанных пептидных соединений. Указанные способы включают лечение пациента, имеющего расстройство, которое характеризуется недостаточным содержанием эритропоэтина или низким или недостаточным уровнем красных кровяных клеток, посредством назначения пациенту терапевтически эффективного количества одного из вышеуказанных соединений. В определенных вариантах реализации настоящего изобретения расстройство представляет собой конечную стадию почечной недостаточности или диализа; связанную со СПИДом анемию, аутоиммунное заболевание или злокачественнуюопухоль; бета-талассемию; кистозный фиброз; раннюю подростковую анемию; анемию, связанную с хроническим воспалительным заболеванием; повреждение спинного мозга; острое малокровие; старение; или состояния опухолевых заболеваний, сопровождающиеся нарушениями кроветворения. Кроме того, в некоторых другом вариантах реализации настоящего изобретения, указанное расстройство представляет собой почечную недостаточность или диализ, а терапевтически эффективное количество соответствует дозировке от 0,025 до 0,2 мг вещества на 1 кг веса тела пациента. В других вариантах реализации настоящего изобретения, расстройство представляет собой почечную недостаточность или диализ, и терапевтически эффективное количество соответствует дозировке от 0,05 до 0,1 мг вещества на 1 кг веса тела пациента. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения расстройство представляет собой анемиею, связанную со злокачественной опухолью, а терапевтически эффективное количество соответствует дозировке от 0,075 до 0,5 мг вещества на 1 кг веса тела пациента. В других вариантах реализации настоящего изобретения расстройство является анемией, связанной со злокачественной опухолью, а терапевтически эффективное количество представляет собой дозировку от 0,2 до 0,4 мг вещества на 1 кг веса тела пациента. Терапевтически эффективную дозу можно однократно каждые 3 до 4 недели.
Изобретение также охватывает фармацевтические составы, которые содержат указанные пептидные соединения. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу около 20000 Да. В других вариантах реализации настоящего изобретения, фармацевтический состав содержит любое из вышеназванных соединений и фармацевтически приемлемый носитель.
Подробное описание изобретения
Определения:
Аминокислотные остатки в пептидах обозначены следующим образом: фенилаланин - РЬе или Р; лейцин - Ьеи или Ь; изолейцин - 11е или I; метионин или М; валин - Уа1 или V; серин - Бет или 8; пролин Рго или Р; треонин - ТЬг или Т; аланин - А1а или А; тирозин - Туг или Υ; гистидин - Н1к или Н; глутамин О1п или О; аспарагин - Акп или Ν; лизин - Ьук или К; аспарагиновая кислота - Акр или Ό; глутаминовая кислота - О1и или Е; цистеин - Сук или С; триптофан - Тгр или ^; аргинин - Агд или К; и глицин - О1у или О. Неканонические аминокислоты в пептидах сокращены следующим образом: 1-нафтилаланин - 1па1 или Νρ; Ν-метилглицин (так называемый саркозин), - МеО или 8с; и ацетилированный глицин (Νацетилглицин) - АсО.
При использовании в настоящем описании термины полипептид или белок относятся к полимеру, состоящему из аминокислотных мономеров, в котором альфа-аминокислоты соединены вместе посредством пептидной связи. Следовательно, полипептиды имеют в длину, по меньшей мере, два аминокислотных остатка, но обычно больше. В целом, термин пептид относится к полипептиду, который имеет в длину только несколько аминокислотных остатков. Новые пептиды - агонисты ЕРО-К, согласно настоящему изобретению, предпочтительно имеют в длину не более, чем примерно 50 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительно, длина составляет от 17 до 40 аминокислотных остатков. Полипептид, по сравнению с пептидом, может содержать любое количество аминокислотных остатков. Следовательно, термин полипептид включает в себя пептиды, а также более длинные аминокислотные последовательности.
При использовании в настоящем описании характеристика фармацевтически приемлемый относится к веществам и составам, которые считают в целом безопасными, например, тем, что являются физиологически приемлемыми и, обычно, при назначении их человеку не вызывают аллергических или аналогичных нежелательных реакций, таких как расстройство желудка, головокружение и тому подобное. Термин фармацевтически приемлемый в данном тексте преимущественно означает одобренный полномочным агентством Федерального правительства или правительства штата США, или то, что указанное вещество или состав включены в И8 РЬагтасоре1а, или другую общепризнанную фармакопею, разрешающую их использование на животных, и в особенности на человеке. Термин носитель относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или переносчику, совместно с которым назначают состав. Таким фармацевтическим носителем могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масло, включая
- 8 014528 масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. В качестве носителей преимущественно применяют воду или водные растворы, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в особенности в растворах для инъекций. Пригодные фармацевтические носители описаны в Кетшдои'з Рйаттасеийса1 БШеисез под редакцией Е.^. Магйи.
В данном тексте термин агонист относится к биологически активному лиганду, который связывается с соответствующим ему биологически активным рецептором и активирует последний, вызывая биологический ответ рецептора, или повышая уже существующую биологическую активность рецептора.
Новые пептиды, которые представляют собой агонисты ЕРО-К
Настоящее изобретение обеспечивает новые пептидные соединения, которые являются агонистами ЕР0-И существенно увеличенной силы и активности. Указанные пептидные соединения представляют собой гомодимеры мономеров пептида, имеющего аминокислотную последовательность (АсС)С^ΥАСНМСРIТ(1-ηа1)VС^Р^ΚК (8ЕС ГО N0: 1), или гомодимерами мономеров пептида, имеющего аминокислотную последовательность (АсС)С^ΥАСНМСРIТ(1-ηа1)VС^Р^Κ(МеС)К (8ЕС ГО N0: 2), гомодимерами мономеров пептида, имеющего аминокислотную последовательность (АсС)С^ΥАСНМСРIТ(1-па1)VС^Р^Κ(МеС) (8ЕС ΙΌ N0: 3); где каждая аминокислота обозначена стандартным однобуквенным сокращением, (АсС) обозначает №ацетилглицин, (1-па1) обозначает 1нафтилаланин, и (МеС) обозначает №метилглицин, также известный как саркозин. Каждый пептидный мономер димера содержит внутримолекулярную дисульфидную связь между остатками цистеина указанного мономера. Такие мономеры могут быть схематически изображены следующим образом:
Пептидные мономеры димеризуют, что обеспечивает пептидному димеру повышенную активность в качестве агониста ЕР0-И. Линкерный участок (ЬК) представляет собой разветвленный третичный амид, который соединяет С-концы двух пептидных мономеров, посредством одновременного присоединения к С-концевым остаткам лизина каждого из мономеров. Линкерный третичный амид может быть изображен как
где X представляет собой ^0-(СН2)2-№Н-;
атом С1 линкера образует амидную связь с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина первого пептидного мономера;
атом С2 линкера образует амидную связь с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина второго пептидного мономера; и атом N группы X присоединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля (ро1уе!йу1еие д1усо1, ПЭГ), причем ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 40000 Да (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес).
Линкерный третичный амид также может быть изображен как
-С*О-СН2-Х-СН2-С2Огде X представляет собой ^0-(СН2)2-ЫН-С30-; атом С1 линкера образует амидную связь с εаминогруппой С-концевого остатка лизина первого пептидного мономера; атом С2 линкера образует амидную связь с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина второго пептидного мономера. Пептидный димер согласно настоящему изобретению кроме того содержит спейсерный участок следующей структуры:
-№Н-(СН2)4-С4Н-М2Нгде атом С4 спейсера ковалентно связан с С3 группы X; атом N спейсера ковалентно присоединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля; и атом N спейсера соединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля, причем ПЭГ имеет молекулярный вес примерно от 10000 до 60000 Да (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес).
Таким образом, новые пептиды согласно настоящему изобретению также могут содержать субъединицу ПЭГ, которая ковалентно соединена карбаматной или амидной связью с линкером на основе третичного амида указанного пептидного димера. ПЭГ представляет собой фармацевтически приемлемый водорастворимый полимер. ПЭГ, при использовании в настоящем изобретении, может быть линейным,
- 9 014528 неразветвленным полиэтиленгликолем, имеющим молекулярную массу от примерно 20 килодальтон (20 кДа), до примерно 60 кДа (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес). Наиболее предпочтительно, ПЭГ имеет молекулярную массу в интервале от 30 до 40 кДа. Специалист в данной области может выбрать желаемый размер полимера, основываясь на таких соображениях, как желаемая дозировка; время циркуляции в крови; устойчивость к протеолизу; влияние, если таковое имеется, на биологическую активность; простота в применении; степень или отсутствие антигенности; и другие известные эффекты влияния ПЭГ на терапевтический пептид.
Пептиды, димеры пептидов и другие молекулы на основе пептидов согласно настоящему изобретению могут быть присоединены к водорастворимым полимерам (например, ПЭГ) с применением любой из ряда химических реакций, позволяющих связать водорастворимый полимер(ы) с рецепторсвязывающей частью молекулы (например, пептид + спейсер). В типичном варианте реализации настоящего изобретения применяют единственную сшивку для ковалентного соединения водорастворимого полимер(ов) с рецептор-связывающей частью молекулы, однако в альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения могут быть использованы множественные сшивки, включая дополнительные варианты, в которых с рецепторсвязывающей частью по различным положениям присоединены различные виды водорастворимого полимера(ов), указанные места присоединения могут включать ковалентные связи со спейсером и/или с одной или обеими пептидными цепями. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения димер или мультимер более высокого порядка содержит пептидные цепи различного вида (то есть гетеродимер или гетеромультимер). Исключительно в качестве примера, но не ограничения, указанный димер может содержать первую пептидную цепь, которая содержит сайт присоединения ПЭГ, и вторую пептидную цепь, у которой может отсутствовать соединение с ПЭГ или может быть использован другой вид связи, чем для первой пептидной цепи, и в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, спейсер может либо содержать, либо не содержать сайт присоединения ПЭГ, для вышеназванного спейсер, в случае связи с полиэтиленгликолем, могут применять другой тип связи, чем способ связи первой и/или второй пептидной цепи. Альтернативный вариант реализации настоящего изобретения предполагает фрагмент ПЭГ, который связан со спейсерной частью рецепторсвязывающей части, тогда как с боковой цепью одной из аминокислот пептидной части молекулы соединен другой водорастворимый полимер природы (например, углевод).
Широкое разнообразие видов полиэтиленгликоля может быть использовано для присоединения ПЭГ (ПЭГилирования) к рецепторсвязывающей части молекулы (пептиды + спейсер). По существу, можно использовать любой подходящий реакционноспособный реагент ПЭГ. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения применение реакционноспособного реагента ПЭГ приводит к образованию карбаматной или амидной связи с рецепторсвязывающей частью молекулы. Подходящие реакционноспособные виды ПЭГ включают, но не ограничиваются, коммерчески доступными видами согласно каталогам: Эгид Ое1Егегу 8у§1ет5 са!а1од (2003) корпорации Ν0Ε (УеЬЦи Сагйеп Р1асе Тотеег, 20-3 ЕЫки 4-сБоте, 8ЫЬиуа-ки, Токуо 150-6019) и Мо1еси1аг Епдтеегтд са!а1од (2003) от №к!аг ТБегареийск (490 ^^8соνе^у Οπιό, Нип1этШе, А1аЬата 35806). В качестве примера, но не для ограничения, приведены следующие реагенты полиэтиленгликоля, часто являющиеся предпочтительными в различных вариантах реализации настоящего изобретения: тРЕС2-NΗ8, тРЕС2-АЬП, ти1й-Агт РЕС, тРЕС(МАЬ)2, тРЕС2(МАЬ), тРЕС-ΝΗχ тРЕС-8РА, тПЭГ-8ВА, тПЭГ-тиоэфиры, тРЕС-двойные эфиры, тРЕС-ВТС, тРЕС-Ви!угАЬП, тРЕС-АСЕТ, гетерофункциональные полиэтиленгликоли (ΝΗ2РЕС-С00Н, Вос-РЕС-ΝΗδ, Етос-РЕС-ΝΗδ, Νΐυ-РЕС-УУ ΝΗδ-РЕС-МАЬ), акрилаты полиэтиленгликоля (АСКЕ-РЕС-ΝΗδ), ПЭГ-фосфолипиды (например, тРЕС-Э8РЕ), химически активированные, способами, известными специалистам в данной области, разветвленные полиэтиленгликоли серии 8ϋΝВК1ТЕ, включая серию СЬ, основывающуюся на глицерине. Любой из активированных полиэтиленгликолей 8υNВΚIТЕ, включая, но не ограничиваясь: карбоксил-ПЭГ, р-№-ПЭГ, трезил-ПЭГ, альдегидПЭГ, ацеталь-ПЭГ, амино-ПЭГ, тиол-ПЭГ, малеимидо-ПЭГ, гидроксил-ПЭГ-амин, амино-ПЭГ-СООН, гидроксил-ПЭГ-альдегид, ПЭГ типа кислотного ангидрида, функциональные ПЭГ-фосфолипиды, и другие аналогичные и/или пригодные реактивы ПЭГ, которые могут быть выбраны специалистами в данной области для их конкретного применения и использования.
Новые пептиды согласно настоящему изобретению также могут содержать две субъединицы ПЭГ, которые ковалентно соединены карбаматными или амидными связями со спейсерным фрагментом, который соединен с линкером пептидного димера на основе третичного амида. Каждая из двух субъединиц ПЭГ, использумых в подобных вариантах реализации настоящего изобретения, может быть линейной, они могут быть связаны вместе в единственной точке прикрепления. Каждая субъединица ПЭГ, используемого в настоящем изобретении, имеет желательную молекулярную массу от примерно 10 килодальтон (10 кДа), до примерно 60 кДа (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес). Особенно предпочтительны линейные субъединицы ПЭГ. Наиболее предпочтительно, чтобы каждая из двух субъединиц ПЭГ имела молекулярную массу в интервале от 20 до 40 кДа, а еще более желательно - в интервале от 30 до 40 кДа. Специалист в данной области может выбрать желаемый размер полимера, основываясь
- 10 014528 на таких соображениях, как желаемая дозировка; время циркуляции в крови; устойчивость к протеолизу; влияние, если таковое имеется, на биологическую активность; простота в применении; степень или отсутствие антигенности; и другие известные эффекты влияния ПЭГ на терапевтический пептид.
Настоящее изобретение также охватывает пептиды-агонисты, которые представляют собой гомодимеры пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (АсС)СЬУАСНМСР1Т(1па1)УСрРЬЯ(Ме6) (8ЕЦ ГО ΝΟ: 3); где каждая аминокислота обозначена стандартным однобуквенным сокращением, (АсС) обозначает Ν-ацетилглицин, (1-па1) обозначает 1-нафтилаланин, и (Меб) обозначает Ν-метилглицин, также известный как саркозин. Каждый пептидный мономер указанного димера содержит внутримолекулярную дисульфидную связь между остатками цистеина мономера. Такие мономеры могут быть схематически представлены следующим образом:
I 1 (АсС)6ЬУАСНМСР1Т( 1 -паРУСрРЬЩМеС) (АсС)6ЬУАСНМСР1Т(1-па1)УСС2РЫ<(МеС) иди I I (8Ες го
ΝΟ: 3)
Указанные мономерные пептиды связаны таким образом, что образуют пептидный димер с повышенной активностью в качестве агониста ЕРО-Я. Линкерная субъединица (ЬК) представляет собой остаток лизина, который соединяет С-концы двух пептидных мономеров, одновременно связываясь с Сконцевыми аминокислотами каждого из мономеров. Первый пептидный мономер связан своим С-концом с ε-аминогруппой лизина и второй пептидный мономер также связан своим С-концом с α-аминогруппой лизина. Например, подобный димер может быть описан структурной формулой II формулой Ι и схематично Формула I
Формула II
Мопотег!--№н
I
СН2
I
Н2С
I сн2 I Н2| /°
Мопотег2— №н —СН-СГ Х5расег-РЕСзсмок
В формулах I и II, Ν2 означает атом азота ε-аминогруппы лизина
Мопотег!—Ν2Η
20-4ОК и Ν1 означает атом азота αаминогруппы лизина.
Пептидный димер согласно настоящему изобретению также содержит спейсерный фрагмент следующей структуры:
-№н-(сн2)2-о-(сн2)2-о-(сн2)2-№нНа одном конце атом Ν1 спейсера ковалентно соединен посредством карбаматной или амидной связи с фрагментом активированного полиэтиленгликоля; на противоположном конце атом Ν2 спейсера присоединен посредством карбаматной или амидной связи к субъединице активированного полиэтиленгликоля, причем ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 10000 до 60000 Да (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес). Предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу от 20000 до 40000 Да.
Таким образом, пептиды согласно настоящему изобретению содержат фрагмент ПЭГ, который ковалентно связан с пептидным димером. ПЭГ представляет собой фармацевтически приемлемый водорастворимый полимер. ПЭГ, при использовании в настоящем изобретении, может быть линейным, неразветвленным полиэтиленгликолем, имеющим молекулярную массу от примерно 20 килодальтон (20 кДа), до примерно 60 кДа (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указаный молекулярный вес). Наиболее предпочтительно, ПЭГ имеет молекулярную массу в интервале от 20 до 40 кДа, а еще более желательно ПЭГ имеет молекулярную массу в интервале от 30 до 40 кДа. Специалист в данной области может выбрать желаемый размер полимера, основываясь на таких соображениях, как желаемая дозировка; время циркуляции в крови; устойчивость к протеолизу; влияние, если оно есть, на биологическую активность; простота в применении; степень или отсутствие антигенности и другие известные эффекты влияния ПЭГ на терапевтический пептид.
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсЩСТУАсНМСРЩКпа^УСрРЬЯК (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1) и атом Ν1 линкера ковалентно присоединен карбаматной связью к фрагменту активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
- 11 014528
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СБУАСНМСР1Т(1-па1)УС0РБКК (8ЕЦ ΙΌ N0:1) и атом Ν1 линкера ковалентно соединен амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СБУАСНМСР1Т(1-па1)УС0РБК(МсС)К (8ЕЦ ΙΌ Ν0: 2) и атом Ν1 линкера ковалентно соединен карбаматной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СБУАСНМСР1Т(1-па1)УС0РБК(МсС)К (8ЕЦ ΙΌ Ν0: 2) и атом Ν1 линкера ковалентно соединен амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
- 12 014528
Предпочтительные пептидные димеры в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничиваются:
- 13 014528
- 14 014528
- 15 014528
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СБУАСНМСР1Т(1-па1)УС0РБКК (8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1) и как Ν1, так и Ν2 атомы спейсера ковалентно соединены карбаматной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
- 16 014528
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (Ас6)6Ь¥АСНМ6Р1Т(1-иа1)УСрРЬВК (8ЕЦ ГО N0: 1) и как Ν1, так и Ν2 атомы спейсера ковалентно соединены амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (Ас6)6Г¥АСНМ6Р1Т(1-па1)УСрРЬВ(Ме6)К (№Г) ГО N0: 2) и как Ν1, так и Ν2 атомы спейсера ковалентно соединены карбаматной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
В случае, если каждый мономер гомодимера имеет аминокислотную последовательность (АсС)СГ¥АСНМСР1Т(1-па1)УС.’0РГВ(МеС)1< (8ЕЦ ГО N0: 2) и как Ν1, так и Ν2 атомы спейсера ковалентно соединены амидной связью с фрагментом активированного ПЭГ, новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут быть представлены следующим образом:
- 17 014528
Предпочтительные пептидные димеры в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничиваются:
- 18 014528
- 19 014528
- 20 014528
- 21 014528
- 22 014528
(8Е0 ГО ΝΟ: 2) ( 8ЕС> ГО ΝΟ: 2) (8Ер Ιϋ КО 2)
- 23 014528
Спейсер соединен карбаматной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля (ПЭГ), новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению (8ЕЦ Ш N0: 3) могут быть представлены следующим образом:
Спейсер соединен амидной связью с фрагментом активированного полиэтиленгликоля (ПЭГ), новые пептидные соединения согласно настоящему изобретению (8ЕЦ Ш N0: 3) могут быть представлены следующим образом:
(АсС.)С1.¥АС’НМиР1'1'(1-па1)7('-рР1.К(.Ме<;)-
рес20_40К (АсО)ОЬ УАСНМ0Р1Т(|-па1)УСрРЬК(Ме6) -ΗΝ
Такая структура димера может быть обозначена как [Ас-пептид, дисульфидный мостик]2Ьу§ спейсер-ПЭГ20-40кд, где обозначены ацетилированные на Ν-конце пептиды, связанные с обеими, и α и εаминогруппами лизина соответственно, содержащие внутримолекулярные дисульфидные связи, и молекула спейсера, образующая ковалентную связь между С-концом лизина и фрагментом ПЭГ, которая имеет молекулярную массу примерно от 20000 до 40000 Да.
Предпочтительные пептидные димеры согласно настоящему изобретению включают, но не ограни чиваются:
- 24 014528
(8ΕφΙϋΝΟ: 3) (8ΕφΙϋΝΟ: 3)
(8Εφ Ю ΝΟ: 3) (8Ε(2 Π) ΝΟ: 3) (8Ε(3 Ю ΝΟ: 3) (8ЕЦ Ю ΝΟ: 3)
Стереоизомеры двадцати стандартных аминокислот (например, Ό-аминокислоты), не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как α,α-двузамещенные аминокислоты, Ν-алкил-аминокислоты, молочная кислота, и другие неканонические аминокислоты также могут быть пригодными компонентами соединений, относящихся к настоящему изобретению. Примеры неканонических аминокислот включают, но не ограничиваются: β-аланин, 3-пиридилаланин, 4-гидроксипролин, О-фосфосерин, Νметилглицин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, пог-лейцин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты. Также возможны другие модификации, включая модификации Ν- и С-концов, замена одной или более из естественных генетически кодируемых аминокислот на неканонические аминокислоты, модификации боковой цепи одного или более аминокислотных остатков, фосфорилирование пептида, и тому подобное.
Последовательности пептидов из соединения согласно настоящему изобретению представляют собой только указанные последовательности или их аналоги, дополненные пептидами на Ν-конце и/или на С-конце. Подобными дополнениями могут служить последовательности, кодирующие природные пептиды, дополненные последовательностями неприродного происхождения или в значительной степени без таковых; дополнения могут включать любые вставки, делеции, точковые мутации или другие модификации последовательности либо их комбинации по желанию специалиста в данной области. Для примера, но не для ограничения, естественно возникшие последовательности могут быть полноразмерными или
- 25 014528 частичной длины и могут содержать замены аминокислот, обеспечивающие сайты присоединения углеводов, ПЭГ, других полимеров, или тому подобного, посредством соединения с боковой цепью. В качестве варианта, аминокислотные замены приводят к гуманизированной последовательности, которая является совместимой с иммунной системой человека. Предусмотрены гибридные белки всех типов, включая последовательности иммуноглобулинов, расположенные в непосредственной близости от ЕРО-К активирующей последовательности согласно настоящему изобретению или смежные с ней с применением или без последовательности неиммуноглобулинового спейсера. Одним из вариантов реализации настоящего изобретения предусмотрена иммуноглобулиновая цепь, которая содержит ЕРО-К активирующую последовательность вместо вариабельного региона (V) тяжелой и/или легкой цепи.
Получение пептидов, относящихся к настоящему изобретению Синтез пептидов
Пептиды, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть получены с помощью классических способов, известных в данной области. Указанные стандартные способы включают полностью твердофазный синтез, способы частично твердофазного синтеза, конденсацию фрагментов, классический синтез в растворе, и технологию рекомбинантных ДНК [см., например, МетГ1е1б 1 Ат. СЬет. 8ос. 1963 85:2149].
В одном варианте реализации настоящего изобретения пептидные мономеры димера синтезируют отдельно и димеризуют после завершения синтеза.
В другом варианте реализации настоящего изобретения пептидные мономеры димера связаны через их С-концы с применением линкерной субъединицы ЬК на основе третичного разветвленного амида, имеющего две функциональные группы, способные служить сайтами инициации для синтеза пептида, и третью функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая способна связываться с другой молекулярным фрагментом (который, например, может присутствовать на поверхности твердого носителя). В этом случае два пептидных мономера можно синтезировать непосредственно на двух реакционноспособных азотсодержащих группах линкерной субъединицы ЬК с вариацией техники твердофазного синтеза. Такой синтез может быть последовательным или одновременным.
В другом варианте реализации настоящеего изобретения два пептидных мономера могут быть синтезированы непосредственно на двух реакционноспособных азотсодержащих группах линкерной субъединицы ЬК с применением варианта техники твердофазного синтеза. Такой синтез может быть последовательным или одновременным. В этом варианте реализации настоящего изобретения субъединица лизинового линкера (ЬК) содержит две аминогруппы, способные служить сайтами инициации для синтеза пептида, и третью функциональную группу (например, карбоксильную группу лизина; или аминогруппу амида лизина, карбоксильная группа остатка лизина в котором преобразована в амидогруппу СОНН2). которая способна связываться с другой молекулярной субъединицей (которая, например, может присутствовать на поверхности твердого носителя).
В случае если производят последовательный синтез цепей пептидного димера на линкере, две функциональные аминогруппы в молекуле линкера защищают двумя другими независимо удаляемыми аминозащитными группами. Защищенный линкер связан с твердым носителем посредством третьей функциональной группы линкера. Первую аминозащитную группу удаляют и синтезируют первый пептид димера на первой реакционноспособной аминогруппе. Затем удаляют вторую аминозащитную группу и синтезируют второй пептид димера на второй реакционноспособной аминогруппе. Например, первая аминогруппа линкера может быть защищена группой А11ос (аллилоксикарбонил), а вторая - защищена группой Ртос (флуоренилметилоксикарбонил). В этом случае группа Ртос (но не группа А11ос), может быть удалена обработкой мягким основанием [например, 20% пиперидином в диметилформамиде (ΌΜΡ)], после чего синтезируют первую пептидную цепь. Затем с помощью пригодных реагентов [например, Рб(РРЬ3)/4-метил морфолин и хлороформ] можно удалить группу А11ос и синтезировать вторую пептидную цепь. Следует отметить, что для цистеина должны быть использованы различные тиолзащитные группы, чтобы управлять образованием дисульфидных связей (как обсуждается ниже), данную технологию нужно применять, даже если конечные аминокислотные последовательности пептидных цепей димера идентичны. В случае, если осуществляется одновременный синтез цепей пептидного димера на линкере, две функциональные аминогруппы в молекуле линкера защищают двумя одинаково удаляемыми аминозащитными группами. Защищенный линкер связан с твердым носителем посредством третьей функциональной группы линкера. В этом случае одновременно снимают защиту с двух защищенных функциональных групп молекулы линкера, и две пептидные цепи одновременно синтезируют на реакционоспособных группах. Следует отметить, что, применяя данный способ, получают идентичные последовательности пептидных цепей димера и используют одинаковые тиолзащитные группы для остатков цистеина.
Предпочтительным способом пептидного синтеза является твердофазный синтез. Процедура твердофазного синтеза хорошо известна в данной области техники [см., например, 81е\уаП 8обб РЬаке Рерйбе 8упШекек (Ргеетап апб Со.: 8ап Ргапшксо) 1969; 2002/2003 Оепега1 Са1а1од Ггот №уаЬюс11ет Согр, 8ап П1едо, И8А; Оообтап 8уп(Нек1к оГ Рерббек апб Рербботипеиск (НоиЬеп-^еу1, 81и(1даг() 2002]. В твердофазном синтезе синтез обычно начинают с С-конца пептида с использованием α-аминозащитной смолы.
- 26 014528
Пригодный исходный материал может быть подготовлен, например, присоединением необходимой αаминокислоты к хлорметилированной смоле, гидроксиметилированной смоле, полист ирольной смоле, бензидриламиновой смоле, или тому подобным. Одна из таких хлорметилированных смола продается под фирменным названием ВЮ-ВЕАЭЗ БХ-1 от Βίο Вай БаЬога1опек (В1сйшоий, СА). Подготовка гидроксиметилированной смолы описана в |Войопкхку, е1 а1. (1966) СНет. 1пй. Ьопйоп 38:1597]. Бензидриламиновая смола (ВНА) описана в [Р1ейа апй Магкйай (1970) СНет. Соттип. 650], ее гидрохлоридная форма коммерчески доступна в Весктап ЕчйгитепК 1пс. (Ра1о Айо, СА). Например, аминозащищенная α-аминокислота может быть связана с хлорметилированной смолой с помощью катализатора бикарбоната цезия, в соответствии с методом, описанным Сын (1973) Не1у. С1ит. Ас1а 56:1467.
После образования начальной связи с α-аминогруппы удаляют защиту, например, используя растворы в органических растворителях трифторуксусной кислоты (йгПиогоасейс ас1й, ТБА) или хлороводородной кислоты (НС1) при комнатной температуре. В соответствии с этим аминокислоты с защищенной α-аминогруппой последовательно присоединяют к связанной с носителем растущей пептидной цепи. Защитные группы для α-аминогрупп могут представлять собой любые, которые могут быть использованы в области пошагового синтеза пептидов, включая: защитные группы ацильного типа (например, формил, трифторацетил, ацетил), защитные группы типа ароматических уретанов [например, бензилоксикарбинол (СЬх) и замещенные СЬх|, защитные группы типа алифатических уретанов [например, третбутилоксикарбонил (Вос), изопропилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил] и защитные группы алкильного типа (например, бензил, трифенилметил), флуоренилметилоксикарбонил (Бтос), аллилоксикарбонил (А11ос) и 1-(4,4-диметил-2,6-диокоциклогекс-1-илиден)этил (Эйе).
Группы, защищающие боковую цепь (обычно простые и сложные эфиры, тритил, РМС, и тому подобное), остаются интактными в течение образования связи и не отщепляются ни в процессе снятия защиты с аминоконцевой группы, ни во время образования связи. Защитная группа для боковой цепи должна быть отщепляемой по завершению синтеза конечного пептида и при условиях реакции, которые не влияют на полученный пептид. Защитные группы для боковой цепи тирозина включают тетрагидропиранил, трет-бутил, тритил, бензил, СЬх, Ζ-Вг-СЬх, и 2,5-дихлорбензил. Защитные группы для боковой цепи аспарагиновой кислоты включают бензил, 2,6-дихлорбензил, метил, этил и циклогексил. Защитные группы для боковой цепи серина и треонина включают ацетил, бензоил, тритил, тетрагидропиранил, бензил, 2,6-дихлорбензил и СЬх. Защитные группы для боковой цепи аргинина включают нитрогруппу, тозил (Ток), СЬх, адамантилоксикарбонил, мезитоилсульфанил (М1к), 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил (РЬП), 4-метокси-2,3,6-триметилбензензульфонил (М1г) или Вос. Защитные группы для боковой цепи лизина включают СЬх, 2-хлоробензилоксикарбонил (2-С1-СЬх), 2бромобензилоксикарбонил (2-Вг-СЬх), Ток или Вос.
После удаления защиты с α-аминогруппы остальные защищенные аминокислоты пошагово добавляют в желаемом порядке. Каждую защищенную аминокислоту обычно вводят в реакцию примерно в трехкратном избытке, используя подходящий активатор карбоксильной группы, как, например, 2-(1Нбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3 тетраметилмочевины гексафлуорофосфат 2-(1Н-Ъепхойтахо1-1-у1)-1,1,3,3 1е1гате111уй.1гопц1т НехаДиогорйокрйа1е (НВТИ) или дициклогексилкарбодиимид (й1сус1ойеху1сагЬой1т1йе, ОСС) растворенный, например, в метиленхлориде (СН2С12), Ν-метил пирролидоне, диметилформамиде (йипеШу 1 Еогшатъйе, ЭМЕ), или их смеси. После того как синтез желаемой аминокислотной последовательности завершен, желаемый пептид отделяют от несущей смолы после обработки соответствующим реагентом, таким как трифторуксусная кислота или фтороводород НЕ, которые не только отделяют пептид от смолы, но также снимают остальные защитные группы с боковых цепей. В случае использования хлорметилированной смолы обработка фтороводородом приводит к образованию свободного пептида в форме кислоты. В случае использования бензидриламиновой смолы обработка фтороводородом приводит к образованию свободного пептида в форме амида. Напротив, в случае использования хлорметилированной смолы пептид с защищенными группами боковых цепей можно снять при помощи обработки смолы аммиаком, и таким образом получить желаемый амид с защищенными боковыми цепями, или алкиламином, таким образом получить алкиламиды или диалкиламиды с защищенными боковыми цепями. Защиту с боковых цепей затем удаляют обычным способом при помощи фтороводорода, получая свободные амиды, алкиламиды, или диалкиламиды.
При получении сложных эфиров в соответствии с настоящим изобретением применяют смолу для получения пептида в форме кислоты, и пептид с защищенными боковыми цепями отщепляют с помощью основания и подходящего спирта (например, метанола). Защитные группы боковых цепей затем удаляют обычным способом, обработкой фтороводородом, и получают желаемый сложный эфир.
Эти процедуры также могут быть использованы для того, чтобы синтезировать пептиды, в которых присутствуют другие аминокислоты, помимо двадцати аминокислот природного происхождения, в одном, двух или более положениях любого из соединений согласно настоящему изобретению ими заменяют генетически кодируемые аминокислоты. Синтетические аминокислоты, которые могут входить в состав пептидов согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются, Ν-метил, Ьгидроксипролил, Ь-3,4-дигидроксифенилаланил, δ-аминокислоты, такие как Ь-5-гидроксилизил и Ό-5
- 27 014528 метилаланил, Ь-а-метилаланин, β-аминокислоты и изохинолил. Б-аминокислоты и синтетические аминокислоты неприродного происхождения также могут быть входить в состав пептидов согласно настоящему изобретению.
Модификации пептидов
Концевые аминогруппы и/или карбоксильные группы пептидных веществ согласно настоящему изобретению также можно модифицировать для того, чтобы получить другие вещества согласно настоящему изобретению. Например, концевую аминогруппу можно ацетилировать уксусной кислотой или ее галогенпроизводными, такими как например, а-хлоруксусная кислота, а-бромуксусная кислота или аиодуксусная кислота).
Боковые цепи 20 природных генетически кодируемых аминокислот (или стереоизомеры Б аминокислот) можно заменить другими боковыми цепями, например, такими группами, как алкилы, низшие алкилы, циклические 4-, 5-, 6- и 7-членные алкилы, амиды низших алкилов, диамиды (низших алкилов), алкокси-, гидрокси-, карбоксипроизводные низших алкилов и их сложные эфиры, 4-, 5-, 6-, 7-членные гетероциклы. В частности, можно применять аналоги пролина, в которых размер цикла в остатке пролина заменен с 5- на 4-, 6- или 7-членный. Циклические группы могут быть насыщенными или ненасыщенными, в случае если они ненасыщенные, то могут быть ароматическими или неароматическими. Гетероциклические группы предпочтительно содержат один или более гетероатом азота, кислорода и/или серы. Примеры таких групп включают фуразанил, фурил, имидазолинил, имидазолил, имидозолинил, изотиазолил, изооксазолил, морфолинил (например, морфолиногруппа), оксазолил, пиперазинил (например, 1пиперазинил), пиперидил (например, 1-пипередил, пиперидиногруппа), пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиарзолил, пиридазинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил (например, 1пирролидинил), пирролинил, пирролил, тиадиазолил, тиазолил, тиенил, тиоморфолинил (например, тиоморфолиногруппа) и триазолил. Эти гетероциклические группы могут быть замещенными или незамещенными. В случае если группа является замещенной, заместитель может быть алкилом, простым эфиром, галогеном, кислородом или замещенным, или незамещенным фенилом.
Можно также легко модифицировать пептиды путем фосфорилирования и другими способами [например, как описано в НгиЬу, е! а1. (1990) Вюсйет 1. 268:249-262].
Пептидные соединения согласно настоящему изобретению также служат в качестве структурных моделей для непептидных соединений с аналогичной биологической активностью. Специалисты в данной области признают, что для создания соединений с той же или аналогичной желаемой биологической активностью, такой же, как у указанного пептида, но с более желательными свойствами, чем у указанного пептида, в отношении растворимости, стабильности и устойчивости к гидролизу и протеолизу, доступен ряд способов [см. Могдап апБ Сашог (1989) Апп. Вер. МеБ. СБет. 24:243-252]. Эти методы включают замещение остова пептида остовом, сформированным фосфонатами, амидатами, карбаматами, сульфонамидами, вторичными аминами и Ν-метиламинокислотами.
Образование дисульфидных связей
Соединения ссогласно настоящему изобретению содержат две внутримолекулярные дисульфидные связи. Такие дисульфидные связи могут быть получены окислением остатков цистеина каждого пептидного мономера.
В одном способе реализации настоящего изобретения контроль образования межцистеиновых связей осуществляют посредства выбора типа окисляющего агента и его эффективной концентрации, чтобы оптимизировать образование желаемого изомера. Например, окисление пептидного димера, в котором образуются две внутримолекулярные дисульфидные связи (по одной в каждой пептидной цепи), предпочтительно достигается (по отношению к образованию межмолекулярных дисульфидных связей), когда окисляющим агентом является БМ80 или иод (Ι2).
В других вариантах реализации настоящего изобретения образование межцистеиновых связей контролируют благодаря избирательному использованию тиолзащитных групп в течение синтеза пептида. Например, в случае когда желательным является димер с двумя внутримолекулярными дисульфидными связями, первую пептидную цепь мономера синтезируют с двумя остатками цистеина основной последовательности, защищенными первой тиолзащитной группой [например, тритил (Тй), алкилоксикарбонил (А11ос), и 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил (ББе) или тому подобному], затем синтезируют второй пептидный мономер, два остатка цистеина основной последовательности которого защищены второй тиол-защитной группой, отличной от первой группы [например, ацетамидометил (Аст), третбутил (!Ви), или тому подобное]. Согласно этому первую тиолзащитную группу удаляют, производя бисульфидную циклизацию первого мономера, а затем удаляют вторую тиолзащитную группу, производя бисульфидную циклизацию второго мономера.
Другие варианты реализации настоящего изобретения предусматривают в качестве аналогов пептидов их дисульфидные производные, в которых один из атомов серы заменен СН2 группой или другой аналогичной группой для серы. Такие аналоги могут быть получены из соединений согласно настоящему изобретению, в которых каждый пептидный мономер содержит по крайней мере один остаток цистеина или гомоцистеина и α-амино-у-масляную кислоту вместо второго остатка цистеина, посредством внут
- 28 014528 римолекулярного или межмолекулярного замещения, с использованием способов, известных в данной области [см., например, Вагкег, е! а1. (1992) 1. Меб. Скет. 35:2040-2048 и Ог, е! а1. (1991) 1. Огд. Скет. 56:3146-3149]. Специалист в данной области легко поймет, что такое замещение можно также произвести с использованием других гомологов α-амино-у-масляной кислоты и гомоцистеина.
Дополнительно к предыдущей стратегии циклизации могут быть применены другие стратегии циклизации пептидов без участия дисульфидных связей. Такие альтернативные стратегии циклизации включают, например, амидную стратегию циклизации, а также образование тиоэфирных связей. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению могут существовать в циклической форме с внутримолекулярными амидными либо тиоэфирными связями. Например, может быть синтезирован пептид, в котором один цистеин основной последовательности заменен на лизин и второй цистеин заменен на глутаминовую кислоту. В соответствии с этим циклический мономер может быть получен посредством амидной связи между боковыми цепями этих двух остатков. Кроме того, может быть синтезирован пептид, в котором один цистеин основной последовательности заменен на лизин (или серин). Циклический мономер может быть затем получен посредством образования тиоэфирной связи между боковыми цепями остатков лизина (или серина) и вторым остатком цистеина основной последовательности. В дополнение к дисульфидным стратегиям циклизации, для циклизации соединений согласно настоящему изобретению легко могут быть использованы амидная и тиоэфирная стратегии циклизации. Кроме того, аминоконцевой остаток пептида может быть закрыт α-замещенной уксусной кислотой, в которой заместитель у α-атома является удаляемой группой, такой как α-галогенуксусная кислота, например α-хлоруксусная кислота, α-бромуксусная кислота или α-иодуксусная кислота.
Добавление линкера на основе третичного разветвленного амида
Пептидные мономеры можно димеризовать с применением линкера, представляющего собой третичный разветвленный амид. В одном способе реализации настоящего изобретения линкер включают в пептид в ходе синтеза пептида. Например, в случае, если субъединица линкера ЬК содержит две функциональные группы, способные служить в качестве сайтов инициации для синтеза пептида, и одну или более другую функциональную группу (например, карбоксильную или аминогруппу), что позволяет связываться с одной или более другими молекулярными субъединицами, линкер может быть конъюгирован с твердым носителем. Таким образом, два пептидных мономера могут быть синтезированы непосредственно на двух реакционноспособных азотсодержащих группах субъединицы линкера ЬК согласно модифицированной методике твердофазного синтеза.
В альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения линкер может быть конъюгирован с двумя пептидными мономерами димера после синтеза пептида. Такое соединение может быть достигнуто хорошо известными в данной области техники методами. В одном способе реализации настоящего изобретения, линкер содержит две функциональные группы, пригодные для присоединения к функциональным группам-мишеням синтезированных пептидных мономеров. Например, линкер, содержащий две карбоксильные группы, либо предактивированные, либо в присутствии подходящих связующих агентов, может прореагировать с аминогруппами-мишенями боковой цепи лизина каждого из двух пептидных мономеров.
Например, мономеры пептида могут быть химически связаны с линкером - третичным амидом, А*-С1О-СН2-Х-СН2-С2О-В* где X представляет собой ИСО-(СН2)2-ИН-У, а Υ - подходящая защитная группа, как например, трет-бутилоксикарбонил (Вое) защитная группа; А* - пригодная функциональная группа, такая как Νоксисукцинимид, используемая для связи атома С1 линкера с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина первого пептидного мономера; и В* - пригодная функциональная группа, такая как Νоксисукцинимид, используемая для связи атома С2 линкера с ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина второго пептидного мономера.
Дополнительно, например, мономеры пептида могут химически связаны линкером на основе третичного амида
А*-С1О-СН2-Х-СН2-С2О-В* где X представляет собой ИСО-(СН2)2-ИН-С3О-; А* - пригодная функциональная группа, такая как Ν-оксисукцинимид, используемая для связи атома С1 линкера с ε - аминогруппой С-концевого остатка лизина первого пептидного мономера; и В* - пригодная функциональная группа, такая как Νоксисукцинимид, используемая для связи атома С2 линкера ε-аминогруппой С-концевого остатка лизина второго пептидного мономера; и линкер на основе третичного амида химически связан со спейсерным фрагментом
Υ-ΝΗ-(ΟΗ2)4-Ο4Η-ΝΗ-Υ где атом С3Х связан ковалентной связью с атомом С4 спейсера; а
Υ - пригодная защитная группа, как например, трет-бутилоксикарбонил защитная группа (Вос).
Добавление лизинового линкера
Мономеры пептида можно димеризовать с применением субъединицы лизинового линкера ЬК. В одном способе реализации настоящего изобретения лизиновый линкер включают в пептид в ходе его
- 29 014528 синтеза. Например, субъединица лизинового линкера ЬК содержит две функциональные группы, способные служить в качестве сайтов инициации синтеза пептида, и третью функциональную группу (например, карбоксильную группу или аминогруппу), которая способна связываться с другой молекулярной субъединицей, линкер может быть связан с твердым носителем. В соответствии с этим два пептидных мономера могут быть синтезированы непосредственно на двух реакционноспособных азотных группах субъединицы лизинового линкера ЬК с применением вариантов техники твердофазного синтеза.
В альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения пептидный димер димеризуют с применением фрагмента лизинового линкера ЬК, вышеуказанный линкер может быть связан с двумя пептидными мономерами димера после пептидного синтеза. Такое соединение может быть достигнуто хорошо известными в данной области техники способами. В одном способе реализации настоящего изобретения, линкер содержит по меньшей мере две функциональные группы, пригодные для присоединения функциональных групп-мишеней синтезированных пептидных мономеров. Например, две свободные аминогруппы лизина могут прореагировать с С-концевыми карбоксильными группами каждого из двух пептидных мономеров.
Добавление спейсера
Пептидные соединения согласно настоящему изобретению также включают спейсерный фрагмент. В одном способе реализации настоящего изобретения, спейсер может быть включен в пептид в ходе синтеза пептида.
Например, спейсер содержит свободную аминогруппу и вторую функциональную группу (например, карбоксильную или аминогруппу), которая способна связываться с другим молекулярным фрагментом, спейсер может быть может быть связан с твердым носителем.
В одном способе реализации настоящего изобретения спейсер, который содержит две функциональные группы первоначально присоединяют с твердым носителем через первую функциональную группу. Затем субъединица лизинового линкера ЬК, имеющая две функциональные группы, способные служить в качестве сайтов инициации синтеза пептида, и третью функциональную группу (например, карбоксильную или аминогруппу), которая способна связываться с другой молекулярной субъединицей связывают со спейсером посредством второй функциональной группы спейсера и третьей функциональной группы линкера. Следовательно, два пептидных мономера могут быть синтезированы непосредственно на двух реакционноспособных азотсодержащих группах субъединицы линкера ЬК с применением вариантов техники твердофазного синтеза. Например, спейсер, связанный с твердым носителем, который имеет свободную аминогруппу, может прореагировать с лизиновым линкером посредством свободной карбоксильной группы линкера.
В альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения спейсер может быть связан с пептидным димером после синтеза пептидов. Такое присоединение может быть достигнуто хорошо известными в данной области техники способами. В одном способе реализации настоящего изобретения линкер содержит по меньшей мере одну функциональную группу, пригодную для присоединения функциональной группе-мишени синтезированного пептида. Например, спейсер со свободной аминогруппой может прореагировать с С-концевой карбоксильной группой пептида. В другом примере настоящего изобретения линкер со свободной карбоксильной группой может прореагировать со свободной аминогруппой амида лизина.
Присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ)
В течение последних лет водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), используют для ковалентной модификации пептидов с терапевтическим и диагностическим значением. Предполагают, что присоединение таких полимеров повышает биологическую активность, продлевает время циркуляции в крови, уменьшает иммуногенность, увеличивает растворимость в воде и повышает устойчивость к протеолизу при пищеварении. Например, ковалентное присоединение ПЭГ к терапевтическим полипетидам, таким как интерлейкины [КиаиТ е! а1. (1988) 1. Βίο1. Скет. 263; 15064; Т8и18ит1 е! а1. (1995) 1. Сои!го11еб Ве1еазе 33:447), интерфероны (Кйа е! а1. (1990) Эгад Эез. ЭеНуегу 6:157), каталаза (АЬискотевкц е! а1. (1977) 1. Вю1. Скет. 252:582), супероксид дисмутаза (Веаискатр, е! а1. (1983) Аиа1. Вюскет. 131:25) и аденозин дезаминаза (Скеа, е! а1. (1981) ВюсЫт. Вюрку. Ас!а 660:293), как сообщают, увеличивает период их полураспада ш угуо и/или уменьшает их иммуногенность и антигенность.
Пептидные соединения согласно настоящему изобретению могут содержать фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), который ковалентно связан с линкером на основе разветвленного третичного амида или спейсером пептидного димера посредством карбаматной или амидной связи. Пример ПЭГ, используемого в настоящем изобретении, представляет собой линейный, неразветвленный полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу от примерно 20 килодальтон (20 кДа) до примерно 40 кДа (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем указанный молекулярный вес). Наиболее предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу в интервале от 30 до 40 кДа.
Другим примером ПЭГ, использованного в настоящем изобретении, является линейный ПЭГ, имеющий молекулярную массу примерно от 10 до 60 кДа (слово примерно означает, что после получения ПЭГ некоторые его молекулы имеют вес больше, а некоторые меньше, чем установленный молеку
- 30 014528 лярный вес). Предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу от 20 до 40 кДа. Наиболее предпочтительно ПЭГ имеет молекулярную массу около 20 кДа.
Примеры способов ковалентного присоединения ПЭГ (ПЭГилирования) описаны ниже. Это иллюстративные описания, не предполагающие ограничения. Любому специалисту в данной области известно, что в данной области техники доступно множество способов для ковалентного присоединения разнообразных ПЭГ. Как таковое, настоящее изобретение охватывает все пептидные соединения, к котором ПЭГ присоединен любым из множества способов присоединения, известных в данной области.
Например, ПЭГ может быть связан с линкером посредством реакционноспособной группы, с которой связана активированная молекула ПЭГ (например, свободная аминогруппа или карбоксильная группа). Молекулы ПЭГ могут быть связаны с аминогруппами с использованием метоксилированного ПЭГ (тРЕС), имеющего различные реакционноспособные группы. Такие полимеры включают тРЕСсукцинимидил сукцинат, тРЕС-сукцинимидил карбонат, тРЕС-имидат, тРЕС-4-нитрофенил карбонат, и цианурохлорид-тРЕС. Аналогично, молекулы ПЭГ могут быть присоединены посредством карбоксильной группы, с использованием метоксилированного ПЭГ со свободной аминогруппой (тРЕС-ИН2).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, линкер или спейсер содержат концевую аминогруппу (то есть, находящуюся на конце спейсера). Эта концевая аминогруппа может прореагировать с соответствующим образом активированной молекулой ПЭГ, такой как тРЕС-паранитрофенилкарбонат (тРЕС-ИРС), чтобы создать стабильную ковалентную карбаматную связь. Кроме того, такая концевая аминогруппа может прореагировать с соответствующим образом активированной молекулой ПЭГ, такой как тРЕС-сукцинимидил бутират (тРЕС-8ВА) или тРЕС-сукцинимидил пропионат (тРЕС-8РА), содержащих реакционноспособную Ν-гидроксилсукцинамидную группу (ΝΗ8), чтобы создать стабильную ковалентную карбаматную связь. В других вариантах реализации настоящего изобретения реакционноспособная группа линкера содержит карбоксильную группу, способную после активации образовать ковалентную связь с содержащей аминогруппу молекулой ПЭГ при соответствующих условиях реакции. Пригодные молекулы ПЭГ включают тРЕС-ИН2, а пригодные условия реакции включают образование карбодиимид-промежуточного амида или тому подобного.
Анализ активности агонистов ЕРО-К Функциональный тест ΐη уйго
Тест на конкурентное связывание ίη νίΐτο дает количественную оценку способности тестируемого пептида конкурировать с ЕРО за связывание с ЕРО-К. Например (см., ϋδ Ра1еп1 5773569), в Е. сой может быть получен внеклеточный домен ЕРО-К человека (ЕРО связывающий белок, ЕВР) и указанный рекомбинантный белок связывают с твердой подложкой, такой как микротитровальная чашка или синтетические гранулы [например, гранулы δυΙΓοΙίηΓ от Р1егсе С11сш1са1 Со. (КоскГотб, 1Ь)]. Иммобилизованный ЕВР затем инкубируют с меченым рекомбинантным ЕРО или с мечеными рекомбинантным ЕРО и тестируемым пептидом. Для таких экспериментов применяют последовательные разбавления тестируемых пептидов. По тестовым точкам без дополнительного тестируемого пептида определяют тотальный ЕРО, связывающийся с ЕВР. Для реакций, содержащих тестируемый пептид, количество связанного ЕРО определяют и выражают в виде процента от контрольного связывания (итого=100%). Эти значения выражают как функцию концентрации пептида. Величину 1С50 определяют как концентрацию тестируемого пептида, которая уменьшает связывание ЕРО с ЕВР до 50% (то есть 50% ингибирование связывания с ЕРО).
При другом способе анализа конкурентного связывания ίη νίϋΌ измеряют световой сигнал, в возникающий в результате близости двух гранул: ЕРО-связанной гранулы и ЕРО-К-связанной гранулы. Близость гранул происходит по причине связывания ЕРО с ЕРО-К. Тестируемый пептид, который конкурирует с ЕРО за связывание с ЕРО-К, предотвращает это связывание, приводя к уменьшению выделения света. Концентрация тестируемого пептида, которая приводит к 50% уменьшению выделения света, определена как величина 1С50.
Пептиды согласно настоящему изобретению очень эффективно конкурируют с ЕРО за связывание с ЕРО-К. Такая увеличенная функция выражается в их способности ингибировать связывание ЕРО при значительно более низкой концентрации пептида (то есть, при очень низкой величине 1С50).
Биологическая активность и потенциал мономерных и димерных пептидов-агонистов ЕРО-К согласно настоящему изобретению, которые специфически связываются с ЕРО-рецептором, могут быть измерены с применением основанных на клетках функциональных систем анализа ίη νίϋΌ.
Один из тестов основан на клеточной линии пре-В-лимфоцитов мыши, экспрессирующей ЕРО-К человека и затем трансфецированной репортерным геном люциферазы под Гок-промотером. В ответ на добавление ЕРО или другого агониста ЕРО-К такие клетки синтезируют люциферазу. Люцифераза вызывает выделение света после добавления своего субстрата - люциферина. Таким образом, уровень активации ЕРО-К в таких клетках можно количественно измерить по люциферазной активности. Активность тестируемого пептида измеряли, добавляя серийные разведения тестируемого пептида в клетки, которые затем инкубировали в течение 4 ч. После инкубации добавляли субстрат - люциферин и измеряли эмиссию света. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной эмиссией света, обозначали как ЕС50.
- 31 014528
Пептиды согласно настоящему изобретению показывают существенно увеличенную способность вызывать зависимую от передачи сигналов ЕРО-К экспрессию люциферазы в данном тесте. Такая усиленная функция отражается в их способности вдвое снижать максимальную активность люциферазы при значительно более низкой концентрации пептида, (то есть у них очень низкие величины ЕС50). Данный способ анализа является предпочтительным способом оценки потенциала и активности пептидов агонистов ЕРО-К согласно настоящему изобретению.
Другой способ анализа может быть проведен с применением клеток ЕБС-Р1/ЕК [Бех!ег, е! а1. (1980) 1. Ехр. Меб. 152:1036-1047], хорошо охарактеризованной ^трансформированной линии, происходящей из костного мозга мыши, в которую стабильно трансфецировали ЕРО-К. Эти клетки демонстрируют ЕРО-зависимую пролиферацию.
В одном таком тесте клетки вырастили до половины стационарной плотности в присутствии необходимых факторов роста (см., например, описание в υδ Ра!еп! 5773569). Затем клетки промыли в РВ8 и подвергли голоданию в течение 16-24 ч в полной среде без факторов роста. После того как определили жизнеспособность клеток (например, окраской трипановым синим), подготовили стоковые растворы (в полное среде без факторов роста), дающие около 105 клеток на 50 мкл. Последовательные разведения соединения пептида - агониста ЕРО-К (обычно свободного пептида, в растворенной фазе, по сравнению со связанным с бактериофагом или другим связанным или иммобилизованным пептидом) протестировали с применением 96-луночного культурального планшета с конечным объемом 50 мкл на лунку. Клетки (50 мкл) добавили в каждую лунку и затем инкубировали 24-48 ч, за время которых клетки в отрицательном контроле должны были умереть или находиться в стационарном состоянии. Пролиферацию клеток затем измеряли способами, известными в данной области техники, такими как МТТ-тест, который измеряет включение Н3-тимидина для отражения пролиферации клеток [см., Моктапп (1983) Е 1ттипо1. МекЪобк 65:55-63]. Пептиды оценивали как на ЕРО-К-экспрессирующей клеточной линии, так и на родительской, не экспрессирующей ЕРО-К клеточной линии. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина от максимального значения пролиферации, записали как ЕС50.
Пептиды согласно настоящему изобретению при этом способе анализа показывают существенно увеличенную способность вызывать ЕРО-зависимый рост клеток. Такая усиленная функция отражается в их способности демонстрировать половину от максимальной активности стимуляции клеточной пролиферации при значительно более низкой концентрации пептида (то есть, при очень низких величинах ЕС50). Данный тест является предпочтительным способом оценки потенциала и активности пептидов агонистов ЕРО-К согласно настоящему изобретению.
В другом способе анализа клетки выращивали до стационарной фазы в среде с добавлением ЕРО, собирали, а затем культивировали дополнительные 18 ч на среде без ЕРО. Клетки разделили на три группы равной клеточной плотности: одна группа без добавления каких-либо факторов (отрицательный контроль), группа с добавлением ЕРО (положительный контроль) и экспериментальная группа с добавлением тестируемого пептида. Культивируемые клетки затем отбирали спустя различные интервалы времени, фиксировали и окрашивали ДНК-связывающим флуоресцентным красителем (например, иодидом пропидия или красителем НоесЕк!, оба красителя доступны от 81дта). Затем измеряли флуоресценцию, например, используя поточный сканирующий цитометр ЕАС8. Затем определяли процент клеток в каждой фазе клеточного цикла, например, используя модель 8ОВК программного обеспечения от Се11Е1Т (Вес!оп Бюкткоп). Клетки, обработанные ЕРО или активным пептидом, показывают большую долю клеток в δ фазе (как определяют повышением флуоресценции как индикатора повышенного содержания ДНК) относительно группы отрицательного контроля.
Аналогичный тест может быть выполнен с использованием клеточных линий ЕБСР-1 [см., например, Бех!ег е! а1. (1980) I. Ехр. Меб. 152:1036-1047] или ТЕ-1 [Кйатита е! а1. (1989) В1ооб 73:375-380]. ЕБСР-1 представляет собой зависящую от факторов роста мышиную клеточную линию, происходящую от мультипотентного примитивного кроветворного предшественника, которая может пролиферировать, но не дифференцироваться при добавлении кондиционированной среды ХУЕН1-3 (среда, которая содержит 1Ь-3, АТСС номер Т1В-68). Для таких экспериментов клеточную линию ЕБСР-1 трансфецировали ЕРО-К человека или мыши, чтобы получить клеточные линии ЕБСР-1-ЬЕРО-К или ЕБСР-1-тЕРО-К, соответственно, которые могут пролиферировать, но не дифференцироваться в присутствии ЕРО. ЕРОзависимая клеточная линия ТЕ-1 также может быть использована для измерения действия пептидов агонистов ЕРО-К на клеточную пролиферацию.
Процедура еще одного теста изложена в Кгук!а1 (1983) Ехр. Нета!о1 11:649-660. Микротест, основанный на включении Н3-тимидина в клетки селезенки, может быть применен для установления способности соединений согласно настоящему изобретению служить в качестве агонистов ЕРО. Вкратце, мышам В6С3Е1 ежедневно в течение двух дней вводили фенилгидразин (60 мг/кг). На третий день выделяли клетки селезенки и оценивали их способность пролиферировать в течение периода 24 ч с использованием теста МТТ.
Связывание ЕРО с ЕРО-К в чувствительной к эритропоэтину клеточной линии индуцирует фосфорилование тирозина как рецептора, так и многочисленных внутриклеточных белков, включая 8Ес, уау и 1АК2 киназу. Следовательно, другие тесты ш У1!то измеряют способность пептидов согласно настоящему
- 32 014528 изобретению индуцировать фосфорилирование тирозина ЕР0-Р и нижележащих внутриклеточных белков сигнальной трансдукции. Активные пептиды, которые были идентифицированы в тестах на связывание и пролиферацию, описанных выше, показали рисунок фосфорилирования почти идентичный тому же, что и вызываемый ЕРО в эритропоэтин-чувствительных клетках. Для этого теста клетки ЕЭС-Р1/ЕР |Оех1ег е1 а1. (1980) 1 Ехр Мей 152:1036-47] подерживали в среде с добавлением ЕРО и выращивали до стационарной фазы. Клетки затем культивировали в среде без ЕРО в течение 24 ч. Определенное количество таких клеток затем инкубировали с тестируемым пептидом в течение приблизительно 10 мин при 37°С. Контрольный образец клеток с ЕРО также подвергнули каждому тесту. Обработанные клетки затем отбирали центрифугированием, ресуспендировали в лизирующем буфере 8Ό8, и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с 8Ό8. Разделенные электрофорезом белки переносили из геля на нитроцеллюлозу; белки, содержащие фосфотирозин, визуализировали на блоте стандартными иммунологическими методами. Например, блот может быть обработан антителом к фосфотирозину (например, анти-фосфотирозиновым 1дС мыши от ир51а1е Вю1есНпо1оду, 1пс), промыт, а затем инкубирован с вторичным антителом [например, меченными пероксидазой антимышиными 1дС козы от Кзгкедаагй & Репу ЬаЬогаФпек, 1пс. (^акЫпдФп, ОС)]. После чего содержащие фосфотирозин белки могут быть визуализированы стандартными методами, включающими колориметрические, хемилюминисцентные или флюоресцентные тесты. Например, хемилюминисцентный тест может быть выполнен с использованием ЕСЬ ХУеЧегп В1оШпд 8у51ет от АтегкНат.
Другой основанный на клетках тест ίη νίίΐΌ, который может быть использован для определения активности пептидов согласно настоящему изобретению, представляет собой исследование количества колоний, использующее костный мозг мыши или периферические клетки крови человека. Мышиный костный мозг может быть получен из бедренных костей мышей, в то время как образец периферической крови человека может быть получен от здорового донора. В случае периферической крови сначала выделяют из крови мононуклеарные клетки, например, с помощью центрифугирования в градиенте фиколла Е1со11-Нурас.|ие [81ет Се11 ТесНпо1од1е§, 1пс. (Уапсоиуег, Сапайа)]. Для этого теста считают число ядерных клеток, чтобы устанавливать число и концентрацию ядерных клеток в исходном образце. Определенное количество ячеек пересевают на метилцеллюлозу в соответствии с инструкциями изготовителя 81ет Се11 ТесНпо1од1е§, 1пс. (Уапсоиуег, Сапайа)]. Экспериментальную группу обрабатывают тестируемым пептидом, группу положительного контроля обрабатывают ЕРО, и группу отрицательного контроля не обрабатывают ничем. Количество растущих колоний для каждой группы затем подсчитывают после определенного периода инкубации, обычно спустя 10 и 18 дней. Активный пептид стимулирует образование колоний.
Другие биологические тесты ίη νίίΐΌ, которые могут быть использованы для выявления активности соединений согласно настоящему изобретению, приведены в СгеепЬегдег, е1 а1. (1983) Ргос. №Й. Асай. 8сЕ И8А 80:2931-2935 (ЕРО-зависимые кроветворные клеточные линии); Оие11е апй \Уо]сНо\\ък| (1991) ί. Вю1. СНет. 266:609-614 (фосфорилирование тирозина в белках клеток В68ИЕЕР); ОщагИег-ЕопП е1 а1. (1992) 1. Вю1. С’Нет. 287:10670-10678 (фосфорилирование тирозина ЕРО-рецептора в ЕРОчувствительных клетках человека); Оие11е е1 а1. (1992) ί. Вю1. СНет. 267:17055-17060 (фосфорилирование тирозина цитозольных белков рр 100 в клетках ЕЭС-ЕР); ^ойНшдоп, е1 а1. (1987) Ехр. НетаЮ1. 15:85-92 (колориметрический тест на гемоглобин); Ка1Но апй Мшпо (1985) Апа1. ВюсНет. 149:117-120 (определение гемоглобина с помощью 2,7-диаминофлуорена); Ра1е1 е1 а1. (1992) ί. Вю1. СНет. 267:21300-21302 (экспрессия с-туЬ); ХУюНиНп е1 а1. (1993) Се11 74:227-236 (ассоциации и фосфорилирование тирозина 1АК2); Ьеопагй е1 а1. (1993) В1оой 82:1071-1079 (экспрессия транскрипционных факторов САТА) и Апйо е1 а1. (1993) Ргос. №111. Асай. 8ск И8А 90:9571-9575 (регуляция перехода в С1 циклинами Ό2 и Ό3).
Было показано, что микрофизиометр, инструмент, разработанный Мо1еси1аг Эеу1се5 Согр., успешно использовали для измерения эффекта агонистов и антагонистов различных рецепторов. Основу для работы этого прибора составляет измерение изменений в показателе подкисления внеклеточной среды в ответ на активацию рецептора.
Функциональный тест ΐη νΐνο
Одним из функциональных тестов ш νίνΌ, которые могут быть использованы для оценки потенциала тестируемого пептида, является полицитемический эксгипоксический тест на мышах. Для этого теста мышей в течение нескольких дней подвергали циклу изменений давления. В этом цикле мышей подвергали изменениям между периодами низкого и нормального давления. Затем в течение 2-3 дней до введения испытываемых образцов мышей содержали при естественном давлении. Образцы тестируемого пептида или стандартного ЕРО в случае положительного контроля подкожно инъецировали мышам, подвергавшимся тесту. Два дня спустя им вводили радиоактивно меченое железо (например, 59Ее) и через два дня после введения меченого железа отбирали образцы крови. Затем стандартными методами для каждого образца крови определяли гематокрит и уровень радиоактивности. Образцы крови от мышей, которым инъецировали активные тестируемые пептиды, показали большую радиоактивность (из-за связывания гемоглобином эритроцитов Ее59), чем образцы от мышей, которые не получали тестируемые пептиды или ЕРО.
Другой функциональный тест ш νίνΌ, который может быть использован для оценки потенциала тес
- 33 014528 тируемого пептида, - это ретикулоцитный тест. Для этого теста обычным не подвергавшимся никаким обработкам мышам подкожно инъецировали ЕРО или тестируемый пептид в течение трех последовательных дней. На третий день мышам также внутрибрюшинно ввели железистый декстран. На пятый день у мышей отобрали образцы крови. Процент (%) ретикулоцитов в крови определяли оранжевой окраской тиазола и поточным цитометрическим анализом (программа учета ретикулоцитов). Кроме того, вручную определяли гематокрит. Скорректированный процент ретикулоцитов определяли, используя следующую формулу:
% КЕТ1Ссоккестео = % КЕТЮовяекуео X (НетаХосгйгко^юиль / НетаюспЫокмАь)
Для активных соединений тест покажет повышение процентного уровня ΚΕΊΊ^ΟΚΚβ^Εο, относительно мышей, которые не получали тестируемых пептидов или ЕРО.
Применение пептидов-агонистов ЕРО-К
Пептидные соединения согласно настоящему изобретению можно применять в исследованиях ίη νίίΓΟ в качестве инструментов для понимания биологической роли ЕРО, включая оценку многих факторов, влияющих на и находящихся под влиянием продукции ЕРО и связывания ЕРО с ЕРΟ-Я (например, механизм ЕРΟ/ЕРΟ-Я сигнальной трансдукции/активации рецептора). Указанные пептиды также полезны в разработке других соединений, которые связываются с ЕРΟ-Я, поскольку соединения согласно настоящему изобретению предоставляют важную информацию об отношениях структуры и активности, которая облегчает подобную разработку.
Кроме того, основываясь на их способности связываться с ЕРΟ-Я, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы как реагенты для детекции ЕРΟ-Я в живых клетках; фиксированных клетках; в биологических жидкостях; в гомогенатах тканей; в очищенных, естественных биологических материалах и т. п. Например, пометив такие пептиды, можно идентифицировать клетки, имеющие ЕРΟ-Я на их поверхностях. Кроме того, основываясь на их способности связывать ΕΓΟ-Я, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы в окрашивании ίη δίΐιι. ЕАС8-анализе (Диогексепсе-асРта1еб се11 когйпд), Вестерн блоттинге, твердофазном ИФА (ЕЫ8А, епхуте-Кпкеб 1шшипокогЬеп1 аккау) и т.п. Кроме того, основываясь на их способности связывать ΕΓΟ-Я, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы при очистке рецептора или в обогащении клеток, экспрессирующих ЕРΟ-Я на своей поверхности (или внутри клетки).
Пептиды согласно настоящему изобретению также могут быть использованы как коммерческие реагенты для различных медицинских исследований и диагностических целей. Такие применения включают, но не ограничиваются: (1) применение в качестве калибровочного стандарта для измерения активности кандидатных агонистов ΕΓΟ-Я в ряду функциональных тестов; (2) применение в качестве блокирующих реагентов при скрининге случайных пептидов, то есть при поиске новых семейств пептидовлигандов ΕΓΟ-Я, пептиды могут быть использованы для блокирования восстановления ЕРО пептидов согласно настоящему изобретению; (3) применение при совместной кристаллизации с ЕРΟ-Я, то есть получение кристаллов пептидов согласно настоящему изобретению, связанных с ЕРΟ-Я, что позволит определять структуры рецептор/пептид методами рентгеновской кристаллографии; (4) применение при измерении способности клеток-предшественников эритроцитов индуцировать синтез глобина и синтез комплекса гема и увеличивать число рецепторов ферритина, при начале дифференцировки; (5) применение для поддержания пролиферации и роста ЕРО-зависимых клеточных линий, таких как Ε^СР-1-тЕРΟЯ и клеточной линии ТЕ-1; (6) применение, относящееся к мечению пептидов согласно настоящему изобретению с радиоактивными хромофорами; и (7) другие исследования и диагностические приложения, при которых желательна активация ΕΓΟ-Я или такая активация должна быть калибрована по известному количеству агонистов ЕРΟ-Я и тому подобное.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы лечения и производства медикаментов. Пептидные соединения согласно настоящему изобретению можно назначать теплокровным животным, включая человека, чтобы имитировать ш νΐνο связывание ЕРО с ЕРΟ-Я. Таким образом, настоящее изобретение охватывает способы терапевтического лечения расстройств, связанных с недостатком ЕРО, которые включают назначение пептидов согласно настоящему изобретению в достаточных для стимуляции ЕРΟ-Я количествах и таким образом облегчать симптомы, связанные с недостатком ЕРО ш νΐνο. Например, пептиды согласно настоящему изобретению найдут применение в лечении почечной недостаточности и/или конечной стадии отказа почки/диализа; анемии, связанной со СПИДом; анемии, связанной с хроническими воспалительными болезнями (например, ревматоидным артритом и хроническим воспалением кишечника) и аутоиммунных заболеваний; и для повышения уровня красных кровяных клеток пациента до хирургической операции. Другие болезненные состояния, расстройства и состояния гематологических нарушений, при которых могут быть показаны к назначению пептиды согласно настоящему изобретению, включают бета-талассемию; кистозный фиброз; беременность и нарушения менструального цикла; раннюю подростковую анемию; повреждение спинного мозга; космический полет; острое малокровие; старение; инсульт, ишемию (как ЦНС, так и сердечную); различные новообразования, сопровождающиеся нарушениями эритропоэза.
- 34 014528
В других вариантах реализации настоящего изобретения пептидные соединения согласно изобретению можно использовать для лечения расстройств, которым не свойственны низкие или недостаточные уровни красных клеток крови, например, предобработка до переливания. В дополнение к этому, назначение соединения согласно настоящему изобретению может привести к уменьшению времени кровотечения и, таким образом, найдет применение для пациентов перед хирургической операцией или для пациентов с показаниями, что ожидается кровотечение. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению найдут применение для активации мегакариоцитов.
Поскольку показано, что ЕРО имеет митогенный и хемотаксический эффект на клетки эндотелия сосудов, а также эффект на холинэргические нейроны ЦНС [см., например, Атадпок!ои е! а1. (1990) Ргос. Να!1. АсаБ. 8с1. И8А 87:5978-5982 и КошкЫ е! а1. (1993) Вгат Век. 609:29-35], соединения согласно настоящему изобретению также найдут применение для лечения некоторых сосудистых расстройств, таких как: стимуляция заживления ран; стимуляция роста колатеральных коронарных кровеносных сосудов (такая, что может понадобиться после инфаркта миокарда); лечение травм; и постсосудистая обработка трансплантантов. Соединения согласно настоящему изобретению также найдут применение при лечении ряда неврологических расстройств, обычно характеризующиеся низкими абсолютными уровнями ацетилхолина или низкими относительными уровнями ацетилхолина по сравнению с другими нейроактивными субстанциями, например, нейротрансмиттерами.
Фармацевтические составы
В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены фармацевтические составы вышеуказанных пептидных соединений - агонистов ЕР0-В. Условия, облегчающие или модулирующие назначение таких составов, включают такие, как те, что указаны выше. Подобные фармацевтические составы могут быть показаны для перорального, парентерального (внутримышечные, внутрибрюшинные, внутривенные или подкожные инъекции), трансдермального (пассивно, либо с использованием ионофореза или электропорации), трансмукозального (назального, вагинального, ректального или сублингвального) способов применения или использование биоразрушаемых имплантатов, для каждого способа назначения могут быть определены подходящие формы дозировки. В общем случае изобретение охватывает фармацевтические составы, которые содержат эффективные количества пептидов агонистов ЕР0-В согласно настоящему изобретению или их производных продуктов, вместе с фармацевтически приемлемыми растворителями, консервантами, растворителями, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие составы включают растворители различного буферного содержимого (например, Тпк-НС1, ацетат, фосфат), рН и ионной силы; добавки, как например, стиральные порошки и солюбилизующие агенты (например, Т\уееп 20, Т\уееп 80, Ро1укогЬа!е 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метасульфит натрия), консерванты (например, тимерзол, бензиловый спирт) и вещества-наполнители (например, лактоза, маннитол); препараты, включенные в частицы полимерных веществ, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т. п. или в липосомы. Также можно использовать гиалуроновую кислоту. Такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, уровень высвобождения ίπ У1уо, и показатели клиренса ш у1уо настоящих белков и производных. См., например, Веттд!оп'к РБагтасеи!1са1 8аепсек, 18!Б ЕБ. (1990, Маск РиЬНкЫпд Со., Еак!оп, РА 18042) стр. 1435-1712, которая включена сюда ссылкой. Составы могут быть получены в жидкой форме или в сухой порошкообразной (например, лиофилизированной) форме.
Пероральное применение
Для перорального применения согласно настоящему изобретению предусмотрены твердофазные формы дозировки, которые описаны в общем виде в Веттд!оп'к РйагтасеиБса1 8аепсек, 18111 ЕБ. 1990 (Маск РиЬНкЫпд Со. Еак!оп 18042) в главе 89 и включены сюда ссылкой. Твердофазные формы дозировки включают таблетки, капсулы, пилюли, саше, драже, порошки или гранулы. Также, при получении фармацевтических композиций, могут быть использованы инкапсулированные липосомы или протеиноиды (такие как микросферы протеиноидов, описанные в И8 Ра!еп! № 4925673). Могут быть использованы инкапсулированные липосомы, а сами липосомы могут быть производными различных полимеров (например, И8 Ра!еп! № 5013556). Описание возможных твердофазных форм дозировки для терапии дано в Магкйа11, К. Ш: МоБегп РйагтасеиБск ЕБ1!еБ Ьу С.8. Вапкег апБ С.Т. ВБоБек Сйар!ег 10, 1979, включенное сюда ссылкой. В общих чертах фармацевтический состав содержит пептиды агонисты ЕР0-В (или их химически модифицированные формы) и инертные компоненты, которые способствуют защите от желудочной среды и освобождению биологически активного материала в кишечнике.
Также для перорального применения предусмотрено использование жидкофазных форм дозировки, включая фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, которые могут содержать другие компоненты, включая инертные растворители; адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты; подсластители, улучшающие вкус и запах агенты.
Для повышения эффективности пептидов при пероральном применении они могут быть химически модифицированы. Обычно, подобная химическая модификация является присоединением по меньшей мере одной субъединицы к исходной молекуле, где вышеуказанная субъединица (а) позволяет избежать протеолиза; и (Ь) повышает поступление из желудка или кишечника в кровоток. Также желательно увеличение общей устойчивости соединения или соединений и увеличение времени циркуляции в теле. Как
- 35 014528 было сказано выше, присоединение ПЭГ - это желательная химическая модификация для фармацевтического использования. Другие субъединицы, которые могут быть использованы, включают пропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинил пирролидон, полипролин, поли-1,3-диоксалан и поли-1,3,6-тиоксокан [см., например, АЬис1ю\\'кк| апб Οηνίκ (1981) 8о1иЬ1е Ро1утег-Епхуте АббисК ш Епхутек ак Эгидк. НосепЬегд апб КоЬейк, ебк. (ЛУПеу-ЕИегкаепсе: Νονν Υо^к, ΝΥ) рр. 367-383; апб №\утагк е1 а1. (1982) Е Арр1. ВюсЬет. 4:185-189].
Местом высвобождения действующего вещества может быть желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалист в данной области может подобрать такую форму препарата, которая не растворится в желудке, но освободит действующее вещество в двенадцатиперстной кишке или в другом требуемом участке кишечника. Желательно, чтобы подобное высвобождение позволяло избежать негативных эффектов желудочной среды или защитить пептид (или его производные) либо высвобождение пептида должно происходить после желудочной среды, например, в кишечнике.
Чтобы гарантировать полную устойчивость в желудке, защитная оболочка должна быть рассчитана на рН по меньшей мере 5,0. Примеры наиболее общеупотребимых инертных компонентов, которые используют для оболочек лекарственных средств - тримеллитат ацетата целлюлозы (се11и1оке асе1а1е 1пте1Ша1е, САТ) фталат гидроксипропилметилцелюлозы (Ьубгохургору1теШу1се11и1оке рЬШаЫе, НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, фталат поливинилацетата (ро1уушу1 асе1а1е рЫЬа1а!е, РУАР), Еибгадй Ε30Ό, Асци-Иепс, фталат ацетата целлюлозы (се11и1оке асе1а1е рЫЬа1а1е, САР) Еибгадй Б, Еибгадй 8, и 8Ье11ас. Эти покрытия могут быть использованы также в смешанных оболочках.
В таблетках также могут быть использованы покрытия или смеси покрытий, которые не предназначены для защиты от среды желудка. Они могут включать сахарные покрытия, или покрытия, которые облегчают проглатывание таблетки. Капсулы могут состоять из жесткой оболочки (такой как желатин) для доставки сухих терапевтических агентов (н.р. порошка), для жидких форм может быть использована мягкая желатиновая оболочка. Материал оболочки саше может представлять собой толстый крахмал или другую съедобную бумагу. Для пилюль, таблеток или формованных таблеток можно использовать технологию влажной массы.
Пептид (или его производные) могут быть включены в виде множества частиц в форме гранул или шариков с размером частиц около 1 мм. Форма материала для назначения в капсулах может также быть порошкооборазной, немного сжатой, или даже в виде таблеток. Эти препараты могут быть получены сжатием.
В состав согласно настоящему изобретению также включены красители и/или отдушки. Например, пептид (или его производные) может быть связан с носителем (таким, как липосомы или инкапсулированные микросферы) и содержаться внутри съедобного продукта, такого как, например, охлажденный напиток, содержащий красители и отдушки.
Можно разбавить или увеличивать объем пептида (или его производных) инертным материалом. Подобные растворители могут включать углеводы, в особенности минннитол, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Определенные неорганические соли могут быть также использованы в качестве наполнителей, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторыми коммерчески доступными растворителями являются Рак1-Р1о, Етбех, 8ТА-Кх 1500, Етсотргекк и Ау1се11.
В состав терапевтического препарата твердой формы дозировки могут быть включены дезинтегрирующие агенты. Материалы, используемые в качестве таких агентов, включают, но не ограничиваются, крахмал, в том числе коммерческие дезинтегрирующие агенты, основанные на крахмале, Ехр1о1аЬ. Крахмалистый гликолат натрия, амберлит, ультраамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновая кожура, кислотные производные карбоксиметилцеллюлозы, их натриевые соли, природная губка и бентонит могут быть использованы. Дезинтегрирующими агентами могут быть также нерастворимые катионные ионообменные смолы. В качестве дезинтегрирующих агентов и связывателей могут быть использованы порошкообразные камеди, такие как агар, Карайя или трагакант. Альгиновая кислота и ее натриевые соли также применимы в качестве дезинтегрирующих агентов.
Для того чтобы удержать пептид (или его производные) вместе и сформировать прочную таблетку, могут быть использованы связывающие вещества, включающие в себя материалы из естественного происхождения, такие как акация, трагакантовая камедь, крахмал и желатин. Другие подобные компоненты включают метилцеллюлозу (те111у1 се11и1оке, МС), этилцеллюлозу (сЛу1 се11и1оке, ЕС) и карбоксиметилеллюлозу (сагЬохутеЛу1 се11и1оке, СМС). Поливинил пирролидон (ро1уушу1 руггоЬбоие, РУР) и гидроксиметилцеллюлоза (Ьубгохургору1теЛу1 се11и1оке, НРМС) также могут быть использованы в спиртовых растворах для гранулирования пептида (или его производных). Снижающие трение агенты могут быть включены в состав препарата пептида (или его производных) для предотвращения слипания в течение процесса производства. Смазочные материалы могут быть использованы в виде слоя между пептидом (или его производными) и стенкой ролика, они включают в себя, но не ограничиваются: стеариновую кислоту, включая ее магниевые и кальциевые соли, политетрафтороэтилен (ρо1уΐеΐ^аГ1ио^оеΐЬу1еие,
- 36 014528
РТРЕ), жидкий парафин, растительное масло и воск. Также могут быть использованы растворимые смазочные материалы, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различного молекулярного веса, СагЬотеах 4000 и 6000.
Могут быть добавлены глиданты, которые способны улучшить свойства текучести лекарства в течение производства и помогают перегруппировке во время прессования. Глиданты могут включать крахмал, тальк, пирогенный кремнезем и гидратированные алюмосиликаты.
Чтобы помогать растворению пептида (или его производных), в водную среду в качестве смачивающих агентов могут быть добавлены поверхностно-активные вещества. Повехностно-активные вещества могут включить анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия. Катионные детергенты также могут быть использованы и включают бензалкониум хлорид или бензэтомиум хлорид. Список потенциальных неионных детергентов, которые могут быть включены в состав препарата как поверхностно-активные вещества, содержит лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен, гидрированное касторовое масло 10, 50 и 60, глицерол моностерат, полисорбат 20, 40, 60, 65 и 80, сложные эфиры сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Эти поверхностно-активные вещества могут присутствовать в препаратах пептидов согласно настоящему изобретению или их производных либо в чистом виде, либо в смеси в различных соотношениях.
Добавки, которые потенциально повышают поглощение пептида (или его производных), например жирные кислоты: олеиновая кислота, линолевая и линоленовая кислоты.
В настоящем изобретении могут быть желательными препараты с контролируемым высвобождением активного вещества. Пептид (или его производные) может быть включен в инертную матрицу, которая позволяет пептиду освобождаться по механизму диффузии или выщелачивания, например жевательную резинку. Также можно использовать медленно дегенерирующие матрицы. Некоторые фармацевтические покрытия также оказывают задерживающий эффект на высвобождение активного вещества. Другой формой контролируемого высвобождения является способ, основанный на терапевтической системе Огок (А1ха Согр.), при котором лекарство изолировано полупроницаемой мембраной, которая позволяет воде проникать внутрь и выталкивать лекарство через единственное небольшое отверстие благодаря осмотическим эффектам.
Для препаратов могут быть использованы и другие покрытия. Они включают ряд сахаров, которые могут быть применены в нанесении покрытий. Пептид (или его производные) также может находиться в форме покрытых оболочкой таблеток, и материалы, использованные в данном случае, подразделяют на 2 группы. В первой группе присутствуют неусвояемые материалы, которые включают метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозы натрия, провидон и полиэтиленгликоли. Вторая группа состоит из материалов для внутреннего применения, которые обычно представляют собой эфиры фталевой кислоты.
Для обеспечения оптимального покрытия могут быть использованы смеси материалов. Покрывающая пленка может быть нанесена с помощью специальной формы, или в кипящем слое, или с помощью компрессионного покрытия.
Парентеральное применение
Препараты для парентерального приема согласно настоящему изобретению включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и пригодные для введения органические сложные эфиры, как например, этилолеат. Подобные препараты могут также содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, эмульгирующие и диспергирующие агенты. Они могут быть стерилизованы, например, фильтрацией через задерживающий бактерий фильтр, введением в состав препарата стерилизующих агентов, облучением состава или его нагреванием. Их также можно получать с применением стерильной воды или любых других стерильных растворителей, пригодных для инъекций, непосредственно перед использованием.
Ректальное либо вагинальное применение
Составы для ректального или вагинального применения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут содержать дополнительно к активному веществу наполнители, как, например, масло какао или суппозиториальный воск. Составы для интраназального или сублингвального применения также получают с использованием стандартных наполнителей, хорошо известных в данной области.
- 37 014528
Легочное применение
Также в настоящем изобретении предусмотрено легочное применение пептидов агонистов ЕР0-И (или их производных). Пептид (или его производное) попадают в легкие млекопитающего со вдохом и проходят сквозь легочный эпителий в кровоток [см., например, Аб)е1 е! а1. (1990) Рйагтасеибса1 Кекеагск 7:565-569; Аб)е1 е! а1. (1990) 1и!. 1. Рйагтасеибсз 63:135-144 (1еиргоббе асе!а!е); Вгацие! е! а1. (1989) 1. Сагбюуазси1аг Ркагтасо1оду 13(зир5):143-146 (еибо!кеби-1); НиЬЬагб е! а1. (1989) Аииа18 оТ 1и!егиа1 Мебюше, Уо1. III, рр. 206-212 (абаиббурзт); 8ткк е! а1. (1989) 1. Сби. 1иуе§!. 84:1145-1146 (а-1-рго!е1иа8е); 0зтееш е! а1. (1990) Аегозоб/абои оТ Рго!етз, Ргосеебтдз оТ 8утрозшт ои Кезр1га!огу Эгид Оебуегу II Кеуз!оие, Со1огабо (гесотЬтаи! китаи дго\\б1 когтоне); ЭеЬз е! а1. (1988) 1. Iттииο1. 140:3482-3488 (т!егТегои-у аиб !итог иесгозб Тас!ог а); и И8 Ра!. №. 5284656 !о Р1а1/, е! а1. (дгаии1осу!е со1оиу 8бти1абид Тас!ог). Способы и составы для легочного применения лекарств с системным эффектом описаны в патенте И.8. Ра!. № 5451569 !о \Уоид е! а1.
Для использования в рамках настоящего изобретения пригодно большое число механических устройств, разработанных для доставки в легкие терапевтических продуктов, которое включает в себя, но не ограничивается, небулайзеры, ингаляторы мерной дозы и порошковые ингаляторы, любые из которых могут применяться в данной области. Некоторыми отдельными примерами коммерчески доступных устройств, пригодных для применения в настоящем изобретении, являются небулайзер Шбауеи! (МаШискгоб! Шс., δ!. Ьошз, МО); небулайзер Асот (Мащиез! Мебка1 Ргобис!з, Еид1етеооб, С0); ингалятор мерной дозы Уеи!о1ш (С1ахо Шс., Кезеагсй Тпаид1е Рагк, N0) и порошковый ингалятор 8рк1ка1ег (Рбоиз Согр., ВебТогб, МА).
Все указанные устройства требуют применения составов, пригодных для распыления пептида (или его производных). Обычно каждый состав специфичен для типа примененного устройства и может включить использование подходящего пропеллента в дополнение к обычным растворителям, адъювантам и/или носителям, применимым при терапии. Также в состав настоящего патента включено использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включения или носителей других типов. Химически модифицированные пептиды также могут быть подготовлены в других составах в зависимости от типа химической модификации или типа применяемого устройства.
Составы, пригодные для применения с помощью небулайзера, впрыскивающего или ультразвукового, обычно содержат пептид (или его производные), растворенные в воде в концентрации от 0,1 до 25 мг биологически активного белка на 1 мл раствора. Состав также может содержать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и регулирования осмотического давления). Состав для небулайзера также может содержать поверхностно-активное вещество для уменьшения или предотвращения поверхностной агрегации пептида (или его производных), вызванного распылением раствора при образовании аэрозоля.
Составы для применения с ингаляторами мерной дозы обычно содержат сильно измельченный порошок, включающий ресуспендированный в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества пептид (или его производные). Пропеллент может быть любым стандартным веществом, применимым с этой целью, как например, хлорофтороуглерод, гидрохлорофтороуглерод, гидрофтороуглерод или углеводороды, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтан, и 1,1,1,2тетрафторэтан, или их комбинацией. Пригодные поверхностно-активные вещества включают триолеат сорбитана и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества также может быть использована олеиновая кислота.
Составы для распыления из устройств типа порошкового ингалятора включают сильно измельченный сухой порошок, содержащий пептид (или его производные), и может также включать наполнители, такие как лактоза, сорбитол, сахароза или маннитол в количествах, которые облегчают распыление устройством порошка, например от 50 до 90 мас.% всего состава. Пептид (или его производные) наиболее выгодно было бы производить в форме частиц со средним размером менее чем 10 мкм (или микрон), наиболее желательно от 0,5 до 5 мкм, для наиболее эффективной доставки в дистальные отделы легкого.
Интраназальное применение
Интраназальное применение пептидов агонистов ЕР0-И (или их производных) также предусмотрено настоящим изобретением. Интраназальное применение допускает попадание пептида в кровоток непосредственно после применения терапевтического продукта, без необходимости накопления продукта в легком. Составы для интраназального применения могут включать в себя декстран или циклодекстран.
Также для использования вместе с пептидами согласно настоящему изобретению предусмотрены другие усилители проницаемости, используемые для облегчения интраназального введения (такие, как описаны в Iи!е^ηа!^οиа1 Ра!еи! РиЬбсабои № \¥0 2004056314, подана 17 декабря 2003 г., включена выше ссылкой во всей своей полноте).
Дозировка
Для всех пептидных соединений, при проведении дальнейших исследований, появится информация относительно подходящих уровней дозировки для лечения различных состояний у различных пациентов, и обычный квалифицированный медицинский работник сможет установить соответствующие дозировки, рассмотрев терапевтический контекст, возраст и общее состояние пациента. Выбранная дозировка зави
- 38 014528 сит от желаемого терапевтического эффекта, способа назначения и желаемой длительности лечения. Обычно ежедневно назначаются уровни дозировки от 0,001 до 10 мг/кг веса тела млекопитающего. В случае внутривенной инъекции или инфузии дозировка обычно может быть более низкой.
В определенных вариантах реализации настоящего изобретения любой из пептидов согласно настоящему изобретению может быть использован при лечении пациентов с почечной недостаточностью до гемодиализа или в течение гемодиализа. Терапевтический диапазон дозы в данной реализации настоящего изобретения может быть от 0,025 до 0,2 миллиграммов (мг) соединения на 1 килограмм (кг) веса тела пациента (0,025-0,2 мг/кг). В частности, может быть предпочтительным диапазон дозировок от 0,05 до 0,1 мг/кг. Кроме того, врач изначально может использовать увеличение дозировок, начиная от 0,025 мг/кг и затем поэтапно увеличивая ее по 0,025 мг/кг, основываясь на индивидуальном гемоглобиновом ответе пациента. Таким образом, врач может поэтапно увеличивать дозировку для каждого пациента, пока не будет достигнут требуемый гемоглобиновый ответ. В случае пациентов, получающих гемодиализ или ожидающих его, требуемый гемоглобиновый ответ заключается в достижении приблизительно нормальных уровней гемоглобина (14-15 д/бЬ) или другого уровня гемоглобина, определенного врачом. В данном варианте реализации настоящего изобретения ожидается, что фармакологически эффективная доза (ФЭД) для каждого отдельного пациента, получающего или ожидающего гемодиализ, составляет от 0,067 до 0,075 мг/кг. Ожидается, что преимуществом такой реализации будет более низкая частота приема препарата, однократно через каждые три-четыре недели для каждого конкретного пациента, вместо еженедельного приема, как в случае других современных стимулирующих кроветворение агентов (СКА). Для назначения могут быть использованы различные пути введения в организм (пероральный, внутривенный, и тому подобное, как было описано выше). Предпочтительным путем введения для получающих гемодиализ пациентов является внутривенный. Предпочтительным путем введения для ожидающих гемодиализ пациентов является подкожный. В других некоторых вариантах реализации настоящего изобретения любое из вышеописанных соединений может быть использовано для лечения анемии, связанной со злокачественными опухолями (у онкологических больных). Ожидается, что терапевтический диапазон дозировок в таком варианте реализации настоящего изобретения будет от трех до пяти раз выше диапазона для ожидающих или получающих гемодиализ пациентов (то есть от 0,075 до 0,5 мг/кг). В частности, может быть предпочтительным диапазон дозировок от 0,2 до 0,4 мг/кг. Таким образом, как было описано выше, врач, лечащий пациентов с онкологическими заболеваниями может подобрать дозировку, начиная от 0,075 мг/кг, поэтапно увеличивая ее по 0,075 мг/кг, пока не будет достигнут требуемый гемоглобиновый ответ. Ожидается, что ФЭД для каждого отдельного онкологического пациента составляет приблизительно 0,25 мг/кг. Кроме того, ожидается, что менее частый прием, чем однократно через каждые три-четыре недели, может иметь преимущества для каждого конкретного пациента. Более того, другим преимуществом для онкологических пациентов является то, что прием можно назначать до химиотерапии (например, заблаговременно за 3-5 дней) или совмещать с химиотерапией, для предотвращения снижения уровня гемоглобина в течение фазы задержки между стимуляцией ретикулоцитов и повышением уровня гемоглобина. Для назначения могут быть использованы различные пути введения в организм (пероральный, внутривенный, и тому подобное, как было описано выше). Предпочтительным путем введения для онкологических пациентов является подкожный. Предпочтительные соединения для использования в лечении ожидающих или получающих гемодиализ, либо онкологиче ских включают соединения, указанные ниже.
Карбаматная связь, саркозин отсутствует, диапазон молекулярной массы ПЭГ (здесь показана последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1)
Карбаматная связь, саркозин отсутствует, предпочтительная молекулярная масса ПЭГ (здесь показана последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1)
- 39 014528
- 40 014528
Ο^Ο-ΡΕΟ40Κ . ^ΝΗ
I------------------------1 0 (АсО)ОЬУАСНМОР1Т( 1 -\а1) УСУРШ-ΝΠ ^^У-ΝΙ12
VΗΝ^ο-ΡΕ<340Κ ο (А<;УХЯЛ’АСНМОР]Т(ЬЧа1)УСОР1.К-НЧ (АсОХЗЬУА^НМОРЩ 1-ΝαΙ) ν^ΟΡΕΚ-ΝΗ χζΑ-ΝΗ2
Ο 'ΝΗ^,ύν ΗΝγΟ-ΡΕΘ50Κ Ο
Ο^^Ο-ΡΕΘ60Κ . .,ΝΗ ™γ°θ
4ν, °ϋ
ΝΗ / (ΑοΟΙΰΕΥΑΟΙΙΝΙΟΙ'ΓΚΙ-ΝΗΐ'ΑΈ^ΙΈΓΙ-ΗΝ ]Γ-ΝΗ2 1----------------------1 Ο
Карбаматная связь, саркозин присутствует, диапазон молекулярной массы ПЭГ (здесь показана последовательность 8Ε0 ΙΩ Ν0: 2)
Карбаматная связь, саркозин присутствует, предпочтительная молекулярная масса ПЭГ (здесь показана последовательность 8ΕΟ ΙΌ Ν0:2)
- 41 014528
- 42 014528
I------------------------1 О (АсО)ОЬ УАСНМ6Р1Т( 1 -Ма1) УСОРЬК(МеО)-КН \
ΝΗ О
Υ О О
А ογ ΝΗ Д ΝΗ (АсбКбЬУАСНМОРЩ 1 -Να1)νθ<3ΡΕΚ(Μεϋ)-ΗΝ ]]-ΝΗ2 1----------------------1 О
О^уО-РЕОгэк.
НМ у о-рЕСзок
О (АсОХ>ЬУА(!нМОР1Т(1-№1)У<!:рРи<(МеО)-МН^1_цн2 \ ΝΗ О
Υ О О
ΝΗ / (АсО)ОЬУАСНМОР1Т(1-Ма1)УСрРЬК(МеО)-НН ]γ-ΝΗ2 1----------------------1 О
Оу^О-РЕО40К .ΝΗ НМуО- РЕС4ок О ι------------------1 0 (АсО)ОЬ УАСНМбРЩ 1 -ΝϊΙ) УСрРЬЖМеСНЫН ^1_ΝΗ1
О
ΝΐΑγ НМуО~РЕС5ак О о^у-о-РЕе60К _ .ΝΗ №°О “V
ΝΗ /
|Ас0)0Ь¥АСНМ6Р1Т(1-Ка1)УС0РЕВ.(МсС'»-НМ |~ΝΗ2
I-------------------------1 0
Амидная связь, саркозин отсутствует, диапазон молекулярной массы ПЭГ (здесь показана последовательность δερ ΙΌ ИО:1)
Амидная связь, саркозин отсутствует, предпочтительная молекулярная масса ПЭГ (здесь показана последовательность δερ ΙΌ ИО: 1)
- 43 014528 (Αε6)ΟΕΥΑ6ΉΜΟΡΠΪ1-Ν3ΐ)ν€9ΡΕΚ-ΝΗ4^_ΝΗ2
- 44 014528
Амидная связь, саркозин присутствует, предпочтительная молекулярная масса ПЭГ (здесь показана последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО:2)
- 45 014528
- 46 014528
'зок '40К
чок
Пептиды из состава согласно настоящему изобретению (или их производные) могут быть назначены в комбинации с одним или несколькими активными веществами или фармацевтическими составами.
Примеры
Настоящее изобретение далее описано посредством нижеследующих примеров. Следует понимать, что эти и другие примеры приведены только в качестве иллюстрации, но никоим образом не ограничивают область и содержание изобретения или любой поясняющей формы. Подобно этому, изобретение не ограничивается какими-либо конкретными предпочтительными реализациями, описанными выше. На самом деле, множество модификаций и изменений настоящего изобретения, которые могут быть осуществлены в его рамках, очевидно при чтении данной заявки для специалистов в данной области. Следовательно, настоящее изобретение ограничивается своей патентной формулой, включая в себя весь спектр эквивалентов, на которые распространяется описание изобретения в его формуле.
Пример 1. Получение агонистов ЕРО-К, пептидных димеров, твердофазным синтезом.
Стадия 1. Синтез карбоксибензил-ТАР
Раствор, содержащий коммерчески доступный диамин (ТАР от А1бпс11 СНет1са1 Со.) (10 г, 67,47 ммоль) в безводном дихлорметане (БСМ) (100 мл), охладили до 0°С. Раствор бензилоксикарбонил хлорида (4,82 мл, 33,7 ммоль) в безводном БСМ (50 мл), медленно добавляли через капельную воронку в течение 6-7 ч, поддерживая температуру реакционной смеси 0°С, затем позволяли смеси нагреться до комнатной температуры (~25°С). Спустя еще 16 ч БСМ удаляли под вакуумом, остаток разделяли при помощи 3Н НС1 и эфира. Водная фракция была собрана и нейтрализована 50% водным раствором №ЮН
- 47 014528 до рН 8-9, а затем была экстрагирована этилацетатом. Этилацетатную фракцию высушили над безводным Ыа28О4, а затем упаривали под вакуумом для получения сырого монокарбоксибензил-ТАР (5 г, выход около 50%). Это вещество без дальнейшей очистки использовали для следующей реакции.
Стадия 2. Синтез карбоксибензил-ТАР-Вос
В интенсивно перемешиваемую суспензию карбоксибензил-ТАР (5 г, 17,7 ммоль) в гексане (25 мл) добавили бутилоксикарбонил Вос2О (3,86 г, 17,7 ммоль) и продолжая перемешивать оставили при комнатной температуре на ночь. Реакционную смесь разбавили ЭСМ (25 мл) и промыли 10% водным раствором лимонной кислотой (двукратно), водой (двукратно) и солевым раствором. Органическую фракцию высушили над безводным Ыа28О4, а затем упаривали под вакуумом. Сырой продукт (выход 5 г) непосредственно использовали в следующей реакции.
Стадия 3. Синтез Вос-ТАР
Сырой продукт из предшествующей реакции растворили в метаноле (25 мл) и прогидрировали в течение 16 ч в присутствии 5% Рй на углероде (5% по весу) под давлением газа в баллоне. Смесь отфильтровали, промыли метанолом и упаривали фильтрат под вакуумом для получения сырого продукта НТАР-Вос (выход 3,7 г). Общий приблизительный выход Вос-ТАР после стадий 1-3 составил 44%, (выход вычислили на основании количества использованного бензилоксикарбонил хлорида).
ΝΗ€6ζ •θ^'χ^ΝΗΒοε
ΡίΙ-С, Н2,МеОН
---------> θ-'·’\^·ΝΗΒθ€
Стадия 4. Синтез Теп1аСе1-линкера
Тсп1аСс1 бромид (2,5 г, 0,48 ммоль/г, от Карр Ро1утеге, Сегшаиу), фенольный линкер (5 эквивалентов) и К2СО3 (5 эквивалентов) нагревали в 20 мл Ν,Ν-диметилформамида ΌΜΓ при 70°С в течение 14 ч. После охлаждения до комнатной температуры смолу промыли (0,1 Н НС1, вода, ацетонитрил (АСЦ), ΌΜΡ, метанол) и высушили до появления смолы янтарного цвета.
К2СОЗ, ϋΜΡ
Стадия 5. Синтез Теп1аСе1-линкер-ТАР(Вос)
Смесь из 2,5 мг смолы, полученной в реакции стадии 4, Н-ТАР-Вос (1,5 мг, 5 экв.) и ледяного этанола (34 мкл, 5 экв.), растворили в смеси метанол-тетрагидрофуран (ТНР) 1:1 и оставили взбалтываться на ночь. Затем к ней добавили 1М раствор цианоборгидрида натрия в ТНР (5 эквивалентов) и взбалтывали еще 7 ч. Смолу отфильтровали, промыли (ΌΜΡ, ТНР, 0,1 Н НС1, вода, метанол) и высушили. Небольшое количество смолы бензоилировали бензоилхлоридом (В/-С1) и Ν,Ν-диизопропилэтиламином (ΌΙΕΆ) в ΌΟΜ и расщепили 70% трифторуксусной кислотой (ТРА) в ΌΟΜ. затем проверили методами жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЬСМ8) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Стадия 6. Синтез Теп1аСе1-линкер-ТАР-Ьу8
Смолу, полученную в реакции стадии 5, обработали активирующим раствором Ртос-ЬуЦРшос)ОХ (получили из 5 экв. аминокислоты и 5 экв. НАТИ, растворенного в 0,5 М ΌΜΡ, после добавления 10 эквивалентов ΌΙΕΑ) и оставили осторожно качаться на 14 ч. Смолу промыли (ΌΜΡ, ТНР, ЭСМ, метанол) и высушили, чтобы получить защищенную смолу. Оставшиеся аминогруппы защитили обработкой смолы раствором 10% уксусного ангидрида, 20% пиридина в ^СΜ в течение 20 мин, сопровождавшейся промывкой, как было указано выше. Группы Ршос удалили, осторожно качая смолу в 30% пипередине в ΌΜΕ в течение 20 мин, с последующей промывкой (ΌΜΕ, ТНР, ^СΜ, метанол) и просушкой.
- 48 014528
Стадия 7. Синтез Теп!аСе1-линкер-ТАР-Ьук(пептида)2
Смолу, полученную в реакции стадии 6, подвергли регулярным циклам присоединения Етосаминокислот с активизацией бензотриазол-1-ил-И-тетраметилурониум гексафторфосфатом (НВТИ/Н0В!) и удалением Етос пиперидином для одновременного синтеза обеих цепей пептида. Синтез был выполнен на автоматическом синтезаторе пептидов АВI 433, доступном от АррИеБ В1окук!етк, Шс. После конечного удаления Етос концевые аминогруппы ацетилировали уксусным ангидридом (10 эквивалентов) и Б!ЕА (20 эквивалентов) в БМЕ в течение 20 мин, после чего продукт промыли, как было указано выше.
Стадия 8. Отщепление смолы
Смолу, полученную в реакции стадии 7, ресуспендировали в растворе ТЕА (82,5%), фенола (5%), этанэдитиола (2,5%), воды (5%) и тиоанизола (5%) в течение 3 ч при комнатной температуре. Также могут быть использованы альтернативные отщепляющие смеси, такие как ТЕА (95%), вода (2,5%) и триизопропилсилан (2,5%). Раствор ТЕА охладили до 5°С и перелили в Е!20, чтобы осадить пептид. Фильтрация и сушка при пониженном давлении давали желаемый пептид. Очистка с помощью препаративного ВЭЖХ на колонне С18 позволила получить чистый пептид.
РерЕйе-Ас
Η θ
Ν—Ч—Рер1йе-Ас
Ас-Рер(Юе—ΝΗ
ТРА
Ас-Ре р1йе—ΝΗ
ЫН,
1_р о
Стадия 9. Окисление пептидов для образования внутримолекулярных дисульфидных связей
Пептидный димер растворили в 20% БМ80/воде (1 мг сухого веса пептида/мл) и оставили стоять при комнатной температуре на 36 ч, пептид очистили проведением реакционной смеси через колонну для ВЭЖХ С18 (^а!егк Бе1!а-Рак С18, размер частицы 15 мкм, размер пор 300 А, длина 40 мм х 200 мм), которую свыше 40 мин элюировали смесью АСХ/вода/0.01% ТЕА с использованием линейного градиента АСN от 5 до 95%. Лиофилизация фракции, содержащей желаемый пептид, позволяет получить продукт в виде рыхлого белого твердого вещества.
Стадия 10. Присоединение ПЭГ к концевой-ЫН2 группе
Присоединение ПЭГ посредством карбаматной связи:
Пептидный димер смешивали с полутора эквивалентами (мольное отношение) активированного ПЭГ (тРЕС-№С от Ν0Ε Согр. 1арап) в сухом БМЕ, чтобы получить чистый раствор. Спустя 5 мин к вышеназванному раствору добавили 4 экв. БЕА. Смесь встряхивали при окружающей температуре 14 ч, после чего очистили с помощью обратнофазовой ВЭЖХ на С18. Структура пептида с присоединенным ПЭГ была подтверждена масс-спектрометрическим методом ионизации лазерной десорбцией при содействии матрицы (МАЬБЦ
Очищенный пептид также подвергли очистке с помощью катионообменной хроматографии, как это
- 49 014528 указано ниже. Процесс присоединения тРЕС-ИРС показан ниже, с использованием последовательности 81Т) ΙΌ ΝΟ: 3.
(АсС)6ЕУЛСНМСР1Т(Ьпа!)УСОРЬВ.(МеО)---νη
ΝΗ2 (АсС)ОЬУАСНМОР1Т( 1-па1) УСОРЬЩМеф-НИ ΝΗΛ^Ο'
I тРЕС-МРС | ГЯЕА.ОМЕ (АсО)6Е Υ АСНМСР1 Т( 1 -11а1) УСОРЬК(МеО)---ΝΗ
Присоединение ПЭГ посредством амидной связи:
Пептидный димер смешивали с полутора эквивалентами (мольное отношение) активированного ПЭГ (РЕС-ЗРА-ΝΗδ от 8йеагоа!ег Согр, И8А) в сухом ЭМЕ, чтобы получить чистый раствор. Спустя 5 мин к вышеназванному раствору добавили 10 эквивалентов Э1ЕА. Смесь встряхивали при окружающей температуре 2 ч, после чего очистили с помощью обратнофазовой ВЭЖХ на С18. Структура пептида с присоединенным к нему ПЭГ была подтверждена МАЬОЕ Очищенный пептид также подвергли очистке с помощью катионообменной хроматографии, как это указано ниже. Процесс присоединения РЕС-8РАΝΗδ показан ниже, с использованием последовательности 8ЕО Ш ΝΟ:3.
(АсС1)6Ь¥АСНМСР1Т(1-па!')УСрРЬК(МеС!---νη .9 (АсС)С1Л'ЛСНМ<ЗР1Т( 1 -па!) УСЦРЬК(Ме<ЗГ-НХ’ N1
I ΡΕΟ-8ΡΑ-ΝΗ8 | ИЕА, ЭМР (Ас6)СЬУАСНМОР1Т(1-па1)УСрРЬК(МеО)-мн
ΝΗ2
О
О ,9 (АсО)6ЬУАСНМ<ЗР1Т(1-па1)УС9РШ(МеО)-НК ΝΗ·
Стадия 11. Ионообменная очистка пептида
Несколько ионообменных носителей были проверены на их способность разделять вышеуказанный конъюгат пептид-ПЭГ от не прореагировавшего (или гидролизованного) ПЭГ, в дополнение к их способности сохранять исходные димерные пептиды. Ионообменную смолу (2-3 г) после перевода в форму натриевой соли (0,2 Н ΝαΟΗ заливали в колонну до тех пор, пока элюент не приобрел рН 14, приблизительно 5 объемов колонны) загрузили в колонну диаметром 1 см, и затем перевели в водородную форму (элюировали 0,1 Н НС1 или 0,1 М уксусной кислотой до рН элюента, соответствующего загрузке, приблизительно 5 объемов колонны), после чего промыли 25% АСЛ/водой до рН 6. И пептид до соединения и конъюгат пептид-ПЭГ растворили в 25% АСХ/воде (10 мг/мл), рН скорректировали с помощью ТЕА до <3, затем смесь загрузили в колонну. После промыли колонну 2-3 объемами 25% АСN/воды, собрали 5 мл фракции, затем пептид вымыли из колонны элюацией с 0,1 М раствором МН^Ас в 25% АСН/воде. снова собрали 5 мл фракции. Анализ методом ВЭЖХ выявил, в какой фракции содержался желаемый пептид. Анализ с помощью Еуарога1|уе Ыдй!-8сайег1пд Эе1ес1ог (ЕЬ8Э) показал, что когда пептид оставался в колонне и элюировался раствором КН^Лс (обычно между фракциями 4 и 10), в качестве загрязняющего вещества не наблюдалось никакого несвязанного ПЭГ. Когда пептид элюировали начальным промывочным буфером (обычно первые 2 фракции), никакого разделения желаемого ПЭГ-конъюгата и избытка ПЭГ не наблюдалось.
Следующие колонны успешно удерживали как пептид, так и конъюгат пептид-ПЭГ, и успешно очищали конъюгат пептид-ПЭГ от несвязанного с ПЭГ пептида.
- 50 014528
Таблица 1. Ионообменные смолы
Носитель Производитель
Мопо 8 НК. 5/5, прочные катионообменные предзагруженные колонны АтегзЬат Вю8С1епее8
8Е53 целлюлоза, микрогранулярный прочный катионообменный носитель У/Ьа1тап
8Р Рав! Г1оул сефароза прочный катионообменный носитель Атегзйат Вюзшепсез
Пример 2. Синтез пептидных димеров-агонистов ЕРΟ-Я способом конденсации фрагментов Стадия 1. Синтез (СЬ/)2-Ьук
Лизин при стандартных условиях прореагировал с раствором бензилхлороформата, в результате получили лизин с двумя аминогруппами, защищенными группой СЬх.
Стадия 2. Синтез Вос-ТАР
Вос-ТАР синтезировали так, как это было описано в стадиях с 1 по 3 примера 1.
Стадия 3. Соединение (СЬ/)2-Ьук и Вос-ТАР (СЬ/)2-Ьук и Вос-ТАР соединили при стандартных соответствующих данной реакции условиях, получили продукт (СЬ/)2-Ьук-ТАР-Вос.
Стадия 4. Ьук-ТАР-Вос
Сырой продукт из предшествующей реакции растворили в метаноле (25 мл) и прогидрировали в течение 16 ч в присутствии 5% Рб на углероде (5% по весу) под давлением газа в баллоне. Смесь отфильтровали, промыли метанолом и упаривали фильтрат под вакуумом для получения сырого продукта ЬукТАР-Вос.
Стадия 5. Синтез пептидных мономеров конденсацией фрагментов
Четыре пептида-фрагмента последовательности пептидного мономера синтезировали с помощью стандартных способов. Эти частично защищенные фрагменты затем подвергли соединению в двух независимых реакциях. В первой реакции сформировали Ν-концевую половину мономера связыванием двух фрагментов пептида, в то время как С-концевую половину мономера сформировали связыванием двух других фрагментов пептида. Во второй реакции соединения Ν-концевую и С-концевую половины соединили с получением полностью защищенного мономера. С мономера затем стандартными методами сняли защитную группу ΟΒπ.
- 51 014528 (ЛсС)-О-Е-У-А-ОН
ΟίΒιι (УЕО ГО ΝΟ: 5)
8(Аст)
Гтос-С-Н-М-О-ОН I ТП (8Е0 ГО ΝΟ: 6) ^соир!е
8(Аст)
Ртос-Р-1-Д1-па1>-У-С-^-Р-ОН
ΟίΒιι ТП (8Е<5 ГО N0: 7) ^соир1е
8(Аст) (АсОЕО-Ь-у-А-С-Н-М-О-ОН
ΟίΒιι Τη (8Εζ) ГОМО:9) ^соир!е
5(Аст)
Ртос-Р-1-^-(1-па1)-У-С-^-Р-Е-^(МеО)-ОВп
ΟίΒιι ТП РЬГ (8Е<3 Ю ΝΟ: 10)
8(Аст)
8(Аст) (АсС>6-ЬУ-А-С-Н-М-С-Р4-ТЧ1-па1)-У-(ко-Р-Ь-К-(Ме<3)-ОВп
II I ||
СЧВи ТП 0(Ви Тг1 рьг (8Ε(}ΙΟΝΟ: 11) ^<1ерго(ес1 ОВп
5(Аст) 8(Аст) (АсС)-О-Е-У-А-С-Н-М-О-Р4-Т-(1-па1)-У-(^-Р-Е-КЧМе6)-ОН ( I I ||
О1Ви ТП о®и Т11 рьг (8Е<? ГОМО: 12)
Стадия 6. Окисление пептидных мономеров для образования внутримолекулярных дисульфидных связей
Конденсированные мономеры со снятой ОВп-защитой (8ЕЦ ΙΌ NО:12) затем окислили при помощи иода для получения внутримолекулярных дисульфидных связей между остатками цистеина мономеров, защищенными Аст-группой.
8(Асш) 8(Аст) (АсО)-С-Ь-¥-А-С-Н-М-О-Р-1-Т-(1-па1)-У-(!-9-Р-Т-К-(МеО)-ОН 11 1 II
О1Ви ТП 0Ши Тг1 рьг (8ЕЦ ГО N0: 12)
Ь охйабоп
I (δΕφΙΏΝΟ: 13)
Стадия 7. Присоединение Ьук-ТАР-Вос к окисленным мономерам со снятой ОВп-защитой для образования пептидного димера: Ьук-ТАР-Вос соединили при стандартных условиях с двукратным (мольным) избытком окисленных мономеров со снятой ОВп-защитой, в результате получили пептидный димер. Затем при стандартных условиях с полученного пептидного димера сняли остальные защитные группы.
- 52 014528
Стадия 8. Присоединение ПЭГ к димеру со снятой защитой
К пептидному димеру со снятой защитой затем присоединили ПЭГ так, как это было описано для стадии 10 примера 1.
Стадия 9. Ионообменное обогащение
Пептидный димер с присоединенным к нему полиэтиленгликолем затем очистили так, как это было описано для стадии 11 примера 1.
Пример 3. Определение активности ίη νίΐτο
Этот пример описывает различные способы исследований оценки ίη νίΐτο активности и потенциала пептидов агонистов ΕΡΘ-Κ согласно настоящему изобретению. Результаты этих исследований демонстрируют, что новые пептиды согласно настоящему изобретению связываются с ΕΡΘ-Κ и активируют передачу сигнала ΕΡΘ-Κ. Кроме того, их результаты показывают, что новые пептиды показывают удивительное увеличение аффинности связывания с ΕΡΘ-Κ и биологической активности по сравнению с пептидами миметиками эритропоэтина, которые были описаны ранее.
Мономеры и димеры пептидов агонистов ΕΡΘ-Κ получают согласно способам, приведенным в примере 1 или примере 2. Потенциал указанного пептидного димера оценивали в серии тестов активности ίη νίΐτο, включая репортерный тест, тест на пролиферацию, тест на конкурентное связывание и С/ВРи-е тест. Эти четыре теста детально описаны ниже.
Результаты этих исследований активности ίη νίΐτο суммированы в табл. 2.
Репортерный тест
Этот тест основан на клеточной линии пре-В-лимфоцитов мыши, происходящей от репортерных клеток ΒаΓ3,/ΕροΒ/СС8ΕΒ Γοδ/ΐιιχ. Эта линия репортерных клеток экспрессирует химерный рецептор, имеющий внеклеточную часть рецептора ЕРО человека и внутриклеточную часть рецептора человека ОС8Р. Клеточную линию далее трансформировали конструкцией, несущей репортерный ген люциферазы под Γοβ-промотором. Активация этого химерного рецептора после добавления стимулирующего кроветворение агента приводит к экспрессии репортерного гена люциферазы, и, следовательно, свечению после добавления люциферина - субстрата для люциферазы. Таким образом, уровень активизации ΕΡΘ-Κ в таких клетках можно количественно измерить посредством измерения активности люциферазы.
Клетки Ваί3/ΕροΒ/6С8РΒ Γοδ/ΐιιχ культивировали в среде ΌΜΕΜ/Γ12 (Οί^ο) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (РВ8; Нус^е), 10% супернатанта \νΕΗΙ-3 (супернатант из культуры клеток νΕΗΙ-3, АТСС # ΤΙΒ-68), и пенициллина/стрептомицина. Приблизительно за 18 ч до теста клетки подвергали голоданию, перенося их на среду ΌΜΕΜ/Γ12 с добавлением 10% РВ8 и 0,1% супернатанта νΕΗΙ-3. В день теста клетки однократно промывали средой ΌΜΕΜ/Γ12 с добавлением 10% РВ8 (без νΕΗΙ-3 супернатанта), затем 1х106 клеток/мл и культивировали в присутствии известной концентрации тестируемого пептида или эритропоэтина в качестве положительного контроля (Р & Ό 8у8ΐет8 1пс., Μίη^αροΐίδ, ΜΝ) в среде ΌΜΕΜ/Γ12 с добавлением 10% РВ8 (без νΕΗΙ-3 супернатанта). В тесте парал- 53 014528 лельно использовали последовательные разведения тестируемого пептида. Исследуемые чашки инкубировали 4 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2, после чего к каждой пробе добавляли люциферин (81еайу-С1о; Рготеда, Майкоп, XVI). После пятиминутной инкубации измеряли эмиссию света с помощью Раскагй Торсоип! Ьиттоте1ег (Раскагй 1пк1гитеп1 Со., Эотепегк Сгоуе, 111). Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно количества света и проанализировали ее с использованием программного обеспечения СгарН Рай. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной эмиссией света, записали как ЕС50.
Тест на пролиферацию
Этот тест основан на клеточной линии ВаГ3 пре-В-лимфоцитов мыши, трансфецированных для экспрессии ЕР0-К человека. Пролиферация полученной таким образом клеточной линии ВаЕ3/Са14/Е1к/ЕР0К зависит от активации ЕРО-К. Степень клеточной пролиферации количественно определяют, используя МТТ, сигнал в МТТ пропорционален количеству живых клеток.
Клетки ВаЕ3/Са14/Е1к/ЕР0Р культивировали в кр1ппег -флаконах в среде ЭМЕМ/Е12 (С1Ьсо) с добавлением 10% ЕВЗ (Нус1опе) и 2% супернатанта νΉΗΙ-3 (АТСС # Т1В-68). Далее клетки подвергали голоданию в течение ночи в кршпег флаконах при клеточной плотности 1х106 клеток/мл, в среде ОМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 и 0,1% супернатанта VЕΗI-3. Клетки после голодания затем дважды отмывали ЭЫЬессо'к РВ8 (С1Ьсо) и ресуспендировали до плотности 1 х 106 клеток/мл в ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВЗ (без VЕΗI-3 супернатанта). Аликвоты суспензии клеток по 50 мкл (-50000 клеток) затем перенесли в 96 луночные планшеты. В эти планшеты добавили аликвоты по 50 мкл из серии разведений тестируемых пептидов-миметиков эритропоэтина или 50 мкл эритропоэтина (К & Ό 8ук1етк 1пс., МшпеароШ, МЦ) или Агапекр™ (йагЬероеШп а1рНа, коммерчески доступный агонист ЕК0-К от Атдеп) в среде ОМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВЗ (без VЕΗI-3 супернатанта) (конечный объем образца 100 мкл). Например, таким образом могут быть протестированы 12 различных разбавлений, где конечная концентрация тестируемого пептида (или эритропоэтина в контроле) лежит в области от 810 рМ до 0.0045 рМ. Клетки рассевали, а затем инкубировали 48 ч при 37°С. Затем к каждой культуральной чашке добавили 10 мкл МТТ (КосНе П1адпокйск) и оставили на еще 4 ч инкубации. Реакцию затем останавливали, добавив 10% 8Ό8 + 0,01Ν НС1. Затем образцы оставили на ночь при 37°С. Оптическую плотность каждого образца спектрфотометрически измерили при длине волны 595 нм. Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно абсорбции и проанализировали с использованием программного обеспечения СгарН Рай. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной оптической плотности записали как ЕС50.
3. Тест на конкурентное связывание
Анализ конкурентного связывания производят в системе, в которой световой сигнал получают в результате близости двух гранул: гранулы-донора стептавидина, несущей биотинилированный ЕР0-Рсвязывающий пептид-трейсер, и акцепторной гранулы, с которой связан ЕР0-Р. Свет выделяется в результате неизлучательной передачи энергии, в течение которой синглетный кислород при освещении освобождается с первой гранулы и вступает в контакт с синглетным кислородом второй гранулы, вызывая вспышку света. Наборы таких гранул являются коммерчески доступными (Раскагй). Сближение гранул происходит по причине связывания ЕР0-К-связывающего пептида-трейсера с ЕР0-К. Тестируемый пептид конкурирует с пептидом-трейсером за связывание с ЕР0-К, предотвращает это связывание, тем самым уменьшая выделение света.
Более подробно данный способ описывается следующим образом: 4 мкл из серии последовательных разбавлений тестируемого пептида-агониста ЕР0-Р или положительного или отрицательного контролей добавили в лунки на 384-луночном планшете. После этого добавили по 2 мкл/лунку коктейля рецептор/гранулы. Коктейль рецептор/гранулы состоит из: 15 мкл 5мг/мл гранул-доноров стептавидина (Раскагй), 15 мкл 5мг/мл моноклонального антитела аЬ179 (это антитело распознает часть белка плацентарной щелочной фосфатазы человека, содержащейся в рекомбинантном ЕР0-Р), акцепторные гранулы, покрытые белком А (белок А связывается с антителом аЬ179; Раскагй), 112,5 мкл разбавленного 1:6,6 рекомбинантного ЕР0-Р (синтезирован в клетках яичника китайского хомячка как слитый белок с частью плацентарной щелочной фосфатазы человека, которая содержит целевой эпитоп для аЬ179) и 607,5 мкл буфера А1рНациек1 (40тМ НЕРЕ8, рН 7.4; 1тМ МдС12; 0.1% В8А, 0.05% Ттеееп 20). Перемешали встряхиванием. Добавили 2 мкл на лунку биотинилированного ЕР0-Р-связывающего пептида-трейсера (конечная концентрация 30 нМ). ЕР0-К-связывающий пептид-трейсер (см. в табл. Репортер ЕС50 (рМ)), получили в соответствии со способами, описанными в примере 1, используя 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 4.
Пептид-трейсер
Вюйп-ООЬУАСНМОИПУУ^фРЬКС^ ^К-МН2 ВюйтОаЕУАСНМСРИУЛ'СОРЬВ.С '
Центрифугировали 1 мин для перемешивания. Обернули планшеты с помощью Раскагй Тор 8еа1 и завернули в фольгу. Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После 18 ч измерили
- 54 014528 световыделение, используя А1рНаОиек1 геабег (Раскагб). Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно световыделения и проанализировали с использованием ОгарЬ Раб или Ехсе1.
Концентрацию тестируемого пептида, которая приводит к 50% уменьшения выделения света относительно контроля без тестируемого пептида, записали как 1С50.
4. С/ВРИ-е тест
Передача сигнала от ЕРО-К стимулирует дифференцировку стволовых клеток костного мозга в пролиферирующих предшественников красных кровяных клеток. Данный тест измеряет способность тестируемых пептидов стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов из первичных стволовых клеток костного мозга человека. Для этого теста используют серии последовательных разведений тестируемого пептида в среде ΙΜΌΜ (О1Ьсо) с добавлением 10% РВ8 (Нус1опе). К пробам из таких последовательных разведений или эритропоэтин в качестве положительного контроля добавляли метилцеллюлозу до итогового объема 1,5 мл. Смесь пептида и метилцеллюлозы затем тщательно перемешали. Затем разморозили аликвоты СЭ34+ (Ро1ебск/СатЬгех) клеток костного мозга человека (100000 клеток/мл). Размороженные клетки осторожно добавили в пробирку на 50 мл к 0,1 мл 1 мг/мл ДНКзы (81ет Се11к). Затем к клеткам осторожно добавили 40-50 мл среды ΙΜΌΜ: среду добавляют капля за каплей вдоль стенки пробирки, сначала 10 мл, а затем остальной объем, также медленно и вдоль стенки пробирки. Затем клетки центрифугировали при 900 грт в течение 20 мин, а среду тщательно удалили осторожной аспирацией. Клетки ресуспендировали в 1 мл среды ΙΜΌΜ и рассчитали клеточную плотность на 1 мл в камере Горяева (в камеру помещали аликвоту 10 мкл суспензии клеток, плотность клеток является средним числом χΙ0000 клеток/мл). Затем клетки разбавили средой ΙΜΌΜ до клеточной плотности 15000 клеток/мл. К каждым 1,5 мл смеси метилцеллюлозы и образца пептида затем добавили 100 мкл разбавленной суспензии клеток (конечная концентрация клеток в среде составила 1000 клеток/мл) и перемешали. Подождали, пока в смеси исчезнут пузыри, затем аспирацией с помощью тупоконечной иглы удалили 1 мл. По 0,25 мл отобранной смеси из каждого образца добавили в каждую из 4 лунок 24-луночного планшета (Ра1соп Ьгапб). Перенесенные на планшеты смеси инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 во влажном инкубаторе в течение 14 дней. Количество колоний эритроидных клеток определяли, используя фазово-контрастную микроскопию (объектив 5х-10х, конечное увеличение 100х). Концентрацию тестируемого пептида, при которой количество сформированных колоний составляет 90% от максимума, относительно положительного контроля - эритропоэтина, записали как ЕС90 [см. табл. 2: С/ВРИ-е ЕС90].
5. Тест на конкурентное связывание радиоактивных лигандов
Альтернативный тест на конкурентное связывание радиоактивных лигандов также может быть использован для измерения величины Κ'.'50 пептидов согласно настоящему изобретению. Данный тест оценивает связывание 125ИЕРО с ЕРОг. Тест желательно проводить согласно следующему образцу протокола.
А. Материалы__
Рекомбинантный химерный белок БРО К/Рс Определение: Рекомбинантный химерный белок ЕРО К/Рс Поставщик: Κ&Ό 8уз1етз (М1ппеароНз, ΜΝ, И8) Номер каталога: 963-ЕК Номер лота: ΕΟΚ033071 Хранение: 4 °С
Иодированный рекомбинантный эритропоэтин человека Определение: (3 [ |2:11]иодотирозил)эритропоэтин, человеческий рекомбинантный, высокоспецифичной активности, 370 кБк, 10 мкКю Поставщик: АтегзЬат Вюзнепсез (Р1зса1атеау, ИД, И8) Номер каталога: 1М219-10цС1 Номер лота: Хранение: 4 °С
Протеин-6 сефароза Определение: Рго1еш-6 8ерЬагозе 4 Раз! ΡΙονν Поставщик: Ашегзйат Вюзйепсез (Р1зса1ат¥ау, N1, И8) Номер каталога: 17-0618-01 Номер лота: Хранение: 4 °С
Буферы Фосфатно-солевой буфер (РВ8), рН 7.4, содержащий 0.1% альбумин сыворотки быка и 0.1% азид натрия Хранение: 4 °С
В. Определение подходящей концентрации рецептора.
Содержимое одного флакона - 50 мкг лиофилизированного рекомбинантного внеклеточного домена белка ЕРОг, слитого с Рс-фрагментом иммуноглобулина !дС1 человека растворили в 1 мл буфера. Для того чтобы определить истинное количество рецептора, используемого в тесте, 100 мкл из серийных разведений рецептора добавили к приблизительно 20000 срт в 200 мкл иодированного рекомбинантного эритропоэтина человека (125ИЕРО) в полипропиленовых пробирках 12х75 мм. Пробирки закрыли и оста
- 55 014528 вили на ночь осторожно перемешиваться при 4°С во вращающемся шейкере йаЬОнаке.
На следующий день к каждой пробирке добавили 50 мкл 50% жидкого раствора Протеин-С сефарозы. Пробирки затем инкубировали при острожном перемешивании в течение 2 ч при 4°С. После этого пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 4000 ЯРМ (3297хС) для осаждения Протеин-С сефарозы. Супернатант тщательно отбирали и удаляли. После трехкратной промывки с 1 мл указанного буфера при 4°С осадок измеряют с помощью счетчика гамма-излучения ^а11ас νί/агб. Результаты затем проанализировали и рассчитали величину разбавления, требуемую для достижения 50% от максимального уровня связывания.
С. Определение Κ'.’50 пептида
Для определения Κ.\0 пептида I, 100 мкл из серийных разведений пептида смешали со 100 мкл рекомбинантного рецептора эритропоэтина (100 пг/пробирку) в полипропиленовых пробирках 12x75 мм. Затем к каждой пробирке добавляли 100 мкл иодированного рекомбинантного эритропоэтина человека (125I-ЕРΟ), закрывали пробирки и оставляли осторожно перемешиваться при 4°С в течение ночи.
На следующий день связанный 125I-ЕРΟ определяли количественно, как было описано выше. Результаты анализировали и вычисляли величину Юо, используя Сгарйраб Рпкш версии 4.0 от СгаркРаб 8ойгаге, Кс. (8ап П1едо, СА). Тест для каждого протестированного пептида повторили два или более раза, для трех или более повторений определения ГС50.
Таблица 2. Определение активности пептидных димеров ш νίΙΐΌ
Обозначение соединения Пептидный димер Репортер ЕС50 (пМ) Пролиферация ЕС50 (пМ) 1С50 (пМ) С/ВРи-е ЕС90 (пМ)
Пептид II ΙΏΝΟ: 3) о (АсОХЗЕ-¥А(!нМСР1Т(1-па])У<к5РкЙ(МеС)-мн НН^-РЕС (АсО)ОЬ¥АСНМОР1Т(1-па1)УСОРЙК(МеО)-НИ -( 110 2.2
Пептид III (8Е<2 ГО ΝΟ: 3) О (АсСЮЙ ΥΑ(*1 ΙΜΟΡΠΌ -па!)У^<?РЙК(МеС)-νη ΝΗ^ΡΕΟ^ у р и ? (АсОХ}й¥АСНМОР1Т(1-па1)¥^рРЙК(МеО)-НМ ИН— 150 72 2.7
Пример 4. Тест активности ш νί\Ό
Этот пример описывает различные способы исследований оценки активности и потенциала пептидов агонистов ЕРΟ-Я согласно настоящему изобретению ш νί\Ό. Мономеры и димеры пептидов агонистов ЕРΟ-Я получают согласно способам, приведенным в примере 1 или примере 2. Активность этого пептидного димера ш νί\Ό оценивали в серии тестов активности, включая полицитемический эксгипоксический тест и ретикулоцитный тест. Эти два теста детально описаны ниже.
1. Полицитемический эксгипоксический тест на мышах
Активность тестируемых пептидов ш νί\Ό определяли на мышах с помощью полицитемического эксгипоксического теста, адаптированного способа, описанного в Со1ек апб Вапдйаш (1961), №1Шге 191: 1065-1067. Данный тест определяет способность тестируемого пептида служить в качестве миметика эритропоэтина: то есть активировать ЕРΟ-Я и индуцировать синтез новых эритроцитов. Синтез эритроцитов количественно оценивают, основываясь на включении радиоактивно меченого железа в гемоглобин новообразованных эритроцитов.
Мыши линии ΒΌΡ1 акклиматизировались в окружающих условиях в течение 7-10 дней. Определили массу тела для всех животных и животных со сниженной массой (<15 г) не использовали. Мышей подвергали последующим циклам подготовки в гипобарической камере в общей сложности в течение 14 дней. Каждый 24-часовой цикл состоял из 18 ч при 0,40±0,02% от атмосферного давления и 6 ч при обычном давлении окружающей среды. После такой подготовки мышей содержали еще 72 ч до введения пептидов или эритропоэтина при обычном давлении.
Тестируемые пептиды, или стандартный рекомбинантный эритропоэтин человека, разбавили в буфере-носителе РВ8 + 0,1% В8А (РВ8/В8А). Пептидные мономеры для стокового раствора сначала растворили в диметилсульфоксиде (^М8Ο). Группа отрицательного контроля включала одну группу мышей, которым инъецировали только РВ8/В8А, и другую группу мышей, которым инъецировали 1% ^М8Ο. Группа для каждой дозировки содержала 10 мышей. Мышам подкожно (в загривок шеи) инъецировали 0,5 мл соответствующего образца.
Сорок восемь часов спустя после инъекции образца мышам делали внутрибрюшинную инъекцию
- 56 014528
0,2 мл Ее59 (Оирои!, в дозе приблизительно 0,75 мкКюри/мышь. Вес тела мыши определяли 24 ч спустя после введения Ее59, умерщвляли мышей 48 ч спустя после введения Ее59. Кровь отбирали из каждого животного проколом в сердце, определяли гематокрит (в качестве антикоагулянта использовали гепарин). Каждый образец крови (0,2 мл) проанализировали на включение Ее59, используя счетчик гамма-излучения от Раскагб. Мышей, не дающих достоверного ответа (то есть тех мышей, у которых включение радиоактивной метки меньше, чем в группе отрицательного контроля) исключили из набора подходящих данных. Также исключили мышей, которые имели величину гематокрита меньше чем 53% от величины в группе отрицательного контроля.
Результаты получили на наборе из 10 животных для каждой экспериментальной дозы. Среднюю дозу включенной радиоактивности [распадов в минуту (соии!з рег т1ии!е, СРМ)] вычислили для образцов крови из каждой группы.
2. Ретикулоцитный тест
Для этого теста обычным мышам линии ВЭЕ1 в течение трех последовательных дней вводили (0,5 мл, подкожная инъекция) эритропоэтин в контроле или тестируемый пептид. На третий день мышам ввели (0,1 мл, внутрибрюшинная инъекция) железистый декстран (100 мг/мл). На пятый день мышей подвергли анестезии с применением СО2 и отобрали образцы крови пункцией сердца. Процент ретикулоцитов в крови определяли оранжевой окраской тиазола и поточным цитометрическим анализом (программа учета ретикулоцитов). Гематокрит определяли вручную. Скорректированный процент ретикулоцитов определяли, используя следующую формулу:
% КЕТ1Ссоккестео = % КЕПСовжкуео X (Нста(осг11|-н)1уШь?± /
НетаЮсгйнокмАь)
3. Гематологический тест
Нормальным мышам линии СГО1 четырьмя еженедельными болюсными внутривенными инъекциями вводили ЕРО для положительного контроля, тестируемый пептид или носитель. Дипазон положительного контроля и доз тестируемого пептида, выраженный в мг/кг, протестировали варьированием концентрации активного компонента в препарате. Введенные объемы составили 5 мл/кг. Контрольная группа на носитель включала двенадцать животных, в то время как во всех остальных группах дозировок было по 8 животных. Ежедневно регистрировали жизнеспособность и еженедельно массу тела.
Мышей, которым вводили пептиды, не кормили и затем подвергли анестезии ингаляцией изофурана и отобрали образцы крови через пунктуру сердца или брюшной аорты на первый день (для мышей контрольной группы на носитель) и на 15 и 29 дни (по 4 мыши/группу/день). Кровь перенесли в пробирки марки Уаси1ашег®. Предпочтительным антикоагулянтом является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕПТА).
В образцах крови для конечных точек оценивали измеренный синтез эритроцитов и физиологические показатели, такие как гематокрит (Нс!), гемоглобин (НдЬ) и тотальное число эритроцитов (красных кровяных клеток, ККК), используя автоматизированные клинические анализаторы, хорошо известные в данной области техники (например, производимые Сои1!ег Шс.).
Пример 5. Синтез агонистов ЕР0-К, гомодимеров пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (АсСЕСИЛАС! 1\1С11ТП1-11а1)\ГС)Р1.НК (8ЕО 10 N0:1)
Стадия 1. Синтез пептидных мономеров
Пептидные мономеры синтезировали с применением стандартной техники Етос-синтеза на пептидном синтезаторе АΒI 431 А, использующего смолу ТС-КАМ (0,18 ммоль/г Карр Ро1утеге, Сегтаиу). Для синтеза пептидных мономеров с амидированным карбоксильным концом полностью собранный пептид отщепляют от смолы смесью 82,5% ТЕА, 5% воды, 6,25% анизола, 6,25% этанэдитиола. После снятия защиты продукт отфильтровали от смолы и осадили диэтиловым эфиром. После этого, тщательно высушенный продукт очистили обратно фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонках С18 с градиентом ацетонитрила/воды в 0,1% трифторуксусной кислоте. Структуру пептида подтвердили масс-спектрометрией с электрораспылением. Пептидные мономеры могут быть проиллюстрированы следующим образом:
(АсО)СЕ¥АС1ШСРП(1-паГ)У’С0РЬКК-МН2 (8Е<Э ГО МО' 1)
Стадия 2. Синтез трифункционального линкера
В раствор диэтилиминоацетата (10,0 г, 52,8 ммоль) и Вос-бета-аланина (10,0 г, 52,8 ммоль) в 100 мл ЭСМ добавляли диизопропилкарбодиимид (8,0 мл, 51,1 ммоль), смесь оставили более чем на 10 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь во время добавления нагрели на ~10°, затем охлаждали до комнатной температуры свыше 20 мин. Реакционную смесь оставили медленно перемешиваться на ночь и отфильтровали осадок диизопропилмочевины. Растворитель удалили при пониженном давлении, чтобы получить камедь, и остаток растворили в этилацетате и снова отфильтровали, чтобы удалить дополнительно осажденную мочевину. Органическую фазу поместили в разделительную воронку, промыли (насыщ. NаНС0з, солевой раствор, 0,5 Нс1 солевой раствор), высушили (Мд§04), отфильтровали и сконцентрировали при пониженном давлении, чтобы получить диэфирный продукт в виде бесцветного масла. Диэфир перенесли в смесь 1:1 метанол:ТНЕ (100 мл), к смеси добавили воду (25 мл), а затем - №10Н (5 г,
- 57 014528
125 ммоль). Измеренный рН был >10. Реакционную смесь оставили медленно перемешиваться на 2 ч при комнатной температуре, затем подкислили до рН 1 с помощью 6 Н НС1. Водную фазу подвергли насыщению №1С1 и четырехкратной экстракции этилацетатом. Смешанную органическую фазу промыли (солевым раствором), высушили (Мд§04) при пониженном давлении, чтобы получить белое полутвердое вещество. Его растворили в 50 мл БСМ, а затем добавили 300 мл гексана, получив белую жидкость. Растворитель удалили при пониженном давлении, чтобы получить двухосновную кислоту в виде белого твердого вещества (14,7 г, 91,5% выход для 2 стадий синтеза). В раствор полученной кислоты (1 г, 3,29 ммоль) в 20 мл БМЕ добавили Ν-гидроксисукцинимид (770 мг, 6,69 ммоль), диизопропилкарбодиимид (1,00 мл, 6,38 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (3 мг, 0,02 ммоль). Реакционную смесь оставили медленно перемешиваться на ночь, растворитель удалили при пониженном давлении. Остаток перенесли в этилацетат и отфильтровали, чтобы удалить осажденную мочевину. Органическую фазу поместили в разделительную воронку, промыли (насыщ. NаНС0з, солевой раствор, 0,5 Н НС1, солевой раствор), высушили (Мд§04), отфильтровали и сконцентрировали при пониженном давлении, чтобы получить двойной ΝΗδ-эфир в виде белого твердого вещества (1,12 г, выход 68%).
Шаг 3. Связывание трифункционального линкера с пептидными мономерами
Для связывания с линкером 2 эквивалента пептида смешали с 1 эквивалентом трифункционального линкера в сухом БМЕ, чтобы получить чистый раствор, 2 мин спустя добавили 5 эквивалентов БГЕА. Смесь продолжали перемешивать при температуре окружающей среды в течение 14 ч. Растворитель удалили при пониженном давлении и сырой продукт растворили в течение 30 мин в 80% ТЕА в БСМ для того, чтобы удалить группу Вос, после чего продукт подвергли очистке обратнофазовой ВЭЖХ на С18. Структура димера подтверждена масс-спектрометрией с электрораспылением. Эта реакция связывания присоединяет линкер к атому азота е-аминогруппы остатка лизина каждого мономера. Связывание с использование последовательности 8ЕЦ ГБ Ν0: 1 показано ниже.
- 58 014528
Стадия 4. Присоединение ПЭГ к пептидному димеру
Присоединение ПЭГ посредством карбаматной связи:
Пептидный димер смешивали с равным количеством (мольное отношение) активированного ПЭГ (шРЕ6-№С от NОΡ Согр. 1арап) в сухом ΌΜΕ, чтобы получить чистый раствор. Спустя 5 мин к вышеназванному раствору добавляли 4 эквивалента ΌΙΕΑ. Смесь встряхивали при окружающей температуре 14 ч, после чего очистили с помощью обратнофазовой ВЭЖХ на С18. Структура пептида с присоединенным к нему ПЭГ была подтверждена ΜΑΣΌΙ. Очищенный пептид также подвергли очистке с помощью катионообменной хроматографии, как это указано ниже. Процесс присоединения шРЕС-№С показан ниже, с использованием последовательности 8Е0 ΙΌΝΟ:1.
- 59 014528
Пептидный димер смешали с равным количеством (мольное отношение) активированного ПЭГ (ΡΕΟ-8ΡΑ-ΝΗ8 от 8Неаг\\'а1ег ^гр, И8Л) в сухом ΌΜΡ, чтобы получить чистый раствор. Спустя 5 мин к вышеназванному раствору добавили 10 эквивалентов ΌΙΕΆ. Смесь встряхивали при окружающей температуре 2 ч, после чего очистили с помощью обратнофазовой ВЭЖХ на С18. Структура пептида с присоединенным к нему ПЭГ была подтверждена ΜΑΤΌ! Очищенный пептид также подвергли очистке с помощью катионообменной хроматографии, как это указано ниже.
Процесс присоединения ΡΕΟ-8ΡΑ-ΝΗ8 показан ниже, с использованием последовательности 8ΕΟ ΙΌ N0:1.
- 60 014528
Стадия 5. Ионообменная очистка пептида
Несколько ионообменных носителей были проверены на их способность разделять вышеуказанный конъюгат пептид-ПЭГ от непрореагировавшего (или гидролизованного) ПЭГ, в дополнение к их способности сохранять исходные димерные пептиды. Ионообменную смолу (2-3 г) после перевода в форму натриевой соли (0,2 Н №0Н заливали в колонну до тех пор, пока элюент не приобрел рН 14, приблизительно 5 объемов колонны) загрузили в колонну диаметром 1 см и затем перевели в водородную форму (элюировали 0,1 Н НС1 или 0,1 М уксусной кислотой до рН элюента, соответствующего загрузке, приблизительно 5 объемов колонны), после чего промыли 25% АС№водой до рН 6. И пептид до соединения и конъюгат пептид-ПЭГ растворили в 25% АС№воде (10 мг/мл), рН скорректировали с помощью ТЕА до <3, затем смесь загрузили в колонну. После промыли колонну 2-3 объемами 25% АС№воды, собрали 5 мл фракции, затем пептид вымыли из колонны элюацией с 0,1 М раствором NН40Ас в 25% АС№воде, снова собрали 5 мл фракции. Анализ методом ВЭЖХ выявил, в какой фракции содержался желаемый пептид. Анализ с помощью Еуарогайуе Ыд111-8саЦеппд Бе!ес!ог (ЕЬ8Б) показал, что когда пептид оставался в колонне и элюировался раствором №40Ас (обычно между фракциями 4 и 10), в качестве загрязняющего вещества не наблюдалось никакого несвязанного ПЭГ. Когда пептид элюировали начальным промывочным буфером (обычно первые 2 фракции), никакого разделения желаемого ПЭГ-конъюгата и избытка ПЭГ не наблюдалось.
Следующие колонны успешно удерживали как пептид, так и конъюгат пептид-ПЭГ, и успешно очищали конъюгат пептид-ПЭГ от несвязанного с ПЭГ пептида.
- 61 014528
Таблица 5. Ионообменные смолы
Носитель Производитель
Мопо 8 НК 5/5, прочные катионообменные предзагруженные колонны Ашегзйат Вюзмепсез
8Е53 целлюлоза, микрогранулярный прочный катионообменный носитель АУЬайпал
8Р Рай Поле сефароза, прочный катионообменный носитель АтегзЬат В1озс1епсез
Пример 6. Синтез агонистов ЕРО-К, гомодимеров пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (АсС1)С11Л’АС11\1С11ЧТ(1-11а1)\ГО1Р Л(\1еС1)К (8ЕО ГО 2)
Агонисты ЕРО-К, гомодимеры пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (Αс6)6^ΥΑСНΜ6РIТ(1 -ηа1)VС^Р^К(Μе6)Κ (8Е0 ΙΌ NΟ: 2), синтезировали так, как это было описано в примере 1, за исключением стадии 1, синтезированные пептиды мономеры имеют последовательность (АсО)ОЬУАСНМОР1Т(|-па1)УСОР1.К(МеС.)К <ЯН<Э ГО ΝΟ: 2)
В случае если ПЭГ присоединен к линкеру посредством карбаматной связи, конечный продукт такого синтеза с использованием последовательности 8Е0 ГО NΟ: 2 может быть структурно иллюстрирован следующим образом
В случае если ПЭГ присоединен к линкеру посредством амидной связи, конечный продукт такого синтеза с применением последовательности 8Е0 ГО NΟ: 2 может быть структурно иллюстрирован следующим образом:
Пример 7. Определение активности ίη νίΙΐΌ
Этот пример описывает различные способы исследований оценки ίη νίΙΐΌ активности и потенциала пептидов агонистов ЕРО-К согласно настоящему изобретению. Результаты этих исследований демонстрируют, что новые пептиды данного изобретения связываются с ЕРО-К и активируют передачу сигнала ЕРО-К. Кроме того, их результаты показывают, что новые пептиды показывают удивительное увеличение аффинности связывания с ЕРО-К и биологической активности по сравнению с пептидами миметиками эритропоэтина, которые были описаны ранее.
Мономеры и димеры пептидов агонистов ЕРО-К получают согласно способам, приведенным в примере 1 или примере 2. Потенциал этого пептидного димера оценивали в серии тестов активности ίη У11го, включая репортерный тест, тест на пролиферацию, тест на конкурентное связывание и С/ВРИ-е тест. Эти четыре теста детально описаны ниже.
Результаты этих исследований активности ίη νίΙΐΌ суммированы в табл. 4.
- 62 014528
Репортерный тест
В этом тесте используют клеточную линию пре-В-лимфоцитов мыши, происходящую от репортерных клеток ВаП3/ЕроВ/СС8ЕВ Пок/1их. Указанная линия репортерных клеток экспрессирует химерный рецептор, который содержит внеклеточную часть рецептора ЕРО человека и внутриклеточную часть рецептора человека СС8Е. Клеточную линию далее трансформировали конструкцией, содержащей репортерный ген люциферазы под Рок-промотором. Активация этого химерного рецептора после добавления стимулирующего кроветворение агента приводит к экспресии репортерного гена люциферазы, и, следовательно, свечению после добавления люциферина - субстрата для люциферазы. Таким образом, уровень активизации ЕР0-В в таких клетках можно количественно измерить посредством измерения активности люциферазы.
Клетки Вай/ЕроВ/СС8ЕВ Пок/1их культивировали в среде ЭМЕМ/Е12 (С1Ьсо) с добавлением 10% фетальной сыворотки КороВ (ЕВ8; Нус1опе), 10% супернатанта ХУЕН1-3 (супернатант из культуры клеток \УЕН1-3, АТСС # Т1В-68), и пенициллина/стрептомицина. Приблизительно за 18 ч до теста клетки подвергали голоданию, перенося их на среду ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 и 0.1% супернатанта ХУЕН1-3. В день анализа клетки однократно промывали средой ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 (без ХУЕН1-3 супернатанта), затем 1 х 106 клеток/мл и культивировали в присутствии известной концентрации тестируемого пептида или эритропоэтина в качестве положительного контроля (В & Ό 8ук1етк 1пс., Мтпеаройк, МЦ) в среде ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 (без ХУЕН1-3 супернатанта). При анализе параллельно использовали последовательные разведения тестируемого пептида. Анализируемые чашки инкубировали 4 ч при 37°С в атмосфере 5% С02, после чего к каждой пробе добавляли люциферин (81еайу-С1о; Рготеда, Майкоп, XVI). После пятиминутной инкубации измеряли эмиссию света с помощью Раскагй Торсона! ^ит^ηοшеΐе^ (Раскагй 1пк1гитеп1 Со., Эо^пегк Сгоуе, Ι11). Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно количества излучения и анализировали ее с использованием программного обеспечения СгарН Рай. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной эмиссии света, учитывали как ЕС50.
Тест на пролиферацию
Этот тест основан на клеточной линии ВаР3 пре-В-лимфоцитов мыши, трансфецированных для экспрессии ЕР0-В человека. Пролиферация полученной таким образом клеточной линии ВаЕ3/Са14/Е1к/ЕР0В зависит от активации ЕР0-В. Степень клеточной пролиферации количественно определяют, используя МТТ, сигнал в МТТ пропорционален количеству живых клеток.
Клетки ВаЕ3/Са14/Е1к/ЕР0В культивировали в кртпег флаконах в среде ЭМЕМ/Е12 (С1Ьсо) с добавлением 10% ЕВ 8 (Нус1опе) и 2% супернатанта VΕНI-3 (АТСС#Т1В-68). Далее клетки подвергали голоданию в течение ночи в кршпег флаконах при клеточной плотности 1х106 клеток/мл, в среде ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 и 0,1% супернатанта VΕНI-3. Клетки после «голодания» затем дважды отмывали ЭЫЬессо'к РВ8 (С1Ьсо) и ресуспендировали до плотности 1 х 106 клеток/мл в ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 (без VΕНI-3 супернатанта). Аликвоты суспензии клеток по 50 мкл (-50000 клеток) затем перенесли в 96-луночные планшеты. В эти планшеты добавили аликвоты по 50 мкл из серии разведений тестируемых пептидов-миметиков эритропоэтина или 50 мкл эритропоэтина (В & Ό 8ук1етк 1пс., МшпеароШ, МК) или Агапекр™ (йагЬероейт а1рНа, коммерчески доступный агонист ЕВ0-В от Ашдеп) в среде ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% ЕВ8 (без VΕНI-3 супернатанта) (конечный объем образца 100 мкл). Например, таким образом могут быть протестированы 12 различных разбавлений, где конечная концентрация тестируемого пептида (или эритропоэтина в контроле) лежит в области от 810 рМ до 0,0045 рМ. Клетки рассевали, а затем инкубировали 48 ч при 37°С. Затем к каждой культуральной чашке добавили 10 мкл МТТ (ВосНе О|адпокйск) и оставили на еще 4 ч инкубации.
Реакцию затем останавливали, добавив 10% 8Ό8 + 0,001 Ν НС1. Затем образцы оставили на ночь при 37°С. Оптическую плотность каждого образца спектрофотометрически измерили при длине волны 595 нм. Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно абсорбции и проанализировали с использованием программного обеспечения СгарН Рай. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной оптической плотности записали как ЕС50.
3. Тест на конкурентное связывание
Определение конкурентного связывания производят тестом, в котором световой сигнал получают в результате близости двух гранул: гранулы-донора стептавидина, несущей биотинилированный ЕР0-Всвязывающий пептид-трейсер, и акцепторной гранулы, с которой связан ЕР0-В. Свет возникает в результате неизлучательной передачи энергии, в течение которой синглетный кислород при освещении освобождается с первой гранулы и вступает в контакт с синглетным кислородом второй гранулы, вызывая видимое свечение. Наборы таких гранул являются коммерчески доступными (Раскагй). Близость гранул происходит по причине связывания ЕР0-В-связывающего пептида-трейсера с ЕР0-В. Тестируемый пептид конкурирует с пептидом-трейсером за связывание с ЕР0-В, предотвращает это связывание, тем самым, уменьшая выделение света.
Более подробно указанный способ описывается следующим образом: 4 мкл из серии последовательных разбавлений тестируемого пептида-агониста ЕР0-В или положительного или отрицательного
- 63 014528 контролей добавили в лунки на 384-луночном планшете. После этого добавили по 2 мкл/лунку коктейля рецептор/гранулы. Коктейль рецептор/гранулы состоит из 15 мкл 5 мг/мл гранул-доноров стептавидина 15 мкл 5 мг/мл моноклонального антитела аЬ79 (это антитело распознает часть белка плацентарной щелочной фосфатазы человека, содержащейся в рекомбинантном ΕΡ0-Κ), акцепторные гранулы, покрытые белком А (белок А связывается с антителом аЬ79; Гаскагб), 112,5 мкл разбавленного 1:6,6 рекомбинантного ΕΡ0-Κ (синтезирован в клетках яичника китайского хомячка как слитый белок с частью плацентарной щелочной фосфатазы человека, которая содержит целевой эпитоп для аЬ179) и 607,5 мкл буфера А1р11ас.|ие51 (40 μΜ ΗΕΡΕ8, ρΗ 7,4; ΐ μΜ Μμί.Ί2; 0,1% В8А, 0,05% Т\уеен 20). Перемешали встряхиванием. Добавили 2 мкл на лунку биотинилированного ΕΡΟ-Κ-связывающего пептида-трейсера (конечная концентрация 30 нМ). ΕΡΟ-Κ-связывающий пептид-трейсер (см. в табл. Репортер ЕС50 (рМ)), получили в соответствии со способами, описанными в примере 1, используя 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4.
Пептид-трейсер
ВюП11-СОЬУА^НМОИ™^рРЬК<К ^Κ-ΝΙΕ ВюНп-ССЬУАСНМСР1Т%^СОРЕК.С '
Центрифугировали 1 мин для перемешивания. Обернули планшеты с помощью Ρ;·κ1<;·ιγ6 Τορ 8еа1 и завернули в фольгу. Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После 18 ч измерили испускание света, используя А1рИаЩиез1 геабег Ласкай). Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно испускания света и проанализировали с использованием Сгарй Ρаб или Εxсе1.
Концентрацию тестируемого пептида, которая приводит к 50% уменьшения испускания света относительно контроля без тестируемого пептида, учитывали как Κ50.
4. С/ВРИ-е тест
Передача сигнала от ΕΡΟ-Р стимулирует дифференцировку стволовых клеток костного мозга в пролиферирующие предшественники красных кровяных клеток. Данный тест измеряет способность тестируемых пептидов стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов из первичных стволовых клеток костного мозга человека. Для этого теста используют серии последовательных разведений тестируемого пептида в среде ΙΜΌΜ (ЩЬот) с добавлением 10% РВ8 (Цу^οηο). К пробам из таких последовательных разведений или эритропоэтину в качестве положительного контроля добавляли метилцеллюлозу до итогового объема 1,5 мл. Смесь пептида и метилцеллюлозы затем тщательно перемешали. Затем разморозили аликвоты ί.'Ό34+ (Ρο^еΐ^С8/СатЬ^еx) клеток костного мозга человека (100000 клеток/мл). Размороженные клетки осторожно добавили в пробирку на 50 мл к 0,1 мл 1 мг/мл ДНКзы (81еш Се1к). Затем к клеткам осторожно добавили 40-50 мл среды ΙΜΌΜ: среду добавляют капля за каплей вдоль стенки пробирки, сначала 10 мл, а затем остальной объем, также медленно и вдоль стенки пробирки. Затем клетки центрифугировали при 900 грт в течение 20 мин, а среду тщательно удалили осторожной аспирацией. Клетки ресуспендировали в 1 мл среды ΙΜΌΜ и рассчитали клеточную плотность на 1 мл в камере Горяева (в камеру помещали аликвоту 10 мкл суспензии клеток, плотность клеток является средним числом х 10000 клеток/мл). Затем клетки разбавили средой ΙΜΌΜ до клеточной плотности 15000 клеток/мл. К каждым 1,5 мл смеси метилцеллюлозы и образца пептида затем добавили 100 мкл разбавленной суспензии клеток (конечная концентрация клеток в среде составила 1000 клеток/мл) и перемешали. Подождали, пока в смеси исчезнут пузыри, затем аспирацией с помощью тупоконечной иглы удалили 1 мл. По 0,25 мл отобранной смеси из каждого образца добавили в каждую из 4 лунок 24-луночного планшета (Ра1сοη Ьгаиб). Перенесенные на планшеты смеси инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 во влажном инкубаторе в течение 14 дней. Количество колоний эритроидных клеток определяли, используя фазово-контрастную микроскопию (объектив 5х-10х, конечное увеличение 100х). Концентрацию тестируемого пептида, при которой количество сформированных колоний составляет 90% от максимума, относительно положительного контроля - эритропоэтина, записали как ЕС90 [см. табл. 4: С/ВРИ-е БС90].
- 64 014528
Таблица 4. Определение активности пептидных димеров 1п У1!го
Обозначение соединения Пептидный димер Репорте Р ЕС50 (пМ) Пролифе рация ЕС50 (пМ) ΑΩ 1С50 (нМ) с/вги-е ЕС90 (нМ)
Пептид IV (8ЕБ ГО N0: 1) 1 1 0 (АсС)СЪ¥АСНМСР1Т(1-па1)УС^Ри<-МНч^^МН2 ΝΗ 0 Υ о 0 ΝΗ (АсО)ОЕ¥АСНМ6Р1Т(1-па])УСрРЕК-НН^ЦН2 6.2
Пример 8. Тест активности ш у1уо
Этот пример описывает различные способы исследований оценки активности и силы действия а пептидов - агонистов ЕР0-В согласно настоящему 1п у1уо. Мономеры и димеры пептидов агонистов ЕР0-В получают согласно способам, приведенным в примере 1 или 2. Активность этого пептидного димера 1п у1уо оценивали в серии тестов активности, включая полицитемический эксгипоксический тест и ретикулоцитный тест. Эти два теста детально описаны ниже.
1. Полицитемический эксгипоксический тест на мышах
Активность тестируемых пептидов ш у1уо определяли на мышах с помощью полицитемического эксгипоксического теста, адаптированного способа, описанного в Со!ек апБ ВапдБат (1961), №11иге 191: 1065-1067. Данный тест определяет способность тестируемого пептида служить в качестве миметика эритропоэтина: то есть активировать ЕР0-В и индуцировать синтез новых эритроцитов. Синтез эритроцитов количественно оценивают, основываясь на включении радиоактивно меченого железа в гемоглобин новообразованных эритроцитов.
Мышей линии ВБЕ1 акклиматизировали к окружающим условиям в течение 7-10 дней. Определили массу тела для всех животных и животных со сниженной массой (<15 г) не использовали. Мышей подвергали последующим циклам подготовки в гипобарической камере в общей сложности в течение 14 дней. Каждый 24-часовой цикл состоял из 18 ч при 0,40±0,02% от атмосферного давления и 6 ч при обычном давлении окружающей среды. После такой подготовки мышей содержали еще 72 ч до введения пептидов или эритропоэтина при обычном давлении.
Тестируемые пептиды, или стандартный рекомбинантный эритропоэтин человека, разбавили в буфере-носителе РВ8+0,1% В8А (РВ8/В8А). Пептидные мономеры для стокового раствора сначала растворили в диметилсульфоксиде (БМ80). Группа отрицательного контроля включала одну группу мышей, которым инъецировали только РВ8/В8А, и другую группу мышей, которым инъецировали 1% БМ80. Группа для каждой дозировки содержала 10 мышей. Мышам подкожно (в загривок шеи) инъецировали 0,5 мл соответствующего образца.
Сорок восемь часов спустя после инъекции образца мышам делали внутрибрюшинную инъекцию 0,2 мл Ее59 (Бироп!, ΝΞΝ), в дозе приблизительно 0,75 мкКюри/мышь. Вес тела мыши определяли 24 ч спустя после введения Ее59, умерщвляли мышей 48 ч спустя после введения Ее59. Кровь отбирали из каждого животного проколом в сердце, определяли гематокрит (в качестве антикоагулянта использовали гепарин). Каждый образец крови (0,2 мл) проанализировали на включение Ее59, используя счетчик гамма-излучения от РаскагБ. Мышей, не дающих достоверного ответа (то есть тех мышей, у которых включение радиоактивной метки меньше, чем в группе отрицательного контроля), исключили из набора подходящих данных. Также исключили мышей, которые имели величину гематокрита меньше чем 53% от величины в группе отрицательного контроля.
Результаты получили на наборе из 10 животных для каждой экспериментальной дозы. Среднюю дозу включенной радиоактивности [распадов в минуту (соип!к рег тти!е, СРМ)] вычислили для образцов крови из каждой группы.
2. Ретикулоцитный тест
Для этого теста обычным мышам линии ВБЕ1 в течение трех последовательных дней вводили (0,5 мл, подкожная инъекция) эритропоэтин в контроле или тестируемый пептид. На третий день мышам ввели (0,1 мл, внутрибрюшинная инъекция) железистый декстран (100 мг/мл). На пятый день мышей подвергли анестезии с применением С02 и отобрали образцы крови пункцией сердца. Процент ретикулоцитов в крови определяли оранжевой окраской тиазола и поточным цитометрическим анализом (программа учета ретикулоцитов). Гематокрит определяли вручную. Скорректированный процент ретикулоцитов определяли, используя следующую формулу:
- 65 014528 % КЕТТСсоякестео - % КЕПСовзекуео X (НетаСосгйп^угоиАЕ /
НетаЛсгйнокмАь)
3. Гематологический тест
Нормальным мышам линии СЭ1 четырьмя еженедельными болюсными внутривенными инъекциями вводили ЕРО для положительного контроля, тестируемый пептид или носитель. Диапазон положительного контроля и доз тестируемого пептида, выраженный в мг/кг, протестировали варьированием концентрации активного компонента в препарате. Введенные объемы составили 5 мл/кг. Контрольная группа на носитель включала двенадцать животных, в то время как во всех остальных группах дозировок было по 8 животных. Ежедневно регистрировали жизнеспособность и еженедельно массу тела.
Мышей, которым вводили пептиды, не кормили и затем подвергли анестезии ингаляцией изофурана и отобрали образцы крови через пунктуру сердца или брюшной аорты на первый день (для мышей контрольной группы на носитель) и на 15 и 29 дни (по 4 мыши/группу/день). Кровь перенесли в пробирки марки Уаси!ашег®. Предпочтительным антикоагулянтом является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕПТА).
В образцах крови для конечных точек оценивали измеренный синтез эритроцитов и физиологические показатели, такие как гематокрит (Нс!), гемоглобин (НдЬ) и тотальное число эритроцитов (ККК), используя автоматизированные клинические анализаторы, хорошо известные в данной области техники (например, производимые Сои1!ег Лс.).
Пример 9. Синтез агонистов ЕРО-К, гомодимеров пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (АсО)О^ΥАСНΜОРIТ(1-иа1)VС^Р^КК (8ЕО ΙΌ ^:1)
Стадия 1. Синтез пептидных мономеров
Пептидные мономеры синтезировали с применением стандартной техники Ртос-синтеза на пептидном синтезаторе АВ 431 А, с применением смолы ТО-КАМ (0,18 ммоль/г Карр Ро1утеге, Оегтапу). Для синтеза пептидных мономеров с амидированным карбоксильным концом полностью синтезированный пептид отщепляют от смолы смесью 82,5% ТРА, 5% воды, 6,25% анизола, 6,25% этанэдитиола. После снятия защиты продукт отфильтровали от смолы и осадили диэтиловым эфиром. После этого, тщательно высушенный продукт очистили обратно фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонках С18 с градиентом ацетонитрила/воды в 0,1% трифторуксусной кислоте. Структуру пептида подтвердили масс-спектрометрией с электрораспылением. Пептидные мономеры могут быть проиллюстрированы следующим образом:
(АсО^ЬУАСНМОРЩЬпаОУСфРЬКК-ННг (8Εζ)ΙΟΝΟ: 1)
Стадия 2. Синтез трифункционального линкера
В раствор диэтилиминоацетата (10,0 г, 52,8 ммоль) и Вос-бета-аланина (10,0 г, 52,8 ммоль) в 100 мл ЭСМ добавили диизопропилкарбодиимид (8,0 мл, 51,1 ммоль), смесь оставили более чем на 10 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь во время добавления нагрели на 10°, затем охладили до комнатной температуры свыше 20 мин. Реакционную смесь оставили медленно перемешиваться на ночь и отфильтровали осадок диизопропилмочевины. Растворитель удалили при пониженном давлении, чтобы получить камедь, и остаток растворили в этилацетате и снова отфильтровали, чтобы удалить дополнительно осажденную мочевину. Органическую фазу поместили в разделительную воронку, промыли (насыщ. NаНСОз, солевой раствор, 0,5 Н НС1, солевой раствор), высушили (Мд8О4), отфильтровали и сконцентрировали при пониженном давлении, чтобы получить диэфирный продукт в виде бесцветного масла. Диэфир перенесли в смесь 1:1 метанол:ТНР (100 мл), к смеси добавили воду (25 мл), а затем №ОН (5 г, 125 ммоль). Измеренный рН был >10. Реакционную смесь оставили медленно перемешиваться на 2 ч при комнатной температуре, затем подкислили до рН 1 с помощью 6 Н НС1. Водную фазу подвергли насыщению №1С1 и четырехкратной экстракции этил ацетатом. Смешанную органическую фазу промыли (солевым раствором), высушили (Мд8О4), и при пониженном давлении, чтобы получить белое полутвердое вещество. Его растворили в 50 мл ЭСМ, а затем добавили 300 мл гексана, получив белую жидкость. Растворитель удалили при пониженном давлении, чтобы получить двухосновную кислоту в виде белого твердого вещества (14,7 г, 91,5% выход для 2 стадий синтеза). В раствор полученной кислоты (1 г, 3,29 ммоль) в 20 мл ΌΜΕ добавили Ν-гидроксисукцинимид (770 мг, 6,69 ммоль), диизопропилкарбодиимид (1,00 мл, 6,38 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (3 мг, 0,02 ммоль). Реакционную смесь оставили медленно перемешиваться на ночь, растворитель удалили при пониженном давлении. Остаток перенесли в этилацетат и отфильтровали, чтобы удалить осажденную мочевину. Органическую фазу поместили в разделительную воронку, промыли насыщ. NаНСОз, солевой раствор, 0,5 Н НС1, солевой раствор), высушили (Мд8О4), отфильтровали и сконцентрировали при пониженном давлении, чтобы получить двойной NН8-эфир в виде белого твердого вещества (1,12 г, выход 68%).
- 66 014528
Стадия 3. Связывание трифункционального линкера с пептидными мономерами
Для связывания с линкером 2 эквивалента пептида смешали с 1 эквивалентом трифункционального линкера в сухом ОМЕ, чтобы получить чистый раствор, 2 мин спустя добавили 5 эквивалентов Э1ЕА. Смесь продолжали перемешивать при температуре окружающей среды в течение 14 ч. Растворитель удалили при пониженном давлении и сырой продукт растворили в течение 30 мин в 80% ТЕА в ЭСМ для того, чтобы удалить группу Вос, после чего продукт подвергли очистке обратнофазной ВЭЖХ на С18. Структура димера подтверждена масс-спектрометрией с электрораспылением. Эта реакция связывания присоединяет линкер к атому азота е-аминогруппы остатка лизина каждого мономера. Связывание с использованием последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ν0: 1 показано ниже.
(АсС)ОЬУАСНМСР1Т(1-па1)ХСк>РЬ1Ж-КНг
Стадия 4. Синтез субъединицы ПЭГ, включающей две линейные цепи ПЭГ, связанные лизином тРЕС2-Ьукто1-№С
Лизинол, который может быть коммерчески получен, обработали избытком тРЕС2-№С для получения МРЕС2-лизинола, который затем реагирует с №С, образуя тРЕ№-лизинол-КРС.
тРЕС2-Ьу^Н8
Этот продукт может быть коммерчески получен, например, из каталога Мо1еси1аг Епдтееппд са!а1од (2003) от №к!аг ТНегареийск (490 О|ксоуегу Опте, Нип1куН1е, А1аЬата 35806) пункт № 223Х0Т01.
Стадия 5. Присоединение ПЭГ к пептидному димеру
Присоединение ПЭГ посредством карбаматной связи
Пептидный димер смешали с двумя эквивалентами (мольное отношение) активированного ПЭГ (тРЕС-№С от Ν0Γ Согр. 1арап) в сухом ОМЕ, чтобы получить чистый раствор. Спустя 5 мин к вышеназванному раствору добавили 4 эквивалента Э1ЕА. Смесь встряхивали при окружающей температуре 14 ч, после чего очистили с помощью обратно фазовой ВЭЖХ на С18. Структура пептида с присоединенным к
- 67 014528 нему ПЭГ была подтверждена МАЬОГ Очищенный пептид также подвергли очистке с помощью катионообменной хроматографии, как это указано ниже. Процесс присоединения тРЕС-№С показан ниже, с использованием последовательности 8Е0 №N0: 1.
Пептидный димер смешали с двумя эквивалентами (мольное отношение) активированного ПЭГ (РЕС-8РА-МН8 от 8йеаггеа!ег Согр, И8А) в сухом ОМЕ, чтобы получить чистый раствор. Спустя 5 мин к вышеназванному раствору добавили 10 эквивалентов ЭША. Смесь встряхивали при окружающей температуре 2 ч, после чего очистили с помощью обратнофазовой ВЭЖХ на С18. Структура пептида с присоединенным к нему ПЭГ была подтверждена МАЬОЬ. Очищенный пептид также подвергли очистке с помощью катионообменной хроматографии, как это указано ниже. Процесс присоединения РЕС-8РА-61Н8 показан ниже, с использованием последовательности 8Е0 ГО N0: 1.
- 68 014528
Стадия 6. Ионообменная очистка пептида
Несколько ионообменных носителей были проверены на их способность разделять вышеуказанный конъюгат пептид-ПЭГ от непрореагировавшего (или гидролизованного) ПЭГ, в дополнение к их способности сохранять исходные димерные пептиды. Ионообменную смолу (2-3 г) после перевода в форму натриевой соли (0,2 Н ИаОН заливали в колонну до тех пор, пока элюент не приобрел рН 14, приблизительно 5 объемов колонны) загрузили в колонну диаметром 1 см и затем перевели в водородную форму (элюировали 0,1 Н НС1 или 0,1 М уксусной кислотой до рН элюента, соответствующего загрузке, приблизительно 5 объемов колонны), после чего промыли 25% АСИ/водой до рН 6. И пептид до соединения и конъюгат пептид-ПЭГ растворили в 25% АСИ/воде (10 мг/мл), рН скорректировали с помощью ТРА до <3, затем смесь загрузили в колонну. После промыли колонну 2-3 объемами 25% АСИ/воды, собрали 5 мл фракции, затем пептид вымыли из колонны элюацией с 0,1 М раствором ИН4ОАс в 25% АСИ/воде, снова собрали 5 мл фракции. Анализ методом ВЭЖХ выявил, в какой фракции содержался желаемый пептид. Анализ с помощью Еνаро^а!^νе ЫдЫ^саИеппд Эе1ес1ог (ΈΕδΩ) показал, что когда пептид оставался в колонне и элюировался раствором ИН4ОАс (обычно между фракциями 4 и 10), в качестве загрязняющего вещества не наблюдалось никакого несвязанного ПЭГ. Когда пептид элюировали начальным промывочным буфером (обычно первые 2 фракции), никакого разделения желаемого ПЭГ-конъюгата и избытка ПЭГ не наблюдалось.
Следующие колонки успешно удерживали как пептид, так и конъюгат пептид-ПЭГ, и успешно очищали конъюгат пептид-ПЭГ от несвязанного с ПЭГ пептида:
- 69 014528
Таблица 5. Ионообменные смолы
Носитель Производитель
Моно 8 НК 5/5, прочные катионообменные предзагруженные колонны АтегзЬаш В1озС1епсез
8Е53 целлюлоза, микрогранулярный прочный катионообменный носитель Й/Иагтап
8Р Раз! Ноте сефароза, прочный катионообменный носитель Атегзйат Вю&лепсея
Пример 10. Синтез агонистов ЕР0-К, гомодимеров пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (АсС)С^ΥАСНМСРIТ(1-иа1)УС^Р^К(МеС)К (8ЕО 10 N0: 2)
Агонисты ЕР0-К, гомодимеры пептидных мономеров, имеющих аминокислотную последовательность (АсС)С^ΥАСНМСРIТ(1-иа1)УС^Р^К(МеС)К (8Е0 ГО N0:2), синтезировали так, как это было описано в примере 1, за исключением стадии 1, синтезированные пептиды мономеры имеют последовательность:
(АсС)СЬУАСНМСР1Т( 1-па!)УС(?РЕК(Ме<3)К Д) N0; 2 )
В случае если ПЭГ присоединен к линкеру посредством карбаматной связи, конечный продукт такого синтеза с использованием последовательности 8Е0 ГО N0:2 может быть структурно иллюстрирован
В случае если ПЭГ присоединен к линкеру посредством амидной связи, конечный продукт такого синтеза с использованием последовательности 8Е0 ГО N0:2 может быть структурно иллюстрирован следующим образом
Пример 11. Определение активности ш уйго
Этот пример описывает различные способы исследований оценки 1и νίΙΐΌ активности и потенциала пептидов агонистов ЕР0-К согласно настоящему изобретению. Результаты этих исследований демонстрируют, что новые пептиды согласно настоящему изобретению связываются с ЕР0-К и активируют передачу сигнала ЕР0-К. Кроме того, их результаты показывают, что новые пептиды показывают удивительное увеличение аффинности связывания с ЕР0-К и биологической активности по сравнению с пептидами миметиками эритропоэтина, которые были описаны ранее.
Мономеры и димеры пептидов агонистов ЕР0-К получают согласно способам, приведенным в примере 1 или 2. Потенциал этого пептидного димера оценивали в серии тестов активности ш уйго, включая репортерный тест, тест на пролиферацию, тест на конкурентное связывание и С/ВЕИ-е тест. Эти четыре теста детально описаны ниже.
- 70 014528
Результаты этих исследований активности ш νίΙΐΌ суммированы в табл. 6.
Репортерный тест
Этот тест основан на клеточной линии пре-В-лимфоцитов мыши, происходящей от репортерных клеток Ваίз/ЕроК/ССδРК Гок/1их. Эта линия репортерных клеток экспрессирует химерный рецептор, который содержит внеклеточную часть рецептора ЕРО человека и внутриклеточную часть рецептора человека ССδР. Клеточную линию далее трансформировали конструкцией, несущей репортерный ген люциферазы под Гок-промотором. Активация этого химерного рецептора после добавления стимулирующего кроветворение агента приводит к экспресии репортерного гена люциферазы, и, следовательно, свечению после добавления люциферина - субстрата для люциферазы. Таким образом, уровень активизации ЕРО-К в таких клетках можно количественно измерить посредством измерения активности люциферазы.
Клетки ВаГ3/ЕроК/ССδРК Гок/1их культивировали в среде ЭМЕМ/Б12 (С1Ьсо) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (РВδ; Нус1опе), 10% супернатанта \УЕН1-3 (супернатант из культуры клеток ^ЕН1-3, АТСС # Т1В-68), и пенициллина/стрептомицина. Приблизительно за 18 ч до теста клетки подвергали голоданию, перенося их на среду ЭМЕМ/Б12 с добавлением 10% РВδ и 0.1% супернатанта \УЕН1-3. В день теста клетки однократно отмывали средой ЭМЕМ/Е12 с добавлением 10% РВδ (без \УЕН1-3 супернатанта), затем 1х106 клеток/мл и культивировали в присутствии известной концентрации тестируемого пептида или эритропоэтина в качестве положительного контроля (К & Ό δук!етк 1пс., Мтпеарокк, МИ) в среде ОМЕМ/Р12 с добавлением 10% РВδ (без \УЕН1-3 супернатанта). В тесте параллельно использовали последовательные разведения тестируемого пептида. Чашки с тестами инкубировали 4 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2, после чего к каждой пробе добавляли люциферин (Ь1еабу-С1о; Рготеда, Маб1коп, XVI). После пятиминутной инкубации измеряли испусканиеи света с помощью Раскагб Торсоип! Еитшоте!ег (Раскагб 1пк!гитеп! Со., Эотепегк Сгоуе, Ι11). Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно количества света и проанализировали ее с использованием программного обеспечения Сгарк Раб. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной величины эмиссии света, учитывали как ЕС50.
Тест на пролиферацию
Этот тест основан на клеточной линии ВаГ3 пре-В-лимфоцитов мыши, трансфецированных для экспрессии ЕРО-К человека. Пролиферация полученной таким образом клеточной линии ВаР3/Са14/Е1к/ЕРОК зависит от активации ЕРО-К. Степень клеточной пролиферации количественно определяют, используя МТТ, сигнал в МТТ пропорционален количеству живых клеток.
Клетки ВаР3/Са14/Е1к/ЕРОК культивировали в кршиег флаконах в среде ЭМЕМ/Б12 (С1Ьсо) с добавлением 10% РВδ (Нус1опе) и 2% супернатанта VЕНI-3 (АТСС # Т1В-68). Далее клетки подвергали голоданию в течение ночи в кршиег флаконах при клеточной плотности 1х106 клеток/мл, в среде ОМЕМ/Р12 с добавлением 10% РВδ и 0,1% супернатанта VЕНI-3. Клетки после голодания затем дважды отмывали ЭЫЬессо'к РВδ (С1Ьсо) и ресуспендировали до плотности 1 х 106 клеток/мл в ОМЕМ/Р12 с добавлением 10% РВδ (без VЕНI-3 супернатанта). Аликвоты суспензии клеток по 50 мкл (-50000 клеток) затем перенесли в 96-луночные планшеты. В эти планшеты добавили аликвоты по 50 мкл из серии разведений тестируемых пептидов-миметиков эритропоэтина или 50 мкл эритропоэтина (К & Ό δук!етк 1пс., МшпеароИк, МИ) или Агапекр™ (багЬероеШп а1рка, коммерчески доступный агонист ЕКО-К от Атдеп) в среде ЭМЕМ/Р12 с добавлением 10% РВδ (без νΡΉΙ-3 супернатанта) (конечный объем образца 100 мкл). Например, таким образом могут быть протестированы 12 различных разбавлений, где конечная концентрация тестируемого пептида (или эритропоэтина в контроле) лежит в области от 810 рМ до 0.0045 рМ. Клетки рассевали, а затем инкубировали 48 ч при 37°С. Затем к каждой культуральной чашке добавили 10 мкл МТТ (Коске О1адпоккск) и оставили на еще 4 ч инкубации. Реакцию затем останавливали, добавив 10% δΌδ + 0,01 И НС1. Затем образцы оставили на ночь при 37°С. Оптическую плотность каждого образца спектрофотометрически измерили при длине волны 595 нм. Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно абсорбции и проанализировали с использованием программного обеспечения Сгарк Раб. Концентрацию тестируемого пептида, которой соответствует половина максимальной оптической плотности учитывали как ЕС50.
3. Тест на конкурентное связывание
Определение конкурентного связывания производят тестом, в котором световой сигнал получают в результате близости двух гранул: гранулы-донора стептавидина, несущей биотинилированный ЕРО-Ксвязывающий пептид-трейсер, и акцепторной гранулы, с которой связан ЕРО-К. Свет возникает в результате неизлучательной передачи энергии, в течение которой синглетный кислород при освещении освобождается с первой гранулы и вступает в контакт с синглетным кислородом второй гранулы, вызывая вспышку света. Наборы таких гранул являются коммерчески доступными (Раскагб). Близость гранул происходит по причине связывания ЕРО-К-связывающего пептида-трейсера с ЕРО-К. Тестируемый пептид конкурирует с пептидом-трейсером за связывание с ЕРО-К, предотвращает это связывание, тем самым, уменьшая выделение света.
Более подробно метод описывается следующим образом: 4 мкл из серии последовательных разбавлений тестируемого пептида-агониста ЕРО-К или положительного или отрицательного контролей доба
- 71 014528 вили в лунки на 384-луночном планшете. После этого добавили по 2 мкл/лунку коктейля рецептор/гранулы. Коктейль рецептор/гранулы состоит из 15 мкл 5 мг/мл гранул-доноров стептавидина (Раскагб), 15 мкл 5 мг/мл моноклонального антитела аЫ79 (это антитело распознает часть белка плацентарной щелочной фосфатазы человека, содержащейся в рекомбинантном ЕРΟ-К), акцепторные гранулы, покрытые белком А (белок А связывается с антителом аЫ79; Раскагб), 112,5 мкл разбавленного 1:6,6 рекомбинантного ЕРΟ-К (синтезирован в клетках яичника китайского хомячка как гибридный белок с частью плацентарной щелочной фосфатазы человека, которая содержит целевой эпитоп для аЫ79) и 607,5 мкл буфера А^кадиек! (40 μΜ НЕРЕ8, рН 7,4; 1 μΜ МдС12; 0,1% В8А, 0,05% Т\уееп 20). Перемешали встряхиванием. Добавили 2 мкл на лунку биотинилированного ЕРΟ-К-связывающего пептида-трейсера (конечная концентрация 30 нМ). ЕРΟ-К-связывающий пептид-трейсер (см. в табл. Репортер ЕС50 (рМ)), получили в соответствии со способами, описанными в примере 1, используя 8ЕО Ш ΝΟ: 4.
Пептид-трейсер
ΒίοΙίη-ΟΟΕΥΑίΦΜΟΡΙΤΨνφρΕΚΰχ.
Χ-ΝΗ2
Вюпп-ССЕУАСНМСРтуУСфРЕКО '
Центрифугировали 1 мин для перемешивания. Обернули планшеты с помощью Раскагб Тор 8еа1 и завернули в фольгу. Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После 18 ч измерили световыделение, используя А^каРиек! геабег (Раскагб). Построили кривую концентрации тестируемого пептида относительно световыделения и проанализировали с использованием Сгарк Раб или Ехсе1.
Концентрацию тестируемого пептида, которая приводит к 50% уменьшения выделения света относительно контроля без тестируемого пептида, записали как 1С50.
4. С/ВЕИ-е тест
Передача сигнала от ЕРΟ-К стимулирует дифференцировку стволовых клеток костного мозга в пролиферирующих предшественников красных кровяных клеток. Данный тест измеряет способность тестируемых пептидов стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов из первичных стволовых клеток костного мозга человека. Для этого теста используют серии последовательных разведений тестируемого пептида в среде ΙΜΌΜ (С1Ьсо) с добавлением 10% ЕВ8 (Нус1опе). К пробам из таких последовательных разведений или эритропоэтин в качестве положительного контроля добавляли метилцеллюлозу до итогового объема 1,5 мл. Смесь пептида и метилцеллюлозы затем тщательно перемешали. Затем разморозили аликвоты СЭ34+ (Ро1ейск/СатЬгех) клеток костного мозга человека (100000 клеток/мл). Размороженные клетки осторожно добавили в пробирку на 50 мл к 0,1 мл 1 мг/мл ДНК-зы (8!ет Се11к). Затем к клеткам осторожно добавили 40-50 мл среды ΙΜΌΜ: среду добавляют капля за каплей вдоль стенки пробирки, сначала 10 мл, а затем остальной объем, также медленно и вдоль стенки пробирки. Затем клетки центрифугировали при 900 грт в течение 20 мин, а среду тщательно удалили осторожной аспирацией. Клетки ресуспендировали в 1 мл среды ΙΜΌΜ и рассчитали клеточную плотность на 1 мл в камере Горяева (в камеру помещали аликвоту 10 мкл суспензии клеток, плотность клеток является средним числом х 10000 клеток/мл). Затем клетки разбавили средой ΙΜΌΜ до клеточной плотности 15000 клеток/мл. К каждым 1,5 мл смеси метилцеллюлозы и образца пептида затем добавили 100 мкл разбавленной суспензии клеток (конечная концентрация клеток в среде составила 1000 клеток/мл) и перемешали. Подождали, пока в смеси исчезнут пузыри, затем аспирацией с помощью тупоконечной иглы удалили 1 мл. По 0,25 мл отобранной смеси из каждого образца добавили в каждую из 4 лунок 24-луночного планшета (Еа1соп Ьгапб). Перенесенные на планшеты смеси инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 во влажном инкубаторе в течение 14 дней. Количество колоний эритроидных клеток определяли, используя фазово-контрастную микроскопию (объектив 5х-10х, конечное увеличение 100х). Концентрацию тестируемого пептида, при которой количество сформированных колоний составляет 90% от максимума, относительно положительного контроля - эритропоэтина, регистрировали как ЕС90 [см. табл. 4: С/ВЕИ-е ЕС90].
- 72 014528
Таблица 6. Определение активности пептидных димеров ш У11го
Обозначе- ние соединения Пептидный димер Репортер ЕС50 (пМ) Пролиферация ЕС50 (пМ) Радиоактивный лиганд 1С50 (пМ) с/врие ЕС90 (нм)
Пептид I 1 1 δ (АеОКН^АСНМОРП(1-л^>^РЩМеС^ 195 165 111 3
(8ЕЦ Ю ΝΟ: 2) О Лук
/ О
Пример 12. Тест активности ш νί\Ό
Этот пример описывает различные способы исследований оценки активности и потенциала пептидов агонистов ЕР0-К согласно настоящему изобретению ш νί\Ό. Мономеры и димеры пептидов агонистов ЕР0-Р получают согласно способам, приведенным в примере 1 или 2. Активность этого пептидного димера ш νί\Ό оценивали в серии тестов активности, включая полицитемический эксгипоксический тест и ретикулоцитный тест. Эти два теста детально описаны ниже.
1. Полицитемический эксгипоксический тест на мышах
Активность тестируемых пептидов ш νί\Ό определяли на мышах с помощью полицитемического эксгипоксического теста, адаптированного способа, описанного в Со!ек апй ВапдНат (1961), №1иге 191: 1065-1067. Данный тест определяет способность тестируемого пептида служить в качестве миметика эритропоэтина: то есть активировать ЕР0-Р и индуцировать синтез новых эритроцитов. Синтез эритроцитов количественно оценивают, основываясь на включении радиоактивно меченого железа в гемоглобин новообразованных эритроцитов.
Мыши линии ВЭЕ1 акклиматизировались в окружающих условиях в течение 7-10 дней. Определили массу тела для всех животных и животных со сниженной массой (<15 г) не использовали. Мышей подвергали последующим циклам подготовки в гипобарической камере в общей сложности в течение 14 дней. Каждый 24 часовой цикл состоял из 18 ч при 0,40±0,02% от атмосферного давления и 6 ч при обычном давлении окружающей среды. После такой подготовки мышей содержали еще 72 ч до введения пептидов или эритропоэтина при обычном давлении.
Тестируемые пептиды, или стандартный рекомбинантный эритропоэтин человека, разбавили в буфере-носителе РВ8 + 0,1% В8А (РВ8/В8А). Пептидные мономеры для стокового раствора сначала растворили в диметилсульфоксиде (ПМ80). Группа отрицательного контроля включала одну группу мышей, которым инъецировали только РВ8/В8А, и другую группу мышей, которым инъецировали 1% ЭМ5>0. Группа для каждой дозировки содержала 10 мышей. Мышам подкожно (в загривок шеи) инъецировали 0,5 мл соответствующего образца.
Сорок восемь часов спустя после инъекции образца мышам делали внутрибрюшинную инъекцию 0,2 мл Ее59 (Пироп!, ΝΞΝ), в дозе приблизительно 0,75 мкКюри/мышь. Вес тела мыши определяли 24 ч спустя после введения Ее59, умерщвляли мышей 48 ч спустя после введения Ее59. Кровь отбирали из каждого животного проколом в сердце, определяли гематокрит (в качестве антикоагулянта использовали гепарин). Каждый образец крови (0,2 мл) проанализировали на включение Ее59, используя счетчик гамма-излучения от Раскагй. Мышей, не дающих достоверного ответа (то есть тех мышей, у которых включение радиоактивной метки меньше, чем в группе отрицательного контроля), исключили из набора подходящих данных. Также исключили мышей, которые имели величину гематокрита меньше чем 53% от величины в группе отрицательного контроля.
Результаты получили на наборе из 10 животных для каждой экспериментальной дозы. Среднюю дозу включенной радиоактивности [распадов в минуту (соип!к рег иипШе, СРМ)] вычислили для образцов крови из каждой группы.
2. Ретикулоцитный тест
Для этого теста обычным мышам линии ВПЕ1 в течение трех последовательных дней вводили (0,5 мл, подкожная инъекция) эритропоэтин в контроле или тестируемый пептид. На третий день мышам ввели (0,1 мл, внутрибрюшинная инъекция) железистый декстран (100 мг/мл). На пятый день мышей подвергли анестезии с применением СО2 и отобрали образцы крови пункцией сердца. Процент ретикулоцитов в крови определяли оранжевой окраской тиазола и поточным цитометрическим анализом (программа учета ретикулоцитов). Гематокрит определяли вручную. Скорректированный процент ретикулоцитов определяли, используя следующую формулу:
- 73 014528 % КЕТ1Ссор.р,естео - % ЯЕПСовзекубо X (Нета1осп1адыуюиАь /
НетаЮсгймокмАь)
3. Гематологический тест
Нормальным мышам линии СЭ1 четырьмя еженедельными болюсными внутривенными инъекциями вводили ЕРО для положительного контроля, тестируемый пептид или носитель. Диапазон положительного контроля и доз тестируемого пептида, выраженный в мг/кг, протестировали варьированием концентрации активного компонента в препарате. Введенные объемы составили 5 мл/кг. Контрольная группа на носитель включала двенадцать животных, в то время как во всех остальных группах дозировок было по 8 животных. Ежедневно регистрировали жизнеспособность, и еженедельно - массу тела.
Мышей, которым вводили пептиды, не кормили и затем подвергли анестезии ингаляцией изофурана и отобрали образцы крови через пунктуру сердца или брюшной аорты на первый день (для мышей контрольной группы на носитель) и на 15 и 29 дни (по 4 мыши/группу/день). Кровь перенесли в пробирки марки Уаси1ашег®. Предпочтительным антикоагулянтом является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕВТА).
В образцах крови для конечных точек оценивали измеренный синтез эритроцитов и физиологические показатели, такие как гематокрит (Нс1), гемоглобин (НдЬ) и тотальное число эритроцитов (ККК), используя автоматизированные клинические анализаторы, хорошо известные в данной области техники (например, производимые СоиНег Кс.).
Пример 13. Повышение уровня гемоглобина у животных и здоровых людей-добровольцев (ЗД)
1. Общие понятия
Основываясь на клинических и неклинических данных, пептид I, полностью синтетический агонист рецептора ЕРО, имеет свойство безопасно и эффективно облегчать анемию, возникающую из-за неадекватного производства ЕРО. Предполагается, что пептид I может иметь несколько потенциальных преимуществ над доступными к настоящему времени продуктами ЕРО, включая пролонгированный период полураспада и фармакодинамическую активность с ожидаемым интервалом дозировки 1 раз через 3-4 недели, которые могут быть переведены в улучшения удобства и гибкости применения; уменьшенную вероятность обусловленной антителам эритроцитарной аплазии (риге геб се11 ар1ак1а, РЯСА), поскольку у него нет общей аминокислотной последовательности с эндогенным ЕРО; возможность лечения пациентов с РЯСА, вызванной антителами на коммерчески доступные стимулирующие эритропоэз агенты (СЭА), который перекрестно реагирует с эндогенным ЕРО; и увеличенную стабильность с пролонгированным временем жизни при комнатной температуре по сравнению с белковыми лекарственными препаратами.
Поскольку первичная аминокислотная последовательность пептида I отличается от последовательности рекомбинантного ЕРО человека (^НиЕРΟ), мало вероятно, что он вызовет перекрестный иммунный ответ против эндогенного ЕРО. Хотя он и очень редок, перекрестный иммунный ответ может вызвать серьезные побочные эффекты, связанные с потерей действенности как рекомбинантного, так и эндогенного эритропоэтина. Кроме того, поскольку пептид I - это синтетический пептид, его производство избегает потенциального риска загрязнения лекарства материалом хозяйских клеток, которое может случиться с рекомбинантными белковыми продуктами.
2. Фармакокинетика пептида I у животных
Пептид I является сильным стимулятором эритропоэза с дозозависимой активностью, наблюдаемой после единичного или повторного введения дозы мышам, крысам (нормоцитемическим и нефроэктомированным), собакам, кроликам и обезьянам. Фармакологические исследования на крысах и обезьяны показали, что повышение уровня ретикулоцитов (незрелых ККК) и ККК, измеренное по уровню гемоглобина, пропорционально дозе.
Исследования фармакокинетики на крысах, собаках и обезьянах продемонстрировали устойчивое присутствие в плазме пептида I по сравнению с продаваемыми в настоящее время продуктами ΓΜυΕΓΟ. Период полуэлиминации (ΐ1/2) лежит в диапазоне от 21,5 -30,7 ч у крыс, до 73,7 ч у собак. Пептид I первоначально находится во фракции плазмы. После внутривенного введения 9,87 мг/кг пептида I пятишести нефроэктомированным крысам, ΐ1/2 приблизительно составило 48 ч, клиренс был низким, на уровне 0,763 мл/ч/кг (по сравнению с 1,44 мл/ч/кг для нормоцитемических крыс), приводя к повышенной величине АИС в 1,8.
2. Фармакодинамика и фармакокинетика пептида I у человека
2.1. Описание и методы
Пептид I протестировали на 20 ХНУ в одном исследовании фазы 1. Данное первое исследование пептида I на людях проводилось как рандомизованное, двойное слепое, с контролем плацебо, однократной дозы, внутривенное, с нарастающей дозой, безопасное и толерантное испытание. Первичными целями анализа были оценка безопасности и фармакокинетики пептида I и установление фармакологически активной дозы (ФАД). Когорта из семи мужчин-добровольцев была сформирована для того, чтобы получать единственную дозу пептида I или плацебо в соотношении 5:2. Когортам по возрастающей добавляли уровень дозировки до ФАД, что определяли по увеличению уровня гемоглобина относительно базо
- 74 014528 вого, точка, которая была идентифицирована в качестве ФАД, повторно проверялась на другой когорте добровольцев. Анализ проводили в четырех когортах, которым последовательным образом давали дозировки пептида Ι 0,025, 0,05, 0,1 мг/кг и 0,1 мг/кг, соответственно (одна доза на когорту). Результаты анализа показали, что возрастание уровней гемоглобина и ретикулоцитов было достигнуто на третьей когорте, получившей 0,1 мг/кг пептида Ι. Эта дозировка была повторена на четвертой когорте, чтобы подтвердить результаты, наблюдаемые в третьей когорте. Как таковой, анализ был завершен. Открытые результаты суммированы ниже.
2.2. Результаты по фармакодинамике
Количество ретикулоцитов (абсолютное число и проценты) показало дозозависимое увеличение с возрастанием дозы пептида Ι. Количество ретикулоцитов достигает максимума приблизительно 7 дней спустя введения дозы во всех когортах. Сравнение максимального ответа ретикулоцитов и графики зависимости числа ретикулоцитов от времени (АиС0-14дней и АиС0-28дней) показали значимые различия среди групп дозировки (р<0,05).
Гемоглобиновый ответ и изменение относительно исходного уровня (как среднее, так и максимальное) свыше 28 дней спустя после введения, показали дозозависимое увеличение с возрастанием дозировки пептида Ι, поскольку контрольная группа показывала небольшое уменьшение уровня гемоглобина во время повторного анализа крови, проведенного без внешней сопутствующей стимуляции эритропоэза [одномерный дисперсионный анализ (ΑNΟVΑ), доверительный интервал 0,0001]. Чтобы сравнивать индивидуальные изменения относительно исходного уровня среди всех четырех групп, использовали одномерный ковариацинный анализ (ΑNСΟVΑ) со смешанными моделями. Результаты этих анализов показали значимую зависимость от дозы для всех четырех групп дозировок (доверительный интервал 0,0001), со значимыми различиями между группами 0,025 и 0,1 мг/кг (доверительный интервал 0,0027), а также группами 0,05 и 0,1 мг/кг (доверительный интервал 0,0113). ФАД пептида Ι, которая приводила к увеличению уровня гемоглобина по меньшей мере на 1,0 г/дл, была 0,1 мг/кг.
Испытуемых в когортах 3 и 4 (0,1 мг/кг пептида Ι или плацебо) подвергли анализу на 42-й день после введения. На 42-й день средний уровень гемоглобина возвратился к исходному уровню испытуемых, которым ввели 0,1 мг/кг пептида Ι, но был все еще ниже указанного исходного уровня испытуемых с плацебо. Таким образом, на 42-й день, как и на протяжении всего исследования, различие в отклонении гемоглобина от исходного уровня было >0,5 г/дл между испытуемыми с дозировкой 0,1 мг/кг пептида Ι по сравнению с получавшими плацебо.
Уровень ЕРО в сыворотке скоротечно уменьшился с увеличением дозы пептида Ι. Изменения других фармакодинамических параметров (повышение числа эритроцитов и гематокрита, скоротечное уменьшение содержания ферритина и гемоглобина ретикулоцитов, скоротечное увеличение растворимого белка рецептора трансферрина и скоротечное уменьшение ЕРО) сопутствовали стимулированию эритропоэза.
2.3. Результаты по фармакокинетике
В пятиминутный период после внутривенного введения пептида Ι в дозах 0,025, 0,05 и 0,1 мг/кг концентрация лекарства обычно достигала максимума в период между 5 мин и 1 ч после начала инфузии. В группе дозировки 0,025 мг/кг концентрация пептида Ι достигала максимума в период между 5 и 15 мин, тогда как для дозы 0,1 мг/кг 1шах достигало 1 ч. После достижения Сшах концентрация в плазме снижалась и обычно была определима (>25нг/мл) вплоть до 96 ч после введения дозы 0,025 мг/кг, вплоть до пятого дня для дозы 0,05 мг/кг и вплоть до седьмого дня для дозы 0,1 мг/кг. Расчетный период полураспада показал небольшое увеличение при дозе 0,1 мг/кг: с разбросом 16,7-21,9 ч (в среднем 19,2 ч) при дозе 0,025 мг/кг, 15,3-25,1 ч (в среднем 18,7 ч) при дозе 0,05 мг/кг дозой и 17,7-33,1 ч (в среднем 23,5 ч) при дозе 0,1 мг/кг.
Распределение и выведение лекарства, по-видимому, не подчиняется стандартной кинетике одного или двух компартментов. Кинетику первого порядка наблюдали только при низких концентрациях лекарства, предполагая насыщение процессов метаболизма/элиминации при концентрации в плазме свыше приблизительно 400 нг/мл. Объем распределения показал небольшое изменение в зависимости от дозы (средние значения 2165, 1903 и 2010 мл для дозировок 0,025, 0,05 и 0,1 мг/кг, соответственно). Клиренс из плазмы показывал с дозой небольшое уменьшение, со средним геометрическим 78,0, 70,7 и 59,2 мл/ч для дозировок 0,025, 0,05 и 0,1 мг/кг, соответственно. Дисперсионный анализ нормированной по дозе величины Сшах и данные АиС(0-бесконечНость) показали, что Сшах имеет линейную зависимость от дозы. Однако АИС(0-бесконечность) свидетельствовал о нелинейности при наибольшей дозе 0,1 мг/кг, возможно, связанной с наблюдаемым небольшим уменьшением клиренса лекарства при более высоких дозах.
2.4. Результаты по безопасности
Пятнадцать испытуемых (4 из 8 получающих плацебо и 11 из 20 получающих пептид Ι) испытали в общей сложности 28 неблагоприятных событий (НС) (6 в группе плацебо и 22 в группе пептида Ι). Для испытуемых, которым вводили пептид Ι, наиболее часто зарегистрированными событиями были головная боль (4/20, 20,0%) и боль в животе (2/20, 10,0%), тошнота (2/20, 10,0%) и фарингит (2/20, 10,0%). Все НС, кроме одного, были оценены как мягкие (Уровень 1). Большинство НС, наблюдаемых среди получа
- 75 014528 телей пептида Ι (15/22), считались, вероятно, не имеющими отношения к анализируемому лекарству, пептиду Ι. Не было отмечено никакого различия в частоте, остроте или распределению НС между 4 группами. Не было отмечено никаких серьезных неблагоприятных событий (СНС) или исключения из анализа вследствие НС; тем не менее, для одного испытуемого прием анализируемого лекарства был прекращен при дозе пептида Ι 0,025 мг/кг из-за мягкой побочной реакции лекарства. Этой реакцией, которая начиналась в течение 2 мин после инъекции, было покраснение, начинающееся на груди, распространяющееся на лицо, с ощущением чувства жара, дискомфорта и першения в горле. В соответствии с мерами предосторожности, для этого испытуемого инъекции были прекращены. Симптомы прошли спонтанно и быстро. Никакое терапевтическое вмешательство не потребовалось. Не было никаких изменений в показателях жизненно важных функций. Лабораторные параметры были в норме, включая дополнительные иммунологические испытания; следовательно, специфическая природа этой реакции не может быть объяснена. Аналогичные (или более острые) лекарственные реакции наблюдаются для многих препаратов, включая другие СЭА. Кроме того, пациенты должны наблюдаться в течение внутривенного введения пептида Ι, инъекция должна быть прекращена, если пациент демонстрирует аналогичные симптомы.
Один получатель плацебо и один получатель пептида Ι принимали соответствующие медикаменты против мягкой головной боли и мягких брюшных судорог, соответственно. Не было никаких клинически значимых изменений в показателях жизненно важных функций, электрокардиограммах (ЭКГ) или лабораторных значениях. Ни один из участвующих в этом испытании не вырабатывал специфические антитела на Пептид Ι.
2.5. Итоги
В итоге, пептид Ι оказался безопасным и хорошо переносился после однократных внутривенных дозировок 0,025, 0,05 или 0,1 мг/кг, с профилем безопасности, как у плацебо. Результаты фармакокинетики показали период полураспада, колеблющийся приблизительно от 15 до 33 ч, со средним значением 23,5 ч при дозе 0,1 мг/кг. Медиана была сравнимой для всех доз спустя 15 мин после начала инфузии. Оказалось, что Стах имеет линейную зависимость от дозы; оказалось, что АиС(0-бесконечНость) является нелинейной при дозе 0,1 мг/кг. Кинетику первого порядка наблюдали только при низких концентрациях лекарства, предполагая насыщение процессов метаболизма/элиминации при концентрации в плазме > 400 нг/мл. Пептид Ι показал на ретикулоцитах фармакологическую активность при всех оцениваемых дозах; обычно ответы были дозозависимыми, с увеличением дозы ответы были больше и более длительными. Группа дозировки 0,1 мг/кг была определена в качестве ФАД для ЗД, поскольку она была связана с клинически и статистически значимым увеличением уровня гемоглобина относительно исходного уровня, со средним максимальным увеличением относительно исходного уровня 1,36 ± 0,39 г/дл среди 10 получателей пептида Ι. Изменения других параметров фармакодинамики (повышение количества эритроцитов и гематокрита, скоротечные уменьшения содержания ферритина и гемоглобина в ретикулоцитах, скоротечное увеличение растворимого белка рецептора трансферрина и скоротечное уменьшение ЕРО), сопутствовали стимулированию эритропоэза.
Во всей своей полноте в настоящий патент включены ссылкой постер и реферат # 0470, представленные на 10-м Ежегодном Конгрессе Европейской Ассоциации Гематологии в Стокгольме 4 июня 2005 г.
Пример 14. Увеличение уровня гемоглобина у ожидающих и получающих гемодиализ пациентов и онкологических пациентов
1. Пациенты до диализа
Будет проведено рандомизованное, двойное слепое, с контролем плацебо, с постепенным повышением дозы исследование пептида Ι на предмет безопасности, фармакодинамики и фармакокинетики в случае однократного и внутривенного введения пациентам с хроническим заболеванием почек (ХЗП), которые не получают гемодиализа и не имели ранее лечения с помощью СЭА. Это исследование оценит профиль безопасности однократного внутривенного введения различных дозировок пептида Ι пациентам с ХБП, которые не получают гемодиализ (пациенты до диализа). Это исследование также позволит оценить ответ на однократную дозу пептида Ι по параметрам фармакодинамики, включая гемоглобин, ретикулоциты и запасы железа; определить профили фармакокинетики однократной дозы пептида Ι, внутривенно введенной пациентам до диализа; определить фармакологически активную дозу при таком способе введения, например дозу, которая приводит к увеличению уровня гемоглобина относительно исходного > 1 г/дл у >70% пациентов до диализа.
Результаты исследования будут включать: неблагоприятные события, серьезные неблагоприятные события, параметры фармакокинетики, включая Стах, АиС0-бесконечность, ΐ1/2β, νά и СЬ; фармакологические параметры, включая уровни ретикулоцитов, гемоглобина, содержание гемоглобина в ретикулоцитах, и измерение запасов железа в сыворотке (например, сывороточный ферритин, насыщение трансферрина и белок рецептор трансферрина); среднее изменение гемоглобина относительно исходного уровня; максимальное изменение гемоглобина относительно исходного уровня; доля обработанных пациентов, у которых увеличение уровня гемоглобина относительно исходного достигает > 1 г/дл; и частоту переливаний крови.
- 76 014528
Пациенты, выбранные для анализа, будут пациентами до диализа в возрасте от 18 до 75 лет с уровнем гемоглобина >9 г/дл и <11 г/дл вследствие хронического заболевания почек, которые ранее не получали лечения с помощью СЭА и имеют приемлемые критерии. В каждой когорте будет 9 пациентов, пациентам произвольно будет назначены либо однократная доза пептида I (п=7), либо плацебо (п=2). Для того чтобы гарантировать доступность данных в течение как минимум 22 дней у 5 пациентов, получивших пептид I, на когорту, третий и последующие пациенты в когорте, которые закончат участие в исследовании до 22-го дня будут заменены. Каждый замещающий пациент будет направлен в ту же лечебную группу, что и заменяемый пациент.
Пациентов, которые закончат анализ после 22-го дня, не будут замещать.
Вплоть до 6 когорт разных уровней дозировки (вплоть до 4 запланированных уровней дозировки и запас на 2 дополнительных более низких, промежуточных, и/или повторяющих [подтверждающих] уровня дозировок) планируется последовательно сформировать, как это определено Независимым Наблюдателем за Безопасностью, Исследователем и Спонсором. В это исследование может быть вовлечено максимум 54 испытуемых пациента.
Ожидается, что каждый пациент будет участвовать в исследовании в течение по меньшей мере 28 дней после введения пептида.
Каждый пациент получит однократную дозу пептида I или плацебо. Запланированные последовательные уровни дозы пептида составляют:
Доза Пептида I
0,05
0,1
0,2
0,3
Дополнительная подтверждающая, промежуточная, или более низкая доза
Дополнительная подтверждающая, промежуточная, или более низкая доза
Это рандомизованное, двойное слепое, с контролем плацебо, с постепенным возрастанием дозы исследование с формированием когорт (из 9 пациентов до диализа) вплоть до дозы С. В каждой когорте пациенты будут наблюдаться до 29-го дня или до стабилизации неблагоприятных событий, которые произойдут позже. Уровни гемоглобина будут наблюдать у всех пациентов до возвращения поднятых уровней в пределы 0,5 г/дл от исходных уровней.
Исходную концентрацию гемоглобина определяют как среднее значение трех последних измерений уровня гемоглобина до приема исследуемого лекарства. В течение анализа, изменения уровня гемоглобина для инициации когорты или решения об остановке требует подтверждения следующей последовательной величиной концентрации гемоглобина.
Если уровень гемоглобина у пациента достигнет 14 г/дл, пациент может быть подвергнут флеботомии, если это клинически показано. Если уровень гемоглобина у пациента достигнет 16 г/дл (подтвержденный уровень), пациент должен быть подвергнут флеботомии.
После введения пептида первой когорте, последующая регистрация следующей когорты на следующем уровне дозировки будет основана на протоколе, определяющем критерии для повышения дозы. Повышения дозы в когорте до следующего уровня может быть остановлено, основываясь на протоколе, определяющем критерии остановки исследования. Независимый наблюдатель за безопасностью будет просматривать открытые для него клинические и лабораторные данные на постоянной основе, чтобы определять, когда встретятся критерии для повышения дозы или остановки.
Клинический персонал Исследователя и Спонсора не будет иметь доступа к информации, относящейся к назначению индивидуального лечения для пациента, например такой как определенные для пациента фармакокинетические данные и результаты гематологии, параметры содержания железа, включая гематокрит, гемоглобин, среднюю концентрацию частиц гемоглобина, средний гемоглобин частицы, средний объем частиц, количество ретикулоцитов, содержание гемоглобина в ретикулоцитах, и результаты о запасах железа включая ферритин, насыщение трансферрина и белок рецептор трансферрина); однако этот персонал может просматривать результаты до идентификации этих параметров в течение исследования. Этот персонал не будет иметь доступа к идентифицированным результатам пациента по этим параметрам, с тем чтобы исключить субъективное трактование идентифицированных по пациентам результатов при назначении лечения.
Начиная с момента, когда все обследуемые пациенты (не менее чем 7) в когорте достигнут 22-го дня, для следующей когорты допускают повышение дозы, если не обнаружено никаких угроз для безопасности и ни один пациент в когорте не достиг повышения уровня гемоглобина >1,0 г/дл; или все пациенты, которые получали пептид I, достигли повышения уровня гемоглобина > 1,0 г/дл относительно исходного уровня, демонстрируя либо стабильность (в пределах 0,5 г/дл от максимальной величины гемо
- 77 014528 глобина) или обратимость (уменьшение относительно максимальной величины гемоглобина) при как минимум двух точках во времени.
Зачисление новых пациентов в текущую когорту и повышение до новой дозы будут прекращено, если встретится любой из следующих критериев: два или более пациента в когорте имеют неблагоприятные события уровней 3 или 4, связанные с пептидом I; два или более пациента в когорте, которые получают пептид I, имеют повышение уровня гемоглобина >2,0 г/дл (повышение относительно исходного уровня) в течение любого 4 недельного периода; или два или более пациента в когорте, которые получают пептид I, превышают верхний предел заданного диапазона гемоглобина (>13 г/дл).
Если не обнаружено никаких угроз для безопасности для того, чтобы изучить подтверждающие (повторяющие), более низкие, или промежуточные дозировки, могут быть введены дополнительные когорты из 9 пациентов после того, как все обследуемые пациенты (не менее чем 7) в когорте достигнут 22го дня.
Ожидается, что для пациентов до диализа, ФАД будет определена в размере от 0,025 до 0,2 мг/кг, возможно 0,05-0,1 мг/кг, возможно от 0,067 до 0,075 мг/кг.
2. Пациенты, получающие диализ
Открытое, проводимое в нескольких центрах, последовательное, направленное на поиск дозировки исследование безопасности, фармакодинамики и фармакокинетики пептида I при его внутривенном введении для поддерживающего лечения анемии у хронических пациентов на гемодиализе, будет выполнено для того, чтобы определять диапазон ежемесячного внутривенного назначения дозировок пептида I, которые поддерживают уровень гемоглобина в пределах выше 1,0 г/дл или нижеуказанного исходного уровня у пациентов на гемодиализе, уровень гемоглобина которых стабилен благодаря препарату Ероебп аба. Этот анализ также будет оценивать профиль безопасности вплоть до 3 доз пептида I, назначенного внутривенно пациентам на гемодиализе; и оценивать профиль фармакокинетики вплоть до 3 доз пептида I, назначенного внутривенно пациентам на гемодиализе (в подмножестве из обследуемых пациентов).
Результаты исследования будут включать среднее еженедельное изменение уровня гемоглобина относительно исходного; число (%) пациентов с изменением гемоглобина в пределах 1,0 г/дл выше или ниже исходного уровня на 13-й неделе; число (%) пациентов, у которых уровень гемоглобина на 13-й неделе поддерживается в пределах 9,5-13,0 г/дл; число (%) пациентов без корректирования дозировки в течение исследования и число (%) пациентов с увеличением или уменьшением дозировки в течение исследования; частоту переливаний крови; дополнительные фармакологические параметры, включая количество ретикулоцитов (абсолютное и АИС), содержание гемоглобина в ретикулоцитах, и измерение запасов железа в сыворотке (например, сывороточный ферритин, насыщение трансферрина, и белок рецептор трансферрина); неблагоприятные события; серьезные неблагоприятные события; параметры фармакокинетики, включая Стах, АиС0-бесконечность, ΐι/2ρ, Уб, Укк и СЬ (в подмножестве из обследуемых пациентов). Результаты анализов фармакокинетики и фармакодинамики будут использованы для того, чтобы определять предварительный показатель конверсии, который наилучшим образом предсказывает ежемесячную дозу пептида I, основываясь на еженедельной дозе Ероебп а1£а.
Пациенты, выбранные для исследования, будут пациентами на гемодиализе в возрасте 18 лет и старше со стабильным уровнем гемоглобина, который поддерживают коммерчески доступным препаратом Ероебп аба, и имеют приемлемые критерии. До 4 когорт по 15 пациентов на когорту последовательных уровней дозировки планируется зачислить в от 3 до 10 клинических центров.
Для того чтобы гарантировать доступность данных как минимум у 10 пациентов на когорту, получивших 3 дозы пептида I, шестой и последующие пациенты в когорте, которые закончат участие в исследовании до получения 3-й дозы будут заменены, вплоть до максимума из 4 замен. Пациенты, которые выбыли из исследования после получения 3-й дозы, не будут заменяться.
Первоначально планируют последовательно сформировать две когорты разных уровней дозировки. В зависимости от наблюдаемого профиля безопасности и фармакологического ответа, до двух дополнительных когорт по 15 пациентов в каждой может быть добавлено для того, чтобы изучить более низкие, промежуточные, и/или повторяющие (подтверждающие) уровни дозировки, и/или частоту приема.
Минимум 30 и максимум 60 обследуемых пациентов могут быть вовлечены в это исследование. Ожидается, что каждый пациент будет участвовать в исследовании в течение приблизительно 15 недель, следующих за 4-недельными периодом скрининга. Запланирована поправка на удлинение продолжительности приема препарата в течение дополнительных 12 недель, ожидая доступности вспомогательных данных.
Прием пептида I будет назначаться каждые 4 недели в общей сложности три раза в виде быстрой внутривенной болюсной инъекции свыше 30 с в течение последних 15 мин диализа. Каждый пациент в когорте получит открытую дозировку пептида I, начиная от предварительно определенного с помощью коэффициента пересчета пептид Еаба-Ероебп. Доза будет увеличена или уменьшена для следующей когорты, основываясь на отношении дозировки и ответа, наблюдавшемся в предыдущей когорте. Запланированный стартовый уровень дозировки пептида I после пересчета составляет
- 78 014528
Дозировка пептида Ι может оыть скорректирована для индивидуальных пациентов следующим образом. Начиная с третьего приема пептида Ι, дозировка будет повышена на 25%, если подтвержденное уменьшение гемоглобина у пациента >1,0 г/дл от исходного уровня или подтвержденное уменьшение гемоглобина у пациента >0,5 г/дл от исходного уровня до уровня ниже 11 г/дл. Начиная с 3-й дозы исследуемого лекарства, дозировка будет уменьшена на 25%, если подтвержденный уровень гемоглобина пациента возрастает > 1,5 г/дл от исходного уровня из базовой строки или подтвержденное увеличение гемоглобина у пациента >0,5 г/дл от исходного уровня до уровня свыше 12 г/дл. Следующая доза будет уменьшена на 25%, если в любое время в течение исследования подтвержденное увеличение гемоглобина у пациента > 1,0 г/дл (повышение относительно исходного уровня) в течение периода любых двух недель. Если в любое время в течение исследования подтвержденный уровень гемоглобина пациента превышает 12,5 г/дл, следующий прием будет задержан, пока гемоглобин не уменьшится до 12,0 г/дл и дозировка будет уменьшена на 25%.
Исходную концентрацию гемоглобина определяют как среднее трех последних еженедельных значений гемоглобина до диализа, собиранных в течение трех недель до приема исследуемого лекарства. В течение исследования изменения уровня гемоглобина для назначения индивидуальной дозы или инициации когорты или принятие критериев остановки требуют в качестве подтверждения повторения величины гемоглобина в любое время в течение 7 дней.
Это открытое, с постепенным повышением дозы исследование с 2-4 получающими лечение когортами из 15 пациентов на гемодиализе на когорту. Каждый пациент внутривенно получит дозу пептида Ι каждые 4 недели, в общей сложности 3 раза. После получения первой дозы пептида Ι пациенты будут проходить осмотр, по меньшей мере, еженедельно во время всего исследования. В течение исследования, статус по железу будут поддерживать в соответствии с руководством по лечению заболевания почек К1Бпеу Б1кеаке 0и!сотек ОнаШу [п111а(1уе (Κ/Ω0ΟΙ).
Пациенты будут наблюдаться как минимум 42 дня после последнего назначения пептид Ι или до стабилизации неблагоприятных событий. После прекращения лечения, уровень гемоглобина наблюдают у всем пациентам до тех пор, пока он не вернется в заданный диапазон.
Если уровень гемоглобина у пациента (подтвержденный уровень) достигнет 14 г/дл, пациент может быть подвергнут флеботомии, по усмотрению Исследователя. Если уровень гемоглобина у пациента достигнет 16 г/дл (подтвержденный уровень), пациента подвергнут флеботомии. Способ флеботомии будет сделан в соответствии со стандартной клинической практикой медицинского центра. Объем выпущенной крови будет документирован. Подвернутые флеботомии пациенты прекратят получение пептида Ι и их данные по фармакодинамике за период после флеботомии будут исключены из анализа.
После исследования первой когорты последующее формирование следующей когорты основано на определяемом критериями протокола повышении и снижении дозировки. Если подходящим окажется уровень дозировки, полученный по коэффициенту пересчета, этот уровень дозировки может быть повторен на подтверждающей когорте. Независимый наблюдатель за безопасностью и спонсор будут на постоянной основе просматривать клинические и лабораторные данные, чтобы определить, когда будут встречены критерии повышения или снижения дозировки, введения дополнительной когорты, или остановки исследования.
Начиная с данных к 7-й неделе о зачислении в когорту шести или более пациентов, зачисление в текущую когорту может быть прекращено, и допускается повышение дозировки в следующей когорте,
- 79 014528 если независимым наблюдателем за безопасностью не обнаружено никаких угроз для безопасности, и комбинированные 6 или более пациентов имеют подтвержденное уменьшение гемоглобина более чем на 1,0 г/дл от исходного уровня на 7-й неделе или позднее.
Начиная с данных к 7-й неделе о зачислении в когорту шести или более пациентов, зачисление в текущую когорту может быть прекращено, и допускается снижение дозировки в следующей когорте, если независимым наблюдателем за безопасностью не обнаружено никаких угроз для безопасности и комбинированные 6 или более пациентов имеют подтвержденное увеличение гемоглобина > 1,0 г/дл (от исходного уровня) до величины гемоглобина > 13,0 г/дл, произошедшее на 7-й неделе или подтвержденное увеличение гемоглобина > 1,0 г/дл (от исходного уровня) в течение периода любых двух недель после вступления пациента в исследование.
Начиная с данных к 7-й неделе о зачислении в когорту десяти или более пациентов, если независимым наблюдателем за безопасностью не обнаружено никаких угроз для безопасности, может быть введена дополнительная когорта, для того, чтобы изучить более низкий или промежуточный (между текущим и изученным прежде) коэффициент пересчета, и/или частоту назначения. Как максимум могут быть введены две дополнительные когорты.
Начиная с данных к 7-ой неделе о зачислении в когорту десяти или более пациентов, может быть введена подтверждающая когорта, использующая тот же коэффициент пересчета, чтобы повторить опыт с тем же коэффициентом пересчета и/или частотой назначения, если независимым наблюдателем за безопасностью не обнаружено никаких угроз для безопасности, и не выполняется ни одно условие повышения или снижения дозировки.
Зачисление новых пациентов в текущую когорту и повышение до новой дозы будет прекращено, если встретится следующий критерий: три пациента в когорте имеют неблагоприятные события уровней 3 или 4, связанные с пептидом Ι.
Ожидается, что для получающих диализ пациентов, ФАД будет определена в размере от 0,025 до 0,2 мг/кг, возможно 0,05-0,1 мг/кг, возможно от 0,067 до 0,075 мг/кг.
Онкологические пациенты
Открытое, проводимое в нескольких центрах с возрастанием дозы исследование безопасности, фармакодинамики и фармакокинетики при подкожном введении пептида Ι онкологическим пациентам с вызванной химиотерапией анемией (ВХА) будет проведено, чтобы определить дозу пептида Ι, которую нужно вводить подкожной инъекцией (ПИ) каждые три недели для достижения гемоглобинового ответа у пациентов с ВХА. Другие цели включают оценку профиля безопасности вплоть до 4 доз пептида Ι, вводимого раковым пациентам подкожно каждые три недели, получающих сопутствующую миелосупрессионную химиотерапию; определение изменений уровня гемоглобина относительно исходного у пациентов с ВХА с различными дозами пептида Ι; определение доли пациентов, которые имеют гемоглобиновый ответ на пептид Ι (как это определено в Результатах); определение дозы подкожно вводимого пептида Ι, которая увеличивает и поддерживает гемоглобин в заданном диапазоне 11-13 г/дл для пациентов с ВХА; оценка профиля фармакокинетики вплоть до 4 доз подкожно вводимого пациентам с ВХА пептида Ι (в подмножестве из обследуемых пациентов) и изучение эффекта частоты дозировки и парентерального замещения железа на активную дозировку пептида Ι.
Результаты исследования будут включать долю пациентов из получавшей пептид группы, которые имеют повышение уровня гемоглобина > 2 г/дл или которые имеют повышение уровня гемоглобина > 1 г/дл до по меньшей мере 12 г/дл на 4-й, 9-й и 12-й неделях при отсутствии переливания ККК в течение 28 предшествующих дней; долю пациентов, которые имеют увеличение уровня гемоглобина > 1 г/дл относительно исходного уровня на 4-й, 9-й и 12-й неделях при отсутствии переливания ККК в течение 28 предшествующих дней; долю пациентов, у которых уровень гемоглобина на 4-й, 9-й и 12-й неделях поддерживается в заданном диапазоне 11-13 г/дл; долю величин гемоглобина в заданном дипазоне 11-13 г/дл после 4-й недели; среднее изменение гемоглобина относительно исходного уровня; частоту переливаний крови; дополнительные фармакологические параметры, включая количество ретикулоцитов (абсолютное и АИС), содержание гемоглобина в ретикулоцитах; изменение измеримых запасов железа, например, насыщение трансферрина и сывороточный ферритин; неблагоприятные события; серьезные неблагоприятные события; и параметры фармакокинетики в подмножестве обследуемых пациентов, включая Стах, АИС^, АИС0-М, ΐ1/2β (период полуэлиминации), νά (явный объем распределения), ν§8 (стационарный объем) и СЬ (клиренс).
Выбранные для исследования пациенты будут иметь солидные опухоли или лимфомы, возраст 1880 лет, уровень гемоглобина >9 г/дл и <11 г/дл вследствие химиотерапии, они также не получали лечения с помощью СЭА в течение последних 90 дней и имеют приемлемые критерии, им будет назначен пептид Ι в начальной дозировке или в последующей дозировке, одобренной Медицинским Наблюдателем (МН). Для того чтобы гарантировать доступность данных в течение 12 недель как минимум у 10 пациентов, из группы получающих пептид Ι, шестой и последующие пациенты в группе, которые закончат участие в исследовании до 8-й недели будут заменены, вплоть до максимума из 5 замен. Каждый замещающий пациент будет направлен в ту же лечебную группу, что и заменяемый пациент. Вплоть до 4 групп с от
- 80 014528 крытой информацией о лечении по 15 пациентов впоследствии может быть добавлено, чтобы изучать более низкие, промежуточные и/или повторяющие дозировки и/или частоты назначения пептида Ι и/или парентеральное замещение железа, чтобы поддерживать насыщение трансферрина на уровне 25-50%. Минимум 30 и максимум 90 пациентов (не включая замененных) могут быть вовлечены в это испытание, если будут изучены все возможные режимы дозировки.
Ожидается, что каждый пациент будет участвовать в исследовании вплоть до 12 недель, после 4 недель периода скрининга.
Последовательные когорты из пятнадцати пациентов будут получать повышающиеся дозировки пептида Ι. Открытая дозировка будет вводиться подкожной инъекцией каждые 3 недели в общей сложности четыре раза (на 1-й, 4-й, 7-й и 10-й неделях исследования). Обычно пептид Ι должен быть назначен в первый день цикла химиотерапии. Начальная дозировка пептида Ι и частота назначения основываются на данных из Фазы 1 испытания на здоровых добровольцах, а также на предсказанном ответе, смоделированном по данным фармакокинетики/фармакодинамики кроветворного ответа на пептид Ι и другие СЭА. Запланированные уровни дозировки пептида Ι и количество пациентов в каждой группе:
№ Лечение Доза (мг/кг) ζ)3\ν
15 Пептид I 0,1 мг/кг
15 Пептид I 0,2 мг/кг
15 Пептид I 0,4 мг/кг
15 Пептид I 0,6 мг/кг
Пациенты будут наблюдаться в течение 28 дней после последнего приема, или до стабилизации неблагоприятных событий, или величины гемоглобина между 11-13 г/дл. Не допускается никакого увеличения дозы. После 4-й недели, если для поддержания гемоглобина в заданном диапазоне требуется переливания ККК, пациент будет исключен из исследования лекарства, ему вернут стандартный медицинский уход и для безопасности будут наблюдать в течение дополнительных 28 дней. Если в любое время в течение исследования гемоглобин пациента возрастает > 1,0 г/дл в течение периода любых двух недель, следующая доза будет задержана, пока гемоглобин не стабилизируется (увеличение в течение недели < 0,5 г/дл) и дозировка будет уменьшена на 50%. Исходная концентрация гемоглобина определена как среднее значение двух последних еженедельных величин гемоглобина, взятых в течение недели до приема исследуемого лекарства (например, скрининг и исходная величина). В течение исследования изменения в уровне гемоглобина для инициации новой когорты или принятия критериев остановки требуют подтверждения в течение 7 дней следующим значением уровня гемоглобина.
Данное открытое, проводимое в нескольких центрах исследование, в котором будет участвовать до 6 групп по 15 пациентов с ВХА на группу. В начальных группах лечения пептид Ι будет открыто назначаться подкожной инъекцией каждые 3 недели до итога в 4 приема. После первого приема препарата пациентов будут осматривать, по меньшей мере, еженедельно во время всего исследования. Пациенты будут наблюдаться как минимум 28 дней после последнего приема исследуемого лекарства, или до стабилизации неблагоприятных событий или величины гемоглобина между 11-13 г/дл. Если уровень гемоглобина у пациента (подтвержденный уровень) достигнет 14 г/дл, пациент может быть подвергнут флеботомии, по клиническим показателям, объем выпущенной крови документируют. Подвернутые флеботомии пациенты прекращают исследуемое лекарство, и их данные по фармакодинамике за период после флеботомии будут исключены из анализа. Медицинский наблюдатель и спонсор будут отслеживать данные о безопасности и фармакодинамике на постоянной основе, чтобы определить, когда будут встречены критерии остановки исследования.
После 6 или более пациентов, зачисленных в когорту по меньшей мере к 6-й неделе продолжения исследования (то есть по меньшей мере три недели спустя после второго приема препарата), зачисление в текущую когорту могут быть прекращено и допускается повышение дозировки в следующей когорте, если выполняются условия: МН не обнаружил никаких угроз для безопасности; и 6 или более пациентов подверглись переливанию крови после 4-й недели или имеют подтвержденное повышение уровня гемоглобина <1 г/дл к 6-й неделе.
После 6 или более пациентов, зачисленных в когорту по меньшей мере к 6-й неделе продолжения исследования (то есть, по меньшей мере, три недели спустя после второго приема препарата), зачисление в текущую когорту будет прекращено и допускается снижение дозировки в следующей когорте до более низкого уровня, если выполняются условия: происшествие по меньшей мере трех НС 3-го или 4-го уровней возможно имеет отношение к пептиду Ι или если ММ идентифицирует любое специфическое расстройство, связанное с пептидом Ι; или в общей сложности 6 или более пациентов имеют подтвержденный уровень гемоглобина > 13,0 г/дл (не связанный с переливанием крови), или имеют подтвержденное повышение уровня гемоглобина > 1,0 г/дл в течение периода любых двух недель (не связанное с переливанием крови).
- 81 014528
Если МН и спонсором не обнаружено никаких угроз для безопасности, может быть введено до двух дополнительных групп открытого лечения по 15 пациентов, чтобы изучить более низкие, промежуточные (между текущей и изученными прежде) или повторяющие уровни дозировки. Кроме того, как только будет определена активная доза, назначаемая каждые три недели, может быть введено до двух дополнительных когорт для того, чтобы определить относительный эффект той же самой дозировки, назначенной в этой фракции с другой частотой (например, 4/3 от 3 недельной дозы назначают каждые 4 недели). Эффект парентерального назначения железа для того, чтобы достигнуть 25-50% насыщения трансферрина, также может быть изучен на отдельной когорте.
Ожидается, что для онкологических пациентов ФАД будет определена в размере от 0,075 до 0,5 мг/кг, возможно 0,2-0,4 мг/кг, возможно 0,25 мг/кг.
Настоящее изобретение не ограничиваются областью описанных выше специфических реализаций. Напротив, из предшествующего описания и сопутствующих рисунков и формул специалистам в данной области техники станут ясны различные модификации изобретения в дополнение к вышеописанным. Такие модификации находятся в пределах области, определенной формулой настоящего изобретения.
Исходя из этого понятно, что все значения являются приблизительными и приведены только для описания.
В описании настоящего изобретения приведены и рассмотрены многочисленные ссылки, включающие патенты, патентные приложения и различные публикации.
Цитирование и/или обсуждение приведенных в этом разделе и на протяжении всего настоящего текста ссылок предложено лишь для того, чтобы разъяснить описание настоящего изобретения, но не допускает трактовки, что какое-либо изобретение с подобной ссылкой является предшествующим изобретением для настоящего изобретения. Все источники, приводимые и обсуждаемые в данной спецификации, включаются выше ссылкой во всей их полноте и в том же объеме, как если бы каждый источник был бы включен ссылкой индивидуально.
- 82 014528
Перечень последовательностей <110> АФФИМАКС ИНК.
делиг, Анне-мария Стед, Ричард лезер, керстин Вудберн, Катерин Барнетт, Роберт
<120> СОСТАВЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ПЕПТИДЫ, СТИМУЛИРУЮЩИЕ РЕЦЕПТОР ЭРИТРОПОЭТИНА И ИХ
ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 04279/2202975-ИО0
<150> <151> 60/687,655 2005-06-03
<160> 13
<170> патентная версия 3.3
<210> <211> <212> <213> 1 20 ПРТ искусственная
<22О> <223> синтетический пептид
<220> <221> <222> <223> М15С_ЕЕАТиКЕ (1)- -(1) Хаа 13 Ы-асе1у1д1ус1пе
<220> <221> <222> <223> М15С_ГЕАТиКЕ (13)..(13) хаа 1з 1-парйгКу1а1ап1пе
<400> 1
хаа с!у ьеи туг А1а Суз Нтз мег С1у Рго Не ТЬг Хаа Уа1 Суз С1п
10 15
Рго 1_еи Агд 1_уз
<210> <211> <212> <213> 2 21 ПРТ искусственная
<220> <223> зупгКеттс ргогетп
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ (1). . (1) хаа 1з м-асегу1д1ус1ле
<220> <221> <222> <223> М15С^ЕЕАТиКЕ (13)..(13) хаа 15 1-парЬг11у1а1ап1пе
- 83 014528
<220> <221> <222> <223> МХ5С_РЕАТ11КЕ (20)..(20) Хаа 15 Ы-теТйуТдТустпе
<400> 2
хаа е!у беи туг А1а суз нтз мет 61у рго 11е тКг хаа Уа1 Суз 61 η
1 5 10 15
рго ьеи дгд хаа ьуз <210> 3 <211> 20 <212> ПРТ <213> искусственная <220>
<223> зупТИеТтс ргоТетп
<220> <221> <222> <223> М15С_ГЕАТиКЕ (1)..(1) Хаа 15 М-асеТу1д1ус1'пе
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<222> ¢13)..(13)
<223> Хаа Ϊ5 1-пар11СИу1а1ат'пе
<220>
<221> М15С_РЕАТийЕ
<222> (20)..(20)
<223> Хаа 15 м-тетКу1д!ус1пе
<400> 3
Хаа 61 у Ьеи Туг А1а Суз ΗΊ5 МеТ 61у Рго 11е ТНг Хаа Уа1 Су5 61П
1 5 10 15
Рго 1_еи Агд Хаа
20
<210> 4
<211> 20
<212> ПРТ
<213> искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<222> (1)-.(I)
<223> ЫоттпуТатес!
<400> 4
61 у 61 у (.ей туг А1а суз нтз мет 61 у рго 11е тНг тгр Уа1 суз 61п
1 5 10 15
- 84 014528
Рго Ьеи Агд С1у <210> 5 <211> 5 <212> ПРТ <213> искусственная <220>
<223> синтетический пептид <220>
<221> М15С_РЕАтикЕ <222> ¢1)..(1) <223> Хаа 15 м-асетуГдТустпе <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (4)..(4) <223> Υ 51 де сЬатп тви рготессед <400> 5 хаа с!у ьеи туг А1а
5 <210> б <211> 4 <212> ПРТ <213> искусственная <220>
<223> синтетический пептид <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (1) .. С1) <22 3> ΝΗ2 ргогестед Ьу Ртос <220>
<221> М15С_РЕАТ0КЕ <222> (1) .. (1) <223> 51 де сЬа1п Аст ргохесХед <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (2)..С2) <223> 51 де сИатп тгс ргохесхед <400> 6
Суз Н1з мех 61 у <210> 7 <211> 8 <212> ПРТ <213> искусственная <220>
<223> синтетический пептид
- 85 014528
<220>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ
<222> (1) .. (1)
<223> ΝΗ2 рготестеб Ьу Риос
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<222> (3)..(3)
<223> 51 бе сНалп ТВи ргоТес£еб
<220>
<221> М1$С_РЕАТиКЕ
<222> (4).. (4)
<223> хаа 15 1-пар11Г11уЗ а1 аги пе
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<222> сб).. со
<223> 51 бе сйатп Аст рготестеб
<220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ
<222> (7).. (7)
<223> 51 бе спа1п ТгТ ргоТесСес!
<400> 7
Рго 11е тИг хаа Уа1 Суз 61η Рго
5
<210> 8
<211> 3
<212> ПРТ
<213> искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<220>
<221> М15С РЕАТиВЕ
<222> (2) . . (2)
<223> 51 бе сНа1п РЬГ рготестес!
<220>
<221> М15С_ГЕАТиКЕ
<222> (3).. (3)
<223> хаа 15 Ы’Шет11у1д1ус1 пе
<220>
<221> М15С_ЕЕАТиЯЕ
<222> (3) . . (3)
<223> соон вп рготестеб
<400> 8
Ьеи Агд хаа
<210> 9
<211> 9
<212> ПРТ
<213> искусственная
- 86 014528 <220>
<223> синтетический пептид <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (1) . . (1) <223> хаа 15 И-асеТу1д1ус1пе <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (4)..(4) <223> 51йе сНатп ТВи рготестей <220>
<221> М15С_ЕЕАТиНЕ <222> (6) . . (6) <223> 51йе сНатп Аст рготестей <220>
<221> М15С_РЕАТиР.Е <222> (7)..(7) <223> 51йе сЬатп тгт рготестей <400> 9
Хаа б!у ьеи Туг А1а Су5 Н15 мет 61у <210> 10 <211> 11 <212> ПРТ <213> искусственная <22О>
<223> синтетический пептид <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (1)..(1) <223> ΝΗ2 рготестей Ьу гтос <22О>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (3)..(3) <223> 51йе сЬатп теи рготестей <22О>
<221> М15С_РЕАТ1Л1Е <222> (4)..(4) <223> Хаа 15 1-парЬтЬу1а1ап1 пе <22О>
<221> М15С_РЕАТОНЕ <222> (6)..(6) <223> 5ΐйе сЬа1П Аст рготестей <220>
<221> М15С_РЕАТ0НЕ <222> (7)..(7) <223> 51йе сЬа!п ТгТ рготестей <22О>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (10)..(10) <223> 5ΐйе сЬатп РЬЕ рготестей
- 87 014528
<220> <221> <222> <223> М15С,РЕАТиКЕ СИ). СИ) Хаа тз М-теЬКуТдТустпе
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ СИ) · СИ) соон вп ргогесгеб
<400> 10
Рго 11е ТЬг Хаа Ча1 Суз 01 η Рго ьеи Агд Хаа 15 10
<210> <2И> <212> <213> 11 20 ПРТ искусственная
<220> <223> синтетический пептид
<220> <221> <222> <223> м15С_гЕдтике С1).. С1) Хаа 15 М-асе1у1д1ус1пе
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ ¢4) . . ¢4) 51 бе сЬа-ΐη сви ргосеснеб
<22О>
<221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ С6)..Сб) 51 бе сНатп Аст ргоьесьеб
<220> <221> <222> <223> МХ$С_РЕАТиКЕ С7) - С7) 51 бе сИатп ττΐ рготессеб
<220> <221> <222> <22 3> М15С_ГЕАТиКЕ ¢12)..¢12) 51бе сКатп ГВи ргогессеб
<22О> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ С13).-С13) Хаа 15 1-парНс11у1а1ап1пе
<22 0> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ ¢15)..0.5) 51 бе сНа1п Аст рготестеб
<22О> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ (16)..06) 31 бе сКатп тгс ргосесхеб
<220> <221> М15С-РЕАТОКЕ
- 88 014528
<222> <22 3> (19)..(19) 31 Йе сИатп рЬГ ргогескеб
<220>
<221> <222> <223> М15С РЕ АТОКЕ (20)..(20) хаа 15 К1-теГпу1д1ус1пе
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ (20)..(20) соон вп ргокесьей
<400> 11
Хаа 61 у Ьеи туг А1а Суз Нтз мег 61 у Рго 11 е ТЬг Хаа Уа1 Суз 61 η 15 10 15
Рго Ьеи Агд хаа
<210> <211> <212> <213> 12 20 ПРТ искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ (1) .. (1) . Хаа 15 1Ч-асеьу1д1ус1пе
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиКЕ (4) .. (4) 51йе сНатп ьви ргоьесьей
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТийЕ (6)..(6) 51йе сЬатп Аст ргогесхей
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТ11КЕ (7).. (7) 51йе сЬатп тгг ргоьесхей
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиНЕ (12)..(12) 51 йе сИатп ьви ргогесьей
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТиВЕ (13)..(13) Хаа 15 1-парИьЬу1а1ап1пе
<220> <221> <222> <223> М15С_РЕАТ11КЕ (15)..(15) 31йе сНатп Аст ргогесьей
<220>
- 89 014528 <221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> ¢16)..¢16) <223> 5Ϊбе сНалп Тгт ргоТесТеб <22О>
<221> М15С_ЕЕАТи«Е <222> (19)..(19) <223> 51 бе сЬатп РЬГ ргогестеб <22О>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (20)..(20) <223> хаа 15 м-тетНу1д1ус1пе <400> 12
Хаа С1у Ьеи Туг А1а Суз Нтз МеТ 61 у Рго Не тЬг хаа Уа1 су5 С1п 15 10 15
Рго Ьеи Агд Хаа <210> 13 <211> 20 <212> ПРТ <213> искусственная <220>
<223> синтетический пептид <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (1) . . (1) <223> Хаа 15 М-асеТу1д1ус1пе <220>
<221> М15С_РЕАТийЕ <222> (4)..(4) <223> 51 бе спатп тви рготестеб <220>
<221> М15С_ГЕАТийЕ <222> (7).. (7) <223> 51 бе сНа1П Тгь рготесьеб <220>
<221> М15С_ГЕАТиКЕ <222> (12)..(12) <223> 51 бе сНатп ТВи ргоТесТеб <22О>
<221> М15С_ЕЕАТОКЕ <222> ¢13)..(13) <223> Хаа 15 1-пар1ть11у1а1ап1пе <220>
<221> М15С_ЕЕАТ0КЕ <222> (16)..(16) <223> 51 бе сНатп тгт рготестеб <220>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (19)..(19) <223> 51 бе сИатп рЫ2 рготестеб <220>
<221> М15С_ЕЕАТиКЕ <222> (20)..(20) <223> Хаа 15 М-те1:Ку1д1ус1пе <400> 13 хаа б1у ьеи туг А)а Су5 нтз мет С1у рго Не тЬг хаа Уа1 Суз С1п 15 10 15
Рго ьеи Агд хаа {И:\04279\2202975ио0\О076Ю88.ТХТ *042792202975Ю0* }
- 90 014528

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения пациента, имеющего расстройство, которое характеризуется недостаточностью эритропоэтина или низким либо недостаточным уровнем красных кровяных клеток, который включает назначение указанному пациенту один раз каждые 3-4 недели терапевтически эффективного количества соединения, которое связывается с рецептором эритропоэтина (ΕΡΟ-Р) и активирует его, при этом терапевтически эффективное количество представляет собой дозу от 0,025 до 0,5 мг соединения на 1 кг веса тела пациента, причем указанное соединение отличается тем, что содержит:
    (a) димерную пептидную субъединицу, которая включает первый пептидный мономер и второй пептидный мономер, отличающиеся тем, что указанные первый и второй пептидные мономеры содержат аминокислотную последовательность (Αс6)6^ΥΑСΗΜ6ΡIΤ(1-ηа1)VС^Ρ^Κ;
    (b) линкер, ковалентно связывающий вышеуказанные пептидные мономеры;
    (c) по меньшей мере один остаток полиэтиленгликоля (ПЭГ), включающий линейный, неразветвленный ПЭГ, имеющий молекулярную массу от 10000 до 60000 Да; и (ά) спейсер, ковалентно соединяющий вышеуказанный по меньшей мере один остаток ПЭГ с вышеуказанным линкером, который имеет формулу, выбранную из группы, включающей где каждый из Р4 независимо выбран из группы, состоящей из ΝΗ, ΝΗΟΌ, СО, СОО и ΝΗί,’ΟΟ.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная аминокислотная последовательность дополнительно содержит ^еб), К или (Μο6)Κ.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность (ΑсС)С^ΥΑСΗΜСΡIΤ(1-ηа1)VС^Ρ^ЯΚ.
  4. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность (ΑсС)С^ΥΑСΗΜСΡIΤ(1-ηа1)VС^Ρ^Я(ΜеС).
  5. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность представляет собой последовательность (Αο6)6ΕΥΑ€ΗΜ6ΡΓΤ(1 -ιι;ι1)\ΪΌΡ1 ,Р(\1еС1)К.
  6. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что спейсер представляет собой иминодиацетатный линкер.
  7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что спейсер представляет собой Тен-аЮт-ПЭГ (2,2'(этилендиокси-(бис-(этиламин)).
  8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что линкер представляет собой лизин.
  9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что ПЭГ имеет молекулярную массу от 10000 до 60000 Да.
  10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что ПЭГ имеет молекулярную массу от 20000 до 40000 Да.
  11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ включает применение фармацевтически приемлемого носителя.
  12. 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой почечную недостаточность или диализ.
  13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество представялет собой дозу от 0,025 до 0,2 мг соединения на 1 кг веса тела пациента.
  14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная доза составляет от 0,05 до 0,1 мг соединения на 1 кг веса тела пациента.
  15. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой анемию, связанную со злокачественной опухолью.
  16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество представляет собой дозу от 0,075 до 0,5 мг соединения на 1 кг веса тела пациента.
  17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная доза составляет от 0,2 до 0,4 мг соединения на 1 кг веса тела пациента.
  18. 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой эритроцитарную аплазию обусловленную антителами (ЭА).
  19. 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный линкер представляет собой линкер на основе
    - 91 014528 третичного амида.
  20. 20. Способ по пп.1, 2, 5, 6, 8-17 и 18-19, отличающийся тем, что соединение представляет собой
EA200702656A 2005-06-03 2006-06-05 Составы, содержащие пептиды, стимулирующие рецептор эритропоэтина и их применение EA014528B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68765505P 2005-06-03 2005-06-03
PCT/US2006/021845 WO2006133144A2 (en) 2005-06-03 2006-06-05 Erythropoietin receptor peptide formulations and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200702656A1 EA200702656A1 (ru) 2008-12-30
EA014528B1 true EA014528B1 (ru) 2010-12-30

Family

ID=37499033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702656A EA014528B1 (ru) 2005-06-03 2006-06-05 Составы, содержащие пептиды, стимулирующие рецептор эритропоэтина и их применение

Country Status (20)

Country Link
US (2) US7550433B2 (ru)
EP (1) EP1917023A4 (ru)
JP (2) JP2008542399A (ru)
KR (2) KR20120119921A (ru)
CN (1) CN101553242A (ru)
AU (1) AU2006255081B2 (ru)
BR (1) BRPI0613233A2 (ru)
CA (1) CA2609401A1 (ru)
CR (1) CR9570A (ru)
EA (1) EA014528B1 (ru)
GE (1) GEP20135981B (ru)
IL (1) IL187354A0 (ru)
MA (1) MA29557B1 (ru)
MX (1) MX2007015303A (ru)
NO (1) NO20076634L (ru)
NZ (1) NZ563433A (ru)
SG (1) SG162747A1 (ru)
UA (1) UA92497C2 (ru)
WO (1) WO2006133144A2 (ru)
ZA (1) ZA200711020B (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009025957A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Takeda Pharmaceuticals Company Limited Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) * 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
PT2076290T (pt) 2006-10-27 2017-01-17 Sunnybrook Health Sciences Center Agonistas de tie 2 multiméricos e utilizações dos mesmos na estimulação da angiogénese
JP2010520855A (ja) * 2007-01-31 2010-06-17 アフィーマックス・インコーポレイテッド 修飾基をポリペプチドおよびその他の高分子に結合するための窒素ベースのリンカー
JP2009191056A (ja) * 2008-02-15 2009-08-27 Affymax Inc 合成ペプチドをベースとするｅｐｏレセプターアゴニストを用いた抗エリスロポエチン抗体に媒介された障害の治療
CN102838677B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组促红细胞生成素及制备方法
CN103044539B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组促红细胞生成素及制备方法
CN102210872A (zh) * 2011-05-30 2011-10-12 深圳翰宇药业股份有限公司 一种聚乙二醇修饰肽药物制剂及其制备方法
CN103450348B (zh) * 2012-05-29 2016-03-30 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种促红细胞生成素模拟肽、其制备方法和用途
CN104231067B (zh) * 2013-06-07 2017-08-11 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 促红细胞生成素模拟肽化学二聚体及其用途
CN105837681B (zh) * 2015-01-13 2019-04-19 天津药物研究院 一种促红细胞生成素模拟肽衍生物、其制备方法和用途
CN106317217B (zh) * 2015-06-26 2019-06-28 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN106279398B (zh) * 2015-06-26 2019-06-28 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN105085653B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN105153293B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其二聚体、以及制备方法和应用
CN105085654B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN105418754A (zh) * 2015-09-30 2016-03-23 天津药物研究院有限公司 羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽及其制备和应用
CN106608912B (zh) * 2015-10-22 2019-09-20 天津药物研究院有限公司 一种脂肪二羧酸偶联的epo模拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN106608911B (zh) * 2015-10-22 2020-01-07 天津药物研究院有限公司 一种二硫键修饰的epo拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN106608913B (zh) * 2015-10-22 2020-05-05 天津药物研究院有限公司 一种1，2，3-丙三酸偶联的epo拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN105367629B (zh) * 2015-11-09 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽以及其制备方法和用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004101606A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2004101611A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
RU2245887C2 (ru) * 1996-10-25 2005-02-10 Джи. Ди. Сирл Энд Ко. Гемопоэтический белок (варианты), последовательность днк, способ получения гемопоэтического белка, способ селективной экспансии кроветворных клеток, способ продуцирования дендритных клеток, способ стимуляции продуцирования кроветворных клеток у пациента, фармацевтическая композиция, способ лечения

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4677195A (en) * 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
EP0545913B1 (en) 1986-08-18 1999-02-24 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
WO1990008822A1 (en) 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE69026306T2 (de) 1989-05-27 1996-10-17 Sumitomo Pharma Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine.
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5292654A (en) * 1990-12-13 1994-03-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Mutant EPO receptor and uses therefor
CA2082951C (en) 1991-03-15 1999-12-21 Robert M. Platz Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
SG89295A1 (en) 1991-03-15 2002-06-18 Amgen Inc Pegylation of polypeptides
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
EP0773227A1 (en) 1991-09-18 1997-05-14 Affymax Technologies N.V. Diverse collections of oligomers in use to prepare drugs, diagnostic reagents, pesticides or herbicides
US6153407A (en) * 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US5888511A (en) * 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5830851A (en) * 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5773569A (en) * 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5919758A (en) * 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5580853A (en) * 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5747446A (en) * 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5668110A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5654276A (en) * 1995-06-07 1997-08-05 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
ES2303338T3 (es) * 1995-06-07 2008-08-01 Glaxo Group Limited Peptidos y compuestos que se unen a un receptor de trombopoyetina.
US5767078A (en) * 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US6251864B1 (en) * 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
PL185040B1 (pl) 1995-06-07 2003-02-28 Affymax Tech Nv Peptyd wiążący się z receptorami erytropoetyny, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd i jego zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego
US5677280A (en) * 1995-06-07 1997-10-14 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5683983A (en) * 1995-06-07 1997-11-04 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
WO1996040189A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5869451A (en) 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6346390B1 (en) 1996-03-08 2002-02-12 Receptron, Inc. Receptor derived peptides involved in modulation of response to ligand binding
US6103879A (en) * 1996-06-21 2000-08-15 Axys Pharmaceuticals, Inc. Bivalent molecules that form an activating complex with an erythropoietin receptor
EP1731174A3 (en) * 1996-08-02 2007-01-17 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a covalently bound N-terminal polyethylene glycol via hydrazone or oxime bond
US5932546A (en) * 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
US6221608B1 (en) * 1997-01-22 2001-04-24 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods for identifying erythropoietin receptor binding protein
JP4304757B2 (ja) 1998-04-24 2009-07-29 株式会社デンソー Ａｂｓアクチュエータ
BRPI9912974B8 (pt) 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke conjugados de peg-urato oxidase e seu uso
CN1896231B (zh) * 1998-08-06 2012-09-05 山景药品公司 分离四聚体尿酸氧化酶的方法
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
EP1008355A1 (en) 1998-12-08 2000-06-14 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Method for identifying or analyzing polymer linkage sites on macromolecules using amino acid report binding
DK1400551T3 (da) 1998-08-28 2007-10-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Polyamidkæder med præcis længde og deres konjugater med proteiner
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
SI2319928T1 (sl) 1998-10-23 2013-08-30 Kirin-Amgen, Inc. Dimerni trombopoietinski peptidni mimetiki, ki se veĺ˝ejo na receptor mp1 in imajo trombopoietinsko aktivnost
US6498155B1 (en) * 1998-11-17 2002-12-24 Smithkline Beecham Corporation Methods of treating thrombocytopenia
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
AUPQ873300A0 (en) * 2000-07-12 2000-08-03 Medvet Science Pty. Ltd. A binding motif of a receptor (2)
AU771460B2 (en) * 1999-09-24 2004-03-25 Smithkline Beecham Corporation Thrombopoietin mimetics
DE60025241T2 (de) * 1999-09-27 2007-01-11 Chugai Seiyaku K.K. HäMOPOIETINREZEPTOR-PROTEIN, NR12
US6703480B1 (en) 1999-11-24 2004-03-09 Palani Balu Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use
US6858630B2 (en) * 1999-12-06 2005-02-22 Smithkline Beecham Corporation Naphthimidazole derivatives and their use as thrombopoietin mimetics
JP2004512258A (ja) * 2000-03-21 2004-04-22 ウィスコンシン　アルムニ　リサーチ　ファンデイション 生物系における細胞応答の調節のための方法および試薬
US6777387B2 (en) * 2000-03-31 2004-08-17 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
JP3967594B2 (ja) * 2000-05-15 2007-08-29 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新しい薬剤組成物
JP2003534384A (ja) 2000-05-26 2003-11-18 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 神経保護性ペプチド
HUP0303056A2 (hu) * 2000-08-02 2003-12-29 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Fokozott hatású vírus- és daganatellenes kemoterápia eritropoietin beadásával
KR20030046411A (ko) * 2000-09-08 2003-06-12 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 '위'-천연 화학적 라이게이션
AU2002233230B2 (en) * 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
EP1362053B1 (en) 2001-02-20 2007-11-14 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
FR2823220B1 (fr) * 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
US20020169128A1 (en) * 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
DK1421175T3 (da) 2001-06-28 2009-03-23 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabiliserede proteinaser
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US7396913B2 (en) * 2002-10-14 2008-07-08 Abbott Laboratories Erythropoietin receptor binding antibodies
AU2003291719A1 (en) * 2002-11-06 2004-06-03 Schering Corporation Cholesterol absorptions inhibitors for the treatment of autoimmune disorders
KR101238517B1 (ko) 2002-12-26 2013-02-28 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 효능이 향상된 인터페론-베타의 중합체 접합체
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EA010015B1 (ru) 2003-05-12 2008-06-30 Афимакс, Инк. Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2245887C2 (ru) * 1996-10-25 2005-02-10 Джи. Ди. Сирл Энд Ко. Гемопоэтический белок (варианты), последовательность днк, способ получения гемопоэтического белка, способ селективной экспансии кроветворных клеток, способ продуцирования дендритных клеток, способ стимуляции продуцирования кроветворных клеток у пациента, фармацевтическая композиция, способ лечения
WO2004101606A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2004101611A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor

Also Published As

Publication number Publication date
EA200702656A1 (ru) 2008-12-30
KR20120119921A (ko) 2012-10-31
WO2006133144A8 (en) 2008-04-17
IL187354A0 (en) 2008-04-13
MA29557B1 (fr) 2008-06-02
NO20076634L (no) 2008-02-29
AU2006255081B2 (en) 2012-03-29
SG162747A1 (en) 2010-07-29
CN101553242A (zh) 2009-10-07
CR9570A (es) 2008-05-05
NZ563433A (en) 2009-12-24
KR20080021115A (ko) 2008-03-06
JP2013173763A (ja) 2013-09-05
BRPI0613233A2 (pt) 2010-12-28
JP2008542399A (ja) 2008-11-27
MX2007015303A (es) 2008-03-05
CA2609401A1 (en) 2006-12-14
KR101262312B1 (ko) 2013-05-14
EP1917023A2 (en) 2008-05-07
US20090136442A1 (en) 2009-05-28
US20070104704A1 (en) 2007-05-10
EP1917023A4 (en) 2010-03-24
ZA200711020B (en) 2008-12-31
AU2006255081A1 (en) 2006-12-14
US7906485B2 (en) 2011-03-15
WO2006133144A2 (en) 2006-12-14
US7550433B2 (en) 2009-06-23
GEP20135981B (en) 2013-12-10
UA92497C2 (ru) 2010-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014528B1 (ru) Составы, содержащие пептиды, стимулирующие рецептор эритропоэтина и их применение
EA010095B1 (ru) Новые пептиды, которые связываются с рецептором эритропоэтина
EA010099B1 (ru) Пептиды, которые связываются с рецептором к эритропоэтину, и способы их применения
US7919461B2 (en) Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US10005826B2 (en) Compounds that bind to the erythropoietin receptor
WO2023165476A1 (zh) 针对sort1的多肽化合物及其药物偶联物
JP2008519858A (ja) エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
US8324159B2 (en) Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
JP2010536858A (ja) エリスロポエチン受容体ペプチド製剤及び用途
US20090209457A1 (en) Treatment of anti-erythropoietin antibody-mediated disorders with synthetic peptide-based epo receptor agonists

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU