CN101553242A - 促红细胞生成素受体肽制剂和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及为促红细胞生成素受体(EPO－R)激动剂的肽化合物。本发明也涉及使用此类肽化合物治疗与血红细胞生产不足或缺陷相关的疾病的治疗方法。也提供了包含本发明的肽化合物的药物组合物和剂量。

Description

促红细胞生成素受体肽制剂和用途
本申请要求2005年6月3日申请的美国临时专利申请系列号60/687,655的优先权。该优先权申请的内容以其整体引入本公开作为参考。
发明领域
本发明涉及为促红细胞生成素受体(EPO-R)激动剂的肽化合物。本发明也涉及使用此类肽化合物治疗与血红细胞生产不足或缺陷相关的疾病的治疗方法。也提供了包含本发明的肽化合物的药物组合物。
发明背景
促红细胞生成素(EPO)是165个氨基酸、分子量大约34千道尔顿(kD)、并且第24、38、83和126位氨基酸为优选的糖基化位点的糖蛋白激素。其最初产生为具23个氨基酸的信号肽的前体蛋白质。EPO可以以三种形式存在：α、β和脱唾液酸的。α和β形式虽然在其糖类组分上略有不同，但具有相同的潜能、生物活性和分子量。脱唾液酸形式为移去了末端糖(唾液酸)的α或β形式。已经报道了编码EPO的DNA序列[Lin的美国专利号4,703,008]。
EPO刺激红细胞前体细胞的有丝分裂和分化，并因此保证红细胞的产生。当为含氧量低的条件时，其在肾中产生。在EPO诱导的红细胞前体细胞分化期间，诱导合成珠蛋白，刺激合成血红素复合体，并增加铁蛋白受体数量。这些变化使细胞吸收更多铁，并合成在成熟的红细胞中结合氧的功能性血红蛋白。因此，红细胞及其血红蛋白在为身体供氧中起重要作用。这些变化通过EPO和在红细胞前体细胞的细胞表面上的适当受体相互作用而启动[见，例如Graber和Krantz(1978)Ann.Rev.Med.29.51-66]。
当身体处于健康状态时，组织从现有数量的红细胞接收足够的氧合，EPO以非常低的浓度存在于血浆中。这种正常的低浓度足够刺激由于衰老正常损失的红细胞的替换。
当循环中血细胞运输的氧减少时，在低氧条件下，循环中的EPO数量增加。低氧可以例如由于出血导致的相当量的血损失、由于过渡暴露于辐射导致的血红细胞破坏、由于高海拔或长时间昏迷导致的氧摄入下降或者多种形式的贫血产生。应答该含氧量低的压力，提高的EPO水平通过刺激类红细胞祖先细胞的增殖来增加血红细胞的产生。当循环中的血红细胞数量大于正常组织氧需求所需要的数量时，循环中的EPO水平下降。
因为EPO在血红细胞形成过程中是必需的，所以这种激素可能在诊断和治疗具有低的或缺陷性血红细胞产生特征的血液疾病中有用。最近的研究提供了研发对多种疾病状态、疾病和血液异常状态有效的EPO疗法的基础，其中所述的疾病状态、疾病和血液异常包括：β-地中海贫血[见Vedovato等人(1984)Acta.Haematol.71：211-213]、囊性纤维化[见Vichinsky等人(1984)J.Pediatric 105：15-21]、妊娠和月经疾病[见Cotes等人(193)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90：304-311]、早产儿早期贫血(early anemia ofprematurity)[见Haga等人(1983)Acta Pediatr.Scand.72；827-831]、脊髓损伤[见Claus-Walker等人(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65：370-374]、宇宙飞行所致疾病(space flight)[见Dunn等人(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52：178-182]、急性血损失[见Miller等人(1982)Brit.J.Haematol.52：545-590]、衰老[见Udupa等人(1984)J.Lab.Clin.Med.103：574-580和581-588以及Lipschitz等人(1983)Blood 63：502-509]、多种伴随着异常红细胞生成的肿瘤疾病状态[见Dainiak等人(1983)Cancer 5：1101-1106和Schwartz等人(1983)Otolaryngol.109：269-272]、以及肾机能不全[见Eschbach等人(1987)N.Eng.J.Med.316：73-78]。
已经表征了纯化的、匀质的EPO的特征[Hewick的美国专利号4,677,195]。纯化、克隆并表达了编码EPO的DNA序列，以产生具有与天然EPO相同生物化学性质和免疫性质的重组多肽。也产生了具有与天然EPO上相同寡糖的重组EPO分子[见Sasaki等人(1987)J.Biol.Chem.262：12059-12076]。
EPO的生物学效应部分通过与细胞膜结合的受体相互作用来介导。最初使用从小鼠脾分离的未成熟类红细胞的研究表明，EPO结合性细胞表面蛋白质包含两个分别具有大约85,000道尔顿和100,000道尔顿分子量的多肽[Sawyer等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3690-3694]。计算EPO结合位点的数量为平均每细胞表面800-1000个。在这些结合位点中，大约300个以大约90pM(皮摩尔)的Kd结合EPO，而其余的以降低的亲和性大约570pM结合EPO[Sawyer等人(1987)J.Biol.Chem.262：5554-5562]。独立的研究表明，从注射了弗罗德白血病病毒的贫血性株(FVA)的小鼠制备的EPO应答性脾成红血细胞具有总计大约400个Kd值分别为大约100pM和800pM的高亲和性和低亲和性EPO结合位点[Landschulz等人(1989)Blood 73：1476-1486]。
随后的工作表明，两种形式的EPO受体(EPO-R)由单一基因编码。这个基因已经被克隆[见，例如Jones等人(1990)Blood 76，31-35、Noguchi等人(1991)Blood 78：2548-2556、Maouche等人(1991)Blood 78：2557-2563]。例如，D′Andrea等人的PCT公开号WO 90/08822中描述了鼠和人EPO-R蛋白质的DNA序列和编码的肽序列。目前的模型表明，EPO和EPO-R的结合导致两个EPO-R分子的二聚化和激活，进而导致随后的信号转导步骤[见，例如Watowich等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2140-2144]。
克隆的EPO-R基因的可获得性促进了对这个重要受体的激动剂和拮抗剂的探索。重组的受体蛋白质的可获得性使得可以在多种随机和半随机的肽多样性产生系统中研究受体-配体的相互作用。这些系统包括“质粒上的肽”系统[美国专利号6,270,170中所述]、“噬菌体上的肽”系统[美国专利号5,432,018和Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6378-6382中所述]、“编码的合成性文库”(ESL)系统[1992年9月16日申请的美国专利申请系列号946,239中所述]、以及“很大规模固定化多聚体合成”系统[美国专利号5,143,854、PCT公开号90/15070、Fodor等人(1991)Science 251：767-773、Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.26：271-180以及美国专利号5,424,186中所述]。
至少一定程度上与EPO-R相互作用的肽已经得到鉴定，并且在例如美国专利号5,773,569、5,830,851、和Wrighton等人的5,986,047、Wrighton等人的PCT公开号WO 96/40749；美国专利号5,767,078以及Johnson和Zivin的PCT公开号96/40772、BaIu的PCT公开号WO 01/38342、以及Smith-Swintosky等人的WO 01/91780中进行了描述。具体而言，已鉴定出一组包含肽基序的肽，其中的成员结合EPO-R、并刺激EPO依赖性的细胞增殖。然而，迄今鉴定的包含基序的肽在体外以大约20纳摩尔(nM)至大约250nM的EC50值刺激EPO依赖性细胞增殖。因此，需要20nM至250nM的肽浓度来刺激由EPO刺激的最大细胞增殖的50％细胞增殖。此外，其它结合EPO受体的肽及其构建体在2003年5月12日申请的美国临时申请系列号60/470,244、60/470,245和60/469,993中描述、在2004年11月11日申请的美国临时申请系列号60/627,432和60/627,433中、2004年5月12日申请的美国非临时申请系列号10/844,968中、在2004年5月12日申请、并分别以WO 2004/101611和WO 2004/101606公开的国际申请系列号PCT/US2004/14886和PCT/US2004/014889中进行了描述。这些申请每一个在此处都以其整体引入作为参考。
既然EPO-R激动剂对这个受体介导的重要生物学性质的研究和对疾病治疗都有非常大的潜能，所以仍然需要鉴定具有增强的潜能和活性的肽EPO-R激动剂。本发明提供了该类化合物。
在这个部分和整个说明书中对所引参考文献的引用和/或讨论仅提供用来阐述本发明，并且不承认任何该参考文献为本发明的“现有技术”。
发明概述
本发明提供了为显著增强潜能和活性的EPO-R激动剂的新型肽化合物。这些肽化合物为具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的同型二聚体或具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的同型二聚体、具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)(SEQ ID NO：3)的肽单体的同型二聚体，其中每个氨基酸都以标准的单字母缩写表述，“(AcG)”为N-乙酰甘氨酸，“(1-nal)”为1-萘丙氨酸，并且“(MeG)”为N-甲基甘氨酸(也已知为肌氨酸)。肽二聚体的每个肽单体包含在单体的半胱氨酸残基之间的分子内二硫键。
肽单体可以通过共价连接至支化的叔酰胺接头而二聚化。叔酰胺接头可以描述为：
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
其中X为NCO-(CH2)2-N1H-；接头的C1与第一肽单体C末端的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；接头的C2与第二肽单体C末端的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；并且X的N1通过氨基甲酸酯键或酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有大约20,000至大约40,000道尔顿的分子量(术语“大约”表明制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量则小)。
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且接头的N1通过氨基甲酸酯键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且接头的N1通过酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100092
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且接头的N1通过氨基甲酸酯键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100101
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且接头的N1通过酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
肽单体也可以通过共价连接至支化的叔酰胺接头而二聚化。叔酰胺接头可以描述为：
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
其中X为NCO-(CH2)2-NH-C3O-、接头的C1与第一肽单体C末端的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；接头的C2与第二肽单体C末端的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键。本发明的肽二聚体进一步包含下列结构的间隔物部分：
-N1H-(CH2)4-C4H-N2H-
其中，间隔物的C4共价结合于X的C3；间隔物的N1通过氨基甲酸酯或酰胺键共价连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分；并且间隔物的N2通过氨基甲酸酯或酰胺键共价连接至活化的PEG部分，其中PEG具有大约10,000至大约50,000道尔顿的分子量(术语“大约”表示制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量则小)。每个PEG部分可以分别为10,000道尔顿(10kD)、20kD、30kD、40kD或50kD。
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且间隔物的N1和N2都通过氨基甲酸酯键共价连接至活化的PEG部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100111
在优选的实施方案中，两个肽单体的C末端赖氨酸都为L-赖氨酸。此外，本领域技术人员理解上述两个线性PEG部分通过赖氨酸结合的化学结构(例如，mPEG2-Lys-NHS或mPEG2-Lysinol-NPC)，其也优选地为L-赖氨酸，并且产生下列立体化学结构。
Figure A20068002699100112
备选地，一个或多个赖氨酸残基可以为D-赖氨酸，产生本领域技术人员可轻易理解的备选立体化学结构。
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且间隔物的N1和N2都通过酰胺键共价连接至活化的PEG部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100121
另外，这个化合物中的赖氨酸分子都优选地为L-赖氨酸，产生下列立体化学结构。
Figure A20068002699100122
备选地，一个或多个赖氨酸残基可以为D-赖氨酸，产生本领域技术人员可轻易理解的备选立体化学结构。
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且间隔物的N1和N2都通过氨基甲酸酯键共价连接至活化的PEG部分、其中Y为氨基甲酸酯基时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100131
优选地，连接这个分子中的肽单体和线性PEG部分的赖氨酸残基都为L-赖氨酸，产生下列立体化学结构：
Figure A20068002699100132
备选地，一个或多个赖氨酸残基可以为D-赖氨酸，产生本领域技术人员可轻易理解的备选立体化学结构。
当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且间隔物的N1和N2都通过酰胺键共价连接至活化的PEG部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100141
优选地，连接这个分子中的肽单体和线性PEG部分的赖氨酸残基都为L-赖氨酸，产生下列立体化学结构：
Figure A20068002699100142
在其它实施方案中，一个或多个赖氨酸残基可以是D-赖氨酸，产生本领域普通技术人员可轻易理解的备选立体化学结构。
肽单体也可以通过连接至赖氨酸接头而二聚化，其中一个肽单体在其C末端连接至赖氨酸的ε-氨基，并且第二肽单体在其C末端连接至赖氨酸的α-氨基。
本发明的肽二聚体进一步包含下列结构的间隔物部分：
-N1H-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N2H-在一末端，间隔物的N1通过酰胺键连接至赖氨酸接头的羰基碳。在相反的末端，间隔物的N2通过氨基甲酸酯键或酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有大约20,000至大约40,000道尔顿的分子量(术语“大约”表示制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量则小)。
当间隔物通过氨基甲酸酯键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物(SEQ ID NO：3)可以表示如下：
Figure A20068002699100151
当间隔物通过酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物(SEQ ID NO：3)可以表示如下：
Figure A20068002699100152
本发明进一步提供用该类肽化合物治疗多种医学病症的方法。方法包括通过向患者施用治疗有效量的一种上述化合物来治疗患有促红细胞生成素缺乏或低的或缺陷性血红细胞群体特征的疾病。在一些实施方案中，疾病为终末期肾衰竭或透析、伴随AIDS的贫血、自身免疫疾病或恶性肿瘤、β-地中海贫血、囊性纤维化、早产儿早期贫血、伴随慢性炎症病症的贫血、脊髓损伤、急性血损失、衰老或伴随异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。此外，在一些实施方案中，疾病为肾衰竭或透析，并且治疗有效量为每千克患者体重0.025-0.2毫克化合物的剂量。在其它实施方案中，疾病为肾衰竭或透析，并且治疗有效量为每千克患者体重0.05-0.1毫克化合物的剂量。在一些实施方案中，疾病为伴随肿瘤的贫血，并且治疗有效量为每千克患者体重0.075-0.5毫克化合物的剂量。在其它实施方案中，疾病为伴随肿瘤的贫血，并且治疗有效量为每千克患者体重0.2-0.4毫克化合物的剂量。治疗有效量可以每3至4周施用一次。
本发明进一步提供了包含该类肽化合物的药物组合物。在一些实施方案中，PEG具有大约20,000道尔顿的分子量。在其它实施方案中，药物组合物包含任意一种上述化合物和可药用载体。
发明详述
定义：
肽中的氨基酸残基简写如下：苯丙氨酸为Phe或F、亮氨酸为Leu或L、异亮氨酸为Ile或I、甲硫氨酸为Met或M、缬氨酸为VaI或V、丝氨酸为Ser或S、脯氨酸为Pro或P、苏氨酸为Thr或T、丙氨酸为Ala或A、酪氨酸为Tyr或Y、组氨酸为His或H、谷氨酰胺为GIn或Q、天冬酰胺为Asn或N、赖氨酸为Lys或K、天冬氨酸为Asp或D、谷氨酸为GIu或E、半胱氨酸为Cys或C、色氨酸为Trp或W、精氨酸为Arg或R以及甘氨酸为GIy或G。肽中的非常规氨基酸简写如下：1-萘基丙氨酸为1-nal或Np、N-甲基甘氨酸(也已知为肌氨酸)为MeG或Sc以及乙酰化甘氨酸(N-乙酰甘氨酸)为AcG。
如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”指的是α氨基酸通过酰胺键连接在一起的氨基酸单体的聚合物。因此，多肽至少两个氨基酸残基长，并且通常更长。一般而言，术语“肽”指的是仅一些氨基酸残基长的多肽。本发明新型的EPO-R激动剂肽优选不长于大约50个氨基酸残基。它们更优选长大约17至大约40个氨基酸残基。相比肽，多肽可以包含任意数量的氨基酸残基。因此，术语多肽包括肽和更长的氨基酸序列。
如本文所用，短语“可药用的”指的是当施用于人时“通常认为安全的”、例如生理上可耐受、并且一般不产生过敏性或相似不适反应例如胃不适、头晕等的分子物质和组合物。优选地，如本文所用，术语“可药用的”表示经联邦或国家政府管理机构批准的或者为美国药典或其它通常认可的药典上列出的用于动物、并且尤其是人的。术语“载体”指的是与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。该类药物载体可以是无菌液体例如水和油，其中包括那些石油、动物、蔬菜或合成来源的无菌液体，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选采用水或含水溶液盐溶液和含水葡萄糖和丙三醇溶液作为载体，尤其是用于可注射溶液的载体。E.W.Martin在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述了适当的药物载体。
如本文所用，术语“激动剂”指的是与其互补的生物学活性受体结合并激活生物学活性受体从而引发受体中的生物学反应或者增强受体现有生物学活性的生物活性配体。
为EPO-R激动剂的新型肽
本发明提供了显著增强了效力和活性的EPO-R激动剂的新型肽化合物。这些肽化合物为具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的同型二聚体或具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的同型二聚体，其中每个氨基酸以标准的单字母缩写表示，“(AcG)”为N-乙酰甘氨酸、“(1-nal)”为1-萘基丙氨酸、并且“(MeG)”为N-甲基甘氨酸(也已知为肌氨酸)。肽二聚体的每个肽单体包含在单体的半胱氨酸之间的分子内二硫键。该类单体图示如下：
这些单体的肽二聚体化来提供具增强的EPO-R激动剂活性的肽二聚体。接头(Lκ)部分为支化的叔酰胺，其通过同时连接至每个单体C末端的赖氨酸残基而桥接两个肽单体的C末端。叔酰胺接头可以描述为：
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
其中X为NCO-(CH2)2-N1H-；接头的C1与第一肽单体的C末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；接头的C2与第二肽单体的C末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；并且X的N1通过氨基甲酸酯键或酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有大约20,000至大约40,000道尔顿的分子量(术语“大约”表示制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量则小)。
叔酰胺接头也可以描述为：
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
其中：X为NCO-(CH2)2-NH-C3O-；接头的C1与第一肽单体C末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；并且接头的C2与第二肽单体C末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键。本发明的肽二聚体进一步包含下列结构的间隔物部分：
-N1H-(CH2)4C4H-N2H-
其中：间隔物的C4共价键合于X的C3；间隔物的N1通过氨基甲酸酯键或酰胺键共价连接至活化的PEG部分；并且间隔物的N2通过氨基甲酸酯键或酰胺键共价连接至活化的PEG部分，其中PEG具有大约10,000至大约60,000道尔顿的分子量(术语“大约”表示制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量则小)。
因此，本发明的新型肽也可包含PEG部分，其通过氨基甲酸酯键或酰胺键共价连接至肽二聚体的叔酰胺接头。PEG为可药用的水溶性聚合物。用于本发明的PEG可以是线性、无分支、具有大约20千道尔顿(20K)至大约60千道尔顿分子量的PEG(术语“大约”表示制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子的分子量则小)。最优选地，PEG具有大约30K至大约40K的分子量。本领域技术人员能够基于下列考虑选择目的聚合物大小，例如目的剂量、循环时间、蛋白酶解抵抗力、任意对生物学活性的效果、操作简便性、抗原性程度或者缺乏抗原性以及PEG对治疗性肽其它已知的的效果。
本发明的肽、肽二聚体和其它基于肽的分子可以使用多种化学方法中的任意一种连接至水溶性聚合物(例如PEG)，以将水溶性聚合物连接于分子的受体结合部分(例如，肽+间隔物)。一般的实施方案采用单个连接接点来进行水溶性聚合物与受体结合部分的共价连接，但在备选实施方案中使用多个连接接点，其中当不同种类的水溶性聚合物在不同的连接接点连接至受体结合部分时包括进一步的变化，其可包括与间隔物和/或与一条或两条肽链的共价连接接点。在一些实施方案中，二聚体或更高等级的多聚体包含不同种类的肽链(即异源二聚体或其它异源多聚体)。作为实例，并且不作为限制，二聚体可以包含具有PEG连接接点的第一肽链和缺乏PEG连接接点或使用与第一肽链不同的连接化学的第二肽链，并且在一些变化方案中，间隔物可以包含或缺乏PEG连接接点，并且如果所述间隔物被PEG化，那么其可以使用不同于第一和/或第二肽链的键化学作用。备选的实施方案采用连接至受体结合部分和不同的水溶性聚合物(例如糖类)的间隔物部分的PEG，其中所述的水溶性聚合物结合至分子的肽部分的一个氨基酸的侧链上。
很多种类的聚乙二醇(PEG)可以用来进行受体结合部分(肽+间隔物)的PEG化。基本上任何适当的活性PEG试剂都可以使用。在优选的实施方案中，活性PEG试剂在与受体结合部分结合后导致形成氨基甲酸酯键或酰胺键。适当的活性PEG种类包括但不限于那些在NOF公司(YebisuGarden Place Tower，20-3Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo 150-6019)的药物递送系统目录和Nektar Therapeutics(490Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的分子操作目录(2003)上有售的PEG种类。例如，并且不作为限制，在多种实施方案中通常优选下列PEG试剂：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、多-Arm PEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-二酯、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、异功能性PEG(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷酯(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEG，其中包括由本领域技术人所选化学作用激活的基于丙三醇的PEG的GL系列、任意SUNBRITE激活的PEG(包括但不限于羧基-PEG、p-NP-PEG、Tresyl-PEG、醛PEG、缩醛-PEG、氨基-PEG、巯基-PEG、马来酰亚胺-PEG、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羟基-PEG-醛、羧酸酐型PEG、功能性PEG-磷酯、以及本领域技术人员根据他们特定应用和用途选择的其它类似和/或适当的活性PEG。
本发明的新型肽也可以包含通过氨基甲酸酯键或酰胺键共价连接至间隔物部分的2个PEG部分，其中间隔物部分共价键合于肽二聚体的叔酰胺接头。在本发明此类实施方案中使用的两个PEG部分中的每一个都可以是线性的，并且可以在单一连接点连接在一起。每个PEG部分优选具有大约10千道尔顿(10K)至大约60K的分子量(术语“大约”表示在制备PEG时，一些分子可以比所述分子量大，一些分子则小)。尤其优选线性的PEG部分。更加优选地，两个PEG部分每一个都具有大约20K至大约40K的分子量，并且仍然更加优选介于大约20K至大约40K之间。仍然更加优选两个PEG部分的每一个都具有大约20K的分子量。本领域技术人员能够基于下列考虑选择目的聚合物大小，其中所述考虑如目的剂量、循环时间、蛋白水解作用的抵抗力、如果有的话，任意的生物活性效果、操作简便性、抗原性程度或者缺乏抗原性、以及PEG对治疗肽其它已知的效果。
本发明也包含肽激动剂，其为具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)(SEQ ID NO：3)的肽单体的同型二聚体，其中每个氨基酸以标准的单字母缩写表示，“(AcG)”为N-乙酰甘氨酸、“(1-nal)”为1-萘基丙氨酸、并且“(MeG)”为N-甲基甘氨酸(也已知为肌氨酸)。肽二聚体的每个肽单体在单体的半胱氨酸残基之间包含分子内的二硫键。此类单体可以图示地表示如下：
Figure A20068002699100201
这些单体的肽二聚化提供具增强的EPO-R激动剂活性的肽二聚体。接头(Lκ)部分为赖氨酸残基，其通过同时连接至每个单体的C末端氨基酸而桥接两个肽单体的C末端。一个肽单体在其C末端连接至赖氨酸的ε-氨基，第二肽单体在其C末端连接至赖氨酸的α-氨基。例如，二聚体在结构上可以示例为如式I所示，并概述为如式II所示：
式I                            式II
Figure A20068002699100211
在式I和式II中，N2代表赖氨酸ε-氨基的氮原子，并且N1代表赖氨酸α-氨基的氮原子。
本发明的肽二聚体进一步包含下列结构的间隔物部分：
-N1H-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N2H-
在一末端，间隔物的N1通过酰胺键连接至赖氨酸接头的羰基碳上。在相反的末端，间隔物的N2通过氨基甲酸酯键或酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中所述的PEG具有大约10,000至大约60,000道尔顿的分子量(术语“大约”表示在制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子则比所述分子量小)。更加优选地，PEG具有大约20,000-40,000道尔顿的分子量。
因此，本发明的新型肽也包含共价连接至肽二聚体的PEG部分。PEG为可药用的水溶性聚合物。本发明所用PEG可以是线性、无分枝、具有大约20千道尔顿(20K)至大约60K(术语“大约”表示在制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子则比所述分子量小)分子量的PEG。最优选地，PEG具有大约20K至大约40K的分子量，并且仍然更优选大约30K至大约40K的分子量。本领域技术人员能够基于下列考虑选择目的聚合物大小，其中所述考虑如目的剂量、循环时间、对蛋白水解作用的抵抗力、如果有的话对生物活性的效果、操作简便性、抗原性程度或者缺乏抗原性、以及PEG对治疗肽的其它已知效果。
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且接头的N1通过氨基甲酸酯键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100221
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且接头的N1通过酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且接头的N1通过氨基甲酸酯键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100231
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且接头的N1通过酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100232
本发明优选的肽二聚体包括但不限于：
Figure A20068002699100241
Figure A20068002699100251
Figure A20068002699100261
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且间隔物的N1和N2都通过氨基甲酸酯键共价连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100281
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)、并且间隔物的N1和N2都通过酰胺键共价连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100282
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(l-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且间隔物的N1和N2都通过氨基甲酸酯键共价连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100291
当同型二聚体的每个单体都具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)、并且间隔物的N1和N2都通过酰胺键共价连接至活化的PEG部分时，本发明的新型肽化合物可以表示如下：
Figure A20068002699100292
本发明优选的肽二聚体包括但不限于：
Figure A20068002699100301
Figure A20068002699100311
Figure A20068002699100321
Figure A20068002699100331
Figure A20068002699100341
Figure A20068002699100351
Figure A20068002699100361
当间隔物通过氨基甲酸酯键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物(SEQ ID NO：3)可以表示如下：
Figure A20068002699100362
当间隔物通过酰胺键连接至活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本发明的新型肽化合物(SEQ ID NO：3)可以表示如下：
Figure A20068002699100371
可以将这种二聚化的结构写成[Ac-肽，二硫化]2Lys-间隔物-PEG20-40k来表示N-末端乙酰化的、与赖氨酸的α和ε氨基都结合的肽，其中每个肽都包含分子内的二硫化环以及在赖氨酸C末端和PEG部分之间形成共价键的间隔物分子，其中PEG具有大约20,000至大约40,000道尔顿的分子量。
本发明优选的肽二聚体包括但不限于：
Figure A20068002699100372
Figure A20068002699100381
二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、以及其它非常规氨基酸也可以是本发明化合物的适当组分。非常规氨基酸的实例包括但不限于β-丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-甲基氨基酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、正亮氨酸、以及其它类似的氨基酸和亚氨基酸。其它修饰也是可能的，其中包括氨基末端的修饰、羧基末端的修饰、用非常规氨基酸替换一个或多个天然存在的遗传编码的氨基酸、一个或多个氨基酸残基侧链的修饰、肽的磷酸化等。
本发明的肽序列可以单独存在或者与肽链N末端和/或C末端的延伸物连接。该类延伸物可以是天然编码的肽序列，其任选地含有或者基本不含有非天然存在的序列；延伸物可以包括任意添加、删除、点突变或其它序列修饰、或者本领域技术人员期望的组合。例如，并且不作为限制，天然存在的序列可以为全长或部分长度，并且可以包括氨基酸替换来提供糖类、PEG、其它聚合物等通过侧链结合的连接位点。在一个变化方案中，氨基酸替换导致序列人源化来使得与人免疫系统相容。提供所有类型的融合蛋白质，其中包括与本发明EPO-R激活序列毗连或邻近的免疫球蛋白序列，其中含有或不含有非免疫球蛋白间隔序列。一种类型的实施方案为用EPO-R激活序列替换了重链和/或轻链可变(V)区的免疫球蛋白链。
本发明肽化合物的制备：
肽的合成
本发明的肽可以通过本领域已知的经典方法制备。这些标准方法包括专用固相合成、局部固相合成法、片段缩合、经典的溶液合成以及重组DNA技术[见，例如Merrifield J.Am.Chem.Soc.196385：2149]。
在一实施方案中，分别合成肽二聚体的肽单体，并在合成后二聚化。
在另一实施方案中，二聚体的肽单体由其C末端通过支化的叔酰胺接头Lκ部分连接，其中所述的Lκ部分具有能够作为肽合成起始位点的两个官能团和能结合至另一分子部分(例如可以存在于固体支持物的表面)的第三官能团(例如羧基或氨基)。在这种情况中，两个肽单体可以以变化的固相合成技术直接在接头Lκ部分的两个活性氮基团上合成。该合成可以是依次的或同时的。
在另一实施方案中，两个肽单体可以以变化的固相合成技术直接在接头Lκ部分的两个活性氮基团上合成。该合成可以是依次的或同时的。在这个实施方案中，使用的赖氨酸接头(Lκ)部分具有两个能作为肽合成起始位点的氨基、以及第三个能结合至另一分子部分(例如，可以存在于固相支持物的表面)的官能团(例如赖氨酸的羧基、或者赖氨酸酰胺的氨基、其中已将羧基转变成酰胺-CONH2的赖氨酸残基)。
当在接头上进行二聚体肽链的相继合成时，用两个不同的可正交移去的胺保护基团对接头分子上的两个胺功能基团进行保护。受保护的接头通过接头的第三个官能团与固相支持物偶联。移去第一个胺保护基团，并在第一个脱保护的胺部分上合成二聚体的第一个肽。然后，移去第二个胺保护基团，并在第二个脱保护的胺部分上合成二聚体的第二个肽。例如，接头的第一个氨基部分可以用Alloc保护，并且第二个用Fmoc保护。在这种情况中，可将Fmoc基团(而非Alloc基团)通过用温和的碱[例如在二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶]处理移去，并合成第一条肽链。然后用适当试剂[例如Pd(PPh3)/4-甲基吗啉和氯仿]移去Alloc基团并合成第二条肽链。注意，当使用不同的用于半胱氨酸的巯基保护基团来控制二硫键形成(如下文所述)时，即使二聚体肽链的最终氨基酸序列相同，也必须使用这项技术。
当在接头上同时合成二聚体的肽链时，用相同的可移去的胺保护基团保护接头分子的两个胺官能团。受保护的接头通过接头的第三个官能团与固体支持物偶联。在这种情况中，接头的两个受保护的官能团同时脱保护，并且同时在脱保护的胺上合成两条肽链。注意，使用这项技术，二聚体肽链的序列将相同，并且用于半胱氨酸残基的巯基保护基团也都相同。
优选的肽合成方法为固相合成。固相肽合成法为本领域熟知[见，例如Stewart固相肽合成(Freeman and Co.：San Francisco)1969；NovabiochemCorp的2002/2003总目录，美国圣地亚哥；Goodman Synthesis of Peptidesand Peptidomimetics(Houben-Weyl，Stuttgart)2002]。在固相合成中，合成一般用α-氨基保护的树脂从肽的C末端开始。适当的起始物质可以例如通过将所需的α-氨基酸连接至氯甲基化的树脂、羟甲基树脂、聚苯乙烯树脂、二苯甲基胺树脂等进行制备。一种该氯甲基化树脂为Bio RadLaboratories(Richmond，CA)以商品名BIO-BEADS SX-I出售的氯甲基化树脂。羟甲基树脂的制备已有描述(Bodonszky等人(1966)Chem.Ind.London 38：1597)。二苯甲基胺(BHA)树脂已有描述[Pietta and Marshall(1970)Chem.Commun.650]，并且氢氯化物形式可自BeckmanInstruments，Inc.(Palo Alto，CA)商业获得。例如，α-氨基保护的氨基酸可以根据Gisin(1973)HeIv.Chim.Acta 56：1467所述的方法借助于碳酸氢铯催化剂偶联至氯甲基化树脂。
最初的偶联之后，例如在室温下用在有机溶剂中的三氟醋酸(TFA)或盐酸(HCl)溶液移去α-氨基保护基团。此后，紧接着将α-氨基保护的氨基酸偶联至延长的结合支持物的肽链。α-氨基保护基团为那些已知在肽分步合成领域中有用的基团，其中包括：酰基类型的保护基团(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳香的氨基甲酸乙酯类型的保护基团[例如苯甲氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz]、脂肪族氨基甲酸乙酯保护基团[例如叔丁氧羰基(Boc)、异丙氧羰基、环己氧羰基]、以及烷基类型的保护基团(例如苄基、三苯甲基)、芴基甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、和l-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)。
侧链保护基团(一般为醚、酯、三苯甲基、PMC等)在偶联期间保持完整，并且在氨基末端保护基团脱保护期间或偶联期间不被分开。侧链保护基团必须是在完成最终肽合成后、并且在不改变靶肽的反应条件下可移去的。Tyr的侧链保护基团包括四氢吡喃基、叔丁基、三苯甲基、苄基、Cbz、Z-Br-Cbz和2，5-二氯苄基。Asp的侧链保护基团包括苄基、2，6-二氯苄基、甲基、乙基和环己基。Thr和Ser的侧链保护基团包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氢吡喃基、苄基、2，6-二氯苄基和Cbz。Arg的侧链保护基团包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金刚烷氧基羰基酰基磺酰基(Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)或Boc。Lys的侧链保护基团包括Cbz、2-氯代苄氧羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴代苄氧羰基(2-Br-Cbz)、Tos或Boc。
移去α-氨基保护基团之后，对剩余的受保护氨基酸以预期次序逐步进行偶联。每个受保护的氨基酸通常用适当的羧基活化剂以三倍过量进行反应，其中所述的羧基活化剂例如在溶液例如二氯甲烷(CH2Cl2)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)或二环己基碳二亚胺(DCC)。
完成目的氨基酸序列之后，将目的肽通过用试剂例如三氟醋酸(TFA)或氟化氢(HF)处理来从树脂支持物上脱偶联，其中所述试剂不仅从树脂上切割肽，而且切割所有残余的侧链保护基团。当使用氯甲基化的树脂时，氟化氢处理导致形成游离的肽酸。当使用二苯甲基胺树脂时，氟化氢处理直接产生游离的肽酰胺。备选地，当采用氯甲基化的树脂时，侧链受保护的肽可以通过用氨处理肽树脂来脱偶联，进而产生目的侧链受保护的酰胺，或通过用烷基胺处理，产生侧链受保护的烷基酰胺或二烷基酰胺。然后以通常方式通过用氟化氢处理移去侧链保护，产生游离的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。
在制备本发明的酯时，采用用来制备肽酸的树脂，并用碱和适当的醇(例如甲醇)切割侧链受保护的肽。然后以通常方式通过用氟化氢处理移去侧链保护基团来获得预期的酯。
这些方法也可以用来合成在本发明任意化合物的一个、两个或多个位置进行了非20个天然存在的遗传编码氨基酸的氨基酸替代的肽。可以替代入本发明肽的合成性氨基酸包括但不限于N-甲基、L-羟丙基、L-3，4-二羟苯基丙氨酰、δ氨基酸例如L-δ-羟基赖氨酰和D-δ-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰、β氨基酸和异喹啉基。D-氨基酸和非天然存在的合成性氨基酸也可以掺入本发明的肽中。
肽修饰
也可以修饰本发明肽化合物的氨基和/或羧基末端来产生本发明的其它化合物。例如，将氨基末端用乙酸或其卤代衍生物例如α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸乙酰化。
可以将20个遗传编码的氨基酸(或立体异构的D氨基酸)的天然存在侧链替换为其它侧链，例如用例如烷基、低级烷基、环状的4、5、6至7元烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基及其低级酯衍生物、以及用4、5、6至7元杂环的基团替换。具体而言，可以采用其中将脯氨酸残基的环大小从5元变为4、6或7元的脯氨酸类似物。环状基团可以是饱和或不饱和的，并且如果是不饱和的话，可以是芳香的或非芳香的。杂环基团优选包含一个或多个氮、氧和/或硫杂原子。该类基团的实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如硫代吗啉代)和三唑基。这些杂环基团可以是取代或非取代的。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧、或取代或取代的苯基。
可以轻易地通过磷酸化和其它方法修饰肽[例如Hruby等人(1990)Biochem J.268：249-262所述]。
本发明的肽化合物也可以作为具相似生物活性的非肽化合物的结构模型。本领域技术人员知道，有多种技术可以用来构建具有与前述肽化合物相同或类似的预期生物活性、但在溶解性、稳定性以及对水解作用和蛋白水解作用的敏感性上具有比前述化合物更加优良的性质的化合物[见Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24：243-252]。这些技术包括用由磷酸盐、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸组成的主链替换肽主链。
二硫键的形成
本发明的化合物包含两个分子内二硫键。该二硫键可以通过氧化每个肽单体的半胱氨酸残基来形成。
在一实施方案中，通过选择有效优化形成预期异构体的氧化剂类型和浓度来对半胱氨酸键的形成进行控制。例如，当氧化剂为DMSO或碘(I2)时，优先(于形成分子间的二硫键)完成肽二聚体的氧化作用来形成两个分子内的二硫键(每条肽链上一个)。
在其它实施方案中，半胱氨酸键的形成通过在肽合成期间选择性地使用巯基保护基团来控制。例如，当期望含有两个分子内二硫键的二聚体时，将第一个单体肽链合成为核心序列的两个半胱氨酸残基受第一个巯基保护基团[例如三苯甲基(Trt)、烯丙氧基羰基(Alloc)和1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)等]保护，然后将第二个单体肽合成为核心序列的两个半胱氨酸残基受不同于第一种巯基保护基团的第二种巯基保护基团[例如乙酰氨基甲基(Acm)、叔丁基(tBu)等]保护。此后，移去第一个巯基保护基团，实现第一个单体的二硫环化，然后移去第二个巯基保护基团，实现第二个单体的二硫环化。
这项发明的其它实施方案提供了这些二硫化衍生物的类似物，其中一个硫用CH2基团或者硫的其它isotere进行了替换。这些类似物可以自本发明的化合物进行制备，其中每个肽单体包含至少一个C或通过用本领域已知方法[见例如，Barker等人(1992)J.Med.Chem.35：2040-2048以及Or等人(1991)J.Org.Chem.56：3146-3149]进行的分子内或分子间替换来替换第二个C残基的高半胱氨酸残基和α-氨基-γ-丁酸。本领域技术人员轻易地理解，这种替换也可以用α-氨基-γ-丁酸和高半胱氨酸的其它同系物进行。
除了上述环化策略外，也可以采用其它非二硫化肽环化策略。该类备选的环化策略包括例如酰胺环化策略和那些涉及形成硫-醚键的策略。因此，本发明的化合物可以呈现为含分子内酰胺键或分子内硫-醚键的环化形式。例如，肽可以合成为其中核心序列的一个半胱氨酸用赖氨酸替代、并且第二个半胱氨酸用谷氨酸替代。此后，通过这两个残基侧链之间的酰胺键形成环状单体。备选地，可以将肽合成为其中核心序列的一个半胱氨酸被替换为赖氨酸(或丝氨酸)。然后通过赖氨酸(或丝氨酸)残基的侧链和核心序列的第二个半胱氨酸残基之间的硫-醚键形成环状单体。如此地，除了二硫化环化策略外，酰胺环化策略和硫-醚环化策略都可以轻易地用来环化本发明的化合物。备选地，肽的氨基末端可以用α-取代的乙酸封端，其中所述的α-取代基为离去基团，例如α-卤代乙酸，例如α-氯代乙酸、α-溴代乙酸或α-碘代乙酸。
添加支化的叔酰胺接头
肽单体可以通过支化的叔酰胺接头部分二聚化。在一实施方案中，接头在肽合成期间掺入肽。例如，当接头Lκ部分包含两个能够作为肽合成起始位点的官能团以及一个或多个能结合至一个或多个其它分子部分的其它官能团(例如羧基或氨基)时，可以将接头连接至固体支持物。此后，以变化的固相合成技术直接在接头Lκ部分的两个活性氮基团上合成两个肽单体。
在备选的实施方案中，接头可以在肽合成之后连接至肽二聚体的两个肽单体。该连接可以通过本领域熟知的方法完成。在一实施方案中，接头包含两个适合连接至合成的肽单体的目标官能团的官能团。例如，包含两个预活化的或在适当偶联试剂存在时的羧基的接头可以与两个肽单体中每一个的目标赖氨酸侧链胺基反应。
例如，肽单体可以化学偶联至叔酰胺接头，
A＊-C1O-CH2-X-CH2-C2O-B＊
其中：X为NCO-(CH2)2-NH-Y，并且Y为适当的保护基团例如叔丁氧羰基(Boc)保护基团；A＊为用来将接头的C1连接至第一肽单体C末端赖氨酸残基的ε-氨基的适当官能团例如N-氧基琥珀酰亚胺，并且B＊为用来将接头的C2连接至第二肽单体C末端赖氨酸残基的ε-氨基的适当官能团，例如N-氧基琥珀酰亚胺。
此外，例如，肽单体可以化学偶联至叔酰胺接头，
A＊-C1O-CH2-X-CH2-C2O-B＊
其中：X为NCO-(CH2)2-NH-C3O，A＊为用来将接头的C1连接至第一肽单体C末端赖氨酸残基的ε-氨基的适当官能团，例如N-氧基琥珀酰亚胺；并且B＊为用来将接头的C2连接至第二肽单体C末端赖氨酸残基的ε-氨基的适当官能团，例如N-氧基琥珀酰亚胺；并且叔酰胺接头化学结合至间隔物部分，
Y-NH-(CH2)4-C4H-NH-Y
其中X的C3共价键合至间隔物的C4；并且Y为适当的保护基团，例如叔丁氧羰基(Boc)保护基团。
添加赖氨酸接头
肽单体可以通过赖氨酸接头Lκ部分二聚化。在一实施方案中，赖氨酸接头在肽合成期间掺入肽。例如，当赖氨酸接头Lκ部分包含两个能够作为肽合成起始位点的官能团以及第三个能够结合至另一分子部分的官能团(例如羧基或氨基)时，接头可以被连接至固体支持物。此后，可以以变化的固相合成技术直接在赖氨酸接头Lκ部分的两个活性氮基团上合成两个肽单体。
在其中肽二聚体通过赖氨酸接头Lκ部分二聚化的备选实施方案中，所述接头可以在肽合成之后连接至肽二聚体的两个肽单体。该连接可以通过本领域熟知的方法完成。在一实施方案中，接头包含至少两个适合连接至合成的肽单体的目标官能团的官能团。例如，赖氨酸的两个游离胺基可以与两个肽单体中每一个肽单体C末端的羧基反应。
添加间隔物
本发明的肽化合物进一步包含间隔物部分。在一实施方案中，间隔物可在肽合成期间掺入肽。例如，当间隔物含有游离氨基以及第二个能结合至另一分子部分的官能团(例如羧基或氨基)时，间隔物可以被连接至固体支持物。
在一实施方案中，含有两个官能团的间隔物首先通过第一个官能团偶联至固体支持物上。接下来，将具有两个能作为肽合成起始位点的官能团和第三个能结合至另一分子部分的官能团(例如羧基或氨基)的赖氨酸接头Lκ部分通过间隔物的第二个官能团和接头的第三个官能团缀合至间隔物。此后，可以以变化的固相合成技术直接在接头Lκ部分的两个活性氮基团上合成两个肽单体。例如，偶联了具游离胺基的间隔物的固体支持物可以通过接头的游离羧基与赖氨酸接头反应。
在备选的实施方案中，间隔物可以在肽合成之后缀合至肽二聚体。该缀合可以通过本领域熟知的方法完成。在一实施方案中，接头含有至少一个适合连接至所合成肽的目标官能团的官能团。例如，具游离胺基的间隔物可以与肽的C末端羧基反应。在另一实例中，具游离羧基的接头可以与赖氨酸酰胺的游离胺基反应。
聚乙二醇(PEG)的连接
近年来，水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)已经用于具重要治疗和诊断意义的肽的共价修饰。认为此类聚合物的连接增强生物学活性、延长血液循环时间、降低免疫原性、增加水溶性、以及增强对蛋白酶消化的抵抗力。例如，已经报道，PEG共价连接至治疗性多肽例如白细胞介素[Knauf等人(1988)J.Biol.Chem.263；15064；Tsutsumi等人(1995)J.ControlledRelease 33：447)、干扰素(Kita等人(1990)Drug Des.Delivery 6：157)、过氧化氢酶(Abuchowski等人(1977)J.Biol.Chem.252：582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp等人(1983)Anal.Biochem.131：25)以及腺苷脱氨酶(Chen等人(1981)Biochim.Biophy.Acta 660：293)延长了它们在体内的半衰期、和/或降低了它们的免疫原性和抗原性。
本发明的肽化合物可以包含聚乙二醇(PEG)部分，其通过氨基甲酸酯键或酰胺键共价连接至肽二聚体的支化叔酰胺接头或间隔物。用于本发明的PEG的实例是线性、无分支、具有大约20千道尔顿(20K)至大约40K(术语“大约”表示在制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子则比所述分子量小)分子量的PEG。优选地，PEG具有大约30K至大约40K的分子量。
用于本发明的PEG的另一实例是线性、具有大约10K至大约60K(术语“大约”表示在制备PEG时，一些分子比所述分子量大，一些分子则比所述分子量小)分子量的PEG。优选地，PEG具有大约20K至大约40K的分子量。更加优选地，PEG具有大约20K的分子量。
下文描述了PEG共价连接(PEG化)的方法。这些示例性描述不用作限制。本领域普通技术人员知道，在本领域中已很好地建立了多种进行大范围PEG共价连接的方法。因此，通过本领域已知的多种连接方法中的任意一种方法使PEG连接的肽化合物都包含在本发明中。
例如，PEG可以通过活化的PEG分子可结合的活性基团(例如游离的氨基或羧基)而共价结合至接头。PEG分子可以用具不同活性部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)连接至氨基。此类聚合物包括mPEG-琥珀酰亚胺基丁二酸酯、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯、mPEG-亚酰胺化物、mPEG-4-硝基苯基碳酸酯以及mPEG-氰尿酰氯。相似地，PEG分子可以使用具游离胺基的甲氧基化PEG(mPEG-NH2)来连接至羧基。
在一些实施方案中，接头或间隔物含有末端氨基(即定位于间隔物的末端)。这个末端氨基可以与适当活化的PEG分子例如mPEG-对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)反应来形成稳定共价的氨基甲酸酯键。备选地，这个末端氨基可以与适当活化的PEG分子例如含有活性的N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)基团的mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)反应来产生稳定共价的氨基甲酸酯键。在其它实施方案中，接头活性基团含有的羧基能在适当反应条件下被激活而与含胺的PEG分子形成共价键。适当的PEG分子包括mPEG-NH2，并且适当的反应条件包括碳二亚胺介导的酰胺形成等。
EPO-R激动剂活性测试：
体外功能测试
体外的竞争性结合测试对测试肽与EPO竞争结合EPO-R的能力进行定量。例如(见，例如美国专利5,773,569中所述)，可在大肠杆菌(E.coli)中重组产生人EPO-R的细胞外结构域(EPO结合蛋白质，EBP)，并将重组的蛋白质偶联至固体支持物例如微滴定血或合成的珠子[例如PierceChemical Co.(Rockford，IL)的Sulfolink珠子]。然后将固定的EBP与标记的重组EPO或与标记的重组EPO和测试肽孵育。该实验对测试肽采取连续稀释。用未加入测试肽的测试点定义结合EBP的总EPO。对于包含测试肽的反应，对结合的EPO量进行定量，并表达为相对对照(总量＝100％)结合的百分数。将这些值相对肽浓度作图。IC50值定义为将EPO与EBP的结合降低50％(即50％抑制EPO结合)的测试肽浓度。
不同的体外竞争结合测试检测作为两种珠子接近的函数所产生的光信号，其中所述的两种珠子为缀合EPO的珠子和缀合EPO-R的珠子。珠子的接近由EPO和EPO-R的结合产生。竞争EPO结合EPO-R的测试肽阻止这种结合，进而导致光发射的下降。将导致光发射下降50％的测试肽浓度定义为IC50值。
本发明的肽非常有效地竞争EPO与EPO-R的结合。这种增强的功能用它们在相当低的肽浓度抑制EPO结合(即它们具有非常低的IC50值)的能力来表示。
本发明特异结合EPO受体的单体和二聚体的肽EPO-R激动剂的生物活性和潜能可以用体外基于细胞的功能测试来检测。
一个测试基于表达人EPO-R并且进一步转染了fos启动子驱动的萤光素酶报告基因构建体的鼠前B细胞系。在暴露于EPO或另一EPO-R激动剂后，该细胞应答合成萤光素酶。萤光素酶在加入其底物萤光素后导致光发射。因此，在该细胞中EPO-R的活化水平可以通过测定萤光素酶活性来定量。测试肽的活性通过向细胞中加入连续稀释的测试肽、然后孵育4小时来测定。孵育之后，向细胞加入萤光素底物，并测试光的发射。将导致光最大发射值一半的测试肽浓度记录为EC50。
在这项测试中，本发明的肽表现出显著增强的促进EPO-R信号转导依赖的萤光素酶表达的能力。这种增强的功能通过其在相当低的肽浓度产生最大萤光素酶活性的一半的能力(即它们具有非常低的EC50值)来表示。这项测试是评价本发明EPO-R激动剂肽的潜能和活性的优选方法。
另一测试可以用稳定转染了EPO-R的FDC-P1/ER细胞[Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152：1036-1047]来进行，其中所述的细胞为已充分表征的非转化的鼠骨髓衍生的细胞系。这些细胞呈现EPO依赖性增殖。
在一个此种该测试中，将细胞在存在必需生长因子(见，例如美国专利5,773,569中所述)下生长至半稳定密度。然后将细胞在PBS中洗涤，并在无生长因子的全培养基中饥饿16-24小时。测定细胞生存力(例如通过台盼蓝染色)之后，用母液(在无生长因子的全培养基中)制成大约每50μL 105个细胞。在96孔组织培养板中将待测试的肽EPO-R激动剂化合物(一般为与噬菌体结合或其它结合或固定的肽相反的游离溶液相肽)的连续稀释物制成每孔终体积50μL。向每孔中加入细胞(50μL)，并将细胞孵育24-48小时，此时阴性对照应该死亡或休眠。然后通过本领域已知的技术测定细胞增殖，其中所述技术例如测试作为细胞增殖指标的H3-胸苷掺入的MTT测试[见Mosmann(1983)J.Immunol.Methods 65：55-63]。在EPO-R表达细胞系和亲本的非表达细胞系中都对肽进行评估。将测试肽产生细胞增殖最大值一半所必需的浓度记录为EC50。
在这个测试中，本发明的肽表现出显著增强的促进EPO依赖的细胞生长的能力。这种增强的功能通过它们在相当低的肽浓度产生最大细胞增殖刺激活性一半的能力(即它们具有非常低的EC50值)来表示。这个测试是评估本发明的EPO-R激动剂肽的潜能和活性的优选方法。
在另一测试中，将细胞在补充了EPO的培养基中生长至稳定期，收集，然后在无EPO的培养基中再培养18小时。将细胞分成等细胞密度的三组。一组不加入因子(阴性对照)，一组加EPO(阳性对照)，且实验组加入测试肽。然后在不同时间点对培养的细胞进行收集、固定、并用DNA结合的荧光染料(例如碘化丙啶或Hoechst染料，两者Sigma均有售)染色。然后例如用FACS扫描流式细胞仪测定荧光。然后，例如用CeIEFIT软件(Becton Dickinson)的SOBR模型测定细胞周期每个时期的细胞百分数。用EPO或活性肽处理的细胞相比阴性对照组表现为更大部分的细胞处于S期(通过作为增加的DNA含量指示物的增加的荧光而测定)。
相似的测试可以用FDCP-1[见，例如Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152：1036-1047]或TF-1[Kitamura等人(1989)Blood 73：375-380]细胞系进行。FDCP-1是生长因子依赖性鼠多潜能的原始造血祖细胞系，当补充WEHI-3条件培养基(包含IL-3的培养基，ATCC编号TIB-68)时，其能增殖，但不能分化。对于该类实验，对FDCP-1细胞系转染人或鼠EPO-R来分别产生在存在EPO时能增殖但不能分化的FDCP-1-hEPO-R或FDCP-1-mEPO-R细胞系。也可以用EPO依赖性细胞系TF-1来测定肽EPO-R激动剂对细胞增殖的效果。
又在另一测试中，可以采用Krystal(1983)Exp.Hematol 11：649-660中所述的基于H3-胸苷掺入脾细胞的微阵列的方法来确定本发明化合物作为EPO激动剂的能力。简而言之，对B6C3F1小鼠每天注射苯肼(60mg/kg)，注射两天。在第三天，取出脾细胞并用MTT测试法确定其在24小时期间的增殖能力。
在促红细胞生成素应答的细胞系中EPO与EPO-R的结合诱导受体和多种细胞内蛋白质的酪氨酸磷酸化，其中所述的蛋白质包括Shc、vav和JAK2激酶。因此，另一体外测试检测本发明肽诱导EPO-R和下游细胞内信号传导蛋白质酪氨酸磷酸化的能力。通过上述结合和增殖测试鉴定的活性肽引起的磷酸化模式与促红细胞生成素应答的细胞中EPO引起的模式几乎完全相同。对于这项测试，将FDC-P1/ER细胞[Dexter等人(1980)JExp Med 152：1036-47]维持在补充了EPO的培养基中，并生长至稳定期。然后在无EPO的培养基中培养这些细胞24小时。然后将确定数目的这类细胞在37℃与测试肽孵育大约10分钟。具EPO的细胞对照样品也进行每项测试。然后将处理的细胞通过离心收集，重悬在SDS裂解缓冲液中，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将在凝胶中电泳移动的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并通过标准免疫技术显示印迹上含磷酸酪氨酸的蛋白质。例如，印迹可以用抗磷酸酪氨酸的抗体(例如Upstate Biotechnology，Inc.的小鼠抗磷酸酪氨酸IgG)探测、洗涤、然后用二抗[例如Kirkegaard&PerryLaboratories，Inc.(Washington，DC)过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG]探测。此后，通过包括色度、化学发光或荧光检测在内的标准技术显示含磷酸酪氨酸的蛋白质。例如，用Amersham的ECL Western印迹系统进行化学发光测试。
另一可以用来评估本发明肽活性的基于细胞的体外测试为使用鼠骨髓或人外周血细胞的集落测试。鼠骨髓可从小鼠股骨获得，而人外周血样品从健康受体获得。在外周血的情况中，先例如通过Ficoll-Hypaque梯度离心[Stem Cell Technologies，Inc.(Vancouver，Canada)]从血液中分离单核细胞。对于这个测试，对有核细胞进行计数来确定原始样品中有核细胞的数量和浓度。将确定数量的细胞按照厂商说明书在甲基纤维素膜上铺板[Stem Cell Technologies，Inc.(Vancouver，Canada)]。实验组用测试肽处理，阳性对照组用EPO处理，并且阴性对照组不进行处理。然后在确定的孵育期通常为10天和18天之后计数每组生长的集落的数目。活性肽将促进集落形成。
在Greenberger等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2931-2935(EPO-dependent hematopoietic progenitor cell line)、Quelle和Woj chowski(1991)J.Biol.Chem.266：609-614(protein tyrosine phosphorylation inB6SUt.EP cells)、Dusanter-Fourt等人(1992)J.Biol.Chem.287：10670-10678(tyrosine phosphorylation of EPO-receptor in humanEPO-responsive cells)、Quelle等人(1992)J.Biol.Chem.267：17055-17060(tyrosine phosphorylation of a cytosolic protein，pp 100，in FDC-ER cells)、Worthington等人(1987)Exp.Hematol.15：85-92(colorimetric assay forhemoglobin)、Kaiho和Miuno(1985)Anal.Biochem.149：117-120(detectionof hemoglobin with 2，7-diaminofiuorene)、Patel等人(1992)J.Biol.Chem.267：21300-21302(expression of c-myb)、Witthuhn等人(1993)Cell74：227-236(association and tyrosine phosphorylation ofJAK2)、Leonard等人(1993)Blood 82：1071-1079(expression of GATA transcription factors)以及Ando等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9571-9575(regulationof Gi transition by cycling D2and D3)中公开了其它可以用来显示本发明化合物活性的体外生物学测试。
已经报道，由Molecular Devices Corp.设计的已知为Microphysiometer的装置成功地用于测试激动剂和拮抗剂对多种受体的效果。这种装置的基础是测试响应受体活化后细胞外介质的酸化率的改变。体内功能测试
一种能用来评估测试肽潜能的体内功能测试是红细胞增多的低氧小鼠生物测试。对于这项测试，对小鼠进行几天变化的条件周期。在这个周期中，小鼠在低压条件期间和环境压力条件期间之间变化。此后，在施用测试样品之前将小鼠维持在环境压力2-3天。将测试肽样品或者阳性对照小鼠情况下的EPO标准品皮下注射入受调节过的小鼠。两天之后施用放射性标记的离子(例如59Fe)，并在施用放射性标记的铁两天后采取血液样品。然后通过标准技术测定每个血液样品的血细胞比容和放射性。来自注射了活性测试肽的小鼠的血液样品将比未接受测试肽或EPO的小鼠显示更大的放射性(由于红细胞血红蛋白结合Fe59)。
另一可以用来评估测试肽潜能的体内功能测试是网织红细胞测试。对于这项测试，连续三天对正常未作处理的小鼠皮下注射EPO或测试肽。在第三天，也向小鼠腹膜内注射葡聚糖铁。在第五天，从小鼠收集血液样品。通过噻唑橙染色和流式细胞仪分析(网织红细胞计数程序)测定血液中网织红细胞的百分数(％)。此外，手动测定血细胞比容。校正的网织红细胞百分数用下列公式确定：
％网织红细胞校正的＝％网织红细胞观察的X(血细胞比容个体的/血细胞比容正常的)
活性的测试化合物将显示相比未接受测试肽或EPO的小鼠增加的％网织红细胞校正的水平。
本发明的EPO-R激动剂肽的用途
本发明的肽化合物作为在体外理解EPO生物学作用的工具非常有用，其中包括评估许多认为影响EPO产生和EPO与EPO-R结合的因子以及被EPO产生和EPO与EPO-R结合影响的因子(例如EPO/EPO-R信号转导/受体激活的机制)。本发明肽也在研发其它结合EPO-R的化合物中有用，因为本发明的化合物提供了重要的促进研发的结构-活性关系的信息。
此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽能够用作检测活细胞上、固定的细胞上、生物学液体中、组织匀浆中、纯化的天然生物学材料等中的EPO-R的试剂。例如，通过标记此类肽，可以鉴定在其表面上具有EPO-R的细胞。此外，基于其结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用于原位染色、FACS(荧光激活的细胞分选)分析、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测试)等等。此外，基于其结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用于受体纯化或纯化在细胞表面(或在透化处理的细胞内部)表达EPO-R的细胞。
本发明的肽也可以用作多种医学研究和诊断目的的商业试剂。此类用途包括但不限于：(1)在多种功能测试中作为定量候选的EPO-R激动剂活性的校准标准品的用途；(2)在随机肽筛选即在寻找EPO-R肽配体新家族中作为阻断试剂的用途，肽可以用来阻断本发明EPO肽的回收；(3)在与EPO-R共结晶中的用途，即可以形成结合至EPO-R的本发明肽的晶体，使得能够通过X射线结晶学确定受体/肽的结构；(4)测定红细胞前体细胞通过启动分化而诱导珠蛋白合成和血红素复合体合成的能力的用途、以及增加铁蛋白受体数量的用途；(5)维持EPO-依赖性细胞系例如FDCP-1-mEPO-R和TF-1细胞系的增殖和生长的用途；(6)涉及用放射性发色团标记本发明肽的用途；以及(7)其它研究和诊断应用，其中EPO-R优选为活化的，或者此种活化方便地校准已知量的EPO-R激动剂等。
此外，在本发明的另一方面，提供了治疗和制备药物的方法。可以将本发明的肽化合物施用至包括人在内的温血动物来在体内模拟EPO与EPO-R的结合。因此，本发明包含治疗性治疗与EPO缺陷相关的疾病的方法，其中所述方法包括施用足以在体内刺激EPO-R、并因此减轻与EPO缺陷相关的症状的量的本发明肽。例如，本发明的肽在治疗肾功能不足和/或末期肾衰竭/透析、与AIDS相关的贫血、与慢性炎症疾病(例如类风湿性关节炎和慢性肠炎)相关的贫血以及自身免疫疾病，以及在外科手术前增加患者的血红细胞数量中发现有用。其它可通过施用本发明肽治疗的疾病状态、疾病和血液异常病症包括β-地中海贫血、囊性纤维化、妊娠和月经性疾病、早产儿早期贫血、脊髓损伤、宇宙飞行所致疾病、急性血液损失、衰老、中风、局部缺血(CNS局部缺血和心局部缺血)、以及多种伴随异常红细胞生成的肿瘤疾病。
在其它实施方案中，本发明的肽化合物可以用来治疗不具有低或缺陷的血红细胞特征的疾病，例如在输液前的预处理。此外，施用本发明的化合物可以使流血时间缩短，并因此在患者外科手术前施用或者在指示预计发生流血中发现有用。此外，本发明的化合物在活化巨核细胞中发现有用。
由于已经表明EPO对血管内皮细胞有促有丝分裂和趋化性作用、并且对中枢胆碱能神经元有作用[见，例如Amagnostou等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：5978-5982和Konishi等人(1993)Brain Res.609：29-35]，所以这项发明的化合物也在治疗多种血管疾病中发现有用，例如促进伤口愈合、促进侧枝冠状血管(例如那些在心肌梗塞后出现的血管)的生长、创伤治疗以及血管移植后的治疗。这项发明的化合物也在治疗多种神经性疾病中发现有用，其中所述疾病通常以低的乙酰胆碱绝对水平或者与其它神经活性物质例如神经递质相比低的乙酰胆碱相对水平作为特征。
药物组合物
此外，在本发明的另一方面，提供了上述EPO-R激动剂肽化合物的药物组合物。通过施用此类组合物缓和或调节的病症包括上文所述的那些病症。此类药物组合物可以通过经口的、肠胃外的(肌内的、腹膜内的、静脉内的(IV)或皮下的注射)、经皮的(被动或者使用离子电渗疗法或电穿孔法)、经黏膜的(鼻的、阴道的、直肠的或舌下的)给药途径或使用可生物蚀解的嵌入体进行施用，并且可以制剂成适合每种施用途径的剂型。一般而言，本发明包含的药物组合物包含有效量的本发明EPO-R激动剂肽或衍生产物、以及可药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物包括多种缓冲物成分(例如Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂、添加剂例如去污剂和增溶剂(例如吐温20、吐温80、聚山梨酸酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苄醇)和增容物质(例如乳糖、甘露醇)、掺入聚合化合物微粒制剂或脂质体的物质，其中所述聚合化合物例如聚乳酸、聚羟乙酸等。也可以使用透明质酸(hylauronic acid)。此类组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，MackPublishing Co.，Easton，PA 18042)1435-1712页，其在此处引入作为参考。组合物可以制备成液体形式，或者干粉(例如冷冻干燥的)形式。
经口递送
本文考虑的用途为通常在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton PA 18042)89章中描述的经口的固体剂型，其中所述文献在此处引入作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、糖锭剂或锭剂、扁囊剂、小丸剂、粉末剂或颗粒剂。此外，脂质体或类蛋白胶囊化可以用来制剂本组合物(例如美国专利号4,925,673中报道的类蛋白小球体)。可以使用脂质体的胶囊化，并且可以用多种聚合物衍生脂质体(例如美国专利号5,013,556)。在由G.S.Banker和CT.Rhodes编辑的Modern Pharmaceutics第10章，1979中Marshall，K给出了进行治疗的可能固体剂型的描述，该文献引入本文作为参考。一般而言，制剂包括EPO-R激动剂肽(或其化学修饰形式)和提供针对胃环境的防护的惰性成份，并且在肠中释放生物活性物质。
本文还考虑的用途为经口施用的液体剂型，包括可药用的乳剂、溶液剂、悬浮液和糖浆剂(其可含有其它组分，包括惰性稀释剂)、佐剂例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、以及甜化剂、调味剂和加香剂。
可以对肽进行化学修饰以便有效地经口递送衍生物。一般而言，考虑的化学修饰为将至少一个部分连接至组分分子本身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解作用、以及(b)从胃或肠中吸收进入血流。也预期组分的总体稳定性增加，并且在身体内的循环时间增加。如上所述，对于药物用途，PEG化是优选的化学修饰。可以使用的其它部分包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚体、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊烷和聚-l，3，6-tioxocane[见，例如Abuchowski和Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″在Hocenberg和Roberts编辑的Enzymes as Drugs一书中(Wiley-Interscience：New York，NY)pp.367-383；以及Newmark等人(1982)J.Appl.Biochem.4：185-189]。
对于经口制剂，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员具有不在胃中溶解、但在十二指肠或肠的其它位置释放物质的可用制剂。优选地，通过保护肽(或衍生物)或通过远离胃环境例如在肠中释放肽(或衍生物)来避免释放对胃环境的有害作用。
为了保证充分的胃抗性，至少pH5.0不能通透的包衣是必需的。更加常见的用作肠包衣的惰性成份的实例为偏苯三酸乙酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和Shellac。
也可以在片剂上使用一种包衣或包衣的混合物，其中所述一种包衣或包衣混合物不是用来针对胃进行防护的。这可以包括糖包衣或者使片剂更容易吞咽的包衣。胶囊可以由递送干治疗物(即粉末)的硬壳(例如明胶)组成，对于液体形式则可以使用软明胶壳。扁囊剂的外壳材料可以是稠淀粉或其它可食用的纸。对于丸剂、锭剂、成型的片剂或片剂研磨剂，可以使用湿润集块技术(moist massing technique)。
肽(或衍生物)可以以细小的多微粒包括在制剂中，在颗粒剂或片剂中为大约1mm颗粒大小。进行胶囊施用的物质的制剂也可以为粉末、轻度压缩的栓剂或者甚至是片剂。这些治疗剂可以通过压缩制备。
也可以包括着色剂和/或调味剂。例如，可以对肽(或衍生物)进行制剂(例如通过脂质体或小球体胶囊化)，然后进一步在其中包含可食用的产物，例如包含着色剂和调味剂的冷藏饮料。
可以用惰性物质稀释或增加肽(或衍生物)的体积。这些稀释剂包括糖类，尤其是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。一些无机盐也可以用作填充剂，其中包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商品化的稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在治疗性制剂中崩解剂可以包含入固体剂型。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的市售崩解剂Explotab。淀粉甘醇酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素纳、ultramylopectin、海藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和皂土都可以使用。崩解剂也可以是不可溶的阳离子交换树脂。粉末性树胶可以用作崩解剂和粘合剂，并且可以包括粉末性树胶例如琼脂、Karaya和西黄蓍胶。海藻酸及其钠盐也可以用作崩解剂。
粘合剂可以用来将肽(或衍生物)维持在一起而形成硬的片剂，并且包括来自天然产物例如阿拉伯胶、西黄蓍胶、淀粉和明胶的物质。其它物质包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用在含醇的溶液中来粒化肽(或衍生物)。
肽(或衍生物)的制剂中可以包括抗磨擦剂来防止制剂过程中的粘附。可以使用润滑剂作为肽(或衍生物)和模具壁之间的层，并且这些润滑剂可以包括但不限于硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以用可溶性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
可加入提高制剂过程中药物流动性、并且在压缩过程中帮助重排的助流剂。助流剂包括淀粉、滑石、氧化硅和水合的硅铝化合物。
为了帮助将肽(或衍生物)溶解入含水的环境，可以加入表面活性剂来作为湿润剂。表面活性剂包括阴离子去污剂例如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠和二辛基碘酸钠。可以使用阳离子去污剂，并且可包括苯扎氯铵(benzalkonium chloride)或苯索氯铵。可包括在制剂中作为表面活性剂的潜在的非离子去污剂名单为Lauromacrogol 400、硬脂酸40聚烃氧基酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或作为不同比率的混合物存在于蛋白质或衍生物的制剂中。
可以期望受控释放的经口制剂。可以将肽(或衍生物)掺入允许通过扩散或滤取机制而释放的惰性基质中，例如树胶中。也可以在制剂中掺入缓慢降解的基质。一些肠道包衣也具有延迟释放的效果。另外一种受控释放的形式为通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即将药物封装在半渗透膜中，其中所述半透膜允许水进入，并由于渗透效果将药物通过单一小孔推出来。
其它的包衣可以用于制剂。这些包括多种可应用在包衣锅中的糖。肽(或衍生物)也可以以膜包衣片剂给出，并将在这种情况中使用的材料分为两组。第一组为非肠道性材料，并且包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组由邻苯二甲酸的常见酯的肠道材料组成。
也可以使用材料的混合物来提供最适的膜包衣。膜包被可以在包衣锅或流化床中或通过压缩包衣进行。
肠胃外递送
用于肠胃外施用的根据本发明的制剂包括无菌含水或不含水的溶液、悬浮液或乳剂。非含水的溶剂或载体的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和玉米油、明胶、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。此类剂型也可以含有佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可以通过例如经细菌阻留性过滤器过滤、通过将灭菌剂掺入组合物、通过照射组合物、或者通过加热组合物来进行灭菌。它们也可以在使用前用无菌水或一些其它无菌可注射的介质来制造。
直肠或阴道递送
进行直肠或阴道施用的组合物优选栓剂，其中所述栓剂除了活性物质外还可以包含赋形剂例如可可黄油或栓剂蜡。用于鼻或舌下施用的组合物也可以用本领域熟知的标准赋形剂制备。
经肺递送
本文也考虑经肺递送EPO-R的激动剂肽(或其衍生物)。将肽(或其衍生物)在吸入时递送至哺乳动物肺，并经过肺上皮衬细胞进入血流[见，例如Adjei等人(1990)Pharmaceutical Research 7：565-569；Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics 63：135-144醋酸柳培林(leuprolide acetate)；Braquet等人(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)：143-146内皮素-1(endothelin-1)；Hubbard等人(1989)Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212，(α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin))；Smith等人(1989)J.Clin.Invest.84：1145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein等人(1990)″Aerosolization ofProteins″，Proceedings of Symposium on RespiratoryDrug Delivery II Keystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs等人(1988)J.Immunol.140：3482-3488(γ-干扰素和α-肿瘤坏死因子)；以及Plate等人的美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。Wong等人在美国专利号5,451,569中描述了进行全身作用的经肺递送药物的方法和组合物。
在实践本发明中考虑了使用大范围的设计用来经肺递送治疗性产物的机械装置，其中包括但不限于喷雾器、计量的剂量吸入器以及粉末吸入器，其中所述这些装置都为本领域技术人员所熟悉。一些适合应用这项发明的商品化装置的特定实例是Ultravent喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)、Acorn II喷雾器(Marquest Medical Products，Englewood，CO)、Ventolin计量的剂量吸入器(Glaxo Inc.，Research Triangle Park，NC)以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.，Bedford，MA)。
所有此类装置都需要使用适于分配肽(或衍生物)的制剂。一般而言，每种制剂对所用装置类型都是特异的，并且除了在治疗中使用的常见稀释剂、佐剂和/或载体外还可涉及使用适当的推进物质。此外，也考虑了使用脂质体、微胶囊或微球体、包含物复合体或其它类型的载体。也可以根据化学修饰的类型或所用装置的类型将化学修饰的肽制备于不同的制剂中。
适合使用喷雾器(喷射或超声的)的制剂一般包含以每毫升溶液大约0.1-25mg生物活性蛋白质的浓度溶于水的肽(或衍生物)。制剂也可包括缓冲剂和简单的糖(例如用于稳定蛋白质和调节渗透压)。喷雾制剂也可以含有表面活性剂来降低或防止由于形成烟雾剂时溶液雾化造成的表面诱导的肽(或衍生物)聚集。
使用计量剂量的吸入器装置的制剂通常包含细小分开的粉末，其中所述粉末含有在表面活性剂协助下悬浮在推进剂中的肽(或衍生物)。为这个目的所采用的推进剂可以是任意常规的物质，例如含氯氟烃、氢化含氯氟烃(hydrochlorofluorocarbon)、氢氟烃(hydrofluorocarbon)或烃类，其包括三氯氟甲烷、二氟二氯甲烷、二氯四氟甲烷、和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合物。适当的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯和大豆磷脂酰胆碱。油酸也可以用作表面活性剂。
用于自粉末吸入器分配的制剂包含细小分开的含有肽(或衍生物)的千粉，并且也可以包括促进粉末从装置分配的量例如制剂重量50-90％的增容剂，例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇。为了最有效地递送至远端的肺，肽(或衍生物)应当最有利地制剂成平均颗粒大小低于10mm(或微米)、最优选0.5-5mm的颗粒形式。
经鼻递送
也考虑了经鼻递送EPO-R的激动剂肽(或衍生物)。经鼻的递送允许在将治疗性产物施用至鼻后直接传送至血流，而不需要在肺中沉积产物。经鼻递送的制剂包括那些包含葡聚糖或环葡聚糖的制剂。
使用本发明的肽时也考虑了其它用来促进经鼻递送的穿透增强剂(如2003年12月17日提交的国际专利公开号WO 2004056314中所述，其在此处以整体引入作为参考)。
剂量
对于所有肽化合物，随着进一步研究的进行，出现了关于在多种患者中治疗多种病症的适当剂量水平的信息，并且普通技术人员能在考虑治疗内容、年龄以及受体总体健康而确定适当剂量。所选剂量取决于预期的治疗效果、给药途径和预期的治疗持续时间。一般向哺乳动物每天施用0.001-10mg/kg体重的剂量水平。一般而言，静脉注射或输注的剂量更低一些。
在某些实施方案中，本发明的任意一种肽都可以用来治疗患透析前或透析期间肾衰竭的个体(透析前或透析患者)。在这个实施方案中的治疗剂量范围可以为0.025-0.2毫克(mg)化合物每1千克(kg)个体体重(0.025-0.2mg/kg)。更加具体地，优选0.05-0.1mg/kg的剂量范围。此外，医生开始时可以使用以0.025mg/kg起始的渐升的剂量，然后对每个正治疗的个体以其个体的血红蛋白反应为基础逐步增加大约0.025mg/kg的剂量。因此，医生可以对每位个体调整剂量直至达到足够的血红蛋白反应。在个体为透析前或透析患者的情况中，足够的血红蛋白反应将大约获得正常的血红蛋白水平(14-15g/dL)或医生确定的另一血红蛋白水平。在这个实施方案中，预计每位单独的透析前或透析患者的药理学有效剂量(PAD)为0.067-0.075mg/kg。这个实施方案的优点预计是对每位个体患者每三至四周一次的较低剂量频率，而非其它当前红细胞生成刺激剂(ESA)情况中的每周一次。可以使用许多给药途径(如上文所述的经口的、IV等)。对透析患者优选的给药途径是经静脉的。对透析前患者优选的给药途径是经皮下的。在其它一些实施方案中，上述化合物中的一种化合物可以用来治疗患伴随恶性肿瘤的贫血的个体(肿瘤患者)。在这个实施方案中的治疗剂量范围预计为透析前或透析患者的三至五倍(即0.075-0.5mg/kg)。更加具体而言，优选0.2-0.4mg/kg的剂量范围。如上文，治疗肿瘤患者的医生可以逐步增加剂量，以0.075mg/kg起始，并以0.075mg/kg的增量增加直至获得足够的血红蛋白反应。预计每位单独的肿瘤患者的PAD为大约0.25mg/kg。同样，预计具有对每位独立患者每三至四周施用一次的较低频率剂量的优点。此外，对肿瘤患者的其他优点是可在化学疗法之前(例如提前3-5天)施用或者与化学疗法共施用来在网织红蛋白刺激和血红蛋白增加之间的延迟期防止血红蛋白降低。可以使用许多给药途径(如上文所述的经口的、IV等，如上所述)。对肿瘤患者，皮下施用是优选的给药途径。用来治疗透析前、透析或肿瘤患者的优选化合物包括下文显示的那些化合物。
氨基甲酸酯键合、无肌氨酸、并且在PEG分子量的范围内(此处显示SEQID NO：1)：
Figure A20068002699100621
氨基甲酸酯键合、无肌氨酸、并且具优选的PEG分子量(此处显示SEQ IDNO：1)：
Figure A20068002699100631
Figure A20068002699100641
氨基甲酸酯键合、具肌氨酸、并且在PEG分子量的范围内(此处显示SEQID NO：2)：
Figure A20068002699100651
氨基甲酸酯键合、具肌氨酸、并且具优选的PEG分子量(此处显示SEQ IDNO：2)：
Figure A20068002699100652
Figure A20068002699100661
酰胺键合、无肌氨酸、并且在PEG分子量的范围内(此处显示SEQ ID NO：1)：
Figure A20068002699100671
酰胺键合、无肌氨酸、并且具优选的PEG分子量(此处显示SEQ ID NO：1)：
Figure A20068002699100681
Figure A20068002699100691
酰胺键合、具肌氨酸、并且在PEG分子量的范围内(此处显示SEQ ID NO：2)：
Figure A20068002699100692
酰胺键合、具肌氨酸、以及优选的PEG分子量(此处显示SEQ ID NO：2)：
Figure A20068002699100701
Figure A20068002699100711
本发明的肽(或其衍生物)可以与一种或多种其它的活性成分或药物组合物联合施用。
实施例
本发明接下来通过下列实施例进行描述。然而，无论在说明书哪个位置的这些以及其它实施例都仅为示例性的，并且不限制本发明或其任意例证形式的范围和意义。同样，本发明不限于本文所述的任何特定优选实施方案。事实上，本领域技术人员在阅读本说明后清楚本发明的许多改进和变化，并且可以不偏离其主旨和范围进行上述改进和变化。因此，本发明仅受所附权利要求书的条款以及权利要求书赋予的等同物的全部范围限制。
实施例1：通过固相合成法合成EPO-R激动剂肽二聚体
步骤1-合成Cbz-TAP：将在无水DCM(100ml)中的含商业可获得的二胺(Aldrich Chemical Co.的″TAP″)(10g，67.47mmol)的溶液冷却至0℃。通过滴液漏斗在6-7小时期间缓慢加入在无水DCM(50ml)中的氯甲酸苄酯(4.82ml，33.7mmol)溶液，将反应混合物的温度一直维持在0℃，然后允许升温至室温(～25℃)。再过16小时，在真空下移去DCM，并在3N HCl和醚之间分配残余物。收集含水层，用50％含水NaOH中和至pH8-9，并用乙酸乙酯提取。将乙酸乙酯层经无水Na2SO4干燥，然后再真空下浓缩来提供粗的单-Cbz-TAP(5g，大约50％的产率)。下一步反应使用这个化合物，而不进行任何进一步的纯化。
Figure A20068002699100721
步骤2-合成Cbz-TAP-Boc：向剧烈搅拌的在己烷(25ml)中的Cbz-TAP(5g，17.7mmol)悬浮液中加入Boc2O(3.86g，17.7mmol)，并在RT持续搅拌过夜。将反应混合物用DCM(25ml)稀释，并用10％含水的柠檬酸(2X)、水(2X)和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，并在真空下浓缩。粗产物(产率5g)直接用于下一步的反应。
Figure A20068002699100722
步骤3-合成Boc-TAP：将前面反应的粗产物溶解在甲醇(25ml)中，并在存在碳上5％Pd(5％w/W)下在球囊压力(balloon pressure)下氢化16小时。过滤混合物，用甲醇洗涤，并在真空下浓缩滤液来提供粗的H-TAP-Boc产物(产率3.7g)。步骤1-3后Boc-TAP的总的大约产率为44％(基于所用Cbz-C1的量计算)。
Figure A20068002699100723
步骤4-合成TentaGel-接头：在20mL DMF中将TentaGel溴化物(2.5g，0.48mmol/g，购自Rapp Polymere，德国)、酚型接头(5当量)和K2CO3(5当量)在70℃加热14小时。冷却至室温之后，洗涤(0.1N HCl、水、ACN、DMF、MeOH)树脂，并干燥来给出琥珀色的树脂。
Figure A20068002699100731
步骤5-合成TentaGel-接头-TAP(Boc)：在1∶1的MeOH-THF混合物中混合2.5mg上述树脂、H-TAP-Boc(1.5mg，5当量)和冰醋酸(34μl，5当量)，并振荡过夜。向这个混合物中加入在THF中的1M氰基硼氢化钠(5当量)溶液，并再振荡7小时。将树脂过滤、洗涤(DMF、THF、0.1N HCl、水、MeOH)并干燥。将少量树脂用在DCM中的Bz-Cl和DIEA苯甲酰化，用70％的TFA-DCM切割，并通过LCMS和HPLC确认。
Figure A20068002699100732
步骤6-合成TentaGel-接头-TAP-Lys：用活化的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH溶液(用以0.5M溶于DMF的5当量氨基酸和5当量HATU，随后加入10当量DIEA制备)处理上述树脂，并轻摇14小时。洗涤树脂(DMF、THF、DCM、MeOH)、并干燥树脂来产生受保护的树脂。残余的胺基通过用在DCM中的10％乙酸酐、20％吡啶的溶液处理树脂20分钟来进行封端，随后如上洗涤。Fmoc基团通过在DMF中的30％哌啶中轻摇树脂20分钟来移去，随后洗涤(DMF、THF、DCM、MeOH)并干燥。
步骤7-合成TentaGel-接头-TAP-Lys(肽)2：对上述树脂重复下列循环来同时构建两条肽链，其中所述重复循环为用HBTU/HOBt活化作用进行Fmoc-氨基酸偶联和用哌啶移去Fmoc。这可以在Applied Biosystems，Inc.有售的ABI 433自动肽合成仪上方便地进行。在最后的Fmoc移去之后，将末端胺基用在DMF中的乙酸酐(10当量)和DIEA(20当量)酰化20分钟，然后如上进行洗涤。
Figure A20068002699100741
步骤8-自树脂切割：将上述树脂在室温下在TFA(82.5％)、苯酚(5％)、乙二硫醇(2.5％)、水(5％)和苯硫基甲烷(5％)的溶液中悬浮3小时。也可以使用备选的切割性混合物例如TFA(95％)、水(2.5％)和三异丙基硅烷(2.5％)。将TFA溶液冷却至5℃、并倾入Et2O中来沉淀肽。减压下过滤并干燥来给出预期的肽。通过用装备了C18柱的制备HPLC纯化来提供纯肽。
Figure A20068002699100742
步骤9-氧化肽来形成分子内的二硫键：将肽二聚体溶解在20％的DMSO/水(1mg肽干重/mL)中，并在室温放置36小时。通过将反应混合物上样至C18HPLC柱(Waters Delta-Pak C18，15微米颗粒大小，300埃孔大小，40mm×200mm长)、然后以5-95％ACN的线性ACN/水/0.01％TFA梯度在40分钟期间纯化肽。冷冻干燥包含预期肽的级分提供松散的白色(fluffy white)固体。
步骤10-末端NH2基团的PEG化：
通过氨基甲酸酯键PEG化：将肽二聚体与1.5当量(基于摩尔计算)在无水DMF中的活化的PEG种类(购自NOF Corp.Japan的mPEG-NPC)混合来提供清亮的溶液。5分钟后，向上述溶液中加入4当量的DIEA。在环境温度搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC进行纯化。PEG化的肽的结构通过MALDI质谱确认。也通过下文概述的阳离子交换层析对纯化的肽进行纯化。下图显示使用SEQ ID NO：3的mPEG-NPC PEG化。
Figure A20068002699100752
通过酰胺键的PEG化：将肽二聚体与1.5当量(基于摩尔计算)在无水DMF中的1当量活化的PEG种类(购自Shearwater Corp，USA的PEG-SPA-NHS)混合来提供清亮的溶液。5分钟后，向上述溶液中加入10当量的DIEA。在环境温度搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC进行纯化。PEG化的肽的结构通过MALDI质谱确认。也通过下文概述的阳离子交换层析对纯化的肽进行纯化。下图显示使用SEQ ID NO：3的PEG-SPA-NHS PEG化。
步骤11-离子交换纯化：对几种交换载体调查了其从未反应的(或水解了的)PEG分离上述肽-PEG缀合物的能力、以及其保留起始的二聚体肽的能力。将离子交换树脂(2-3g)加载入1cm柱，随后转变为钠形式(将0.2N NaOH加载至柱，直至洗出液pH为14，大约5个柱体积)，然后转变为氢形式(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱，直至与洗出液匹配的装载pH，大约5个柱体积)，随后用25％ACN/水洗涤直至pH为6。将缀合前的肽或肽-PEG缀合物溶解在25％的ACN/水(10mg/mL)中，并用TFA将pH调整为＜3，然后加载至柱。在用2-3个柱体积的25％ACN/水洗涤并收集5mL级分之后，通过用在25％ACN/水中的0.1M NH4OAc洗涤来将肽从柱上释放下来，再次收集5mL级分。通过HPLC分析来显示那些级分含有预期的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)的分析表明，当肽保留在柱上、并用NH4OAc溶液洗脱(通常介于级分4和10之间)时，没有观察到非缀合的PEG污染。当肽在最初的洗涤缓冲液(通常为最初的两个级分)中洗脱时，没有观察不到预期的PEG缀合物和过量的PEG的分离。
下列柱成功地保留了肽和肽-PEG缀合物这两者，并且成功地从非缀合肽中纯化肽-PEG缀合物。
表1：离子交换树脂
  载体   来源
  Mono S HR 5/5强阳离子交换预载柱 Amersham Biosciences
  SE53纤维素，微粒强阳离子交换载体 Whatman
  SP琼脂糖快速流动强阳离子交换载体 Amersham Biosciences
实施例2：通过片段缩合合成EPO-R激动剂肽二聚体
步骤1-合成(Cbz)2-Lys：将赖氨酸在标准条件下与氯甲酸苄酯溶液反应来获得其两个氨基都用Cbz基团保护的赖氨酸。
Figure A20068002699100771
步骤2-合成Boc-TAP：如实施例1的步骤1-3合成Boc-TAP。
步骤3-偶联(Cbz)2Lys和Boc-TAP：在标准偶联条件下偶联(Cbz)2-Lys和Boc-TAP来获得(Cbz)2-Lys-TAP-Boc。
Figure A20068002699100772
步骤4-Lys-TAP-Boc：将上述反应的粗产物溶解在甲醇(25ml)中，并在球囊压力(balloon pressure)下在存在碳上5％Pd(5％w/W)时氢化16小时。过滤混合物、用甲醇洗涤，并在真空中浓缩滤液来提供粗的Lys-TAP-Boc产物
步骤5-通过片段缩合合成肽单体：通过标准技术合成肽单体序列的四个肽片段。然后对这些部分受保护的片段进行两轮独立的偶联。在第一轮中，N末端一半的单体通过偶联两个肽片段形成，而C末端一半的单体通过偶联另外两个肽片段形成。在第二轮偶联中，偶联N末端和C末端的两半来形成完全受保护的单体。然后通过标准技术对单体进行OBn-脱保护。
Figure A20068002699100781
步骤6-氧化肽单体来形成分子内的二硫键：然后用碘化物氧化OBn-脱保护的缩合的肽单体(SEQ ID NO：12)来在单体的Acm-保护的半胱氨酸残基之间形成分子内二硫键。
步骤7-将Lys-TAP-Boc偶联至氧化的OBn脱保护的单体来形成肽二聚体：在标准条件下将Lys-TAP-Boc偶联至两倍摩尔过量的氧化的OBn脱保护的单体来形成肽二聚体。然后在标准条件下对肽二聚体进行脱保护。
步骤8-PEG化脱保护的二聚体：然后如实施例1的步骤10所述对脱保护的肽二聚体进行PEG化。
步骤9-离子交换纯化：然后如实施例1的步骤11所述对PEG化的肽二聚体进行纯化。
实施例3：体外活性测试
这个实施例描述了多种体外用来评估本发明EPO-R激动剂肽的活性和效能的检测法。这些测试的结果证明这项发明的新型肽结合EPO-R，并激活EPO-R信号转导。此外，这些测试的结果表明，新型肽组合物呈现比以前描述的EPO模拟肽令人吃惊的增加的EPO-R结合亲和性和生物学活性。
根据实施例1或实施例2中提供的方法制备了EPO-R激动剂肽二聚体。用一系列体外活性测试评估了这些肽二聚体的效能，其中所述体外活性测试包括：报告测试(reporter assay)、增殖测试、竞争性结合测试和C/BFU-e测试。下文进一步详细描述这四项测试。
表2中概述了这些体外活性测试的结果。
1.报告测试
这项测试以从鼠前B细胞系衍生的报告细胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux作为基础。这种报告细胞系表达包含人EPO受体的细胞外部分至人GCSF受体的细胞内部分的嵌合受体。进一步向这个细胞系转染fos启动子驱动的萤光素酶报告基因构建体。通过加入红细胞生成剂激活这种嵌合受体，导致萤光素酶报告基因表达，并因此在加入萤光素酶底物萤光素后导致光的产生。因此，在该类细胞中EPO-R的活化水平可以通过测定萤光素酶活性来定量。
在补充了10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、10％WEHI-3上清(WEHI-3细胞培养物的上清，ATCC#TIB-68)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux细胞。于测试前的大约18小时，通过将细胞转移至补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中饥饿它们。在测试当天，将细胞用补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基洗涤一次，然后以1×106个细胞/mL在存在已知浓度的测试肽或以EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作为阳性对照的、补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基中培养。在这项测试中检测连续稀释的测试肽。将测试板在37℃、5％的CO2大气中孵育4小时，之后向每孔中加入萤光素(Steady-Glo；Promega，Madison，WI)。孵育5分钟之后，在Packard Topcount光度计(Packard Instrument Co.，Downers Grove，Ill.)上检测光发射。将光计数相对测试肽浓度作图，并用Graph Pad软件进行分析。将产生最大值一半的光发射的测试肽浓度记录为EC50[见表2：报告EC50]。
2.增殖测试
这项测试基于鼠前B细胞系Baf3，经转染来表达人EPO-R。所得细胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖依赖于EPO-R活化。细胞增殖的程度用MTT定量，其中MTT测试中的信号与活细胞的数量成比例。
在旋转烧瓶中将BaF3/Gal4/Elk/EPOR细胞培养在补充了10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培养基(Gibco)中。在旋转烧瓶中将培养的细胞以1×106个细胞/毫升的细胞密度在补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中饥饿过夜。然后将饥饿的细胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤两次，并在补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12中悬浮成1×106个细胞/毫升的细胞密度。然后取50μL等份(～50,000个细胞)的细胞悬液在96孔测试板中一式三份放置。向96孔测试板中加入50μL等份在补充了10％FBS(无WEHI-3上清I)的DMEM/F12培养基中连续稀释的受试EPO模拟肽、或50μL EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)或AranespTM(阿法达贝汀(darbepoeitin alpha)，Amgen商品化的ERO-R激动剂)(最终孔体积为100μL)。例如，可以测试12个不同稀释物，其中测试肽(或对照EPO肽)的终浓度在810pM至0.0045pM的范围。然后将铺板的细胞在37℃孵育48小时。接下来，向每个培养皿孔中加入10μL MTT(RocheDiagnostics)，然后孵育4小时。然后通过加入10％SDS+0.01N HCl终止反应。然后将平板在37℃孵育过夜。然后通过分光光度法测定每孔在595nm波长处的吸光度。将吸光度读数对测试肽浓度绘图，并用Graph Pad软件计算EC50。将导致最大吸光度一半的测试肽浓度记录为EC50[见表2：增殖EC50]。
3.竞争性结合测试
采用测试来进行竞争性结合计算，在所述测试中光信号的产生是作为如下两种珠子的接近作用的函数：具生物素化的EPO-R结合肽示踪物的链亲和素供体珠子和结合EPO-R的受体珠子。光通过非放射性能量转移产生，其中第一个珠子在照射后释放单线态氧，并且接触释放的单线态氧导致第二个珠子发射光。这些珠子集合均有售(Packard)。珠子的接近通过EPO-R结合肽示踪物结合EPO-R产生。与EPO-R结合肽示踪物竞争结合EPO-R的测试肽阻止这种结合，从而导致光发射下降。
更加具体而言，所述方法如下：向384孔板的孔中加入4μL连续稀释的受试EPO-R激动剂肽、或阳性或阴性对照。然后以2μL/孔加入受体/珠子混合物。受体珠子混合物由15μL 5mg/ml的链亲和素供体珠子(Packard)、15μL 5mg/ml的单克隆抗体ab179(这种抗体识别包含在重组EPO-R中的人胎盘碱性磷酸酶蛋白的部分)、A蛋白包被的受体珠子(A蛋白将结合ab179抗体；Packard)、112.5μL 1∶6.6稀释的重组EPO-R(在中国仓鼠卵巢细胞中以融合了包含ab179靶表位的人胎盘碱性磷酸酶蛋白的一部分的融合蛋白产生)和607.5μL Alphaquest缓冲液(40mM HEPES，pH 7.4；1mM MgCl2；0.1％BSA，0.05％吐温20)组成。轻弹混合。以2μL/孔加入生物素化的EPO-R结合肽示踪物(30nM终浓度)。肽示踪物为EPO-R结合肽(见表“报告EC50(pM)”)，根据实施例1中所述方法用序列：生物素-GGLYACHMGPITWVCQPLRG(SEQ ID NO：4)制备。
Figure A20068002699100821
离心1分钟混合。用Packard Top Seal密封平板，并用箔锡纸包裹。在室温孵育过夜。18小时后用AlphaQuest读数仪(Packard)读取光发射。将光发射对肽浓度作图，并用Graph Pad或Excel分析。
将导致光发射相比无测试肽时观察的光发射下降50％的测试肽浓度记录为IC50[见表2：AQ IC50]。
4.C/BFU-e测试
EPO-R信号转导刺激骨髓干细胞分化成为增殖的血红细胞前体。这项测试检测测试肽刺激来自原代人骨髓多能干细胞的血红细胞前体增殖和分化的能力。
对于这项测试，在补充了10％FBS(Hyclone)的IMDM培养基(Gibco)中连续稀释测试肽。然后将这些连续稀释液或阳性对照EPO肽加入到甲基纤维素中来产生1.5mL的终体积。然后彻底涡旋甲基纤维素和肽混合物。解冻等份(100,000个细胞/mL)的人骨髓衍生的CD34+细胞(Poietics/Cambrex)。在50mL试管中将解冻的细胞轻轻地加入到0.1mL lmg/ml的DNA酶(Stem Cells)中。接下来，向细胞轻轻加入40-50mL IMDM培养基：前10mL培养基沿着50mL试管侧壁逐滴加入，然后将剩余体积的培养基沿着试管侧壁缓慢加入。然后将细胞以900转/分钟离心20分钟，并通过轻轻吸取小心移去培养基。将细胞重悬于1ml的IMDM培养基中，并在血细胞计数器载玻片上计数每毫升的细胞密度(以10μL等份的细胞悬液置于载玻片上，并且细胞密度为平均计数×10,000个细胞/ml)。然后将细胞在IMDM培养基中稀释至15,000个细胞/mL的细胞密度。然后每1.5mL甲基纤维素和肽样品中加入100μL稀释的细胞(测试培养基中最终的细胞浓度为1000个细胞/mL)，并涡旋混合物。使混合物中的气泡消失，然后用钝头针吸取1mL。将0.25mL从每个样品中吸取的混合物加入到24孔板(Falcon brand)4孔的每个孔中。在湿的培养箱中在37℃、5％CO2下孵育铺板的混合物14天。用相差显微镜(5×-10×物镜，最终放大倍数100×)计数存在的类红细胞集落。将形成的集落数目为最大值的90％(相比EPO阳性对照观察到的集落数目)的测试肽浓度记录为EC90[见表2：C/BFU-e EC90]。
5.放射性配体竞争性结合测试
也可以用备选的放射性配体竞争性结合测试来测定本发明肽的IC50值。这项测试检测125I-EPO与EPOr的结合。优选根据下列示例性方案进行测试：
A.材料
  重组人EPO R/Fc嵌合体   ●身份：重组人EPO R/Fc嵌合体●供应商：R&D Systems(Minneapolis，MN，US)●目录号：963-ER●批号：EOK033071●贮存：4℃
  碘化重组人促红细胞生成素   ●身份：(3[125I]碘酪氨酰)促红细胞生成素，人重组体，高比活性，370kBq，10μCi●供应商：Amersham Biosciences(Piscataway，NJ，US)●目录号：IM219-10μCi●批号：●贮存：4℃
  G蛋白琼脂糖   ●身份：G蛋白琼脂糖4快速流动●供应商：Amersham Biosciences(Piscataway，NJ，US)●目录号：17-0618-01●批号：●贮存：4℃
  测试缓冲液   ●磷酸缓冲盐水(PBS)，pH 7.4，含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％叠氮钠●贮存：4℃
B.确定合适的受体浓度。
将一管50μg冷冻干燥的与人IgG1的Fc部分融合的重组EPOr细胞外结构域在1mL测试缓冲液中重新构建。为了确定在测试中受体正确的使用量，在12×75mm的聚丙烯测试管中将100μL该受体制备物的连续稀释物与大约20,000cpm的200μL碘化的重组人促红细胞生成素(125I-EPO)合并。将试管盖上盖子，并在LabQuake旋转振荡器上于4℃轻轻混合过夜。
第二天，向每管中加入50μL 50％的G蛋白琼脂糖悬浮液。然后在4℃孵育试管2小时，轻轻混合。然后将试管以4000转/分钟(3297×G)离心来沉淀G蛋白琼脂糖。小心移出并弃去上清。用1mL 4℃的测试缓冲液洗涤3次之后，在Wallac Wizardγ计数器中对沉淀进行计数。然后分析结果，并计算达到最大结合值的50％所需的稀释度。
C.测定肽的IC50
为了测定肽I的IC50，在12×75mm的聚丙烯测试管中将100μL肽的连续稀释物与100μL重组的促红细胞生成素受体(100Pg/管)混合。然后向每管中加入100μL碘化的重组人促红细胞生成素(125I-EPO)，并将试管盖上盖子，在4℃轻轻混合过夜。
第二天，如上所述定量结合的125I-EPO。分析结果，并用GraphPadSoftware，Inc.(San Diego，CA)的Graphpad Prism 4.0版计算IC50值。对每个测试肽重复测试两次或多次，总计3次或多次重复测定IC50。
实施例4：体内活性测试
这个实施例描述了多种用来评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效力的测试。EPO-R激动剂肽二聚体根据实施例1或实施例2中提供的方法制备。这些肽单体和二聚体的体内活性用一系列测试进行评估，其中包括红红细胞增多的低氧小鼠(polycythemic exhypoxic mouse)生物测试和网织红细胞测试。这两个测试在下文做进一步描述。
1.红细胞增多的低氧小鼠生物测试
在由Cotes和Bangham(1961)，Nature 191：1065-1067所述方法改进的红细胞增多的低氧小鼠生物测试中测定测试肽的体内活性。这项测试检测测试肽作为EPO模拟物发挥作用即激活EPO-R并诱导新的血红细胞合成的能力。血红细胞的合成基于掺入合成的血红细胞血红蛋白中的放射标记的铁来定量。
将BDF1小鼠在周围环境驯化7-10天。测定所有动物的体重，并且不使用低体重动物(＜15g)。在低压室中对小鼠进行总共14天的连续条件循环。每24小时的循环由18小时0.40±0.02％的大气压和6小时的环境压力组成。在条件循环之后，于给药之前将小鼠再在环境压力维持72小时。
在PBS+0.1％BSA载体(PBS/BSA)中稀释测试肽或重组人EPO标准品。先在二甲基亚砜(DMSO)中溶解肽单体母液。阴性对照组包括一组仅注射PBS/BSA的小鼠、以及一组注射1％DMSO的小鼠。每个剂量组包含10只小鼠。对小鼠皮下(颈背)注射0.5mL适当样品。
注射样品48小时之后，对小鼠腹膜内注射0.2ml Fe59(Dupont，NEN)，达到大约0.75μCi/小鼠的剂量。在施用Fe5924小时之后测定小鼠体重，并在施用Fe5948小时之后处死小鼠。通过心脏穿刺收集每只动物的血液，并测定血细胞比容(肝素用作抗凝血剂)。用Packard γ计数器分析每个血液样品(0.2ml)的Fe59掺入。将非应答小鼠(即那些放射掺入低于阴性对照组的小鼠)排除出适当的数据组。也排除血细胞比容值低于阴性对照组53％的小鼠。
结果从每个实验剂量10只动物的集合中获得。计算每组掺入血液样品的平均放射性数量[每分钟计数(CPM)]。
2.网织红细胞测试
对正常的BDF1小鼠连续三天施用(0.5mL，皮下注射)EPO对照或测试肽。第三天，还对小鼠施用(0.1mL，腹膜内注射)铁葡聚糖(100mg/ml)。第五天，用CO2麻痹小鼠，并通过心脏穿刺取血。通过噻唑橙染色和流式细胞仪分析(网织红细胞计数程序)测定每个血液样品的网织红细胞百分数(％)。手动测定血细胞比容。校正的网织红细胞百分数用下列公式确定：
％网织红细胞校正的＝％网织红细胞观察的X(血细胞比容个体的/血细胞比容正常的)
3.血液测试
对正常的CD1小鼠每周一次经快速静脉内团注(bolus intravenousinjections)施用EPO阳性对照、测试肽或载体，共四次。通过改变制剂中活性化合物的浓度来测试阳性对照和测试肽剂量(表达为mg/kg)的范围。注射的体积为5ml/kg。载体对照组包含12只动物，而剩余剂量组每组为8只小鼠。记录每天的生存和每周的体重。
在第1天(对载体对照小鼠)、以及第15天和第29天(4只小鼠/组/天)对给药的小鼠禁食，然后吸入异氟烷麻醉，并通过心脏或腹部大动脉穿刺收集定期的血液样品。将血液转移到
Figure A20068002699100881
牌试管。优选的抗凝血剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
使用本领域熟知的自动化临床分析器(例如Coulter，Inc.制造的仪器)检测血红细胞合成和生理性质例如血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hgb)和总红细胞计数(RBC)来评估血液样品的终点。
实施例5：合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO：1)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体
步骤1-合成肽单体：肽单体用标准的Fmoc化学法在ABI 431A肽合成仪上用TG-RAM树脂(0.18mmol/g Rapp Polymere，德国)合成。为了合成具酰胺化的羧基末端的肽单体，用82.5％TFA、5％水、6.25％苯甲醚、6.25％乙二硫醇来从树脂切割完全组装的肽。将脱保护的产物从树脂滤出，并用二乙醚沉淀。彻底干燥之后，产物通过C18反相高压液相层析仪纯化，使用了在0.1％三氟醋酸中的乙腈/水的梯度。肽的结构通过电喷雾质谱确认。将肽以1mg/mL的浓度溶解在1∶1的DMSO∶水的溶液中来影响二硫化物的形成。产物通过C18反相高压液相层析仪纯化，使用了在0.1％三氟醋酸中的乙腈/水的梯度。肽单体示例如下：
Figure A20068002699100891
步骤2-合成三功能性接头：室温下向在100mL DCM中的亚氨乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)和Boc-β-丙氨酸(10.0g，52.8mmol)的溶液中在10分钟期间加入二异丙基碳二亚胺(8.0mL，51.1mmol)。在添加期间反应混合物升温～10度，然后在20分钟期间冷却回室温。搅拌反应混合物过夜，并滤去沉淀的二异丙脲。减压下移去溶剂来产生胶，并将残余物溶解在乙酸乙酯中，并再次过滤移去额外沉淀的尿素。将有机相放入分液漏斗，洗涤(饱和的NaHCO3，盐水，0.5N HCl，盐水)，干燥(MgSO4)，过滤，并减压下浓缩来提供无色油状的二酯产物。将二酯置于1∶1的MeOH∶THF(100mL)混合物中，并向其中加入水(25mL)，然后加入NaOH(5g，125mmol)。pH测定为＞10。室温搅拌反应混合物2小时，然后用6N HCl酸化为pH1。用NaCl饱和水相，并用乙酸乙酯提取4次。(盐水)洗涤合并的有机相、干燥(MgSO4)、并减压下浓缩来产生白色的半固体。将固体溶解在50mL DCM中，并向其中加入300mL己烷来产生白色浆状物。减压下移除溶剂来提供白色固体的二酸(14.7g，两步产率91.5％)。向在20mL DMF中的二酸(1g，3.29mmol)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(770mg，6.69mmol)、二异丙基碳二亚胺(1.00mL，6.38mmol)和4-二甲基氨基吡啶(3mg，0.02mmol)。搅拌反应混合物过夜，并减压下移去溶剂。将残余物置于乙酸乙酯中，并过滤移去沉淀的脲。将有机相放入分液漏斗、洗涤(饱和的NaHCO3，盐水，0.5N HCl，盐水)、干燥(MgSO4)、过滤、并减压下浓缩来提供白色固体的二-NHS酯产物(1.12g，产率68％)。
步骤3-将三功能性接头偶联至肽单体：为了偶联至接头，在无水DMF中混合2当量的肽和1当量的三功能性接头来产生清澈溶液，2分钟之后加入5当量的DIEA。在环境温度搅拌混合物14小时。减压下移去溶剂，并将粗产物于DCM中的80％TFA中溶解30分钟来移去Boc基团，然后用C18反相HPLC进行纯化。二聚体的结构用电喷雾质谱确认。这个偶联反应将接头连接至每个单体的赖氨酸残基ε-氨基的氮原子。该过程用SEQID NO：1显示如下。
Figure A20068002699100911
步骤4-PEG化肽二聚体：
通过氨基甲酸酯键的PEG化：在无水DMF中混合肽二聚体和等量(基于摩尔计算)的活化的PEG种类(购自NOF Corp.Japan的mPEG-NPC)来提供清澈溶液。5分钟后，向上述溶液中加入4当量的DIEA。于环境温度搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。PEG化的肽的结构通过MALDI质谱确认。也通过下文概述的阳离子交换层析对纯化的肽进行纯化。下图用SEQ ID NO：1显示mPEG-NPCPEG化。
Figure A20068002699100921
通过酰胺键的PEG化：在无水DMF中混合肽二聚体和等量(基于摩尔计算)的活化的PEG种类(购自Shearwater Corp，USA的PEG-SPA-NHS)来提供清澈溶液。5分钟后，向上述溶液中加入10当量的DIEA。在环境温度搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。PEG化的肽的结构通过MALDI质谱确认。也通过下文概述的阳离子交换层析对纯化的肽进行纯化。下图用SEQ ID NO：1显示PEG-SPA-NHS PEG化。
步骤5：-肽的离子交换纯化：调查了几种交换载体从未反应的(或水解了的)PEG分离上述肽-PEG缀合物的能力、以及其保留起始的二聚体肽的能力。将离子交换树脂(2-3g)加载入1cm柱，随后转变为钠形式(向柱加载0.2N NaOH，直至洗出液pH为14，大约5个柱体积)，然后转变为氢形式(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱，直至与洗出液匹配的装载pH，大约5个柱体积)，随后用25％ACN/水洗涤直至pH为6。将缀合前的肽或肽-PEG缀合物溶解在25％的ACN/水中(10mg/mL)，并将pH用TFA调整为＜3，然后加载至柱。在用2-3个柱体积的25％ACN/水洗涤并收集5mL级分之后，将肽用在25％ACN/水中的0.1M NH4OAc洗涤来从柱上释放下来，再次收集5mL级分。通过HPLC分析来显示哪些级分含有预期的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)的分析表明，当肽保留在柱上、并用NH4OAc溶液洗脱(通常介于级分4和10之间)时，没有观察到非缀合的PEG污染。当肽在最初的洗涤缓冲液(通常为最初的两个级分)中洗脱时，没有观察到预期的PEG缀合物和过量的PEG的分离。
下列柱成功地保留了肽和肽-PEG缀合物这两者，并且成功地从非缀合肽中纯化肽-PEG缀合物。
表3：离子交换树脂
  载体   来源
  Mono S HR 5/5强阳离子交换预载柱 Amersham Biosciences
  SE53纤维素，微粒强阳离子交换载体 Whatman
  SP琼脂糖快速流动强阳离子交换载体 Amersham Biosciences
实施例6：合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单
体的EPO-R激动剂肽同型二聚体
具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体如实施例1所述进行合成，除了在步骤1中合成的肽单体为：(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K  (SEQ ID：2)
当PEG通过氨基甲酸酯键连接至接头时，这个使用SEQ ID NO：2的合成的最终产物在结构上可以示例如下：
Figure A20068002699100951
当PEG通过酰胺键连接至接头时，这个使用SEQ ID NO：2的合成的最终产物在结构上可以示例如下：
实施例7：体外活性测试
这个实施例描述了多种用来评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效能的体外测试。这些测试的结果证明这项发明的新型肽结合EPO-R，并激活EPO-R信号转导。此外，这些测试的结果显示，新型肽组合物呈现比以前描述的EPO模拟肽令人吃惊的增加的EPO-R结合亲和性和生物学活性。
EPO-R激动剂肽单体和二聚体根据实施例1或实施例2中提供的方法制备。这些肽二聚体的效能用一系列体外活性测试进行评估，其中包括：报告测试(reporter assay)、增殖测试、竞争性结合测试和C/BFU-e测试。下文进一步详细描述这四项测试。
表2中概述了这些体外活性测试的结果。
1.报告测试
这项测试以从鼠前B细胞系衍生的报告细胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux作为基础。这种报告细胞系表达包含人EPO受体的细胞外部分至人GCSF受体的细胞内部分的嵌合受体。进一步向这个细胞系中转染fos启动子驱动的萤光素酶报告基因构建体。通过加入红细胞生成剂激活这种嵌合受体，进而导致萤光素酶报告基因表达，并因此在加入萤光素酶底物萤光素后产生光。因此，该类细胞中EPO-R的活化水平可以通过测定萤光素酶活性来定量。
在补充了10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、10％WEHI-3上清(WEHI-3细胞培养物的上清，ATCC#TIB-68)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux细胞。测试前大约18小时，通过将细胞转移至补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中饥饿它们。在测试当天，用补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基洗涤细胞一次，然后以1×106个细胞/mL在存在已知浓度的测试肽或以EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作为阳性对照的、补充了10％FBS (无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基中培养。在这项测试中同时检测连续稀释的测试肽。将测试板在37℃、5％的CO2大气中孵育4小时，之后向每孔中加入萤光素(Steady-Glo；Promega，Madison，WI)。孵育5分钟之后，在Packard Topcount光度计(PackardInstrument Co.，Downers Grove，Ill.)上检测光发射。将光计数相对测试肽浓度进行作图，并用Graph Pad软件进行分析。将产生最大光发射一半的测试肽浓度记录为EC50。
2.增殖测试
这项测试基于鼠前B细胞系Baf3，经转染表达人EPO-R。所得细胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖依赖于EPO-R的活化。细胞增殖的程度用MTT定量，其中MTT测试中的信号与活细胞的数量成比例。
在旋转烧瓶中将BaF3/Gal4/Elk/EPOR细胞培养在补充了10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培养基(Gibco)中。在旋转烧瓶中将培养的细胞以1×106个细胞/毫升的细胞密度在补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中饥饿过夜。然后将饥饿的细胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤两次，并在补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12中悬浮成1×106个细胞/毫升的细胞密度。然后取50μL等份(～50,000个细胞)的细胞悬液在96孔测试板中一式三份放置。向96孔测试板中加入50μL等份在补充了10％FBS(无WEHI-3上清I)的DMEM/F12培养基中连续稀释的受试EPO模拟肽、或50μL EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)或AranespTM(阿法达贝汀，Amgen商品化的ERO-R激动剂)(最终孔体积为100μL)。例如，可以测试12个不同稀释度，其中测试肽(或对照EPO肽)的终浓度在810pM至0.0045pM的范围。然后将铺板的细胞在37℃孵育48小时。接下来，向每个培养皿孔中加入10μL MTT(Roche Diagnostics)，然后孵育4小时。然后通过加入10％SDS+0.01N HCl终止反应。然后将平板在37℃孵育过夜。然后通过分光光度法测定每孔在595nm波长处的吸光度。将吸光度读数对测试肽浓度绘图，并用Graph Pad软件计算EC50。将导致最大吸光度一半的测试肽浓度记录为EC50。
3.竞争性结合测试
用测试来进行竞争性结合计算，在其中所述测试中由于下列两个珠子的接近作用而产生光信号：具生物素化的EPO-R结合肽示踪物的链亲和素供体珠子和结合EPO-R的受体珠子。光通过非放射性能量转移产生，其中第一个珠子在照射后释放单线态氧，并且第二个珠子接触释放的单线态氧后发射光。这些珠子集合均有售(Packard)。珠子的接近通过EPO-R结合肽示踪物结合EPO-R产生。与EPO-R结合肽示踪物竞争结合EPO-R的测试肽阻止这种结合，从而导致光发射下降。
更加具体而言，所述方法如下：向384孔板的孔中加入4μL连续稀释的受试EPO-R激动剂肽、或阳性或阴性对照。然后以2μL/孔加入受体/珠子混合物。受体珠子混合物由15μL 5mg/ml的链亲和素供体珠子(Packard)、15μL 5mg/ml的单克隆抗体ab179(这种抗体识别包含在重组EPO-R中的人胎盘碱性磷酸酶蛋白的部分)、A蛋白包被的受体珠子(A蛋白将结合ab179抗体；Packard)、112.5μL 1∶6.6稀释的重组EPO-R(在中国仓鼠卵巢细胞中以融合了包含ab179靶表位的人胎盘碱性磷酸酶蛋白的一部分的融合蛋白产生)和607.5μL Alphaquest缓冲液(40mM HEPES，pH 7.4；1mM MgCl2；0.1％BSA，0.05％吐温20)组成。轻弹混合。以2μL/孔加入生物素化的EPO-R结合肽示踪物(30nM终浓度)。肽示踪物为EPO-R结合肽(见表“报告EC50(pM)”)，根据实施例1中所述方法用SEQ ID NO：4制备。
离心1分钟混合。用Packard Top Seal密封平板，并用箔锡纸包裹。在室温孵育过夜。18小时后用AlphaQuest读数仪(Packard)读取光发射值。将光发射对肽浓度作图，并用Graph Pad或Excel分析。
将导致光发射相比无测试肽时观察的光发射下降50％的测试肽浓度记录为IC50。
4.C/BFU-e测试
EPO-R信号转导刺激骨髓干细胞分化成为增殖的血红细胞前体。这项测试检测测试肽刺激来自原代人骨髓多能干细胞的血红细胞前体增殖和分化的能力。
为了这项测试，在补充了10％FBS(Hyclone)的IMDM培养基(Gibco)中连续稀释测试肽。然后将这些连续稀释液或阳性对照EPO肽加入到甲基纤维素中来产生1.5mL的终体积。然后彻底涡旋甲基纤维素和肽混合物。解冻等份(100,000个细胞/mL)的人骨髓衍生的CD34+细胞(Poietics/Cambrex)。在50mL试管中将解冻的细胞轻轻地加入到0.1mL lmg/ml的DNA酶(Stem Cells)中。接下来，向细胞轻轻加入40-50mL IMDM培养基：前10mL培养基沿着50mL试管壁逐滴加入，然后将剩余体积的培养基沿着试管壁缓慢加入。然后将细胞以900转/分钟离心20分钟，并通过轻轻吸取小心地移去培养基。将细胞重悬于1ml的IMDM培养基中，并在血细胞计数器载玻片上计数每毫升的细胞密度(以10μL等份的细胞悬液置于载玻片上，并且细胞密度为平均计数×10,000个细胞/ml)。然后将细胞在IMDM培养基中稀释至15,000个细胞/mL的细胞密度。然后每1.5mL甲基纤维素和肽样品中加入100μL稀释的细胞(测试培养基中最终的细胞浓度为1000个细胞/mL)，并涡旋混合物。使混合物中的气泡消失，然后用钝头针吸取1mL。将0.25mL从每个样品中吸取的混合物加入到24孔板(Falcon brand)4孔的每个孔中。在湿的培养箱中在37℃、5％CO2下孵育铺板的混合物14天。用相差显微镜(5×-10×物镜，最终放大倍数100×)计数存在的类红细胞集落。将形成的集落数目相比EPO阳性对照观察到的集落数目为最大值90％的测试肽浓度记录为EC90[见表2：C/BFU-e EC90]。
Figure A20068002699101001
实施例8：体内活性测试
这个实施例描述了多种用来评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效能的体内测试。EPO-R激动剂肽单体和二聚体根据实施例1中提供的方法制备。这些肽单体和二聚体的体内活性用一系列测试进行评估，其中包括红细胞增多的低氧小鼠生物测试和网织红细胞测试。这两个测试在下文进一步做详细描述。
1.红细胞增多的低氧小鼠生物测试
在由Cotes和Bangham(1961)，Nature 191：1065-1067所述方法改进的红细胞增多的低氧小鼠生物测试中测定测试肽的体内活性。这项测试检测测试肽作为EPO模拟物发挥作用即激活EPO-R并诱导新的血红细胞合成的能力。血红细胞的合成基于掺入合成的血红细胞血红蛋白中的放射标记的铁来定量。
将BDF1小鼠在周围环境驯化7-10天。测定所有动物的体重，并且不使用低体重动物(＜15g)。在低压室中对小鼠进行总共14天的连续条件循环。每24小时的循环由18小时0.40±0.02％的大气压和6小时的环境压力组成。在条件循环之后，于给药之前将小鼠再在环境压力维持72小时。
在PBS+0.1％BSA载体(PBS/BSA)中稀释测试肽或重组人EPO标准品。先在二甲基亚砜(DMSO)中溶解肽单体母液。阴性对照组包括一组仅注射PBS/BSA的小鼠、以及一组注射1％DMSO的小鼠。每个剂量组包含10只小鼠。对小鼠皮下(颈背)注射0.5mL适当样品。
注射样品48小时之后，对小鼠腹膜内注射0.2ml Fe59(Dupont，NEN)，达到大约0.75μCi/小鼠的剂量。在施用Fe5924小时之后测定小鼠体重，并在施用Fe5948小时之后处死小鼠。通过心脏穿刺收集每只动物的血液，并测定血细胞比容(肝素用作抗凝血剂)。用Packardγ计数器分析每个血液样品(0.2ml)的Fe59掺入。将非应答小鼠(即那些放射掺入低于阴性对照组的小鼠)排除出适当的数据组。也排除血细胞比容值低于阴性对照组53％的小鼠。
结果从每个实验剂量10只动物的集合中获得。计算每组掺入血液样品的平均放射量[每分钟计数(CPM)]。
2.网织红细胞测试
对正常的BDF1小鼠连续三天施用(0.5mL，皮下注射)EPO对照或测试肽。第三天，还对小鼠施用(0.1mL，腹膜内注射)铁葡聚糖(100mg/ml)。第五天，用CO2麻痹小鼠，并通过心脏穿刺取血。通过噻唑橙染色和流式细胞仪分析(网织红细胞计数程序)测定每个血液样品的网织红细胞百分数(％)。手动测定血细胞比容。用下列公式测定修正的网织红细胞百分数：
％网织红细胞修正的＝％网织红细胞观察的×(血细胞比容个体/血细胞比容标准)
3.血液测试
对正常的CD1小鼠每周一次经快速静脉内团注施用EPO阳性对照、测试肽或载体，共四次。通过改变制剂中活性化合物的浓度来测试阳性对照和测试肽剂量的范围，其中所述剂量以mg/kg表示。注射的体积为5ml/kg。载体对照组包含12只动物，而剩余剂量组每组为8只小鼠。记录每天的生存和每周的体重。
对给药的小鼠禁食，然后通过吸入异氟烷来麻醉，并在第1天(对载体对照小鼠)、以及第15天和第29天(4只小鼠/组/天)通过心脏或腹部大动脉穿刺收集定期的血液样品。将血液转移到牌试管。优选的抗凝血剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
用本领域熟知的自动化临床分析器(例如Coulter，Inc.制造的仪器)检测血红细胞合成和生理性质例如血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hgb)和总红细胞计数(RBC)来评估血液样品的终点。
实施例9：合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK
(SEQ ID NO：1)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体
步骤1-合成肽单体：肽单体用标准的Fmoc化学法在ABI 431A肽合成仪上用TG-RAM树脂(0.18mmol/g Rapp Polymere，德国)合成。为了合成具酰胺化的羧基末端的肽单体，用82.5％TFA、5％水、6.25％苯甲醚、6.25％乙二硫醇来从树脂切割完全组装的肽。将脱保护的产物从树脂滤出，并用二乙醚沉淀。彻底干燥之后，产物通过C18反相高压液相层析仪纯化，使用了在0.1％三氟醋酸中的乙腈/水的梯度。肽的结构通过电喷雾质谱确认。肽单体示例如下：
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK-NH2(SEQ ID NO：1)
步骤2-合成三功能性接头：
室温下向在100mL DCM中的亚氨乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)和Boc-β-丙氨酸(10.0g，52.8mmol)的溶液中于10分钟期间加入二异丙基碳二亚胺(8.0mL，51.1mmol)。在添加期间反应混合物升温～10度，然后在20分钟期间冷却回室温。搅拌反应混合物过夜，并滤去沉淀的二异丙脲。减压下移去溶剂来产生胶，并将残余物溶解在乙酸乙酯中，并再次过滤移去额外沉淀的尿素。将有机相放入分液漏斗，洗涤(饱和的NaHCO3，盐水，0.5N HCl，盐水)，干燥(MgSO4)，过滤，并减压下浓缩来提供无色油状的二酯产物。将二酯置于1∶1的MeOH∶THF(100mL)混合物中，并向其中加入水(25mL)，然后加入NaOH(5g，125mmol)。pH测定为＞10。室温搅拌反应混合物2小时，然后用6N HCl酸化为pH 1。用NaCl饱和水相，并用乙酸乙酯提取4次。对合并的有机相进行洗涤(盐水)、干燥(MgSO4)、并减压下浓缩来产生白色的半固体。将固体溶解在50mLDCM中，并向其中加入300mL己烷来产生白色浆状物。减压下移除溶剂来提供白色固体的二酸(14.7g，两步产率91.5％)。向在20mL DMF中的二酸(1g，3.29mmol)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(770mg，6.69mmol)、二异丙基碳二亚胺(1.00mL，6.38mmol)和4-二甲基氨基吡啶(3mg，0.02mmol)。搅拌反应混合物过夜，并减压下移去溶剂。将残余物置于乙酸乙酯中，并过滤移去沉淀的脲。将有机相放入分液漏斗、洗涤(饱和的NaHCO3，盐水，0.5N HCl，盐水)、干燥(MgSO4)、过滤、并减压下浓缩来提供白色固体的二-NHS酯产物(1.12g，产率68％)。
步骤3-将三功能性接头偶联至肽单体：
为了偶联至接头，在无水DMF中混合2当量的肽和1当量的三功能性接头来产生清澈溶液，2分钟之后加入5当量的DIEA。在环境温度搅拌混合物14小时。减压下移去溶剂，并将粗产物于DCM中的80％TFA中溶解30分钟来移去Boc基团，然后用C18反相HPLC进行纯化。二聚体的结构用电喷雾质谱确认。这个偶联反应将接头连接至每个单体的赖氨酸残基ε-氨基的氮原子。用SEQ ID NO：1的偶联显示如下。
Figure A20068002699101042
步骤4-合成包含两个通过赖氨酸连接的线性PEG链的PEG部分mPEG2-Lysinol-NPC
用过量的mPEG2-NPC处理Lysinol(可购得)来获得MPEG2-lysinol，然后与NPC反应来形成mPEG2-lysinol-NPC。
mPEG2-Lys-NHS
这个产物可以从例如Nektar Therapeutics(490Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的分子工程目录(2003)，货号2Z3X0T01购得。步骤5-肽二聚体的PEG化：
通过氨基甲酸酯键的PEG化：
在无水DMF中以1∶2的摩尔比混合肽二聚体和PEG种类(mPEG2-Lysinol-NPC)来提供清澈溶液。5分钟后，向上述溶液中加入4当量的DIEA。于环境温度搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。PEG化肽的结构通过MALDI质谱确认。也通过下文概述的阳离子交换层析对纯化的肽进行纯化。下文用SEQ ID NO：1显示使用mPEG-Lysinol-NPC的PEG化。
Figure A20068002699101061
通过酰胺键的PEG化：
在无水DMF中以1∶2的摩尔比混合肽二聚体和PEG种类(来自Shearwater Corp，USA的mPEG2-Lys-NHS)来提供清澈溶液。5分钟后，向上述溶液中加入10当量的DIEA。于环境温度搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。PEG化肽的结构通过MALDI质谱确认。也通过下文概述的阳离子交换层析对纯化的肽进行纯化。下文用SEQ ID NO：1显示使用mPEG2-Lys-NHS的PEG化。
步骤6：-肽的离子交换纯化：调查了几种交换载体从未反应的(或水解了的)PEG分离上述肽-PEG缀合物的能力、以及其保留起始的二聚体肽的能力。将离子交换树脂(2-3g)加载入1cm柱，随后转变为钠形式(向柱加载0.2N NaOH，直至洗出液pH为14，大约5个柱体积)，然后转变为氢形式(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱，直至与洗出液匹配的装载pH，大约5个柱体积)，随后用25％ACN/水洗涤直至pH为6。将缀合前的肽或肽-PEG缀合物溶解在25％的ACN/水中(10mg/mL)，并将pH用TFA调整为＜3，然后加载至柱。在用2-3个柱体积的25％ACN/水洗涤并收集5mL级分之后，将肽用在25％ACN/水中的0.1M NH4OAc洗涤来从柱上释放下来，再次收集5mL级分。通过HPLC分析来显示哪些级分含有预期的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)的分析表明，当肽保留在柱上、并用NH4OAc溶液洗脱(通常介于级分4和10之间)时，没有观察到非缀合的PEG污染。当肽在最初的洗涤缓冲液(通常为最初的两个级分)中洗脱时，没有观察到预期的PEG缀合物和过量的PEG的分离。
下列柱成功地保留了肽和肽-PEG缀合物这两者，并且成功地从非缀合肽中纯化肽-PEG缀合物：
表5：离子交换树脂
  载体   来源
  Mono S HR 5/5强阳离子交换预载柱 Amersham Biosciences
  SE53纤维素，微粒强阳离子交换载体 Whatman
  SP琼脂糖快速流动强阳离子交换载体 Amersham Biosciences
实施例10：合成具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体
具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)的肽单体的EPO-R激动剂肽同型二聚体如实施例1所述进行合成，除了步骤1中合成的肽单体为：
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO：2)
当PEG通过氨基甲酸酯键连接至间隔物时，这个用SEQ ID NO：2合成的最终产物在结构上可以示例如下：
Figure A20068002699101091
当PEG通过酰胺键连接至间隔物时，这个用SEQ ID NO：2合成的最终产物在结构上可以示例如下：
Figure A20068002699101092
实施例11：体外活性测试
这个实施例描述了多种用来评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效能的体外测试。这些测试的结果证明这项发明的新型肽结合EPO-R，并激活EPO-R信号转导。此外，这些测试的结果显示，新型肽组合物呈现比以前描述的EPO模拟肽令人吃惊的增加的EPO-R结合亲和性和生物学活性。
EPO-R激动剂的肽单体和二聚体根据实施例1或实施例2中提供的方法制备。这些肽二聚体的效能用一系列体外活性测试进行评估，其中包括：报告测试(reporter assay)、增殖测试、竞争性结合测试和C/BFU-e测试。下文进一步详细描述这四项测试。
表2中概述了这些体外活性测试的结果。
1.报告测试
这项测试以从小鼠前B细胞系衍生的报告细胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux作为基础。这种报告细胞系表达包含人EPO受体的细胞外部分至人GCSF受体的细胞内部分的嵌合受体。进一步向这个细胞系转染fos启动子驱动的萤光素酶报告基因构建体。通过加入红细胞生成剂激活这种嵌合受体，进而导致萤光素酶报告基因表达，并因此在加入萤光素酶底物萤光素后产生光。因此，在该类细胞中EPO-R的活化水平可以通过测定萤光素酶活性来定量。
在补充了10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、10％WEHI-3上清(WEHI-3细胞培养物的上清，ATCC#TIB-68)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux细胞。测试前大约18小时，通过将细胞转移至补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中饥饿它们。在测试当天，用补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基洗涤细胞一次，然后以1×106个细胞/mL在存在已知浓度的测试肽或以EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作为阳性对照的、补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基中培养。在这项测试中同时检测连续稀释的测试肽。将测试板在37℃、5％的CO2大气中孵育4小时，之后向每孔中加入萤光素(Steady-Glo；Promega，Madison，WI)。孵育5分钟之后，在Packard Topcount光度计(PackardInstrument Co.，Downers Grove，Ill.)上检测光发射。将光计数相对测试肽浓度作图，并用Graph Pad软件进行分析。将产生最大光发射值一半的测试肽浓度记录为EC50。
2.增殖测试
这项测试基于鼠前B细胞系Baf3，经转染表达人EPO-R。所得细胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖依赖于EPO-R的活化。细胞增殖的程度用MTT定量，其中MTT测试中的信号与活细胞的数量成比例。
将BaF3/Gal4/Elk/EPOR细胞在旋转烧瓶中在补充了10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养。将培养的细胞在旋转烧瓶中以1×106个细胞/毫升的细胞密度在补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中饥饿过夜。然后将饥饿的细胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤两次，并在补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12中悬浮成1×106个细胞/毫升的密度。然后取50μL等份(～50,000个细胞)的细胞悬液在96孔测试板中一式三份放置。向96孔测试板中加入50μL等份在补充了10％FBS(无WEHI-3上清I)的DMEM/F12培养基中连续稀释的受试EPO模拟肽、或50μL EPO(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)或AranespTM(阿法达贝汀，Amgen商品化的ERO-R激动剂)(最终孔体积为100μL)。例如，可以测试12个不同稀释度，其中测试肽(或对照EPO肽)的终浓度在810pM至0.0045pM的范围。然后将铺板的细胞在37℃孵育48小时。接下来，向每个培养皿孔中加入10μL MTT(Roche Diagnostics)，然后孵育4小时。然后通过加入10％SDS+0.01N HCl终止反应。然后将平板在37℃孵育过夜。然后通过分光光度法测定每孔在595nm波长处的吸光度。将吸光度读数对测试肽浓度绘图，并用Graph Pad软件计算EC50。将导致最大吸光度一半的测试肽浓度记录为EC50。
3.竞争性结合测试
用测试来进行竞争性结合计算，在其中所述测试中由于下列两个珠子的接近作用而产生光信号：具生物素化的EPO-R结合肽示踪物的链亲和素供体珠子和结合EPO-R的受体珠子。光通过非放射性能量转移产生，其中第一个珠子在照射后释放单线态氧，并且第二个珠子接触释放的单线态氧后发射光。这些珠子集合均已商品化(Packard)。珠子的接近通过EPO-R结合肽示踪物结合EPO-R产生。与EPO-R结合肽示踪物竞争结合EPO-R的测试肽阻止这种结合，从而导致光发射下降。
更加具体而言，所述方法如下：向384孔板的孔中加入4μL连续稀释的受试EPO-R激动剂肽、或阳性或阴性对照。然后以2μL/孔加入受体/珠子混合物。受体珠子混合物由15μL 5mg/ml的链亲和素供体珠子(Packard)、15μL 5mg/ml的单克隆抗体ab179(这种抗体识别包含在重组EPO-R中的人胎盘碱性磷酸酶蛋白的部分)、A蛋白包被的受体珠子(A蛋白将结合ab179抗体；Packard)、112.5μL 1∶6.6稀释的重组EPO-R(在中国仓鼠卵巢细胞中以融合了包含ab179靶表位的人胎盘碱性磷酸酶蛋白的一部分的融合蛋白产生)和607.5μL Alphaquest缓冲液(40mM HEPES，pH 7.4；1mM MgCl2；0.1％BSA，0.05％吐温20)组成。轻弹混合。以2μL/孔加入生物素化的EPO-R结合肽示踪物(30nM终浓度)。肽示踪物为EPO-R结合肽(见表“报告EC50(pM)”)，根据实施例1中所述方法用SEQ ID NO：4制备。
Figure A20068002699101121
离心1分钟混合。用Packard Top Seal密封平板，并用箔锡纸包裹。在室温孵育过夜。18小时后用AlphaQuest读数仪(Packard)读取光发射值。将光发射对肽浓度作图，并用Graph Pad或Excel分析。
将导致光发射相比无测试肽时观察的光发射下降50％的测试肽浓度记录为IC50。
4.C/BFU-e测试
EPO-R信号转导刺激骨髓干细胞分化成为增殖的血红细胞前体。这项测试检测测试肽刺激来自原代人骨髓多能干细胞的血红细胞前体增殖和分化的能力。
为了这项测试，将测试肽在补充了10％FBS(Hyclone)的IMDM培养基(Gibco)中进行连续稀释。然后将这些连续稀释液或阳性对照EPO肽加入到甲基纤维素中来产生1.5mL的终体积。然后彻底涡旋甲基纤维素和肽混合物。解冻等份(100,000个细胞/mL)的人骨髓衍生的CD34+细胞(Poietics/Cambrex)。在50mL试管中将解冻的细胞轻轻地加入到0.1mL lmg/ml的DNA酶(Stem Cells)中。接下来，向细胞轻轻加入40-50mL IMDM培养基：前10mL培养基沿着50mL试管壁逐滴加入，然后将剩余体积的培养基沿着试管壁缓慢加入。然后将细胞以900转/分钟离心20分钟，并通过轻轻吸取小心地移去培养基。将细胞重悬于1ml的IMDM培养基中，并在血细胞计数器载玻片上计数每毫升的细胞密度(以10μL等份的细胞悬液置于载玻片上，并且细胞密度为平均计数×10,000个细胞/ml)。然后将细胞在IMDM培养基中稀释至15,000个细胞/mL的细胞密度。然后每1.5mL甲基纤维素和肽样品中加入100μL稀释的细胞(测试培养基中最终的细胞浓度为1000个细胞/mL)，并涡旋混合物。使混合物中的气泡消失，然后用钝头针吸取1mL。将0.25mL从每个样品中吸取的混合物加入到24孔板(Falcon brand)4孔的每个孔中。在湿的培养箱中在37℃、5％CO2下孵育铺板的混合物14天。用相差显微镜(5×-10×物镜，最终放大倍数100×)计数存在的类红细胞集落。将形成的集落数目相比EPO阳性对照观察到的集落数目为最大值90％的测试肽浓度记录为EC90[见表2：C/BFU-e EC90]。
Figure A20068002699101141
实施例12：体内活性测试
这个实施例描述了多种用来评估本发明的EPO-R激动剂肽的活性和效能的体内测试。EPO-R激动剂肽的单体和二聚体根据实施例1中提供的方法制备。这些肽单体和二聚体的体内活性用一系列测试进行评估，其中包括红细胞增多的低氧小鼠生物测试和网织红细胞测试。这两个测试在下文进一步做详细描述。
1.红细胞增多的低氧小鼠生物测试
在由Cotes和Bangham(1961)，Nature 191：1065-1067所述方法改进的红细胞增多的低氧小鼠生物测试中测定测试肽的体内活性。这项测试检测测试肽作为EPO模拟物发挥作用即激活EPO-R并诱导新的血红细胞合成的能力。血红细胞的合成基于掺入合成的血红细胞血红蛋白中的放射标记的铁来定量。
将BDF1小鼠在周围环境驯化7-10天。测定所有动物的体重，并且不使用低体重动物(＜15g)。在低压室中对小鼠进行总共14天的连续条件循环。每24小时的循环由18小时0.40±0.02％的大气压和6小时的环境压力组成。在条件循环之后，于给药之前将小鼠再在环境压力维持72小时。
在PBS+0.1％BSA载体(PBS/BSA)中稀释测试肽或重组人EPO标准品。先在二甲基亚砜(DMSO)中溶解肽单体母液。阴性对照组包括一组仅注射PBS/BSA的小鼠、以及一组注射1％DMSO的小鼠。每个剂量组包含10只小鼠。对小鼠皮下(颈背)注射0.5mL适当样品。
注射样品48小时之后，对小鼠腹膜内注射0.2ml Fe59(Dupont，NEN)，达到大约0.75μCi/小鼠的剂量。在施用Fe5924小时之后测定小鼠体重，并在施用Fe5948小时之后处死小鼠。通过心脏穿刺收集每只动物的血液，并测定血细胞比容(肝素用作抗凝血剂)。用Packard γ计数器分析每个血液样品(0.2ml)的Fe59掺入。将非应答小鼠(即那些放射掺入低于阴性对照组的小鼠)排除出适当的数据组。也排除血细胞比容值低于阴性对照组53％的小鼠。
结果从每个实验剂量10只动物的集合中获得。计算每组掺入血液样品的平均放射量[每分钟计数(CPM)]。
2.网织红细胞测试
对正常的BDF1小鼠连续三天施用(0.5mL，皮下注射)EPO对照或测试肽。第三天，还对小鼠施用(0.1mL，腹膜内注射)铁葡聚糖(100mg/ml)。第五天，用CO2麻痹小鼠，并通过心脏穿刺取血。通过噻唑橙染色和流式细胞仪分析(网织红细胞计数程序)测定每个血液样品的网织红细胞百分数(％)。手动测定血细胞比容。用下列公式测定修正的网织红细胞百分数：
％网织红细胞修正的＝％网织红细胞观察的×(血细胞比容个体/血细胞比容标准)
3.血液测试
对正常的CD1小鼠每周一次经快速静脉内团注施用EPO阳性对照、测试肽或载体，共四次。通过改变制剂中活性化合物的浓度来测试阳性对照和测试肽剂量的范围，其中所述剂量以mg/kg表示。注射的体积为5ml/kg。载体对照组包含12只动物，而剩余剂量组每组为8只小鼠。记录每天的生存和每周的体重。
对给药的小鼠禁食，然后通过吸入异氟烷来麻醉，并在第1天(对载体对照小鼠)、以及第15天和第29天(4只小鼠/组/天)通过心脏或腹部大动脉穿刺收集定期的血液样品。将血液转移到
Figure A20068002699101161
牌试管。优选的抗凝血剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
用本领域熟知的自动化临床分析器(例如Coulter，Inc.制造的仪器)检测血红细胞合成和生理性质例如血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hgb)和总红细胞计数(RBC)来评估血液样品的终点。
实施例13：动物和人正常健康志愿者(NHV)血红蛋白水平的增加
1.总述
基于非临床和临床数据，完全合成的EPO受体激动剂肽I具有安全且有效地减轻EPO生产不足续发的贫血的潜能。预期肽I具有一些超过目前可用的EPO产品的潜在优点，其中所述优点包括：延长的半衰期和药物动力学活性，具有期望的每3-4周的剂量间隔，这可以解释为改善的便利性和顺应性；降低的抗体介导的纯红细胞发育不全(PRCA)的可能性，这是因为没有与内源EPO共有的共同氨基酸序列；治疗患有PRCA的患者的潜能，其中所述的PRCA由针对商业可获得的EPO的抗体与内源EPO交叉反应引起；以及增强的稳定性，具有与蛋白质疗法相比室温下延长的贮存期限。
因为肽I的一级氨基酸序列与重组的人EPO(rHuEPO)不同，所以其诱导抗内源EPO交叉反应性免疫应答的可能性较小。尽管非常罕见，但交叉反应性免疫应答可引起伴随着重组人ESA和内源EPO都丧失效能的严重负作用。此外，因为肽I是合成的肽，所以其生产避免了重组蛋白质产品可能出现的宿主细胞物质污染药物的潜在风险。
2.肽I在动物中的药物代谢动力学
在小鼠、大鼠(正常红细胞的(normocythemic)和肾切除的)、狗、兔和猴中进行单一或者重复的剂量给药之后，观察到肽I是有效的具有剂量依赖活性的红细胞生成刺激剂。在大鼠和猴子中的药理学研究表明，通过血红蛋白水平测定的网织红细胞(未成熟的RBC)和RBC的上升是剂量成比例的。
在大鼠、狗和猴子中的药物代谢动力学研究证明了肽I与当前商品化的rHuEPO产品相比持久的血浆持续性。在大鼠中的消除半衰期(t1/2)范围为21.5-30.7小时，在狗中为73.7小时。肽I的生物学分布主要为血浆级分。对5/6肾切除大鼠进行9.87mg肽I/kg的静脉内施用之后，t1/2约为48小时，清除率低至0.763mL/小时/kg(与正常红细胞的大鼠的1.44mL/小时/kg相比)，产生增加的AUC倍数1.8。
2.肽I在人中的药物动力学和药物代谢动力学
2.1.概述和方法
肽I在一次1期研究中在20名NHV中进行了测试。肽I这种第一次在人中的研究为随机、双盲、安慰剂对照、单剂量、IV、增加的剂量、安全性和耐受性的实验。研究的主要目的是评估肽I的安全性和药物代谢动力学，以及确定药学有效剂量(PAD)。将7名雄性志愿者的组以5∶2的比率安排来接受单剂量的肽I或安慰剂。以增加的剂量水平添加组，直至观察到PAD，其中所述PAD通过血红蛋白自基线值的增加来确定，并在另一志愿者的组中重复鉴定为PAD的剂量水平点。
对登记的4个组以肽I剂量分别为0.025、0.05、0.1mg/kg和0.1mg/kg(每组单一剂量)的连续方式开始研究。研究结果表明，在第3组接受0.1mg/kg肽I后网织红细胞数量和血红蛋白水平增加。在第4组中重复这一剂量来证实在第3组中观察到的结果。如此地，研究结束。下文概述了非盲法的结果。
2.2药物动力学结果
显示网织红细胞计数(绝对数和百分数)随肽I剂量增加的剂量依赖性增加。在所有剂量组中网织红细胞计数在给药后大约7天达到最大值。比较最大网织红细胞应答和网织红细胞对时间的曲线(AUC0-14天和AUC0-28 天)，剂量组间显示显著差异(p＜0.05)。
在给药后28天期间的血红蛋白应答和自基线的改变(均为平均数和最大值)表现出伴随肽I剂量增加的剂量依赖性增加，而对照组在研究相关的血液绘图之后没有外源的红细胞生成刺激的时间里表现为血红蛋白轻微下降[单因素方差分析(ANOVA)，0.0001的p值]。用使用混合模型的单因素协方差分析(ANCOVA)来比较所有四组中个体随时间自基线的变化。这种分析的结果显示所有四个剂量组间的显著性剂量应答(p＝0.0001)，其中0.025和0.1mg/kg组间差异显著(p＝0.0027)，其中0.05和0.1mg/kg组间差异也显著(p＝0.0113)。肽I伴随血红蛋白增加至少1.0g/dL的PAD为0.1mg/kg。
此外，在给药后42天里监测组3和组4(0.1mg/kg肽I或安慰剂)的受试者。在第42天，平均血红蛋白水平在用0.1mg/kg肽I处理的受试者中恢复到基线，但在安慰剂的受试者中仍低于基线值。因此，在贯穿研究的第42天，施用0.1mg/kg肽I的受试者和施用安慰剂的受试者之间血红蛋白自基线变化的差异≥0.5g/dL。
血清的EPO水平随肽I剂量增加而瞬间下降。其它药物动力学参数的变化(红细胞数和血细胞比容增加、铁蛋白和网织红细胞血红蛋白含量瞬间减少、可溶性运铁蛋白受体蛋白质瞬间增加以及EPO瞬间减少)与刺激红细胞生成一致。
2.3.药物代谢动力学结果
在5分钟期间静脉内施用0.025、0.05和0.1mg/kg肽I后，药物浓度一般在输注起始后的5分钟至1小时之间达到峰值。在0.025mg/kg剂量组中，肽I浓度在5-15分钟之间达到峰值，而0.1mg/kg剂量的tmax接近1小时。达到Cmax后，血浆浓度下降，并且一般在0.025mg/kg剂量后高达96小时都可以进行计量(＞25ng/mL)，0.05mg/kg剂量高达5天，并且0.1mg/kg剂量高达7天。计算显示，0.1mg/kg剂量的半衰期有小幅增加，在0.025mg/kg剂量后范围为16.7-21.9小时(平均19.2小时)，在0.05mg/kg剂量后为15.3-25.1小时(平均18.7小时)，并且在0.1mg/kg剂量后为17.7-33.1小时(平均23.5小时)。
药物的分布和消除表现为不遵循标准的一室或二室动力学。仅在较低的药物浓度观察到第一级动力学，这表明血浆浓度的代谢/消除过程的饱和度大于大约400ng/mL。分布体积显示随剂量几乎没有变化(0.025、0.05和0.1mg/kg剂量分别为平均2165、1903和2010mL)。血浆清除率显示随剂量的小的降低，0.025、0.05和0.1mg/kg剂量的几何平均数分别为78.0、70.7和59.2mL/小时。剂量归一化的Cmax和AUQ(0-无穷)数据的ANOVA表明，Cmax与剂量具有线性相关性。然而，AUC(0-无穷)在最高剂量0.1mg/kg显示非线性的证据，这可能与在更高剂量时观察到的药物清除率小幅下降有关。
2.4.安全性结果
15名受试者(8人中4人服用安慰剂，并且20人中11人服用肽I)经历了总共28例不良事件(AE)(安慰剂组中6例，并且肽I组中22例)。对于服用肽I的受试者，头痛(4/20，20.0％)和腹痛((2/20，10.0％)、恶心((2/20，10.0％)和鼻咽炎((2/20，10.0％)是较频繁报告的事件。所有不良事件(AE)，除一例外，等级评定都为轻微(1级)。认为肽I受试者中(15/22)观测到的大多数AE可能与研究药物肽I无关。4组之间AE的频率、严重性或模式都没有差异。没有严重不良事件(SAE)或由于AE而在研究中停药；然而，一名给0.025mg/kg剂量肽I的受试者由于轻微药物反应而停止了研究药物。这种反应在输注2分钟后开始，其为胸部开始出现潮红、并扩张到面部、感觉发热、不舒服以及咽喉刺痛。作为安全预防，这名受试者停止输注。症状自发且迅速地消退。无需治疗介入。生命体征上没有变化。实验室参数正常，其中所述参数包括额外的免疫测试；因此，无法解释这种特异性质的反应。许多药物都观察到类似(或更严重的)药物反应，包括其它ESA。此外，应在静脉内施用肽I期间观察患者。如果患者产生类似症状，那么停止注射。
一名安慰剂受试者和一名肽I受试者分别伴随药物治疗产生轻微头痛和轻微的腹部绞痛。生命体征、心电图(ECG)或实验值在临床上没有显著变化。在这次实验中没有受试者产生对肽I的特异抗体。
2.5总结
总而言之，肽I在单次静脉内施用0.025、0.05或0.1mg/kg的剂量后表现出安全性和良好的耐受性，具有与安慰剂类似的安全谱。药物代谢动力学结果表明，0.1mg/kg剂量的半衰期范围为大约15-33小时，平均23.5小时。所有剂量的中位数相当，在输注开始后15分钟出现。Cmax表现为与剂量具有线性关系；AUC(0-无穷)在0.1mg/kg剂量表现为非线性。仅在较低药物浓度下观察到一级动力学，这表明血浆浓度的代谢/消除过程的饱和度＞400ng/mL。在评估的所有剂量肽I都显示出对网织红细胞的药学活性；通常，应答是剂量依赖性的，随剂量增加应答更明显并且更长。由于0.1mg/kg剂量组在10名肽I受试者中伴随着血红蛋白自基线的临床和统计学上显著的增加，具有自基线的平均最大增加1.36±0.39g/dL，所以将其定义为NHV中的PAD。其它药物动力学参数的变化(红细胞数和红细胞比容增加、铁蛋白和网织红细胞血红蛋白含量瞬间减少、可溶性运铁蛋白受体蛋白质瞬间增加以及EPO瞬间减少)与刺激红细胞生成一致。
2005年6月4日在Stockholm举办的欧洲血液学协会第10次年度会议(European Hematology Association 10th Annual Congress)上展示的展板和摘要#0470在此处以其整体引入作为参考。
实施例14：透析前、透析以及肿瘤患者血红蛋白水平的增加
1.透析前患者
在不进行透析、并且先前未服用红细胞生成刺激剂(ESA)治疗的慢性肾病(CKD)患者中进行肽I注射的单静脉内剂量的安全性、药物动力学以及药物代谢动力学的研究，其为随机、双盲、安慰剂对照、依次剂量增加的研究。这项研究将评估单静脉内注射(IV)剂量水平的肽I在不进行透析(透析前患者)的CDK患者中的安全谱(safety profile)。这项研究也将：评估单剂量的肽I与药物动力学参数的剂量应答关系，其中所述的药物动力学参数包括血红蛋白、网织红细胞和铁的存储；评估在透析前患者中由静脉内施用单剂量水平的肽I的药物代谢动力学谱；确定在透析前患者中静脉内施用的药学有效剂量(PAD)，例如使＞70％的患者实现血红蛋白自基线的增加≥1g/dL的剂量。
研究的终点包括：不良事件(AE)、严重不良事件(SAES)、药物代谢动力学参数，其中包括Cmax、AUC0-tAUC0-无穷、t1/2β、Vd和CL、药理学参数，其中包括网织红细胞、血红蛋白、网织红细胞的血红蛋白含量以及铁存储的血清测定值(例如血清铁蛋白、运铁蛋白饱和度和运铁蛋白受体蛋白质)、自基线的平均血红蛋白变化、自基线的最大血红蛋白变化、实现血红蛋白自基线增加≥1g/dL的受治疗患者的比率、以及血红细胞输注的频率。
选来进行研究的患者为年龄在18-75岁、慢性肾病之后血红蛋白≥9g/dL并且≤11g/dL、以前未进行ESA治疗的透析前患者，登记满足合格标准的患者。在9名患者的每组中，将患者随机分配来接受单次剂量的肽I(n＝7)或安慰剂(n＝2)。为确保每组中有5名肽I处理患者至少22天的数据可用，将替换掉组中在22天前终止研究的第三名和随后患者。将每名替代的患者指定为与退出的患者相同的处理组。不替换22天后自研究中止的患者。
计划连续登记多达6个剂量水平组(多达4个计划的剂量水平和2个额外的较低的中间的、和/或重复[证实]的剂量水平)，其中所述剂量水平由独立安全监督者(Independent Safety Monitor)、研究者(Investigator)和赞助商(Sponsor)确定。这次实验中最多登记54名可评估的患者。
期望研究中的每名患者参与至少28天下述剂量处理。
每名患者接受单次剂量的肽I或安慰剂。计划的依次肽I剂量水平为：
  肽I剂量(mg/kg)
  0.050.10.20.3额外的证实性中间的或较低的剂量额外的证实性中间的或较低的剂量
这是每组9名透析前患者高达G剂量组的随机、双盲、安慰剂对照、依次剂量增加的研究。在每组中，监测患者29天或者直至随后发生的任何不良事件稳定。监测所有患者的血红蛋白水平直到提高的水平恢复到基线水平的0.5g/dL内。
基线的血红蛋白浓度定义为研究用药前三个最近血红蛋白值的平均值。在研究中，决定每组起始或结束的血红蛋白变化需要用下一连续的血红蛋白值来确定。
如果患者的血红蛋白水平达到14g/dL，若有临床指示，那么应对患者进行静脉切开放血。如果患者的血红蛋白水平达到16g/dL(已确定)，那么应对患者进行静脉切开放血。
在对第一组给药后，随后加入的下一剂量水平的另一组将基于实验方案指示的剂量增加标准。下一剂量水平组的剂量增加基于实验方案指示的停止标准来中止。非盲法的独立安全监督者将在正进行的基础上参考非盲法的临床和实验数据来确定何时满足剂量增加或中止标准。
研究者临床人员和赞助商临床人员不知道个体患者的处理安排和患者鉴定的PK、血液学和铁参数结果，其中所述结果包括血细胞比容、血红蛋白、MCHC(平均细胞血红蛋白浓度)、MCH(平均细胞血红蛋白)，MCV(平均细胞体积)、网织红细胞计数和网织红细胞血红蛋白含量、或铁存储结果，其中所述铁存储结果包括铁蛋白、运铁蛋白饱和度和运铁蛋白受体蛋白质；但这些工作人员在研究过程中可以检查这些参数经鉴定的结果。这些工作人员不知道所鉴定的这些参数的结果的患者，这时因为如果鉴定了结果的患者，那么处理安排就可能不是盲法的。
当组中所有可评估患者(不少于7名)到达22天，如果未鉴定到安全性问题，并且：组中没有患者实现血红蛋白≥1.0g/dL的增加，或者所有接受肽I并实现血红蛋白自基线增加＞1.0g/dL的患者显示在最小两个时间点期间的稳定性(0.5g/dL血红蛋白峰值之内)或可逆性(血红蛋白峰值下降)，那么对下一组开始增加剂量是允许的。
如果碰到下列条件中的任何一项，那么向当前组中加入新患者以及增加至新剂量都将停止：组中2名或多名患者出现3或4级肽I相关的不良事件；组中接受肽I的2名或多名接受肽I的患者在任意四周时间期间血红蛋白增加≥2.0g/dL(增加自基线水平开始)；或者组中接受肽I的2名或多名患者的血红蛋白超过目标范围上限(＞13g/dL)。
如果未鉴定出安全问题，那么在组中所有评估患者(不少于7名)到达22天后开始额外的9名患者组来研究证实性(重复)的较低或者中间剂量。
期望透析前患者测定的PAD为0.025-0.2mg/kg、可能0.05-0.1mg/kg、可能0.067-0.075mg/kg。
2.透析患者
进行在慢性血液透析患者中静脉内注射施用肽I来维持贫血治疗的安全性、药物动力学和药物代谢动力学的剂量探测研究，以便测定每月由静脉内施用肽I的剂量范围，其中所述研究是公开标记的、多中心的、连续的，并且其中所述每月剂量范围使血红蛋白值对红细胞生成素α(Epoetinalfa)稳定的血液透析患者的血红蛋白维持在高于1.0g/dL或低于基线之内。这项研究也评估在血液透析患者中经静脉施用高达3次剂量的肽I的安全谱，评估在血液透析患者(研究患者亚组)中经静脉内施用高达3次剂量的肽I的药物代谢动力学谱。
研究的终点包括：血红蛋白自基线的平均每周变化、经过13周血红蛋白在1.0g/dL以上或基线以下的患者的数量(％)；经过13周血红蛋白维持在9.5-13.0g/dL内的患者数量(％)；研究期间未调整剂量的患者数量(％)和研究期间剂量增加或减少的患者数量(％)、血红细胞输注频率；额外的药学参数，其中包含网织红细胞计数(绝对值和AUC)、网织红细胞血红蛋白含量和铁储量的血清测定值(例如，血清铁蛋白、运铁蛋白饱和度和可溶性运铁蛋白受体蛋白质)；不良事件；严重不良事件；以及药物代谢动力学参数，其中包括Cmax、AUC0-t AUC0-无穷、t1/2β、Vd、Vss和CL(研究患者亚组)。用药物代谢动力学和药物动力学分析的结果测定初级转换系数(preliminary conversion factor)，其基于每周的红细胞生成素α(Epoetin alfa)剂量来最好地预测肽I的每月剂量。
选来进行研究的患者是年龄在18岁或以上、血红蛋白用稳定剂量的商品化红细胞生成素α维持稳定的血液透析患者，登记满足合格条件的患者。计划在3-10个临床中心登记每组15名患者的多达4个连续剂量水平的组。
为确保接受三次肽I剂量的每组中最少有10名患者数据可用，将替换掉组中在接受第三次剂量之前终止研究的第6名和随后的患者，最多可替换掉四名患者。不替换接受三次剂量后中止研究的患者。
最初计划依次加入两个剂量水平组。根据观察得到的安全谱和药理学反应，可以加入多达2个额外的每组15名患者的组来研究较低的中间的、和/或者重复的(证实的)剂量水平、和/或施用频率。
这个实验中可登记最少30名并且最多60名可评估的患者。期望研究中的每名患者在4周筛选期之后参与大约15周。
根据支持性数据的有效性，计划对给药持续时间进行延长另外12周的修改。
肽I剂量每4周施用1次，共施用3次剂量，其在透析的最后15分钟以快速的静脉内团注30秒来施用。组中的每名患者接受公开标记剂量的肽I，其中所述剂量起始于预先指定的红细胞生成素α至肽I的转变水平。下一组基于先前组观察到的剂量应答关系而增加或向下降低剂量。计划的肽I起始剂量水平转换为：
  组              100U/kg/周红细胞生成素α至肽I剂量(mg/kg/Q4W)转换系数起始组          0.033增加组或降低组  对于增加组，为0.041-0.050对于降低组，为0.017-0.025中间组或证实组  待确定中间组或证实组  待确定
在个体患者中肽I的剂量可以进行如下调整。以肽I研究药物的第三剂量开始，如果证实患者的血红蛋白自基线下降大于1.0g/dL、或者证实患者的血红蛋白自基线下降0.5g/dL而到达11g/dL以下的水平，那么剂量将增加25％。以研究药物的第三剂量开始，如果证实患者的血红蛋白自基线增加大于1.5g/dL、或者证实患者的血红蛋白自基线增加0.5g/dL而到达12g/dL以上的水平，那么剂量将下降25％。如果在研究期间的任何时间证实患者的血红蛋白在任意2周期间增加(自基线增加)大于1.0g/dL，那么下一个剂量将减少25％。如果在研究期间的任何时间证实患者的血红蛋白超过12.5g/dL，那么将延迟下一个剂量直至血红蛋白降低到12.0g/dL，并且剂量将减少25％。
基线的血红蛋白浓度定义为在施用研究药物之前3周的3个最近星期三所收集的透析前血红蛋白值的平均值。研究期间，进行个体剂量调整或组起始或中止标准判断的血红蛋白水平的变化需要用7天内任意时间重复的血红蛋白值来确认。
这是每组15名血液透析患者、2-4个处理组、公开标记的相继剂量探究实验。每名患者每四周1次地共接受3次剂量的静脉内注射的肽I剂量。在接受第一次剂量的肽I后，患者在整个研究期间至少每周观察一次。研究期间，铁的状态根据Kidney Disease Outcomes Quality Initiative(K/DOQI)的治疗方针进行维持。
在最后施用肽I之后，最少监测患者42天，或者直到随后出现的不良事件稳定为止。停止处理后，监测所有患者的血红蛋白水平直至其恢复到目标范围。
如果患者的血红蛋白水平达到14g/dL(经确认的)，那么将根据研究者的判断对患者进行静脉切开放血。如果患者的血红蛋白水平达到16g/dL(经确认的)，那么将对患者进行静脉切开放血。静脉切开放血的方法根据位置的标准临床实践(the site′s standard clinical practice)进行。记录静脉切开放血的体积。进行静脉切开放血开的患者中止服用肽I，并将静脉切开放血后的药物动力学数据将排除在分析之外。
对第一组给药后，随后基于实验方案特定的剂量增加和降低标准来加入下一组。一旦确定了适当的剂量水平转换系数，那么将在证实性组中重复转换系数剂量水平。独立安全监督者和赞助者将在正进行的基础上参考临床和实验数据来确定何时满足剂量增加、减少、额外的组或中止标准。
第7周开始，检查登记在组中的6名或多名患者的数据，如果独立安全监督者未鉴定出安全问题、并且组合的6名或多名患者确认血红蛋白在第7周或之后自基线下降超过1.0g/dL，那么可停止登记入当前组，并且允许下一组增加剂量。
第7周开始，检查登记在组中的6名或多名患者的数据，如果独立安全监督者未鉴定出安全问题、并且组合的6名或多名患者确认血红蛋白在第7周或之后自基线增加超过1.0g/dL达到大于13.0g/dL的血红蛋白值、或者确认血红蛋白在研究开始后的任意两周期间增加超过1.0g/dL(自基线以上开始增加)，那么可停止登记入当前组，并且允许下一组降低剂量。
第7周开始，检查登记在组中的10名或更多患者的数据时，如果独立安全监督者未鉴定出安全问题，那么开始额外的组来研究较低或中间的(介于当前和先前研究之间的)转换系数、和/或施用频率。最多加入两个额外组。
在检查了登记在组中的10名或更多患者的第7周数据后，如果独立安全监督者未鉴定出安全问题、并且不满足剂量增加或剂量减少规则，那么可启动使用相同转换系数的证实组来重复相同的转换系数和/或施用频率。
如果满足下述标准即组中3名患者出现肽I相关的3级或4级不良事件，那么当前组停止加入新患者，并且停止增加至新剂量。
预计对透析前患者测定的PAD为0.025-0.2mg/kg、可能0.05-0.1mg/kg、可能0.067-0.075mg/kg。
3.肿瘤患者
进行在患有化学疗法诱导的贫血(CIA)的肿瘤患者中皮下施用肽I的安全性、药物动力学和药物代谢动力学的公开标记、多中心剂量增大的研究来测定伴随着患有化学诱导的贫血的患者体内的血红蛋白应答的每三周经皮下(SC)注射施用的肽I剂量。其它目的包括：评估在接受并发骨髓抑制化学治疗的癌症患者中每三周1次地皮下施用多达4次剂量肽I的安全谱；测定在患有CIA的患者中不同剂量水平肽I的Hgb自基线的变化；测定对肽I具有Hgb应答(如终点的定义)的患者比例；测定将CIA患者的血红蛋白增加并维持在11-13g/dL的目标范围的肽I皮下施用剂量；评估在CIA患者(研究患者亚组中)中皮下施用高达4剂量肽I的药物代谢动力学谱；以及探究活性剂量的肽I的剂量频率和肠胃外铁替换的效果。
研究终点包括：治疗组中血红蛋白增加大于2g/dL或者前28天未进行RBC输注、在4周、9周和12周时Hgb增加大于1g/dL达到至少12g/dL的患者比例；前28天未进行RBC输注、在4周、9周、12周时Hgb自基线增加＞1g/dL的患者比例；在4周、9周、12周时Hgb在11-13g/dL目标范围内的患者比例；第4周后Hgb值在11-13g/dL目标范围内的比例；血红蛋白自基线的平均变化；血红细胞输注频率；额外的药学参数，其中包括网织红细胞计数(绝对值和AUC)、网织红细胞的血红蛋白含量、铁存储测定值的变化例如运铁蛋白饱和度和血清铁蛋白；不良事件(AE)；严重不良事件(SAE)；以及研究患者一亚类药物代谢动力学参数，其中包括Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、t1/2β(消除半衰期)、Vd(表观分布体积)、Vss(稳态体积)和CL(清除率)。
选来进行研究的患者为年龄在18-80岁、化学治疗之后血红蛋白≥9g/dL并且≤11g/dL、之前90天内未进行ESA处理、并且满足合格标准的患者，对其指定药物监测者(MM)认可的起始剂量或随后的相继剂量的肽I。为确保每处理组有最少10名处理患者12周的数据可用，替换掉组中8周前中止研究的第6名和后续患者，最多进行5次替换。每次替换的患者指定为与退出患者相同的处理组。随后增加多达4组公开标记处理、15名患者的组来研究较低的中间和/或重复的剂量水平、和/或施用肽I的频率、和/或将运铁蛋白饱和水平维持在25-50％的肠胃外铁替换。如果探究所有可能的剂量方案，那么这个实验中可以登记最少30名并且最多90名患者(不包括替换)。
期望研究中的每名患者在多达4周的筛选期后参与多达12周。
15名患者的后续组将接受增加剂量的肽I。公开标记的剂量将通过每3周1次共4次剂量(研究第1、4、7、10周)的SC注射来施用。一般而言，肽I将在化学治疗周期的第一天施用。肽I的起始剂量和剂量频率基于健康志愿者的1期数据，并且根据从对肽I和其它红细胞生成刺激试剂(ESA)的红细胞生成应答的PK/PD数据建模的反应来预测。每组中安排的肽I剂量水平和患者数量为：
  N   处理   剂量(mg/kg)Q3W
  15   肽I   0.1mg/kg
  15   肽I   0.2mg/kg
  15   肽I   0.4mg/kg
  15   肽I   0.6mg/kg
在最后一次注射后监控患者28天或者直至不良事件稳定或者最终出现的血红蛋白值介于11-13g/dL之间。不允许增加剂量。第4周以后，如果需要RBC输注来将Hgb维持在目标范围，那么患者将从药物研究中移出，返回到标准护理，并且另外监控28天的安全性。如果在研究期间的任意时间，患者的血红蛋白在任意2周期间内增加＞1.0g/dL，那么将延迟下一剂量直至血红蛋白稳定(一周中的增加＜0.5g/dL)，并且剂量将下降50％。基线血红蛋白浓度定义为在施用研究药物前周收集的最近2次每周血红蛋白值(例如筛选和基线值)的平均数。研究期间，对于组起始或中止判断标准的血红蛋白水平变化需要通过7天内下一个连续血红蛋白值来确认。
这是每组15名CIA患者、高达6个处理组的公开标记、多中心的实验。在最初的处理组中，每3周1次共高达4次剂量地经皮下施用公开标记的肽I。在第一次剂量之后，整个研究期间至少每周观察患者一次。在最后施用研究药物之后，最少监控患者28天，或者直到不良事件稳定、或者最后出现的血红蛋白值介于11-13g/dL之间。如果患者的血红蛋白水平达到14g/dL(经确认的)，那么可对患者如临床指示地进行静脉切开放血，并记录静脉切开放血的体积。进行静脉切开放血的患者中止服用研究药物，并将静脉切开放血后的药物动力学数据排除在分析之外。医药监督者(MM)和赞助商将在正进行的基础上参考安全性和药物动力学数据来确定是否以及何时满足中止标准。
对登记在组中的6名或更多患者完成了至少6周的监控(即第二次剂量后至少3周)后，如果MM未鉴定出安全问题、并且在第4周后对6名或更多患者进行了输注或者确认了第6周时的血红蛋白增加小于1g/dL，那么可停止登记入当前组并且允许下一组将剂量扩大。
在6名或更多患者登记在组中、并且完成了至少6周的监控(第2次剂量后至少3周)后，如果出现至少3级或4级可能与肽I相关的AE、或者如果MM鉴定出任何对肽I特异的忧虑、或者总共6名或更多患者确认了血红蛋白水平＞13.0g/dL(与输注无关)或者确认血红蛋白在任意两周期间内增加＞1.0g/dL(与输注无关)，那么可停止登记入当前组并且允许在下一组中将剂量降低至较低水平。
如果MM和赞助商未鉴定出安全问题，那么可以起始多达两个15名患者的、额外的、公开标记的处理组来研究较低的中间(介于当前和先前研究的剂量之间)或重复的剂量水平。此外，一旦测定了每三周施用的活性剂量，可以登记多达两个额外的组来测定以不同频率(例如，每4周施用的每3周剂量的4/3)的部分施用相同总剂量的相对效果。也可以在分开的组中探究肠胃外施用铁来实现运铁蛋白25-50％饱和度的效果。
预期对肿瘤患者测定的PAD为0.075-0.5mg/kg、可能0.2-0.4mg/kg、可能0.25mg/kg。
本发明不限于本文描述的特定实施方案。事实上，除了本文描述的那些之外，本领域技术人员从上述描述和附图清楚本发明的多种修改。这些修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
需要进一步理解的是，所有值都是近似的，并且是提供来进行描述的。
在本发明的说明书中引用和讨论了许多参考文献，其中包括专利、专利申请和多种出版物。对这些参考文献的引用和/或讨论仅用来阐明本发明的描述，并且不是承认任何此类参考文献是本发明的“现有技术”。说明书中引用和讨论的所用参考文献在此处都以其整体和如同每篇参考文献单独引入作为参考的相同程度引入作为参考。
序列表
<110>阿费麦克斯公司
<120>促红细胞生成素受体肽制剂和用途
<130>04279/2202975-WO0
<150>60/687,655
<151>2005-06-03
<160>13
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
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<223>合成的肽
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<223>侧链Trt保护的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>侧链tBu保护的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa是1-萘基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>侧链Trt保护的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>侧链Pbf保护的
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa是N-甲基甘氨酸
<400>13
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln
1               5                   10                  15
Pro Leu Arg Xaa
           20

Claims (19)

1.治疗患有以促红细胞生成素缺乏或者低的或缺陷的血红细胞群体为特征的疾病的患者的方法，其中所述方法包括向患者施用治疗有效量的结合并激活促红细胞生成素受体(EPO-R)的化合物，其中所述的治疗有效量为每1千克患者体重0.025至0.5毫克化合物的剂量，其中所述的化合物包含：
(a)含有第一肽单体和第二肽单体的肽二聚体部分，其中所述的第一肽单体和第二肽单体包含氨基酸序列
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR；
(b)接头部分，其共价结合所述肽单体；
(c)聚乙二醇(PEG)部分，其包含线形无分支的具有10,000-60,000道尔顿分子量的PEG；以及
(d)间隔物部分，其共价连接所述PEG部分至所述接头部分，并且具有下式
其中R4选自NH、NHCO、CO、COO和NHCOO。
2.权利要求1的方法，其中所述的氨基酸序列额外地包含(MeG)、K或(MeG)K。
3.权利要求2的方法，其中所述的氨基酸序列为(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK。
4.权利要求2的方法，其中所述的氨基酸序列为(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)。
5.权利要求2的方法，其中所述的氨基酸序列为(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K。
6.权利要求1的方法，其中所述的间隔物为亚氨基二乙酰接头。
7.权利要求1的方法，其中所述的间隔物为十原子PEG(2，2′-(乙二氧撑(双乙胺)))。
8.权利要求1的方法，其中所述的接头为赖氨酸。
9.权利要求1的方法，其中所述的PEG为10,000-60,000道尔顿。
10.权利要求9的方法，其中所述的PEG为20,000-40,000道尔顿。
11.权利要求1的方法，其中所述的方法还包括可药用载体。
12.权利要求1的方法，其中所述的疾病为肾衰竭或透析。
13.权利要求12的方法，其中所述的治疗有效量为每1千克患者体重0.025-0.2毫克化合物的剂量。
14.权利要求13的方法，其中所述的剂量为每1千克患者体重0.05-0.1毫克化合物。
15.权利要求1的方法，其中所述的疾病为伴随恶性肿瘤的贫血。
16.权利要求15的方法，其中所述的治疗有效量为每1千克患者体重0.075-0.5毫克化合物的剂量。
17.权利要求16的方法，其中所述的剂量为每1千克患者体重0.2-0.4毫克化合物。
18.权利要求1的方法，其中每3-4周施用治疗有效量一次。
19.权利要求1、2、5、6、8-18中任意一项所述的方法，其中所述的化合物为
Figure A2006800269910003C1
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