CN103044539A - 重组促红细胞生成素及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学修饰的重组促红细胞生成素及制备方法，采用基因工程技术对促红素进行重组，在促红素中引入了具有化学活泼酮基的4-乙酰苯丙氨酰残基，在聚乙二醇对重组促红素共价修饰时，聚乙二醇特异性地与4-乙酰苯丙氨酰残基反应，反应完全，且不与其他氨基酸残基发生反应，所需要的反应条件较温和，解决了现有技术中选择性差、反应条件恶劣的问题。聚乙二醇化的重组促红素的药代动力学研究结果、血细胞比容测定结果均优于天然的促红素。

Description

重组促红细胞生成素及制备方法

技术领域

本发明涉及重组促红细胞生成素及制备方法，具体涉及化学修饰的重组促红细胞生成素及制备方法。

背景技术

促红细胞生成素(Erythropoietin)也称促红素，英文简称EPO，是一种糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓红细胞前体细胞的分化与增殖，因此EPO被认为是促进红细胞的产生并能够调节体内的红细胞总量在最适宜水平的主要调节因子。

天然人促红细胞生成素(hEPO)是一种主要由肾脏合成并分泌的糖蛋白激素。当肾脏功能衰竭时，EPO就无法正常合成，因而导致红细胞生成数量的减少，即造成贫血。贫血是慢性肾病的常见症状之一，以前对于慢性肾病引起的贫血没有有效的预防和治疗措施，基本上只能是通过输血来暂时缓解症状。

随着现代基因技术的发展，1984年重组人促红素(r-HuEPO)首次研究成功并广泛应用于临床，大大加速了人们对促红素的基础及应用研究，并为肾性贫血病患者提供了新的医疗途径。现有的研究表明促红素的作用要比以前所认识到的广泛，它不仅适用于慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血和艾滋病引起的贫血等，还可以降低病人对输血的需求，减少艾滋病以及病毒性肝炎等通过血液制品传播疾病的发生几率。目前，越来越多得贫血患者在接受EPO治疗。

目前医药市场上的促红素产品以第一代重组促红素为主，主要在中华豚鼠细胞内表达和然后纯化。而第一代重组促红素，因其血浆半衰期较短以及对蛋白酶降解的敏感性，其在体内的生物利用度较低。针对第一代产品的缺陷，目前已经开发出第二代重组促红素产品(以罗氏制药(Roche)开发出来的CERA为代表)，即经聚乙二醇(PEG)修饰的重组促红素。

聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被运用到治疗和诊断有重大意义的多肽的共价修饰上。例如PEG共价连接到白介素、干扰素等治疗性多肽上，已经报道PEG的共价修饰可以延长这些治疗性多肽在体内的半衰期、和/或降低它们的免疫原性和抗原性。

同样的，PEG的共价修饰也适用于重组促红素。临床实验也证明了，将无体内活性或生物利用度较低的重组促红素经聚乙二醇共价修饰，可以获得具有体内促红细胞生产活性的重组促红素产品，该产品的半衰期是第一代重组促红素产品的16倍以上。

除了PEG以外，其他的聚环氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用于修饰重组促红素，起到延长血浆半衰期的作用。

到目前为止，已经公开了重组促红素的多种类型的聚乙二醇化学修饰方法，例如WO94/28024公开了一种具有促红细胞生成素活性的糖修饰的PEG缀合物，其中PEG与rEPO的被氧化的糖链连接，在PEG化学修饰方法中，A)若只是采用纯化学的方法缀合到PEG上(例如罗氏制药的CERA是通过对重组促红素内的自由氨基进行PEG化学修饰)，这类方法通常都存在选择性差(无法定向和/或特异性修饰)，以及反应条件恶劣等缺陷；B)采用PEG对重组促红素的被氧化的糖基进行共价修饰，由于共价修饰前涉及到糖基化以及糖基氧化的步骤，这类方法同样存在选择性差、反应不完全的缺陷。

WO 90/12874中公开了单甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制备方法，其中EPO内通过基因工程手段导入了一个半胱氨酸残基，再将特定的PEG试剂共价连接到该残基上。将非天然氨基酸用基因编入法引入蛋白质是实现在单氨基酸残基水平上选择性标记蛋白质的一种非常有效的方法，该方法利用一琥珀型抑制因子tRNA(tRNA_CUA)通读一个存在于mRNA读码框内的琥珀型终止密码子(UAG)，在此过程中，氨酰基-tRNA合成酶对该tRNA进行了非天然氨基酸酰化，该体系与发现于一些产(甲)烷古生菌和一种革兰氏阳性菌(Desulfitobacterium hafniense)细胞内天然进行的吡咯赖氨酸(Pyl)引入机制相同，在这些生物细胞内，一个读码框内的琥珀密码子对Pyl进行共同翻译并插入蛋白质中，这一琥珀密码子被一类具有CUA反密码子并且由吡咯赖氨酰基氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)进行Pyl酰化的Pyl琥珀型抑制因子tRNA(pylT)所抑制，这些生物体内的PylRS-pylT配对体与细胞内其他类型的合成酶-tRNA配对体正交，即无相互作用，因此该配对体只针对Pyl以确保精确引入Pyl。与Pyl引入机制类似，特定的氨酰基-tRNA合成酶可以将非天然氨基酸特定连接到其同源tRNA_CUA上，形成正交的合成酶-tRNA_CUA配对体，当这一合成酶-tRNA_CUA配对体在细胞中表达时，非天然氨基酸在琥珀密码子处被高效、精确地定点引入到蛋白质中。这一方法可在细菌、酵母、及哺乳动物细胞内将多种非天然氨基酸定点引入蛋白质，并用以研究大量生物学课题。

发明内容

本发明引入了两种非天然氨基酸，4-乙酰苯丙氨酸(AcF)和2-氨基-8-羰基壬酸(KetoK)，均包含功能性酮基，引入这两类非天然氨基酸可用于蛋白质定点修饰。本发明将这两类非天然氨基酸引入促红细胞生成素(EPO)基因，并成功用于促红细胞生成素与带有羟胺基的20K聚乙二醇(PEG)的共价连接。

本发明提供了两种化学修饰的重组促红细胞生成素，在第一种重组促红细胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸残基为4-乙酰苯丙氨酰残基，至少一个4-乙酰苯丙氨酰残基上共价连接了聚乙二醇；在第二种重组促红细胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸残基为2-氨-8-氧代壬酰残基，至少一个2-氨-8-氧代壬酰残基上共价连接了聚乙二醇。

本发明还提供了上述化学修饰的重组促红细胞生成素的制备方法，该方法采用基因工程技术时促红素进行重组，在促红细胞生成素的第65位和/或第152位上引入具有化学活泼酮基的氨基酸残基，该氨基酸残基为4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基，然后用聚乙二醇对氨基酸残基进行化学修饰，聚乙二醇特异性地与4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基反应，反应完全且不与其他氨基酸残基发生反应，所需要的反应条件较温和，解决了现有技术中选择性差、反应条件恶劣的问题。

用来化学修饰4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基的聚乙二醇是一类亲水聚合物，优选地，羟氨基或联氨基取代的聚乙二醇，这类聚乙二醇可以更特异地与4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基上的化学活泼的酮基反应，反应更完全，所需的反应条件很温和，一般只需要在生理条件下反应即可。

具有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素的制备方法包括：

(1)构建含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体，编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No.2所述，琥珀突变抑制tRNA基因序列如SEQ ID No.1所述，在第65位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No.3所述，在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No.4所述；

(2)将所述重组表达载体转染宿主细胞，培养所述宿主细胞并从中分离得到在第65位和/或第152位具有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素；

(3)采用聚乙二醇对分离得到的所述重组促红细胞生成素上的至少一个4-乙酰苯丙氨酰残基进行化学修饰。

在一种具体实施方式中，所述重组表达载体为

重组质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO_TAG，所述宿主细胞为将含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体稳定整合到CHO细胞染色体的CHO细胞。CHO细胞的全称为中国仓鼠卵巢细胞。

类似地，具有2-氨-8-氧代壬酰残基的重组促红细胞生成素的制备方法包括：

(1)构建含有编码2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体，编码2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No.6所述，琥珀突变抑制tRNA基因序列如SEQID No.5所述，在第65位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No.3所述，在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No.4所述；

(2)将所述重组表达载体转染宿主细胞，培养所述宿主细胞并从中分离得到在第65位和/或第152位具有2-氨-8-氧代壬酰残基的重组促红细胞生成素；

(3)采用聚乙二醇对分离得到的所述重组促红细胞生成素上的至少一个2-氨-8-氧代壬酰残基进行化学修饰。

在一种具体实施方式中，所述重组表达载体为

重组质粒pcDNA3.1-pylT-KeoKRS-EPO_TAG，所述宿主细胞为将含有编码2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体稳定整合到CHO细胞染色体的CHO细胞。

重组促红细胞生成素的制备方法是利用琥珀密码子无义抑制的方法在促红细胞生成素中引入特定的氨基酸残基，该氨基酸残基为4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基，首先在促红素的原始基因序列中合适的位点(第65位和/或第152位)制造至少一个琥珀无义突变，并在促红素的表达载体中引入合适的琥珀突变抑制tRNA的基因序列和氨酰基-tRNA合成酶的基因序列，然后，当表达载体在宿主细胞中表达时，发生了琥珀无义突变的位置翻译成上述特定的氨基酸残基，从而成功在促红素中引入4-乙酰苯丙氨酰残基或2-氨-8-氧代壬酰残基。

本发明还提供了化学修饰的重组促红细胞生成素在制备治疗贫血药物中的用途。PEG-EPO缀合物比天然EPO有更好的药物代谢动力学特征和更高的活性。

本发明还提供了一种药物组合物，其中，该组合物包含化学修饰的重组促红细胞生成素和药学上可以接受的载体。本发明的重组促红细胞生成素优选哺乳动物或人源化的重组促红细胞生成素，更优选人源化的重组促红细胞生成素。

附图说明

图1是pKetoAmber-EPO65TAG重组表达质粒图谱；

图2是pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO重组表达质粒图谱；

图3是pcDNA3.1-pylT-KeoKRS-EPO重组表达质粒图谱；

图4是带有羟氨基的聚乙二醇对本发明的重组促红素进行化学修饰的反应式；

图5是未修饰重组促红素与聚乙二醇修饰后的促红素(EPO(AcF65))的SDS胶体电泳图；

图6是未假饰重组促红素与聚乙二醇修饰后的促红素(EPO(AcF152))的SDS胶体电泳图；

图7是未修饰重组促红素与聚乙二醇修饰后的促红素(EPO(KetoK65))的SDS胶体电泳图；

图8是未修饰重组促红素与聚乙二醇修饰后的促红素(EPO(KetoK152))的SDS胶体电泳图；

图9是天然促红素和聚乙二醇修饰后的重组促红素在不同时间点在血液中的含量变化图；

图10是注射天然促红素和聚乙二醇修饰后的重组促红素后血细胞比容值随时间的变化图。

具体实施方式

实施例一：聚乙二醇化学修饰在第65位和/或第152位上带有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素

(1)获得在第65位和/或第152位上带有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素

(1a)重组表达载体的构建

一种方法：

参见图1，首先，在体外构建4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因的表达载体(pKeto)，即：扩增合成含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因(该基因序列参见SEQ ID No.2)的DNA片段，将获得的该DNA片段利用特异性的酶切位点导入合适的载体中，获得含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因的表达载体。可以用一个带有XbaI酶切位点的引物和一个带有ApaI酶切位点的引物，利用PCR扩增出带有KetoRS(基因序列为图3所示的SEQ ID No.2)的DNA片断，并进过琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到纯化的DNA片断；再将该DNA片断用XbaI和ApaI酶切后连接到pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen公司)的XbaI和ApaI位点之间；再将连接好的载体转化到大肠杆菌Top10中，利用氨苄青霉素进行筛选，最后提取质粒，即表达载体pKeto(通过测序确认表达载体pKeto的DNA序列)；

然后，在体外构建含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶和琥珀突变抑制tRNA的基因的表达载体(pKetoAmber)，即：扩增合成含有编码tRNA_CUA基因(该基因的序列参见SEQID No.1)的DNA片段，将获得的该DNA片段利用特异性的酶切位点导入到上述的表达载体pKeto中。扩增合成含有编码tRNA_CUA基因(该基因的序列参见SEQ ID No.1)的三联体DNA片段将含有一个tRNA_CUA基因序列的DNA片段、四条多聚脱氧核酸链、含有人tRNA^Tyr基因启动子的DNA片段通过PCR方法依次连接，四条多聚脱氧核酸链，按连接次序依次为：

链1：

GCAACGGAATTCAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACAC；

链2：GCCACTTCGCTACCCCTCCGACGTGTACGTGTGTCGGCGTCCCCTGAGGT；

链3：CGGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCT；

链4：

GCAACGGGATCCTGGAGGGGGACGGATTCGAACCGCCGAACCCAAAGGGAGCGGATTTAGAGTCC。

连接完成后，利用EcoRI合BamHI酶切后连接到pUC18表达质粒中形成pUC18-1tRNA_CUA：

采用PCR的方法，利用带有BglII和BamHI酶切位点的引物，扩增pUC18-tRNA_CUA中的含有一个tRNA_CUA基因序列的DNA片段和人tRNA^Tyr基因启动子的DNA片段，再用BglII和BamHI酶切后连接到pUC18-tRNA_CUA的BamHI位点内形成pUC18-2tRNA_CUA；

采用PCR的方法，利用带有BglII和BamH1酶切位点的引物，扩增pUC18-tRNA_CUA中的含有两个tRNA_CUA基因序列的DNA片段和人tRNA^Tyr基因启动子的DNA片段，再用BglII和BamHI酶切后连接到pUC18-2tRNA_CUA的BamHI位点内形成pUC18-3tRNA_CUA；

采用PCR的方法，利用带有BglII和EcoRI酶切位点的引物扩增pUC18-3tRNA_CUA中的的含有编码tRNA_CUA基因的三联体DNA片段(3tRNA_CUA)，再用BglII和EcoRI酶切纯化后连接到表达载体pKeto的BglII和MfeI位点内形成表达载体pKetoAmber。

之后，再体外构建含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶、琥珀突变抑制tRNA和包含至少一个琥珀无义突变的促红素的基因的表达载体(pKetoAmber-EPOTAG)，即：

先构建带有人类野生型促红素EPO的表达载体，利用定点突变试剂盒对该表达载体进行处理，得到带有人促红素基因突变体EPO65TAG(EPO基因中第65位的密码子突变成TAG，SEQ ID No.3)表达载体，再从该表达载体中扩增出EPO65TAG以及相应的启动子和终止子DNA片段，并利用合适的酶切位点导入到上述的表达载体pKetoAmber中形成表达载体pKetoAmber-EPO65TAG。

首先可以采用PCR方法，利用带有XbaI和ApaI酶切位点的引物扩增出人类野生型促红素，再用XbaI和ApaI酶切后连接到pcDNA4/TO/Myc HisA表达载体内形成pcDNA4-EPO；

然后用快速点突变试剂盒(美国Stratagene公司)和两个引物GCTTGAATGAGTAGATCACTGTCCCAGAC和gtctgggacagtgatctactcattcaagc合成表达载体pcDNA4-EPO65TAG，该表达载体中的EPO基因中第65位发生琥珀无义突变(EPO65TAG的序列参见SEQ ID No.3)，在65位的天门冬酰胺被突变为TAG琥珀无义密码子)；采用PCR方法，利用带有BamHI和BglII酶切位点的引物来扩增pcDNA4-EPO65TAG中的EPO65TAG基因、以及带有两倍TetO2位点的启动子和BGH pA终止子的DNA片断，最后用BamHI和BglII酶切纯化后连接到pKetoAmber的BglII位点内形成pKetoAmber-EPO65TAG，如图1所示。

另外一种方法：

参见图2，首先，将双螺旋多聚核苷酸U6-EctRNA_CUA ^Tyr-BamHI-BglII(订购自Epoch Biolabs)(序列为SEQ ID No.7)用内切酶BamHI、BglII酶切后，插入质粒pcDNA3.1/hygro(+)的BglII位点，得到重组质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr，EctRNA^tyr的序列为SEQ ID No.1；

然后，使用AcFRS-ApaI-R(序列为SEQ ID No.8)和AcFRS-XbaI-F(序列为SEQ ID No.9)作为引物对AcFRS(4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶)(序列为SEQ ID No.2)(来自PSWAN-AcFRS⁷)进行扩增，随后用内切酶XbaI、ApaI酶切；

然后，将上述用内切酶XbaI、ApaI酶切的产物插入重组质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr，插入位点为XbaI、ApaI，所得质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS含有U6-EctRNA_CUA ^Tyr和AcFRS序列；

之后，利用内切酶XbaI、ApaI对EPO-XbaI-ApaI(序列为SEQ ID No.10)(订购自EpochBiolabs)进行酶切，后插入质粒pcDNA3.1/hygro(+)，然后用CMV-BamHI-F(序列为SEQ ID No.11)、BGH-BglII-R(序列为SEQ ID No.12)作为引物，扩增EPO，该EPO含有CMF启动子和BGH终止子，扩增产物EPO用内切酶BamHI、BglII酶切后，插入质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS的BglII位点，构建重组质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO。分别利用EPO-65TAG-F(序列为SEQ ID No.13)和EPO-65TAG-R(序列为SEQ ID No.14)为一组、EPO-152TAG-F(序列为SEQ ID No.15)和EPO-152TAG-R(序列为SEQ ID No.16)为一组对pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO进行定点诱变，从而引入TAG突变在65和152位得到两个质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO65TAG和pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO152TAG。EPO65TAG的脱氧核糖核酸序列如SEQ ID No.3.EPO152TAG的脱氧核糖核酸序列为SEQ IDNo.4。

(1b)转染宿主细胞和分离提纯重组促红素蛋白

将重组表达载体转染宿主细胞，将稳定转染后的宿主细胞置入含有非天然氨基酸的培养液中培养后，分离提纯获得带有非天然氨基酸残基的重组促红素蛋白。

对于重组表达载体pKetoAmber-EPO65TAG，将pKetoAmber-EPO65TAG和Fugene 6(Roche公司)混合后来转染中华豚鼠细胞，转染后的中华豚鼠细胞在带有25ug/ML湿霉素B的DMEM培养液(美国Invitrogen公司)筛选获得培养获得带有pKetoAmber-EPO65TAG的稳定中华豚鼠细胞。又称稳定细胞稳定细胞在1升带有1mM 4-乙酰苯丙氨酸和25ug/ML湿霉素B的DMEM培养液，37度和5％二氧化碳的环境下培养三天后达到稳定细胞量，细胞旋转沉降后分离，利用超声波破细胞后，细胞上清液经过高效阴离子交换色谱柱分离得到纯化的含有4-乙酰苯丙氨酸残基(第65位)的重组促红素蛋白(EPO(AcF65))。在本实施例中，经检测，纯化后得到的重组促红素蛋白量约为100毫克。

对于重组表达载体pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO65TAG和pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO152TAG，将CHO细胞培养在75cm²的组织培养瓶中达到80-90％克隆率后，利用60μl FuGENE 6将重组表达载体2μg对细胞进行转染。过夜培育后将培养基换为含有1mM 4-乙酰苯丙氨酸的新鲜培养基。细胞在37℃生长1-2天后收集，并用RIPA裂解液溶解细胞。细胞裂解后的上清液用PBS缓冲液进行平衡与透析，然后装入抗-EPO琼脂糖凝胶层析柱。小鼠单克隆抗-EPO抗体(MAIIADiagnostics)被固定于经NHS活化的琼脂糖凝胶(GE healthcare)，根据生产商提供的说明，每克干凝胶固定6.3mg抗-EPO3F6。层析柱(直径7mm)加入0.3mL抗-EPO凝胶达到8mm高度后使用20mM Tris缓冲液pH 7.5、30mM NaCl、0.1％Tween 20、0.02％NaN3进行平衡。为了保护EPO不被蛋白酶降解，所有缓冲液每毫升均加入0.01片绝对不含EDTA的片剂。大约100mL含EPO的细胞裂解物通过层析柱后用2mL平衡缓冲液洗脱。利用加入了1μM胃蛋白酶抑制剂(Roche)的低pH(2.2)溶液2.5mL，将EPO解析。用试管收集洗脱液，并且立即调整其pH至6.5。最后得到EPO(AcF65)和EPO(AcF152)(含有4-乙酰苯丙氨酸残基(第152位)的重组促红素蛋白)。

(2)聚乙二醇的化学修饰

一种方法：

首先将得到的重组促红素放置在5mM的磷酸缓冲液渗析12个小时，渗析后的重组促红素被稀释到0.1mg/mL，然后再向其中加入分子量在10,000～20,000道尔顿之间的羟氨聚乙二醇进行反应(反应式参见图6)，反应约12个小时，高速离心浓缩后，采用SDS胶体电泳分析(如图7所示)，本实施例中聚乙二醇的修饰率达到99％以上，如图4。

其中羟氨聚乙二醇的合成可以采用以下途径：将带有羟基的分子量在10,000～20,000道尔顿之间的聚乙二醇(美国Sigma公司)2克、N-羟基酞酰亚胺160毫克、三苯磷250毫克，溶解在15毫升的二氯甲烷内；逐滴加入偶氮二甲酸二异丙脂(173微升)，边加边搅拌(温度处于20度，搅拌约18小时)；再向其中加入乙醚进行沉降，过滤后得到羟氨聚乙二醇。

另一种方法：

在标准多肽耦合条件下，含活性羟胺基的叔丁氧羰基氨氧基乙酸可与胺端基聚乙二醇(PEG)耦合制得分子量为2万的PEG衍生物。在乙腈中将等量的叔丁氧羰基氨氧基乙酸与1-羟基苯并三氮唑(HOBt)反应30分钟，然后加入等量的胺端基聚乙二醇室温搅拌4小时。粗产物通过乙醚沉淀提纯后在室温下与95％的三氟乙酸水溶液共置搅拌3小时，减压蒸馏除去三氟乙酸，得到的含活性羟胺基的PEG衍生物溶于水配制成10mM溶液。含活性羟胺基的PEG衍生物与得到的重组促红素在50％的乙腈水溶液中室温共置1小时，随后进行干燥冷冻，从而完成与酮标记蛋白的结合过程，如图4所示。反应混合物重新溶于水后用SDS-PAGE分离，如图5和图6所示。

实施例二：聚乙二醇化学修饰在第65位和/或第152位上带有2-氨-8-氧代壬酰残基的重组促红细胞生成素

(1)获得在第65位和/或第152位上带有2-氨-8-氧代壬酰残基的重组促红细胞生成素

参见图3，首先，将双螺旋多聚核苷酸U6-pylT-BamHI-BglII(序列为SEQ ID No.17)(订购自Epoch Biolabs)用内切酶BamHI、BglII酶切后，插入质粒pcDNA3.1/hygro(+)的BglII位点，得到重组质粒pcDNA3.1-pylT，PylT的序列为SEQID No.5；

然后，用KetoKRS-XbaI-F(序列为SEQ ID No.18)，KetoKRS-ApaI-R(序列为SEQ ID No.19)作为引物对2-氨-8-氧代壬酰基-tRNA合成酶(KetoKRS)(序列为SEQID No.6)进行扩增，随后用内切酶XbaI、ApaI酶切；

然后，将用内切酶XbaI、ApaI酶切的产物插入重组质粒pcDNA3.1-pylT，插入位点为XbaI、ApaI，所得质粒pcDNA3.1-pylT-KetoKRS含有U6-pylT和KetoKRS序列；

之后，利用内切酶XbaI、ApaI对EPO-XbaI-ApaI进行酶切，后插入质粒pcDNA3.1/hygro(+)。然后将CMV-BamHI-F、BGH-BglII-R作为引物，扩增EPO，该EPO含有CMF启动子和BGH终止子。将扩增产物EPO用内切酶BamHI、BglII酶切后，插入质粒pcDNA3.1-pylT-KetoKRS的BglII位点，构建重组质粒pcDNA3.1-pylT-KetoKRS-EPO。分别利用EPO-65TAG-F和EPO-65TAG-R为一组、EPO-152TAG-F和EPO-152TAG-R为一组对pcDNA3.1-pylT-KetoKRS-EPO进行定点诱变，从而引入TAG突变在65和152位得到两个质粒pcDNA3.1-pylT-KetoKRS-EPO65TAG和pcDNA3.1-pylT-KetoKRS-EPO152TAG。

重组质粒pcDNA3.1-pylT-KetoKRS-EPO65TAG

和pcDNA3.1-pylT-KetoKRS-EPO152TAG被用来表达含非天然氨基酸的突变EPOs。将CHO细胞培养在75cm²的组织培养瓶中达到80-90％克隆率后，利用60μlFuGENE 6将一种重组质粒2μg对细胞进行转染。过夜培育后将培养基换为含有1mMKetoK的新鲜培养基。细胞在37℃生长1-2天后收集，并用RIPA裂解液溶解细胞。细胞裂解后的上清液用PBS缓冲液进行平衡与透析，然后装入抗-EPO琼脂糖凝胶层析柱。小鼠单克隆抗-EPO抗体(MAIIA Diagnostics)被固定于经NHS活化的琼脂糖凝胶(GE healthcare)，根据生产商提供的说明，每克干凝胶固定6.3mg抗-EPO3F6。层析柱(直径7mm)加入0.3mL抗-EPO凝胶达到8mm高度后使用20mM Tris缓冲液pH7.5、30mM NaCl、0.1％Tween 20、0.02％NaN3进行平衡。为了保护EPO不被蛋白酶降解，所有缓冲液每毫升均加入0.01片绝对不含EDTA的片剂。大约100mL含EPO的细胞裂解物通过层析柱后用2mL平衡缓冲液洗脱。利用加入了1μM胃蛋白酶抑制剂(Roche)的低pH(2.2)溶液2.5mL，将EPO解析。用试管收集洗脱液，并且立即调整其pH至6.5。最后得到EPO(KetoK65)(含有2-氨-8-氧代壬酰残基(第65位)的重组促红素蛋白)和EPO(KetoK152)(含有2-氨-8-氧代壬酰残基(第152位)的重组促红素蛋白)。

(2)聚乙二醇的化学修饰

在标准多肽耦合条件下，含活性羟胺基的叔丁氧羰基氨氧基乙酸可与胺端基聚乙二醇(PEG)耦合制得分子量为2万的PEG衍生物。在乙腈中将等量的叔丁氧羰基氨氧基乙酸与1-羟基苯并三氮唑(HOBt)反应30分钟，然后加入等量的胺端基聚乙二醇室温搅拌4小时。粗产物通过乙醚沉淀提纯后在室温下与95％的三氟乙酸水溶液共置搅拌3小时，减压蒸馏除去三氟乙酸，得到的含活性羟胺基的PEG衍生物溶于水配制成10mM溶液。含活性羟胺基的PEG衍生物与得到的重组促红素在50％的乙腈水溶液中室温共置1小时，随后进行干燥冷冻，从而完成与酮标记蛋白的结合过程，如图4所示。反应混合物重新溶于水后用SDS-PAGE分离，如图7和图8。

实施例三：聚乙二醇化EPO(AcF65)、EPO(AcF152)、EPO(KetoK65)和EPO(KetoK152)的药代动力学研究和血细胞比容测定

使用无DMSO的PBS反应缓冲液(即用SC-PEG-12K在赖氨酸位点修饰天然EPO)，制备了聚乙二醇化EPO(AcF65)、EPO(AcF152)、EPO(KetoK65)和EPO(KetoK152)同浓度样品。这些PEG化EPO化合物被用于与下列物质比较药代动力学特征：天然的、未经修饰的、天然功能的EPO[来自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA]作为基准，因为它是被FDA核准的产品，且由于蛋白的超糖基化而有较长的半衰期。为了检测血液中的蛋白质，用本领域已知的氯胺T法，用¹²⁵I于酪氨酸位点标记五个样品。每一分子有约1-2个¹²⁵I连接。每一样品(80ug)均被标记，使用脱盐柱将其从残余的未结合¹²⁵I中分离，检测蛋白质的活性，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和反相柱验证。评估PEG化样品中的以下亚群：缀合了一个PEG分子的EPO亚群(1PEG-EPO)、或缀合了二个PEG分子的EPO亚群(2PEG-EPO)。1PEG-EPO与2PEG-EPO之比率，在EPO-PEG201中为54∶46；在EPO-PEG202中为45∶55.为了分析四个批次放射标记蛋白的药代动力学特征，将蛋白溶液以2Ci/kg体重的计量皮下注射到雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠被分为5个亚组，每亚组4只动物，以避免每只动物超过3次血液采样。在注射后不同时间点(0、0.5、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72、96和120小时)采集血液样品。用闪烁计数器测定放射标记蛋白在血液样本中的量，对所产生的数据进行统计分析。

药代动力学研究结果显示在图9中，该图比较了天然EPO和经基因修饰得到的EPO在不同时间点测得的血液中含量。横坐标轴记录测量时间点(单位h)，纵坐标轴代表所测样品在血液中的含量值(单位pCi/ml blood)。从图中可以看出，天然EPO注射后立即达到高水平。其在注射约13小时后，血液中含量达到高峰。13小时后，天然EPO血液含量显著减少，并在40小时内基本被清除。实验测得四种经基因修饰得到的EPO随时间变化其在血液中含量变化相似。注射后其血液含量不断上升，并在37小时左右达到峰值，随后虽然其含量缓慢下降，但是仍然在很长时间内保持较高值，整个代谢周期持续120小时以上。此外，经基因修饰得到的EPO在血液中浓度均显著高于天然EPO，如本实验中测得基因修饰所得EPO的峰值是天然EPO峰值的大约1.5倍，另外前者在注射120小时后的残留值也略高于代谢相同时间的天然EPO残留值。

血细胞比容测定结果如图10所示，该图比较了注射天然EPO和经基因修饰得到的EPO后血细胞比容值随时间的变化。横坐标轴记录测量时间点(单位D)，纵坐标轴代表在一定容积内全血中红细胞所占的百分比。从图中可以看出，注射天然EPO大约12天后，全血中红细胞含量达到峰值约51％，随后不断下降；注射后25天，血液中红细胞含量恢复到注射前水平。注射EPO(AcF152)-20K PEG、EPO(KetoK65)-20KPEG和EPO(KetoK152)-20K PEG后，全血中红细胞含量随时间变化基本类似：注射大约12天后，全血中红细胞含量达到峰值约60％，比注射天然EPO后得到的峰值高约8％-9％；随后血液中红细胞含量不断下降，但含量均仍显著高于注射天然EPO后同时间点的红细胞含量；注射后25天，血液中红细胞含量恢复到，或仍略高于，注射前水平。注射EPO(AcF65)-20K PEG后，血液中红细胞含量在2-3天时达到最高值约56％，随后下降，并在第12天时重新升高到大约55％，然后不断下降；注射25天后，血液中红细胞含量恢复到注射前水平。目前还不能很好地解释这一波动。

Claims (7)

1.一种化学修饰的重组促红细胞生成素，其中，第152位的氨基酸残基为4-乙酰苯丙氨酰残基，所述的4-乙酰苯丙氨酰残基是通过在促红细胞生成素基因序列的第152位发生琥珀无义突变后由该琥珀无义突变的位置翻译而成的，在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No.4所述，所述的4-乙酰苯丙氨酰残基上共价连接了聚乙二醇。

2.如权利要求1所述的重组促红细胞生成素，其中，所述的聚乙二醇为羟氨基或联氨基取代的聚乙二醇。

3.制备如权利要求1所述的重组促红细胞生成素的方法，其中，该方法包括

(1)构建含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体，所述编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No.2所述，所述琥珀突变抑制tRNA基因序列如SEQ IDNo.1所述，所述在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因序列如SEQ ID No.4所述；

(2)将所述重组表达载体转染宿主细胞，培养所述宿主细胞并从中分离得到在第152位具有4-乙酰苯丙氨酰残基的重组促红细胞生成素；

(3)采用聚乙二醇对分离得到的所述重组促红细胞生成素上的4-乙酰苯丙氨酰残基进行化学修饰。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述重组表达载体为

重组质粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO_TAG。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述宿主细胞为将含有编码4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突变抑制tRNA基因、在第152位发生琥珀无义突变的促红细胞生成素基因的重组表达载体稳定整合到CHO细胞染色体的CHO细胞。

6.如权利要求1所述的化学修饰的重组促红细胞生成素在制备治疗贫血药物中的应用。

7.一种治疗贫血的药物组合物，其中，该组合物包含权利要求1所述的化学修饰的重组促红细胞生成素和药学上可以接受的载体。

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