CN101965199A - 含硒的改性剂和缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含水溶性聚合物的改性剂，其中所述水溶性聚合物包含至少一种反应活性硒基团，所述反应活性硒基团能够与硫醇基团反应从而形成-Se-S-键。此外，本发明还涉及生产所述改性剂的方法以及所述改性剂在药物活性剂例如G-CSF的改性中的用途。此外，本发明还涉及包含水溶性聚合物和药物活性剂的缀合物，其中所述水溶性聚合物经S-Se键结合于试剂，并且涉及所述缀合物的生产方法及其作为药剂的应用。最后，本发明还涉及包含本发明缀合物的药物组合物。

Description

含硒的改性剂和缀合物
本发明涉及包含水溶性聚合物的改性剂，其中所述水溶性聚合物包含至少一个反应活性的硒基团，所述反应活性的硒基团能够与硫醇反应，优选地与药物活性剂的巯基(thiol)基团反应，从而形成-Se-S-键。此外，本发明还涉及一种生产所述改性剂的方法以及所述改性剂在药物活性剂例如G-CSF的改性中的用途。此外，本发明还涉及包含水溶性聚合物和药物活性剂的缀合物，其中所述水溶性聚合物通过S-Se键连接于所述药物活性剂，并且涉及所述缀合物的生产方法及其作为药剂的用途。最后，本发明还涉及包含本发明缀合物的药物组合物。
在过去的几年中，诸如重组蛋白和肽的药物活性剂的数量急剧增加。然而许多这种蛋白和肽因其体内半衰期短、具有免疫原性、低蛋白水解抗性或低溶解度而不适合用于治疗。为克服这些缺点，使用了不同的解决方法。其中之一是通过使蛋白或肽结合水溶性聚合物尤其是聚乙二醇而对其进行化学改性。这种称为聚乙二醇化的方法已被证明对改善蛋白性质有效。蛋白与PEG链的结合增加了所述蛋白的分子量并延长了体内半衰期。缠绕所述蛋白的PEG链对所述蛋白具有保护作用并因此降低了蛋白水解降解和该缀合物的免疫原性。
PEG在最通常的情况下通过赖氨酸残基的氨基和氨基酸N-末端的氨基与蛋白和肽结合。蛋白表面上赖氨酸的数量通常很多，因此赖氨酸氨基的聚乙二醇化导致形成包含位置异构体和多聚乙二醇化形式的复杂混合物。
半胱氨酸残基——其出现频率通常比赖氨酸残基低——提供了更理想的位点特异性聚乙二醇化的可能性。可使用具有不同反应活性基团的PEG试剂进行自由巯基残基的改性。在本领域中，推荐使用具有巯基或二硫基(disulfide)(受保护的巯基)反应活性基团的PEG试剂。然而，这些PEG试剂与巯基形成二硫键，其可在还原性环境中容易地断裂。目前有两种通过形成具有上述缺点的二硫键而进行蛋白改性的市售PEG试剂。所述试剂基于PEG-硫醇和PEG-邻吡啶二硫化物试剂，描述见US2005/0014903 A1。类似地，在EP 1 586 334中提出了一种对G-CSF的Cys18进行聚乙二醇化的方法。然而，该方法生成含有-S-S-键的缀合物，其包括上述缺点。
因此，本发明的一个目的是提供用于改性包含至少一个巯基基团的药物活性剂——例如包含至少一个自由半胱氨酸基团的多肽——的有利试剂。优选地，所述改性应是可逆的。
具体地，本发明的一个目的是提供用于对包含至少一个巯基基团的药物活性剂进行改性的改性剂，其中所述反应时间应缩短。此外，低过量的改性剂是必需的。此外，应实现位点特异性聚乙二醇化。
本发明的另一目的是提供一种简单可靠的生产包含水溶性聚合物和药物活性剂的缀合物的方法，其中所述水溶性聚合物应通过所述药物活性剂的巯基基团连接。
通常，市售硫醇反应活性PEG试剂只可用于碱性条件下，然而碱性条件下通常会发生不想要的副反应例如形成由二硫键连接的蛋白二聚体和多聚体。因此，本发明的另一目的是提供也可用于酸性条件下的巯基反应活性PEG试剂，尽管其预期的反应速率与在碱性条件下相比要低。通常，含有表面暴露的半胱氨酸残基的蛋白可自发氧化为由二硫键连接的二聚体或多聚体。这一反应在酸性条件下较慢，因此使用本发明改性剂的改性反应可在酸性pH下进行是有利的。
最后，本发明的一个目的是提供含有本发明缀合物的药物组合物。
本发明的目的可出人意料地通过使用含有硒基团的，尤其是与巯基基团反应的硒基团的改性剂实现。
因此，本发明的主题为包含水溶性聚合物的改性剂，其中所述水溶性聚合物包含至少一个反应活性的硒基团，所述反应活性硒基团的能够与巯基基团(-SH)反应，从而形成硒-硫键(Se-S-键)。
所述改性剂包含两个必要特征：
(1)水溶性聚合物；和
(2)反应活性的硒基团。
任选地，所述改性剂还包含
(3)连接基团，其中通常所述连接基团将所述水溶性聚合物和所述反应活性的硒基团连接起来。
关于特征(1)、(2)和(3)的具体描述如下：
水溶性聚合物(1)为在25℃下可溶于水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物有至少约40％(重量)可溶于水，更优选地至少约55％(重量)可溶于水，仍然更优选地约75％(重量)可溶于水，特别优选地约90％(重量)可溶于水。最优选地，所述水溶性聚合物或片段有约95％(重量)可溶于水或完全可溶于水，其中全部溶解性数据都是指在25℃下。
水溶性聚合物(1)可具有不同的几何形状，例如直链型、支链型、二叉型和多臂型。优选具有直链结构的水溶性聚合物。所述水溶性聚合物可包括单官能、同基双官能和异基双官能聚合物。
所述水溶性聚合物(1)例如聚乙二醇，通常具有300-100000道尔顿(Da)、优选1000-60000道尔顿、更优选6000-40000道尔顿、特别优选10000-40000道尔顿的平均分子量。在一个优选实施方案中，所述聚合物具有20000-40000道尔顿的分子量。一种优选的聚合物具有约20000道尔顿的分子量。
合适的水溶性聚合物(1)的实例为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、多元醇(例如聚醚多元醇或聚酯多元醇)、聚环氧烷例如聚乙二醇(PEG)、纤维素、蔗糖、羟烷基淀粉(HAS)和羟乙基淀粉(HES)。
在一个优选实施方案中，所述水溶性聚合物为羟烷基淀粉(HAS)或特别优选羟乙基淀粉(HES)。在本发明的上下文中，术语“羟烷基淀粉”用于指代被羟烷基团取代的淀粉衍生物。在这种情况下，所述烷基基团可被取代。优选地，所述羟烷基含有2-10个碳原子，更优选地含有2-4个碳原子。因此“羟烷基淀粉”优选地包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中优选羟乙基淀粉和羟丙基淀粉。HAS的一个或多个羟烷基团含有至少一个OH-基团。表述“羟烷基淀粉”也包括其中烷基基团被单取代或多取代的衍生物。在这种情况下，所述烷基基团优选地被卤素尤其是氟，或者被芳基取代，只要HAS仍然是水溶性的即可。此外，羟烷基的末端羟基可被酯化或醚化。此外，所述羟烷基淀粉的烷基可为直链型或支链型。此外，也可用直链或支链型取代或未取代烯基代替烷基。
在本发明的上下文中，羟乙基淀粉(HES)是优选的HAS。羟乙基淀粉(HES)是天然支链淀粉(amylopektin)的衍生物，在体内被α-淀粉酶降解。本领域现有技术描述了HES-蛋白缀合物的制备(参见例如DE 26 16 086或DE 26 46 854中的HES-血红蛋白缀合物)。HES是糖类聚合物支链淀粉的取代衍生物，其以最高至95重量％的浓度存在于玉米淀粉中。HES具有有利的生物学性质并用作血液容量置换剂和在临床上用于血液稀释疗法。支链淀粉由葡萄糖基团构成，其中在主链中存在α-l，4-糖苷键并在支链位点上存在α-l，6-糖苷键。这种分子的物理-化学性质主要取决于糖苷键的类型。由于有切口的的α-l，4-糖苷键，形成了每个螺旋具有约6个葡萄糖单体的螺旋结构。
在本发明的上下文中，羟乙基淀粉可具有1-300kDa的平均分子量(重均)，其中更优选5-100kDa的平均分子量。羟乙基淀粉还可具有0.1-0.8的摩尔取代度，并且对于羟乙基，C2∶C6取代之间的比例为2-20。
在一个更优选的实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧烷，尤其是聚乙二醇(以下称为PEG)。本文所用的“PEG”或“聚乙二醇”包含如下两种结构之一：″-(CH2CH2O)n-″或″-(CH2CH2O)n-CH2CH2-″。变量″n″为3-4000，优选为10-3500，更优选为55-2500，仍然更优选80-1500，特别优选150-900。如果PEG为支链型，那么-(CH2CH2O)n-链可被一个或多个支链单元中断。
所述PEG残基可为例如单官能、双官能或多官能的。当PEG为单官能的(其为优选的)时，所述PEG残基包含末端加帽的基团R，即PEG为R-(CH2CH2O)n-。R可为例如氢、羟基或C1-C20-烷氧基。优选地，R为羟基、甲氧基、乙氧基或苄氧基，特别优选甲氧基。
此外，PEG可为直链和支链型。如果PEG为支链型，那么上述直链结构就被支链单元中断。
通常，所述反应活性硒基团(2)为任何在常规条件下容易地反应或以实用速率反应的硒基团。在本发明中，所述反应活性硒基团(2)能够与巯基基团(-SH)反应，从而形成Se-S键。
在一个优选实施方案中，所述反应活性硒基团(2)包含联硒基团(-Se-Se-)、亚硫酸硒基团(-SeSO3 -)、硒醇基团(-SeH)或硒酸酯基团(-Se-)。更优选地，所述反应活性烯基(2)包含联硒基团(-Se-Se-)或亚硫酸硒基团(-SeSO3 -)。
任选地，本发明的改性剂还包含连接基团(3)。本文所用的术语“连接基团”是指任选地用于连接相互连接的基团，优选地用于连接所述水溶性聚合物和所述反应活性硒基团的原子或原子集合。本发明的连接基团优选地为水解稳定的。
通常，所述连接基团包含由1-10个桥接原子、优选2-6个桥接原子形成的桥，其中所述桥接原子任选地可包含侧链，例如烷基或烷氧基残基。
合适的连接基团的实例为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-CH2-、-CO-NH-CH2-、-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-CH2-、-CH2-CH2-CO-NH-、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CO-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-、-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-、-CO-O-CH2-、-CH2-CO-O-CH2-、-CH2-CH2-CO-O-CH2-、-CO-O-CH2-CH2-、-O-CO-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-CO-CH2-、-CO-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CH2-CO-CH2-、-CH2-CH2-CO-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CO-、-NH-CO-CH2-、-CH2-NH-CO-CH2-、-CH2-CH2-NH-CO-CH2-、-NH-CO-CH2-CH2-、-CH2-NH-CO-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2、-CO-NH-CH2-、-CO-NH-CH2-CH2-、-O-CO-NH-CH2-以及两个或多个任意上述基团的结合。
优选地，所述连接基团为-CO-NH-CHR-CH2-，其中R为氢、羧基或C1-C6烷基，特别优选地，R为氢或羧基。
本发明的优选实施方案的主题为具有如式I或II所述结构的改性剂，
Figure BPA00001211682800051
其中在上式中P为水溶性聚合物，L为连接基团。优选地，P和L分别选自如上所述的水溶性聚合物和连接基团。特别地，P为PEG残基且L为-CO-NH-CHR-CH2-，其中R为氢、羧基或C1-C6烷基，具体地R为氢或羧基。
如上所述，所述水溶性聚合物可为双官能或多官能的。因此，本发明的主题还为具有如式Ia或IIa所示结构的改性剂，
其中在上式中P为水溶性聚合物，L为连接基团且n为数字2-10。优选地，P和L分别选自如上所述的水溶性聚合物和连接基团。此外，n优选为2、3或4，特别是2。特别地，P为PEG残基且L为-CO-NH-CHR-CH2-，其中R为氢、羧基或C1-C6烷基，具体地R为氢或羧基。
因此，本发明的一个特别优选的实施方案的主题为具有如式III或IV所示结构的改性剂，
Figure BPA00001211682800062
其中在上式中PEG为聚乙二醇且R为氢、羧基或C1-C6烷基。PEG的上述优选实施方案(例如分子量、末端加帽基团)也适用于式III和IV的PEG。
本发明的另一主题还为一种用于生产上述本发明改性剂的方法。
因此，本发明包含一种用于生产本发明改性剂的方法，包含如下步骤：
(i)提供式V的化合物
Figure BPA00001211682800063
其中A为官能团且L为连接基团，
(ii)使式V的化合物与活化的水溶性聚合物反应，和
(iii)任选地使步骤(ii)的产物发生亚硫酸盐解反应。
步骤(ii)所得到的产物对应式I、Ia和III的化合物。附加反应步骤(iii)所得到的产物对应式II、IIa和IV的化合物。
在本发明方法的步骤(i)中提供了一种式V的化合物。式V的化合物包含一个联硒键、两个连接基团L和两个官能团A。
所述连接基团L是指上述优选实施方案。优选地，所述连接基团为-CHR-CH2-，其中R为氢、羧基或C1-C6烷基，尤其优选R为氢或羧基。
所述官能团A能够与所述活化的水溶性聚合物反应，优选地能够形成稳定的连接。官能团A优选地选自氨基、羟基和羧基。最优选地，所述官能团A为伯氨基团，即A为-NH2。
式V的化合物在步骤(ii)中与“活化的水溶性聚合物”反应。术语活化的水溶性聚合物包含任何如上定义的水溶性聚合物，所述聚合物包含一个或多个可与上面定义的式V的官能团A反应的基团。反应活性基团的实例为N-羟基-琥珀酰亚胺酯、二氯三嗪、三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate)、琥珀酰亚胺碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、碳酸三氯苯酯、N，N′-羰基二咪唑(carbonylimidazole)、异氰酸酯、异硫氰酸酯和醛反应活性基团。
优选地，在步骤(ii)中使用活化的PEG，即带有N-羟基琥珀酸亚胺酯、二氯三嗪、三氟乙基磺酸单甲氧基、琥珀酰亚胺碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、碳酸三氯苯酯、N，N′-羰基二咪唑和醛反应活性基团的PEG试剂。特别地，使用被N-羟基琥珀酰亚胺酯残基激活的聚乙二醇(以下称为PEG-NHS)。
对于优选实施方案，要注意的是：如果式V的官能团″A″为氨基，那么“活化的水溶性聚合物”(优选活化的PEG)包含一个或多个氨基反应活性基团。如果“A”为羧基，那么“活化的水溶性聚合物”包含一个或多个酰肼基团。如果“A”为羟基，那么“活化的水溶性聚合物”包含一个或多个异氰酸酯基团。或者，反过来的方式也是可能的。即，所述活化的水溶性聚合物(优选活化的PEG)带有氨基、羟基或羧基，而“A”为对于所述活化水溶性聚合物合适的上述官能团。
因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，在步骤(i)中提供式VI化合物。
其中在上式中，R为氢或羧基，
并且在步骤(ii)中，式VI的化合物与PEG-NHS反应。式VI的化合物为式V化合物的更具体的实施方案。
特别优选地，使用硒代胱氨酸(R＝COOH)或硒代胱胺(R＝H)作为式VI的化合物。
偶联反应(ii)可在水性或非水性溶液中进行。其中pH为6-10，优选为7.5-8.5。所述反应可在例如10-50℃，优选20-30℃下进行。反应时间可为例如1-20小时。
硒代胱胺容易溶解于水性溶液中，而硒代胱氨酸的慢溶解速率优选地可通过碱性溶液例如1M KOH来加快。然而，对于与PEG-NHS的反应，所述溶液的pH必须降低。当所述偶联反应完成时，可通过超滤或通过有机相萃取从所述混合物中除去剩余的硒代胱氨酸。有机相萃取可分离固体形式的PEG混合物。通常，不需除去未反应的PEG-NHS，因为其会随时间水解为非反应活性形式。双取代的硒代胱氨酸或硒代胱胺的量可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或通过反相色谱(RP-HPLC)定量测定。这两种方法都可使用，因为步骤(ii)的反应产物(以下也称为(PEG-Se)2)的量是所述起始材料(PEG-NHS)的两倍。
下面所示的反应路线说明了包含反应步骤(i)和(ii)的优选实施方案：
Figure BPA00001211682800091
其中R优选地为H或COOH。
在附加反应步骤(iii)中，包含联硒基团的改性剂可反应生成包含亚硫酸硒基团的改性剂。
所述反应(iii)即所谓的亚硫酸盐解反应。为进行所述反应步骤(iii)，可使用亚硫酸盐解试剂。合适的亚硫酸盐解试剂可通过混合Na2SO3和Na2S4O6而制备。所述反应可在水溶液中进行。所述溶液优选地为缓冲溶液。pH可为7-10，优选8-9。所述反应可在例如10-50℃，优选20-30℃下进行。反应时间可为例如1-20小时。
可例如通过SDS-PAGE来监测单体形式(＝PEG-SeSO3 -)的形成。当所述反应完成时，可例如通过超滤除去低分子量试剂。
下面所示的反应示意图说明了包含反应步骤(i)至(iii)的优选实施方案：
Figure BPA00001211682800101
其中R优选地为H或COOH。
所述改性剂的两种形式(二聚体形式，即步骤(ii)的反应产物；以及单体形式，即步骤(iii)的反应产物)都可含有与未反应的活化水溶性聚合物例如PEG-NHS试剂有关的杂质。这些杂质不需除去，因为它们不干扰所述缀合反应，例如含有巯基的活性剂——例如含有巯基的蛋白——的聚乙二醇化反应。
任选地，可使用选自例如离子交换色谱、分子筛色谱或反相色谱的不同色谱技术来除去未反应的活化水溶性聚合物。对于由硒代胱氨酸和单体Se-PEG试剂制备的二聚Se-PEG试剂，由于负电荷的存在，可使用离子交换色谱。由硒代胱胺制备的二聚Se-PEG试剂可通过分子筛色谱或反相色谱而有效纯化。
本发明的改性剂可用于将水溶性聚合物连接于包含巯基基团的药物活性剂，优选地连接于多肽的半胱氨酸残基上。当所述水溶性聚合物为PEG时，所述改性剂可用于聚乙二醇化包含巯基基团的药物活性剂，特别是用于聚乙二醇化多肽的半胱氨酸残基。优选地，本发明的改性剂用于G-CSF的聚乙二醇化，其中具体是G-CSF的Cys18被聚乙二醇化，更具体是被单聚乙二醇化。
因此，本发明的主题还为包含水溶性聚合物和包含巯基基团的药物活性剂的缀合物，其中所述水溶性聚合物通过S-Se键连接于所述药物活性剂。
因此，本发明的另一主题为一种用于制备本发明缀合物的方法，包括如下步骤：
(i)提供含有至少一个自由巯基基团的药物活性剂，和
(ii)将所述药物活性剂与本发明的改性剂反应。
即，包含巯基基团的药物活性剂例如具有自由巯基基团的蛋白、肽或氨基酸可与本发明的改性剂反应。通过此反应经硒硫键(selenylsulfide)形成共价连接，如下面的示意图所示。
A为含有自由半胱氨酸残基的药物活性剂，优选多肽。
当所述水溶性聚合物为双或多官能时可发生类似的反应，见下面的反应示意图。
Figure BPA00001211682800112
A为含有自由半胱氨酸残基的药物活性试剂，优选多肽，n为自然数，优选2-10，更优选2、3或4。
通常，术语“药物活性剂”是指任何能够提供在体内或体外被证明的某种药学效果(优选某种有益效果)的试剂、药物、化合物、组合物或混合物。
药物活性剂的常见实例为肽、多肽、蛋白、抗体和抗体衍生物、多糖、甾族化合物、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂肪、电解质以及它们的混合物。
合适的药物活性剂的具体实例为天门冬酰胺酶、氨多索韦(DAPD)、贝卡普勒明(becaplermin)、双膦酸盐、降钙素、蓝藻抗病毒蛋白、地尼白介素(denileukin)、促红细胞生成素(EPO)、红细胞生成刺激蛋白(NESP)、凝血因子如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子VIII、血管性血友病因子；西利酶(ceredase)、思而赞(cerezyme)、α-葡萄糖苷酶、胶原蛋白、环孢素、α防御素、β防御素、唾液素4(exedin-4)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素(elcatonin)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、纤维蛋白原、卵泡刺激素(FSH)、人生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、生长调节致癌基因β(GRO-β)、GRO-β抗体、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、CD-40配体、肝素、人血清白蛋白、干扰素如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素τ、复合干扰素(consensus interferon)；白细胞介素和白细胞介素受体如白细胞介素1受体、白细胞介素2、白细胞介素2融合蛋白、白细胞介素1受体拮抗剂、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素4受体、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12、白细胞介素13受体、白细胞介素17受体；胰岛素、低分子量肝素(LMWH)、胰岛素原、流感疫苗、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素调理素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、单克隆抗体、纤溶酶原激活剂如阿替普酶(alteplase)、尿激酶、瑞替普酶(reteplase)、链激酶、帕米普酶(pamiteplase)、拉诺普酶(lanoteplase)和替奈普酶(teneteplase)；神经生长因子(NGF)、护骨素、血小板衍生生长因子、组织生长因子、转化生长因子-1、血管内皮生长因子、白血病抑制因子、角质细胞生长因子(KGF)、胶质细胞生长因子(GGF)、T细胞受体、CD分子/抗原、肿瘤坏死因子(TNF)、单核细胞趋化蛋白-1、血管内皮生长因子、甲状旁腺素(PTH)或者它们的混合物。重要的是，上述活性剂包含自由巯基基团或者以某种方式被改性从而包含自由硫巯基基团。“自由巯基基团”是指未通过二硫键与另一巯基基团连接的巯基基团(-SH)。
抗体实例是已知的，例如抗HER2的抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab))、抗VEGF的抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、抗EGF的抗体(例如西妥昔单抗(cetuximab))、抗CD20的抗体(例如利妥昔单抗(rituximab))、抗TNF的抗体(例如英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab))。抗体衍生物的实例也是已知的，包括例如免疫球蛋白Fc融合蛋白(例如依那西普(etanercept))或Fab片段(例如兰尼单抗(ranibizumab))。
优选地，所述药物活性剂为多肽，包含至少一个自由巯基基团，优选属于所述多肽的半胱氨酸残基的自由巯基基团。即，所述巯基基团通常属于天然存在的未成对的半胱氨酸残基，然而它们也可通过化学或遗传学方法引入到所述蛋白结构中。或者，也可通过还原所述蛋白的二硫键(如果此二硫键对所需的蛋白生物学活性不是必需的)得到自由巯基基团。
优选多肽的实例为EPO、IFN-[α]、IFN-[β]、IFN-[γ]、复合IFN、因子VII、因子VIII、因子IX、G-CSF、GM-CSF、hGH、胰岛素、FSH、FTH或它们的混合物。特别优选G-CSF。或者，特别优选EPO。
通常，本发明优选地采用纯化和分离的多肽，所述多肽具有部分或全部一级结构构象(即氨基酸残基的连续序列)以及一种或多种生物学性质(例如免疫学性质和体外生物学活性)和物理性质(例如分子量)。这些多肽的特征还可在于它们是化学合成反应的产物，或者是外源DNA序列的原核或真核宿主(例如培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)表达产物，所述外源DNA序列是通过基因组或cFNA克隆或通过基因合成获得的。代表性酵母(例如酿酒酵母)或原核生物(例如大肠杆菌((E.coli))宿主细胞的产物不与任何哺乳动物蛋白结合。在脊柱动物(例如非人哺乳动物和鸟类)细胞中的微生物表达的产物不与任何人蛋白结合。根据采用的宿主，本发明中所用的多肽可被哺乳动物或其他真核生物的糖类糖基化或者可不被糖基化。本发明的多肽还可包括一个起始甲硫氨酸残基(在-1位上)。
特别地，使用由E.coli生产的重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。优选G-CSF的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中。示于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列优选地不被糖基化并作为非格司亭(Filgrastim)市售。或者，使用通过真核宿主表达而生产的重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这一优选实施方案的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示相同，但不存在Met1。此外，这一优选实施方案的多肽被糖基化并作为来格司亭(Lenograstim)市售。
在另一优选实施方案中，还可使用促红细胞生成素(EPO)及其衍生物。EPO在本领域内广为人知。促红细胞生成素是一种约34kDa的酸性糖蛋白激素。人促红细胞生成素是在天然状态下作为单体存在的166个氨基酸的多肽(Lin et al.，1985，PNAS 82，7580-7584，EP 148 605 B2，EP 41 1678 B2)。
本发明中所用的EPO可来源于任何人或其他哺乳动物，并可通过从诸如人或动物的肾、人或动物的胚胎肝脏——优选猴肾——的天然来源纯化而获得。优选地，所述EPO是以重组方法生产的。这包括在真核或原核细胞，优选哺乳动物、昆虫、酵母、植物、细菌细胞中或在任何其他便于重组生产EPO的细胞类型中的生产。此外，所述EPO可在转基因动物(例如在体液，如乳汁、血液等)中、在转基因鸟类尤其是家禽(优选鸡)的蛋中或者在转基因植物或藻类中表达。
所述EPO可包含一个或多个(优选1-4个，优选4个)通过N-和/或O-连接的糖基化结合于所述EPO的糖侧链，即所述EPO被糖基化。通常，当EPO在真核细胞中生产时，所述多肽被翻译后糖基化。因此，所述糖侧链可在哺乳动物尤其是人、昆虫、植物或酵母细胞中的生物合成过程中就已结合于所述EPO。
多肽的重组生产在本领域中是已知的。通常，这包括用合适表达载体转染宿主细胞、在能够产生所述多肽的条件下培养所述宿主细胞以及从所述宿主细胞纯化多肽。
特别地，所述EPO可具有人EPO的氨基酸序列(参见EP 148 605B2)。此外，表述“促红细胞生成素”或“EPO”还包含EPO变体，其中与人EPO的序列相比，一个或多个氨基酸(例如1-25个，优选1-10个，更优选1-5个，最优选1或2个)被另一氨基酸置换，并且其中所述EPO具有促红细胞生成活性(参见EP 640 619 B1)。
促红细胞生成活性的测量在本领域中有所描述(对于体外活性测量，参见例如Fibi et al.，1991，Blood，77，1203 ff；对于体内EPO活性测量，参见例如Fibi，Hermentin，Pauly，Lauffer，Zettlmeissl.，1995，N-andO-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells，Blood，85(5)，1229-36；(在第1、2和3天将EPO和改性EPO形式制剂到雌性NMRI小鼠中(等量于50ng蛋白/小鼠)，在第四天采集血样并测定网织红细胞))。
通常，多肽的上述实例还可包括其类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体以及可药用盐形式。此外，上述多肽还包括合成、重组、天然、糖基化和非糖基化形式、及其生物活性片段，只要存在至少一个自由巯基基团即可。
术语“生物学活性的”，特别是“生物学活性片段”的含义为本领域技术人员所理解。具体地，如果片段或衍生物保留了其母体分子的生物学活性性质，即使所述活性有所升高或降低，那么该片段或衍生物也被认为是生物学活性的。更具体地，生物学活性的是指如果以合适的剂量给药，那么所述片段或衍生物应为治疗活性的。
因此，本发明优选实施方案的主题为具有式VII结构的缀合物
Figure BPA00001211682800151
其中在上式中，P为水溶性聚合物，L为连接基团，Se为硒原子，Pept为多肽且S为属于所述多肽的半胱氨酸残基的硫原子。对于优选实施方案，P、L和Pept的解释如上。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及具有式VIII结构的缀合物
Figure BPA00001211682800152
其中在上式中，PEG为聚乙二醇；L为连接基团，优选地为-CO-NH-CHR-CH2-残基，其中R为氢、羧基或C1-C6烷基；Se为硒原子；G-CSF为粒细胞集落刺激因子并且S为属于所述粒细胞集落刺激因子的胱氨酸残基的硫原子。在式VIII中，″G-CSF″优选地为在E.coli中生产的重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。优选G-CSF的氨基酸序列示于图8中。或者，可使用称为来格司亭(Lenograstim)的G-CSF。
特别优选地，在式VIII中“S”为G-CSF的Cys18残基的硫原子。因此，G-CSF在Cys18处被单乙二醇化是特别优选的。
本发明缀合物可用作药剂。因此，本发明的另一主题是用作药剂的本发明缀合物。
在一个优选实施方案中，本发明缀合物用于治疗嗜中性白血球减少症。特别地，该治疗用于接受骨髓抑制性抗癌药物的非髓系恶性血液病患者中。
如上面所讨论的，本发明还涉及制备本发明缀合物的方法，包括如下步骤：
(i)提供含有至少一个自由巯基基团的药物活性剂，和
(ii)将所述药物活性剂与本发明的改性剂反应(缀合反应)。
所述缀合反应可在水溶液中进行。所述溶液优选地为被缓冲的。pH为3-10，优选6-9。所述反应可在例如2-50℃，优选20-30℃下进行。通常，所述缀合反应可进行到基本不再有缀合发生，这通常可通过监测反应随时间的进程而确定。所述反应的进程可通过在不同时间点从反应混合物中取出等分试样并通过例如SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱来分析所述反应混合物来监测。反应时间可为例如1-50小时，优选10-25小时。
在本发明的方法中，所有上面关于水溶性聚合物和药物活性剂的优选实施方案的描述都适用。优选地，所述水溶性聚合物为PEG且所述活性剂为G-CSF。
对于自由巯基基团的聚乙二醇化来说，所述巯基基团优选地应充分暴露以使得可与本发明改性剂反应。在G-CSF中，Cys18残基通常只部分暴露于溶剂，不能与所述改性剂充分接触，因此，优选地使G-CSF发生可逆变性(优选地在温和条件下)，然后进行聚乙二醇化反应。所述可逆变性可通过加入多种化合物(例如尿素、GdHCl、DMSO、SDS、NLS、吐温)而实现。聚乙二醇化反应之后，优选地进行复性步骤。复性可通过离子交换和/或稀释而引起。
所述缀合反应通常在改性剂摩尔过量的条件下进行。在一个优选实施方案中，反应活性硒原子与反应活性巯基基团的摩尔比为0.9∶1到10∶1，更优选地为1.0到5∶1，更优选地为1.1∶1到3∶1。
优选地将所得到的缀合产物进行纯化以分离出例如过量试剂、未缀合的反应物、不想要的多缀合物质和/或游离或未反应的聚合物。然后可使用分析方法(例如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳和/或色谱法)进一步表征所得到的缀合物。
最后，本发明的另一主题是一种药物组合物，包含：
(a)本发明的缀合物，
(b)一种或多种可药用的赋形剂。
对于缀合物(a)，所有上面关于优选实施方案的描述都适用。
通常，“可药用的赋形剂”是指可包括在本发明组合物中并且不会对患者导致明显不利的毒理学效应的赋形剂。
合适的赋形剂的实例为糖类、抗微生物剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、抗氧化剂、无机盐以及它们的混合物。
合适的糖类赋形剂的实例为单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖；多糖，例如淀粉；以及糖醇例如甘露醇、山梨糖醇。无机盐或缓冲剂的实例为柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、一价磷酸钠、二价磷酸钠以及它们的结合物。合适的表明活性剂的实例为聚山梨醇酯，例如“吐温20”和“吐温80”，山梨聚糖酯；脂类例如磷脂(例如卵磷脂)、脂肪酸和脂肪酸酯；甾族化合物例如类固醇；以及螯合剂例如EDTA。
本发明的药物组合物包含所有制剂，其中优选适于注射的制剂。所述组合物中的缀合物的量会变动，但当所述组合物以单位剂型(例如小瓶)保存时所述缀合物的量优选为治疗有效剂量。
本发明的药物制剂优选地经注射给药并因此通常为液体溶液或悬液。
本发明将通过以下实施例进行说明。
实施例
A)本发明所用的方法：
SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)
SDS-PAGE用于检测新Se-PEG试剂的形成以及用于评估蛋白与Se-PEG试剂之间的偶联反应。SDS-PAGE使用市售4％-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行。使用了两种检测方法：用于显示PEG的碘染色和用于显示蛋白的Simply Blue(Invitrogen)染色。
阳离子交换色谱(CEC)
CEC用于从聚乙二醇化混合物中分离在Cys18残基处聚乙二醇化的G-CSF。使用装有SP-5PW TSK-Gel(TO-SOHAAS)的8ml柱进行分离。结合缓冲液为pH 3.8的25mM CH3COOH/NaOH。使用35倍柱体积的0-100％的平缓线性梯度的洗脱缓冲液(75mM CH3COOH/NaOH，pH 8.0)分离聚乙二醇化和非聚乙二醇化形式的G-CSF。分离以2.0ml/min的流速进行。根据在非还原条件下进行的SDS-PAGE分析(Simply Blue染色和碘染色)来收集CEC级分。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)。
RP-HPLC用于分析Se-PEG试剂。通过使用Corona plus和Knauer 紫外检测器在Waters BondapakTM Phenyl柱(3.9x150mm，粒径10μm)上进行RP-HPLC。结合洗脱液为40％CH3CN/H2O。使用40-50％的线性梯度的CH3CN/H2O分离所述PEG部分。流速为1ml/min。通过将所述固体PEG混合物溶解在40％的CH3CN/H2O中来制备样品并以10L的注射体积注射。
B)附图说明
图1：Se-PEG试剂的SDS-PAGE分析(碘染色，非还原条件下)。
泳道1：PEG分子量标准(5kDa，12kDa，20kDa，30kDa)
泳道2：起始10kDa mPEG-NHS试剂
泳道3：由硒代胱氨酸和10kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的反应混合物。
泳道4：由硒代胱胺和10kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的反应混合物。
泳道5：由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的反应混合物。
泳道6：由硒代胱氨酸和20kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的反应混合物。
泳道7：由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的PEG-SeSO3试剂的反应混合物。
泳道8：由硒代胱氨酸和20kDa PEG-NHS制备的PEG-SeSO3试剂的反应混合物。
泳道2、3、4、5和6：较高分子量的斑对应于(Se-PEG)2试剂，较低分子量的斑对应于起始PEG-NHS试剂。
泳道7和8：通过对应于(PEG-Se)2的高分子量斑的消失来证实PEG-SeSO3的形成。
图2：在无水DMF中制备的(PEG-Se)2试剂的SDS-PAGE分析(碘染色，非还原条件下)。
泳道1：PEG分子量标准(5kDa，12kDa，20kDa，30kDa)
泳道2：由硒代胱氨酸和10kDa PEG-NHS制备的(Se-PEG)2试剂的反应混合物。
图3：G-CSF和不同Se-PEG试剂的聚乙二醇化混合物的SDS-PAGE分析(Simply Blue染色，非还原条件下)。
泳道1：蛋白分子量标准(2.5kDa，3.5kDa，6kDa，14.4kDa，21.5kDa，31.0kDa，36.5kDa，55.4kDa，66.3kDa，97.4kDa，116.3kDa，200kDa)
泳道2：G-CSF+Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)
泳道3：G-CSF与由硒代胱胺和10kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的聚乙二醇化混合物。
泳道4：G-CSF与由硒代胱氨酸和10kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的聚乙二醇化混合物。
泳道5：G-CSF与由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的聚乙二醇化混合物。
泳道6：G-CSF和由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的PEG-SeSO3试剂的聚乙二醇化混合物。
泳道3和4：较高分子量的斑对应于与10kDa Se-PEG试剂缀合的G-CSF，较低分子量的斑对应于天然G-CSF。
泳道5和6：较高分子量的斑对应于与20kDa Se-PEG试剂缀合的G-CSF，较低分子量的斑对应于天然G-CSF。
图4：用(PEG-Se)2试剂制备的、纯化的G-CSF缀合物的SDS-PAGE分析(Simply Blue染色，还原和非还原条件下)。
泳道1：蛋白分子量标准(2.5kDa，3.5kDa，6kDa，14.4kDa，21.5kDa，31.0kDa，36.5Da，55.4kDa，66.3kDa，97.4kDa，116.3kDa，200kDa)
泳道2：G-CSF+Neulasta；还原条件下
泳道3：带有结合至Cys 18上的10kDa PEG的G-CSF缀合物(用来自硒代胱胺和10kDa PEG-NHS的(PEG-Se)2制备)；还原条件下
泳道4：G-CSF+Neulasta；非还原条件下
泳道5：带有结合至Cys 18上的10kDa PEG的G-CSF缀合物(用来自硒代胱胺和10kDa PEG-NHS的(PEG-Se)2制备)；非还原条件下
在非还原条件下可见单条高分子量的条带，其对应于聚乙二醇化的G-CSF。在还原条件下PEG被从所述蛋白上切开，可见分子量对应于天然G-CSF的单条带。
图5：用(PEG-Se)2或PEG-SeSO3试剂制备的、纯化的G-CSF缀合物的SDS-PAGE分析(Simply Blue染色，还原和非还原条件下)。
泳道1：蛋白分子量标准(15kDa，21kDa，31kDa，50kDa，66kDa，100kDa)
泳道2：G-CSF；非还原条件下
泳道3：Neulasta；非还原条件下
泳道4：带有结合至Cys 18上的20kDa PEG的G-CSF缀合物(用来自硒代胱胺和20kDa PEG-NHS的(PEG-Se)2制备)；非还原条件下
泳道5：带有结合至Cys 18上的20kDa PEG的G-CSF缀合物(用来自硒代胱胺和20kDa PEG-NHS的PEG-SeSO3制备)；非还原条件下
泳道6：G-CSF；还原条件下
泳道7：Neulasta；还原条件下
泳道8：带有结合至Cys 18上的20kDa PEG的G-CSF缀合物(用来自硒代胱胺和20kDa PEG-NHS的(PEG-Se)2制备)；还原条件下
泳道9：带有结合至Cys 18上的20kDa PEG的G-CSF缀合物(用来自硒代胱胺和20kDa PEG-NHS的(PEG-Se)2制备)；还原条件下
在非还原条件下可见单条高分子量的条带，其对应于聚乙二醇化的G-CSF。在还原条件下PEG被从所述蛋白上切开，可见分子量对应于天然G-CSF的单条带。
图6：由硒代胱氨酸和20kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的反应混合物的RP-HPLC色谱(Corona检测器)。
图7：由硒代胱氨酸制备的(PEG-Se)2试剂的反应混合物的RP-HPLC色谱(Knauer紫外检测器，＝215nm)。在tr＝18min时的信号表示聚合物二聚体Se-Se基团的吸收，这显示了以定量产率进行的(PEG-Se)2合成。
图8：在pH 4.0、5.0、6.0、7.0和7.5下的G-CSF和(PEG-Se)2聚乙二醇化混合物的SDS-PAGE分析(Simply Blue染色，非还原条件下)。
泳道1：蛋白分子量标准(2.5kDa，3.5kDa，6kDa，14.4kDa，21.5kDa，31.0kDa，36.5kDa，55.4kDa，66.3kDa，97.4kDa，116.3kDa，200kDa)
泳道2：G-CSF+Neulasta
泳道3：在pH 4.0下的聚乙二醇化混合物
泳道4：在pH 5.0下的聚乙二醇化混合物
泳道5：在pH 6.0下的聚乙二醇化混合物
泳道6：在pH 7.0下的聚乙二醇化混合物
泳道7：在pH 7.5下的聚乙二醇化混合物
高分子量的斑对应于与20kDa Se-PEG试剂缀合的G-CSF，低分子量斑对应于天然G-CSF。G-CSF二聚体的位置以箭头标记。
所述结果显示Se-PEG试剂可在酸性条件下使用并且缀合产率在较高pH下更好。
C)反应进行
实施例1：由硒代胱氨酸和10kDa PEG-NHS制备(PEG-Se)2试剂。
步骤1.硒代胱氨酸的溶解
将8.5mg硒代胱氨酸溶解于101.6l的1M KOH中。通过加入1.017ml的0.2M K2B4O7将pH调节到约9.8。
步骤2.PEG和硒代胱氨酸的偶联反应：
将924mg(0.092mmol)的10kDa PEG-NHS试剂溶解于2mL的pH8.5的0.2M磷酸钠中。向此溶液中加入0.411mL(0.0092mmol)的溶解的硒代胱氨酸(步骤1)。使此反应在室温下进行18小时。
步骤3.低分子量杂质的去除：
使用10MWCO的Amicon Ultra-15进行超滤。将缓冲液置换为pH7.5的0.2M磷酸钠。缓冲液置换后的体积为4mL。
实施例2：在无水DMF中由硒代胱氨酸和10kDa PEG-NHS制备(PEG-Se)2试剂。
步骤1.PEG和硒代胱氨酸的偶联反应：
将3.3mg(0.01mmol)的硒代胱氨酸悬浮于3mL含有69.1mg(0.5mmol)K2CO3的无水DMF中。1小时后，加入200mg(0.02mmol)的10kDa PEG-NHS试剂，然后将所得反应混合物在惰性氩气气氛中下在室温下搅拌5天。向此溶液中加入10mL水，然后将所得混合物再搅拌1天(通过水解使PEG-NHS试剂淬灭)。
步骤2.低分子量杂质的去除：
将所得聚合物混合物进行过滤并用二氯甲烷将所得滤出液洗涤3次。在低压下浓缩合并的有机相，然后通过逐滴加入乙醚沉淀所述聚合物混合物。离心后，将沉淀在室温下高真空干燥12小时。
实施例3：由硒代胱胺和10kDa PEG-NHS制备(PEG-Se)2试剂。
步骤1.硒代胱胺储液的制备：
将6.2mg硒代胱胺溶解于0.31mL的pH 8.5的0.2M磷酸钠中。
步骤2.PEG和硒代胱胺的偶联反应：
将939mg(0.094mmol)的10kDa PEG-NHS试剂溶解于4.26mL的pH 8.5的0.2M磷酸钠中。向此溶液中加入0.15mL(0.0094mmol)溶解的硒代胱胺(步骤1)。使此反应在室温下进行18小时。
步骤3.低分子量杂质的去除：
使用10MWCO的Amicon Ultra-15进行超滤。将缓冲液置换为pH7.5的0.2M磷酸钠。缓冲液置换后的体积为4.775mL。
实施例4：由硒代胱氨酸和20kDa PEG-NHS制备(PEG-Se)2和PEG-SeSO3试剂。
步骤1.硒代胱氨酸的溶解：
将23.3mg硒代胱氨酸溶解于140l的1M KOH中。通过加入0.4ml的0.2M K2B4O7将pH调节到约9.9。
步骤2.PEG和硒代胱氨酸的偶联反应：
将610mg(0.03mmol)的20kDa PEG-NHS试剂溶解于2mL的pH8.5的0.2M磷酸钠中。向此溶液中加入27.5l(0.003mmol)的溶解的硒代胱氨酸(步骤1)。使此反应在室温下进行18小时。
步骤3.低分子量杂质的去除：
使用10MWCO的Amicon Ultra-15进行超滤。将缓冲液置换为pH7.5的0.2M磷酸钠。缓冲液置换后的体积为13.6mL。
步骤4.亚硫酸盐解试剂的制备：
通过将0.315g Na2SO3和0.121g的Na2S4O6溶解于1ml的pH 8.0的1M TRIS/HCl溶液中并用水稀释至25mL而制备亚硫酸盐解试剂。
步骤5.(PEG-Se)2试剂的亚硫酸盐解：
将6.25mL的亚硫酸盐解试剂加入(亚硫酸对联硒基团是100倍摩尔过量的)到10.2mL的(PEG-Se)2试剂(步骤3)中。使此反应在室温下进行18小时。
步骤6.低分子量杂质的去除：
使用10MWCO的Amicon Ultra-15进行超滤。将缓冲液置换为pH7.5的0.2M磷酸钠。缓冲液置换后的体积为8.1mL。
实施例5：由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备(PEG-Se)2和PEG-SeSO3试剂。
步骤1.硒代胱胺储液的制备：
将12.4mg硒代胱胺溶解于0.341mL的pH 8.5的0.2M磷酸钠中。
步骤2.PEG和硒代胱胺的偶联反应：
将583mg(0.03mmol)的20kDa PEG-NHS试剂溶解于1.906mL的pH 8.5的0.2M磷酸钠中。向此溶液中加入27.5l(0.003mmol)的溶解的硒代胱胺(步骤1)。使此反应在室温下进行18小时。
步骤3.低分子量杂质的去除：
使用10MWCO的Amicon Ultra-15进行超滤。将缓冲液置换为pH7.5的0.2M磷酸钠。缓冲液置换后的体积为13.0mL。
步骤4.(PEG-Se)2试剂的亚硫酸盐解：
将6.25mL的亚硫酸盐解试剂(实施例4、步骤4)加入(亚硫酸对联硒基团是100倍摩尔过量的)到9.75mL的(PEG-Se)2试剂(步骤3)中。使此反应在室温下进行18小时。
步骤5.低分子量杂质的去除：
使用10MWCO的Amicon Ultra-15进行超滤。将缓冲液置换为pH7.5的0.2M磷酸钠。缓冲液置换后的体积为9.0mL。
实施例6：由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备(PEG-Se)2。
步骤1.硒代胱胺储液的制备：
将22.2mg硒代胱胺溶解于1.48mL的pH 8.0的1M K2B4O7中。
步骤2.PEG和硒代胱胺的偶联反应：
将321mg(0.016mmol)的20kDa PEG-NHS试剂溶解于1.075mL的pH 8.0的0.1M K2B4O7中。向此溶液中加入0.114(0.0054mmol)的溶解的硒代胱胺(步骤1)。使此反应在室温下避光进行24小时。
步骤3.低分子量杂质的去除和固体(PEG-Se)2的分离：
通过加入草酸将反应混合物的pH调节到3.0并用水稀释到终体积为20mL。然后用二氯甲烷将所述缓冲溶液萃取三次。用Na2SO4干燥合并的有机部分。通过旋转蒸发使所述有机溶液浓缩并通过逐滴加入乙醚来沉淀(PEG-Se)2。离心后，将沉淀在室温下高真空干燥12小时。
实施例7：G-CSF与由硒代胱氨酸和10kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的缀合。
步骤1.G-CSF在Cys 18上的聚乙二醇化：
为了将G-CSF溶液的pH调节到7.5，将3.636ml的pH 8.5的0.2M磷酸钠加入到11.2mL的G-CSF(20mg)总体溶液中。然后加入2.18mL由硒代胱氨酸制备的(PEG-Se)2试剂(实施例1、步骤3)和0.172mL的10％SDS。使此聚乙二醇化反应在室温下避光进行24小时。通过SDS-PAGE分析所述聚乙二醇化混合物。
实施例8：G-CSF与由硒代胱胺和10kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的缀合物的制备。
步骤1.G-CSF在Cys 18上的聚乙二醇化：
为了将G-CSF溶液的pH调节到7.5，将3.246ml的pH 8.5的0.2M磷酸钠加入到10.8mL的G-CSF(19.2mg)总体溶液中。然后加入3.65mL由硒代胱胺制备的10kDa(PEG-Se)2试剂(实施例3、步骤3)和0.2mL的10％SDS。使此聚乙二醇化反应在室温下避光进行26小时。
步骤2.聚乙二醇化的终止：
使用Sephadex G-25柱将所述缓冲液置换为pH 3.8的25mMCH3COOH/NaOH并用相同的缓冲液进行1+1的稀释。然后将所得样品置于4℃下18小时。通过非还原条件下的SDS-PAGE分析所述聚乙二醇化混合物。
步骤3.通过CEC分离在Cys 18上聚乙二醇化的G-CSF：
用63％和71％之间的洗脱缓冲液洗脱含有在Cys 18上聚乙二醇化的G-CSF的级分。通过还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析所收集的级分。
实施例9：G-CSF与由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂的缀合物的制备。
步骤1.G-CSF在Cys 18上的聚乙二醇化：
为了将G-CSF溶液的pH调节到7.5，将0.462ml的pH 8.5的0.2M磷酸钠加入到1.4mL的G-CSF(2.5mg)总体溶液中。然后加入2.6mL由硒代胱胺制备的(PEG-Se)2试剂(实施例5、步骤3)和0.045mL的10％SDS。使此聚乙二醇化反应在室温下避光进行24小时。
步骤2.聚乙二醇化的终止：
使用Sephadex G-25柱将所述缓冲液置换为pH 3.8的25mMCH3COOH/NaOH并用相同的缓冲液进行1+1的稀释。然后将所得样品置于4℃下24小时。
步骤3.通过CEC分离在Cys 18上聚乙二醇化的G-CSF：
用63％和67％之间的洗脱缓冲液洗脱含有在Cys 18上聚乙二醇化的G-CSF的级分。通过还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析所收集的级分。
实施例10：制备G-CSF与由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的PEG-SeSO3试剂的缀合物。
步骤1.G-CSF在Cys 18上的聚乙二醇化：
为了将G-CSF溶液的pH调节到7.5，将2.039ml的pH 8.5的0.2M磷酸钠加入到6.179mL的G-CSF(11mg)总体溶液中。然后加入7.92mL由硒代胱胺制备的20kDa PEG-SeSO3试剂(实施例5、步骤5)和0.163mL的10％SDS。使此聚乙二醇化反应在室温下避光进行24小时。
步骤2.聚乙二醇化的终止：
使用Sephadex G-25柱将所述缓冲液置换为pH 3.8的25mMCH3COOH/NaOH并用相同的缓冲液进行1+1的稀释。然后将所得样品置于4℃下24小时。
步骤3.通过CEC分离在Cys 18上聚乙二醇化的G-CSF：
用59％和67％之间的洗脱缓冲液洗脱含有在Cys 18上聚乙二醇化的G-CSF的级分。通过还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析所收集的级分。
实施例11：G-CSF与由硒代胱胺和20kDa PEG-NHS制备的(PEG-Se)2试剂在不同pH值下的缀合。
步骤1.G-CSF在pH 4.0、5.0、6.0、7.0和7.5的缓冲液中在Cys 18上的聚乙二醇化
通过分别加入0μl、4.1μl、6.6μl、15.3μl和7.2μl的0.2M磷酸钠将G-CSF溶液(140μl/0.25mg的G-CSF)的pH调节到4.0、5.0、6.0、7.0和7.5，然后进行G-CSF与(PEG-Se)2试剂的聚乙二醇化。为在全部样品中得到相同的浓度，加入合适体积的水。在室温和避光并且存在0.1％的SDS条件下，用10倍摩尔过量的20kDa(PEG-Se)2试剂将G-CSF聚乙二醇化24小时。通过SDS-PAGE分析所述聚乙二醇化混合物。
Figure IPA00001211682300021

Claims (17)

1.一种包含水溶性聚合物的改性剂，其中所述水溶性聚合物包含至少一个反应活性硒基团，所述反应活性硒基团能够与硫醇基团反应从而形成-Se-S-键。
2.权利要求1的改性剂，其中所述反应活性硒基团包含联硒基团(-Se-Se-)、亚硫酸硒基团(-SeSO3 -)、硒醇基团或硒酸酯(selenoate)基团。
3.权利要求1或2的改性剂，具有如式I或II所示的结构，
Figure FPA00001211682700011
其中在上式中P为水溶性聚合物，L为连接基团。
4.权利要求1-3任一项的改性剂，具有如式III或IV所示的结构，
Figure FPA00001211682700012
其中在上式中PEG为聚乙二醇且R为氢、羧基或C1-C6烷基。
5.生产权利要求1-4任一项的改性剂的方法，包括如下步骤：
(i)提供式V的化合物
Figure FPA00001211682700013
其中A为官能团且L为连接基团，
(ii)使式V化合物与活化的水溶性聚合物反应，和
(iii)任选地使步骤(ii)的产物发生亚硫酸盐解反应。
6.权利要求5的方法，其中在步骤(i)中提供式VI的化合物
Figure FPA00001211682700021
其中在上式中R为氢、羧基或C1-C6烷基，
并且在步骤(ii)中，式VI的化合物与PEG-NHS反应。
7.权利要求1-4任一项的改性剂用于使水溶性聚合物结合至多肽的半胱氨酸残基上、尤其是用于使多肽的半胱氨酸残基聚乙二醇化的用途。
8.权利要求8的用途，其中G-CSF的Cys l8被聚乙二醇化，尤其是单聚乙二醇化。
9.包含水溶性聚合物和含有硫醇基团的药物活性剂的缀合物，其中所述水溶性聚合物经S-Se键连接于所述药物活性剂。
10.权利要求9的缀合物，具有式VII的结构：
Figure FPA00001211682700022
其中在上式中，P为水溶性聚合物，L为连接基团，Se为硒原子，Pept为多肽且S为属于所述多肽的半胱氨酸残基的硫原子。
11.权利要求9或10的缀合物，具有式VIII的结构：
Figure FPA00001211682700023
其中在上式中，PEG为聚乙二醇；L优选地为-CO-NH-CHR-CH2-残基，其中R为氢、羧基或C1-C6烷基；Se为硒原子；G-CSF为粒细胞集落刺激因子并且S为属于所述粒细胞集落刺激因子的半胱氨酸残基的硫原子。
12.权利要求11的缀合物，其中所述聚乙二醇残基特异地结合在所述G-CSF的Cys18上。
13.权利要求9-12任一项的缀合物作为药剂的用途。
14.权利要求9-12任一项的缀合物用于治疗嗜中性白血球减少症。
15.权利要求14的缀合物，其中所述治疗是在接受骨髓抑制性抗癌药物的非髓系恶性血液病患者中进行的。
16.用于制备权利要求9-12任一项的缀合物的方法，包括如下步骤：
(i)提供含有至少一个自由硫醇基团的药物活性剂，和
(ii)使所述药物活性剂与权利要求1-4任一项的改性剂反应。
17.药物组合物，包括：
(a)权利要求9-12任一项的缀合物，和
(b)一种或多种可药用的赋形剂。
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