CN103619358B - 药物制剂 - Google Patents

药物制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN103619358B
CN103619358B CN201280026567.5A CN201280026567A CN103619358B CN 103619358 B CN103619358 B CN 103619358B CN 201280026567 A CN201280026567 A CN 201280026567A CN 103619358 B CN103619358 B CN 103619358B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hcg
peg
modified
restructuring
sialylated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280026567.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103619358A (zh
Inventor
伊恩·科廷厄姆
丹尼尔·普拉克辛
詹尼·阿哈拉诺夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ferring BV
Original Assignee
Ferring BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ferring BV filed Critical Ferring BV
Publication of CN103619358A publication Critical patent/CN103619358A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103619358B publication Critical patent/CN103619358B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

包括聚(乙二醇)修饰的重组hCG(r hCG)的制剂。

Description

药物制剂
本发明涉及用于治疗不育的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。具体地，本发明涉及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的化学修饰(包括聚乙二醇化)，通过所述化学修饰，可以改变例如hCG的化学和／或生理学性质。
促性腺激素类是一组在男性和女性中调节生殖腺功能的异二聚体糖蛋白激素。它们包括促卵泡激素(FSH)，黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)由垂体前叶腺自然分泌，并且发挥功能以支持卵泡发育和排卵。hCG包含对于其它糖蛋白激素LH和FSH也是常见的92个氨基酸的α亚基，以及赋予该激素特异性的hCG独有的145个氨基酸的β亚基。每个亚基通过添加复杂的糖残基进行翻译后修饰。α亚基包含在氨基酸52和78处的2-N-连接的糖基化位点，β亚基包含在氨基酸13和30处的2-N-连接的糖基化位点和在氨基酸121、127、132和138处的4个O-连接的糖基化位点。
从怀孕妇女的尿液中提取的hCG[Choragen(Ferring)]已经在不育治疗中使用了许多年。从尿液中提取的hCG的产生包括大量尿液的收集和处理。重组形式的hCG，即Ovitrelle(Serono)也是可获得的。这在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。已知的重组hCG产物具有与从人尿中产生的hCG不同的药代动力学模式(pharmacokinetic profile)。
存在与hCG制剂相关的相当大的异质性，其涉及在存在的各种同工型的量上的不同。单独的hCG同工型显示相同的氨基酸序列，但是在它们翻译后修饰的程度上不同；特定的同工型特征为糖分枝结构的异质性以及唾液酸(末端糖)结合量的不同，这两者都显示影响具体的同工型生物活性。
天然hCG的糖基化是高度复杂的。在自然来源的垂体hCG中的聚糖可以包含广泛范围的结构，其可以包括二天线聚糖、三天线聚糖和四天线聚糖的组合。所述聚糖可以具有其它的修饰：核心岩藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙酰基半乳糖胺延伸的链、部分或完全唾液酸化(sialylation)，具有α2,3和α2，6连接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺。此外，在单独的糖基化位点的聚糖结构的分布之间存在差异。
重组hCG(“rhCG”)产品的糖基化反映在宿主细胞系中存在的糖基转移酶范围。现存的rhCG产品Ovitrelle源自改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在CHO来源的rhCG中的聚糖修饰范围比在源自尿液的天然产物中发现的那些更有限。在CHO来源的rhCG中发现的减少的聚糖异质性的例子包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心岩藻糖基化和乙酰基乳糖胺延伸。此外，CHO细胞仅能够使用α2,3连接加入唾液酸(Kagawa等人，1988，Takeuchi等人，1988，Svensson等人，1990)。这不同于天然产生的hCG，其包含具有α2,3和α2,6-连接的唾液酸混合物的聚糖。
已经证实当与垂体、血清或绝经期后尿液FSH比较时，重组FSH制剂(Organon)在具有低于4的等电点(pI)的FSH(考虑酸性同工型)的量上不同(Ulloa-Aguirre等人.1995)。与重组产物Gonal-f(Serono)和Puregon(Organon)比较，在尿制备物中的酸性同工型的量高得多(Andersen等人.2004)。这必定反映在rFSH中更低摩尔含量的唾液酸，因为在FSH中用硫酸盐修饰的带负电荷的聚糖的含量低。与天然FSH比较，更低的唾液酸含量是两种商购FSH产品的特征，并且因此必定反映制备方法中的限制(Bassett和Driebergen，2005)。已经关于来自多种来源的物质记载了FSH的循环寿命。这些物质中的一些已经基于总分子电荷进行分离，总分子电荷如通过它们的pI表征，其中更多的酸等同于更高的负电荷。对于总分子电荷的主要贡献者是每种FSH分子的总唾液酸含量。例如，rFSH(Organon)具有约8mol／mol的唾液酸含量，而尿来源的FSH具有更高的唾液酸含量(de Leeuw等人.1996)。在大鼠中的相应血浆清除率是0.34和0.14ml／min(Ulloa-Aguirre等人.2003)。在另一个实例中，其中将重组FSH样品分为高和低pI级分，高pI(更低唾液酸含量)级分的体内功效减少并且其具有更短的血浆半衰期(D'Antonio等人.1999)。本申请人已经发现，与FSH类似，已知的来源于CHO的重组hCG产物(例如，Ovitrelle)也具有比尿hCG更低量的具有低于4的等电点(pI)的hCG(认为是酸性同工型)，这也反映已知的rhCG产品比尿hCG更低的唾液酸含量。
hCG和rhCG的总唾液酸含量不是直接可比较的，因为唾液酸一般通过两种方式连接。垂体／血清／尿hCG都包括α2,3和α2,6-连接的唾液酸，其中主要为前者。然而，CHO细胞来源的重组体仅包括α2,3(Kagawa等人，1988，Takeuchi等人，1988，Svensson等人，1990)。换言之，使用CHO系统表达的重组蛋白将在其末端唾液酸连接的类型方面不同于其天然对应物。除了后者更低的唾液酸总含量以外，这是在天然产物和目前的重组产物之间存在另一种差异，并且在生产药用的生物制剂中这是一项重要的考虑，因为糖结构部分可能对所述分子的药理学性质有贡献。
因此，合乎需要的是，具有这样的rhCG产品：所述rhCG产品更接近地复制或模拟由人尿生产的产品的生理化学和药代动力学模式。合乎需要的是，具有这样的rhCG产品：其与已知重组产物比较，具有一种或多种改善的药物代谢动力学性质。
申请人已经开发了人来源的重组hCG，其具有比CHO来源的产物Ovitrelle更加酸性的模式，并且其具有更高的唾液酸含量。申请人的研究表明，唾液酸连接的类型，α2,3-或α2,6-，可以具有对hCG的生物清除的巨大影响。与CHO细胞系相反，人细胞系可以表达唾液酸通过α2,3和α2,6连接两者进行连接的重组hCG。
通过改造人细胞系以表达rhCG和α2,3唾液酸转移酶两者来制备具有α2,3和α2,6-连接的唾液酸二者的混合物的重组hCG。表达的产物是高度酸性的并且携带α2,3-和α2,6-连接的唾液酸两者的混合物；后者由内源的唾液酸转移酶活性提供。与在常规CHO细胞中表达的rhCG比较，这具有两个优势：首先，由于这两种唾液酸转移酶的组合活性，所以所述物质是更加高度唾液酸化的；其次，所述物质更接近地类似于天然hCG。与CHO细胞来源的重组产物比较，这可能在生物学上是更加适合的，所述CHO细胞来源的重组产物仅产生α2,3连接的唾液酸并且具有减少的唾液酸含量。这是国际专利申请号PCT／GB2010／001854的主题。申请人令人惊奇地发现，与其它重组产物相比，他们的人来源的重组hCG可以更接近地复制或模拟天然人尿产物的生理化学和药代动力学模式。换言之，本发明的rhCG可以更接近于“天然”hCG。关于给药等，这可能具有明显的优势。此外，更“天然”或更“人化”的产品对于可能需要治疗的患者可能是更理想的，尽管在某种意义上，人工是指尽可能的是“天然的”。
普遍已知的是，用例如水溶性聚合物对治疗性蛋白的化学修饰可能获得这样的结果：改变蛋白的化学和／或生理学性质(例如降低清除率、提高稳定性等，由此延长活性时间)。一类这样的水溶性聚合物是聚(氧化烯)(poly(alkylene oxide))，例如聚(乙二醇)(poly(ethylene glyco1)，PEG)。实际上，已经创造出术语“聚乙二醇化”或“PEG化”来表示至少一个PEG分子对化学实体的修饰(连接)。用于连接某些聚(乙二醇)部分的方法是可得到的，例如Roberts M.J.等人，Adv.Drug Del.Rev.54：459-476,2002；，Harris J.M.等人.，Drug Delivery Sytems40：538-551,2001。已经描述了聚乙二醇化的治疗性蛋白，例如ADAGENX(用于治疗重症联合免疫缺陷疾病的腺苷脱氨酶的聚乙二醇化制剂)和ONCASPAR(用于治疗过敏性ALL患者的聚乙二醇化L-天冬酰胺酶)。但是，聚乙二醇化形式的hCG，特别是可成为商业产品的具有适当性能的那些，迄今不可得到。
根据本发明，提供了一利聚(乙二醇)修饰的hCG。优选地，所述聚(乙二醇)修饰的hCG具有式(Ia)
(R)n-X-Y (Ia)；
其中：(R)是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)；n是1、2、3或4；X是键或接头基团；且Y是hCG或其激动性变体。优选地，n是1且X是共价键，或者n是1、2或4且X是接头基团。优选地，所述接头基团X在一个末端处键合至hCG的N-端。
所述接头基团X是这样的部分：其将hCG(例如其在一个末端处结合至hCG，例如其在一个末端处结合至hCG的N-端)连接至所述(或每个)R基团(例如其也结合至所述R基团或每个R基团，例如其也结合至每个R基团的末端氧或每个R基团)。所述接头基团X可以是在聚乙二醇化领域中已知的任意接头分子。
所述接头基团X可以是，例如，O或-C(=O)-或-(CH2)t-C(=O)-，其中t是0或1-10的整数。
所述接头基团X可以是例如式(Z1CH2)b-(CH2)z-(CHZ2)a-(CH2)u-O-C(=O)-NH-(CH2)t-C(=O)-的基团，其中：-C(=O)-结合至Y；Z1和Z2代表与R基团的键；a和b各自独立地选自0和1，前提条件是，a和b不都是0；t、u和z各自独立地选自0或1-10的整数。
在一些实施例中，a、b和u是1；t是2，且z是0，所以X是Z1CH2-CHZ2-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-，且所述聚(乙二醇)修饰的hCG具有式CH2R-CHR-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-hCG，其中每个R是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。在一个优选实施例中，每个R是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)(参见实施例12A)。
所述接头基团X可以是例如式(Z1CH2)b-(CH2)z-(CHZ2)a-(CH2)u-O-C(=O)-NH-(CH2)t-C(=O)-的基团，其中：-C(=O)-结合至Y；a和b各自独立地选自0和1；t、u和z各自独立地选自0或1-10的整数；且Z1和Z2各自独立地选自(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)c-(CH2)f-O(CH2CH2O)m，其中Z3和Z4代表与R基团的键；c和d各自独立地选自0和1；e和f独立地选自0或1-10的整数，且m是1-20，例如1-10。
在一些实施例中，a和b和u是1，t是2，且z是0；Z1=Z2且均为(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)c-(CH2)f-O(CH2CH2O)m，其中c、d和f是1，e是0，且Z3和Z4代表与R基团的键；所以X是[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-，且所述聚(乙二醇)修饰的hCG具有结构：
(即[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-hCG)，其中每个R是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。在一个优选实施例中，每个R是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。
所述接头基团X可以是例如式-R3-R2-R1-C(=O)-的基团，其中：-C(=O)-结合至Y；R1是键，或者任选地被取代的支链或直链C1-C10烷基，所述烷基结合至R或至少一个R(如果存在超过一个R的话)，且R2和R3各自独立地选自键、H、或任选地被取代的支链或直链C1-C10烷基，所述烷基结合至一个或多个R基团。
hCG可以通过本领域已知的任意方式得到。本文中使用的hCG包括人来源的hCG和重组hCG。人来源的hCG可以通过本领域已知的任意方法从任意适当的来源(例如尿)纯化。所述hCG可以是重组hCG，例如在人细胞系中表达的重组hCG。表达和纯化重组hCG的方法是本领域众所周知的。优选地，所述hCG是重组hCG(“rhCG”或“rechCG”)。优选地，所述hCG是人细胞系来源的重组hCG。
根据本发明，在另一个方面，提供了一种药物制剂，其包含聚(乙二醇)修饰的hCG，优选上面式Ia的聚(乙二醇)修饰的hCG，优选聚(乙二醇)修饰的重组hCG，优选人细胞系来源的重组hCG。优选地，所述hCG是聚(乙二醇)修饰的、人细胞系来源的、重组hCG。
因此，本发明可以提供聚(乙二醇)修饰的重组形式的hCG，其携带α2,3和α2,6唾液酸的混合物。
本发明的组合物优选地从在室温具有水溶性的聚(氧化烯)制备。该组包括α-取代的聚氧化烯衍生物诸如聚乙二醇(PEG)和甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或其它合适的烷基取代的PAO衍生物，诸如含有单个或两个末端C1-C4基团的那些。直链的无抗原性的聚合物诸如单甲基PEG同聚物是优选的。其它合适的聚氧化烯包括其它聚(乙二醇)同聚物、其它烷基-聚(氧化乙烯)嵌段共聚物、以及聚(氧化烯)的嵌段共聚物的共聚物。
所述R或至少一个R是聚(氧化烯)，例如聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)，可以具有约200至约40,000之间的分子量，例如200至约20,000之间的分子量，例如2,000至约10,000之间的分子量，例如约5,000的分子量。
所述聚(乙二醇)可以在氨基酸残基处缀合至(例如重组)hCG。所述聚(乙二醇)可以在(例如重组)hCG的N-氨基末端和／或(例如重组)hCG的C-氨基末端处缀合至(例如重组)hCG。优选地，90％以上的聚(乙二醇)缀合至(例如重组)hCG的N-氨基末端。优选地，95％以上的聚(乙二醇)缀合至(例如重组)hCG的N-氨基末端。预见到，本发明的这种聚(乙二醇)修饰的hCG和／或本发明的制品用于受控的卵巢刺激、IVF技术和排卵诱导的用途，将兼有与现有重组产品相比更天然的卵巢刺激和增强的药代动力学模式。本发明可以进一步提供PEG-hCG和mPEG-hCG缀合物，其具有主要连接在hCG的N-端的一个或两个PEG或mPEG分子(或包括一个、两个以上个PEG或mPEG分子的接头分子)。这会避免或减少与在不同hCG分子上的不同位点处的聚乙二醇化造成的异质产物有关的问题。应当理解，本发明的PEG-hCG和mPEG-hCG缀合物可以具有借助于共价键连接在hCG的N-端处的一个或两个PEG或mPEG分子。如果接头分子连接在N-端处，所述接头分子可以携带一个、两个以上的PEG或mPEG分子。
根据本发明，在另一个方面，提供了一种组合物，其包含式(I)的修饰的hCG：
(R)n-X-Y (I)
其中：
R是水溶性的、基本上无抗原性的聚合物；
n是1、2、3或4；
X是键或接头基团；且
Y是hCG或其激动性变体。
优选地，n是1且X是共价键，或者n是1、2或4且X是接头基团。所述R或至少一个R是直链聚合物，例如聚(氧化烯)，例如聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。优选地，所述接头基团X在一个末端处键合至hCG的N-端。
所述接头基团X是这样的部分：其将hCG(例如其在一个末端处结合至hCG，例如其在一个末端处结合至hCG的N-端)连接至所述(或每个)R基团(例如其也结合至所述R基团或每个R基团，例如其也结合至每个R基团的末端氧或每个R基团)。所述接头基团X可以是在聚乙二醇化领域中已知的任意接头分子。
所述接头基团X可以是，例如，O或-C(=O)-或-(CH2)t-C(=O)-，其中t是0或1-10的整数。
所述接头基团X可以是例如式(Z1CH2)b-(CH2)z-(CHZ2)a-(CH2)u-O-C(=O)-NH-(CH2)t-C(=O)-的基团，其中：-C(=O)-结合至Y；Z1和Z2代表与R基团的键；a和b各自独立地选自0和1，前提条件是，a和b不都是0；t、u和z各自独立地选自0或1-10的整数。
在一些实施例中，a、b和u是1；t是2，且z是0，所以X是Z1CH2-CHZ2-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-，且所述修饰的hCG具有式CH2R-CHR-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-hCG。每个R可以是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。在一个优选实施例中，每个R是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)(参见实施例12A)。
所述接头基团X可以是例如式(Z1CH2)b-(CH2)z-(CHZ2)a-(CH2)u-O-C(=O)-NH-(CH2)t-C(=O)-的基团，其中：-C(＝O)-结合至Y；a和b各自独立地选自0和1；t、u和z各自独立地选自0或1-10的整数；且Z1和Z2各自独立地选自(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)c-(CH2)f-O(CH2CH2O)m，其中Z3和Z4代表与R基团的键；c和d各自独立地选自0和1；e和f独立地选自0或1-10的整数，且m是1-20，例如1-10。
在一些实施例中，a和b和u是1，t是2，且z是0；Z1=Z2且均为(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)c-(CH2)f-O(CH2CH2O)m，其中c、d和f是1，e是0，且Z3和Z4代表与R基团的键；所以X是[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-、，且所述修饰的hCG具有结构：
(即[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-hCG)。每个R可以是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。在一个优选实施例中，每个R是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。
所述接头基团X可以是例如式-R3-R2-R1-C(=O)-的基团，其中：-C(=O)-结合至Y；R1是键或任选地被取代的支链或直链C1-C10烷基，所述烷基结合至R或至少一个R(如果存在超过一个R的话)，且R2和R3各自独立地选自键、H或任选地被取代的支链或直链C1-C10烷基，所述烷基结合至一个或多个R基团。
本发明的组合物优选地从在室温具有水溶性的聚(氧化烯)制备。该组包括α-取代的聚氧化烯衍生物诸如聚乙二醇(PEG)和甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或其它合适的烷基取代的PAO衍生物，诸如含有单个或两个末端C1-C4基团的那些。直链的无抗原性的聚合物诸如单甲基PEG同聚物是优选的。其它合适的聚氧化烯包括其它聚(乙二醇)同聚物、其它烷基-聚(氧化乙烯)嵌段共聚物、以及聚(氧化烯)的嵌段共聚物的共聚物。
所述R或至少一个R是聚(氧化烯)，例如聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)，可以具有约200至约40,000之间的分子量，例如200至约20,000之间的分子量，例如2,000至约10,000之间的分子量，例如约5,000的分子量。
hCG可以通过本领域已知的任意方式得到。本文中使用的hCG包括人来源的hCG和重组hCG。人来源的hCG可以通过本领域已知的任意方法从任意适当的来源(例如尿)纯化。所述hCG可以是重组hCG，例如在人细胞系中表达的重组hCG。表达和纯化重组hCG的方法是本领域众所周知的。优选地，所述hCG是重组hCG(“rhCG”或“rechCG”)。优选地，所述hCG是人细胞系来源的重组hCG。
优选地，所述聚(乙二醇)修饰的重组hCG包括α2，3唾液酸化和α2，6唾液酸化。所述rhCG可以任选地进一步包括α2，8唾液酸化。
在本发明的实施方案中，所述rhCG可以作为单一同工型或作为同工型的混合物存在。
所述rhCG可以具有15mol／mol或更大的唾液酸含量[以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示](实施例8)，例如15mol／mol至25mol／mol，例如17mol／mol至24mol／mol，例如17.7mol／mol至23mol／mol，例如18mol／mol至22mol／mol，例如19mol／mol至21mol／mol，例如19mol／mol至20mol／mol。所述rhCG可以在人细胞系中生产或表达。
所述rhCG的总唾液酸化的10％以上可以是α2,3-唾液酸化。例如，总唾液酸化的20、30、40、45、50、55、60、70、80或90％以上可以是α2,3-唾液酸化。所述rhCG可以以总唾液酸化的45％至80％的量，例如总唾液酸化的50％至70％，例如总唾液酸化的55％至65％的量包括α2,3-唾液酸化。所述rhCG可以以总唾液酸化的65-85％的量，例如总唾液酸化的70-80％，例如总唾液酸化的71-79％的量包括α2,3-唾液酸化。所述rhCG的总唾液酸化的50％以下可以是α2,6-唾液酸化。例如，总唾液酸化的45、40、30、20、10、5％以下可以是α2,6-唾液酸化。所述rhCG可以以总唾液酸化的20-55％的量，例如总唾液酸化的30-50％，例如总唾液酸化的35-45％的量包括α2,6-唾液酸化。所述rhCG可以以总唾液酸化的15-35％的量，例如总唾液酸化的20-30％，例如总唾液酸化的21-29％的量包括α2,6-唾液酸化。所述rhCG的总唾液酸化的5％以下可以是α2,8-唾液酸化。例如，总唾液酸化的2.5％以下可以是α2,8-唾液酸化。所述rhCG可以以总唾液酸化的0-4％，例如总唾液酸化的0.1-4％，例如总唾液酸化的0.5-3％，例如总唾液酸化的0.5-2.5％的量包括α2，8-唾液酸化。所述rhCG可以不具有α2,8-唾液酸化。唾液酸化是指在hCG糖结构上存在的唾液酸残基的量。α2,3-唾液酸化是指在2,3位置处的唾液酸化(如本领域中公知的)，和α2,6唾液酸化是指在2,6位置处的唾液酸化(也在本领域中公知的)。因此，“总唾液酸化的％可以是α2,3唾液酸化”指在2,3位置处被唾液酸化的hCG中存在的唾液酸残基总数的％。术语“总唾液酸化的％是α2,6-唾液酸化”指在2,6位置处被唾液酸化的hCG中存在的唾液酸残基总数的％。
所述rhCG可以具有6质量％以上(例如，6质量％至15质量％，例如，7质量％至13质量％，例如，8质量％至12质量％，例如，11质量％至15质量％，例如，12质量％至14质量％)的唾液酸含量(每个hCG分子唾液酸化的量)(基于蛋白质的质量，而不是蛋白质加上糖的质量)。
在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的重组hCG仅包含α2,3唾液酸化。
所述rhCG可以在人细胞系中生产或表达。其可以简化生产方法(并使其更有效)，因为操作和控制例如细胞生长培养基以维持唾液酸化与已知方法相比可能是较不关键的。所述方法也可以是更有效的，因为与已知rhCG产品的生产比较，有更少量碱性rhCG产生；产生更多的酸性rhCG并且分离／去除碱性hCG是较不成问题的。rhCG可以在Per.C6细胞系、Per.C6来源的细胞系或修饰的Per.C6细胞系中生产或表达。所述细胞系可以使用α2,3-唾液酸转移酶进行修饰。所述rhCG可以包含由[细胞系]的内源唾液酸转移酶活性提供的α2,6-连接的唾液酸(α2，6唾液酸化)。可替换地，或另外地，所述细胞系可以使用α2,6-唾液酸转移酶修饰。
所述rhCG可以使用α2,3-唾液酸转移酶产生。rhCG可以包含由内源唾液酸转移酶活性提供的α2,6-连接的唾液酸(α2,6唾液酸化)。所述rhCG可以使用α2,3-和／或α2,6-唾液酸转移酶产生。
所述rhCG结构包含聚糖结构部分。可以发生分支作用，结果是聚糖可以具有1、2、3、4以上个末端糖残基或“天线”，如本领域中众所周知的。本发明的rhCG可以具有聚糖，其中唾液酸化存在于单天线和／或二天线和／或三天线和／或四天线的结构上。rhCG可以包含单唾液酸化的，二唾液酸化的，三唾液酸化的和四唾液酸化的聚糖结构，例如具有如下的相对量：0.1-4％单唾液酸化；35-45％二唾液酸化；0.5-8％三唾液酸化和0-1％四唾液酸化(例如，如通过带电荷的聚糖的WAX分析所显示，如在实施例8D中所显示)。优选地，本发明的重组hCG包括单(1S)、二(2S)、三(3S)和四(4S)唾液酸化的结构。优选地，唾液酸化的结构的相对量在下述比率内(1S：2S：3S：4S)：0.2-1％：35-40％：2.5-7％：0.5-1％(例如，如通过带电荷的聚糖的WAX分析所显示，如在实施例8D中所显示)。
在本发明的一个实施例中，聚(乙二醇)通过hCG(或其激动性变体)的氨基酸残基结合(例如共价地结合)。优选地，所述聚(乙二醇)结合至hCG的N-端。本领域技术人员已知许多活化的聚(乙二醇)，它们具有许多不同的官能团、接头、构型和分子量。通过本领域已知的方法(参见例如RobertsM.J.等人，Adv.Drug Del.Rev.54：459-476,2002)，HarrisJ.M.等人.，Drug Delivery Sytems40：538-551,2001)，可以将这些用于合成PEG-hCG缀合物或PEG-hCG激动性变体缀合物。
根据本发明，在另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含聚(乙二醇)修饰的重组rhCG，例如包括α2,3-唾液酸化和α2,6-唾液酸化(例如如上所述)的聚(乙二醇)修饰的重组rhCG。所述药物组合物可以进一步包含FSH和／或LH。
可以通过本领域已知的任何方式获得FSH。在本文中使用的FSH包含人来源的和重组FSH。可以通过本领域已知的任何方法从任何适当来源(例如，尿)纯化人来源的FSH。所述FSH可以是重组FSH-例如，在人细胞系中表达的FSH。表达和纯化重组FSH的方法是本领域中众所周知的。
LH可以通过本领域中已知的任何方法获得。LH，如本文所用，包含人来源的和重组LH。可以通过本领域已知的任何方法从任何适当的来源(例如，尿)纯化人来源的LH。表达和纯化重组LH的方法是本领域中已知的。
所述药物组合物可以用于治疗不育，例如，用于在例如辅助生殖技术(ART)，排卵诱导或宫内人工受精(IUI)中。所述药物组合物可以例如用于这样的医学适应证，在所述适应证中使用已知hCG制剂。本发明也提供了本文中描述的聚(乙二醇)修饰的重组rhCG和／或聚(乙二醇)修饰的重组rhCG制剂(根据本发明的各方面)用于或在制备用于治疗不育的药物中的用途。可以将本发明的药物组合物配制为用于任何药物施用途径的众所周知的组合物，所述药物施用途径例如口服、直肠、肠胃外、透皮(例如，贴剂技术)、静脉内、肌内、皮下、脑池内(intrasusternal)、阴道内、腹膜内、局部(粉末、药膏或滴剂)或作为含服剂或鼻喷雾剂。典型的组合物包含药用载体，如水溶液、无毒性赋形剂，包括盐和防腐剂，缓冲剂等，如在雷明顿药物科学第15版(Remington’s Pharmaceutical Sciences fifteenthedition，Matt出版公司，1975)，在1405-1412和1461-87页中，以及在国家药典(nationalformulary)XIV第14版(美国药物协会(American Pharmaceutical Association)，1975)中所述。
适合的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，羧甲基纤维素及其适合的混合物，植物油(如橄榄油)，和可注射的有机酯如油酸乙酯。
本发明的组合物还可以包含添加剂如，但不限于防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以包含抗细菌剂和抗真菌剂以防止微生物的生长，并且包括，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含等张剂如糖、氯化钠等可能是合乎需要的。
在一些情况下，为了实现延长的作用，需要延缓自皮下或肌内注射的hCG(和其它活性成分，如果存在的话)的吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液体混悬液来实现。hCG吸收的速率于是取决于其溶出速率，其又可以取决于晶体大小和结晶形式。可替换地，肠胃外施用的hCG组合形式的延缓吸收通过将所述hCG组合溶解或悬浮在油赋形剂中实现。
可注射贮库形式可以通过在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成聚(乙二醇)修饰的重组rhCG(和其它药剂，如果存在的话)的微胶囊基质来进行制备。取决于hCG与聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性质，可以控制hCG释放的速率。其它可生物降解的聚合物的例子包括聚乙烯吡咯烷酮，聚(原酸酯)，聚(酐)等。可注射的长效制剂也通过将hCG包埋在脂质体或微乳中进行制备，所述脂质体或微乳可与机体组织相容。
可注射制剂可以例如通过经过留住细菌(bacterial-retaining)的滤器进行过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌，所述无菌固体组合物可以溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中，之后立即使用。可以将可注射制剂提供在任何适合的容器中，所述容器例如小瓶、预先填充的注射器、注射药筒等。
可注射制剂可以作为这样的产品供应，所述产品具有包含聚(乙二醇)修饰的重组rhCG的药物组合物(任选地具有FSH、LH等)。如果存在超过一种活性成分(即聚(乙二醇)修饰的重组rhCG，和例如FSH或LH)，这些可以适合于单独或在一起施用。如果单独施用，施用可以是先后的。所述产品可以在任何适合的包装中供应。例如，产品可以包含许多含有hCG，FSH，或FSH和hCG的组合的预先填充的注射器，在泡眼包装或其它装置里包装注射器以保持无菌。产品可以任选地包含使用所述聚(乙二醇)修饰的重组rhCG和FSH制剂的说明书。
根据本领域中的常规实践调整药物组合物各种成分的pH和提取物浓度。见GOODMAN和GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FORTHERAPEUTICES(治疗剂的药理学基础)，第7版。在优选的实施方案中，本发明的组合物作为用于肠胃外施用的组合物供应。制备肠胃外制剂的一般方法是本领域中已知的并且在REMINGTON；THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY(雷明顿：药物科学和实践)，同上文，第780-820页中描述。肠胃外组合物可以以液体制剂或作为固体供应，所述固体与无菌可注射介质混合，之后立即施用。在尤其优选的实施方案中，肠胃外组合物以易于施用和均一剂量的单位剂型供应。
具体实施方式
现在参照下面的实施例和附图更详细地描述本发明，在附图中：
图1显示phCGα／β表达载体的质粒图谱；
图2显示α2,3-唾液酸转移酶(ST3GAL4)表达载体；
图3显示α2，6-唾液酸转移酶(ST6GAL1)表达载体；
图4显示与现有技术的制剂(泳道1，2)相比较，通过用考马斯蓝染色的IEF在人细胞系来源的重组hCG制剂(泳道3，4)中检测rhCG同工型；
图5显示α2，3-唾液酸转移酶改造的Per.C6hCG样品的代谢清除率(MCRs)；
图6显示α2，3-唾液酸转移酶改造的Per.C6rhCG样品的长效MCRs。
图7显示通过实施例12的方法生产的本发明的聚乙二醇化hCG的SEC HPLC分析；和
图8A和8B显示通过实施例12A和12B的方法生产的本发明的聚乙二醇化hCG产物的SEC HPLC分析。
序列选择
人hCG
根据Fiddes和Goodman(1979)使用hCGα多肽的基因编码区。该序列登记为AH007338，并且在构建时，不存在该蛋白序列的其它变体。该序列在本文中称为SEQ ID1。
根据Fiddes和Goodman(1980)使用hCGβ多肽的基因编码区。所述序列登记为NP_000728，并且与CGβ3、CGβ5和CGβ7的蛋白序列相一致。该序列在本文登记为SEQ ID2。
唾液酸转移酶
α2，3-唾液酸转移酶-根据Kitagawa和Paulson(1994)使用β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(α2,3-唾液酸转移酶，ST3GAL4)的基因的编码区。该序列登记为L23767，并且在本文称为SEQ ID3。
α2,6-唾液酸转移酶-根据Grundmann等(1990)使用β-半乳糖酰胺(半乳糖酰胺)α-2,6-唾液酸转移酶1(α2,6-唾液酸转移酶，ST6GAL1)的基因编码区。该序列登记为NM_003032并且在本文称为SEQ ID4。
实施例
实施例1hCG表达载体的构建
分别使用引物组合CGa-fw与CGa-rev和CGb-fw与CGb-rec，通过PCR扩增hCGα多肽(AH007338，SEQ ID1)和hCGβ多肽(NP_000728，SEQ ID 2)的编码序列。
CGa-fw5’-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3’
CGa-rev5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3’
CGb-fw5′-CCAGGCGCGCCACCATGGAGATGTTCCAGGGGCTGC-3’
CGb-rev5’-CCGGGTTAACTTATTGTGGGAGGATCGGGG-3’
将得到的扩增hCGβDNA用限制性酶AscI和HpaI消化，并将其插入在携带新霉素选择标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体的AscI和HpaI位点中。类似地，将hCGαDNA用BamHI和NheI消化，并将其插入到在已经包含hCGβ多肽DNA的表达载体上的位点BamHI和NheI中。
将载体DNA用于转化大肠杆菌(E.coli)的DH5α菌株。挑取菌落用于扩增，并且从包含含有hCGα和β两者的载体的数目中选择20个用于测序。选择用于测序的所有菌落包含正确的按照SEQ ID1和SEQ ID2的序列。选择质粒phCG A+B用于转染(图1)。
实施例2ST3表达载体的构建
使用引物组合2，3STfw和2，3STrev，通过PCR扩增β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶4(ST3，L23767，SEQ ID3)的编码序列。
2，3STfw5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3’
2，3STrev5’-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’
将得到的扩增的ST3DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化，并将其插入在携带潮霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。将所述载体如前述扩增，并且测序。克隆pST3#1(图2)包含正确的根据SEQ ID3的序列，并选择其用于转染。
实施例3ST6表达载体的构建
使用引物组合2，6STfw和2，6STrev，通过PCR扩增β-半乳糖酰胺α-2，6-唾液酸转移酶1(ST6，NM_003032，SEQ ID4)的编码序列。
2，6STfw5’-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3’
2,6STrev5’-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3’
将得到的扩增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化，并将其插入携带潮霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。将所述载体如前述扩增并且测序。克隆pST6#11(图3)包含正确的根据SEQ ID4的序列，并选择其用于转染。
实施例4phCG A+B在PER.C6细胞中的稳定表达。转染分离和克隆的筛选。
通过在单一质粒中表达hCG的两个多肽链产生生产hCG的Per.C6克隆(见实施例1)。
为了获得稳定的克隆，与phCGA+B构建体一起使用基于脂质体的转染试剂。在补充了10％FCS并包含G418的Per.C6选择培养基中选择稳定的克隆。在转染后三周，长出G418抗性克隆。选择共389个克隆用于分离。在选择培养基中培养分离的克隆直到70-80％汇合。使用hCG选择性ELISA测定上清液的hCG蛋白含量，并且使用cAMP积累测定法(CAMPaccumulation assay)，在克隆的细胞系中测定关于hCG受体的药理学活性。表达功能蛋白的克隆(118)进一步培养扩增到24孔、6孔和T80烧瓶中。
在产生足量的物质的T80烧瓶中开始关于确定来自47个克隆的物质的生产率和质量的研究。在如前述的补充培养基中培养细胞7天，并且收集上清液。使用hCG选择性ELISA测定生产率。确定所述物质的等电情况(使用实施例6所述的方法)。将来自IEF的信息用来选择用于代谢清除率分析的克隆。关于唾液酸转移酶改造，选择具有足够生产率和质量的克隆。
实施例5a唾液酸化水平在过量表达α2，3-唾液酸转移酶的细胞中增加。pST3在表达hCG的PER.C6细胞中稳定表达；转染分离和克隆筛选。
通过从在已经表达hCG的两个多肽链的Per.C6细胞(见实施例4)中的各个质粒(见实施例2)表达α2,3唾液酸转移酶来产生生产高度唾液酸化hCG的Per.C6克隆。针对它们的性质，所述性质包括生产率，良好生长情况，功能蛋白的产生，和产生的包含一些唾液酸化的hCG，选择在实施例4中提及的由细胞产生的克隆。
如前在实施例4中所述产生稳定的克隆。分离来自α2,3-唾液酸转移酶程序的克隆，将其扩增并测定。用于α2,3-研究的最终克隆数是5个。α2,3-唾液酸转移酶克隆适合无血清培养基和悬浮条件。
如前，使用hCG选择性ELISA，在hCG受体细胞系中的功能反应，IEF(实施例6)，测定克隆。它们还进行代谢清除率(实施例9)和USP hCG生物测定(实施例10)评估。将结果与商购重组hCG(Ovitrelle，Serono)和亲代hCG Per.C6细胞系进行比较。将代表性样品显示在实施例和附图中。
总之，与仅表达hCG的细胞比较，在Per.C6细胞中hCG与α2,3-唾液酸转移酶一起的表达导致增加水平的唾液酸化的hCG。
实施例5b在表达hCG的PER.C6细胞中稳定表达pST3----一种不同的方法
上述产生的αβ异型二聚体(实施例4)具有导致非常基本的IEF模式的低水平唾液酸化。如上所示(实施例5a)，与仅表达hCG的细胞比较，在Per.C6细胞中hCG与α2,3-唾液酸转移酶一起的表达导致增加水平的唾液酸化的hCG。
双重转染hCGα和β亚基基因与α2,3唾液酸转移酶基因到混悬的细胞培养形式的Per.C6细胞中。通过在无血清条件下共转染hCG载体(双α/β，实施例1)和编码α2,3-唾液酸转移酶的载体(实施例2)而产生细胞系。针对它们的性质，所述性质包括生产率，良好生长情况，功能蛋白的产生，和产生的包含一些唾液酸化的hCG，选择由细胞产生的克隆。分离、扩增和测定克隆。
如前，使用hCG选择性ELISA，在hCG受体细胞系中的功能反应，IEF(实施例6)，测定克隆。它们还进行代谢清除率(实施例9)和USP hCG生物测定(实施例10)评估。将结果与商购重组hCG(Ovitrelle，Serono)和亲代hCG Per.C6细胞系进行比较。将代表性样品显示在实施例和附图中(见实施例6，9，10，附图4和5)。与不与α2,3-唾液酸转移酶表达的hCG和Ovitrelle相比，由所述克隆产生的重组hCG(即，根据本发明的重组hCG)具有显著提高的唾液酸化(即，平均更多的具有大量唾液酸的hCG同工型)(见实施例6和8，附图4)。
实施例6通过等电聚焦分析Per.C6产生的hCG同工型的等电点pI。
电泳定义为带电荷的分子通过电场经过溶剂的转运。生物分子经过电场的移动性将取决于场强、分子上的净电荷、分子的大小和形状、离子强度和分子迁移经过的介质的性质。
等电聚焦(IEF)是基于它们的pI分离蛋白质的电泳技术。pI是这样的pH，在所述pH蛋白质不带净电荷并在电场中不会迁移。hCG同工型的唾液酸含量精细地改变每种同工型的pI点，其可以使用这种技术研究以显现来自每种克隆的Per.C6hCG同工型。
使用等电聚焦分析在细胞培养物上清液中的Per.C6产生的hCG同工型的等电点。如在实施例4、5a和5b中所述产生来自Per.C6hCG克隆的细胞培养基。
在两性电解质溶液pH3.0-7.0中，在pH3.0-7.0梯度的天然条件下，在包含5％聚丙烯酰胺的凝胶上分离Per.C6hCG样品。蛋白使用本领域公知方法用考马斯蓝染色显现。
图4显示，根据本发明的组合物(泳道3，10μg，和泳道4，15μg)和现有技术CHO来源的组合物Ovitrelle(泳道1，Ovitrelle，10μg，和泳道2，Ovitrelle，15μg)，通过考马斯蓝染色的IEF检测rhCG同工型。条带代表包含不同数量唾液酸分子的hCG的同工型。使用这种方法，鉴定产生具有更多数量唾液酸分子的hCG同工型的克隆。图4显示，用α2,3-唾液酸转移酶改造的人细胞系来源的重组hCG具有比Ovitrelle更加酸性的模式。
实施例7Per.C6hCG的唾液酸连接的分析
使用基于凝集素的聚糖区分方法分析复合糖。使用这种方法，可以表征与硝基纤维素结合的糖蛋白和复合糖。凝集素选择性识别特定结构部分，例如α2,3连接的唾液酸。使用的凝集素与类固醇半抗原洋地黄毒苷缀合，这使得能够进行结合的凝集素的免疫学检测。
使用标准SDS-PAGE技术分离来自亲代克隆(没有另外的唾液酸转移酶)和α2,3-唾液酸转移酶改造的克隆的纯化的Per.C6hCG。将商购重组hCG(Ovitrelle，Serono)用作标准物。
根据制造商的说明书，使用DIG聚糖区分试剂盒(目录号11 210 238001，罗氏)分析唾液酸。与黑接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)的阳性反应指示末端连接(2-6)唾液酸。与朝鲜槐(Maackia amurensis)凝集素II(MAA)的阳性反应：指示末端连接(α2-3)的唾液酸。
总之，亲代克隆包含低水平的α2,3-和α2,6-唾液酸两者。用α2,3-唾液酸转移酶改造的克隆包含高水平的α2,3-唾液酸连接和低水平的α2,6-唾液酸连接。标准对照Ovitrelle仅包括α2,3-唾液酸连接。这与关于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的重组蛋白已知的情况是一致的(Kagawa等人，1988，Takeuchi等人，1988，Svensson等人，1990)。
结论为，用α2,3-唾液酸转移酶改造Per.C6hCG细胞成功地增加与样品中重组hCG缀合的唾液酸分子的数量。
实施例8A和8B总唾液酸量化
唾液酸是被认为是单糖的蛋白结合的糖并且与其它单糖如半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺和岩藻糖组合存在。使用基于Stanton等的方法(J.Biochem.Biophys.Methods.(生物化学生物物理学方法杂志)30(1995)，37-48)的方法，测量根据本发明纯化的rhCG上的总唾液酸。
实施例8A
测量用α2,3-唾液酸转移酶修饰的Per.C6重组hCG(例如，实施例5a，实施例5b)的总唾液酸含量，并且发现其大于15mol／mol[以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]，例如大于18mol／mol，例如大于19.1mol／mol。这可以与Ovitrelle相比较，Ovitrelle的总唾液酸含量为17.6mol／mol。
实施例8B
测量用α2,3-唾液酸转移酶080019-19修饰的Per.C6重组hCG(通过上述实施例5b的方法制备)的总唾液酸含量，并且发现其为20mol／mol[以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]。同样地，这可以有利地与Ovitrelle相比较，Ovitrelle的总唾液酸含量为17.6mol／mol。检测该实例(080019-19)来定量α2,3和α2,6唾液酸的相对量(实施例8C)。
实施例8Ca2,3和a2,6唾液酸的相对量的量化
使用已知技术-具有正常相(NP)的HPLC，测量α2,3和α2,6唾液酸在纯化的rhCG[实例(080019-19)，和由实施例5的方法制备的另两个实例]上的相对百分比量。
为了定量在O-连接聚糖中的α2,3和2,6-唾液酸，进行下述分析。将O-连接的聚糖用Orela聚糖释放试剂盒从hCG样品上分解，并在NP-HPLC上分离。将提取、合并的聚糖(如上提取)的样品用不同的唾液酸酶消化以确定连接。使用α2,3，6，8唾液酸酶和α2,3唾液酸酶进行聚糖的酶降解。然后，将酶消化的聚糖在NP柱上重新分离，使用准备的标准，在NP-HPLC上鉴定O-聚糖。计算相对百分数，并且显示在下表中(SA=唾液酸)。
发现对于α2,3唾液酸化的相对百分数在55％至65％范围内(例如59％)；对于α2,6唾液酸化的相对百分数在35-45％范围内(例如41％)。
实施例8D单、二、三和四天线唾液酸化的结构的相对量的量化
使用已知技术，测量从纯化的rhCG(实施例8C中使用的三个样品)提取的聚糖上的单、二、三和四唾液酸化的结构的相对百分比量。
将rhCG的每个样品固定(凝胶块)，洗涤，还原，烷基化并用PNGase F消化过夜。接着，对N-聚糖进行提取和处理。如在Royle等中详述，用荧光团2AB标记用于NP-HPLC和WAX-HPLC分析的N-聚糖。
如在Royle等中所述，进行弱阴离子交换(WAX)HPLC以通过电荷分离N-聚糖(实施例8C)，其中将胎球蛋白N-聚糖标准物用作参照。根据它们包含的唾液酸的数量洗脱聚糖。所有的样品包括单(1S)，二(2S)，三(3S)和四(4S)唾液酸化结构。发现唾液酸化结构的相对量在下列比率(1S：2S：4S：4S)中：0.1-4％：35-45％：0.5-8％：0-1％。
优选的例子080019-19包含单(1S)，二(2S)，三(3S)和四(4S)唾液酸化结构。唾液酸化结构的相对量在下述比率(1S：2S：4S：4S)内：0.1-4％：35-45％：0.5-8％：0-1％。
实施例9确定rhCG的代谢清除率
为了确定用α2,3-唾液酸转移酶改造的Per.C6hCG样品(例如，实施例5a，5b)的代谢清除率(MCR)，将清醒的雌性大鼠(每个克隆3只动物)在0时间点，用rhCG(1-10μg／大鼠，基于样品的ELISA量化，DRG EIA1288)推注到尾静脉中。在测试样品注射后1、2、4、8、12、24和32小时，从尾尖提取血液样品(400μl)。通过离心收集血清，并且通过ELISA(DRGEIA1288)测定hCG含量。使用α2,3-唾液酸转移酶改造的Per.C6hCG样品的MCR显示出与标准相似的半衰期(图5)。图6显示用α2,3-唾液酸转移酶改造的其它hCG样品可能具有比所述标准提高的半衰期(图6)。
实施例10根据USP的hCG生物测定
进行hCG生物测定，以测定hCG特异性活性。按照USP(USP Monographs：ChorionicGonadotropin(USP专著：绒毛膜促性腺激素)，USP Official8／1／09-11／30／09)，使用Ovitrelle作为标准测量所述活性。Ovitrelle具有26,000IU／mg的生物学活性(Curr MedRes Opin(现代医学研究观点)，2005年12月；21(12)：1969-76)。接受的极限是>21,000IUhCG／mg。用α2,3-唾液酸转移酶改造的人细胞系来源的hCG重组hCG样品(具有19.1mol／mol的唾液酸含量-见实施例8)的生物学活性为27,477IU hCG／mg。
实施例11生产和纯化综述
开发了一种在PER.C6细胞中生产重组hCG的方法，其在无血清培养基中混悬培养。在下面描述所述方法并且将其应用于一些生产hCG的PER.C6细胞系。
使用由Lowry等人.(1976)所述的方法的改进，纯化来自α2,3-克隆的重组hCG。
对于PER.C6-hCG的生产，使所述细胞系适应于无血清培养基，即Excell525(JRHBiosciences(JRH生物科学))。首先将所述细胞在T80培养瓶中培养到形成70％至90％汇合单层。传代后，将细胞重新悬浮在无血清培养基，Excell525+4mM L-谷氨酰胺中到0.3x106细胞／ml的细胞密度。将25ml的细胞混悬液置于250ml摇瓶中，并在5％CO2下，在37℃，在100rpm摇动。在达到>1x106细胞／ml的细胞密度后，将细胞继代培养到0.2或0.3x106细胞／ml的细胞密度，并且在摇瓶中，在37℃，5％CO2和100rpm进一步培养。
对于hCG的生产，将细胞转移到无血清生产培养基，即VPRO(JRH Biosciences(JRH生物科学))中，其支持PER.C6细胞的生长到非常高的细胞密度(在批次培养物中通常为>107细胞／ml)。首先，将所述细胞在Excell525中培养到>1x106细胞／ml，接着在1000rpm离心5分钟，并随后悬浮在VPRO培养基+6mM L-谷氨酰胺中到1x106细胞／ml的密度。接着，将细胞在37℃，5％CO2和100rpm，在摇瓶中培养7-10天。在该期间过程中，将所述细胞培养到>107细胞／ml的密度。在细胞生命力开始下降后收获培养基。将所述细胞在1000rpm离心5分钟，并将所述上清液用于hCG的量化和纯化。使用ELISA(DRG EIA1288)确定hCG的浓度。
随后，使用由Lowry等人.(1976)所述方法的改进方法进行hCG的纯化。这通过在DEAE纤维素上的层析法，在Sephadex G100上的凝胶过滤，在羟基磷灰石上的吸附层析法，和制备级聚丙烯酰胺电泳来实现。
在所有的层析方法中，通过RIA(DRG EIA1288)和IEF(实施例6)证实免疫反应性重组hCG的存在。
实施例12聚乙二醇化
在本发明的一个实施例中，聚(乙二醇)通过hCG(或其激动性变体)的氨基酸残基结合(例如共价地结合)。优选地，所述聚(乙二醇)结合至hCG的N-端。本领域技术人员已知许多活化的聚(乙二醇)，它们具有许多不同的官能团、接头、构型和分子量。通过本领域已知的方法(参见例如Roberts M.J.等人，Adv.Drug Del.Rev.54：459-476,2002)，HarrisJ.M.等人.，Drug Delivery Sytems40：538-551,2001)，可以将这些用于合成PEG-hCG缀合物或PEG-hCG激动性变体缀合物。
使用甲氧基-PEG-肼(20kD)，合成了N-端聚乙二醇化的hGG的基本上均匀的制剂。甲氧基-PEG-肼(20kD)是可广泛得到的，并且它们的应用是本领域众所周知的。使用氨基转移反应除去人来源的重组hCG的N-端处的胺基，以在该位置剩下醛。醛基和甲氧基-PEG-肼(20kD)之间的化学反应会导致hCG在N-端处的聚乙二醇化。通过本领域已知的方法，使用单个离子交换色谱法步骤，将聚乙二醇化hCG产物从反应混合物纯化至>95％(SEC分析)。
将1mg／mL的在20mM乙酸铵、150mM NaCl(pH8)中的纯化的rhCG(通过实施例5b的方法内部生产，并根据实施例11的方法纯化)浓缩至3mg／mL，并通过10KD-超速离心装置(Vivaspin20)在4,000rpm、8℃调节至50mM醋酸钠、150mM NaCl pH5.5缓冲液。
氨基转移：将浓缩的hCG在含有2M-乙酸钠、0.4M乙酸、0.1M乙醛酸钠和5mM CuSO4的溶液(ph5.5)中在室温温育4小时。然后通过加入EDTA至20mM的终浓度，停止反应。使用10KD-超速离心装置除去不希望的氨基转移-组分，并将缓冲液更换为50mM磷酸钠、150mMNaCL(pH7.5)。
聚乙二醇化：通过将低压冻干的粉末(NOF)溶解在1mM HCl中，制备10mM的m-PEG-肼储备溶液。通过将低压冻干的粉末(Fluka)溶解在水中，制备200mM的氰基硼氢化钠储备溶液。
在搅拌下，将11倍摩尔量的m-PEG-肼(得自10mM储备溶液)加入装有氨基转移的-rhCG(3mg／mL)的瓶中。此后立即从储备溶液加入75倍摩尔的氰基硼氢化钠作为还原剂。将反应混合物在室温搅拌24小时，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)HPLC柱Superdex-75(GEhealthcare)监测PEG(聚乙二醇化)对hCG的修饰程度。24小时后，停止反应，并用400mM甘氨酸、50mM磷酸钠、150mM NaCl pH6.7缓冲液1：1稀释至1mg／mL，并用1M HCl进行最终的pH调节。将反应混合物进行0.2μm过滤，分成等分试样，并在4℃储存。SEC HPLC分析显示在图7中。
从HPLC分析(图7)可以看出，所述方法提供了聚乙二醇化hCG。约16％的hCG分子被聚乙二醇化。据信，该反应的相对较低的收率是因为约80％至90％的人源化蛋白具有在它们的N-端上的乙酰基-残基，这意味着，hCG氨基转移步骤的收率相对较低。
实施例12A使用2-分支的m-PEG-醛(20Kd)的聚乙二醇化：
在pH5.5，m-PEG-醛的官能团主要与N-端相互作用。用线性m-PEG-醛进行实验，得到聚乙二醇化的-hCG，其具有约6-7个PEG-链，而不是预期的2-链。这暗示，m-PEG-醛会与其它氨基酸诸如组氨酸(hCG具有4个组氨酸残基)相互作用。
本发明的发明人发现，2-分支的m-PEG-醛的应用会减少或阻止不希望的聚乙二醇化(位阻会抑制向N-端以外的位点的接近)，并增加仅N-端聚乙二醇化的产物的收率。进行的操作显示在路线图1中，且如下所述。
路线图1：具有2臂分支的mPEG醛的hCG聚乙二醇化：
[在本文中的路线图1、2和3中，CH3-(CH2CH2O)n是表示mPEG的普通命名法。在路线图1、2和3中的整数n和m不具有与在本发明的权利要求中的那些整数相同的含义]。
将1mg/mL的在20mM乙酸铵、150mM NaCL(pH8)中的纯化的rhCG(通过实施例5b的方法内部生产，并根据实施例11的方法纯化)浓缩至3mg/mL，并通过10KD-超速离心装置(Vivaspin20)在4,000rpm、8℃调节至50mM乙酸铵、150mM NaCL(pH5.5)缓冲液。
通过将低压冻干的粉末(NOF)溶解在1mM HCL中，制备10mM的2-分支的m-PEG-醛(40KD)储备溶液。通过将低压冻干的粉末(Fluka)溶解在水中，制备200mM的氰基硼氢化钠储备溶液。
将10倍摩尔量的2-分支的m-PEG-醛(得自10mM储备溶液)加入装有rhCG(3mg／mL)的瓶中，并搅拌。此后立即从储备溶液加入75倍摩尔量的氰基硼氢化钠作为还原剂。将反应混合物室温搅拌24小时，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)HPLC柱Superdex-200(GEhealthcare)监测PEG(聚乙二醇化)对hCG的修饰程度。24小时后，停止反应，并用400mM甘氨酸、50mM磷酸钠、150mM NaCl(pH6.7缓冲液)1：1稀释至1mg／mL。用1M HCl进行最终的pH调节。将反应混合物进行0.2μm过滤，分成等分试样，并在4℃储存。
SEC(Superdex-20010／300mm GL)HPLC分析显示在图8A中。如图8-A所示，观察到2个聚乙二醇化的-hCG群体。第一个洗脱峰(编号1)是较高分子量的PEG-链，第二个洗脱峰(编号2)是较低分子量的PEG-链。94％的hCG分子被聚乙二醇化，这表示与实施例12相比显著的收率增加。在使用的SEC-条件下，不可能确定每个群体中的PEG-链数目，因为剩余的游离2-分支的m-PEG-醛在与聚乙二醇化的-hCG相同的RT(保留时间)洗脱。在生物测定中针对它的活性试验了产物分支的-聚乙二醇化hCG(实施例13)。
应当理解，较高分支的m-PEG试剂(例如4-分支的m-PEG-醛，诸如下述的)的应用更可能产生具有较低PEG-链的单一PEG-hCG群体(图1-B上的峰编号2)，因为4分支的m-PEG-醛会进一步抑制向N-端以外的其它位点的接近。
通过与上面的路线图1所示的方法类似的方法制备4-臂分支的mPEG醛的合适路线图显示在路线图2中。
路线图2：使用4臂分支的mPEG醛的hCG聚乙二醇化：
实施例12B
使用实施例12A的方法，用线性m-PEG-醛(10KD)修饰rhCG(通过实施例5b的方法内部生产和根据实施例11的方法纯化)。进行的操作显示在路线图3中，且如下所述。
路线图3：使用线性mPEG醛的hCG聚乙二醇化：
产物线性-聚乙二醇化hCG的SEC-HPLC分析显示在图8-B中。也在生物测定中针对它的活性试验了该线性-聚乙二醇化hCG(实施例13)。
实施例13-活化的-PEG hCG生物测定
通过实施例5b的方法生产重组hCG，并根据实施例11的方法纯化。将21只大鼠分成3组(7只大鼠／组)，并在分开的3天给每只大鼠注射3次(每次注射在不同天)下述剂量之一的重组hCG(1组=1种剂量)：4.3ng(组A中的大鼠)，8.6ng(组B中的大鼠)；和17.1ng(组C中的大鼠)。5天后，处死大鼠，并根据已知的和常规的生物测定，将子宫称重进行效能确定。
5天后，已经注射了3个日剂量共计4.3ng重组hCG的大鼠具有30-40mg的平均子宫重量。5天后，已经注射了3个日剂量共计8.6ng rhCG的大鼠具有60-70mg的平均子宫重量。5天后，已经注射了3个日剂量共计17.1ng rhCG的大鼠具有110-120mg的平均子宫重量(参见下表)。
发明人试验了本发明的产品的提供长效制剂的潜力，所述长效制剂允许每周单次给药。
本发明的发明人使用相同的生物测定来测量如下处理的大鼠在5天后的子宫重量：
(i)单次注射通过实施例5b的方法内部生产和根据实施例11的方法纯化的重组hCG，其施用浓度是3个每日注射剂量的最高浓度的10倍，即在10倍浓度(170ng)；
(ii)单次注射通过实施例12A的方法生产的本发明的分支的-聚乙二醇化的重组hCG，其施用浓度是3个每日注射剂量的最高浓度的10倍，即在10倍浓度(170ng)；和
(iii)单次注射通过实施例12的方法生产的本发明的线性-聚乙二醇化的重组hCG，其施用浓度是3个每日注射剂量的最高浓度的10倍，即在10倍浓度(170ng)；
结果显示在下表中。
可以看出，分支的PEG-rhCG生物测定实施例(表的第5列)证实，本发明的分支的聚乙二醇化的rhCG的单次注射会提供134.11的平均子宫重量(mg)，大致等同于17.1ng rhCG的最高剂量的3次单独注射。这强烈地指示，使用本发明的聚乙二醇化hCG，可以得到“1-周持续释放”制剂。这种提供重组hCG的1周制剂的能力，代表了胜过已知的hCG制剂的一个显著优点。
rhCG=重组hCG
参考文献
Andersen CY，Westergaard LG，和van Wely M.(2004).FSH isoformcomposition of commercial gonadotrophin preparations：a neglected aspect?(商购促性腺激素制剂的FSH同工型组合物：被忽视的方面?)Reprod Biomed Online(生殖医学在线).9(2)，231-236.
Bassett RM，和Driebergen R.(2005).Continued improvements in thequality and consistency of follitropin alfa，recombinant human FSH(促滤泡素重组人FSH的质量和一致性的继续改进).Reprod Biomed Online(生殖医学在线).10(2).169-177.
D′Antonio M.，Borrelli F.，Datola A.，Bucci R.，Mascia M.，Polletta P.，Piscitelli D.，和Papoian R.(1999)Biological characterization of recombinanthuman follicle stimulating hormone isoforms(重组人卵泡刺激激素同工型的生物学表征).Human Reproduction(人生殖)14，1160-1167
Fiddes，J.C.和Goodman，H.M.(1979)Isolation，cloning and sequenceanalysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin(人绒毛膜促性腺激素的α亚基的cDNA分离、克隆和序列分析).Nature(自然)，281，351-356.
Fiddes，J.C.和Goodman，H.M.(1980)The cDNA for the beta-subunit of humanchorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough intothe3′-untranslated region(人绒毛膜促性腺激素的β亚基的cDNA提示通过通读3’-非翻译区的基因进化).Nature(自然)，286，684-387.
Kagawa Y，Takasaki S，Utsumi J，Hosoi K，Shimizu H，Kochibe N，和Kobata A.(1988).Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of naturalhuman interferon-beta1and recombinant human interferon-beta1produced by threedifferent mammalian cells(天然人干扰素β1和由三种不同的哺乳动物细胞产生的重组人干扰素β1的天冬酰胺-连接的糖链的比较研究).J Biol Chem.(生物化学杂志)263(33)，17508-17515.
Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，Randall RJ.(1951)Protein measurementwith the Folin phenol reagent(使用Folin酚试剂的蛋白质测量).J Biol Chem.(生物化学杂志)193(1)，265-75.
Lowry,PJ，McLean，C，Jones RL和Satgunasingam N.(1976)Purification ofanterior pituitary and hypothalamic hormones(前叶垂体和下丘脑激素的纯化)ClinPathol Suppl(临床病理学增刊)(Assoc Clin Pathol).7，16-21.
Royle L，Radcliffe CM，Dwek RA和Rudd PM(2006)Methods in MolecularBiology(分子生物学方法)，ed I Brockhausen-Schutzbach(Humana Press)，347：Glycobiology protocols(糖生物学方法)，125-144.
Steelman SL，和Pohley FM.(1953)Assay of the follicle stimulatinghormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin(基于用人绒毛膜促性腺激素的卵泡刺激激素的测定).Endocrinology(内分泌学).53(6)，604-616.
Svensson EC，Soreghan B，和Paulson JC.(1990)Organization of the beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase gene.Evidence for the transcriptionalregulation of terminal glycosylation(β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶基因的组织。末端糖基化的转录调控的证据).J Biol Chem.(生物化学杂志)265(34)：20863-20868.
Takeuchi M，Takasaki S，Miyazaki H，Kato T，Hoshi S，Kochibe N，和Kobata A(1988).Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of humanerythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinantChinese hamster ovary cells(由尿液和重组中国仓鼠卵巢细胞的培养基纯化的人红细胞生成素的天冬酰胺-连接的糖链的比较研究).JBiol Chem.(生物化学杂志)263(8)，3657-3663.
Ulloa-Aguirre A，Midgley AR Jr，Beitins IZ，和Padmanabhan V.(1995).Follicle-stimulating isohormones：characterization and physiologicalrelevance.(卵泡刺激同工激素：表征和生理学相关性)Endocr Rev.(内分泌综述)16(6)，765-787.
Ulloa-Aguirre A，Timossi C，Barrios-de-Tomasi J，Maldonado A，和Nayudu P.(2003).Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone：studies derived from in vitro and in vivo models(糖异质性在促卵泡激素功能中的影响：来源于体外和体内模型的研究).Biol Reprod.(生物学生殖)69(2)，379-389。

Claims (15)

1.聚(乙二醇)修饰的hCG，其具有式(Ia)
(R)n-X-Y (Ia)
其中：
(R)是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)；
n是1、2或4；
X是键或接头基团；且
Y是hCG，
其中n是1且X是共价键或接头基团，或者其中n是2或4且X是接头基团。
2.根据权利要求1所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是重组hCG。
3.根据权利要求1所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是人细胞系来源的重组hCG。
4.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是包括α2,3-和α2,6-唾液酸化的重组hCG。
5.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是具有以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示的15mol/mol或更大的唾液酸含量的重组hCG。
6.根据权利要求5所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是具有15mol/mol至25mol/mol的唾液酸含量的重组hCG。
7.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是总唾液酸化的10％以上为α2,3-唾液酸化和/或总唾液酸化的50％以下为α2,6-唾液酸化的重组hCG。
8.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是总唾液酸化的45％至80％为α2,3-唾液酸化的重组hCG。
9.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是总唾液酸化的20％至55％为α2,6-唾液酸化的重组hCG。
10.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)缀合至hCG的氨基酸残基。
11.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)缀合至hCG的N-氨基末端或C-氨基末端。
12.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中90％以上的聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)缀合至hCG的N-氨基末端。
13.药物制剂，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG。
14.药物组合物，其包含根据权利要求1-12所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求13所述的药物制剂，且任选地进一步包含FSH和/或LH。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求13所述的药物制剂在制备用于治疗不育的药物中的用途。
CN201280026567.5A 2011-03-31 2012-03-29 药物制剂 Active CN103619358B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11160736.2 2011-03-31
EP11160736 2011-03-31
EP12151389 2012-01-17
EP12151389.9 2012-01-17
PCT/GB2012/000291 WO2012131306A1 (en) 2011-03-31 2012-03-29 Pharmaceutical preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103619358A CN103619358A (zh) 2014-03-05
CN103619358B true CN103619358B (zh) 2017-02-15

Family

ID=46051700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280026567.5A Active CN103619358B (zh) 2011-03-31 2012-03-29 药物制剂

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9757469B2 (zh)
EP (1) EP2691119B1 (zh)
JP (2) JP6087338B2 (zh)
CN (1) CN103619358B (zh)
CA (2) CA3163525A1 (zh)
ES (1) ES2693273T3 (zh)
PL (1) PL2691119T3 (zh)
WO (1) WO2012131306A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI488640B (zh) 2008-04-16 2015-06-21 Ferring Int Ct Sa 藥學製劑
TWI532495B (zh) * 2009-10-05 2016-05-11 菲瑞茵國際中心股份有限公司 藥學製劑
EP2691119B1 (en) * 2011-03-31 2018-08-01 Ferring B.V. Pharmaceutical preparation
BR102016006222A2 (pt) * 2016-03-22 2017-09-26 Universidade De São Paulo - Usp Process of production and purification of recombinant hydrogen hydrogen hybrid or non-hybrid, recombinant hydrogen hydrogen hybrids or non-hybrid, vectors of expression, and uses of recombinant glicoprotetic hormones

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4421896A (en) 1979-11-13 1983-12-20 The Dow Chemical Company Method of coupling a protein to a polymer particle containing hydrazide groups in a polymer latex and the products formed therefrom
DK49987A (da) 1987-01-30 1988-07-31 Nordisk Gentofte Fremgangsmaade til behandling af infertilitet og middel til anvendelse ved fremgangsmaaden
IT1206302B (it) 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario
IL122732A0 (en) 1997-01-15 1998-08-16 Akzo Nobel Nv Liquid gonadotropin-containing formulation its preparation and a device containing same
DK1775346T3 (da) 1997-06-25 2009-09-28 Merck Serono Sa Disulfid-tværbundne glycoproteinhormonanaloger, deres fremstilling og anvendelse
US6500627B1 (en) 1998-02-03 2002-12-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by HCG assay
EA006605B1 (ru) 2000-02-22 2006-02-24 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ
AR036592A1 (es) 2001-09-12 2004-09-22 Applied Research Systems Uso de gch en la hiperestimulacion ovarica controlada
CN1608078B (zh) 2001-10-22 2012-07-25 默克雪兰诺有限公司 用于卵泡生成的促性腺激素
DK1440157T3 (da) 2001-10-29 2012-05-07 Crucell Holland Bv Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
US20040248784A1 (en) 2003-06-03 2004-12-09 Marco Filicori Unitary combinations of FSH and hCG
CA2554968C (en) 2004-02-04 2012-03-27 Centre National De La Recherche Scientifique Process for screening glycoform-specific antibodies
US8609370B2 (en) 2004-02-13 2013-12-17 Glycotope Gmbh Highly active glycoproteins-process conditions and an efficient method for their production
EP2049144B8 (en) * 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
LT2068907T (lt) 2006-10-04 2018-01-10 Novo Nordisk A/S Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai
CA2711503A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
TWI488640B (zh) 2008-04-16 2015-06-21 Ferring Int Ct Sa 藥學製劑
TWI532495B (zh) 2009-10-05 2016-05-11 菲瑞茵國際中心股份有限公司 藥學製劑
EP2691119B1 (en) * 2011-03-31 2018-08-01 Ferring B.V. Pharmaceutical preparation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012131306A1 (en) 2012-10-04
JP2014510745A (ja) 2014-05-01
JP6087338B2 (ja) 2017-03-01
WO2012131306A8 (en) 2013-10-24
EP2691119B1 (en) 2018-08-01
JP2017101030A (ja) 2017-06-08
EP2691119A1 (en) 2014-02-05
CN103619358A (zh) 2014-03-05
CA3163525A1 (en) 2012-10-04
CA2831486A1 (en) 2012-10-04
ES2693273T3 (es) 2018-12-10
US9757469B2 (en) 2017-09-12
PL2691119T3 (pl) 2019-01-31
US20140088010A1 (en) 2014-03-27
JP6336557B2 (ja) 2018-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6580104B2 (ja) 医薬製剤
CN105906703A (zh) 包括α 2,3-和α 2,6-唾液酸化的重组FSH
JP6336557B2 (ja) 医薬製剤
CN102549011B (zh) 包含重组hcg的药物制剂
Class et al. Patent application title: Pharmaceutical Preparation Comprising Recombinant HcG Inventors: Ian Cottingham (St. Prex, CH) Daniel Plaksin (St. Prex, CH) Richard Boyd White (San Diego, CA, US) Assignees: Ferring BV

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant