EA006605B1 - СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ - Google Patents
СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ Download PDFInfo
- Publication number
- EA006605B1 EA006605B1 EA200200892A EA200200892A EA006605B1 EA 006605 B1 EA006605 B1 EA 006605B1 EA 200200892 A EA200200892 A EA 200200892A EA 200200892 A EA200200892 A EA 200200892A EA 006605 B1 EA006605 B1 EA 006605B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- hcg
- column
- eluting
- sample
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 21
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 15
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 abstract description 37
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 abstract description 37
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 abstract description 30
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 9
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 3
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 3
- 240000007673 Origanum vulgare Species 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 2-[4-[(z)-2-chloro-1,2-diphenylethenyl]phenoxy]-n,n-diethylethanamine;hydron;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C1=CC(OCCN(CC)CC)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(/Cl)C1=CC=CC=C1 PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical group [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005670 Anovulation Diseases 0.000 description 1
- 206010002659 Anovulatory cycle Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010011498 Cryptorchism Diseases 0.000 description 1
- 206010012205 Delayed puberty Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 231100000552 anovulation Toxicity 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008364 bulk solution Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 229940046989 clomiphene citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 201000000160 cryptorchidism Diseases 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
Способ очистки рекомбинантного человеческого хорионического гонадотропина (чХГ) из образца неочищенного рекомбинантного чХГ в супернатанте клеток СНО предусматривает комбинированное использование ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Ионообменную хроматографию осуществляют дважды, а последующее использование вытеснительной хроматографии на колонке позволяет удалять любые следовые количества примесей. Удельная биологическая активность высокоочищенного чХГ, полученного указанным способом, является особенно высокой и составляет примерно 25000 МЕ/мг.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу очистки хорионического гонадотропина, а в частности к очистке рекомбинантного человеческого хорионического гонадотропина (чХГ) из образца неочищенного рекомбинантного чХГ. Этот способ предусматривает использование ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Хорионический гонадотропин представляет собой гормон, продуцируемый плацентой и обычно получаемый из мочи беременных женщин.
Указанный гормон представляет собой гетеродимер, состоящий из нековалентно связанных а- и βсубъединиц. Он действует преимущественно так же, как и лютеинизирующий гормон, гонадотропин.
Хорионический гонадотропин вводят женщинам в целях индуцирования у них овуляции после созревания фолликула, стимулируемого фолликулостимулирующим гормоном или постменопаузальными гонадотропинами человека, для лечения бесплодия, которое является следствием ановуляции, обусловленной отсутствием или низкими концентрациями гонадотропинов. Для имитации пика выброса лютеинизирующего гормона, который обычно стимулирует овуляцию в середине цикла, вводят разовую дозу от 5000 до 10000 единиц путем внутримышечной инъекции. Хорионический гонадотропин также вводят в сочетании с менотропином, а иногда также с цитратом кломифена, используемым в качестве добавки для осуществления процедур ίη νίΐτο-оплодотворения и процедур, связанных с оплодотворением и зачатием, включая суперовуляцию и сбор ооцитов. У мужчин этот гормон используют для лечения препубертатного крипторхидизма. Схемы лечения широко варьируются, но обычно дозы составляют от 500 до 4000 единиц и вводятся три раза в неделю путем внутримышечной инъекции.
Указанный гормон также применяют для лечения мужского бесплодия, ассоциированного с гипогонадотропиновым гипогонадизмом. В этом случае предусматривается использование различных схем лечения, и используемые дозы могут варьироваться от 500 до 4000 единиц и вводиться два-три раза в неделю. Для обеспечения нормального сперматогенеза часто добавляют агент с фолликулостимулирующей активностью, такой как менотропин. Для лечения олигоспермии могут быть введены дозы вплоть до 3000 единиц хорионического гонадотропина вместе с менотропином и другим фолликулостимулирующим препаратом. При лечении гипогонадизма у мужчин, связанного с задержкой полового созревания, может быть введена доза 500-1500 единиц два раза в неделю; причем указанная доза должна титроваться против концентрации тестостерона в плазме.
Для выделения и очистки чХГ из образцов мочи были использованы различные методы (В1гкеп е! а1., Епбостшо1оду, 133(3): 1390-7, 1993; 8акак1Ьага е! а1., Сйет. Рйатт. Ви11., 35(5): 1414-6, 1990; Όοηίηί е! а1., Ас!а Епбостшок, 73(1): 133-45, 1973). Недавно был разработан другой метод аффинной хроматографии, названный аффинной хроматографией с фильтрацией на мембране, и этот метод был применен для очистки чХГ из мочи (Хи е! а1., Рго1еш ехргеххюп апб ритШсайоп, 16:221-3, 1999). Этот способ позволяет избежать использования ВтСЫ-активированной сефарозы в качестве твердой фазы для аффинной хроматографической колонки и представляет собой вариант обычных способов аффинной хроматографии, используемых для очистки чХГ из образцов мочи. Иммуноактивность очищенного чХГ в соответствии с этим способом составляет 8554 МЕ/мг.
Рекомбинантный чХГ имеет те преимущества, что он не содержит другие гонадотропные гормоны и примеси человеческого происхождения, а более конкретно, примеси, присутствующие в моче человека. Однако неочищенный препарат рекомбинантного чХГ содержит все остальные белки и примеси клеток, используемых для его рекомбинантного продуцирования, а поэтому разработка способа достижения абсолютной чистоты рекомбинантного хорионического гонадотропина является крайне необходимой.
Краткое описание изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что неочищенный препарат чХГ, происходящий от концентрированного образца культуральной среды, полученной после осуществления рекомбинантного способа или из неочищенного концентрата мочи беременных женщин, может быть очищен до такой степени, что полученный чХГ практически не будет содержать белков и/или других примесей, находящихся в неочищенном препарате чХГ.
Данный способ очистки основан на использовании ионообменной хроматографии и обращеннофазовой ВЭЖХ. Возможное дополнительное использование вытеснительной колонки позволяет удалять любые следовые количества примесей. Оптимальные результаты были получены при осуществлении по крайней мере двух стадий ионообменной хроматографии.
Способ настоящего изобретения может быть использован для очистки рекомбинантного чХГ из неочищенного препарата культуральной среды, полученной в результате рекомбинантного способа. р-чХГ, полученный с высокой степенью чистоты и с высокой удельной биологической активностью (в пределах 23000-28000 МЕ/мг), практически не содержит белков фетальной телячьей сыворотки (ЕВ 8), если она присутствует в культуральной среде, и нуклеиновых кислот или других примесей, присутствующих в клетках-хозяевах, используемых в данном рекомбинантном способе.
Способ настоящего изобретения может быть также использован для очистки уринарного чХГ, полученного из неочищенного концентрата мочи беременных женщин, и для очистки ХГ, происходящего от других видов млекопитающих, включая, например, коров, лошадей, свиней, овец и обезьян.
- 1 006605
Следовательно, целью настоящего изобретения является способ очистки чХГ из образца, предусматривающий использование ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Указанный способ включает стадии, в которых данный образец подвергают ионообменной хроматографии, и стадии, в которых элюат подвергают обращенно-фазовой ВЭЖХ. Кроме того, может быть проведена дополнительная стадия нанесения элюата на вытеснительную колонку.
Две стадии ионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют в различных условиях в целях получения оптимальных результатов указанного способа очистки. Предпочтительный вариант способа настоящего изобретения включает стадии:
(a) элюирования образца через хроматографическую колонку с двуокисью кремния;
(b) элюирования через ионообменную хроматографическую колонку с ΌΕΑΕ-сефарозой;
(c) элюирования через ионообменную хроматографическую колонку с СМ-сефарозой.
(ά) элюирования через обращенно-фазовую ВЭЖХ-колонку с двуокисью кремния С 18; и (е) элюирования через вытеснительную хроматографическую колонку с сефакрилом.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения элюирование через ионообменную колонку с ΌΕΑΕ-сефарозой осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН примерно 7,5.
Элюирование через ионообменную колонку с СМ-сефарозой предпочтительно осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН примерно 6.
Стадию (ά) обращенно-фазовой ВЭЖХ предпочтительно осуществляют с использованием смеси 2пропанола/Трис-фосфатного буфера в качестве подвижной фазы.
ХГ настоящего изобретения предпочтительно представляет собой человеческий ХГ, а наиболее предпочтительно, рекомбинантный чХГ, полученный из культуральной среды клеток СНО, используемых в данном рекомбинантном способе.
Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество очищенного рекомбинантного чХГ, продуцированного рекомбинантным способом, описанным выше, вместе с подходящими наполнителями. Примером подходящего наполнителя является сахароза, которая способствует стабилизации лиофилизованного продукта. Фармацевтическая композиция указанного рекомбинантного чХГ является особенно подходящей для подкожного введения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу очистки чХГ, а в частности, к способу очистки рекомбинантного чХГ из неочищенного препарата культуральной среды, полученного в процессе осуществления рекомбинантных процедур. р-чХГ, полученный с высокой степенью чистоты и с высокой удельной активностью, практически не содержит белков фетальной телячьей сыворотки (ЕВ§), которые присутствуют в культуральной среде, и нуклеиновых кислот или других примесей, находящихся в клеткаххозяевах, используемых в указанном рекомбинантном способе. Настоящее изобретение предполагает использование биологических материалов, в частности неочищенных смесей, содержащих чХГ и другие примесные белки, и называемых в данной заявке образцами исходного материала. В примерах, подробно описанных ниже, используются образцы исходного материла, содержащие р-чХГ, полученный из супернатанта клеточной культуры в биореакторе. Альтернативно, указанным образцом является неочищенная концентрированная моча, взятая у беременных женщин.
Указанный образец представляет собой свежесобранный супернатант среды клеточной культуры, пропускаемый через биореактор в течение двух дней. Предпочтительно супернатант осветляют путем фильтрации. Если необходимо, неочищенный раствор концентрируют и подвергают хроматографии на двуокиси кремния С4 для удаления примесей, присутствующих в клеточной культуре.
Затем после ультрафильтрации, полуочищенный сбор подвергают ионообменной хроматографии, которую предпочтительно осуществляют два раза и предпочтительно в различных условиях, и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Первая стадия ионообменной хроматографии на ΌΕΑΕ-сефарозе может быть, в основном, осуществлена как стадия сквозного прохождения чХГ, в которой удаляется большая часть белков, не являющихся чХГ, и ДНК. Вторую стадию ионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют на колонке с СМ-сефарозой как стадию связывания с чХГ, и в этой стадии удаляются остаточные ДНК и примеси клеток-хозяев или примесные белки среды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эту стадию проводят при температуре примерно 5°С, элюируя фосфатнонатриевым буфером примерно при рН 6.
Обращенно-фазовая хроматография позволяет эффективно удалять следовые количества нуклеиновых кислот и примесей клеточной культуры. Колонку предпочтительно элюируют смесью 2пропанола/трис-фосфатного буфера, используемой в качестве подвижной фазы. Затем раствор ретентата (удерживаемой фракции) предпочтительно подвергают ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10 кД и концентрируют, после чего он может быть выделен с использованием бикарбоната аммония, рН 8. Затем концентрированный продукт может быть нанесен на вытеснительную хроматографическую колонку с сефакрилом §200 НВ. В этой стадии разделение молекул по размерам достигается элюированием бикарбонатом аммония, рН 8, проводимом для удаления возможно еще присутствующих следовых количеств примесей клеточной культуры, возможных агрегатов и свободных субъединиц чХГ. Затем
- 2 006605 элюат может быть подвергнут диализу путем ультрафильтрации на мембранах с 10 кД-отсечкой предпочтительно в фосфатно-натриевом буфере, рН 7. После фильтрации очищенную массу чХГ предпочтительно хранят в стерильных сосудах при низкой температуре.
Пример 1.
Реагенты
Аммиак, аналитической чистоты.
Бикарбонат аммония, аналитической чистоты (В.Р.).
Двухосновный гидрофосфат натрия, аналитической чистоты.
Абсолютный денатурированный этанол.
Фосфорная кислота, аналитической чистоты (РДЕиг.).
2-Пропанол, аналитической чистоты (ΡΚ.ΗοΙν.).
Хлорид натрия, аналитической чистоты (РДЕиг.).
Дигидрофосфат натрия, аналитической чистоты.
Гранулы гидроксида натрия, аналитической чистоты (РДЕиг.).
Трифторуксусная кислота (ТРА) для ВЭЖХ. Трис-(гидроксиметил)аминометан, аналитической чистоты.
Краткая блок-схема способа очистки
Собранный материал, продуцируемый в процессе культивирования клеток, очищают и концентрируют путем проведения серии пяти хроматографических стадий.
В нижеследующей блок-схеме (табл. 1) систематизирован предпочтительный вариант осуществления способа очистки р-чХГ, а также описаны смолы, используемые в хроматографических колонках и принципы осуществления каждой из промежуточных стадий.
Таблица 1 Блок-схема, в которой систематизирован способ очистки р-чХГ
Стадия I | КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ИЗ БИОРЕАКТОРА 1 Хроматография на двуокиси кремния С4 (Элюат содержит р-чХГ) |
1 Ультрафильтрация с 10 кД-отсечкой (Ретентат содержит р-чХГ) 1 СБОР КОНЦЕНТРИРОВАННОГО НЕОЧИЩЕННОГО р-чХГ 1 | |
Стадия II | ΏΕΑΕ-СЕФАРОЗА ЕЕ (Несвязанная фракция содержит р-чХГ) 1 |
Стадия III | СМ-сефароза ЕЕ (Элюат содержит р-чХГ) 1 |
Стадия IV | ОФ-ВЭЖХ НА ДВУОКИСИ КРЕМНИЯ С18 (Элюат содержит р-чХГ) 1 Ультрафильтрация (10 кД) |
Стадия V | СЕФАКРИЛ 5-200 НК (Элюат содержит р-чХГ) 1 РАСТВОР ВСЕГО р-чХГ |
Подробное описание блок-схемы и всего процесса приводится ниже. Условиями для стадии захвата (стадия I) являются условия, которые обычно применяются к неочищенному материалу, полученному рекомбинантным способом.
Стадия I (стадия захвата).
В данной стадии (стадия I) осуществляют предварительное концентрирование и буфер заменяют так, чтобы он имел регулируемый состав. Эту стадию начинают при комнатной температуре (хроматография на двуокиси кремния С4), а затем продолжают примерно при +5°С. Предпочтительный интервал
- 3 006605 температуры составляет 5±3°С. Эту стадию повторяют отдельно для каждого сбора в течение цикла продуцирования в биореакторе.
(ί) Осветление сборов.
Свежесобранную культуральную среду из биореактора обычно сначала осветляют путем фильтрации.
(ίί) Хроматография на двуокиси кремния С4.
После осветления сборы загружают на хроматографическую колонку с двуокисью кремния С4, предварительно уравновешенную в 25 мМ фосфате натрия, рН 7. Предпочтительный диапазон рН составляет от 6,6 до 7,7. Колонку промывают фосфатом натрия 25 мМ до тех пор, пока УФ-сигнал на мониторе не возвратится на базовую линию. Затем продукт элюируют 34,2% (мас./мас.) 2-пропанола в 25 мм фосфате натрия.
(ίίί) Обработка аммиаком.
Затем к раствору добавляют аммиак до конечной концентрации 1М. Эту смесь инкубируют в течение 6 ч. После этого раствор 2-кратно разбавляют водой и рН доводят до 7,5 с использованием 85%-ной фосфорной кислоты. Предпочтительный диапазон рН составляет 7,5±0,2.
(ίν) Концентрирование и диализ.
Мембраны с 10 кД-отсечкой, которые между циклами хранились в 0,05 М гидроксиде натрия, промывают очищенной водой до тех пор, пока рН не понизится приблизительно до 8.
Продукт концентрируют и диализуют (путем ультрафильтрации на 10 кД-мембране) для удаления материала, имеющего молекулярную массу ниже 10 кДа, и для удаления следовых количеств 2пропанола, а также для замены раствора аммиака 40 мМ фосфатом натрия, рН 7,5. Предпочтительный диапазон рН составляет 7,5±0,2.
Конечный ретентат отделяют от мембран с использованием 40 мМ фосфата натрия с достижением концентрации целевого белка 3-15 мг/мл.
Затем раствор фильтруют и полученный концентрат хранят в замороженном виде приблизительно при -15°С.
Стадия II (фильтрация и ионообменная хроматография на ΌΕΛΕ-сефарозе ЕЕ).
Данная хроматографическая стадия представляет собой стадию сквозного прохождения р-чХГ, в которой удаляется большая часть белков, не являющихся не-р-чХГ, и нуклеиновых кислот. Если фильтрацию проводят при комнатной температуре, то хроматографическую стадию, в которой продукт пропускают через колонку, осуществляют в холодном помещении.
(ί) Оттаивание и объединение концентрированных неочищенных сборов р-чХГ.
Замороженные концентраты оттаивают и объединяют. Партию очищенной массы р-чХГ получают из пула, состоящего из различного числа неочищенных концентратов р-чХГ, продуцированных из того же самого рабочего банка клеток. Критерий для числа неочищенных концентратов р-чХГ, объединенных в пул, основан на максимальной способности связывания белков в следующей хроматографической стадии данного способа очистки (4 мг общего белка/мг смолы).
(ίί) Осветление путем фильтрации.
Раствор р-чХГ предпочтительно пропускают через фильтрующее устройство и фильтры промывают 40 мМ фосфатом натрия, рН 7,5.
Отфильтрованный раствор и промывки объединяют.
(ίίί) Ионообменная хроматография на ΌΕΆΕ-сефарозе ЕЕ.
Колонку, слабо упакованную анионообменной смолой диэтиламиноэтан(ПЕАЕ)сефароза Еа§1 Ρ1ο\ν. уравновешивают 40 мМ фосфатом натрия (рН 7,5).
Раствор р-чХГ загружают на колонку.
В колонку подают 40 мМ фосфата натрия, рН 7,5. Мониторинг хроматографического процесса осуществляют с помощью спектрофотометрии при 280 нм.
Первую фракцию отбрасывают до тех пор, пока не начинает элюироваться пик. Затем собирают несвязанные фракции, содержащие р-чХГ.
Стадия III (хроматография на сефарозе ЕЕ).
В данной хроматографической стадии удаляется большая часть контаминатов от клеток-хозяев. Эту хроматографическую стадию осуществляют примерно при +5°С. Предпочтительный интервал температуры составляет 5±3°С.
(ί) Разведение элюата из колонки с ΌΕΑΕ-сефарозой ЕЕ.
К элюату из колонки с ΌΕΑΕ-сефарозой ЕЕ добавляют воду для инъекций и рН доводят до 6 с использованием 85% фосфорной кислоты. Предпочтительный диапазон рН составляет 6±0,1.
(ίί) Ионообменная хроматография на СМ-сефарозе ЕЕ.
Колонку, слабо упакованную анионообменной смолой карбоксиметил(СМ)-сефароза Еа§1 Ρ1ο\ν. уравновешивают 20 мМ фосфатно-натриевым буфером (рН 6). Предпочтительный диапазон рН составляет 6±0,1.
Раствор р-чХГ загружают на колонку.
- 4 006605
Колонку промывают 20 мМ фосфатно-натриевым буфером, рН 6. Мониторинг хроматографического процесса осуществляют с помощью спектрофотометрии при 280 нм.
Продукт элюируют с использованием 130 мМ фосфатно-натриевого буфера, рН 6. Первую фракцию отбрасывают до тех пор, пока не начнет элюироваться пик.
Полный пик, содержащий р-чХГ, собирают. На этой стадии, для удаления вирусных примесей, продукт может быть, но необязательно, отфильтрован.
Стадия IV (ОФ-ВЭЖХ на двуокиси кремния С18).
Эта хроматографическая стадия ОФ-ВЭЖХ является эффективной для удаления следовых количеств контаминатов от клеточной культуры, остатков нуклеиновой кислоты и эндотоксинов. После этой стадии осуществляют ультрафильтрацию с 10 кД-отсечкой и необязательную фильтрацию.
(ί) Получение аликвот.
рН аликвот доводят до 5 и добавляют 2-пропанол до конечной концентрации 15% (об./об.).
(ίί) ОФ-ВЭЖХ-хроматография на двуокиси кремния С18.
Колонку, упакованную смолой двуокисью кремния С18, сначала уравновешивают в 15% (об./об.) 2пропаноле в 0,5М трис-фосфатном буфере.
Первую аликвоту загружают на колонку и проводят мониторинг хроматографии с помощью УФспектрофотометрии.
Колонку промывают тем же самым уравновешивающим буфером.
Затем осуществляют элюирование р-чХГ линейным градиентом смеси 2-пропанола/0,5 трисфосфатного буфера от 15 до 25% (об./об.), используемой в качестве подвижной фазы. Когда соответствующий пик детектируется с помощью спектрофотометрии (А280), то р-чХГ фракционируют. Фракции, оптическая плотность которых превышает 65% высоты максимального пика в восходящей части и превышает 20% высоты максимального пика в нисходящей части, объединяют.
Затем четыре пула, содержащие р-чХГ, объединяют и разбавляют в эквивалентном объеме воды для инъекций (νΕΙ).
Продукт концентрируют и диализуют (путем ультрафильтрации на 10 кД-мембране) против νΕΙ для удаления материала, имеющего молекулярную массу меньше чем 10 кД, и для удаления 2-пропанола.
Затем продукт диализуют путем ультрафильтрации против 0,1М аммонийбикарбонатного буфера, рН 8.
Полученное промежуточное соединение хранят примерно при +5°С или замораживают, если это необходимо. Предпочтительные температуры хранения составляют 5±3°С, либо равны или ниже -15°С соответственно.
Стадия V (вытеснительная хроматография на сефакриле 8200 НВ).
Эта стадия вытеснительной хроматографии является эффективной для удаления следовых количеств примесей от клеточной культуры, возможных агрегатов и/или свободных субъединиц. После этой стадии осуществляют ультрафильтрацию с 10 кД-отсечкой. Стадию хроматографии на сефакриле 8-200 НВ и стадию ультрафильтрации с 10 кД-отсечкой проводят примерно при +5°С. Предпочтительная температура составляют 5±3°С.
(ί) Вытеснительная хроматография на сефакриле 8200 НВ.
Колонку, упакованную смолой сефакрил 8200 НВ, уравновешивают бикарбонатом аммония, 0,5М (рН 8).
Предпочтительный диапазон рН составляет 8±0,2.
Раствор р-чХГ загружают на колонку и элюирование инициируют бикарбонатом аммония, 0,5М, рН 8. Предпочтительный диапазон рН составляет 8±0,2.
Сбор фракции р-чХГ начинают от начала пика и продолжают вплоть до достижения в нисходящей части этого пика отметки 50% от высоты максимального пика.
(ίί) Ультрафильтрация с 10 кД-отсечкой.
Мембраны с 10 кД-отсечкой, которые в промежутках между циклами хранили в 0,05 М гидроксиде натрия, промывают νΕΙ до тех пор, пока рН не снижался примерно до 8.
Полученный продукт концентрируют и диализуют (путем ультрафильтрации) против νΕΙ.
Затем продукт диализуют (путем ультрафильтрации) против 0,01М фосфатно-натриевого буфера, рН 7, и конечную концентрацию белка доводят до нужной конечной концентрации 3,5 мг/мл.
Конечный объемный раствор полученного р-чХГ предпочтительно хранят в замороженном виде примерно при -15°С.
Хроматографические смолы
В указанном способе очистки могут быть использованы следующие хроматографические смолы, указанные ниже. Могут быть также использованы эквивалентные смолы.
- 5 006605
Стадия I: Двуокись кремния С4, 250 Ангстрем - 50 мкм
Стадия II: ϋΕΑΕ-сефароза ЕЕ
Стадия III: СМ-сефароза ЕЕ
Стадия IV: Двуокись кремния С18, 300 Ангстрем - 15-20 мкм
Стадия V: Сефакрил 5-200 НК
Поставщиками являются:
АтегзЬат РНагтас1а В1оЬесН,
ВэогкдаЬап 30 5-751 84, Цррза1а
5’»едеп и5А (МаГгех®, МПИроге) (РЬагшас1а) (РЬагтасга) (Уудас) (РЬагтас1а)
МПИроге СогрогаЫоп
СЬеггу Ηίΐΐ ϋτίνβ
Бапуегз, МА 01923, ΙΙ3Α
УуДас, ТДе ЗерагаЫопз Сгоир,
17434 Μο^Βνθ 5Ь. Незрегга, СА
92345 и5А
Результаты
Масса и размер молекул.
Электрофорез в ПААГ с ДСН.
Относительная молекулярная масса р-чХГ, полученного после проведения способа очистки настоящего изобретения, была определена с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН против стандартных белков с известной молекулярной массой.
Окрашивание кумасси бриллиантовым голубым после электрофореза в нередуцирующем ПААГ с ДСН выявило одну широкую полосу для гетеродимера р-чХГ с молекулярной массой приблизительно 70 кД (в диапазоне 65-75 кД). Идентичность этой полосы была подтверждена с помощью Вестерн-блотанализа.
Биологическая активность.
Биологическая активность различных партий р-чХГ после очистки способом настоящего изобретения представлена в табл. 2. Концентрацию белка определяли с помощью спектрофотометрии при 276,5 нм, а = 0,616.
Средняя удельная активность препарата р-чХГ является особенно высокой и составляет примерно 25000 МЕ/мг.
Таблица 2
Композиции.
Жидкие и лиофилизованные композиции были получены с использованием высокоочищенного рекомбинантного чХГ настоящего изобретения.
Жидкая композиция.
Две жидкие композиции при концентрации 10000 МЕ/мл получали во флаконах ΏΙΝ 2К с использованием маннита или сахарозы в качестве наполнителя (табл. 3) и тестировали на стабильность при 50, 40, 25 и 4°С.
Эта композиция описана в табл. 3 и 4.
- 6 006605
Таблица 3
Ингредиенты | Единица | |
р-чХГ | МЕ/мл | 10000 |
Сахароза | мг/мл | 102, 8 |
о-фосфорная кислота | мг/мл | 0, 98 |
Гидроксид натрия | Дост. кол. до достижения рН 7,0 |
Объем наполнения: 0,5 мл
Таблица 4
Ингредиенты | Единица | |
р-чХГ | МЕ/мл | 10000 |
Маннит | мг/мл | 54, 6 |
о-фосфорная кислота | мг/мл | 0, 98 |
Гидроксид натрия | Дост. кол. до достижения рН 7,0 |
Объем наполнения: 0,5 мл.
Результаты тестов на стабильность, проведенных с помощью биоанализа, вытеснительной ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ, показали, что композиция с маннитом была более стабильной, чем композиция с сахарозой. Условия хранения в холодильниках являются предпочтительными и необходимы для минимизации окисления белка и образования свободных субъединиц.
Лиофилизованная композиция.
Лиофилизованную композицию при концентрации 5000 МЕ получали во флаконах ΏΙΝ 2К с использованием сахарозы в качестве наполнителя и тестировали на стабильность при 50, 40, 25 и 4°С.
Эта композиция описана в табл. 5.
Таблица 5
Ингредиенты | Единица | |
р-чХГ | МЕ | 5000 |
Сахароза | мг | 30 |
о-фосфорная кислота | мг | 0, 98 |
Гидроксид натрия | Дост. кол. до достижения рН 7,0 |
Результаты тестов на стабильность, проведенных с помощью биоанализа, вытеснительной ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ, показали, что данная лиофилизованная композиция была стабильной при 40 и 50°С, по крайней мере, в течение 19 недель.
Тесты на стабильность при 25 и 4°С проводили вплоть до 6 месяцев, что указывало на отсутствие разложения активного вещества.
Claims (13)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ очистки рекомбинантного чХГ из образца, включающий последовательные стадии:(a) элюирования образца через хроматографическую колонку с двуокисью кремния;(b) элюирования препарата через ионообменную хроматографическую колонку;(c) элюирования через вторую ионообменную хроматографическую колонку;(б) элюирования через обратно-фазовую ВЭЖХ-колонку и (е) обработки элюата вытеснительной хроматографией.
- 2. Способ очистки рекомбинантного чХГ из образца по п.1, включающий последовательные стадии:(a) элюирования образца через хроматографическую колонку с двуокисью кремния;(b) элюирования препарата образца через ионообменную хроматографическую колонку с ΏΕΑΕсефарозой;(c) элюирования через ионообменную хроматографическую колонку с СМ-сефарозой.(б) элюирования через обратно-фазовую ВЭЖХ-колонку с двуокисью кремния С18 и (е) обработки элюата с помощью вытеснительной хроматографии на сефакриле.
- 3. Способ по п.2, где элюирование через ионообменную колонку с ΏΕΑΕ-сефарозой осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН 7,5.
- 4. Способ по любому из пп.2-3, где элюирование через ионообменную колонку с СМ-сефарозой осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН 6.- 7 006605
- 5. Способ по любому из пп.2-4, где стадию обращенно-фазовой ВЭЖХ осуществляют с использованием 2-пропанол/трис-фосфатного буфера в качестве подвижной фазы.
- 6. Способ по любому из пп.2-5, где стадию вытеснительной хроматографии осуществляют с использованием аммонийбикарбонатного буфера в качестве подвижной фазы.
- 7. Способ по любому из пп.2-6, где образцом является культуральная среда клеток СНО.
- 8. Рекомбинантный чХГ, имеющий удельную биологическую активность в диапазоне от 23000 до 28000 МЕ/мг, получаемый способом по любому из пп.1-7.
- 9. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный чХГ по п.8 и приемлемые наполнители.
- 10. Фармацевтическая композиция по п.9, где указанным наполнителем является сахароза.
- 11. Фармацевтическая композиция по п.9, где указанным наполнителем является маннит.
- 12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.9-11 для подкожного введения.
- 13. Применение рекомбинантного чХГ по п.8 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с бесплодием.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00103690 | 2000-02-22 | ||
PCT/EP2001/000665 WO2001062773A1 (en) | 2000-02-22 | 2001-01-22 | PROCESS OF PURIFICATION OF hCG AND RECOMBINANT hCG PURIFIED BY THAT METHOD |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200200892A1 EA200200892A1 (ru) | 2003-02-27 |
EA006605B1 true EA006605B1 (ru) | 2006-02-24 |
Family
ID=8167925
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200200892A EA006605B1 (ru) | 2000-02-22 | 2001-01-22 | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7297777B2 (ru) |
EP (2) | EP1257564B1 (ru) |
JP (1) | JP4588960B2 (ru) |
KR (1) | KR100806911B1 (ru) |
CN (1) | CN100482679C (ru) |
AT (1) | ATE406378T1 (ru) |
AU (2) | AU783320B2 (ru) |
BG (1) | BG65807B1 (ru) |
BR (1) | BRPI0108556B8 (ru) |
CA (1) | CA2399020A1 (ru) |
CY (1) | CY1108460T1 (ru) |
CZ (1) | CZ303144B6 (ru) |
DE (1) | DE60135541D1 (ru) |
DK (1) | DK1257564T3 (ru) |
EA (1) | EA006605B1 (ru) |
EE (1) | EE05644B1 (ru) |
ES (1) | ES2307585T3 (ru) |
HK (1) | HK1052016A1 (ru) |
HR (1) | HRP20020650B1 (ru) |
HU (2) | HU1300063D0 (ru) |
IL (2) | IL151308A0 (ru) |
ME (1) | ME00296B (ru) |
MX (1) | MXPA02007871A (ru) |
NO (1) | NO328694B1 (ru) |
PL (1) | PL205149B1 (ru) |
PT (1) | PT1257564E (ru) |
RS (1) | RS50741B (ru) |
SI (1) | SI1257564T1 (ru) |
SK (1) | SK287146B6 (ru) |
UA (2) | UA86938C2 (ru) |
WO (1) | WO2001062773A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200206109B (ru) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1257564T3 (da) * | 2000-02-22 | 2008-10-06 | Serono Lab | Fremgangsmåde til oprensning af rekombinant HCG med en specifik bioaktivitet |
WO2006041945A2 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Novetide, Ltd. | A counterion exchange process for peptides |
CN1958603B (zh) * | 2005-11-04 | 2010-05-05 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法 |
EA200802426A1 (ru) * | 2006-07-11 | 2009-04-28 | Коваль, Антон Александрович | Применение хорионического или лютеинизирующего гормона для профилактики или лечения возрастного гипогонадизма |
CN101397339B (zh) * | 2008-09-24 | 2012-07-25 | 上海天伟生物制药有限公司 | 糖蛋白中去除/灭活病毒的方法 |
TWI532495B (zh) | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
CN101792481B (zh) * | 2010-03-12 | 2012-05-30 | 丽珠医药集团股份有限公司 | 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法 |
WO2012120535A2 (en) * | 2011-02-03 | 2012-09-13 | Sanzyme Limited | A composition comprising highly purified chorionic gonadotropin, it's formulation and uses of the same |
CA3163525A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Ferring Bv. | Pharmaceutical preparation |
WO2013102921A2 (en) * | 2011-11-17 | 2013-07-11 | Sanzyme Limited | Hcg - newer treatment modality for type 2 diabetes mellitus (t2dm) |
CN103288950A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-09-11 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法 |
CN104101656A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-10-15 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种促性腺激素的纯度测定方法 |
US20150065426A1 (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-05 | Professional Compounding Centers Of America | Testosterone Booster Transdermal Compositions |
CN105968185A (zh) * | 2016-07-20 | 2016-09-28 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种绒促性素纯化方法 |
CN111233999B (zh) * | 2020-03-21 | 2024-02-23 | 上海浦东明炎生物技术有限公司 | 一种从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法 |
CN113398251B (zh) * | 2021-07-30 | 2022-08-05 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0461200T3 (da) * | 1989-02-21 | 1997-03-10 | Univ Washington | Modificerede former af reproduktionshormoner |
IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
IT1254370B (it) * | 1992-05-22 | 1995-09-14 | Sorin Biomedica Spa | Procedimento per la purificazione di proteine da sistemi cellulari. |
WO1996029095A1 (en) | 1995-03-21 | 1996-09-26 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Hcg liquid formulations |
CN1261579C (zh) * | 1996-02-20 | 2006-06-28 | 应用研究系统Ars控股公司 | 形成异源二聚体的杂种蛋白质 |
IT1287138B1 (it) * | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
WO1998056806A1 (en) | 1997-06-12 | 1998-12-17 | The Regents Of The University Of California | A TRANSCRIPTION FACTOR COACTIVATOR PROTEIN, p/CIP |
DK0998486T4 (da) * | 1997-06-13 | 2012-05-14 | Genentech Inc | Proteinoprensning ved kromatografi efterfulgt af filtrering på en ladet fase |
US6583109B1 (en) * | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
DK1257564T3 (da) * | 2000-02-22 | 2008-10-06 | Serono Lab | Fremgangsmåde til oprensning af rekombinant HCG med en specifik bioaktivitet |
-
2001
- 2001-01-22 DK DK01901188T patent/DK1257564T3/da active
- 2001-01-22 JP JP2001562554A patent/JP4588960B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 ME MEP-2008-389A patent/ME00296B/me unknown
- 2001-01-22 IL IL15130801A patent/IL151308A0/xx unknown
- 2001-01-22 AU AU26804/01A patent/AU783320B2/en not_active Expired
- 2001-01-22 BR BRPI0108556A patent/BRPI0108556B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 WO PCT/EP2001/000665 patent/WO2001062773A1/en active IP Right Grant
- 2001-01-22 HU HUP1300063 patent/HU1300063D0/hu unknown
- 2001-01-22 AT AT01901188T patent/ATE406378T1/de active
- 2001-01-22 EP EP01901188A patent/EP1257564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 RS YUP-602/02A patent/RS50741B/sr unknown
- 2001-01-22 SI SI200130858T patent/SI1257564T1/sl unknown
- 2001-01-22 PT PT01901188T patent/PT1257564E/pt unknown
- 2001-01-22 EE EEP200200469A patent/EE05644B1/xx unknown
- 2001-01-22 CN CNB018053637A patent/CN100482679C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 CA CA002399020A patent/CA2399020A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-22 DE DE60135541T patent/DE60135541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 EA EA200200892A patent/EA006605B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 PL PL357508A patent/PL205149B1/pl unknown
- 2001-01-22 UA UAA200511832A patent/UA86938C2/ru unknown
- 2001-01-22 CZ CZ20022855A patent/CZ303144B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 UA UA2002086890A patent/UA78488C2/uk unknown
- 2001-01-22 HU HU0204231A patent/HU228935B1/hu unknown
- 2001-01-22 EP EP06024050A patent/EP1752466A3/en not_active Withdrawn
- 2001-01-22 SK SK1206-2002A patent/SK287146B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 ES ES01901188T patent/ES2307585T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 KR KR1020027010625A patent/KR100806911B1/ko active IP Right Grant
- 2001-01-22 MX MXPA02007871A patent/MXPA02007871A/es active IP Right Grant
- 2001-01-22 US US10/204,630 patent/US7297777B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-07-31 ZA ZA200206109A patent/ZA200206109B/en unknown
- 2002-08-01 HR HR20020650A patent/HRP20020650B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-08-14 BG BG107000A patent/BG65807B1/bg unknown
- 2002-08-18 IL IL151308A patent/IL151308A/en active IP Right Grant
- 2002-08-21 NO NO20023985A patent/NO328694B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-17 HK HK03104314.8A patent/HK1052016A1/xx unknown
-
2006
- 2006-01-06 AU AU2006200059A patent/AU2006200059A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-08-28 US US11/846,118 patent/US20070299001A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-10-27 CY CY20081101218T patent/CY1108460T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20070299001A1 (en) | PURIFIED hCG | |
KR101860830B1 (ko) | 당단백질 정제 방법 | |
US20060079460A1 (en) | Purified LH | |
KR100361894B1 (ko) | 치환크로마토그라피방법및정제된헤모글로빈생성물 | |
CN110563832A (zh) | 一种高纯度重组促卵泡刺激素纯化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
PD4A | Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title | ||
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
MK4A | Patent expired |
Designated state(s): RU |