HU228935B1 - Process of purification of hcg and recombinant hcg purified by that method - Google Patents

Description

Eljárás h€G tisztítására és az eljárással tisztított rehembíaáas h€<3

A találmány tárgya. éljárás a chorionális gosadtóropb tisztítására, előnyösen emberi eredeti ehortonálís gonadotropin (höö) tisztítására nyers, rokmnhjnáas hCG tartalmú «maátdjói. Az eljárás sz tóscsutélőfcmmatográSa és a fordított fázisú HPLC alkalmazásán alajmt

A choríonálfe gonadótropint a placent» lemeli és a hagyományosan terhes nők vizeletéből nyerik ki.

A höfos.oö nem kovalensen kapcsolt a és β alegységeket tartalmazó heterodímer.

A hennon hatásai túlnyomórészt stegogyezoek a goaadottopín hiteíntzáló hormon hatásaival

Chorionális gonaifotrepiat abból a célból adnak be stóknek, hogy mintán a follículusok fejlődését foliíeníusekat serkentő hormonnal vagy emberi meoopauzáíís goHadobopiaokkal. serkentették, gonadottopmok alacsony koncentrációjára vagy hiányára visszavezethető anovnlációs infertilitás kezelésére ovulációt indukáljanak. Egyszeres dózisban 5000-1ŐŐÖŐ egységet inttnmnszknlárís miekcíókém beadva a hormon utánozza a. ciklus közepén az ovulációi normális esetben serkentő luteunzáló hormsncsócsot. Chorionélis gonadottopim. menotrophmnal vagy bizonyt» esetekben eterphene-eitráttal együtt is he szokták adni járulékos kezelésként in viám megteiméksttyítéa esetén illetve más, a fogamzást elősegítő sznperovnlácíós ás eoeita gyöjtóses eljárások sotán, Férfiakban a prepnbertális cr^itorchidismus kezelésére szokták alkalmazni. A beadási rendek igen változatosak, azonban a dózisok általában 50Ö-4ÖOŐ egységnyiek, amelyeket hetente háromszori mtramuszkeláris htjskcíő formájában adnak be,

E hormont hipogonadotrefikus hhiogonadizmassal kapcsolatos ferfisferiíitás esetén is beadják. Az előzőekhez hasonlóan, a áoztaásS rendek nagymértékben ekésnek egymástól, és hetente kétszer vagy háromszor beadott dózisok az 50Ö-4ÖÖG egységnyi tartományban változnak,. Foiiiculust serkentő aktivitású ágenst, mint: például menotrophmt, gyakran beadnak a normális spetmatogenesis tehetővé tételére. Otígospermia esetén, maximum 3ÖÖŐ egység ehorionális gonadotropín-dózbi menottephisnai vagy más, folliculust serkentő készítménnyel kombinálva alkalmazhatunk. Férimkfca» késleltetett: pubertással kapcsolatba hozható hípogoasdisams kezelésére, 500-1500 egységet szokás beadni hetooto kétszer (a dózist a plazma teszmss^ron-konceattáeíójának megfelelően be kell állítató),

Nyers vizelelmitttákból különböző eíjátosokktó izoláltak ás bszíhtóiak hCO-t (Búkén és mtsai, .Endixrinoiogy .1.33, 1390-13*3? (1.993); Sakakibara és mtsai, Chem. Pliarm. Bull, 3,3, 1414-141 δ (1390); fbstótó és mtsai., Acta Buáocrinol 73, 133-145 O9?3)j, Az utóbbi időben, az aífinításkFon^ográSús eljárások egyik, a merahránszüréses affinitáskromalegráfia óéven ismeri, változatát fejlesztették .kis és alkalmazták hCG tisztítására vizeletből [Xu és mtsai, Frol Expr. Purif. 16, -221-223 (19§9)'j. Az e^átámi tókerülbtóyök az aíSnitáskromatográfiás oszlopban. a CNBr-rel aktivált Sepharose szilárd fázisként történő alkalmazását, Az eljárás a hCÖ, vízeleöníntákból történő sriBniiéskromatográfiás tisztítására ssoígálő szokásos eljárások egyik változatának tekinthető. Aa említett «(Járással iisstótoít hCG immunaktivitésa §534 NBAög.

Hnth és mtsai (Badoctyselogy (1994), 133(3) 911-9? §] feításják hCG bakteriális expressziós rendszerben előállított feéís-tósgységónek tisztítását, a rtkembináns hCG-béta-ategység és vizeletből származó hCGslfe-ategység összeszerelését és a dimer sntoncsecéíő ktomstógtáfteb v&ió tisztkását

Az 1993. ítocemfeetolxa!. közzétett WO 9§/5ő3ő8 sz nemzetközi közzétételi irat satí-CO- idpsttteKsombtóst tisztítására szolgáló eljárást ismertet, ami anioacwéiö kromategráBát, valamint hidrofób 'kölcsönhatási kromato^sáfiál· tógtel magában.

97377-7195/SG ·>

Áz 1990. szepientborébes közzétett WO90/Ö989Ö9 sz. semzetkőzi közzétételi. jm reproduktív bormcsmk és azokat tartalmazó gyógyászati készítmények módosított forjskií ismerteti.

A rekombináns hCG előnye abban rejlik, hogy melleiig nincs jelen más, emberi eredetik illetve eiősyösebben emberi vizeletből. származó, más gonadotropm ás ssesoyeződés. Azonban a nyers, rekombináns hCGpmparáhim tartalmaz más, a rekombináns elöáH&ásra alkalmazón sejtből származó fehfejőket és szennyeződéseket, ezáltal szükség van tökéletesen tiszta, rekombináns chcriogéa gonadotropin előállítására alkalmas tisztítási eljárás ksdblgozására.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást

A találmány szerinti megoldást az L igénypont jellemzi, és előnyős megvalósítási módokat defináhsak a 2«7. ISggő Igénypontok,

Felismertük, hogy a rekombinációs folyamatból nyert tápoktól folötószájának bokcaoenfehií mintájából vagy terhes nő vizeletének nyers koncenttáiumábői származó, nyers hCÖ preparátumot meg lehet ágy tisztítani, hogy az eredményül kapott hCC gyakorlatilag mentes legyen minden, olyan más fehérétől vagy szennyező anyagtól, amit a nyers hCG-pmparáhmi tartalmazott

Á liszíkási folyamat az imtcserélŐ-krosuhográSa ás fordított fázisó HPLC alkalmazásán alapul. Méretkizófesos-'feöímrfegráfe szí köveid lehetséges alkalmazásával eltávolítható bármilyen, nyomokban előforduló szennyeződés. Optimális eredmény abban az esetben érhető el, ha legalább két ionsserélő-temaíogoáfiás lépést végzőnk el.

A találmány szerinti elírást alkslmszhsijtsk a rekombinációs folyamatból nyert tápóidat felüléezójának nyma preparátumából származó rekombináns hCG tisztítására. Az így kapón r-hC<3 magas tisztasági fokó és igen speeítlkoe bioaktivltásí mutat (23íXX)'2k(KX5 NE/mg tsoomásv), és mselletí gyakorlatilag mentes a borjőeredetű szérumalbumm (FBS) fehérjéitől (amennyiben a iápolífeí FBS-t tartalmazott), illetve nsklmnsavaktól vagy- a mkombísáns előállításra alkalmazott sebből származó egyéb szennyesodésektöl,

A találmány szerinti eljárást emellett alkalmazhatjuk hCG, vizeletből történő tisztítására (terhes nőtől származó, feskoseeniráh vizeletből kiindulva), illetve Cö tisztítására más emlős&jofcböl, így például, pénasesülkü kérődzők, ló, sertés, juh és majom, /1 találmány szériád megoldás célja eljárás kidolgozása bCG tisztítására mintákból, amely eljárás során ioscserélő-kramatográSát és fordított fázisú HPLC-t alkahaszank. A folyamat lépései során a mintát ioncserélőkromatográfiával, majd az itt kapod eluátumot fordított feisű HPLC-vel kmmatografáljuk. Az eiuátumöt egy további lépésben roérelkizfeásos oszlopra vlhsfo'ők fel,

A találmány tárgyát az L igénypont határozza meg, és előnyös megvalósítási módokat definiáltunk a 2-7. igénypontokban.

Az optimális eredmény elérése céljából a liszibási folyamatban a?, ioncsmélfokromatográfiáí előnyösen kés, egymástól eltérő körülmények között végezzük. A találmány előnyös tsegvalósittfeí módjában a találmány szerinti folyamat az alábbi lépéseket tartalmazza:

(a) a mintái sziiikagél oszlopon keresztül ehtáljuk;

(b) DEAE Sapbarose ioncsefelŐ-doOsnafe^llás oszlopon keresztül efeáhmk;

(c) CM Sephsfoss ioscsoi'éső-tomatográfiás oszlopon keresztül efoőfeok;

(d) Szikké Cl.§ fordított feisó HPLC oszlopos keresztül efoferk; és <?

(«) Sephacryl méreíkizárásös-kromtitográfiás oszlopon keresztül eluáiunk.

A találmány előnyös megvalósítást módja szerint, a DEAE Sepharose ioncserélő-kromatográfiás oszlopon át történő eíóciót nátrinmfbszfát-pufierben végezzük körülbelül pH 7,5 biztosítósával,

Á CM' Sepharose ioncserélő-kromatográfiás oszlopon át történd eléciőt nátríumfoszfát-pufíerben végezzük körülbelül pH 6 biztosítósával,

A fordított fázisó HPLC lépésben (d) a mozgó fázis előnyösen 2-propanol/Ins-foszfát-puffer,

A találmány szerinti CG előnyösen emberi CG, és legelőnyösebben rekombínáns hCG, amely rekombináns hCG a rekombináns folyamatban, a CHO-sejtek tenyésztésére alkalmazott tápoldatából származik.

Az alábbiakban részletesen leírjuk «találmány szerinti megoldást.

A találmány tárgya eljárás hCG tisztítására, előnyösen emberi eredetű ehorionális gonadotropin (hCG) tisztitósára, illetve rekombínáns hCG tisztítására a rekombinációs folyamatból nyert tápoldat fetülúszójának nyers preparátumából. Az így kapott r-hCG magas tisztasági fokó és igen specifikus bioaktívítást mutat (23Ö002S0Ö0 NEAsg tartomány), emellett gyakorlatiiag mentes a borjúeredetü szérumaibumin (FBS) fehérjéitől (amennyiben a tápoldat FBS-í tartalmazott), illetve mskleinsavaktól vagy a rekombínáns előállításra alkalmazott sejtből származó egyéb szennyeződésektől. A találmány szerinti megoldást biológiai anyagok, előnyösen hCG-t és más szennyező fehérjéket tartalmazó nyers keverékek - a továbbiakban kiindulási anyagminták - viszonylatóban szándékozzuk alkalmazni. Az alábbiakban részletesen leírt példákban, bioreaktorban tenyésztett sejtek felüiúsHójáböl származó, r-hCG tartóimé kiindulási anyagmintákat alkalmaztunk. Bizonyos esetekben, a minta terhes nőtől származó, nyers, bekoscentrált vízeletmintó volt

A bioreaktoron 2 napon át tápoldatot áramoltattunk, majd & tenyésztett sejtekről azonmód felülőszót gyűjtöttünk. A felüiászót előnyösen szóréssel tisztítottuk. Amennyiben szükséges, a nyers oldatot töményitjük és C4 ssílikagél kromafográfiát végzünk a sejttenyészetböl származó szennyeződések eltávolítására.

A begyűjtőit részlegesen tisztított anyagot ultraszöríük, majd - előnyösen kétszer, és előnyösen eltérő kósiifeteöyek közöli - ioncserélő-kromatográfiát, és fordíioít fázisú HPI.C-t alkalmaztunk. Első DEAE Sepharose ioncserélő lépést, lényegében keresztülfolyásos („Qow-drfoogh”) lépésként végezhetjük el, mely során a nem hCG-fehérjék és a DNS nagy részétől megszabadulhatunk, Az előnyösen C.M Sepharose oszlopon végzett második ioncserélő lépés feC-G-t megkötő lépésként szerepel, amely során eltávolítjuk a visszamaradt ÖNS-t és gszdasejíbói vagy lápóteiatböl származó fehérjeszennyeződéseket. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint e lépés előnyösen 5^vC-on, nátriumfoszfát-pufiferrel (körülbelül pH ő-on) végzett elócióval történik.

Szilika C1S oszlopon végzett fordított fázisó kromatogtófiával hatékonyan távolíthatunk el nyomokban jelenlévő nukieinsavakat és sejttenyészetből származó szennyeződéseket. Az oszlopot előnyösen 2propa»oVTrís-fi»zfái-puffer mozgó fázissal elítéljük. A visszatartott oldatot előnyösen 10 kD .kizárási tartományú aítraszSréssel szűrjük, töményitjük és ammónium-hídrogénksrimnátbaa (pH 8) visszanyerjük. Ért kővetően a koncentrált terméket Sephacryl S2ÖÖ HK mértdkizáfáscs-kmmatogtáfiás oszlopra visszük fel. E lépésben, a még feltehetően nyomokban jelenlévő, sejttenyészetből származó szennyeződések, potenciális aggregátumok és szabad hCG alegységek eltávolítása céljából ammóniom-lüdrogénkarbonátta! (pH S) történő elócióval molekulaméréíen alapuló elválasztást végzünk. Áz ehsátumot 10 kD kizárási tartományú membránokon végzett ultraszűréssel, előnyösen nátriumfosztót-pufferben (pH 7), dializáljuk. Szűrés utón, az ömlesztett tisztított hCG-t előnyösen steril üvegekben, alacsony hőmérsékleten tároljuk.

ΦΦΧΧ

Φ X Φ Φ * χ Φ X X Φ X « φ ♦ *«

Φχ«Φ * Φ Φ * χ «Φ X X * ♦ *

LHÜdg

Reagensek

Ammónia, analitikai minőségű Ammónmm-bidrogénkmb^át, analitikai minőségű (B.P.)

Dmátrróm-brdrogáafoszfát, analitikai minőségű Abszolút, denaturált etanoi

Foszforsav·, analitikai minőségű (Pb, Eur.)

2-propanol» aüslítíkeí. minőségű (Pb. Helv.)

Nátrnankforiá, analitikai minőségű (Pfe. Eor.)

Nátrfora-á&iárogénfoszlát, analitikai minőségű Nátiiumhiárosid szemcsék, analitikai minőségű (Ph. Eur.) 'ÍVifinorecetsav (TPA), HPLC minőségű Tns-(foátwmétíl)atttfooatetán_s analitikai minőségű Tisztítási folyamatot összefoglaló ábra

A sejtienyésztési folyantafoól származó, összegs-Sitött anyagot üsztitottuk, és öt kronrato^áfiás lépésből álló sorozat alkalmazásával betöméuyíteti&L

Az alábbi ábrás (5. táblázat) összefoglaljuk a találmány előnyös megvalósítási módja szerinti r-hCG tisztítási folyamtól leírjuk a kromatográfiás -gyantákat és 82 egyes köztes lépések lényegét.

h táblázat

1. lépés	A SJÖREAKTÖOÓL SZÁRMAZÓ TÁPOLDAT C4 szslika kromatogmSa (az eiuáűun tartalmam az r-hCG-t't Uitmzörés 1.Ö kB kizárási mérethatáré szűrös (a visszamaradt anyag tartalmam az r-bCO-i) ' Ί KONCENTRÁLT NYERS r-hCG ÖSSZEGYŰJTÉSE 1..........
2. lépés	DEAE SEPHAROSE FF (a fel nem kötött frakció tartalmam az r-hCG-t)
3, tépés	CMSEPMOSEEE (az efeátnm fortéimmá az r-bCO-t) . . . .............1. . '........... ..
4. lépés	RP-HPLC S3MA Clt-on (az elnátam tartalmazza az r-bCö-t) UitraszÚrös(10kD)

5. lépés	SEPHACRYL S-200 HR (az eluátum tartalmazza az r-hCG-t) í
	! ÖMLESZTETT r-hCG OLDAT

Az ábrái és a folyamat leírását az alábbiakban részletezzük. A befogási lépésre („capture step, 5. lépés) megadott körülményeket normális esetben rekombináns eredetű nyersanyag esetén alkalmazzuk.

idépésíSsIsgásiJépés)

E lépésben ί I, lépés) előzetes töményítést érünk el és az addigi puffért meghatározott összetételű pufferre cseréljük. E lépést szobahőmérsékleten indítottuk el (Szilika C4 kromaíográfia) és körülbelül -MALon folyattuk. Az előnyős hőmérsékleti tartomány 5±3°C. E lépést a bioreaktor minden egyes termelési ciklusa során végzett begyűjtés esetén egyedileg végeztük el.

.ÜIAbegy:űjtöttanyagJi§ztítása

A biorektorböl frissen gyűjtött tápoldatoí általában először szűréssel tisztítottuk. iXkSziíika C4..kromatográfia

A szűréssel történt tisztítás után, az összegyűjtött anyagot, előzőleg 25 mM-os nátriurafoszfát-puffenrel (pH 7) ekvilibrálí, C4 szilikagél kromatográfiás oszlopra vittük tél. Az előnyös pH-tartomány ő,6 és 7,7 közötti. Az oszlopot 25 xnM-os nátriumfoszfát-pufferrel addig mosták, amíg az UV monitor jele az alapvonalra vissza nem állt. Ezután a terméket 34,2% 2-propanolt (w/w) tartalmazó 25 mM-os nátriumfoszfát-pufferrel eluáltuk.

íiÁilíüSWlSShyfoyégzgttAezeiés

Az oldathoz ammóniát adtunk addig, amíg az 1 M-os végkoncentrációt el nem értük. E keveréket 6 órán át mkubáltuk, majd az oldatot vízzel kétszeresére hígítottuk, és 85%»os íoszforsavval a pl-l-t 7,5-re állítottuk be. Előnyös a 7,5±0,2 pH tartomány.

A 0,05 M náíriumhidrosid oldatban, taszkokban tárolt, lö kD kizárási, mérethatáró membránokat tisztított vízzel addig öblítettük, amíg a pH le nem csökkent körülbelül pH 8-ta.

A terméket betöményítettük és díalízáltnk (10 kD membránon történt ultraszürésse.1) a lö kD-nál alacsonyabb molekulatömegö anyagok és a nyomokban visszamaradt 2-propanol eltávolítása, illetve az ammónia oldat 40 mM-os nátriumfeSzfátra (pH 7,5) kicserélése céljából. Előnyös a ?,5±0,2 pH tartomány.

A membránon visszamaradt végső anyagot olyan mennyiségű 40 mM-os nátriumfoszfátíal vettük fel, hogy a célfehérje koncentrációja 3-15 mg/ml legyen.

Az oldatot ekkor szűrtük és az eredményül kapott koneentrátumot fagyasztva, körülbelül -15°C-on tároltuk.

E kromatográfiás lépés olyan keresztülfolyásos („fiow-üirough”) lépés, amely során a nem hCG-fehétjék és a DNS nagy részétől megszabadulhatunk. Míg a szűrést szobahőmérsékleten végezzük, a kromatográfiás szakasz, azaz amikor a. terméket az oszlopon áramoltatjuk át, hidegszobában történik.

ÍÍlÁíLí-h!Q&jáítífe^

A fagyasztott koncentrátumot felolvasztottuk és összeömőttük. Ugyanazon működő sejtbankból számár zó, különböző számó r-hCG koncentrátumokat öntöttünk össze, és az ebből kivett, ömlesztett r-hCG adagokat processzáltuk. Az összeöntésre kerülő nyers. r-bCÖ koncenttátámok számát a tisztítást folyamatban következő' kromatográfiás lépés maximális fehérjekötő kapacitása alapján (4 mg összfebérje/mg gyanta) határoztuk meg.

φ <

φ « φ φ φ φ * φ

Φ <£ * *

ΦΦΦ ΦΦΦ #*Φ

ΦΦΦ Φ Φ « * φ «« ΦΦ ΦΦΧ

ÜOhtííhs ss&feggl

Áz r-hCG oldatot előnyösen SÍíErőberssídezésesr kérésztől nyomtok át és a szűrőket 40 mM-os nátriomfoszfáttai (pH ?,$} mostuk.

A szőrt és a s?tosáskor nyert oldatot ősszeőntöttők.

A gyengén töltött, dsofiiammo-etfct (DEAE) Sepharose fást Fknv (FF) anioncserélő gyantát tartalmazó oszlopot 40 ss Hl nátriamfoszfáttal (pH 7,5} ekvülbráltok.

Az s'-hCG oldatot felvittük az oszlopra.

Az oszlopot 40 mM~«s sktsiostfosstatul (pH 7,5) ntosfek. A kmoiatográföás folyamatot 280 nm-en tör·' fest spskttofmometriával kővettSk nyomon,

A kezdeti átfolyó oldatot eltávolítóitok egészen sddig, amíg a csúcs eluálódni nem kezdett, Az r-hCG-t tartalmazó, nem kötött frakciót gyűjtöttük.

E ktost?atog.fellás lépésben a gszdasejíböl származó szennyeződések nagy részét távolijuk el. A kromatográfiás lépést közSíbeíüí -hSX-oa végezzük. A hőntomékieítaríömány előnyösen *M3^CC,

Injektálásra alkalmas vizet adfemfc a DEA£ Sepharose FF oszloptól származó ektátomboz és a. pH 6-ra állítottuk be S5%-os .fbssfomawat Előnyös a &fcS,i pH tartomány.

A gyengén tokáit, karfeoximeirl (CM) Sep&amse fest Flow (FF) kationesefélő gyantát tartalmazó oszlopot 28 mM sshriomfeszfetod (pH ó) okvfehfehok. Előnyös a fed), 1 pH (adomány,

Az s'-'hGCi oldatot felvittük az oszlopra.

Az oszlopot 20 mM-os nátnumfoszíáttal (pH ő) mostok. A kromatográfiás folyamatot 288 nm~en tórtéat spektrofotommriával követtok. nyomon.

A tormákét 130 mM-os nátriomfoszSt-pal^mel (pH Ó) eluáltok. Á kezdeti átfolyó oldatot eltávolítottok egészen addig, amíg a csúcs eluálódnl nem kezdett.

Az r-bCG-t tartalmazó teljes csúcsot összegyűjtöttük, E stádiumban a ttotokét igény szerint sgftrhetjök a vitális szennyeződések eltávolítása eéljsböl.

Ezen RP-HFLC kromatográfiás lépessel hatékonyan lávölhbotook el sejheayészetböí származó szennyeződéseket, nnklemsav-maradékekat és eadetoxiaokat. £ lépési 10 ,kí> kizárási mérethatáré szűrőt? végzett ultrassúrés és igény szerint szűrés követ.

Az adagok pH-ját 5-te sülkottok be és 15%-os (vAj végkosceniráció elétésérg az adagokhoz 2-propaaoit adtoito.

A Sztlíka 08 hantával fellőtt oszlopot először 15% (v/v) 2-própanolt tartalmazó 8,5 M~os Tris-ibstoátpvÖerrel. ekvthbráltok.

Az élsó adagot feivihük az oszlopra és a kromatogréflát UV six?k(rofetomeirhvto követtük nyomon.

Az- oszlopot az ekvülbrációa pufferrel mostok.

Ess kővetően & r-.h.Cö-t 1594-25% (tevj 2«ptopaael/ö,5 M Tris-foszfáí lineáris gradienssel (mozgó fázis) eltoltuk.

Amikor s megfelelő csúcsot spektrofetometriával (A^) észtetesk &?, r-hCÖ-ből frakciókat sztotttek. Azokat a frakciókat gyűjtöttük össze, amelyek abssxírtoseiáj» a csúcs emelkedő részén a maximum csúcsmagasság 05%-ánál nagyobb volt illetve a leszálló részén, a maximum esűcsmagasság 30%-ánál volt nagyobb.

A togy r-hCG-t tartalmazó, összegyűjtött frakciót ősszeöntőttSk és azonos memyiségö Injektálásra szolgáló vízzel („teteígr/ór /wcítonWFl) hígítottuk.

A terméket belőméayíteüük és WFl-vel szembe» dializáituk (lő kö membránon végzett nl&aszöfesse?) a 10 kD-tol alacsonyabb molefofistőmegö anyagok és a .'2-prapsaol eltávolítása céljából.

A terméket ezután 0,1 M-o.s amrnóníum-hídmgénkwborsát-paffersel (pH 8) szemben uifraszötéssel dializáhuk.

Az ereámésyúl kapott köztes terméket körülbelül -t-S’C-ott vagy igéay esete» fagyasztva tároltak. Előnyős tárolási hőmérséklet az S*3^CC és a -15%;-sl egyenlő vagy az alatti hőmérséklet, megfelelően.

% jtoé8<Mtotektete:toate.te^

E més'eíkteáítoos-.texímatögteilés lépéssel hatékonyan távolíthatunk «I sejttenyészetből származó, nyomokban jelenlévő szeoayezbdésoket, potenciális aggregátorokat és/vagy szabad alegységeket. E kromatográfiás lépést 10 kD kizárási métohaterü szőrön végzett «lüaszürés követ. A Sephacjyl S-2ÖÖ HR kromatográfiás és a lő kD kizárási méntfeahtó sx&& történő ufemszörést 5°C-«n végezzük. Előnyős az S-toÁI hömérséktetortoíírfey.

ŰiM&«^Ítorásos^^wgiáfi3S^g»rylJ_r^0(JR.gyaglto

A Scpkaeryl S-2Ő0 K& gyantával töltött oszlopot 0,5 M-os asnaömum-biárogénkarbonát-ps^eíTel (pH 8} ektekbráiiak. Előnyös a 8*2 pH-tartomáay.

Az r-hOG oldatot az oszlopra felvltálk és 0,5 M~es srömóniam-biíkogóökarbosáópateeaei (pH 8} eluálhmk. Eiősyős a fi±2 pH-tartomány.

Az r-bCG frakciót a csúcs kezdetétől a leszálló szakaszban a este maximális magasságának 50%-nsk megfelelő jelzésig gyűjtöttük.

fíöJOZMsWisésfe

A 0,05 M nátriumblároxid oldalban, tasakokhas tárolt 1.0 kD kizárási métethaíárú membránokat WFI-vel addig öblítettük, amíg a pH körülbelül pH 8-ra le nem csökkeni.

A terméket betőményltettük és WFÍ-vel szemben (altraszúréssel) dializáituk,

A termékei (ultraszűréssel} 0,01 M-os mM nátrimnioszfet-puffonrel (pH ?} szemben dí&lízáhuk, és fehérje végső koncentrációját 3,5 mg/ml-xe állítottak be.

Az eredményül kapott r-hCG végső ómlestectt oldatot el&yöseo támasztva, körülbelül -1 S’C-on tároltuk. gvsatek

Az alábbi iommatográfiás gyantákat sikatew&atjsk a toztitesi folyamaiban (ekvivalens gyanták is alkabnazkatők:

1. lépés	Steiika C4S 25Ö Angsfrom·-- Sö pm	(Matróz®, Miííipore)
.2, lépés	DÉAB Sepharose FF	i'FkiH'Í»sci»)
3.tep«s	CM Sepbarose FF	(PhsmasU)
4. lépés	Stoliks C18,300 Áagsfrom - Í5-2Ő pm	(Vydas)
5. lépés	Sephacryt S-2Ö0 HR	(Phsmates)

ΦΦ «ΧΦΦ » φ * * φ

Φ X ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ »««« φ* * * φ «φ φφ φ«φ

Az említett szállítók az alábbiak:

Ame«h&m Pharmacia Bioteoh,

Björkg&taa 30

S-751 84 Uppsala

Svédország

Mii lipom Cöiponstioö

Cherry HillDrive

Danvets, MA Ö1923

USA

Vydac, tóé Sepamtíons Group,

17434 Mojave St ííespem»CA 92345 USA teásatek

SP&FAOI

Az r-hCU relatív molekulatömegét a tólátmtósy szerinti tisztítási eljárást követően SDS-PAGE-vel hatómat meg ismert molekulatömegő, standard tóhérjék segtiségévsí.

Nem redukáló SDS-PAGB után .követed Coömassie bniUssí kékkel végzek festést követte az r-hCG egyszeres, kűtólhsfet ?ö kD (63-75 kD tartományban) molekulatömegnek megfelelő széles sávként látszott, A sáv identitását Western blotíoláss&l igazoltók,

A találmány szerinti eljárással tisztítóit kttíönhözd r~bCO ssrzsok biológiai aktivitásait s 2, táblázat tetatnwaa. A Sátóriekonoenlráelól spektmfoiometóávai (276,5 sm, 8=0,610} határoztakmeg.

Azr-bCG posp&tómmok átlagos speetSkas aktivitása előnyösen magas, körölbeföl 25ÖÖ0 NEöng.

3, .táblásat

S'tóCG 88SZS	Speeifífeas bfeakriritás (NE/mg)
BUBA 900 Ϊ	24427
BCriA 9902	26863
BUBA 9003	25630
BUBA 9904	27152
BCEA9905	23729

Ké^ífetifeyek

A tóiábnány szerinti, uagymértótóm tisztított rtósorahínáas hCG-val tstínd folyékony és mind pedig &

gyasztva-szárstotí kássátótóoyeket. fejiesztótfenk. ki.

* ϊ *

*«·* ί

*·*'*

DIN 2R íteiákbstö két ΙδΟδΟ NE/tnI köscmíüeiéjü, folyékony készitssényk állitoWök elő adalékanyagként manóitól vagy szacharóz aJfcalmazásáwl és ezekkel 50, 40,25 ás 4Xi-on stabilitási teszteket végeztünk.

?kz összetételeket a 3. és 4, táblázat tartalmazza.

2.·. láMteé

összetevő	Egység
ís-feCG	NE/mi	10ÖÖ0
Szacharóz	mg/ml	tbfeé
Örte-lbszfössav	tng/ssí	0,90
Náöinmhídroxid		PH ?.O beállításához szOkséges ratamyiségbe»

idOfegt

Összetevő	Egység
r-hCö	Nibmí	1Ó0Ö0
Mamától	mg/ml	54,6
örto-foaafbísav	mg/ml	0,98
Náüiöscfihiüroxíá		PH 7,0 beállításához szükséges nxmsyiségben

Töltési térfogat: 0,5 ml

A bioesszévd, SE/HFLC és RR-HRLC alkalmazásával végzett stabilitási teszt ereátaéaysi szériát a jsatmltólal készeit készítmény a szacharózzal készükhöz képest stabilabb. A készítményt előnyöse» hötve keli tárolni a fehérjék osiááeíápfcak és a szabad alegységek kisfekulésánek minimalizálása céhábol,

DÍN 2R fiolában SOOö NE/raí koneeatrációjó,, &§>»szó-szfótott készítményt áílőottnnk elő adalékanyagként szacharóz alkalmazóval és ezzel 50, 40,25 és 4*C-o& stabilitási teszteket végeztünk;

Az összetételt az 5. táblásat tartalmazza.

SJáblfete

összetevő	Egység
texhCÖ	N'E/ml	SŐÖQ
Szacharóz	mg/ml	30
örte-foszíorsav	mg/ml	0,98
Nátóombhboxid	______	PH ?,0 beáíMtésSboz szükséges mmmyiséghe»

A bioewüvcl, SE/HPLC és RP-HPLC alkalmazóval végzett stabilitási teszt eredményei szerint, e fitgyasztva-sz&dtott készüsüw 40 és SÍPC-os legalább 19 b&m át stsbü mamát

A 25 és 4^!íC-ort_s. 6 bénspig végzett stabilitási tesztben az aktív összetevő me áegmdátócbb:.

Claims (7)

1. SZÁBAOAIMI IGÉNYPONTOK

   1, Eljárás refcömbiaáas &CG előállítására mísíából, amelynek spectfikas bio&tóvhása 23ŐÖÖ-28000 NE'stg, «listákból történő tisztítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza;

   (a) a mintát szilikagél kromatográfiás oszlopos keresztül elnáljnk;

   (b) a mintái ioaeserélő-kromatográfiás oszlopos keresztül elnáljnk;

   (o) sgy második ioncserélő-kromatográfiás oszlopos keresztül ekíáltmk;

   (d) fordított felső HPLC oszlopos keresztül olttálosk; és (e) az elaáfeaaot méretidzArásos-kromatográfífe oszlepra visszük fel,
2. 2, Az 1, igénypont szotínd eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:

   (a) & mlmát sziükagél kromatográfiás oszlopon keresztül elnáljnk;

   (b.i DRAE Sepharose i<mcse«dlő~kros«iiográfiás oszlopos keresztül elaáhmk;

   (o) CM Sepharose ioncserélő-kromatográfiás oszlopos keresztül ekrákmk;

   (d) Szilika €18 fordított fázisú HPLC oszlopon keresztül etaákmk; ás (e) az nlnátosnot Seph&eryi méteskszáráros-kroWögráSás oszlopra visszük M
3. 3 A 2. igénypont. szefárd eljárás, asnolylsns a DBAE Sepharose ioscserélő gyantán át történő elácíöt nátriamfi^?.lSt-p»®sAe» (pH 7,5} végezzük.
4. 4. Az 2. 3, igénypont szerinti eljárás, amelyben a CM. Sepharose ioncserélő gyantás át történő elóciói aáírramfö8zí&t-tm<&sbe& (pH ó) végezzük.
5. 5. Az K igájwoötefe bármelyike szfentí eWH amelybe» a (d) iöráitod fázisé HPLOlépést 2propsaol/Tm-fi^zSt-pwfier mozgó fázissal végszsilk,
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti djátás, amelybe» az (o) méretkízárisos kromatográfiás lépést ammőaiamdüdrog^zkarbos^-pafer mozgó fázissal végezzük,
7. 7. Az K igénypontok bármelyike szénát! eljárás, amelyben a sdata. CHO-sejftesyészeiből származó tápközeg,