BRPI0108556B1 - Processo para purificação de gonadotropina coriônica humana recombinante (hcg). - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de invenção para "PROCESSO PARA PURIFICAÇÃO DE GONADOTROPINA CORIÔNICA HUMANA RE-COMBINANTE (HCG)".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um processo para a purificação de Gonadotropina Coriônica, em particular à purificação de Gonadotropina Coriônica humana recombinante (hCG) a partir de uma amostra de hCG re-combinante bruta. O método compreende o uso de cromatografia de troca iônica e HPLC de fase inversa.

Gonadotropina coriônica é um hormônio produzido pela placenta e tradicionalmente obtida da urina de mulheres grávidas. O hormônio é um heterodímero que consiste em subunidades α e β ligadas não-covalentemente. Seus efeitos são predominantemente aqueles do hormônio de luteinização de gonadotropina.

Gonadotropina coriônica é dada a mulheres para induzir ovula-ção após desenvolvimento folicular ter sido estimulado com hormônio estimulante de folículos ou gonadotropinas humanas da menopausa no tratamento de infertilidade anovulatória devido a concentrações de gonadotropinas ausentes ou baixas. Uma única dose de 5.000 a 10.000 unidades é dada por meio de injeção intramuscular para imitar o pico de ciclo médio de hormônio de luteinização que normalmente estimula ovulação. Gonadotropi-na coriônica é também dada em conjunto com menotrofina e às vezes também com citrato de clomifeno como adjunto a procedimentos de fertilização in vitro e outras técnicas de concepção assistida que envolvem superovula-ção e coleta de oócitos. Em machos gonadotropina coriônica tem sido usada no tratamento de criptorquidismo de pré-puberdade. Os regimes variam amplamente, mas as doses usualmente variam de 500 a 4.000 unidades três vezes por semana através de injeção intramuscular.

Gonadotropina coriônica é também administrada para infertilidade em machos associada a hipogonadismo hipogonadotrófico. Novamente, há considerável variação no regime de dosagens, e as doses têm variado de 500 a 4.000 unidades duas a três vezes por semana. Um agente com ativi- dade estimulante de folículos tal como menotrofina é freqüentemente adicionado para possibilitar espermatogênese normal. Para oligospermia, poderão ser empregadas doses de até 3.000 unidades de gonadotropina coriônica semanalmente com menotrofina ou uma outra preparação estimulante de folículos. No tratamento de puberdade atrasada associada a hipogonadismo em machos, uma dose de 500 a 1.500 unidades é dada duas vezes por semana; a dose deve ser titulada contra concentração de testosterona no plasma.

Diferentes métodos têm sido usados para isolar e purificar hCG de amostras de urina bruta (Birken e outros, Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Sakakibara e outros, Chem. Pharm. Bull., 35(5): 1414-6, 1990; Donini e outros, Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). Recentemente, um método diferente de cromatografia de afinidade, denominado cromatografia de afinidade por filtração em membrana, foi desenvolvido e aplicado para purificar hCG de urina (Xu e outros, Expressão e purificação de proteínas, 16: 221-3, 1999). O método evita o uso de Sefarose ativada por BrCN como fase sólida para a coluna de cromatografia de afinidade e representa uma variação dos métodos de purificação usuais de hCG por meio de cromatografia de afinidade a partir de amostras de urina. A imunoatividade da hCG purificada de acordo com esse método é de 8.554 Ul/mg. hCG recombinante apresenta a vantagem de ser desprovida de outros hormônios de gonadotropina e de contaminantes de origem humana, e, mais especificamente, daqueles presentes em urina humana. A preparação bruta de hCG recombinante contém, entretanto, todas as outras proteínas e contaminantes da célula usada em sua produção recombinante e um método para atingir uma pureza absoluta de Gonadotropina Coriônica recombinante é altamente desejável Sumário da Invenção Verificamos agora que uma preparação bruta de hCG, que deriva de uma amostra concentrada de um meio de cultura obtida após o processo recombinante ou de um concentrado bruto de urina de mulheres grávidas, pode ser purificada tal que a hCG resultante seja praticamente livre de proteínas ou outros contaminantes contidos na preparação bruta de hCG. O processo de purificação baseia-se no uso de cromatografia de troca iônica e HPLC de fase inversa. O uso adicionalmente possível de uma coluna de exclusão de tamanho permite a remoção de quaisquer traços residuais de contaminantes. Resultados ótimos são obtidos quando pelo menos duas etapas de cromatografia de troca iônica são realizadas. O processo da invenção pode ser utilizado para a purificação de hCG recombinante a partir de uma preparação bruta do meio de cultura derivado do processo recombinante. A r-hCG é obtida com um alto grau de pureza e alta bioatividade específica (na faixa de 23.000-28.000 Ul/mg), praticamente livre de proteínas de Soro Fetal Bovino (FBS), se presentes no meio de cultura, e de ácidos nucléicos ou outros contaminantes contidos nas células hospedeiras usadas no processo recombinante. O processo da invenção pode ser utilizado também para a purificação de hCG urinária, partindo de um concentrado bruto de urina de mulheres grávidas, e para a purificação de CG de outras espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, bovinos, eqüinos, suínos, ovinos e símios.

Trata-se de um objetivo da presente invenção proporcionar um processo para purificação de hCG de uma amostra, compreendendo esse processo o uso de cromatografia de troca iônica e HPLC de fase inversa. O processo compreende as etapas de submeter a amostra a cromatografia de troca iônica e submeter o eluato a HPLC de fase inversa. Uma etapa adicional de aplicar o eluato a uma coluna de exclusão de tamanho poderá adicionalmente ser realizada.

As duas etapas de cromatografia de troca iônica são preferencialmente realizadas sob condições diferentes a fim de obter resultados ótimos do processo de purificação. Uma modalidade preferida do processo da invenção compreende as etapas de: (a) eluir a amostra através de uma coluna de cromatografia de sílica; (b) eluir através de uma coluna de cromatografia de troca iônica de DEAE Sefarose; (c) eluir através de uma coluna de cromatografia de troca iônica de CM- Sefarose; (d) eluir através de uma coluna de HPLC de fase inversa de Sílica C18; (e) eluir através de uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho em Sefacrila.

Em uma modalidade preferida da invenção, eluição através da coluna de troca iônica de DEAE Sefarose é realizada em tampão de fosfato de sódio sob cerca de pH 7,5. Eluição através da coluna de troca iônica de CM-Sefarose é preferencialmente realizada em tampão de fosfato de sódio sob cerca de pH 6. A etapa de HPLC de fase inversa (d) é preferencialmente realizada com 2-propanol/tampão de Tris-fosfato como fase móvel. A CG da presente invenção é preferencialmente CG humana e ainda mais preferencialmente é hCG recombinante, que deriva do meio de cultura de células CHO usadas no processo recombinante.

Trata-se de um objetivo adicional da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de hCG recombinante purificada conforme preparada pelo processo recombinante descrito acima, juntamente com excipientes adequados. Um exemplo de excipiente adequado é sacarose, que ajuda na estabilização do produto liofilizado. A composição farmacêutica de hCG recombinante é particularmente adequada para administração subcutânea. Descrição Detalhada da Invenção A invenção proporciona um método para a purificação de hCG, em particular para a purificação de hCG recombinante a partir de uma preparação bruta do meio de cultura do processo recombinante. A r-hCG é obtida com um alto grau de pureza e alta bioatividade específica (na faixa de 23.000-28.000 Ul/mg), praticamente livre de proteínas de Soro Fetal Bovino (FBS) que estão presentes no meio de cultura e de ácidos nucléicos ou outros contaminantes contidos nas células hospedeiras usadas no processo recombinante. A invenção destina-se a uso com materiais biológicos, particularmente misturas brutas que contêm hCG e outras proteínas contaminantes referidas nesta invenção como amostras de material de partida. Os exemplos descritos em detalhes abaixo usam amostras de material de partida que contêm r-hCG obtida de meio sobrenadante de cultura de células de um bi-orreator. Alternativamente, a amostra é urina bruta concentrada de mulheres grávidas. A amostra é constituída coletando meio sobrenadante novo de cultura de células em perfusão através de um biorreator durante dois dias. Preferencialmente o sobrenadante é clarificado por filtração. Se necessário, a solução bruta é concentrada e submetida a cromatografia em C4 sílica para remover contaminantes derivados da cultura de células. A colheita semipurificada, após ultrafiltração, é então submetida a cromatografia de troca iônica, que é preferencialmente realizada duas vezes, e, preferencialmente, sob condições diferentes, e a HPLC de fase inversa. Uma primeira etapa de troca iônica em DEAE Sefarose poderá ser realizada, essencialmente atuando como uma etapa de "escoamento" ("flow-through") de hCG, em que uma grande parte das proteínas não-hCG e DNA são eliminados. Uma segunda etapa de troca iônica, preferencialmente através de uma coluna de CM-Sefarose, atua como etapa de ligação de hCG e remove DNA residual e contaminantes de células hospedeiras ou proteínas do meio. Em uma modalidade preferida essa etapa é realizada a cerca de 5°C, eluindo com tampão de fosfato de sódio sob cerca de pH 6.

Cromatografia de fase inversa em coluna de Sílica C18 é eficaz em remover quantidades de traço de ácidos nucléicos e contaminantes derivados de cultura de células. A coluna é preferencialmente eluída com 2-propanol/tampão de Tris-fosfato como fase móvel. A solução de retentato é preferencialmente então submetida a ultrafiltração de corte de 10 kD, concentrada e pode ser recuperada com hidrogenocarbonato de amônio pH 8. O produto concentrado pode por conseguinte ser aplicado a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho em Sephacryl S200 HR. Nessa etapa, uma separação baseada em tamanho molecular é obtida eluindo com hidrogenocarbonato de amônio pH 8 para remover quantidades de traço ainda possíveis de contaminantes derivados de cultura de células, agregados potenciais e subunidades de hCG livres. O eluato pode então sofrer uma diálise por ultrafiltração em membranas com corte de 10 kD, preferencialmente em tampão de fosfato de sódio, pH 7. Após filtração, a massa de hCG purificada é preferencialmente armazenada em frascos estéreis à baixa temperatura.

Exemplo 1 Reagentes: Amônia, grau analítico Hidrogenocarbonato de amônio, grau analítico (B.P.) Hidrogenofosfato de dissódio, grau analítico Etanol desnaturado absoluto, Ácido fosfórico, grau analítico (Ph. Eur.) 2-propanol, grau analítico (Ph. Helv.) Cloreto de sódio, grau analítico (Ph. Eur.) Diidrogenofosfato de sódio, grau analítico Péletes de hidróxido de sódio, grau analítico (Ph. Eur.) Ácido trifluoroacético (TFA), grau HPLC Tris-(hidroximetil)aminometano, grau analítico Diagrama de fluxo resumido do processo de purificação Material de colheita derivado do processo de cultura de células é purificado e concentrado através de uma série de cinco etapas cromatográfi-cas. O diagrama de fluxo seguinte (Tabela 1) resume uma modalidade preferida do processo de purificação de r-hCG, sublinhando as resinas da coluna cromatográfica e os princípios de operação de cada uma das etapas intermediárias.

Tabela 1 Diagrama de fluxo resumindo o processo de purificação de r-hCG

Um diagrama de fluxo e descrição de processo detalhados são fornecidos abaixo. As condições fornecidas para a etapa de captura (etapa I) são aquelas que são normalmente aplicadas quando o material bruto é de origem recombinante.

Etapa I (Etapa de captura) Nessa etapa (Etapa I), uma concentração preliminar é obtida e o tampão é mudado para ser de composição controlada. Essa etapa é iniciada à temperatura ambiente (cromatografia em Sílica C4) e em seguida continuada a cerca de +5°C. Uma faixa preferida de temperaturas é de 5 ± 3. Ela é repetida individualmente para cada colheita durante o ciclo de produção do biorreator. (i) Clarificação de colheitas O meio de cultura novo coletado do biorreator é usualmente primeiro clarificado por filtração. (ii) Cromatografia em Sílica C4 Após clarificação, as colheitas são carregadas em uma coluna de cromatografia em C4 sílica, que foi previamente equilibrada em fosfato de sódio 25 mM, pH 7. Uma faixa de pH preferida é de 6,6 a 7,7. A coluna é lavada com fosfato de sódio 25 mM até o sinal monitor de UV retorna à referência. O produto é então eluído com propanol a 34,2% (p/p) 2-propanol em fosfato de sódio 25 mM. (iii) Tratamento com amônia Amônia é então adicionada à solução para atingir uma concentração final de 1 M. Essa mistura é incubada por 6 horas. Em seguida a solução é diluída duas vezes com água e o pH é ajustado em 7,5 usando ácido fosfórico a 85%. Uma faixa de pH preferida é de 7,5 ± 0,2. (iv) Concentração e diálise As membranas de corte de 10 kD armazenadas em hidróxido de sódio 0,05 M entre bateladas são rinsadas com água purificada até o pH de-crescer até aproximadamente 8. O produto é concentrado e dialisado (por ultrafiltração na membrana de 10 kD) para remover material que apresenta peso molecular inferior a 10 kD e para eliminar traços de 2-propanol e mudar a solução de amônia para fosfato de sódio 40 mM, pH 7,5. Uma faixa de pH preferida é de 7,5 ±0,2. O retentato final é recuperado das membranas com fosfato de sódio 40 mM a fim de atingir a concentração alvo de proteína de 3 a 15 mg/ml. A solução é por conseguinte filtrada e o concentrado resultante é armazenado congelado a cerca de -15°C.

Etapa II (Filtração e Troca lônica em Cromatoqrafia em DEAE Sefarose FF) Essa etapa de cromatografia é uma etapa de "escoamento" ("flow-through") de r-hCG em que uma grande parte das proteínas não r-hCG e ácidos nucléicos são eliminados. Embora a filtração seja realizada à temperatura ambiente, o estágio de cromatografia, onde produto atravessa a coluna, é realizado em uma temperatura fria.

(i) Descongelamento e acumulação das colheitas brutas concentradas de r-hCG

Os concentrados congelados são descongelados e acumulados. Uma batelada de r-hCG em massa purificada é processada a partir de um acúmulo de número variável de concentrados brutos de r-hCG produzidos do mesmo banco de células de trabalho. Os critérios para o número de concentrados brutos de r-hCG acumulados baseiam-se na capacidade máxima de ligação de proteína da etapa cromatográfica seguinte no processo de purificação (4 mg do total de proteína/mg de resina). (ii) Clarificação por filtração A solução de r-hCG é preferencialmente passada através de um aparelho de filtros e os filtros lavados com fosfato de sódio 40 mM, pH 7,5. A solução filtrada e as lavagens são acumuladas.

(iii) Cromatografia de troca iônica em DEAE Sefarose FF A coluna, recheada com uma resina de troca aniônica fracamente carregada, dietil amino etano (DEAE) Sefarose de Fluxo Rápido, é equilibrada com fosfato de sódio 40 mM (pH 7,5). A solução de r-hCG é carregada na coluna. A coluna é alimentada com fosfato de sódio 40 mM, pH 7,5. O processo cromatográfico é monitorado por espectrofotometria a 280 nm. O efluente condutor é descartado até o pico começar a eluir. A fração não-ligada que contém o r-hCG é então coletada.

Etapa 111 (Cromatografia em CM Sefarose FR

Nessa etapa cromatográfica, uma grande parte dos contami-nantes das células hospedeiras é removida. A etapa cromatográfica é realizada a cerca de +5°C. Uma faixa de temperaturas preferida é de 5 ± 3.

(i) Diluição do eluato de DEAE Sefarose FF Água para injeção é adicionada ao eluato de DEAE Sefarose FF e o pH ajustado em 6 usando ácido fosfórico a 85%. Uma faixa de pH preferida é de 6 ±0,1.

(ii) Cromatografia de troca iônica em DEAE Sefarose FF A coluna, recheada com uma resina de troca catiônica fracamente carregada, Carboximetil (CM) Sefarose de Fluxo Rápido, é equilibrada com tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6). Uma faixa de pH preferida éde6±0,1. A solução de r-hCG é carregada na coluna. A coluna é lavada com tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 6. O processo cromatográfico é monitorado por espectrofotometria a 280 nm. O produto é eluído usando tampão de fosfato de sódio 130 mM, pH 6. O efluente condutor é descartado até o pico começar a eluir.

Todo o pico contendo r-hCG é coletado. O produto pode ser opcionalmente filtrado nesse estágio para remover contaminantes virais.

Etapa IV (RP-HPLC em Sílica C181 Essa etapa cromatográfica de RP-HPLC é eficaz em remover quantidades de traço de contaminantes de cultura de células, resíduos de ácidos nucléicos e endotoxinas. Ela é seguida por uma ultrafiltração de corte de 10 kD e filtração opcional. (i) Preparação de alíquotas O pH das alíquotas é ajustado em 5 e 2-propanol é adicionado até uma concentração final de 15% (v/v). (ii) Cromatografia de RP-HPLC em Sílica C18 A coluna, recheada com uma resina de Sílica C18, é primeiro equilibrada em 2-propanol a 15% (v/v) em tampão de Tris-fosfato 0,5 M. A primeira alíquota é carregada na coluna e a cromatografia é monitorada por espectrofotometria de UV. A coluna é lavada com o mesmo tampão de equilíbrio.

Eluição da r-hCG é subseqüentemente realizada com um gradiente linear de 2-propanol/tampão de Tris-fosfato 0,5 M como fase móvel de 15% a 25% (v/v). A r-hCG é fracionada quando o pico correspondente é detectado por espectrofotometria (A28o)· As frações cuja absorbância é maior que 65% da altura máxima do pico na parte ascendente e maior que 20% da altura máxima do pico na parte descendente são acumuladas.

Os quatro acúmulos contendo r-hCG são então reunidos e diluídos em um volume equivalente de Água Para Injeção (WFI). O produto é concentrado e dialisado (por ultrafiltração em uma membrana de 10 kD) contra WFI para remover material que apresenta peso molecular inferior a 10 kD e para eliminar 2-propanol. O produto é em seguida dialisado por ultrafiltração contra tampão de hidrogenocarbonato de amônio 0,1 M, pH 8. O intermediário resultante é armazenado a cerca de +5°C ou congelado se requerido. Temperaturas de armazenamento preferidas são 5 ± 3°C e igual ou abaixo de -15°C, respectivamente.

Etapa V (Cromatoqrafia de exclusão de tamanho em Sephacryl S-200 HR) Essa etapa cromatográfica de exclusão de tamanho é eficaz em remover quantidades de traço de contaminantes derivados de cultura de células, agregados potenciais e/ou subunidades livres. Ela é seguida por uma ultrafiltração de corte de 10 kD. As etapas de Sephacryl S-200 HR e de ultrafiltração de corte de 10 kD são realizadas a cerca de +5°C. Uma faixa de temperaturas preferida é de 5 ± 3°C.

(i) Exclusão de tamanho em Sephacryl S-200 HR A coluna recheada com resina Sephacryl S-200 HR é equilibrada com hidrogenocarbonato de amônio 0,5 M (pH 8). Uma faixa de pH preferida é de 8 ± 0,2. A solução de r-hCG é carregada na coluna e a eluição é iniciada usando hidrogenocarbonato de amônio 0,5 M, pH 8. Uma faixa de pH preferida é de 8 ± 0,2. A coleta da fração de r-hCG é iniciada a partir do iní- cio do pico e dura até a marca de 50% da altura máxima do pico na parte descendente do mesmo ser atingida.

(ii) Ultrafiltração de corte de 10 kD

Membranas de corte de 10 kD armazenadas em hidróxido de sódio 0,05 M entre bateladas são rinsadas com WFI até o pH decrescer até aproximadamente 8. O produto é concentrado e dialisado (por ultrafiltração) contra WFI. O produto é em seguida dialisado (por ultrafiltração) contra tampão de fosfato de sódio 0,01 M, pH 7, e a concentração final de proteína é ajustada para atingir uma concentração-alvo final de 3,5 mg/ml. A solução em massa final de r-hCG resultante é preferencialmente armazenada a cerca de -15°C.

Resinas Cromatoqráficas As seguintes resinas cromatográficas poderão ser empregadas no processo de purificação: Resinas equivalentes podem também ser empregadas.

Etapa I: Sílica C4, 250 angstròms - 50 pm (Matrex®, Millipore) Etapa II: DEAE Sepharose FF (Pharmacia) Etapa III: CM Sepharose FF (Pharmacia) Etapa IV: Sílica C18, 300 angstròms - 15 - 20 pm (Vydac) Etapa V: Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) Os fornecedores usuais são: Amersham Pharmacia Biotech, Millipore Corporation Bjõrkgatan 30 17 Cherry Hill Drive S-751 84, Uppsala Danvers, MA 01923 Suécia EUA

Vydac, The Separations Group, 17434 Mojave St.

Hesperia, CA 92345 EUA

Resultados • Peso molecular e tamanho SDS-PAGE O peso molecular relativo da r-hCG obtida após o método de purificação da presente invenção foi determinado por SDS-PAGE contra proteínas padrões de peso molecular conhecido.

Formação de manchas com azul brilhante de Coomassie após SDS-PAGE não redutor revelou uma única banda larga para o heterodímero de r-hCG sob peso molecular de aproximadamente 70 kD (faixa de 65-75 kD). A identidade da banda foi confirmada por Western blotting. • Atividade Biológica Atividade Biológica de diferentes bateladas de r-hCG após purificação com o método da presente invenção é registrada na Tabela 2. A concentração de proteína foi determinada por espectrofotometria a 276,5 nm, a=0,616. A atividade média específica da preparação de r-hCG é particularmente alta, equivalendo a cerca de 25.000 lU/mg.

Tabela 2 • Formulações Formulações tanto líquidas quanto secas por congelamento foram desenvolvidas com a hCG recombinante altamente purificada da presente invenção.

Formulação Líquida Duas formulações líquidas a 10.000 Ul/ml foram preparadas em frascos DIN 2R usando manitol ou sacarose como excipiente e submetidas a testes de estabilidade a 50, 40, 25 e 4°C. A composição é registrada nas tabelas 3 e 4.

Tabela 3 Volume de enchimento: 0,5 ml Tabela 4 Volume de enchimento: 0,5 ml Os resultados dos testes de estabilidade, realizados através de Bioensaio, SE/HPLC e RP-HPLC, mostraram que a formulação com manitol era mais estável com relação à formulação com sacarose. Condições de armazenamento refrigerado foram preferencialmente exigidas para minimizar a oxidação da proteína e formação de subunidades livres.

Formulação seca por congelamento Uma formulação seca por congelamento sob uma concentração de 5.000 IU foi preparada em frascos DIN 2R para testes de estabilidade a 50, 40, 25 e 4°C, usando sacarose como excipiente. A composição é registrada na tabela 5.

Tabela 5 Os resultados dos testes de estabilidade, realizados através de Bioensaio, SE/HPLC e RP-HPLC, mostraram que essa formulação seca por congelamento era estável a 40 e 50°C por pelo menos 19 semanas.

Os testes de estabilidade a 25 e 4°C foram realizados até 6 meses, não indicando nenhuma degradação da substância ativa.

Claims (7)

1. Processo para purificação de gonadotropina coriônica humana recombinante (hCG) a partir de uma amostra contendo hCG, caracterizado pelo fato de que compreendendo as etapas de: (a) eluir a amostra através de uma coluna de cromatografia de síli-ca; (b) eluir a amostra através de uma cromatografia de troca iônica; (c) eluir através de uma segunda coluna de cromatografia de troca iônica; (d) eluir através de uma HPLC de fase inversa; e (e) aplicar o eluato a uma cromatografia de exclusão de tamanho.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) eluir a amostra através de uma coluna de cromatografia de síli-ca; (b) eluir a amostra através de uma coluna de cromatografia de troca iônica de DEAE Sefarose; (c) eluir através de uma coluna de cromatografia de troca iônica de CM-Sefarose; (d) eluir através de uma coluna de HPLC de fase inversa de Sílica C18; (e) aplicar o eluato à cromatografia de exclusão de tamanho em Se-facrila.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a eluição através de resina de troca iônica DEAE Sefarose é realizada em tampão de fosfato de sódio sob pH 7,5.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a eluição através de resina de troca iônica CM-Sefarose é realizada em tam-pão de fosfato de sódio sob pH 6.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é realizada com 2-propanol/tampão de Tris-fosfato como fase móvel.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) é realizada com tampão de hi-drogenocarbonato de amônio como fase móvel.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a amostra é um meio de cultura de células CHO.