CN103288950A - 改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种研究柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法，大大提高了HCG的收率和效价。技术方案是采用精品上柱工序用最佳配比度的洗涤液、洗脱液的浓度去除可见杂质，解决原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题，通过增加洗涤液的浓度的方法来去除杂质低盐洗涤，高盐洗脱高效分离。在保持“HCG”生物活性稳定条件下，最后测得产品效价由原来的2500单位提高到现在的5000单位以上。放大生产效价同样能达到5000，极大的满足了国内外客户的需要，增强了企业竞争力。

Description

改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质，解决使用原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题，提高了分离度。 

背景技术

绒促性素(Chorionic Gonadotrophin)系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素，具有类似黄体生成素的功能。绒促性激素是从受精卵着床第1天，即受孕的第8天开始，由胎盘滋养层合体细胞分泌的。受孕后第20天尿中可测得HCG，当妊娠45天时，尿中HCG的浓度升高，60-70天时达到高峰。此后逐渐下降，到妊娠第18周降至最低水平，分娩后4天左右消失。 

临床主要用于男性垂体机能不足所致的性机能过低症和隐睾症，用于由黄体功能不全引起的功能性子宫出血病和习惯性流产。与自孕马血清、绝经期妇女尿中提取的促性激素合用，可诱发排卵，治疗不育症，亦可用于皮肤搔痒症、神经性皮炎等。 

国际上从20年代就开始研究，1927年Zondek和Ascbheim首先发现妊娠妇女尿中存在着促性腺激素，1936年Brown和Venning找到在妊娠第60-80天，尿中绒促性素分泌达到最高峰。1928年Zondek和Ascbheim首先用乙醇沉淀法，从孕妇尿中取得了活性物质，其他研究者则进行应用吸附剂从尿中直接吸附绒促性素的研究，这包括1932年Katzman和Doisy用苯甲酸吸附法，1943年Katzman等人用人造沸石层析吸附法，1954年Loraine和Brown用高岭土吸附法，1959年难波修一等人用离子交换树脂吸附法等，用这些方法所取得的绒促性素再用各种纯化方法进行纯化。 

本发明依据绒促性素是糖蛋白激素，分子中的唾液酸组份对其生物活性免受破坏具有保护作用对这一特点进行攻关，突破了高速冷冻 离心、DEAE吸附分离杂蛋白、高-低盐反抽纯化等技术难点，独创了柱分离、柱平衡提纯技术，在保持“HCG”生物活性稳定条件下，使HCG生物活性提高并稳定在5000iu/mg以上，收率则从47％-50％一举提高到90％以上，并于1999年11月通过青岛市科学技术委员会组织的专家组鉴定。 

发明内容

本发明公开了一种研究柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法，改进原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题，通过增加洗涤液的盐度的方法来去除杂质低盐洗涤，高盐洗脱高效分离，大大提高了HCG的收率和效价。 

在发明的技术方案中，所述HCG制备工艺路线如下： 

1粗制品生产工艺 

尿液检查、吸附、脱附、干燥后的HCG粗品。 

2高盐抽提 

2.1高盐抽提液的配制：0.1mol/L醋酸钠，0.015mol/L无水氯化钙，0.5mol/L氯化钠，加纯化水搅拌溶解，滴加冰醋酸，调pH至5.1；然后加95％乙醇，使乙醇终浓度为50％，搅拌混匀，置8-12℃保存。 

2.2取上述粗制品，加高盐抽提液，在低温8～12℃条件下搅拌，静止过夜；次日虹吸上清液；向渣子内加高盐抽提液，在低温8～12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液；合并二次上清液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌30分钟，置低温8～12℃静止过夜；次日，虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用少量工业丙酮洗涤，置离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用工业五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后即为高盐抽提干粉。 

3低盐反抽 

3.1低盐反抽液的配制：0.1mol/L醋酸钠加纯化水搅拌溶解，滴加冰醋酸，调pH至4.8；然后加95％乙醇，使乙醇终浓度为50％，搅拌混合均匀，置8-12℃保存。 

3.2取上述高盐抽提干粉，慢慢加入低盐反抽液，在低温8～12℃条件下搅拌3小时，离心，收集上清液，向渣子内加入低盐反抽液， 在低温8～12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液；合并二次上清液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌30分钟，置低温8～12℃静止过夜；次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用适量丙酮脱水，置六罐离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后的即为低盐反抽干粉。 

4DEAE吸附 

取上述低盐反抽干粉，溶解于0.1mol/L pH6.2的乙酸钠平衡液中，加入DEAE，在低温8-12℃条件下搅拌吸附2.5小时；过滤，得滤过液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌10分钟，置低温8～12℃静止48小时；48小时后，虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物用少量工业丙酮洗涤，置离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后即为DEAE吸附干燥品。 

5柱分离工序 

5.1缓冲液配制： 

A、缓冲液1：0.01mol/L醋酸铵，用纯化水溶解，加冰醋酸调pH5.0 

B、缓冲液2：0.01mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾，按1∶8比例用纯化水溶解，调PH5.8。 

C、洗脱液：0.2mol/L乙酸铵PH8.5。 

5.2上样 

温度在20℃以下，将DEAE干燥品按1∶60比例溶解于pH5.0缓冲液中，成上柱液；用醋酸或氨水调节上柱液的pH，至pH5.0；上CG-50柱，流速控制在20-30ml/分。 

5.3洗涤 

上样结束后，用pH5.0缓冲液洗涤2倍柱床体积，流速控制在20ml/分：再用pH5.8的洗涤液洗涤4倍床体积，流速控制在30ml/分。 

5.4洗脱 

用洗脱液洗脱，流速控制在30ml/分左右，至流出液OD值在0.3以上，滴加乙醇变浑浊后开始收集流出液，直到0D值在0.3以下， 停止收集流出液； 

5.5沉淀 

量出收集液体积，转入不锈钢桶内，加入(V/V)的冷乙醇，用玻璃棒搅拌沉淀，然后置冷库沉淀过夜。 

5.6干燥 

次日，虹吸弃去桶内的上清液，下层沉淀置入离心罐内，离心30分钟，弃去上清液；用少量的无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；置于五氧化二磷干燥箱内干燥，干燥得干燥品。 

6去热原 

6.1将上述干燥品用纯化水搅拌溶解至澄清后，加入等体积冷乙醇，使乙醇溶液的浓度达47％，此时溶液混浊； 

6.2加入总体积的醋酸铵，溶液澄清后，缓慢加入0.2mol/L磷酸钠溶液，边搅拌边缓慢加入0.3mol/L醋酸钙溶液； 

6.3用5mol/L Na0H调节pH，稳定后继续搅拌1～1.5小时，搅拌结束，置离心机离心，弃去沉淀物； 

6.4上清液用5mol/L HCl调pH，在搅拌下，加入95％乙醇，沉淀析出，置冰箱过夜； 

6.5次日，虹吸上清液，沉淀离心收集，并用无水乙醇或丙酮研磨、洗涤沉淀物，离心30分钟，反复2次； 

6.6最后，沉淀物置五氧化二磷干燥箱内干燥，得干燥品。 

本发明的效果是：工艺中改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质，解决使用原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题，提高了分离度。收率达到94％以上，效价5000iu/mg以上，达到国际领先水平，极大的满足了国内外客户的需要。 

附图说明

图1为HCG制备工艺路线的流程图。 

图2为HCG制备工艺路线的简化流程图 

实施例

1、取pH值在5.0-7.0之间的澄清孕妇尿1T入反应罐中加苯甲 酸钠，搅拌使全部溶解，缓慢加入工业盐酸，调节pH，不断搅拌1小时，使吸附完全；过滤，弃去废尿液，得吸附物60kg。 

2、取上述吸附物加乙醇，充分搅拌，至白色苯甲酸全部溶解，有絮状沉淀产生为止，静置过夜；次日，虹吸上层乙醇苯甲酸溶液；底部絮状沉淀物，加入95％乙醇稍搅拌后，放置4小时以上，待沉淀完全；4小时后弃去上层液，过滤底部絮状沉淀物，待过滤物即将抽干时，加入少量工业丙酮洗涤一次，抽干；将过滤物取出，置用工业无水氯化钙或五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，研磨成粉末即得粗制品，称重700g，置阴凉处保存。 

3、取上述粗制品，加高盐抽提液(0.5mol/L氯化钠、0.1mol/L乙酸钠、0.015mol/L氯化钙、pH5.1)，在低温8～12℃条件下搅拌，静止过夜；次日虹吸上清液；向渣子内加高盐抽提液，在低温8～12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液；合并二次上清液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌30分钟，置低温8～12℃静止过夜；次日，虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用少量工业丙酮洗涤，置离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用工业五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后即为高盐抽提干粉，称重50.4g。 

4、取上述高盐抽提干粉，慢慢加入低盐反抽液(0.1mol/L乙酸钠、pH4.8)，在低温8～12℃条件下搅拌3小时，离心，收集上清液，向渣子内加入低盐反抽液，在低温8～12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液；合并二次上清液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌30分钟，置低温8～12℃静止过夜；次日，虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物用少量工业丙酮洗涤，置离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用工业五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后即为低盐反抽干粉称重37.8g。 

5、取上述低盐反抽干粉，溶解于0.1mol/L pH6.2的乙酸钠平衡液中；向上述上清液中加入DEAE，在低温8-12℃条件下搅拌吸附2.5小时；过滤，得滤过液；测量滤液体积1.5L，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，开继续搅拌10分钟，置低温8～12℃静止48小时；48小时后，虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物用少量工业丙 酮洗涤，置离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后即为DEAE吸附干燥品，称重28.4g。 

6、在20℃以下，将上述DEAE干燥品溶于缓冲液中，成上柱液；用醋酸或氨水调节上柱液的pH；上CG-50柱，流速控制在20-30ml/分；上样结束后，用缓冲液洗涤柱床，流速控制在20ml/分左右；用缓冲液洗涤柱床，流速控制在30ml/分左右；用洗脱液洗脱，流速控制在30ml/分左右，至流出液0.D值在0.3以上，滴加乙醇变浑浊后，开始收集流出液，直到0.D值在0.3以下，停止收集流出液；量出收集液体积，转入不锈钢桶内，加入(V/V)的冷乙醇，用玻璃棒搅拌沉淀，然后置冷库沉淀过夜；次日，虹吸弃去桶内的上清液，下层沉淀置入离心罐内，离心30分钟，弃去上清液；用少量的无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；置于五氧化二磷干燥箱内干燥，干燥得干燥品3.4g。 

7、将上述干燥品用纯化水搅拌溶解至澄清后，加入等体积冷乙醇，使乙醇溶液的浓度达47％，此时溶液混浊；加入总体积的醋酸铵，溶液澄清后，缓慢加入0.2mol/L磷酸钠溶液，边搅拌边缓慢加入0.3mol/L醋酸钙溶液；用5mol/L NaOH调节pH，稳定后继续搅拌1～1.5小时，搅拌结束，置离心机离心，弃去沉淀物；上清液用5mol/LHCl调pH，在搅拌下，加入95％乙醇，沉淀析出，置冰箱过夜；次日，虹吸上清液，沉淀离心收集，并用无水乙醇或丙酮研磨、洗涤沉淀物，离心30分钟，反复2次；最后，沉淀物置五氧化二磷干燥箱内干燥，得干燥品3.2g，收率94％，干燥品即为HCG成品。 

Claims (6)

1.一种研究柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法，其特征在于：采用精品上柱工序用最佳配比度的洗涤液、洗脱液的浓度最大限度地去除可见杂质，解决原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题。

2.根据权利要求1所述的用最佳配比度的洗涤液、洗脱液的浓度去除可见杂质的方法，其特征在于所述的柱分离工序中最佳配比度洗涤液的工艺为：

1、缓冲液配制

A、缓冲液1：0.01mol/L醋酸铵，用纯化水溶解，加冰醋酸调pH5.0；

B、缓冲液2：0.01mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾，按1∶8比例用纯化水溶解，调PH5.8。

C、洗脱液：0.2mol/L乙酸铵PH8.5。

2、上样

温度在20℃以下，将DEAE干燥品按1∶60比例溶解于pH5.0缓冲液中，成上柱液；用醋酸或氨水调节上柱液的pH，至pH5.0；上CG-50柱，流速控制在20-30ml/分。

3.洗涤

上样结束后，用pH5.0缓冲液洗涤2倍柱床体积，流速控制在20ml/分：再用pH5.8的洗涤液洗涤4倍床体积，流速控制在30ml/分。

4.洗脱

用洗脱液洗脱，流速控制在30ml/分左右，至流出液OD值在0.3以上，滴加乙醇变浑浊后开始收集流出液，直到OD值在0.3以下，停止收集流出液。

5.沉淀

量出收集液体积，转入不锈钢桶内，加入冷乙醇，用玻璃棒搅拌沉淀，然后置冷库沉淀过夜。

6.干燥

次日，虹吸弃去桶内的上清液，下层沉淀置入离心罐内，离心30分钟，弃去上清液；用少量的无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；置于五氧化二磷干燥箱内干燥，干燥得干燥品。

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