CN103193880B - Hcg粗品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种HCG粗品的制备方法。HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：a.收集孕妇尿液，超滤得浓缩液；b.在浓缩液中加入浓度为0.5-0.8%的无水氯化钙，搅拌溶解；c.再将步骤b中的浓缩液加入到2-3倍体积的丙酮中静置10-16小时，所述的丙酮温度为4℃，并将加入了浓缩液的丙酮置于4℃下保存；d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；抽干或真空干燥。采用以上的方法制备HCG粗品，和传统的采用苯甲酸钠的制备方法相比，无需采用苯甲酸钠和盐酸，降低了成本；而且本发明的方法中，减少了由于中间反应环节带来的HCG的损失。

Description

HCG粗品的制备方法

技术领域

本发明属于技术生物医药技术领域，具体涉及一种HCG粗品的制备方法。

背景技术                          

HCG即人绒毛膜促性腺激素，是英文human chorionic gonadotrophin三个英文的首字字母缩写，是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。

HCG在受精后第六天前后就进入母血并快速增殖一直到孕期的第8周，然后缓慢降低浓度直到第18～20周，然后维持10天左右，并开始下降（但仍高于正常水平）。完整的HCG全部是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生。其主要功能就是刺激黄体，有利于雌激素和黄体酮持续分泌，以促进子宫蜕膜的形成，使胎盘生长成熟。现代认为HCG是由滋养层过渡型细胞和合体细胞产生的。HCG在受精后6左右天开始分泌，60－70天达到高峰。在妊娠的前8周增值很快，以维持妊娠。在大约孕8周以后， HCG逐渐下降，直到大约20周达到相对稳定。

HCG性状呈白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂，pH3.2-3.3，干品较稳定，临床上主要用于男性垂体机能不足所致的性机能过低的隐睾症，用于由黄体功能不全引起的功能行子宫出血病和习惯性流产与HMG合同可诱发排卵和治疗不育症。HCG的另一个重要用途是制备妊娠试剂盒放射免疫试剂，用以妊娠检验和绒毛膜癌的诊断，HCG在医学上有重要的用途。

HCG的传统制备方法是：收集孕妇尿液，在尿液中加入苯甲酸钠，再加入盐酸，充分反应，生成苯甲酸，将HCG吸附住，再加入食用酒精使HCG沉淀下来，再干燥HCG，该方法的缺点是，该方法的步骤繁多，尿液中的HCG损失较大；而且该方法中使用到了苯甲酸钠和盐酸，其成本较高，而且盐酸的复新过程需要消耗热量。

CN1302818A公开的方法中，采用醋酸钠的高盐抽提和低盐反抽技术得到HCG中间体，经过SP-葡聚糖凝胶的分离纯化技术制得一种高纯度的人绒毛膜促性腺激素，经过无菌无热原的处理制得医用的注射用HCG精品原料。其具体的工艺流程是：中间体制造工段和纯品HCG制造工段，中间体制造工段过程中，称取HCG粗品，投入到氯化钠的醋酸钠氯化钙乙醇的缓冲液中，搅拌提取，静置过夜虹吸上清液，残渣继续提取，离心取上清液；加入乙醇继续提取；采用预冷丙酮脱水后真空干燥，得中间体；过色谱柱对HCG中间体纯化，收集，加乙醇沉淀，的效价为3000-3500iu/mg的HCG纯品。该方法的缺点是：采用的试剂较多，步骤较为繁琐，而且在该方法中采用了有机试剂乙醇，增加了溶剂回收的步骤。

CN1047507A披露了一种提取人绒毛膜促性腺激素的吸附剂和方法，该方法的具体步骤是：使用硅藻土作为吸附剂，从早、中期（2-6个月）孕妇新鲜尿液中，在37℃以下提取人绒毛膜促性腺激素。具体为：调节孕妇尿液pH值，加硅藻土吸附，取硅藻土装柱，用洗脱液洗脱，加酒精沉淀，经脱水干燥制得人绒毛膜促性腺激素。该方法的缺点是：采用硅藻土作为吸附剂，会吸附一部分HCG，带来HCG的损失。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种成本低、步骤简单、易于工业化生产的HCG粗品的制备的方法。

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.8-4.0，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4-5%为止；

b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.5-0.8%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2-3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置6-15小时，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；抽干或真空干燥得HCG粗品。

上述的步骤a中，超滤尿液后，用反渗透水清洗超滤设备，清洗液冷藏并入下次尿液，可以将尿液中的有效成份更彻底的清洗出来，减少提取中的损失。

上述的步骤b中，在浓缩液中加入战浓缩液总重为0.65%的无水氯化钙，搅拌溶解。

优选的，上述的步骤c中，具体为：再将步骤b中的浓缩液中加入到2.5倍体积的丙酮中静置12小时，所述的丙酮为预冷到4℃的丙酮，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存。

上述的步骤a中，收集的孕妇尿液中，不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

上述的步骤a中，所得到的HCG粗品成品中不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

步骤a中，在4-10℃的区间范围内，有利于HCG粗品的提取。

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.9，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%为止；

b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.6%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置8小时，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；抽干或真空干燥得HCG粗品。

本发明的有益效果在于，采用以上的方法制备HCG粗品，和传统的采用苯甲酸钠的制备方法相比，无需采用苯甲酸钠和盐酸，降低了成本；而且本发明的方法中，减少了由于中间反应环节带来的HCG的损失。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，该孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.9，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4%左右；

超滤后用反渗透水清洗超滤设备，清洗液冷藏并入下次尿液；

b.在浓缩液中加入浓度为0.65%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置6小时以上，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；真空干燥，得HCG粗品，经检测， HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

采用以上的实施例中的方法制备HCG粗品，其实验结果如下：

                                                 

对比例

收集孕妇尿液，该孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab，；在尿液中加入苯甲酸钠，苯甲酸钠的加入量为2.2%，再加入盐酸至pH值3.9充分反应，生成苯甲酸，苯甲酸将HCG吸附住，2小时后弃去废尿甩干沉淀。再将甩干物加入食用酒精，使HCG沉淀下来并真空干燥得HCG粗品，粗品的比活为5-8IU/mg。

从以上表格中的数据可以看出来，实施例1中的粗品比活大于对比例中的粗品比活，而实施例1中的HCG产品每50克的生产成本要比对比例中生产成本低15%左右，每批次的生产时间要少将近一半，由此可见，本发明的HCG粗品的制备方法，其成本低，时间少，效率高。

实施例2

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，该孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.8，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%左右；

超滤后用反渗透水清洗超滤设备，清洗液冷藏并入下次尿液；

b.在浓缩液中加入浓度为0.6%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置10小时以上，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；真空干燥，得HCG粗品，经检测，成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

实施例3

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，该孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH4.0，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4%左右；

超滤后用反渗透水清洗超滤设备，清洗液冷藏并入下次尿液；

b.在浓缩液中加入浓度为0.7%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液中加入到3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置10小时以上，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；真空干燥，得HCG粗品，经检测，成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

实施例4

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，该孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.8，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的5%左右；

超滤后用反渗透水清洗超滤设备，清洗液冷藏并入下次尿液；

b.在浓缩液中加入浓度为0.7%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置10小时以上，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于6℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；真空干燥，得HCG粗品，经检测，成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

实施例5

HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，该孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.9，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%为止；

b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.6%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置8小时，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；抽干或真空干燥得HCG粗品，经检测，成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

Claims (8)

1.HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.8-4.0，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4-5%为止；

b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.5-0.8%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2-3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置6-15小时，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；抽干或真空干燥得HCG粗品。

2.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，超滤尿液后，用反渗透水清洗超滤设备，清洗液冷藏并入下次尿液。

3.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中，在浓缩液中加入浓度为0.65%的无水氯化钙，搅拌溶解。

4.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤c中具体为：再将步骤b中的浓缩液中加入到2.5倍体积的丙酮中静置12小时，所述的丙酮为预冷到4℃的丙酮，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存。

5.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，所述的孕妇尿液中，未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

6.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤d中，所述的HCG粗品中不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

7.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，超滤的温度为4-10℃。

8.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法，包括下述的步骤：

a.收集孕妇尿液，采用40目滤网过滤；采用微滤设备预处理过滤，再在超滤设备中超滤得到浓缩液，超滤的条件是：pH3.9，超滤膜的截留分子量为10000Da，超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%为止；

b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.6%的无水氯化钙，搅拌溶解；

c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置8小时，并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存；

d.虹吸步骤c中的上层液，并用丙酮洗涤沉淀两次；抽干或真空干燥得HCG粗品。