CN114805542A - 一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法。一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：S1.收集尿液进行透析处理；S2.层析收集洗脱液；S3.分离；S4.进一步处理。本发明提供的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，所纯化得到的促性腺激素具有效价高，纯度高的优点，且所制成的促性腺注射制剂不会引起疼痛或者红疹等不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法。
背景技术
促性腺激素是调节脊椎动物性腺发育，促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素，如垂体前叶分泌的促卵泡成熟激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)，两者协同作用，刺激卵巢或睾丸中生殖细胞的发育及性激素的生成和分泌；人胎盘分泌的绒毛膜促性腺激素(HCG)，可促进妊娠黄体分泌孕酮。怀孕初期尿中即可出现HCG，于妊娠两个月时达高峰，临床常以此作为妊娠指标。
绝经期妇女由于雌性激素和孕激素缺乏，从而反馈调节垂体，分泌大量FSH和LH，由尿中排出。因此，目前HMG的生产方法多以绝经期妇女的尿液作为原料，经过高岭土吸附、酒精抽提得到＞3IU/mg的HMG粗品，再从HMG粗品开始生产，通过硅酸铝层析、阴离子交换树脂层析、除热原等工序得到HMG原料。临床上HMG主要应用于治疗女性排卵障碍导致的不孕症，为促排卵主要药物。另外，也用于男性激素水平低下导致的精子过少或活力不足，妇女闭经，月经不调及男女性机能失调等症。
CN105732797B公开了一种尿促性腺激素的纯化方法，取绝经期妇女尿液超滤浓缩后，将超滤液用聚乙二醇醚-硫酸铵双水相体系萃取两次后，得含尿促性腺激素的有机相，有机相在水浴中处理后分相，离心，得含尿促性腺激素的水相，将水相过超滤膜后上羟基磷灰石层析柱收集洗脱液，在洗脱液中加乙醇溶液调酒精度，静置，过滤得沉淀物，干燥得纯化后的尿促性腺激素。所得到的尿促性腺激素中卵泡刺激素和黄体生成激素生物效价高、活性回收率好，操作简单、容易工业化生产。
然而CN105732797B或其他现有技术从人尿中提取的促性腺激素存在较多的异源化学成分，且不同原料或不同批次提取的促性腺激素成分会有不同，因此个别促性腺注射制剂部分会发生疼痛或者红疹等不良反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法。本发明得到的促性腺激素效价高，纯度高，所制成的促性腺注射制剂不会引起疼痛或者红疹等不良反应。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液进行透析处理
S2.层析收集洗脱液
S3.分离
向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入质量分数为10-15％硫酸铵，搅拌均匀后超声30-45分钟，之后缓慢加入质量分数为13-15％聚乙二醇醚，搅拌均匀后超声20-30分钟，加热至55-65℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
S4.进一步处理
向步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入无水硫酸钠充分混合均匀，抽滤得到滤液，加入乙醇进行沉淀再次抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素。
本发明步骤S3中先后加入的硫酸铵和聚乙二醇醚可以使促性腺激素更多地溶于聚乙二醇醚有机相中，使杂质更多地溶于水相中，实现了促性腺激素和杂质的有效分离，有利于提高所提取的促性腺激素纯度，步骤S4中加入的无水硫酸钠能够将促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中的水分去除，本发明提供的纯化方法实现了尿液中促性腺激素与其他杂质的稳定、有效分离，得到的促性腺激素效价高，纯度高，所制成的促性腺注射制剂不会引起疼痛或者红疹等不良反应。
进一步地，步骤S1具体为，利用纯净水对尿液透析3-4h，利用12-14mM PH值为7.7-8.1的Tris-HCl缓冲溶液对尿液透析3-4h，离心，得上清液。
进一步地，步骤S1中，所述纯净水、Tris-HCl缓冲溶液与尿液的体积比为(1-3):(1-3):1。
进一步地，步骤S1中，所述尿液为绝经期妇女尿液。
进一步地，步骤S2具体为，将步骤S1得到的上清液上羟基磷灰石层析柱，采用PH为5.5-6.0的0.05M醋酸-醋酸钠溶液洗涤3-5个柱体积，之后经过PH为5.5-6.0的含0.2M氯化钠的0.1M醋酸-醋酸钠洗脱，检测洗脱液在280nm处的吸光值，并收集吸光度值大于0.1的洗脱液。
进一步地，步骤S3中，所述硫酸铵、聚乙二醇醚与洗脱液的体积比为1:1:1。
进一步地，步骤S4中，所述无水硫酸钠与聚乙二醇醚的加入量比例为(3-7)g:100mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明加入的硫酸铵和聚乙二醇醚可以使促性腺激素更多地溶于聚乙二醇醚有机相中，使杂质更多地溶于水相中，实现了促性腺激素与杂质的有效分离，有利于提高所提取的促性腺激素纯度。
(2)本发明加入的无水硫酸钠能够将促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中的水分去除，从而实现了尿液中促性腺激素与其他杂质的稳定、有效分离，得到的促性腺激素效价高，纯度高，所制成的促性腺注射制剂不会引起红疹、喷嚏、疼痛等不良反应。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液进行透析处理
利用纯净水对绝经期妇女尿液透析3h，利用13mM PH值为7.9的Tris-HCl缓冲溶液对尿液透析3.5h，离心，得上清液；
本实施例中，所述纯净水、Tris-HCl缓冲溶液与尿液的体积比为2:2:1；
S2.层析收集洗脱液
将步骤S1得到的上清液上羟基磷灰石层析柱，采用PH为5.6的0.05M醋酸-醋酸钠溶液洗涤4个柱体积，之后经过PH为5.6的含0.2M氯化钠的0.1M醋酸-醋酸钠洗脱，检测洗脱液在280nm处的吸光值，并收集吸光度值大于0.1的洗脱液；
S3.分离
向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入质量分数为12％硫酸铵，搅拌均匀后超声35分钟，之后缓慢加入质量分数为14％聚乙二醇醚，搅拌均匀后超声25分钟，加热至60℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
本实施例中，所述硫酸铵、聚乙二醇醚与洗脱液的体积比为1:1:1；
S4.进一步处理
向步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入无水硫酸钠充分混合均匀，抽滤得到滤液，加入乙醇进行沉淀再次抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素；
本实施例中，所述无水硫酸钠与聚乙二醇醚的加入量比例为5g:100mL。
实施例2
一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液进行透析处理
利用纯净水对绝经期妇女尿液透析4h，利用13mM PH值为7.7的Tris-HCl缓冲溶液对尿液透析3h，离心，得上清液；
本实施例中，所述纯净水、Tris-HCl缓冲溶液与尿液的体积比为1:3:1；
S2.层析收集洗脱液
将步骤S1得到的上清液上羟基磷灰石层析柱，采用PH为6.0的0.05M醋酸-醋酸钠溶液洗涤3个柱体积，之后经过PH为6.0的含0.2M氯化钠的0.1M醋酸-醋酸钠洗脱，检测洗脱液在280nm处的吸光值，并收集吸光度值大于0.1的洗脱液；
S3.分离
向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入质量分数为10％硫酸铵，搅拌均匀后超声30分钟，之后缓慢加入质量分数为13％聚乙二醇醚，搅拌均匀后超声20分钟，加热至55℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
本实施例中，所述硫酸铵、聚乙二醇醚与洗脱液的体积比为1:1:1；
S4.进一步处理
向步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入无水硫酸钠充分混合均匀，抽滤得到滤液，加入乙醇进行沉淀再次抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素；
本实施例中，所述无水硫酸钠与聚乙二醇醚的加入量比例为3g:100mL。
实施例3
一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液进行透析处理
利用纯净水对绝经期妇女尿液透析4h，利用14mM PH值为8.1的Tris-HCl缓冲溶液对尿液透析4h，离心，得上清液；
本实施例中，所述纯净水、Tris-HCl缓冲溶液与尿液的体积比为3:1:1；
S2.层析收集洗脱液
将步骤S1得到的上清液上羟基磷灰石层析柱，采用PH为5.5的0.05M醋酸-醋酸钠溶液洗涤5个柱体积，之后经过PH为5.5的含0.2M氯化钠的0.1M醋酸-醋酸钠洗脱，检测洗脱液在280nm处的吸光值，并收集吸光度值大于0.1的洗脱液；
S3.分离
向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入质量分数为15％硫酸铵，搅拌均匀后超声45分钟，之后缓慢加入质量分数为15％聚乙二醇醚，搅拌均匀后超声20分钟，加热至60℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
本实施例中，所述硫酸铵、聚乙二醇醚与洗脱液的体积比为1:1:1；
S4.进一步处理
向步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入无水硫酸钠充分混合均匀，抽滤得到滤液，加入乙醇进行沉淀再次抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素；
本实施例中，所述无水硫酸钠与聚乙二醇醚的加入量比例为6g:100mL。
实施例4
一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：
S1.收集尿液进行透析处理
利用纯净水对绝经期妇女尿液透析4h，利用14mM PH值为8.0的Tris-HCl缓冲溶液对尿液透析4h，离心，得上清液；
本实施例中，所述纯净水、Tris-HCl缓冲溶液与尿液的体积比为3:1:1；
S2.层析收集洗脱液
将步骤S1得到的上清液上羟基磷灰石层析柱，采用PH为6.0的0.05M醋酸-醋酸钠溶液洗涤4个柱体积，之后经过PH为5.5的含0.2M氯化钠的0.1M醋酸-醋酸钠洗脱，检测洗脱液在280nm处的吸光值，并收集吸光度值大于0.1的洗脱液；
S3.分离
向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入质量分数为12％硫酸铵，搅拌均匀后超声40分钟，之后缓慢加入质量分数为14％聚乙二醇醚，搅拌均匀后超声30分钟，加热至65℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
本实施例中，所述硫酸铵、聚乙二醇醚与洗脱液的体积比为1:1:1；
S4.进一步处理
向步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入无水硫酸钠充分混合均匀，抽滤得到滤液，加入乙醇进行沉淀再次抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素；
本实施例中，所述无水硫酸钠与聚乙二醇醚的加入量比例为7g:100mL。
实施例5
促性腺激素的纯化方法具体同实施例1，所不同的是：未采用步骤S1进行处理。
实施例6
促性腺激素的纯化方法具体同实施例1，所不同的是：步骤S4具体为：步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入乙醇进行沉淀后抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素。
对比例1
促性腺激素的纯化方法具体同实施例1，所不同的是：步骤S1利用截留分子量为10000的超滤膜对绝经期妇女尿液处理，得超滤浓缩液，之后进行后续步骤处理。
对比例2
促性腺激素的纯化方法具体同实施例1，所不同的是：步骤S3具体为：首先将质量分数为12％硫酸铵与质量分数为14％聚乙二醇醚按照体积比1:1混合得到混合液，向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入混合液，搅拌均匀后超声60分钟，加热至60℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相，所述混合液与洗脱液的体积比为2:1。
试验例1FSH生物效价、LH生物效价及回收率测试
对实施例1、实施例5、实施例6、对比例1和对比例2步骤S1尿液中促卵泡成熟激素(FSH)生物效价、步骤S1尿液中促黄体生成激素(LH)生物效价、步骤S4促性腺激素中促卵泡成熟激素(FSH)生物效价、步骤S4促性腺激素中促黄体生成激素(LH)生物效价、促卵泡成熟激素(FSH)的回收率以及促黄体生成激素(LH)的回收率进行测试，具体结果见表1。
表1FSH和LH生物效价及回收率测试
由表1数据可知，本发明实施例1、实施例5、实施例6、对比例1和对比例2在步骤S1尿液中FSH生物效价和LH生物效价相同的条件下，经过纯化方法得到促性腺激素，其中，实施例1中步骤S4促性腺激素中FSH生物效价和LH生物效价具有较高值，且FSH和LH的回收率最高，说明本发明实施例1提供的纯化方法显著优于实施例5、实施例6、对比例1和对比例2的纯化方法。
试验例2药理试验
选取35只重约200g左右的雌性豚鼠和35只重约200g左右的雄性豚鼠，随机分为7组，每组10只，雌雄各半。将实施例1、实施例5、实施例6、对比例1和对比例2提取的促性腺激素制备成注射制剂，浓度为60单位/mL，按照0.5mL/只的剂量分别通过腹腔注射给药给5组豚鼠，依次标记为试验组1、试验组2、试验组3、对照组1和对照组2，将生理盐水和2％牛血清白蛋白溶液按照0.5mL/只的剂量分别通过腹腔注射给其余2组豚鼠，并标记为空白组和参照组，给药0.5h、1h、6h、12h、24h、48h时观察豚鼠的机体活力和反应，具体结果见表2。
表2药理学试验结果
由表2数据可知，试验例1和空白组48h内均未出现机体活动力下降，且未出现红疹、喷嚏、竖毛等过敏反应，试验组2在1h时出现机体活动力下降和过敏反应，试验组3在24h时出现机体活动力下降和过敏反应，对照组1、对照组2和参照组在0.5h、1h、6h、12h、24h和48h均出现了机体活动力下降和过敏反应，说明本发明实施例1提取的促性腺激素所制成的促性腺制剂能够有效避免红疹、喷嚏、疼痛、竖毛、咳嗽等不良反应的发生。
试验例3稳定性试验
以5种绝经期妇女尿液(来源于不同人体)为原料，利用实施例1、对比例1和对比例2的纯化方法分别提取5种绝经期妇女尿液中的促性腺激素。选取30只重约200g左右的雌性豚鼠和30只重约200g左右的雄性豚鼠，随机分为3组，每组20只，雌雄各半。每组豚鼠分为5个小组，每个小组分别4只，雌雄各半，每组中不同小组的豚鼠分别注射基于不同种类原料并采用同一纯化方法得到的促性腺激素。将实施例1、对比例1和对比例2得到的促性腺激素制备成注射制剂，并按照试验例2药理试验中的剂量通过腹腔注射给药给3组豚鼠，依次标记为试验组4、对照组3和对照组4，给药0.5h、1h、6h、12h、24h、48h时观察豚鼠的机体活力和反应，具体结果见表3。
表3稳定性试验结果
由表3数据可知，利用实施例1、对比例1和对比例2提供的纯化方法从5种不同种类的绝经期妇女尿液提取促性腺激素，其中，仅试验组4的豚鼠在给药48h内机体活动保持正常，未出现过敏反应，说明当采用的原料种类不同时，本发明对比例1和对比例2提供的纯化方法所得到的促性腺激素可能会引起机体过敏等不良反应。
对本发明其他实施例纯化得到的促性腺激素也进行了上述FSH生物效价、LH生物效价、回收率、药理试验和稳定性试验，其获得的结果相似。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.收集尿液进行透析处理
S2.层析收集洗脱液
S3.分离
向步骤S2中的洗脱液中缓慢加入质量分数为10-15％硫酸铵，搅拌均匀后超声30-45分钟，之后缓慢加入质量分数为13-15％聚乙二醇醚，搅拌均匀后超声20-30分钟，加热至55-65℃，离心，得到含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相和含杂质的水相；
S4.进一步处理
向步骤S3中含有促性腺激素的聚乙二醇醚有机相中加入无水硫酸钠充分混合均匀，抽滤得到滤液，加入乙醇进行沉淀再次抽滤，将得到的沉淀物干燥，即得促性腺激素。
2.根据权利要求1所述的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，步骤S1具体为，利用纯净水对尿液透析3-4h，利用12-14mM PH值为7.7-8.1的Tris-HCl缓冲溶液对尿液透析3-4h，离心，得上清液。
3.根据权利要求2所述的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述纯净水、Tris-HCl缓冲溶液与尿液的体积比为(1-3):(1-3):1。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述尿液为绝经期妇女尿液。
5.根据权利要求1所述的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，步骤S2具体为，将步骤S1得到的上清液上羟基磷灰石层析柱，采用PH为5.5-6.0的0.05M醋酸-醋酸钠溶液洗涤3-5个柱体积，之后经过PH为5.5-6.0的含0.2M氯化钠的0.1M醋酸-醋酸钠洗脱，检测洗脱液在280nm处的吸光值，并收集吸光度值大于0.1的洗脱液。
6.根据权利要求1所述的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述硫酸铵、聚乙二醇醚与洗脱液的体积比为1:1:1。
7.根据权利要求1所述的一种基于尿液中促性腺激素的纯化方法，其特征在于，步骤S4中，所述无水硫酸钠与聚乙二醇醚的加入量比例为(3-7)g:100mL。
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