CN105461799A - 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。本发明所提供的方法是将重组人促卵泡生成素蛋白的丰收液经过澄清后，上样到染料亲和层析色谱中后收集洗脱液，再将洗脱液依次经过疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析后过滤获得重组人促卵泡生成素纯化液。本发明所提供的纯化方法具有工艺简单，成本低，杂质残留少，易于工业化放大生产，目标产物纯度高，收率高等特点，适用于规模扩大化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，属于蛋白质纯化技术领域。
背景技术
卵泡刺激素(促卵泡激素，folliclestimulatinghormone，FSH)是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，具有调节机体的生长、性成熟和繁殖等作用，在生殖过程中起至关重要的作用；可促使男性生精上皮发育、刺激精子发生和精子成熟；对女性的功能为刺激卵泡发育、促使卵泡成熟、促进排卵，可刺激多个卵泡发育、抑制卵巢闭锁、诱导芳香酶活性、刺激颗粒细胞增生及诱导LH和PRL受体产生。
FSH的糖基结构决定了其生物学活性和生理功能，FSH蛋白的分离纯化不但对结构与功能的研究具有重要学术意义，而且作为一种治疗用生物制品，制备出大量高纯度符合法规要求的纯品，具有重大的经济及社会效益。随着法规要求的不断提高，对重组生产的FSH有了更高的质量要求，如对DNA限度要求的提高，对病毒去除的要求等，所以这对FSH的下游纯化提出了更大的挑战。
FSH是一种糖蛋白，糖蛋白的不均一性引起理化性质的差异巨大，为层析纯化增加了难度，所以要合理的使用不同原理层析技术，安排好层析顺序，既要考虑质量，还要考虑回收率，同时满足以上两点，才是一个合格的纯化工艺。
目前纯化重组人FSH的文献中多数采用金属螯合层析或染料亲和层析作为捕获手段，后期通过亲和层析，反相层析，离子交换层析，疏水层析，凝胶层析等多种手段进行后续处理，实现FSH的纯化。专利CN201080056651公开了一种层析方法，次序为反相层析、凝胶层析、疏水层析等，专利CN100554277C中公开了一种层析方法，次序为阴离子交换层析、金属螯合层析、疏水层析等，专利CN101087805中公开了一种层析方法，次序为超滤、阴离子交换层析、染料亲和层析、疏水层析、反相层析、阴离子交换层析等，专利US7939296中公开了一种层析方法，次序为阳离子交换层析、染料亲和层析、疏水层析、凝胶层析等。
反相层析蛋白质洗脱过程中需要用到有机溶剂，而蛋白质长期暴露在有机环境中可能会引起蛋白质的三级结构改变，丧失生物学活性，金属螯合层析会导致高浓度金属离子引入到蛋白质溶液中，导致蛋白质活性的降低，并增加了后续处理的难度，凝胶层析时间过长，处理量有限。
随着层析介质制备技术的发展，性能更为优异的层析介质实现商品化，具有更高的载量，更快的速度，更低的吸附，更高的分辨率。应用到生产中将缩短工艺时间，提高处理量，降低成本，提高质量。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，使用新型层析介质，提供先进的FSH纯化工艺，在工艺和技术上优于已有专利，得到结构更加稳定的蛋白纯品。所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，该方法是将重组人促卵泡生成素丰收液依次经过染料亲和层析、疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析。
优选地，所述方法是将重组人促卵泡生成素蛋白的丰收液经过澄清后，上样到染料亲和层析色谱中后收集洗脱液，再将洗脱液依次经过疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析后过滤获得重组人促卵泡生成素纯化液。
所述方法的步骤如下：
1)澄清重组人促卵泡生成素的丰收液，利用平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡后，将经过澄清的丰收液上样层析，收集并获得亲和层析洗脱液；
2)利用步骤1)中的洗脱缓冲液平衡输水层析柱，再在将步骤1)所得的亲和层析洗脱液上样层析，收集并获得疏水层析流穿液；
3)利用平衡缓冲液平衡脱盐层析柱后，再将步骤2)所得的疏水层析流穿液上样到脱盐层析柱中进行脱盐，收集并获得脱盐蛋白液；
4)利用平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，再将步骤3)所得的脱盐蛋白液进行上样层析，收集并获得羟基磷灰石层析流穿峰；
5)利用平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡后，将步骤4)所得的羟基磷灰石层析流穿峰进行上样层析，收集并获得洗脱液，再将所得洗脱液经过超滤后获得重组人促卵泡生成素纯化液。
优选地，所述平衡缓冲液，是pH为6.0-10.5，浓度为5-100mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。
更优选地，所述平衡缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。
优选地，步骤1)所述亲和层析，所用冲洗缓冲液中所含盐为NaCl，Na2SO4，Na3PO3，或(NH4)2SO4，浓度为150-700mmol/L；所用洗脱缓冲液中所含盐为NaCl，Na2SO4，Na3PO3，或(NH4)2SO4，浓度为1.2-2.0mmol/L。
更优选地，所述冲洗缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为400-600mmol/L；所述洗脱缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为1.5-1.7mmol/L。
优选地，步骤2)所述疏水层析，层析介质为苯基凝胶Phenyl-HP或CaptoPhenyl，优选CaptoPhenyl。
优选地，步骤3)所述脱盐层析，层析介质为G-15或G-25，优选G-25Coarse。
优选地，步骤4)所述羟基磷灰石层析，层析介质为CHT陶瓷羟基磷灰石或CFT氟代羟基磷灰石介质，更优选地，层析介质为CFT氟代羟基磷灰石介质。
优选地，步骤5)所述阴离子交换层析，层析介质为含有配基季铵基或二乙胺乙基的Capto-Q，CaptoDEAE，QSepharoseFF，QSepharoseHP，DEAESepharoseFF或CaptoQimpRes，其中，优选CaptoQimpRes；洗脱缓冲液所用盐为NaCl，浓度为70-300mmol/L，优选浓度为80-150mmol/L。
所述方法的具体步骤如下：
1)澄清重组人促卵泡生成素的丰收液，利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡后，将经过澄清的丰收液上样层析，层析过程中所用冲洗缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为400-600mmol/L；所述洗脱缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为1.5-1.7mmol/L，收集并获得亲和层析洗脱液；
2)利用步骤1)中的洗脱缓冲液平衡输水层析柱，再在将步骤1)所得的亲和层析洗脱液上样层析，层析介质为苯基凝胶CaptoPhenyl，收集并获得疏水层析流穿液；
3)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液平衡脱盐层析柱后，再将步骤2)所得的疏水层析流穿液上样到脱盐层析柱中进行脱盐，脱盐层析介质为G-25，收集并获得脱盐蛋白液；
4)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，再将步骤3)所得的脱盐蛋白液进行上样层析，层析介质为CFT氟代羟基磷灰石介质，收集并获得羟基磷灰石层析流穿峰；
5)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡后，将步骤4)所得的羟基磷灰石层析流穿峰进行上样层析，层析介质为CaptoQimpRes，洗脱液是浓度为80-150mmol/L的NaCl溶液，收集并获得洗脱液，再将所得洗脱液经过超滤后获得重组人促卵泡生成素纯化液。
本发明获得的有益效果如下：
本发明提供一种适于规模扩大化生产，快速，高效，简便，易于控制的FSH纯化方法，使用新型层析介质，具有工艺简单，成本低，杂质残留少，易于工业化放大生产，目标产物纯度高，收率高等特点，得到产品符合最新的法规要求。
本发明方法制备的原液经检测电泳纯度100％，液相纯度>99％(SECHPLC法)，活性>13000IU/mg,氧化亚基含量<1.5％(反相HPLC法)DNA残留<5pg/33μg(RealtimePCR检测)，宿主蛋白残留<0.01％。
附图说明
图1为染料亲和层析图谱；
(其中，1.CaptoBlue流穿峰2.CaptoBlue预洗峰3.CaptoBlue洗脱峰4.CaptoBlue再生峰)。
图2为疏水层析及脱盐层析图谱；
(其中，1.CaptoPhenyl流穿峰2.CaptoPhenyl洗脱及再生峰3.G25脱盐峰4.G25脱盐峰)。
图3为羟基磷灰石层析图谱；
(其中，1.CFT流穿峰2.CFT清洗峰)。
图4为阴离子交换层析图谱；
(其中，1.CaptoQimpRes洗脱峰2.CaptoQimpRes清洗峰)。
图5为染料亲和层析及疏水层析电泳图；
(其中，1.CaptoBlue冲洗2.CaptoBlue洗脱3.CaptoBlue拖尾4.pH灭活后5.CaptoPhenyl流穿6.PhenylCapto洗脱7.marker)。
图6为羟基磷灰石层析及阴离子交换层析电泳图；
(其中，CFT流穿2.CFT清洗3.CaptoQimpRes洗脱峰4.CaptoQimpRes清洗峰5.CaptoQimpRes拖尾6marker)。
图7为SECHPLC法FSH液相纯度图谱；
(其中，目标蛋白(峰1)纯度99.94％)。
图8为反相HPLC法FSH液相图谱；
(其中，氧化亚基含量1.017％)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用的材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
样品蛋白浓度测定采用消光系数法。
电泳分析使用BIO-RAD的MiniproteanTerracell系统，采用SDS-PAGE方法，胶浓度为12％，点样量10μg，考马斯亮蓝染色。
离心机型号:SORVALL12BP+
层析系统：AKTApurifier操作温度：20-24℃
层析介质：CaptoBlue介质(GE公司)，CaptoPhenyl介质(GE公司)，G-25Coase介质(GE公司)，CFT氟代羟基磷灰石介质(BIO-RAD公司)，CaptoQimpRes介质(GE公司)。
实施例1重组人促卵泡生成素的制备
重组人促卵泡生成素的制备采取细胞培养的方式，具体过程如下：
从液氮罐取出表达FSH的CHO种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心4min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基重悬后，所述基础培养基由18g/LCD-CHO培养基、3.5g/LSFM4CHO培养基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氢钠和1.0g/L的F68组成。于250ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速120rpm，温度37℃，湿度75％，5％CO2。种子扩增按照250ml摇瓶-500ml摇瓶-1000ml摇瓶-2000ml摇瓶的顺序逐级传代，经过7d的扩增，细胞培养体积达到500ml，密度为3.2×106个/ml。
取种子悬液接种生物反应器，接种后培养体积为3L，密度5×105个/ml。初始培养条件为：转速150，溶氧40％，温度37℃，pH值7.2。在反应器培养的第4，6，8d分别补充培养体积10％的补料培养基，所述补料培养基由40g/L的FeedB培养基、20g/LFeedC培养基和2mM甲硫氨酸组成。第7天调节温度为33℃。每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充500g/L的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于1g/L，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化。共收获细胞培养液3.5L，经测定人促卵泡激素的表达量为40mg/L。细胞培养液经离心后取上清进行后续纯化。
实施例2重组人促卵泡生成素的纯化
2.1CaptoBlue染料亲和层析
层析柱：XK50-20，装柱体积130ml
用平衡缓冲液(20mMPB，pH7.4)平衡CaptoBlue层析柱，将澄清后的细胞丰收液上样至柱上，此条件下，FSH蛋白吸附到柱上，用冲洗缓冲液(20mMPB，pH7.4，500mMNaCL)洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液(20mMPB，pH7.4，1.5MNaCL)洗脱FSH目的蛋白，收集洗脱峰。层析柱随后依次使用高盐(20mMPB，pH7.4，3MNaCL)及0.1MNaOH再生处理。
将洗脱蛋白置于37℃，pH10.5孵育2h病毒灭活，调回pH至7.4。
经过染料亲和层析的结果如图1所示。图中，峰1为CaptoBlue流穿峰，峰2为CaptoBlue预洗峰，峰3为CaptoBlue洗脱峰，峰4为CaptoBlue再生峰。
2.2CaptoPhenyl疏水层析
层析柱：XK16-20，装柱体积10ml。
用洗脱缓冲液(20mMPB，pH7.4，1.5MNaCL)平衡CaptoPhenyl层析柱，将灭活后CaptoBlue染料亲和层析洗脱液上样至层析柱，此条件下杂蛋白吸附到柱上，而FSH蛋白流穿，收集流穿峰。平衡缓冲液(20mMPB，pH7.4)洗脱杂蛋白，高碱((1MNaOH)再生处理。
2.3G-25脱盐层析
层析柱：XK50-30，装柱体积450ml
用平衡缓冲液(20mMPB，pH7.4)平衡G-25层析柱，将CaptoPhenyl疏水层析流穿峰上样至层析柱，上样两次，收集脱盐后FSH蛋白样品峰。
经过CaptoPhenyl疏水层析和脱盐的结果如图2所示。图中，峰1为CaptoPhenyl流穿峰，峰2为CaptoPhenyl洗脱及再生峰，峰3为G25脱盐峰，峰4为G25脱盐峰。
2.4CFT羟基磷灰石层析
层析柱：XK26-40，装柱体积100ml
用平衡缓冲液(20mMPB，pH7.4)平衡CFT羟基磷灰石层析柱，将G-25脱盐后FSH蛋白样品上样至层析柱，此条件下杂蛋白吸附到柱上，，而FSH不吸附，收集流穿峰。高盐(20mMPB，pH7.4，1MNaCL)及高碱(1MNaOH)再生处理。
经过CFT羟基磷灰石层析的结果如图3所示。图中，峰1为CFT流穿峰，峰2为CFT清洗峰。
2.5CaptoQimpRes阴离子交换层析
层析柱：XK16-20，装柱体积24ml
用平衡缓冲液(20mMPB，pH7.4)平衡CaptoQimpRes阴离子交换层析柱，将CFT羟基磷灰石层析流穿样品上样至层析柱，此条件下，FSH蛋白吸附，用洗脱缓冲液(20mMPB，pH7.4，100mMNaCL)洗脱，收集FSH洗脱峰，随后用高盐(20mMPB，pH7.4，1MNaCL)处理，杂蛋白及糖基变异体被洗脱，高碱(1MNaOH)再生处理。
CaptoQimpRes阴离子交换层析洗脱液通过纳米膜进行病毒去除过滤，0.22μm滤膜除菌过滤。图4为阴离子交换层析图谱，图中峰1CaptoQimpRes洗脱峰，峰2为CaptoQimpRes清洗峰。
同时，本发明还对染料亲和层析及疏水层析电泳(图5)，羟基磷灰石层析及阴离子交换层析电泳(图6)进行了测定。另外，发明人还利用SECHPLC(图7)和反向HPLC(图8)对FSH液进行了测定。本发明方法制备的原液经检测电泳纯度100％，液相纯度>99％(SECHPLC法)，活性>13000IU/mg,氧化亚基含量<1.5％(反相HPLC法)DNA残留<5pg/33μg(RealtimePCR检测)，宿主蛋白残留<0.01％。其质量远远超过中国药典标准。
实施例3本发明的实施例
本实施例也提供了一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，具体如下：
3.1CaptoBlue染料亲和层析
层析柱：XK50-20，装柱体积130ml
用平衡缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0)平衡CaptoBlue层析柱，将澄清后的细胞丰收液上样至柱上，此条件下，FSH蛋白吸附到柱上，用冲洗缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0，150mMNa3PO3)洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0，1.2MNa3PO3)洗脱FSH目的蛋白，收集洗脱峰。层析柱随后依次使用高盐及0.1MNaOH再生处理。
将洗脱蛋白置于37℃，pH10.5孵育2h病毒灭活，调回pH至6.0。
3.2CaptoPhenyl疏水层析
层析柱：XK16-20，装柱体积10ml。
用洗脱缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0，1.2MNa3PO3)平衡CaptoPhenyl层析柱，将灭活后CaptoBlue染料亲和层析洗脱液上样至层析柱，收集流穿峰。平衡缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0)洗脱杂蛋白，高碱((1MNaOH)再生处理。
3.3G-25脱盐层析
层析柱：XK50-30，装柱体积450ml
用平衡缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0)平衡G-25层析柱，将CaptoPhenyl疏水层析流穿峰上样至层析柱，上样两次，收集脱盐后FSH蛋白样品峰。
3.4CFT羟基磷灰石层析
层析柱：XK26-40，装柱体积100ml
用平衡缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0)平衡CFT羟基磷灰石层析柱，将G-25脱盐后FSH蛋白样品上样至层析柱，收集流穿峰。高盐及高碱(1MNaOH)再生处理。
3.5CaptoQ阴离子交换层析
层析柱：XK16-20，装柱体积24ml
用平衡缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0)平衡CaptoQimpRes阴离子交换层析柱，将CFT羟基磷灰石层析流穿样品上样至层析柱，用洗脱缓冲液(10mMTris-HCl，pH6.0，70mMNaCL)洗脱，收集FSH洗脱峰，随后用高盐、高碱(1MNaOH)再生处理。
洗脱液通过纳米膜进行病毒去除过滤，0.22μm滤膜除菌过滤。
发明人利用SECHPLC和反向HPLC对FSH液进行了测定。本发明方法制备的原液经检测电泳纯度100％，液相纯度>99％(SECHPLC法)，活性>13000IU/mg,氧化亚基含量<1.5％(反相HPLC法)，DNA残留<5pg/33μg(RealtimePCR检测)，宿主蛋白残留<0.01％。
实施例4
本实施例也提供了一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，具体如下：
4.1CaptoBlue染料亲和层析
层析柱：XK50-20，装柱体积130ml
用平衡缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0)平衡CaptoBlue层析柱，将澄清后的细胞丰收液上样至柱上，此条件下，FSH蛋白吸附到柱上，用冲洗缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0，700mMNaCL)洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0，2.0MNaCL)洗脱FSH目的蛋白，收集洗脱峰。层析柱随后依次使用高盐及0.1MNaOH再生处理。
将洗脱蛋白置于37℃，pH10.5孵育2h病毒灭活，调回pH至10.0。
4.2CaptoPhenyl疏水层析
层析柱：XK16-20，装柱体积10ml。
用洗脱缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0，2.0MNaCL)平衡CaptoPhenyl层析柱，将灭活后CaptoBlue染料亲和层析洗脱液上样至层析柱，收集流穿峰。平衡缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0)洗脱杂蛋白，高碱((1MNaOH)再生处理。
4.3G-25脱盐层析
层析柱：XK50-30，装柱体积450ml
用平衡缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0)平衡G-25层析柱，将CaptoPhenyl疏水层析流穿峰上样至层析柱，上样两次，收集脱盐后FSH蛋白样品峰。
4.4CFT羟基磷灰石层析
层析柱：XK26-40，装柱体积100ml
用平衡缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0)平衡CFT羟基磷灰石层析柱，将G-25脱盐后FSH蛋白样品上样至层析柱，收集流穿峰。高盐及高碱(1MNaOH)再生处理。
4.5CaptoQimpRes阴离子交换层析
层析柱：XK16-20，装柱体积24ml
用平衡缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0)平衡CaptoQimpRes阴离子交换层析柱，将CFT羟基磷灰石层析流穿样品上样至层析柱，用洗脱缓冲液(100mMTris-HCl，pH10.0，300mMNaCL)洗脱，收集FSH洗脱峰，随后用高盐、高碱(1MNaOH)再生处理。
洗脱液调PH值至6-8，然后通过纳米膜进行病毒去除过滤，0.22μm滤膜除菌过滤。
发明人利用SECHPLC和反向HPLC对FSH液进行了测定。本发明方法制备的原液经检测电泳纯度100％，液相纯度>99％(SECHPLC法)，活性>13000IU/mg,氧化亚基含量<1.5％(反相HPLC法)，DNA残留<5pg/33μg(RealtimePCR检测)，宿主蛋白残留<0.01％。
实施例5
本实施例提供了一种常规的重组人促卵泡生成素的纯化方法，具体如下：
步骤1阴离子交换层析
将含重组人FSH的细胞培养上清液上样至DEAE-FF凝胶，收集流传峰。柱体积100ml，平衡缓冲液为20mMTris-HCl，pH7.5，200mMNaCL，细胞培养上清液加入NaCL，使其终浓度达到200mMNaCL。
步骤2亲和层析
将阴离子交换层析流传峰上样至FSH特异的亲和层析柱，柱体积100ml，平衡液为20mMTris-HCl，pH7.5，200mMNaCL，用含20mMTris-HCl，pH7.5，1.5MMgCL2溶液洗脱，收集洗脱峰。
步骤3
将亲和层析洗脱峰进行超滤浓缩和缓冲液置换，置换缓冲液为20mMTris-HCl，pH7.5，200mMNaCL。
步骤4凝胶层析
将FSH超滤浓缩液上样至分子筛凝胶superdex-75，柱形为XK26-100，柱体积400ml，平衡缓冲液为20mMTris-HCl，pH7.5，50mMNaCL，收集洗脱峰。
洗脱液通过纳米膜进行病毒去除过滤，0.22μm滤膜除菌过滤。
发明人利用SECHPLC和反向HPLC对FSH液进行了测定。本发明方法制备的原液经检测电泳纯度100％，液相纯度98.01％(SECHPLC法)，活性12280IU/mg,氧化亚基含量3.5％(反相HPLC法)，DNA残留108pg/33μg(RealtimePCR检测)，宿主蛋白残留0.08％。可以看出，液相纯度及活性均有下降，氧化亚基含量增加，但DNA残留及宿主蛋白残留均大大增加。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，其特征在于，是将重组人促卵泡生成素丰收液依次经过染料亲和层析、疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析。
2.根据权利要求1所述一种重组人促卵泡生成素的纯化方法，其特征在于，是将重组人促卵泡生成素蛋白的丰收液经过澄清后，上样到染料亲和层析色谱中后收集洗脱液，再将洗脱液依次经过疏水层析、脱盐层析、羟基磷灰石层析和阴离子交换层析后过滤获得重组人促卵泡生成素纯化液。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)澄清重组人促卵泡生成素的丰收液，利用平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡后，将经过澄清的丰收液上样层析，收集并获得亲和层析洗脱液；
2)利用步骤1)中的洗脱缓冲液平衡输水层析柱，再在将步骤1)所得的亲和层析洗脱液上样层析，收集并获得疏水层析流穿液；
3)利用平衡缓冲液平衡脱盐层析柱后，再将步骤2)所得的疏水层析流穿液上样到脱盐层析柱中进行脱盐，收集并获得脱盐蛋白液；
4)利用平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，再将步骤3)所得的脱盐蛋白液进行上样层析，收集并获得羟基磷灰石层析流穿峰；
5)利用平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡后，将步骤4)所得的羟基磷灰石层析流穿峰进行上样层析，收集并获得洗脱液，再将所得洗脱液经过滤后获得重组人促卵泡生成素纯化液。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述平衡缓冲液，是pH为6.0-10.5，浓度为5-100mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1)所述亲和层析，所用冲洗缓冲液中所含盐为NaCl，Na2SO4，Na3PO3，或(NH4)2SO4，浓度为150-700mmol/L；所用洗脱缓冲液中所含盐为NaCl，Na2SO4，Na3PO3，或(NH4)2SO4，浓度为1.2-2.0mmol/L。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤2)所述疏水层析，层析介质为苯基凝胶Phenyl-HP或CaptoPhenyl。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述脱盐层析，层析介质为G-15或G-25。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述羟基磷灰石层析，层析介质为CHT陶瓷羟基磷灰石或CFT氟代羟基磷灰石介质。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤5)所述阴离子交换层析，层析介质为含有配基季铵基或二乙胺乙基的Capto-Q，CaptoDEAE，QSepharoseFF，QSepharoseHP，DEAESepharoseFF或CaptoQimpRes；洗脱缓冲液所用盐为NaCl，浓度为70-300mmol/L。
10.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)澄清重组人促卵泡生成素的丰收液，利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡后，将经过澄清的丰收液上样层析，层析过程中所用冲洗缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为400-600mmol/L；所述洗脱缓冲液，所用盐为NaCl，浓度为1.5-1.7mmol/L，收集并获得亲和层析洗脱液；
2)利用步骤1)中的洗脱缓冲液平衡输水层析柱，再在将步骤1)所得的亲和层析洗脱液上样层析，层析介质为苯基凝胶CaptoPhenyl，收集并获得疏水层析流穿液；
3)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液平衡脱盐层析柱后，再将步骤2)所得的疏水层析流穿液上样到脱盐层析柱中进行脱盐，脱盐层析介质为G-25，收集并获得脱盐蛋白液；
4)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，再将步骤3)所得的脱盐蛋白液进行上样层析，层析介质为CFT氟代羟基磷灰石介质，收集并获得羟基磷灰石层析流穿峰；
5)利用pH为7.0-8.0，浓度为20-40mmol/L的Tris-HCl或磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡后，将步骤4)所得的羟基磷灰石层析流穿峰进行上样层析，层析介质为CaptoQimpRes，洗脱液是浓度为80-150mmol/L的NaCl溶液，收集并获得洗脱液，再将所得洗脱液经过滤后获得重组人促卵泡生成素纯化液。
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