CN106478801A - 一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。步骤为，强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。所述方法操作步骤更少，缩短了生产周期、提高了回收率，纯度高，均一性好，体外生物活性极高，通常大于1.5×10⁵ U/mg，远高于市场中注射用鼠神经生长因子（0.5×10⁵ U/mg）。

Description

一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的 方法

技术领域

本发明涉及生物纯化方法，尤其涉及一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。

背景技术

神经生长因子（NGF）是最早发现的神经系统营养因子，其作用广泛，对中枢和周围神经细胞的生长、发育、分化及再生具有重要作用，其中β亚单位是NGF的活性区。通常所说的β-hNGF是118个氨基酸成熟肽。在人体内，β-NGF的表达有下列过程：1.β-NGF编码序列（723 bp）翻译为prepro-hNGF（241aa），包括信号肽（1-18aa）、导肽（19-121aa）、成熟肽（122-241aa）；2.内质网上，信号肽被水解，形成pro-hNGF，包括导肽与成熟肽。导肽末端有4个氨基酸残基（118-121aa）Arg-Ser-Lys-Arg，为哺乳动物前体蛋白加工酶识别位点，导肽在高尔基体中被前体蛋白加工酶水解，形成hNGF(120aa)；3.hNGF在7S hNGF中γ亚基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽（118aa）。目前商品化的神经生长因子药物为鼠源β-mNGF如恩经复®（NOBEX），是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化获得。广泛应用于眼科、神经外科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗。

虽然鼠源神经生长因子（mNGF）与人源神经生长因子（hNGF）具有极高的同源性，但动物源性的蛋白质存在潜在的免疫原性，且生产需要大量的合格的雄性小鼠颌下腺。因此开发基因工程技术重组表达hNGF的制备方法，将是未来NGF药物研发的趋势。在众多表达系统中，相对于原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等，哺乳动物细胞表达系统具有许多优势，例如正确有效的翻译后修饰，是蛋白质能正确的折叠成最接近天然分子的结构；能有效分泌蛋白质至细胞外，且宿主本底表达较低，利于纯化等。

重组hNGF发酵液上清中，包含有宿主细胞污染物、hNGF的不同变体（如错误折叠形式、电荷异构体、部分加工的前体序列、糖基化的形式等）。开发一种将hNGF从这些污染物及错误变体形式中分离出来的方法，是获得高质量重组hNGF的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产周期短、操作步骤少、回收率高、纯度高、均一性高、体外活性高的从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。

为实现上述目的， 本发明提供一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，步骤为，

强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；

疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。

进一步，所述哺乳动物细胞培养物为CHO细胞培养物。

进一步，所述强阳离子交换层析步骤中，澄清后的哺乳动物细胞培养物上清的pH为5.0-8.0，电导低于10 mS/cm；优选的，pH为6.0。

进一步，所述强阳离子交换层析步骤中，缓冲液洗脱条件为：pH5.0-8.0，升高的盐浓度梯度，；优选的，为线性梯度洗脱，盐浓度梯度为0.2-0.8 mmol/L，梯度长度10-30 柱体积。

进一步，所述疏水层析步骤中，第一重组人神经生长因子处理后的pH为5.0-8.0，盐浓度为0.5M-1.5M。

进一步，所述疏水层析步骤中，疏水作用层析的树脂配基为苯基、辛基或丁基。

进一步，所述疏水层析步骤中，洗脱缓冲液的洗脱条件为：pH5.0-8.0，梯度洗脱，降低的盐浓度梯度，优选的，为线性梯度洗脱，梯度长度10-30 柱体积；

任选的，所述盐为硫酸铵、柠檬酸盐、乙酸铵或氯化钠。

进一步，所述疏水层析的树脂为Phenyl Sepharose High Performance。

进一步，所述疏水层析的洗脱缓冲液中含有体积百分比为5%-20%的醇试剂；优选乙醇试剂。

进一步，所述疏水层析的洗脱缓冲液中含有体积百分比为0.1%-1%的非离子型表面活性剂；优选的，含有体积百分比为0.1%-1%的Tween 80。

研究表明，功能活性的β-hNGF是一个同源二聚体结构，每个单体中有三对二硫键，从而形成半胱氨酸簇结构。这个特殊的结构为β-hNGF生物功能的维持所必须。β-hNGF二聚体由两个相同的单体组成，每个单体的折叠由三个伸长的扭曲的β转角连接的三对反平行β折叠组成，而且每个单体的上部是三个β发夹环，中部是二硫键核心。整个分子呈长形，有一个平的疏水性很强的表面，该表面使两个单体间通过“半胱氨酸结(cysteine-knot)”连接成二聚体。

β-hNGF单体保守的分子结构主要包括两对反向平行的β折叠，β折叠构成了NGF长而扁平的构型，其中包括六个半胱氨酸残基（cysteines），组成三对二硫键。这三对二硫键为组成NGF的结构提供刚性支持，其中两个二硫桥Cys58-Cys108、Cys68-Cys110和内部的残基59-67及109形成一个环结构，第三个二硫桥Cys15-Cys80穿过该环形成一个紧密包裹的“半胱氨酸结”，这种结构使得两个NGF单体中的β折叠互相包裹，组成一个较大的由芳香族氨基酸残基构成的疏水单体交界面，沿着两个单体平面的轴形成了NGF二聚体的活性分子，组成疏水面的氨基酸残基对NGF三维结构的形成起了主要作用，还有一些氨基酸残基通过氢键和盐键，辅助支持三维结构的稳定性。当与高亲和力TrkA受体结合时，保守结构，尤其是β3β4折叠片对形成配体受体复合物起到支持作用，因为这种结合需在NGF二聚体的疏水面上进行。

哺乳动物细胞培养的重组β-hNGF，其发酵液上清中含有不正确蛋白水解加工的变体，如含部分前体序列变体，前体NGF，杂交前体NGF和剪接的前体NGF序列，还存在糖基化的NGF以及不正确蛋白水解加工变体的糖基化形式。糖基化形式可形成分子量较高的聚合体，可能在体内产生不良的免疫原性。由于这些hNGF变体的疏水性不如天然结构hNGF，因此可以采用疏水作用层析分离这些变体形式，在hNGF洗脱峰的前缘，先于天然结构hNGF洗脱下来。此外，哺乳动物细胞培养的重组hNGF，发酵液上清中还存在电荷异构体，如氨基甲酰化、氧化、异天冬氨酸、脱酰胺化和某些剪接形式（如C端截短）。通过阳离子交换层析可以将这些变体与天然结构hNGF分离开来。

本发明所述方法，组合了强阳离子交换层析与疏水层析（HIC）两步层析，通过强阳离子交换层析从哺乳动物细胞发酵液上清中捕获、富集重组hNGF，并分离电荷异构体；通过疏水层析精细纯化重组hNGF，去除不正确的蛋白水解加工变体及糖基化形式，最终获得的组份是几乎纯的重组人神经生长因子，几乎不含神经生长因子变体，体外生物活性极高。hNGF的纯度通常大于99.0%，体外生物活性可达1.5×10⁵ U/mg。

使用含成熟118氨基酸的hNGF编码DNA序列的重组哺乳动物细胞发酵hNGF。优选的，哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）。为了使重组hNGF能正确折叠、加工并分泌至培养液中，编码DNA序列应含信号肽序列及hNGF导肽序列。一种优选的培养模式为流加方式进行补料培养，至细胞活力低于70%结束。

强阳离子交换层析

发酵后，收获细胞培养液。进行层析前需澄清培养液，优选的，使用深层过滤。调整细胞培养液pH为5.0-8.0，优选的pH为6.0，电导低于10 mS/cm。可使用超滤或稀释对发酵液上清进行调整，大规模培养时，优选的使用切向流超滤系统。不同pH条件下进行的强阳离子交换层析，层析树脂为SP Sepharose Fast Flow（SP FF）,收集得到的组分SDS-PAGE结果如图1所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1-4泳道分别为pH 5.0、6.0、7.0、8.0结合条件下强阳离子交换层析洗脱组分，结果说明，pH 5.0-8.0范围内，hNGF均可结合至SP FF树脂上，并被洗脱下来。

层析树脂选用强阳离子交换层析树脂，配基为SP、S等。在本发明的一个实施例中，使用了SP Sepharose Fast Flow。该树脂具有高载量（70mg核糖核酸酶/毫升树脂）、良好的分辨率、较高的流速（可达300cm/h）、良好的化学稳定性等特点，特别适用于从大规模的培养物中捕获并富集hNGF，将hNGF从宿主细胞污染物中分离出来。且其具有良好的分辨率，可一定程度上分离hNGF的电荷异构体。层析柱经平衡缓冲液平衡（pH5.0-8.0），上样后，采用升高的盐梯度洗脱，优选的为梯度洗脱，盐浓度梯度为0.2-0.8 mmol/L，梯度长度10-30 柱体积。收集电导超过25mS/cm后洗脱得到的组分。

疏水层析

疏水层析中，树脂的配基可以是苯基（phenyl）、辛基（octyl），丁基（butyl），最优的为苯基。不同疏水作用配基层析所收集的组分，其SDS-PAGE结果如图2所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1-5分别为phenyl HP、phenyl HS、phenyl LS、octyl、butyl配基洗脱组分。结果说明phenyl HP、phenyl HS、phenyl LS、octyl及butyl配基层析获得的组分，均为单一蛋白质条带，均可达到较好的纯化效果，各配基层析图谱如图3所示，其中A为phenyl HP、B为phenyl HS、C为phenyl LS、D为octyl、E为butyl，图谱显示phenylHP配基树脂洗脱峰较窄，分辨率更高。

在本发明的一个较优实施例中，使用了Phenyl Sepharose High Performance树脂。该树脂颗粒大小为34 μm，可提供较高的分辨率。

疏水层析中使用的盐，可以是硫酸铵、柠檬酸盐、乙酸铵、氯化钠等，盐浓度为0.5mol/L-1.5mol/L，以使hNGF结合至树脂上。

疏水层析中，缓冲液添加剂可以用来改善选择性和分辨率。醇类与表面活性剂可以改变溶液极性，减少水的表面张力，因此可以减弱蛋白与配基间相互作用并导致解离。其非极性区还可以与蛋白竞争疏水配基，从而造成解离。hNGF具有很强的疏水性，高盐、高浓度条件下与疏水配基结合紧密，也易引起沉淀。缓冲液中添加一定浓度的醇类及表面活性剂可改善hNGF的结合与洗脱，获得更高的选择性与分辨率。一定浓度的表面活性剂可以形成胶束，hNGF的疏水表面可埋藏在微胶束的内部，这样有利于增加强疏水性蛋白质的溶解度，防止其聚集沉淀，保持其天然的活性构象。

阳离子交换层析获得的组合物，调节其盐浓度，上样后，采用降低的盐梯度洗脱，洗脱缓冲液添加有醇试剂及非离子型表面活性剂，优选的为5%-20%乙醇、0.1%-1% Tween80。

本发明利用NGF可结合在阳离子交换剂上，用阳离子交换层析分离天然结构NGF与电荷异构体；同时NGF具有很强的疏水性，该性质是维持其活性结构所必须的，不正确加工的变体不具备活性或者活性差，其疏水性和天然结构NGF有差异，因此可以用疏水作用层析分离天然结构NGF和不正确加工的变体。

本发明与之前公开的hNGF纯化方法相比，具有如下优点：

1.操作步骤更少，仅需经两步层析，即可获得纯的重组hNGF，缩短了生产周期、提高了回收率，纯度通常大于99.0%，回收率通常大于71.4%。

2.避免使用反向层析技术。减少了乙腈等试剂对蛋白活性的影响。

3.避免使用凝胶过滤技术。凝胶过滤技术对样品上样量有较大限制，上样前一般需要对样品进行浓缩操作。浓缩过程中蛋白质易聚集、变性、沉淀，这样大大增加了样品的粘稠度，将影响凝胶过滤的分辨率，并降低hNGF的回收率。

4.采用疏水层析分离hNGF，可去除重组表达过程中产生的不正确加工形态的hNGF形式，获得的hNGF几乎不含不正确形态，均一性好，体外生物活性极高，通常大于1.5×10⁵ U/mg，远高于市场中注射用鼠神经生长因子（0.5×10⁵ U/mg）。

附图说明

图1是不同pH结合条件下强阳离子交换层析（SP FF）洗脱组分SDS-PAGE结果；

图2是不同疏水作用配基洗脱组分SDS-PAGE结果；

图3是不同疏水作用配基层析图谱；

图4是pH6.0结合条件下强阳离子交换层析层析图谱；

图5是疏水作用层析图谱；

图6是强阳离子交换层析（pH6.0）组分及疏水作用层析(phenyl HP)组分SDS-PAGE结果；

图7是高效液相色谱检测重组人神经生长因子纯化组分纯度结果；

图8是高效反向液相色谱检测重组人神经生长因子纯化组分结果；

图9是重组人神经生长因子纯化组分刺激TF-1细胞增殖的剂量效应曲线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，“第一”、“第二”、“第三”等为指代或描述方便，不能理解为有顺序关系或者有相对重要性指示，除非另有说明，“多个”、“多组”、“多重”的含义是两个（组或重）或两个（组或重）以上。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

1.阳离子交换层析

使用ÄKTA Purifer100层析系统来进行亲和层析，色谱柱为HiTrap SPSepharos FastFlow（SP FF） 1 mL。仪器操作按操作指南进行，A1泵为Buffer A（50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.0），B1泵为Buffer B（50 mmol/L磷酸盐缓冲液，0.8mol/LNaCl，pH6.0）。

清洗：以0.1mol/LNaOH,流速1 ml/min,冲洗SP FF树脂柱5 个柱体积（CV），再用超纯水以流速1 ml/min清洗5 cv，去除SP FF树脂上的杂质残留。

平衡: Buffer A以 1 ml/min流速冲洗10CV ，以维持SP FF树脂处于适合hNGF结合的环境中。

上样：澄清过滤后的发酵液，用去离子水稀释发酵液至电导低于10 mS/cm，并调节pH至6.0。以1 ml/min的速率通过SP FF树脂，使hNG结合至配基上。

冲平：Buffer A以1 ml/min流速冲洗至280 nm吸收值低于0.01。

洗脱：以1 ml/min流速，梯度洗脱，梯度长度为15CV，梯度范围为0-100 % BufferB，收集洗脱峰。

层析图谱如图4所示，结果显示，随着电导梯度升高，洗脱得一带拐点的峰。收集电导超过25 mS/cm后的洗脱组分（阴影部分）。SDS-PAGE结果如图6所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为强阳离子交换层析组分1,2泳道为强阳离子交换层析组分2，可以看出，杂蛋白主要存在于组分1中，而hNGF主要存在于组分2中，通过切峰收集组分2，捕获了发酵液中绝大部分的hNGF，并与大部分的杂蛋白质分离。

2.疏水层析

使用ÄKTA Purifer 100层析系统来进行亲和层析，色谱柱为HiTrap PhenylSepharosHigh Performance（Phenyl HP） 1 mL。仪器操作按操作指南进行，A1泵为BufferA（50 mmol/L磷酸盐缓冲液，1 mol/L NaCl，0.1% Tween 80,pH 6.0）；B1泵为Buffer B（50mmol/L磷酸盐缓冲液，20% 乙醇，0.1% Tween 80,pH 6.0）。

清洗：以0.1mol/L NaOH,流速1 ml/min,冲洗SP FF树脂柱5 个柱体积（CV），再用超纯水以流速1 ml/min清洗5 CV，去除Phenyl HP树脂上的杂质残留。

平衡: Buffer A以 1 ml/min流速冲洗10 CV ，以维持Phenyl HP树脂处于适合hNGF结合的环境中。

上样：澄清过滤后的SP FF收集组分，调整盐浓度至1 mol/L NaCl，并添加终浓度为0.1%的Tween 80，以1 ml/min的速率通过Phenyl HP树脂，使hNG结合至配基上。

冲平：Buffer A以1 ml/min流速冲洗至280 nm吸收值低于0.01。

洗脱：以1 ml/min流速，梯度洗脱，梯度长度为10CV，梯度范围为0-100 % BufferB，收集洗脱峰。

层析图谱如图5所示，结果显示，随着电导梯度下降，洗脱得一尖锐的峰。去除洗脱峰前缘及后缘部分，收集阴影部分组分（电导45 mS/cm-20 mS/cm），即为纯的hNGF。SDS-PAGE结果如图6所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，3泳道为疏水作用层析组分，从图中可以看出，该组分仅含单一条带，扫描分析其纯度为99%。

3.纯度分析

参照2015版《中国药典》第三部0512高效液相色谱法。

高效液相色谱仪及检测器：Waters e2695型HPLC仪（Waters 2998 PAD检测器）。

采用Tosho G3000SWxl色谱柱（300 mm × 7.8 mm，4 µm），流动相为0.15 mol/L磷酸缓冲液（含0.1 mol/L Na₂SO₄，pH7.0）：乙腈=85:15，流速0.8 mL/min，检测波长为280 nm，柱温30 ℃。

采用面积归一化法，取疏水作用层析得到的纯化组分，进样后记录色谱图，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。结果如图7所示。色谱图中，可见于保留时间13.232 min处有一主峰，系统自动积分后，测得主峰占总峰面积百分率为99.11%，对称因子为1.11，符合2015版《中国药典》规定。

4.高效反向色谱分析

高效液相色谱仪及检测器：Waters e2695型HPLC仪（Waters 2998 PAD检测器）。采用四烷基丁基键合硅胶反相C4色谱柱柱，检测波长为280 nm，柱温30 ℃。流动相为：A：0.1%TFA水溶液，B：0.1%TFA乙腈溶液，以0.22μm 滤膜过滤，超声脱气10 min后使用，进行变梯度洗脱。洗脱条件为：0-30 min由10%B升到40%B，30-35 min由40%B升到90%B，35-36 min由90%B降到10%B，36-41min维持10%B 5 min（均为体积百分数）。流速：1.0 ml/min。

采用面积归一化法，取疏水作用层析得到的纯化组分，进样后记录色谱图，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。结果如图8所示。色谱图中，可见于保留时间23.748min处有一主峰，峰单一尖锐，显示疏水作用层析纯化组分较为单一，均一性好。

5.体外生物活性分析

参照2015版《中国药典》鼠神经生长因子生物学活性测定法，第二法：TF-1细胞/MTS比色法。

TF-1细胞法是基于TF-l细胞系的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）高度依赖性，利用NGF与TF-1细胞表面的NGF高亲和力受体TrkA结合后诱导TF-1细胞增殖的特点，建立的一种新的NGF活性测定方法。该方法目前已成为检测重组人神经生长因子（rhNGF）WHO参考品的标准方法。

TF-1细胞培养：TF-1细胞株用完全培养基于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵～5.0×10⁵个细胞，传代后第二天用于NGF生物学活性测定。

细胞悬液制备：取足量细胞培养液1000 g离心5min，弃去上清，收集TF-1细胞。加入5ml 基础培养基重悬细胞，1000 g离心5min后弃去上清，如此洗3次后重悬于基础培养基并配成每1ml约含6.0×10⁴个细胞的细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳条件下备用。

标准品溶液制备：取1支分装好的重组人神经生长因子活性标准品（购自英国国家生物学标准和质控物研究所（NIBSC），货号93/556），用基础培养基稀释10倍，至每1ml含100U。

检品溶液制备：检品用基础培养基进行预稀释，每步稀释最大不超过10倍，至每1ml约含100 U。

检品梯度制备：

96孔细胞培养板选取除第1列和第12列外的相邻两列作为标准品列或检品列；

在96孔细胞培养板的检品列和标准品列除A孔外，每孔加入100μl基础培养基；

检品列或标准品列A孔每孔分别加入150μl检品溶液或标准品溶液；

自A行至H行将检品溶液或标准品溶液进行3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个复孔，每孔分别留100μl溶液，弃去孔中多余溶液；

向检品列和标准品列每孔加入100μl细胞悬液，向空白列每孔加入200μl无菌水；

将96孔细胞培养板放入湿盒中，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中静置培养66-72h。

检品列和标准品列每孔加入MTS溶液20μl后将96孔板放回湿盒中，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中静置培养3h。

将96孔细胞培养板放入酶标仪，以550nm为参比波长，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。

结果判定:

试验数据采用SoftMax® Pro 5 Software数据分析软件进行处理，并编入按下式计算结果：

检品生物学活性（U⁄ml）

式中,Pr为标准品生物学活性，U/ml；

Ds为检品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es为检品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效量的稀释倍数。

检品比活性（U/mg）=检品生物学活性/蛋白含量。

重组hNGF刺激TF-1细胞增殖剂量的效应曲线如图9，四参数如表1所示，拟合方程为。从图中可以看出，稀释至133.33ng/mL的梯度组，其与标准品的剂量效应曲线一致。该曲线符合四参数拟合方程。计算表明hNGF的比活为1.515×10⁵ U/mg。

表1 量效曲线拟合方程的参数表

	A	B	C	D	R2
						标准品	0.0184	1.42	2.02	0.232	0.998
检品	0.0122	1.22	2.00	0.236	0.999

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，步骤为，

强阳离子交换层析：将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；

疏水层析：将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。

2.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞培养物为CHO细胞培养物。

3.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述强阳离子交换层析步骤中，澄清后的哺乳动物细胞培养物上清的pH为5.0-8.0，电导低于10 mS/cm；优选的，pH为6.0。

4.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述强阳离子交换层析步骤中，缓冲液洗脱条件为：pH5.0-8.0，升高的盐浓度梯度；优选的，为线性梯度洗脱，盐浓度梯度为0.2-0.8 mmol/L，梯度长度10-30 柱体积。

5.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析步骤中，第一重组人神经生长因子处理后的pH为5.0-8.0，盐浓度为0.5M-1.5M。

6.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析步骤中，疏水作用层析的树脂配基为苯基、辛基或丁基。

7.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析步骤中，洗脱缓冲液的洗脱条件为：pH5.0-8.0，梯度洗脱；优选的，为线性梯度洗脱，降低的盐浓度梯度，梯度长度10-30 柱体积；

任选的，所述盐为硫酸铵、柠檬酸盐、乙酸铵或氯化钠。

8.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析的树脂为Phenyl Sepharose High Performance。

9.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析的洗脱缓冲液中含有体积百分比为5%-20%的醇试剂；优选乙醇试剂。

10.权利要求1所述从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法，其特征在于，所述疏水层析的洗脱缓冲液中含有体积百分比为0.1%-1%的非离子型表面活性剂；优选的，含有体积百分比为0.1%-1%的Tween 80。