CN107973848A - 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法。即从含有人或鼠神经生长因子的溶液中，采用金属离子螯合层析进行分离纯化，得到天然序列神经生长因子；所述金属离子螯合层析树脂由支持介质、螯合配基和金属离子组成；所述金属离子螯合于螯合配基上；所述洗脱的条件为改变蛋白质与金属离子配位结合的竞争性物质浓度梯度。还可以在金属离子螯合层析前，先进行强阳离子交换层析；在金属离子螯合层析后，再进行高效强阳离子交换层析。采用本发明的方法可快速纯化分离天然序列、不带任何蛋白标签的神经生长因子。

Description

一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法

技术领域

本发明涉及生物技术纯化领域，尤其涉及一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是最早发现的神经系统营养因子，其作用广泛，对中枢和周围神经细胞的生长、发育、分化及再生具有重要作用，其中β亚单位是NGF的活性区。通常所说的β-NGF是118个氨基酸成熟肽。在人体内，β-NGF的表达有下列过程：1.β-NGF编码序列(723bp)翻译为prepro-NGF(241aa)，包括信号肽(1-18aa)、导肽(19-121aa)、成熟肽(122-241aa)；2.内质网上，信号肽被水解，形成pro-NGF，包括导肽与成熟肽。导肽末端有4个氨基酸残基(118-121aa)Arg-Ser-Lys-Arg，为哺乳动物前提蛋白加工酶识别位点，导肽在高尔基体中被前体蛋白加工酶水解，形成NGF(120aa)；3.NGF在7S NGF中γ亚基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽(118aa)。目前商品化的神经生长因子药物为鼠源β-mNGF如(NOBEX)，是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化获得。广泛应用于眼科、神经外科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗。

虽然鼠源神经生长因子(mNGF)与人源神经生长因子(hNGF)具有极高的同源性，但动物源性的蛋白质存在潜在的免疫原性，且生产需要大量的合格的雄性小鼠颌下腺。因此开发基因工程技术重组表达hNGF的制备方法，将是未来NGF药物研发的趋势。在众多表达系统中，相对于原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等，哺乳动物细胞表达系统具有许多优势，例如正确有效的翻译后修饰，使蛋白质能正确得折叠成最接近天然分子的结构；能有效分泌蛋白质至细胞外，且宿主本底表达较低，利于纯化等。

无论是动物组织来源或重组表达的β-NGF，均含有杂蛋白、多聚体、水解误加工形式的β-NGF变体、电荷异构体等不同形式的污染物或β-NGF变体，这些不同形式的β-NGF变体大大影响了β-NGF活性。开发一种将天然118aa序列的β-NGF从这些污染物及错误变体形式中分离出来的方法，是获得高质量重组β-hNGF或动物源β-NGF的关键。

现有市场上的NGF为鼠源且是动物组织提取，存在免疫原性、鼠源病毒等风险。无论是动物组织提取的β-NGF，还是重组表达的β-NGF，都存在有多种变体，比如水解误加工变体、多聚体、电荷异构体。现有的β-NGF纯化技术方案缺点有：难以除去水解误加工变体，产品中存在氨基酸序列截短的NGF；难以除去各种电荷异构体(比如氨基甲酰化、氧化、异天冬氨酸、脱酰胺化等形式)。或者可以制备变体较少的β-NGF，但需要多个层析步骤，例如离子交换层析-疏水作用层析-高效离子交换层析-反向层析，而且反向层析应用到有机试剂，容易使蛋白变性。水解误加工变体，缺失了部分对NGF活性起关键作用的氨基酸残基，大大影响活性。有效去除水解误加工变体可以提高活性。中国专利CN 1268639C中认为疏水作用层析可以去除水解误加工变体。

现有分离提取神经生长因子的技术方法中，存在着难以分离水解误加工变体、电荷异构体的技术难点，分离得到的神经生长因子存在着多种影响活性的变体。抑或为了获得变体含量较少的神经生长因子，需要通过多个层析步骤方才实现，例如通过疏水作用层析、离子交换层析、反向层析等四步层析方法，且反向层析过程中的有机试剂影响活性。

20世纪70年代，Porath等首先提出金属离子螯合层析(Immobilized Metal IonAffinity Chromatography，IMAC)，利用螯合配基将金属离子固定在基架上，通过固定金属离子与蛋白质的配位作用进行分离。由于固定金属离子对表面含有组氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基等的蛋白质具有强烈亲和作用，因此该法广泛用于蛋白质的分离与纯化，已成为研究生物大分子不可缺少的工具。最广泛的应用，即利用金属螯合亲和层析纯化带有6×组氨酸标签的重组蛋白质。该方法可快速从重组培养物中将带有6×组氨酸标签的重组蛋白质从杂蛋白中分离出来，快速、简便、特异性好、纯度高，往往一步纯化即可获得纯度超过90％的重组蛋白。

但是对于没有标签的天然蛋白β-NGF，如何更好的分离和纯化，是目前需要解决的一个难题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过金属离子螯合层析技术快速纯化分离天然序列、不带任何蛋白标签的神经生长因子的方法。更佳的，将活性高、序列正确的118aa(如SEQ ID NO:1、NO:2所示)神经生长因子从多聚体及不正确水解加工的变体中纯化分离的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法，该混合物为含有人或鼠神经生长因子的溶液，其特征在于，采用金属离子螯合层析对混合物进行分离纯化，得到天然神经生长因子；

其中，所述混合物的pH为6.5-8.5，盐浓度为0.1M-1.0M；

所述金属离子螯合层析树脂由支持介质、螯合配基和金属离子组成；所述金属离子螯合于螯合配基上；

所述分离纯化的洗脱条件为改变蛋白质与金属离子配位结合的竞争性物质浓度梯度。

进一步，所述混合物的pH为7.5；

任选的，所述溶液为组织匀浆液上清、发酵液上清或包涵体重折叠蛋白质溶液。

进一步，所述含有人或鼠神经生长因子的溶液为含有天然来源或重组表达的人或鼠神经生长因子溶液；优选的，所述重组表达为原核表达或真核表达；

任选的，所述神经生长因子的序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

进一步，所述螯合配基为含有3、4或5个配位位点的螯合物；

任选的，所述金属离子为Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe3、Al³⁺、Ga²⁺、In³⁺、Tl³⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、La³⁺、Nd³⁺、Eu³⁺、Hg²⁺、K⁺、Yb³⁺、Mg²⁺或Ca²⁺；优选的，所述金属离子为Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺或Ni^{2 +}。

进一步，所述分离纯化的平衡缓冲液的pH为6.5-8.5，盐浓度为0.1-1M。

进一步，所述分离纯化的洗脱缓冲液pH值为7.5-9.0，洗脱缓冲液中的竞争剂浓度为0.1-2.0M；优选的，洗脱的洗脱缓冲液pH值为8.5；

任选的，所述分离纯化的洗脱缓冲液中竞争剂为咪唑、组氨酸、甘氨酸、组胺、NH4⁺盐或氨水；优选的，洗脱的洗脱缓冲液为0.5-2.0M的NH₄Cl。

进一步，所述分离纯化的条件为降低的pH值梯度，pH值梯度范围为6.0-3.0，优选的，为使用乙酸盐缓冲系统；优选的，为pH3.5、含有0.5-1M盐的乙酸盐缓冲液。

进一步，所述混合物在采用金属螯合层析对混合物进行纯化前，先进行强阳离子交换层析；在采用金属螯合层析对混合物进行纯化后，进一步采用高效强阳离子交换层析分离纯化。

进一步，所述强阳离子交换层析为，将所述混合物在pH5.5-6.5，电导低于15mS/cm的条件下加样至颗粒直径为40-90μm的强阳离子交换层析树脂上，用含0.6M NaCl，pH 5.5-6.5的缓冲液梯度洗脱；优选的，所述强阳离子交换层析树脂为SP Sepharose FF。

进一步，所述高效强阳离子交换层析为，将采用金属螯合层析所得样品在pH8.0-8.5，电导低于5mS/cm的条件下加样至颗粒直径为15-40μm的高效强阳离子交换层析树脂上，用含0.3M NaCl，pH8.0-8.5的缓冲液梯度洗脱；优选的，所述高效强阳离子交换层析树脂为SP Sepharose HP、Macro-Prep 25S Resin或Fractogel EMD SO3-(S)。

本发明所述混合物含有其他杂质(宿主DNA、脂类等)、杂质蛋白(宿主蛋白、提取来源组织的蛋白等)以及神经生长因子的变体。

本发明的混合物经过金属离子螯合层析，β-NGF的纯度可以得到90％以上，几乎都是118aa的β-NGF。但纯的β-NGF中，其中可能会存在一些不同形式的β-NGF，比如电荷异构体。采用高效强阳离子交换层析分离神经生长因子电荷异构体，可以进一步去掉这些电荷异构体，得到更加纯化的β-NGF。

金属离子螯合层析的洗脱，是通过破坏蛋白氨基酸残基和金属离子间的配位作用。本发明通过竞争性基团(如咪唑、组氨酸、甘氨酸、组胺、铵盐、氨水等竞争剂)去竞争氨基酸残基与金属离子的配位位点或使氨基酸残基质子化(即降低pH，使氨基酸残基与H⁺结合)，从而破坏氨基酸残基与金属离子的配位作用。本发明的竞争剂(如咪唑)或低pH洗脱，均可较好地洗脱神经生长因子，但部分洗脱条件洗脱强度较大，容易将结合较牢固的多聚体一并洗脱。适当pH及浓度的氯化铵溶液，洗脱较为温和，可以提供较好的洗脱选择性和分辨率，并且不会同时洗脱多聚体，结果见图1。其中A中泳道1为150mM咪唑洗脱；泳道2为含0.5M NaCl的pH3.5乙酸盐缓冲液洗脱；B中泳道1-4分别为pH8.5,0.5、1.0、1.5、2.0M NH₄Cl的洗脱图。从图1可知，使用氯化铵溶液洗脱比较温和，可以得到比较好的结果，SDS-PAGE凝胶中仅显示单一的蛋白条带；而用咪唑或者低pH洗脱，SDS-PAGE凝胶中除了β-NGF条带，还显示了其他高分子量的蛋白条带，说明该洗脱方式容易将结合牢固的多聚体一起洗脱。

选择不同的金属离子作为螯合配基的结合对象，因其所带电荷、离子半径和电子层结构的不同，对同一蛋白质也会呈现出不同的结合能力。在本发明的一个实施例中，使用了IDA-Cu²⁺-Saepharose(Chelating Sepharose FF)金属螯合层析树脂从重组CHO细胞表达物上清中快速纯化分离了重组人β-NGF。Cu²⁺在形成配位化合物时，1个3d轨道上的电子先跃迁到4p轨道中形成1个3d单电子轨道和1个4p单电子轨道，而后1个3d轨道、1个4s轨道和2个4p轨道杂化形成dsp2杂化轨道，可提供4个配合位点。与3个配合位点的IDA结合后，余下一个配合位点与蛋白质形成配位化合物。由于在形成配位化合物过程中，Cu²⁺的3d、4p单电子轨道与配位体的π电子形成大π键，因此Cu²⁺配位化合物更稳定，在纯化的捕获阶段，将目的蛋白快速地从不稳定的、含有污染物的环境中富集、分离开来。该实施例中，SEC-HPLC(图3)结果显示重组人β-NGF及其变体的纯度可达95％，实现了快速富集、分离目的蛋白的目的。

β-NGF包含4个组氨酸残基，其中两个位于N端前8个残基中。定点突变技术显示H4对高亲和力受体结合是必需的，是Trk A的磷酸化位点。其余两个组氨酸残基位于75和84位，H75侧链与D72以氢键相连，有利于稳定这个区域的构象；H84直接参与结合Trk A。利用水解切割和定点突变使β-NGF缺失氨基端前10个氨基酸残基，缺失体显著降低了与Trk A的结合力和生物学活性。N端区由于其柔韧性所以是受体的接触区；β-NGF的C端缺失也影响活化Trk A和诱导PC12细胞分化的能力，说明C端可能参与Trk A的非特异性反应.研究发现，以下氨基酸残基介导β-NGF与Trk A的相互作用，包括N端的3-9残基、I区的I31、II区的E41、N45、IV区的Y79、T81、H84和V区的94-98残基，它们对结合Trk A及生物学活性非常重要。

天然提取的β-NGF，由于颌下腺提取物中两种特异性酶的切割作用，35％N端缺少8个氨基酸残基(H8与R9间)，17％-20％C端缺少Arg残基(117变体)。哺乳动物细胞尤其是CHO细胞表达的重组β-NGF，其发酵液中，往往具有多种N端和C端发生误加工水解产生的变体，包括成熟的114AA(1-114)，115AA(1-115)、117AA(1-117)变体，氨基酸H8和R9间及R9和G10间发生断裂的变体，导肽剪切不完全变体如proNGF中R-39与S-38间的N端断裂的导肽剪切不完全变体。此外，还存在β-NGF的多聚体形式。这些误加工变体及多聚体，因缺少多个与维持活性或空间结构相关的氨基酸残基，其活性较成熟118aaβ-NGF大大降低。

β-NGF变体，其氨基酸序列及空间构象均与正确的β-NGF存在差异，因此其与金属离子的结合能力存在不同。例如，N端H8与R9断裂的β-NGF截短分子，与成熟118分子相比，缺少了2个与金属离子亲和力极高的组氨酸残基，其与金属离子的结合能力相对减弱。因此，在适当的结合与洗脱条件下，可以通过金属螯合亲和层析，将成熟118分子形式的β-NGF与多聚体及水解误加工的各种形式分子快速分离开来，获得活性更高的天然序列NGF。本发明所得的经金属螯合层析纯化的β-NGF，其活性≥1.0×10⁶U/mg，远高于市售注射用鼠神经生长因子标示的0.5×10⁶U/mg。

在本发明的一个实施例中，使用了IDA-Zn²⁺-Sephrose HP金属螯合层析树脂(Chelating HP，GE Healthcare)，从重组CHO细胞培养物上清中将天然序列的重组人β-NGF(118aa)与其他误加工水解变体分离开来。Zn²⁺离子在形成配位化合物时，由1个4s轨道3个4p轨道杂化形成sp3杂化轨道，可提供4个配合位点。与3个配位数的IDA螯合后，仅余一个配合位点与蛋白质形成配位复合物。因此相对于其他可提供6个配合位点的金属离子(如Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺等)，其蛋白质亲和力相对较弱，可减少非特异性吸附并降低水解误加工变体的亲和力。Sephrose HP基架为高度聚合的琼脂糖，其粒径小，仅为34μM，这在层析过程中将提供极高的分辨率，利于不同亲和程度的水解误加工变体的洗脱分离。层析图谱如图4，在梯度洗脱过程中，分离得到了较为明显的4个峰组分。将收集得到的组分进行高分辨率的Tricine-SDS-PAGE分析，结果如图5所示(其中泳道1为穿透，泳道2为峰1，泳道3为峰2，泳道4为峰3，泳道5为峰4前缘，泳道6为峰4)，电泳结果显示，天然序列重组人β-NGF与其他有分子量差异的水解误加工形式变体得到了有效分离，分子量更小的截短重组人β-NGF由于缺少了2个组氨酸等氨基酸残基，其与Zn²⁺的亲和力下降，故在洗脱梯度的前段被洗脱下来。Western Blot分析结果如图6，结果显示最终获得的组分中，不存在其他形式的重组人β-NGF。

在本发明的另一个实施例中，首先通过强阳离子交换层析将重组人β-NGF从富含污染物(培养液组分、宿主细胞代谢废物、蛋白酶等)、易降解的培养液上清中快速富集、分离，使蛋白更加稳定。然后进行Zn²⁺螯合层析纯化得纯的重组人β-NGF。更进一步的，通过高效阳离子交换层析分离纯化重组人β-NGF的电荷异构体。在神经生长因子中，除了各种水解误加工变体外，还存在许多电荷异构体，如氨基甲酰化、氧化、异天冬氨酸、脱酰胺化等形式。通过高效阳离子交换层析，在适当的结合条件下，可有效分离这些电荷异构体。从而纯化分离得到几乎不含变体的神经生长因子。该实施例中，分离纯化的β-hNGF活性可达1.5×10⁶U/mg。

在本发明的另一个实施例中，使用Co²⁺螯合层析从鼠颌下腺中分离纯化得到天然鼠神经生长因子，纯度较好。说明金属离子螯合层析，适用于不同种属来源的天然神经生长因子的分离纯化。

附图说明

图1为不同洗脱方式的非还原SDS-PAGE(15％)检测图。

图2不同金属离子螯合层析纯化CHO重组人β-NGF、鼠颌下腺提取的鼠β-NGF、E.coli重组表达人β-NGF的结果图。

图3为Cu²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF纯化组分SEC-HPLC检测结果图。

图4为Zn²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF色谱图。

图5为Zn²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF非还原Tricine-SDS-PAGE检测结果图。

图6为Zn²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF纯化组分Western Blot检测结果图。

图7为SP FF&Zn²⁺IMAC&SP HP纯化组分等电聚焦图检测结果图。

图8为SP FF&Zn²⁺IMAC&SP HP纯化组分非还原Tricine-SDS-PAGE检测结果图。

图9为SP FF&Zn²⁺IMAC&SP HP纯化组分C4-RPC-HPLC检测结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：铜离子螯合层析纯化重组人神经生长因子(CHO细胞表达)

层析柱：取1mL金属螯合层析树脂Chelating Sepharose FF(GE Healthcare)装填至GraviTrap PD-10重力柱(GE Healthcare)中。使用5柱体积(CV)蒸馏水冲洗树脂，添加0.5柱体积(CV)0.1M硫酸铜溶液，将Cu²⁺离子螯合至树脂中。

流速：1-1.25mL/min。

平衡缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH8.5，含1.5M NH₄Cl的Tris-HCl Buffer。

取5CV平衡缓冲液，添加至树脂中，平衡树脂。取CHO细胞表达的重组人β-NGF培养物(见专利申请文件CN201310016022.2，采用实施例2的方法将实施例1方法所制备的表达载体pCMV-β-NGF-IREs-dhfr转染至CHO细胞中表达获得重组人β-NGF)上清10mL，调节pH至7.5，添加至金属螯合层析树脂中。上样完毕后，使用平衡缓冲液洗涤5CV，洗涤完毕后，使用洗脱缓冲液洗脱5CV，收集洗脱组分。洗脱组分进行非还原SDS-PAGE检测，结果如图2泳道1、2。

图2为不同金属离子螯合层析纯化CHO重组人β-NGF、鼠颌下腺提取的鼠β-NGF、E.coli重组表达人β-NGF的结果图。泳道1、2为Cu²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF；泳道3为Ni²⁺螯合层析纯化鼠颌下腺提取的鼠β-NGF；泳道4为Co²⁺纯化E.coli重组表达人β-NGF图。

从图中看出，泳道1、2中，10-12kD范围分离得到一单一的蛋白条带，未见明显的其他分子量蛋白条带，说明Cu²⁺螯合层析可以从CHO细胞表达的重组人β-NGF培养物中分离重组人β-NGF。SEC-HPLC检测结果见图3的Cu²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF纯化组分SEC-HPLC检测结果图，从图中可以看出重组人β-NGF及其变体纯度可达95％(图3)。

实施例2：锌离子螯合层析纯化重组人神经生长因子(CHO细胞表达)

层析柱：HiTrap Chelating HP 1mL(GE Healthcare)，4支预装柱串联，使柱高为10cm。

平衡缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH8.5,含1.5M NH₄Cl的Tris-HCl Buffer。

流速200cm/h(1.25mL/min)。

将层析柱接入Purifier 100(GE Healthcare)，使用蒸馏水冲洗层析柱5CV后0.1M硫酸锌溶液冲洗1CV，使Zn²⁺离子螯合至树脂中。

平衡缓冲液平衡层析柱5CV，取CHO细胞表达的重组人β-NGF上清(同实施例1的样品制备)15mL，调节pH至7.5，上样至层析柱中。上样完毕后使用平衡缓冲液洗涤5CV。洗涤完毕后，梯度洗脱30CV。收集洗脱组分。层析图谱如图4所示，结果显示，经梯度洗脱，分离了至少4组组分。各组分进行非还原Tricine-SDS-PAGE检测及Western Blot分析(图5、6)。图5为Zn²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF非还原Tricine-SDS-PAGE检测结果，其中泳道1为穿透，泳道2为峰1，泳道3为峰2，泳道4为峰3，泳道5为峰4前缘，泳道6为峰4。从图5中可以看出，峰1-3及峰4前缘组分中，分离出了其他分子量大小的条带，而峰4组分仅分离得到单一的蛋白条带，说明不同分子量大小的水解误加工变体，先于118aaβ-hNGF洗脱下来，得到了有效分离。

图6为Zn²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF纯化组分Western Blot检测结果图。其中泳道M为Marker，泳道1为峰4。从图6可以看出，胶片上仅单一荧光条带，不存在其他分子量的β-NGF。

实施例3：镍离子螯合层析纯化鼠神经生长因子

样品制备：取适量鼠颌下腺，清洗后使用高压均质机匀浆，除去表面油脂。匀浆液反复冻融3次后离心收集上清液。调节上清液pH至4.0进行酸解，4℃静置10min，调节pH至7.5得到鼠颌下腺酸解液上清。

层析柱：HisTrap FF Crude 1mL。

平衡缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl、150mM咪唑的50mM PBS。

用注射器吸取5CV平衡缓冲液，注射至预装柱内，平衡树脂。吸取上述20mL鼠颌下腺酸解液上清，注射至预装柱内。上样完毕后注射5CV平衡缓冲液洗涤树脂。洗涤完毕后取5CV洗脱缓冲液，注射至树脂中，并收集洗脱组分。洗脱组分进行非还原SDS-PAGE检测，结果如图2泳道3。

图2为不同金属离子螯合层析纯化CHO重组人β-NGF的结果图。泳道1、2为Cu²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF；泳道3为Ni²⁺螯合层析纯化鼠β-NGF；泳道4为Co²⁺纯化大肠杆菌重组人β-NGF图。

从图中可以看出，泳道3中10-15kD间分离得到一条明显的蛋白条带，其他分子量蛋白条带较少，说明Ni²⁺螯合层析可以从鼠颌下腺组织中，分离得到天然鼠β-NGF，并得到较好的纯度。

实施例4：钴离子螯合层析纯化重组人神经生长因子(大肠杆菌表达)

样品制备：IPTG诱导表达含重组人β-NGF的大肠杆菌(见中国发明专利申请201410024115.4实施例1所得的PET11a-pro-rhNGF表达载体)，破碎细胞收集包涵体。使用8M尿素溶解包涵体。复性包涵体，采用稀释复性，稀释倍数为30倍。复性Buffer：0.1M Tris-HCl，1M L-精氨酸，5mM EDTA，0.61g/L氧化型谷胱甘肽，1.53g/L还原型谷胱甘肽。复性后调节pH至7.5。按pro-rhNGF与胰酶250:1的质量比例，添加胰酶，消化切除导肽序列，即得含重组人β-NGF的蛋白混合溶液。

层析柱：取1mL金属螯合层析树脂TALON Superflow(GE Healthcare)装填至GraviTrap PD-10重力柱(GE Healthcare)中。TALON Superflow树脂螯合配基为4配位位点，钴离子通过螯合配基固定于Sepharose基架上。

流速：1-1.25mL/min。

平衡缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl、150mM咪唑的50mM PBS。

使用5柱体积(CV)蒸馏水冲洗树脂,取5CV平衡缓冲液，添加至树脂中，平衡树脂。取复性液10mL，调节pH至7.5，添加至金属螯合层析树脂中。上样完毕后，使用平衡缓冲液洗涤5CV，洗涤完毕后，使用洗脱缓冲液洗脱5CV，收集洗脱组分。洗脱组分进行非还原SDS-PAGE检测，结果如图2泳道4。

图2为不同金属离子螯合层析纯化CHO重组人β-NGF、鼠颌下腺提取的鼠β-NGF、E.coli重组表达人β-NGF的结果图。泳道1、2为Cu²⁺螯合层析纯化CHO重组人β-NGF；泳道3为Ni²⁺螯合层析纯化鼠β-NGF；泳道4为Co²⁺纯化大肠杆菌重组人β-NGF。

从图中可以看出，泳道4于10-15kD间分离得到一明显蛋白条带，并无其他明显条带，Co²⁺螯合层析纯化大肠杆菌表达重组人NGF可以获得良好的结果。

实施例5

本实施例中，首先采用了Sephrose SP FF快速富集神经生长因子及其变体。Sephrose SP FF填料，颗粒粒径为90μm，可耐高流速、高反压，适合用于将目的蛋白从混合物中快速地富集、分离的纯化步骤，并且可排除发酵液上清中铵盐对金属离子螯合层析的影响，提高蛋白的得率。第二步采用了高效Zn²⁺螯合亲和层析，Chelating HP填料颗粒粒径为34μm，可提供较高的分辨率，螯合Zn²⁺后，对水解误加工变体亲和力相对较弱，可有效分离118aa形式神经生长因子与水解误加工变体。第三步采用了高效阳离子交换层析分离神经生长因子的电荷异构体，Sephrose SP HP填料，粒径颗粒为34μm，可提供较高的分辨率，能有效分离各种电荷异构体。

1.强阳离子交换层析

层析柱：HiScreen SP FF(GE Healthcare)

样品：调节CHO细胞表达重组人β-NGF上清(同实施例1所述的样品制备)pH为6.0、电导10mS/cm。

平衡缓冲液：pH6.0的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH6.0，含0.6M NaCl的50mM PBS。

流速：200cm/h(0.96mL/min)。

层析系统：Purifier 100(GE Healthcare)。

平衡缓冲液平衡柱体积5CV后，加样至层析柱中，上样完毕后使用平衡缓冲液洗涤5CV。洗涤完毕后，梯度洗脱15CV。

收集电导32mS/cm后的洗脱组分。

2.Zn²⁺螯合层析

层析柱：HiTrap Chelating HP 1mL(GE Healthcare)，4支预装柱串联，使柱高为10cm。

样品：取强阳离子交换层析收集组分，调节pH至7.5。

平衡缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH8.5,含1.0M NH₄Cl的Tris-HCl Buffer。

流速200cm/h(1.25mL/min)。

层析系统：Purifier 100(GE Healthcare)。

将层析柱接入Purifier 100(GE Healthcare)，使用蒸馏水冲洗层析柱5CV后0.1M硫酸锌溶液冲洗1CV，使Zn²⁺离子螯合至树脂中。

平衡缓冲液平衡层析柱5CV后，上样至层析柱中。上样完毕后使用平衡缓冲液洗涤5CV。洗涤完毕后，梯度洗脱30CV。

收集电导74mS/cm后的洗脱组分。

3.高效强阳离子交换层析

层析柱：HiScreen SP HP(GE Healthcare)

样品：调节Zn²⁺螯合层析收集组分pH为8.5、电导至5mS/cm。

平衡缓冲液：pH8.5的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH8.5，含0.3M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液。

流速：100cm/h(0.96mL/min)。

层析系统：Purifier 100(GE Healthcare)。

平衡缓冲液平衡柱体积5CV后，加样至层析柱中，上样完毕后使用平衡缓冲液洗涤5CV。洗涤完毕后，梯度洗脱15CV。

收集电导10mS/cm后的洗脱组分。

4.TF-1细胞活性检测

参照2015版《中国药典》鼠神经生长因子生物学活性测定法，第二法：TF-1细胞/MTS比色法。

活性检测结果显示，经强阳离子交换层析，Zn²⁺离子螯合层析及高效阳离子交换层析的重组人β-NGF，其活性为1.5×10⁶U/mg。

5.等电聚焦检测

采用等电聚焦的方法，对重组人β-NGF纯化组分进行了电荷异构体的分析。结果如图7，图7为SP FF&Zn²⁺IMAC&SP HP纯化组分等电聚焦图检测结果图，其中泳道1为重组人β-NGF纯化组分，泳道2为分子marker。可以看出，凝胶中，于pH 9.3处分离得到一单一的蛋白条带，未分辨出其他等电点的蛋白条带。

6.非还原Tricine-SDS-PAGE检测

结果如图8所示，图8为SP FF&Zn²⁺IMAC&SP HP纯化组分非还原Tricine-SDS-PAGE检测结果图，其中泳道1为重组人β-NGF纯化组分，泳道M为分子Marker。可以看出，电泳结果显示纯化组分仅分离得到一条蛋白条带，未分辨出其他分子量的蛋白条带。

7.C4-RPC-HPLC检测

高效液相色谱仪及检测器：Waters e2695型HPLC仪(Waters 2998PAD检测器)。采用四烷基丁基键合硅胶反相C4色谱柱柱，检测波长为280nm，柱温30℃。流动相为：A：0.1％TFA水溶液，B：0.1％TFA乙腈溶液，以0.22μm滤膜过滤，超声脱气10min后使用，进行变梯度洗脱。洗脱条件为：0-30min由10％B升到40％B，30-35min由40％B升到90％B，35-36min由90％B降到10％B，36-41min维持10％B 5min(均为体积百分数)。流速：1.0ml/min。

采用面积归一化法，取纯化组分(即步骤3所得)，进样后记录色谱图，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。结果如图9所示，图9为SP FF&Zn²⁺IMAC&SP HP纯化组分C4-RPC-HPLC检测结果图。从图中可以看出，天然的重组人β-NGF(118aa)保留时间为24.145min，系统自动积分后，测得主峰占总峰面积百分率为96.24％，说明纯化组分中变体含量极少。

实施例6：钴离子螯合层析纯化重组人神经生长因子(CHO细胞表达)

层析柱：取1mL金属螯合层析树脂TALON Superflow(GE Healthcare)装填至GraviTrap PD-10重力柱(GE Healthcare)中。

流速：1-1.25mL/min。

平衡缓冲液：pH7.5，含100mM NaCl的50mM PBS。

洗脱缓冲液：pH3.5，含0.5M NaCl的50mM醋酸盐缓冲液。

取5CV平衡缓冲液，添加至树脂中，平衡树脂。取CHO细胞表达的重组人β-NGF培养物(同实施例1所述的样品制备)上清10mL，调节pH至7.4，添加至金属螯合层析树脂中。上样完毕后，使用平衡缓冲液洗涤5CV，洗涤完毕后，使用洗脱缓冲液洗脱5CV，收集洗脱组分。洗脱组分进行非还原SDS-PAGE检测，结果如图1A泳道2。从图中看出，泳道1中，10-12kD范围分离得到一蛋白条带，即为重组人β-NGF，说明低pH洗脱，可以有效得将重组人β-NGF从金属离子上洗脱下来。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 未名生物医药有限公司

<120> 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法

<130> WMSW-17003-CNI

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

Ser Arg Lys Ala Val Arg

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ser Ser Thr His Pro Val Phe His Met Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Ala Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

Phe Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Ser Asn Pro Val

Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gln

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

Ser Arg Lys Ala Thr Arg

Claims (10)

1.一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法，该混合物为含有人或鼠神经生长因子的溶液，其特征在于，采用金属离子螯合层析对混合物进行分离纯化，得到天然神经生长因子；

其中，所述混合物的pH为6.5-8.5，盐浓度为0.1M-1.0M；

所述金属离子螯合层析树脂由支持介质、螯合配基和金属离子组成；所述金属离子螯合于螯合配基上；

所述分离纯化的洗脱条件为改变蛋白质与金属离子配位结合的竞争性物质浓度梯度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物的pH为7.5；

任选的，所述溶液为组织匀浆液上清、发酵液上清或包涵体重折叠蛋白质溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有人或鼠神经生长因子的溶液为含有天然来源或重组表达的人或鼠神经生长因子溶液；优选的，所述重组表达为原核表达或真核表达；

任选的，所述神经生长因子的序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述螯合配基为含有3、4或5个配位位点的螯合物；

任选的，所述金属离子为Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe³、Al³⁺、Ga²⁺、In³⁺、Tl³⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、La³⁺、Nd³⁺、Eu³⁺、Hg²⁺、K⁺、Yb³⁺、Mg²⁺或Ca²⁺；优选的，所述金属离子为Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺或Ni²⁺。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的平衡缓冲液的pH为6.5-8.5，盐浓度为0.1-1M。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的洗脱缓冲液pH值为7.5-9.0，洗脱缓冲液中的竞争剂浓度为0.1-2.0M；优选的，洗脱的洗脱缓冲液pH值为8.5；

任选的，所述分离纯化的洗脱缓冲液中竞争剂为咪唑、组氨酸、甘氨酸、组胺、NH₄ ⁺盐或氨水；优选的，洗脱的洗脱缓冲液为0.5-1.0M的NH₄Cl。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的条件为降低的pH值梯度，pH值梯度范围为6.0-3.0，优选的，为使用乙酸盐缓冲系统；优选的，为pH3.5、含有0.5-1M盐的乙酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物在采用金属螯合层析对混合物进行纯化前，先进行强阳离子交换层析；在采用金属螯合层析对混合物进行纯化后，进一步采用高效强阳离子交换层析分离纯化。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述强阳离子交换层析为，将所述混合物在pH5.5-6.5，电导低于15mS/cm的条件下加样至颗粒直径为40-90μm的强阳离子交换层析树脂上，用含0.6M NaCl，pH 5.5-6.5的缓冲液梯度洗脱；优选的，所述强阳离子交换层析树脂为SP Sepharose FF。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述高效强阳离子交换层析为，将采用金属螯合层析所得样品在pH8.0-8.5，电导低于5mS/cm的条件下加样至颗粒直径为15-40μm的高效强阳离子交换层析树脂上，用含0.3M NaCl，pH8.0-8.5的缓冲液梯度洗脱；优选的，所述高效强阳离子交换层析树脂为SP Sepharose HP、Macro-Prep 25S Resin或Fractogel EMD SO3-(S)。