TWI773019B - 一種重組人神經生長因子的製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種重組人神經生長因子的製備方法，雜質少，純度高，生物活性好，可以作為治療藥物，具有良好的應用前景。

Description

一種重組人神經生長因子的製備方法
本發明屬於生物工程範疇，涉及用基因工程方法製備高純度、高活性、無修飾的重組人神經生長因子。
Oxervate(cenegermin，重組人神經生長因子，rhNGF)是義大利製藥商Dompé原研的一款滴眼液，是一種用於中度至重度神經營養性角膜炎(neurotrophic keratitis，NK)成人患者的治療的孤兒藥(Orphan drug)，目前已在歐盟和美國上市。另外，其用於治療阿爾茲海默症的適應症也在研發中。
為了製備重組人神經生長因子，原研廠商首先表達proNGF包涵體，然後再變複性，純化proNGF複性液，酶切純化得到重組人神經生長因子。然而，該方法需要酶切，酶切後還需要純化，步驟較多，過程較為繁瑣。
因此，研究人員一直希望找到一種簡單的、能夠直接變複性的方法。Collins, et al.(US5,986,070)發明了一種rhNGF直接變複性的方法，其採用Tris作為緩衝液，在8M尿素條件下變性，在8M尿素條件下複性，這種方法獲得了高活性的rhNGF。但是，這種方法獲得的rhNGF經質譜測定，有許多分子量與rhNGF接近的雜質，這些雜質可能是rhNGF的修飾產物。由於修飾後的rhNGF和未修飾的rhNGF的分子量和性質都非常接近，這給後續分離純化造成了困難，習知技術很難分開，即使分開，產率也較低。
為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種高純度、高活性、無修飾的重組人神經生長因子的製備方法。本申請的發明人在對rhNGF的長期研究中發現，當採用碳酸氫銨(NH4 HCO3 )作為緩衝液，在尿素存在條件下變複性時，使用本發明的方法製備的重組人神經生長因子大大地減少了非目的蛋白的雜質，純度高，生物活性好，可以作為治療藥物，具有良好的應用前景。
為了實現上述目的，本發明採用了如下的技術方案：
本發明提供了一種重組人神經生長因子的製備方法，包括以下步驟：
(a)在大腸桿菌中表達並分離重組人神經生長因子的包涵體；
(b)使用包涵體洗滌液洗滌包涵體；
(c)加入變性液溶解包涵體；
(d)加入複性液進行包涵體複性；
(e)純化獲得重組人神經生長因子；
其中，前述步驟(d)採用碳酸氫銨作為緩衝液。
重組人神經生長因子的包涵體可以採用商業化的或已知的大腸桿菌蛋白表達系統進行表達並分離。根據本發明的一個較佳的實施方式，步驟(a)包括以下步驟：人神經生長因子氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示，全基因合成人神經生長因子基因，插入載體，轉化大腸桿菌，表達，碎菌，離心，收集沉澱。根據本發明的一個較佳實施方式，前述載體為pET28a，前述大腸桿菌為大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)plyss，前述表達為IPTG誘導表達，前述碎菌為超聲碎菌或勻漿機破碎等。
在分離重組人神經生長因子的包涵體後，可以使用包涵體洗滌液洗滌包涵體以去除雜質，本申請的發明人對包涵體的洗滌液的組合進行了各種嘗試以篩選特別適用於本發明的重組人神經生長因子的包涵體的洗滌方案。根據本發明的一個較佳實施方式，步驟(b)包括以下步驟：使用包涵體洗滌液A重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，其中，前述包涵體洗滌液A包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，0.5-3% Triton X-100，pH 8.0-8.5；使用包涵體洗滌液B重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，其中，前述包涵體洗滌液B包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，1-4M尿素，pH 8.0-8.5；再使用包涵體洗滌液C重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，其中，前述包涵體洗滌液C包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，pH 8.0-8.5。更佳的，前述步驟(b)包括以下步驟：使用包涵體洗滌液A重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，重複該洗滌步驟一次，其中，前述包涵體洗滌液A包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1% Triton X-100，pH8.5；使用包涵體洗滌液B重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，重複該洗滌步驟一次，其中，前述包涵體洗滌液B包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5；再使用包涵體洗滌液C重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，重複該洗滌步驟一次，其中，前述包涵體洗滌液C包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5。
在純化重組人神經生長因子的包涵體後，需要對包涵體進行變性和複性步驟以獲得具有正確折疊形式和生物活性的目的蛋白。
根據本發明的一個較佳實施方式，前述步驟(c)包括以下步驟：在包涵體中加入變性液，前述變性液包括8M尿素和15-25mM檸檬酸，pH 2.8-3.2，前述包涵體與前述變性液按照濕重(g)：體積(ml)為1：20-30比例加入變性液，溶解後離心去除沉澱。根據本發明的一個較佳實施方式，前述變性液包括8M尿素和20mM檸檬酸，pH 3.0，前述包涵體與前述變性液按照濕重(g)：體積(ml)為1：25比例加入變性液。
根據本發明的一個較佳實施方式，前述步驟(d)包括以下步驟：在變性液中加入1/4體積0.8-1.0M碳酸氫銨pH8.0-9.0和8M尿素溶液，加入DTT至終濃度為5-10mM，25-37°C 30-60min；再加入氧化型穀胱甘肽至終濃度為20-40mM，25-37°C 10-15min；再加入19倍體積稀釋緩衝液，前述稀釋緩衝液包括50-150mM Na2 HPO4 ，5-15mM乙醇胺，4.2-4.6M尿素，14-18% PEG300，pH8.3-8.5；再加入半胱氨酸至終濃度為1-5mM；用氬氣趕出空氣，4°C複性1-7天；用3K膜超濾濃縮複性液至rhNGF終濃度為1-2mg/ml。更佳的，前述碳酸氫銨的濃度為1M，pH為8.5，前述DTT的終濃度為5mM，前述氧化型穀胱甘肽的終濃度為20mM，前述稀釋緩衝液包括100mM Na2 HPO4 ，10mM乙醇胺，4.6M尿素，15.8% PEG300，pH8.3，前述半胱氨酸的終濃度為3mM。
在包涵體變性和複性後，可以採用已知的層析系統純化目的蛋白。根據本發明的一個實施方式，前述步驟(e)包括SP純化和C4反相層析的步驟。
本發明的有益效果：
1、操作簡單，不需要酶切，步驟較少，所得產品雜質少，純度高；
2、本發明的方法沒有破壞目標蛋白的生物活性，所得產品可以作為候選藥物。
本發明提供了一種重組人神經生長因子的製備方法，雜質少，純度高，生物活性好，可以作為治療藥物，具有良好的應用前景。
以下實施例、實驗例是對本發明進行進一步的說明，但不以任何形式限制本發明。
除特別注明外，以下實施例中使用的原料組分皆市售可得。
實施例1：rhNGF包涵體的製備
1.1 rhNGF表達菌株構建
人神經生長因子成熟肽NGF去掉C端兩個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，按照大腸桿菌密碼子偏好優化密碼子，全基因合成人神經生長因子基因，其基因序列如SEQ ID NO:2所示，插入pET28a多株位點(MCS)XbaⅠ和XhoⅠ，構建質粒hNGFpET28a。利用強啟動子T7表達蛋白。將質粒hNGFpET28a用42度熱激轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)plyss(購於promega公司)，對兩個菌落進行IPTG誘導表達，超聲碎菌，離心12000rpm×5min，表達產物上清液和沉澱的SDS-PAGE圖譜如第1圖所示。將種子菌液加入15%甘油製備甘油菌於-80°C保存。
1.2 IPTG誘導表達
將甘油菌種按體積比為1：1000比例接種含抗性培養基，37°C，180rpm培養過夜；將種子液按照體積比為1：100比例接種含抗性培養基，37°C，180rpm培養到OD600為0.3-0.8；加入IPTG 使終濃度為1mM，25°C，170rpm，繼續培養18 小時；離心8500rpm×10min，去除上清液，收集菌體；取樣，超聲碎菌，沉澱進行SDS-PAGE檢測，誘導表達產物的SDS-PAGE圖譜如第2圖所示。
1.3 包涵體的分離
菌體與碎菌液(2mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5)按照濕重(g)：體積(ml)為1：5-1：10比例加入碎菌液，超聲2s間隔3s，功率(power)80%，5min，重複超聲步驟四次，4°C離心12000rpm×15min，收集沉澱。
1.4包涵體的純化
使用包涵體洗滌液A(50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1% Triton X-100，pH 8.5)重懸包涵體，超聲2s間隔3s，功率(power)80%，5min，重複超聲步驟一次，4°C離心12000rpm×15 min，收集沉澱。重複該洗滌步驟一次。
使用包涵體洗滌液B(50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5)重懸沉澱，超聲2s間隔3s，功率(power)80%，5min，重複超聲步驟一次，4°C離心12000rpm×15 min，收集沉澱。重複該洗滌步驟一次。
再使用包涵體洗滌液C(50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5)重懸沉澱，超聲2s間隔3s，功率(power)80%，5min，重複超聲步驟一次，4°C離心12000rpm×15 min，收集沉澱。
實施例 2：rhNGF包涵體在碳酸氫銨中變複性及純化
2.1包涵體的變性
將實施例1中的包涵體沉澱與變性液(8M尿素，20mM 檸檬酸，pH 3.0)按照濕重(g)：體積(ml)為1：25比例加入變性液，溶解後離心去除沉澱。
2.2 包涵體的複性
在變性液中加入1/4體積1M 碳酸氫銨pH8.5和8M 尿素溶液，加入二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為5mM，25°C 30-60min；再加入氧化型穀胱甘肽至終濃度為20mM，25°C 10-15min；再加入19倍體積稀釋緩衝液(100mM Na2 HPO4 ，10mM乙醇胺,4.6M尿素，15.8% PEG300，pH8.3)；再加入半胱氨酸至終濃度為3mM；用氬氣趕出空氣，4°C複性1-7天；用3K膜超濾濃縮複性液至rhNGF終濃度為1-2mg/ml。
同時設立對照組，區別在於在變性液中加入1/4體積1M TrispH8.5和8M尿素，其他條件均相同。
2.3 純化
2.3.1 SP純化 SP柱：SP XL 1ml GE公司 上樣：緩衝液組成 20mM NaAc pH 5.0，電導4.5 洗脫條件：梯度洗脫 A：20mM NaAc pH 5.0 B：20mM NaAc 2M NaCl pH 5.0 A到B  20min。
2.3.2 C4反相層析
上樣前蛋白用3K膜超濾濃縮至rhNGF終濃度為0.8-1.2/ml。 C4柱：Vydac 214TP 10μm C4  250×10mm A：0.1%三氟乙酸H2 O溶液 B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液 層析條件：流速 5ml/min 時間(min)%B 0           5% 5-10        5-20% 10-40       20-50% 40-50       50-80%。
2.4 質譜檢測
質譜條件如下：
Waters公司UPLC-XEVO G2 Q-TOF液質聯用系統。系統液相部分配置為：BSM二元高壓混合泵，SM樣品管理器，TUV紫外檢測器；質譜部分配置為：ESI源，Q-TOF檢測器。資料處理分析採用Masslynx V4.1及BiopharmaLynx分析軟體(Version：1.2)。
液相條件
色譜柱：MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1x5mm(完整蛋白分子量分析)。 柱溫：80°C 流動相A：0.1%FA-H2 O 流動相B：0.1%FA-CAN Seal Wash溶液：10%IPA 質譜清洗液：50%ACN 質譜IntelliStart閥清洗液：50%MeOH 進樣體積：10µL 樣品室溫度：10°C 梯度洗脫條件
完整蛋白分子量分析 線上脫鹽柱 時間(min) 流速(mL/min) %A %B 曲線
初始 0.5 95 5 初始
0.5 0.5 95 5 6
0.51 0.2 95 5 6
2 0.2 10 90 6
2.1 0.5 95 5 6
2.7 0.5 10 90 6
2.8 0.5 95 5 6
3.4 0.5 10 90 6
3.5 0.5 95 5 6
4.0 0.5 95 5 6
質譜條件
MS資料均採用輪廓圖(continuum)模式，在Resolution模式下採集；LockSpray採集模式為：即時採集並不應用校準。 校準溶液：即時校準(LockSpray)溶液(2ng/μL LE溶液)。 品質軸的校正溶液：2μg/μL碘化鈉溶液。 質譜參數
完整蛋白分子量分析 毛細管電壓(V) 3000 線上脫鹽柱採集時間(min) 0.4-4
一級錐孔電壓(V) 35 SEC柱採集時間(min) 0-8
二級錐孔電壓(V) 4/0.1(ADC樣品) 品質校準範圍(m/z) 100-3500或以上
脫溶劑氣溫度(℃) 350 採集品質範圍(m/z) 500-3500或以上
脫溶劑氣流速(L/h) 500 採樣時間(sec) 0.500
錐孔氣流速(L/h) 50 LockSpray掃描時間(sec) 0.500
ESI源溫(℃) 130 LockSpray掃描間隔(sec) 30
使用Tris緩衝液的對照樣品製備的rhNGF質譜如第3圖所示，其中有許多與rhNGF分子量接近的雜質峰。而使用本發明的NH4 HCO3 緩衝液製備的rhNGF質譜如第4圖所示，幾乎沒有雜質峰，大大地提高了rhNGF樣品的純度。
實施例3：rhNGF生物活性測定
將實施例2中製備的rhNGF以及商品化的rhNGF(購於義翹神州)通過TF1細胞增殖法測定生物活性。
實驗步驟如下：
1. 處於對數生長期的TF1細胞(ATCC@CRL-2003TM )用37°C預熱的1640培養基洗2遍，300-500g離心5min。
2. 計數TF1細胞，用含10%FBS的1640培養基懸浮到適當密度，接種到96孔盤中，10000個/150μl/孔。
3. 在96孔板中用1640培養基梯度稀釋rhNGF樣品，以三倍連續稀釋9個梯度；將稀釋好的樣品加入96孔細胞培養板中，50μl/孔；96孔周圍用200μl/孔的蒸餾水補齊。
4. 在37°C、5%CO2 條件的孵箱中孵育培養3天(視情況，可以延長到四天)。
5. 3天后96孔細胞培養板每孔加入20μl CCK-8溶液，在37°C孵箱中繼續培養8h。
6. 混勻後酶標儀讀OD450值，GraphPad Prism6進行資料分析，作圖並計算EC50。
結果如第5圖所示，使用Tris緩衝液製備的rhNGF以及使用本發明的碳酸氫銨緩衝液製備的rhNGF和商品化的rhNGF一樣可以使TF1細胞增殖，說明本發明方法製備的rhNGF具有優良的生物活性，可以作為候選藥物。
無
以下將結合附圖閱讀，根據以下詳細描述可以最好地理解本揭露的各方面。應理解，根據行業中的慣例，各種特徵未按比例繪製。實際上，為了清楚起見，各種特徵的尺寸可以任意地增加或減小。 第1圖為本發明表達產物的SDS-PAGE圖譜，其中，M表示蛋白標記，US和UP分別表示未誘導表達的菌株的上清和沉澱，IS和IP分別表示IPTG誘導表達的菌株的上清和沉澱。 第2圖為本發明IPTG誘導表達產物的SDS-PAGE圖譜，其中，M表示蛋白Marker。 第3圖為本發明目標蛋白質譜圖譜，其中，rhNGF分子量為13261.65。 第4圖為本發明目標蛋白質譜圖譜，其中，rhNGF分子量為13261.71。 第5圖為本發明目標蛋白促進TF1細胞繁殖圖譜，其中，NGF表示商品化rhNGF促進TF1細胞生長圖譜，NH4 HCO3 表示本發明方法製備的rhNGF促進TF1細胞繁殖圖譜，Tris表示在Tris緩衝液中製備的rhNGF促進TF1細胞繁殖圖譜。
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<110> 三生國健藥業(上海)股份有限公司
<120> 一種重組人神經生長因子的製備方法
<150> CN 201911325340.0
<151> 2019-12-20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo)
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<212> DNA
<213> 智人(Homo)
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Figure 109144140-A0305-02-0017-2

Claims (8)

  1. 一種重組人神經生長因子的製備方法，包括以下步驟：(a)在一大腸桿菌中表達並分離一重組人神經生長因子的一包涵體；(b)使用一包涵體洗滌液洗滌該包涵體；(c)加入一變性液溶解該包涵體；(d)加入一複性液進行包涵體複性；以及(e)純化獲得該重組人神經生長因子；其中，所述步驟(b)包括以下步驟：使用包涵體洗滌液A重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，其中，所述包涵體洗滌液A包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，0.5-3% Triton X-100，pH 8.0-8.5；使用包涵體洗滌液B重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，其中，所述包涵體洗滌液B包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，1-4M尿素，pH 8.0-8.5；再使用包涵體洗滌液C重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，其中，所述包涵體洗滌液C包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，pH 8.0-8.5；所述步驟(c)包括以下步驟：在包涵體中加入變性液，所述變性液包括8M尿素和15-25mM檸檬酸，pH 2.8-3.2，所述包涵體與所述變性液按照濕重(g)：體積 (ml)為1：20-30比例加入變性液，溶解後離心去除沉澱；所述步驟(d)包括以下步驟：在變性液中加入1/4體積0.8-1.0M碳酸氫銨pH8.0-9.0和8M尿素溶液，加入DTT至終濃度為5-10mM，25-37℃ 30-60min；再加入氧化型谷胱甘肽至終濃度為20-40mM，25-37℃ 10-15min；再加入19倍體積稀釋緩衝液，所述稀釋緩衝液包括50-150mM Na2HPO4，5-15mM乙醇胺，4.2-4.6M尿素，14-18% PEG300，pH8.3-8.5；再加入半胱氨酸至終濃度為1-5mM；用氬氣趕出空氣，4℃複性1-7天；用3K膜超濾濃縮複性液至rhNGF終濃度為1-2mg/ml。
  2. 如請求項1所述的製備方法，其中該步驟(a)包括以下步驟：該人神經生長因子之一氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，全基因合成該人神經生長因子基因，插入一載體，轉化該大腸桿菌，表達，碎菌，離心，收集沉澱。
  3. 如請求項2所述的製備方法，其中該載體為pET28a，該大腸桿菌為大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)plyss，該表達為IPTG誘導表達，該碎菌為超聲碎菌或勻漿機破碎。
  4. 如請求項1所述的製備方法，其中該步驟(b) 包括以下步驟：使用該包涵體洗滌液A重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，重複該洗滌步驟一次，其中，該包涵體洗滌液A包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1% Triton X-100，pH 8.5；使用該包涵體洗滌液B重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，重複該洗滌步驟一次，其中，該包涵體洗滌液B包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5；以及再使用該包涵體洗滌液C重懸沉澱，超聲，離心，收集沉澱，重複該洗滌步驟一次，其中，該包涵體洗滌液C包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5。
  5. 如請求項1所述的製備方法，其中該變性液包括8M尿素和20mM檸檬酸，pH3.0，該包涵體與該變性液按照濕重(g)：體積(ml)為1：25比例加入該變性液。
  6. 如請求項1所述的製備方法，其中該碳酸氫銨的濃度為1M，pH為8.5，該DTT的終濃度為5mM，該氧化型穀胱甘肽的終濃度為20mM，該稀釋緩衝液包括100mM Na2HPO4，10mM乙醇胺，4.6M尿素，15.8% PEG300，pH8.3，該半胱氨酸的終濃度為3mM。
  7. 如請求項1所述的製備方法，其中該步驟(e) 包括SP純化和C4反相層析的步驟。
  8. 如請求項1所述的製備方法，包括下述步驟：1)在該大腸桿菌中表達並分離重組該人神經生長因子的該包涵體，該人神經生長因子之該氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，一表達載體為pET28a，該大腸桿菌為大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)plyss，該表達為IPTG誘導表達；2)使用該包涵體洗滌液分別洗滌步驟1)所述之包涵體，其中：2a)使用一包涵體洗滌液A洗滌該包涵體，該包涵體洗滌液A包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1% Triton X-100，pH 8.5；2b)使用一包涵體洗滌液B洗滌步驟2a)獲得的該包涵體，該包涵體體洗滌液B包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5；2c)使用一包涵體洗滌液C洗滌步驟2b)獲得的該包涵體，該包涵體洗滌液C包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5；可選地，重複上述步驟2a)~2c)；3)加入該變性液溶解步驟2)洗滌獲得的該包涵體，該變性液包括8M尿素和20mM檸檬酸，pH3.0，該包涵體與該變性液按照濕重(g)：體積(ml)為1：25比例加入 該變性液；4)將步驟3)獲得的該包涵體進行該包涵體複性：在步驟3)的該變性液中加入1/4體積1.0M pH8.5的該碳酸氫銨和8M尿素溶液，加入一DTT至終濃度為5mM，25-37℃ 30-60min；再加入一氧化型穀胱甘肽至終濃度為20mM，25-37℃ 10-15min；再加入一19倍體積稀釋緩衝液，一稀釋緩衝液包括100mM Na2HPO4，10mM乙醇胺，4.6M尿素，15.8% PEG300，pH8.3；再加入一半胱氨酸至終濃度為3mM；用氬氣趕出空氣，4℃複性1-7天；用3K膜超濾濃縮該複性液至rhNGF終濃度為1-2mg/ml。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024527197A (ja) 2021-07-30 2024-07-23 チェンドゥ ユノヴェル バイオファーマ カンパニー リミテッド． 組換えｃｈｏ細胞、その構築方法、並びにそれを用いた検出システム及び方法
CN115894705A (zh) * 2021-09-30 2023-04-04 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种β-NGF融合蛋白、其制备方法及用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107973848A (zh) * 2017-12-28 2018-05-01 未名生物医药有限公司 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986070A (en) 1990-04-06 1999-11-16 Amgen Inc. Production of biologically active NGF proteins
CN1219795C (zh) * 2000-07-19 2005-09-21 深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司 用新的复性方法制备重组人神经生长因子
CN102628058B (zh) * 2012-03-23 2013-06-26 杭州纽龙生物科技有限公司 制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液
CN102839182B (zh) * 2012-08-07 2013-10-16 武汉海特生物制药股份有限公司 利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法
EP2889304A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-01 Sandoz Ag Method for refolding recombinantly produced polypeptides
CN103880944B (zh) * 2014-01-20 2017-03-29 未名生物医药有限公司 一种野生型rhNGF的制备方法
CN103880943A (zh) * 2014-01-20 2014-06-25 厦门北大之路生物工程有限公司 一种rhNGF成熟肽的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107973848A (zh) * 2017-12-28 2018-05-01 未名生物医药有限公司 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Singh S.M. and Panda A.K.,"Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins",Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 99, 2005, page: 303-310. *

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