JP2023507298A - 組換えヒト神経成長因子の製造方法 - Google Patents

組換えヒト神経成長因子の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023507298A
JP2023507298A JP2022535143A JP2022535143A JP2023507298A JP 2023507298 A JP2023507298 A JP 2023507298A JP 2022535143 A JP2022535143 A JP 2022535143A JP 2022535143 A JP2022535143 A JP 2022535143A JP 2023507298 A JP2023507298 A JP 2023507298A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
solution
urea
washing
inclusion body
growth factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022535143A
Other languages
English (en)
Inventor
朱禎平
黄浩旻
肖建国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd filed Critical Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Publication of JP2023507298A publication Critical patent/JP2023507298A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

治療薬物として使用できる組換えヒト神経成長因子の製造方法を提供する。

Description

本発明は、生命工学範疇に属し、遺伝工学方法を用いた高純度、高活性および無変形の組換えヒト神経成長因子の製造に関する。
Ｏｘｅｒｖａｔｅ（ｃｅｎｅｇｅｒｍｉｎ、組換えヒト神経成長因子、ｒｈＮＧＦ）は、イタリアの製薬会社であるＤｏｍｐｅが最初に開発した点眼液であり、中等度から重症の神経栄養性角膜炎（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ，ＮＫ）成人患者を治療するための希少医薬品であり、現在既にヨーロッパ連盟と米国にて発売されている。また、アルツハイマー病を治療するための適応症も、研究開発中にある。
組換えヒト神経成長因子を製造するために、本来の研究会社は、まず、ｐｒｏＮＧＦ封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）を発現した後、変性と再生、ｐｒｏＮＧＦ再生液の精製、酵素切断および精製を経て組換えヒト神経成長因子を獲得した。しかしながら、前記方法は、酵素切断が必要であり、酵素切断後に精製がさらに必要であるので、段階が比較的多く、過程が比較的わずらわしい。
したがって、研究員らは、ずっと簡単ながらも直接的に変性および再生が可能な方法を探していた。Ｃｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（ＵＳ５，９８６，０７０）は、Ｔｒｉｓを緩衝液として、８Ｍ尿素の条件で変性し、８Ｍ尿素の条件で再生する方法を用いたｒｈＮＧＦの直接変性および再生方法を発明し、このような方法で高活性ｒｈＮＧＦを獲得した。しかしながら、このような方法で獲得したｒｈＮＧＦは、質量分析で測定した結果、分子量がｒｈＮＧＦに近い不純物が多く、このような不純物は、ｒｈＮＧＦの変形生成物である可能性がある。変形後のｒｈＮＧＦと変形されないｒｈＮＧＦは、分子量および性質の両方が非常に類似しているので、これは、後続の分離精製に困難を招いてしまい、一般的な方法では分離することが非常に難しく、分離をしても、収率が低い。
従来技術の不足を克服するために、本発明は、高純度、高活性および無変形の組換えヒト神経成長因子の製造方法を提供する。本出願の発明者は、ｒｈＮＧＦに関する長期間の研究を通じて、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）を緩衝液とし、尿素（ｕｒｅａ）が存在する条件で変性および再生を行う場合、本発明の方法を使用して製造された組換えヒト神経成長因子は、非標的タンパク質の不純物が大幅減少して、純度が高く、生物活性に優れていて、治療薬物として使用でき、良好な応用展望を有することを発見した。
前記目的を具現するために、本発明は、以下の技術方法を採択する：
本発明は、以下の段階を含む組換えヒト神経成長因子の製造方法を提供する：
（ａ）大腸菌の中で組換えヒト神経成長因子の封入体を発現して分離させる段階；
（ｂ）封入体洗浄液を使用して前記封入体を洗浄する段階；
（ｃ）変性液を投入して前記封入体を溶解させる段階；
（ｄ）再生液を投入して封入体を再生させる段階；
（ｅ）精製して組換えヒト神経成長因子を獲得する段階；
ここで、前記段階（ｄ）は、炭酸水素アンモニウムを緩衝液として使用する。
組換えヒト神経成長因子の封入体は、商業化したまたは既知の大腸菌タンパク質発現システムを使用して発現および分離を行うことができる。本発明の好ましい一実施形態によれば、前記段階（ａ）は、ヒト神経成長因子のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表され、ヒト神経成長因子遺伝子の全長遺伝子合成、ベクター挿入、大腸菌への転換、発現、菌破壊、遠心分離、沈殿収集段階を含む。本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ベクターは、ｐＥＴ２８ａであり、前記大腸菌は、大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓｓであり、前記発現は、ＩＰＴＧ誘導発現であり、前記菌破壊は、超音波破壊または均質器破壊などである。
組換えヒト神経成長因子の封入体を分離した後、封入体洗浄液で封入体を洗浄して不純物を除去することができ、本出願の発明者は、封入体の洗浄液の組み合わせに対して様々な試みを行うことによって、本発明の組換えヒト神経成長因子に特に適用される封入体洗浄方法を選別した。本発明の好ましい一実施形態によれば、前記段階（ｂ）は、以下の段階を含む：封入体洗浄液Ａを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集する段階、ここで、前記封入体洗浄液Ａは、２０～１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、１～１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５～３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．０～８．５を含み；封入体洗浄液Ｂを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集する段階、ここで、前記封入体洗浄液Ｂは、２０～１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、１～１０ｍＭのＥＤＴＡ、１～４Ｍの尿素、ｐＨ ８．０～８．５を含み；さらに封入体洗浄液Ｃを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集する段階、ここで、前記封入体洗浄液Ｃは、２０～１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、１～１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０～８．５を含む。さらに好ましくは、前記段階（ｂ）は、以下の段階を含む：封入体洗浄液Ａを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返す段階、ここで、前記封入体洗浄液Ａは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．５を含み；封入体洗浄液Ｂを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返す段階、ここで、前記封入体洗浄液Ｂは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、ｐＨ８．５を含み；さらに封入体洗浄液Ｃを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返す段階、ここで、前記封入体洗浄液Ｃは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５を含む。
組換えヒト神経成長因子の封入体を精製した後、正確な折り畳み型（ｆｏｌｄｉｎｇ ｆｏｒｍ）と生物活性を有する標的タンパク質を獲得するために、封入体に対して変性と再生段階を行わなければならない。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記段階（ｃ）は、封入体に８Ｍの尿素と１５～２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ２．８～３．２を含む変性液を前記封入体と前記変性液の湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：２０～３０である割合で投入し、溶解後に遠心分離して、沈殿を除去する段階を含む。本発明の好ましい一実施形態によれば、前記変性液は、８Ｍの尿素と２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０を含み、前記封入体と前記変性液は、湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：２５である割合で変性液を投入する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記段階（ｄ）は、以下の段階を含む：変性液に１／４体積の０．８～１．０Ｍの炭酸水素アンモニウムｐＨ８．０～９．０と８Ｍの尿素溶液を投入し、ＤＴＴを５～１０ｍＭの終濃度に達するように投入して、２５～３７℃で３０～６０分間維持した後；酸化型グルタチオンを２０～４０ｍＭの終濃度に達するように投入し、２５～３７℃で１０～１５分間維持し；さらに１９倍体積の５０～１５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５～１５ｍＭのエタノールアミン、４．２～４．６Ｍの尿素、１４～１８％のＰＥＧ３００、ｐＨ８．３～８．５を含む希釈緩衝液を投入した後、システインを１～５ｍＭの終濃度に達するように投入し；アルゴンガスで脱気して、４℃で１～７日間再生し；３Ｋ膜でｒｈＮＧＦの終濃度が１～２ｍｇ／ｍＬに達するように再生液を限外ろ過して濃縮させる。さらに好ましくは、前記炭酸水素アンモニウムの濃度は、１Ｍであり、ｐＨは、８．５であり、前記ＤＴＴの終濃度は、５ｍＭであり、前記酸化型グルタチオンの終濃度は、２０ｍＭであり、前記希釈緩衝液は、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのエタノールアミン、４．６Ｍの尿素、１５．８％のＰＥＧ３００、ｐＨ８．３を含み、前記システインの終濃度は、３ｍＭである。
封入体の変性と再生後、既知のクロマトグラフィーシステムを用いて標的タンパク質を精製することができる。本発明の一実施形態によれば、前記段階（ｅ）は、ＳＰ精製およびＣ４逆相クロマトグラフィー段階を含む。
本発明の有益な効果：
１．操作が簡単であり、酵素切断が不要なので、段階が少なく、収得された生成物は、不純物が少なく、純度が高い。
２．本発明の方法は、標的タンパク質の生物活性を破壊せず、収得された製品は、候補薬物として使用できる。
本発明は、組換えヒト神経成長因子の製造方法を提供し、不純物が少ないため、純度が高く、生物活性に優れていて、治療薬物として使用でき、良好な応用展望を有する。
本発明の発現生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンであり、ここで、Ｍは、タンパク質Ｍａｒｋｅｒを示し、ＵＳとＵＰは、それぞれ誘導発現しない菌株の上清と沈殿を示し、ＩＳとＩＰは、それぞれＩＰＴＧ誘導発現した菌株の上清と沈殿を示す。 本発明のＩＰＴＧ誘導発現生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンであり、ここで、Ｍは、タンパク質Ｍａｒｋｅｒを示す。 本発明の標的タンパク質の質量スペクトルプロファイルであり、ここで、ｒｈＮＧＦの分子量は、１３２６１．６５である。 本発明の標的タンパク質の質量スペクトルプロファイルであり、ここで、ｒｈＮＧＦの分子量は、１３２６１．７１である。 本発明の標的タンパク質のＴＦ１細胞増殖促進グラフであり、ここで、ＮＧＦは、商品化したｒｈＮＧＦのＴＦ１細胞成長促進を示すプロファイルであり、ＮＨ４ＨＣＯ３は、本発明の方法で製造されたｒｈＮＧＦのＴＦ１細胞増殖促進を示すプロファイルであり、Ｔｒｉｓは、Ｔｒｉｓ緩衝液で製造されたｒｈＮＧＦのＴＦ１細胞増殖促進を示すプロファイルである。
以下、実施例と実験例は、本発明をより具体的に説明するためのものであるが、ただし、いずれの形式でも本発明を制限するものではない。
別途説明しない限り、以下の実施例において使用される原料成分は、すべて市中で購入可能である。
実施例１：ｒｈＮＧＦ封入体の製造
１．１ ｒｈＮＧＦ発現菌株の構築
ヒト神経成長因子成熟ペプチド（ＮＧＦ）は、Ｃ末端の２個のアミノ酸を除去したものであり、アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されている。大腸菌コドンの選好度によってコドンを最適化して、ヒト神経成長因子遺伝子を全長遺伝子合成し、その遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されたように、ｐＥＴ２８ａ多重クローニングサイト（ＭＣＳ）Ｘｂａ ＩとＸｈｏ Ｉを挿入して、プラスミドｈＮＧＦｐＥＴ２８ａを構築した。強プロモーター（ｓｔｒｏｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）Ｔ７を用いてタンパク質を発現した。プラスミドｈＮＧＦｐＥＴ２８ａを４２℃の熱衝撃を利用して大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓｓ（ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）に転換し、２個のコロニーに対してＩＰＴＧ誘導発現、超音波による菌破壊を行い、１２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎで遠心分離した。発現生成物の上清と沈殿のＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンは、図１に示されている。種子菌液を１５％のグリセロールに投入して、バクテリアグリセロールストックを製造し、－８０℃で保存した。
１．２ ＩＰＴＧ誘導発現
バクテリアグリセロールストックを１：１０００の体積比で抗生剤含有培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで一晩中培養した後；接種液を１：１００の体積比で抗生剤含有培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍでＯＤ６００が０．３～０．８となるように培養した後；ＩＰＴＧを投入して、終濃度が１ｍＭとなるようにし、２５℃、１７０ｒｐｍで１８時間の間続いて培養し；８５００×１０ｍｉｎで遠心分離して、上清を除去し、菌体を収集した後；サンプルを抽出して超音波破壊し、沈殿は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行った。誘導発現生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンは、図２に示されている。
１．３ 封入体の分離
菌体と破砕菌液（２ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）を湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：５～１：１０である割合で破砕菌液に投入し、出力（ｐｏｗｅｒ）を８０％で、５分間３秒間隔で２秒間超音波処理し、超音波段階を４回繰り返し、４℃で１２０００ｒｐｍ×１５分間遠心分離し、沈殿を収集した。
１．４ 封入体の精製
封入体洗浄液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．５）を使用して封入体を再懸濁し、出力（ｐｏｗｅｒ）を８０％で、５分間３秒間隔で２秒間超音波処理し、超音波段階を１回繰り返し、４℃で１２０００ｒｐｍ×１５分間遠心分離して、沈殿を収集した。前記洗浄段階を１回繰り返した。
封入体洗浄液Ｂ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、ｐＨ８．５）を使用して沈殿を再懸濁し、出力（ｐｏｗｅｒ）を８０％で、５分間３秒間隔で２秒間超音波処理し、超音波段階を１回繰り返し、４℃で１２０００ｒｐｍ×１５分間遠心分離して沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返した。
さらに封入体洗浄液Ｃ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）を使用して沈殿を再懸濁し、出力（ｐｏｗｅｒ）を８０％で、５分間３秒間隔で２秒間超音波処理し、超音波段階を１回繰り返し、４℃で１２０００ｒｐｍ×１５分間遠心分離して、沈殿を収集した。
実施例２：ｒｈＮＧＦ封入体の炭酸水素アンモニウム中での変性、再生および精製
２．１ 封入体の変性
実施例１中の封入体沈殿と変性液（８Ｍの尿素、２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０）を湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：２５である割合で変性液を投入し、溶解後に遠心分離して、沈殿を除去した。
２．２ 封入体の再生
変性液に１／４体積の１Ｍの炭酸水素アンモニウムｐＨ８．５と８Ｍの尿素溶液を投入し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を５ｍＭの終濃度に達するように投入して、２５℃で３０～６０分間維持させた後；酸化型グルタチオンを２０ｍＭの終濃度に達するように投入して、２５℃で１０～１５分間維持させ；１９倍体積の希釈緩衝液（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのエタノールアミン、４．６Ｍの尿素、１５．８％のＰＥＧ３００、ｐＨ８．３）を投入した後；システインを３ｍＭの終濃度に達するように投入し；アルゴンガスで脱気して４℃で１～７日間再生し；３Ｋ膜でｒｈＮＧＦの終濃度が１～２ｍｇ／ｍＬに達するように再生液を限外ろ過して濃縮させた。
これと同時に、対照サンプルを構築し、差異点は、変性液に１／４体積の１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．５と８Ｍの尿素を投入したことにあり、その他の条件は、すべて同一である。
２．３ 精製
２．３．１ ＳＰ精製
ＳＰカラム：ＳＰ ＸＬ １ｍＬ ＧＥ社
サンプルローディング：緩衝液成分：２０ｍＭのＮａＡｃ ｐＨ５．０、伝導性４．５
溶離条件：グラジエント溶離
Ａ：２０ｍＭのＮａＡｃ ｐＨ５．０
Ｂ：２０ｍＭのＮａＡｃ ２ＭのＮａＣｌ ｐＨ５．０
ＡからＢまで２０ｍｉｎ。
２．３．２ Ｃ４逆相クロマトグラフィー
サンプルローディング前にタンパク質を３Ｋ膜でｒｈＮＧＦの終濃度が０．８～１．２／ｍＬに達するように限外ろ過して濃縮させた。
Ｃ４カラム：Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ １０μｍ Ｃ４ ２５０×１０ｍＭ
Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸Ｈ２Ｏ溶液
Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
クロマトグラフィー条件：流速５ｍＬ／ｍｉｎ
時間（ｍｉｎ） ％Ｂ
０ ５％
５～１０ ５～２０％
１０～４０ ２０～５０％
４０～５０ ５０～８０％．
２．４ 質量分析検出
質量分析条件は、次の通りである：
Ｗａｔｅｒｓ社のＵＰＬＣ－ＸＥＶＯ Ｇ２ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム。システムの液相部分の構成は、次の通りである：ＢＳＭバイナリ高圧混合ポンプ、ＳＭサンプルマネージャ、ＴＵＶ紫外線検出器；質量スペクトル部分の構成は、次の通りである：ＥＳＩソース、Ｑ－ＴＯＦ検出器。データ処理と分析は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１とＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ分析ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ：１．２）を使用した。
液相条件
クロマトグラフィーカラム：Ｍａｓｓ ＰＲＥＰＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ ２．１×５ｍＭ（インタクトタンパク質分子量分析）、カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．１％のＦＡ－Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％のＦＡ－ＣＡＮ
Ｓｅａｌ Ｗａｓｈ溶液：１０％のＩＰＡ
質量分析洗浄液：５０％のＡＣＮ
質量分析ＩｎｔｅｌｌｉＳｔａｒｔバルブ洗浄液：５０％のＭｅＯＨ
サンプル注入体積：１０μＬ
サンプル室温度：１０℃
Figure 2023507298000001
質量分析条件
ＭＳデータは、全部輪郭図（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）モードを用いて、Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎモードで収集した。
ＬｏｃｋＳｐｒａｙ収集モード：リアルタイム収集であり、キャリブレーションは適用しなかった。
キャリブレーション溶液：リアルタイムキャリブレーション（ＬｏｃｋＳｐｒａｙ）溶液：２ｎｇ／μＬのＬＥ溶液；
質量軸のキャリブレーション溶液：２μｇ／μＬのヨウ化ナトリウム溶液
Figure 2023507298000002
Ｔｒｉｓ緩衝液を使用した対照サンプルで製造したｒｈＮＧＦの質量スペクトルは、図３に示されており、ｒｈＮＧＦと分子量が類似した多くの不純物ピークがあることが分かる。これに対し、本発明のＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液で製造されたｒｈＮＧＦの質量スペクトルは、図４に示されたように、不純物ピークが殆どなく、ｒｈＮＧＦサンプルの純度が大きく向上した。
実施例３：ｒｈＮＧＦ生物活性の測定
実施例２で製造されたｒｈＮＧＦおよび商品化したｒｈＮＧＦ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（義翹神州）から購入）をＴＦ１細胞増殖法により生物活性を測定した。
実験段階は、次の通りである：
１．対数増殖期にあるＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ＠ＣＲＬ－２００３ＴＭ）を３７℃に予熱された１６４０培地で２回洗浄し、３００～５００ｇで５分間遠心分離する；
２．ＴＦ１細胞を計数し、１０％のＦＢＳを含有する１６４０培地を適当な密度に達するように懸濁した後、９６ウェルプレートに１００００個／１５０μＬ／ウェルで接種する；
３．９６ウェルプレートで１６４０培地を使用してｒｈＮＧＦサンプルを勾配希釈して、９個の勾配で３倍連続希釈し；希釈したサンプルを９６ウェル細胞培養プレートに５０μＬ／ウェルで投入した後；９６ウェルの周囲を２００μＬ／ウェルの蒸留水で満たす；
４．３７℃、５％ＣＯ２条件のインキュベーターで３日間インキュベートする（状況に応じて４日に延長することができる）；
５．３日後に９６ウェル細胞培養プレートの各ウェル当たり２０μＬのＣＣＫ－８溶液を投入し、３７℃のインキュベーターで８時間の間続いて培養する。
６．均一に混合した後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を読み、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６でデータ分析を行って、グラフを描き、ＥＣ５０を計算する。
結果は、図５に示されたように、Ｔｒｉｓ緩衝液を使用して製造されたｒｈＮＧＦおよび本発明の炭酸水素アンモニウム緩衝液を使用して製造されたｒｈＮＧＦは、商品化したｒｈＮＧＦと同様に、ＴＦ１細胞を増殖させることができることが示され、これは、本発明の方法で製造されたｒｈＮＧＦが優れた生物活性を有し、候補薬物として使用できることを示唆する。

Claims (11)

  1. 組換えヒト神経成長因子の製造方法において、
    （ａ）大腸菌の中で組換えヒト神経成長因子の封入体を発現して分離させる段階と、
    （ｂ）封入体洗浄液を使用して前記封入体を洗浄する段階と、
    （ｃ）変性液を投入して前記封入体を溶解させる段階と、
    （ｄ）再生液を投入して封入体を再生させる段階と、
    （ｅ）精製して組換えヒト神経成長因子を獲得する段階と、を含み、
    ここで、前記段階（ｄ）は、炭酸水素アンモニウムを緩衝液として使用することを特徴とする組換えヒト神経成長因子の製造方法。
  2. 前記段階（ａ）は、ヒト神経成長因子のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表され、ヒト神経成長因子遺伝子の全長遺伝子合成、ベクター挿入、大腸菌への転換、発現、菌破壊、遠心分離、沈殿収集段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記ベクターは、ｐＥＴ２８ａであり、前記大腸菌は、大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓｓであり、前記発現は、ＩＰＴＧ誘導発現であり、前記菌破壊は、超音波破壊または均質器破壊であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
  4. 前記段階（ｂ）は、２０～１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、１～１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５～３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．０～８．５を含む封入体洗浄液Ａを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集する段階；２０～１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、１～１０ｍＭのＥＤＴＡ、１～４Ｍの尿素、ｐＨ８．０～８．５を含む封入体洗浄液Ｂを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集する段階；さらに２０～１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、１～１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０～８．５を含む封入体洗浄液Ｃを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  5. 前記段階（ｂ）は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．５を含む封入体洗浄液Ａを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返す段階；５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、ｐＨ８．５を含む封入体洗浄液Ｂを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返す段階；さらに５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５を含む封入体洗浄液Ｃを使用して沈殿を再懸濁し、超音波、遠心分離を経て沈殿を収集し、前記洗浄段階を１回繰り返す段階を含むことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
  6. 前記段階（ｃ）は、封入体に８Ｍの尿素と１５～２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ２．８～３．２を含む変性液を前記封入体と前記変性液の湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：２０～３０である割合で投入し、溶解後に遠心分離して沈殿を除去する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  7. 前記変性液は、８Ｍの尿素と２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０を含み、前記封入体と前記変性液は、湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：２５である割合で変性液を投入することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
  8. 前記段階（ｄ）は、変性液に１／４体積の０．８～１．０Ｍの炭酸水素アンモニウムｐＨ８．０～９．０と８Ｍの尿素溶液を投入し、ＤＴＴを５～１０ｍＭの終濃度に達するように投入して、２５～３７℃で３０～６０分間維持した後；酸化型グルタチオンを２０～４０ｍＭの終濃度に達するように投入し、２５～３７℃で１０～１５分間維持し；さらに１９倍体積の５０～１５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５～１５ｍＭのエタノールアミン、４．２～４．６Ｍの尿素、１４～１８％のＰＥＧ３００、ｐＨ８．３～８．５を含む希釈緩衝液を投入した後、システインを１～５ｍＭの終濃度に達するように投入し；アルゴンガスで脱気して、４℃で１～７日間再生し；３Ｋ膜でｒｈＮＧＦの終濃度が１～２ｍｇ／ｍＬに達するように再生液を限外ろ過して濃縮させる段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  9. 前記炭酸水素アンモニウムの濃度は、１Ｍであり、ｐＨは、８．５であり、前記ＤＴＴの終濃度は、５ｍＭであり、前記酸化型グルタチオンの終濃度は、２０ｍＭであり、前記希釈緩衝液は、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのエタノールアミン、４．６Ｍの尿素、１５．８％のＰＥＧ３００、ｐＨ８．３を含み、前記システインの終濃度は、３ｍＭであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
  10. 前記段階（ｅ）は、ＳＰ精製およびＣ４逆相クロマトグラフィー段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  11. １）大腸菌の中で組換えヒト神経成長因子の封入体を発現して分離させる段階、前記ヒト神経成長因子のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表され、発現ベクターは、ｐＥＴ２８ａであり、前記大腸菌は、大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓｓであり、前記発現は、ＩＰＴＧ誘導発現であり；
    ２）封入体洗浄液を使用して段階１）の前記封入体をそれぞれ洗浄する段階；ここで：
    ２ａ）５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．５を含む封入体洗浄液Ａを使用して前記封入体を洗浄し；
    ２ｂ）５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、ｐＨ８．５を含む封入体洗浄液Ｂを使用して段階２ａ）で獲得された封入体を洗浄し；
    ２ｃ）５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５を含む封入体洗浄液Ｃを使用して段階２ｂ）で獲得された封入体を洗浄し；
    選択的に前記段階２ａ）～２ｃ）を繰り返し；
    ３）８Ｍの尿素と２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０を含む変性液を前記封入体と前記変性液の湿重量（ｇ）：体積（ｍＬ）が１：２５である割合で投入して、段階２）の洗浄で獲得された封入体を溶解させる段階；
    ４）段階３）で獲得された封入体に対して封入体再生を行う段階であり、段階３）の変性液に１／４体積の１．０Ｍの炭酸水素アンモニウムｐＨ８．５と８Ｍの尿素溶液を投入し、ＤＴＴを５ｍＭの終濃度に達するように投入して、２５～３７℃で３０～６０分間維持させた後；酸化型グルタチオンを２０ｍＭの終濃度に達するように投入して、２５～３７℃で１０～１５分間維持させ；１９倍体積の１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのエタノールアミン、４．６Ｍの尿素、１５．８％のＰＥＧ３００、ｐＨ８．３を含む希釈緩衝液を投入した後；システインを３ｍＭの終濃度に達するように投入し；アルゴンガスで脱気して４℃で１～７日間再生し；３Ｋ膜でｒｈＮＧＦの終濃度が１～２ｍｇ／ｍＬに達するように再生液を限外ろ過して濃縮させる段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
JP2022535143A 2019-12-20 2020-11-03 組換えヒト神経成長因子の製造方法 Pending JP2023507298A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911325340.0 2019-12-20
CN201911325340.0A CN113004388A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种重组人神经生长因子的制备方法
PCT/CN2020/126147 WO2021120900A1 (zh) 2019-12-20 2020-11-03 一种重组人神经生长因子的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023507298A true JP2023507298A (ja) 2023-02-22

Family

ID=76382000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022535143A Pending JP2023507298A (ja) 2019-12-20 2020-11-03 組換えヒト神経成長因子の製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230037311A1 (ja)
EP (1) EP4079754A4 (ja)
JP (1) JP2023507298A (ja)
CN (2) CN113004388A (ja)
TW (1) TWI773019B (ja)
WO (1) WO2021120900A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023004784A1 (zh) 2021-07-30 2023-02-02 成都优洛生物科技有限公司 一种重组cho细胞、其构建方法、利用其的检测系统和方法
CN115894705A (zh) * 2021-09-30 2023-04-04 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种β-NGF融合蛋白、其制备方法及用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986070A (en) 1990-04-06 1999-11-16 Amgen Inc. Production of biologically active NGF proteins
CN1219795C (zh) * 2000-07-19 2005-09-21 深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司 用新的复性方法制备重组人神经生长因子
CN102628058B (zh) * 2012-03-23 2013-06-26 杭州纽龙生物科技有限公司 制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液
CN102839182B (zh) * 2012-08-07 2013-10-16 武汉海特生物制药股份有限公司 利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法
EP2889304A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-01 Sandoz Ag Method for refolding recombinantly produced polypeptides
CN103880943A (zh) * 2014-01-20 2014-06-25 厦门北大之路生物工程有限公司 一种rhNGF成熟肽的制备方法
CN103880944B (zh) * 2014-01-20 2017-03-29 未名生物医药有限公司 一种野生型rhNGF的制备方法
CN107973848B (zh) * 2017-12-28 2020-10-16 未名生物医药有限公司 一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4079754A4 (en) 2024-06-19
CN114929732A (zh) 2022-08-19
TWI773019B (zh) 2022-08-01
WO2021120900A1 (zh) 2021-06-24
CN113004388A (zh) 2021-06-22
TW202128738A (zh) 2021-08-01
EP4079754A1 (en) 2022-10-26
US20230037311A1 (en) 2023-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023507298A (ja) 組換えヒト神経成長因子の製造方法
WO2024087761A1 (zh) 一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用
CN111117977B (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
JPH01502638A (ja) グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類
CN110305224B (zh) 一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
CN110964096A (zh) 一种重组人源c反应蛋白的制备方法
CN111548392A (zh) 一种促溶标签及其应用
CN107746432B (zh) 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
CN108484749B (zh) 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法
US11639515B2 (en) Genetically engineered strain for producing porcine myoglobin and food-grade fermentation and purification thereof
CN113912691B (zh) 重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用
CN113025599B (zh) 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用
Surovtsev et al. Purification of bacteriocins by chromatographic methods
CN110982745B (zh) 一种戊糖片球菌z-1、戊糖片球菌细菌素z-1及戊糖片球菌细菌素z-1的生产方法
RU2441072C1 (ru) ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА
RU2650667C1 (ru) Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу
RU2453604C1 (ru) Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека
CN112592931A (zh) 一种生产重组蛋白酶k的方法
CN113004419B (zh) 普卡那肽的制备方法
KR100309700B1 (ko) 재조합단백질의활성상태로의재구성방법
CN114671945A (zh) 一种草鱼细菌小肽识别受体及制备方法与应用
CN116284278A (zh) 一种高酯键形成效率分子肽突变体
CN114106107A (zh) 免疫肽及其制备方法
CN117229381A (zh) 一种重组人参降血糖肽及其制备方法和应用
RU2319502C1 (ru) РАСТВОР ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSX50, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА, ШТАММ Escherichia coli SX50 - ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА И СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231010