RU2650667C1 - Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу - Google Patents
Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу Download PDFInfo
- Publication number
- RU2650667C1 RU2650667C1 RU2016147379A RU2016147379A RU2650667C1 RU 2650667 C1 RU2650667 C1 RU 2650667C1 RU 2016147379 A RU2016147379 A RU 2016147379A RU 2016147379 A RU2016147379 A RU 2016147379A RU 2650667 C1 RU2650667 C1 RU 2650667C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- heparinase
- amino acid
- mutant
- specific activity
- residue
- Prior art date
Links
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 241000605114 Pedobacter heparinus Species 0.000 title claims abstract description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 15
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 7
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Chemical group O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000030725 Transient neonatal myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical group N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical group O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
- C12Y402/02007—Heparin lyase (4.2.2.7), i.e. heparinase I
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен вариант мутантной рекомбинантной гепариназы I из Pedobacter heparinus, содержащий следующие аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью исходной гепариназы I: E117Q, Q118P, Е362Р, Y363P. Предложен фрагмент ДНК, кодирующий указанную мутантную гепариназу I. Группа изобретений позволяет получить рекомбинантную мутантную гепариназу I, обладающую повышенной удельной активностью по сравнению с исходной немодифицированной гепариназой I. 2 н.п. ф-лы, 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается фермента - гепариназы I с повышенной удельной активностью, обеспечивающей повышение биодоступности антикоагулянта гепарина путем уменьшения длины его цепей.
Гепариназы, ферменты, относящиеся к классу лиаз, выделяют из различных источников, однако хорошо изучены и охарактеризованы только гепариназы I, II и III из Pedobacter heparinus. Эти ферменты используют для анализа структуры гепарина и его контаминации, снижения концентрации гепарина в крови, получения низкомолекулярного гепарина (НМГ).
Гепарин (сульфатированный гликозаминогликан) - общее название гетерогенной смеси сульфатированных полисахаридных цепей, в состав которых входят повторяющиеся единицы D-глюкозамина, L-идуроновой или глюкуроновой кислот.
Гепарин, выделяемый из легких и печени рогатого скота, применяют в медицинской практике как антикоагулянт, но только около 30% молекул нефракционированного гепарина (НФГ) обладает антикоагулянтной активностью. Уменьшение длины цепей гепарина снижает его способность связываться с белками крови, стенками сосудов, эндотелиальными клетками, макрофагами и тромбоцитами, что повышает время существования низкомолекулярного гепарина (НМГ) в плазме крови больных и обеспечивает более прогнозируемый лечебный эффект назначенной дозировки. Биодоступность низкомолекулярных гепаринов достигает почти 100%; при этом их период полувыведения в 2-4 раза превышает таковой у нефракционированного гепарина.
Применяемые в настоящее время НМГ получают из гепарина с помощью различных химических и энзиматических способов. Наиболее перспективным является способ получения НМГ путем обработки гепарина гепариназами.
Известна гепариназа I, выделенная из природного продуцента P. heparinus, которая обладает удельной активностью равной 130 ед./мг белка [The journal of biological chemistry 1992; 267 №34: 24347-24355], а также рекомбинантная гепариназа I из P. heparinus, продуцируемая клеткакми E.coli, с удельной активностью 100 ед./мг белка [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 3660-3664].
Однако использование указанных гепариназ I как в лабораторных, так и в промышленных масштабах производства НМГ, малоэффективно из-за низкой удельной активности этих ферментов [Godavarti S. Protein engineering of heparinase I - elucidation of structure-activity relationships // Massachusetts. - 1996. – 229 pp.].
Таким образом, важной задачей является получение гепарназ I с повышенной удельной активностью.
Известно [Microbiol Immunol, 1999. 243: p. 55-86; Biophys J, 2005. 89(6): p. 4159-70], что активность белка связана с такими структурными свойствами белка, как стабильность активного центра, способность белка образовывать димеры, тетрамеры и т.д., число водородных связей, число солевых мостиков, порядок контактов, доля остатков в белке, вовлеченных в различные элементы вторичной структуры, т.е. структурными свойствами, которые играют важную роль в сворачивании белка и приобретении им своей конечной нативной структуры.
Вклад аминокислоты в формирование третичной структуры фермента определяется не только ее природой, но и ее положением в аминокислотной последовательности и, следовательно, осуществляя точечные замены аминокислот, находящихся в значимых положениях аминокислотной последовательности, можно добиться изменения структурных свойств белка и его активности [J. Mol. Biol, 1998, v. 278, р. 279-289].
Известна мутантная гепариназа I, полученная путем замены аминокислотного остатка серии в положении 377 на аминокислотный остаток аланин [US 7056504 В1]. Данная замена привела к изменению удельной активности фермента на 10%. Однако такая величина изменения удельной активности фермента недостаточна для его практического применения.
Задачей заявляемого изобретения является получение мутантной гепариназы I с повышенной удельной активностью.
Поставленная задача решена тем, что получена мутантная рекомбинантная гепариназа I из P. heparinus с повышенной удельной активностью, характеризующаяся аминокислотной последовательностью соответствующей аминокислотной последовательности гепариназы I из бактерий Pedobacter heparinus, в которой аминокислотный остаток глутаминовой кислоты в положении 117 заменен на остаток глутамина, аминокислотный остаток глутамина в положении 118 заменен на остаток пролина, аминокислотный остаток глутаминовой кислота в положении 362 заменен на остаток пролина, аминокислотный остаток тирозина в положении 363 заменен на остаток пролина.
Для получения мутантной гепариназы I к гену НерА, кодирующему гепариназу I и имеющему нуклеотидную последовательность, приведенную в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1 [СР 001681.1, GenBank], применяют метод сайт-направленного мутагенеза [Archives of Biochemistry and Biophysics, 2000, v. 382, №1, p. 105-112] и получают ДНК, кодирующую заявляемую гепариназу I с выбранными аминокислотными заменами.
Полученную ДНК клонируют в вектор, подходящий для ее трансформации в клетки Е. coli. Так как в силу «вырожденности» генетического кода одна и та же аминокислотная последовательность может кодироваться большим числом нуклеотидных последовательностей, то для клонирования может быть использована не только сама вышеуказанная нуклеотидная последовательность, но и все ее формы, определяемые вырожденностью генетического кода.
Полученной рекомбинантной плазмидой осуществляют трансформацию штамма-реципиента. Трансформанты тестируют на способность проявлять гепариназную активность по методу Бернштейна [Methods Enzymol., 1988, V. 137, P. 515-529] и, отбирая клон, обладающий гепариназной активностью, получают штамм, продуцирующий мутантную гепариназу I.
Пример
1. Конструирование векторов для экспрессии природного и мутантного генов, кодирующих гепариназу I.
Мутантный ген HepA-QPPP получают, применяя метод сайт-направленного мутагенеза к гену НерА, кодирующему гепариназу I. Для этого в нативный ген НерА последовательно вводятся мутации, по две аминокислотные замены за один акт мутагенеза.
1.1. Получение промежуточного мутантного гена НерА-QP, кодирующего гепариназу I, содержащую замены в позициях 117 и 118.
На данном этапе мутагенеза ПЦР-методом синтезируют два фрагмента ДНК, включающих нуклеотидную замену в положении 349-354 нуклеотидного сиквенса, указанного в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1 (нативная гепариназа I), таким образом, что пара кодонов gaacag (кодирующие глутаминовую кислоту и глутамин) заменяют на пару кодонов cagccg (кодирующий глутамин и пролин).
Для ПЦР-синтеза используют следующие праймеры:
1. Для синтеза первого фрагмента
прямой - HepN1 
обратный - HepEQ -R 
2. Для синтеза второго фрагмента
прямой - HepEQ-F 
обратный - HepN2 
В качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции используют хромосому Pedobacter heparinus.
Для проведения полимеразной цепной реакции используют 100 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 нг ДНК-матрицы, по 1 мкМ соответствующего прямого и обратного праймеров, 2,5 ед. Pfu-полимеразы, 10 мкл 10х Pfu-буфера, 0,8 мМ dNTP. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин), 54°С - отжиг (1 мин), 72°С - полимеризация (50 с). Всего проводят 30 циклов амплификации. Амплифицированные фрагменты ДНК очищают в агарозном геле и затем при помощи «DNA gel extraction KIT» (Fermentas).
Наработанные фрагменты имеют следующие размеры:
- первый фрагмент 378 пар оснований;
- второй фрагмент 772 пар оснований.
Мутантный ген HepA-QP синтезируют методом полимеразной цепной реакции из двух вышеописанных фрагментов. Для проведения ПЦР используют 100 мкл реакционной смеси, содержащей 0,2 нг каждого ДНК-фрагмента, по 2 мкМ соответствующего прямого HepN1 и обратного HepN2 праймеров, 2,5 ед. Pfu-полимеразы, 10 мкл 10х Pfu-буфера, 0,8 мМ dNTP. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин), 54°С - отжиг (1 мин), 72°С - полимеризация (1 мин). Всего проведено 30 циклов амплификации. Из агарозного геля выделен амплифицированный фрагмент ДНК, размером 1098 пар оснований, который очищен при помощи «DNA gel extraction KIT».
1.2. Конструирование плазмиды pET22b- HepA-QP.
Полученный фрагмент ДНК HepA-QP гидролизуют эндонуклеазами рестрикции MlsI и HindIII (Fermentas), очищают в агарозном геле и лигируют с вектором pET22b(+), который в качестве селективного маркера для отбора трансформантов в клетках E. coli содержит селективный маркер bla, в качестве сайта начала репликации содержит pUC f1 ori, в состав экспрессионной кассеты входит промотор Т7-полимеразы, lac - оператор, Т7-терминатор транскрипции, С-концевую последовательность His-Tag для очистки белков, ген lacI, кодирующий репрессор лактозного оперона; а в качестве сигнального пептида вектор содержит сигнальный пептид пектат лиазы В Erwinia carotovora.
Предварительно вектор pET22b(+) расщепляют ферментами рестрикции по сайтам MlsI и HindIII. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E. coli Tuner DE3 [Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, Москва, "Мир", 1984, с. 84], приготовленные накануне путем обработки хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0°С - 40 мин, 42°С - 2 мин, 0°С - 5 мин) клетки разводят в 10 раз средой LB [Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, Москва, "Мир", 1984, с. 84], подращивают в течение одного часа и высевают на агар LB, содержащий ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Посевы инкубируют при 37°С.
На следующие сутки выросшие устойчивые к ампициллину колонии тестируют с помощью вышеприведенных праймеров и отбирают позитивные клоны, из которых выделяют плазмидную ДНК по стандартной методике (Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, Москва, "Мир", 1984, с. 89). Выделенные плазмидные ДНК гидролизуют эндонуклеазами рестрикции MlsI и HindIII, размер полученных фрагментов определяют с помощью гель-электрофореза. Затем отбирают клон, плазмидная ДНК которого содержит последовательность, соответствующую размеру последовательности кодирующей ген HepA-QP.
Из отобранного клона выделяют рекомбинантную плазмиду pET22b- HepA-QP. Ген HepA-QP секвенируют.
1.3. Получение мутантного гена НерА-QPPP, кодирующего гепариназу I, содержащую замены в позициях 117, 118, 362 и 363.
ПЦР-методом синтезируют ген, кодирующий мутантную гепариназу I, - QPPP, включающий нуклеотидные замены в положениях 349-354, 1084-1089 нуклеотидного сиквенса SEQ ID NO:1, таким образом, что пара кодонов gaaact (кодирующие глутаминовую кислоту и тирозин) заменяют на пару кодонов ccgccg (кодирующие пролин).
Для ПЦР-синтеза используют следующие праймеры:
прямой - HepN1 
обратный - Нер2ЕТ -R 
В качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции используют плазмиду pET22b- HepA-QP, полученную на предыдущем этапе.
Для проведения полимеразной цепной реакции используют 100 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 нг ДНК-матрицы, по 1 мкМ соответствующего прямого и обратного праймеров, 2,5 ед. Pfu-полимеразы, 10 мкл 10х Pfu-буфера, 0,8 мМ dNTP. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин), 54°С - отжиг (1 мин), 72°С - полимеризация (50 с). Всего проводят 30 циклов амплификации. Амплифицированные фрагменты ДНК очищают в агарозном геле при помощи «DNA gel extraction KIT» (Fermentas). Из агарозного геля выделен амплифицированный фрагмент ДНК, размером 1118 пар оснований, который очищен при помощи «DNA extraction KIT».
1.4. Конструирование плазмиды и отбор колонии трансформантов производят аналогично первому этапу мутагенеза (раздел 1.2).
В результате отбирают клон Е. coli pET22b- HepA-QPPP, плазмидная ДНК которого содержит последовательность, соответствующую размеру последовательности, кодирующей ген HepA-QPPP.
Из отобранного клона выделяют рекомбинантную плазмиду pET22b-HepA-QPPP. Ген HepA-QPPP секвенируют. Нуклеотидная последовательность гена соответствует последовательности, приведенной в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, и кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:3, отличающуюся от исходной заменами в позициях 117, 118, 362 и 363. Культуру отобранного и проверенного клона обозначают как штамм Е. coli pET22b- HepA-QPPP. Он способен продуцировать мутантную гепариназу I P. heparinus, отличающуюся от природного фермента заменами в позициях 117, 118, 362 и 363, и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) как Е. coli ВКПМ В-12284.
1.5. Для корректного сравнения удельной активности заявляемой мутантной рекомбинантной гепариназы I из P. heparinus и используемой в качестве контроля рекомбинантной природной гепариназы I из P. heparinus получен ген НерА (с использованием праймеров HepN1 и HepN2), кодирующий природную гепариназу I из P. heparinus, сконструирована плазмида pET22b-НерА и на ее основе получен штамм Е. coli pET22b- НерА, продуцирующий рекомбинантную природную гепариназу I из P. heparinus.
Дальнейшие действия для обоих рекомбинантных штаммов: штамма Е. coli pET22b- HepA-QPPP, продуцирующего мутантную рекомбинантную гепариназу I из P. heparinus, и штамма Е. coli pET22b- НерА, продуцирующего рекомбинантную природную гепариназу I из P. heparinus, осуществляют в одинаковых условиях.
2. Культивирование продуцентов природной и мутантной гепариназ I.
Культуру выращивают в пробирках в LB среде следующего состава, в мас. %: (пептон - 1,5; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; вода - остальное), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) при температуре 37°С при встряхивании (200 об/мин) в течение ночи. Далее 50 мкл ночной культуры переносят в 5 мл среды LB (без ампициллина) и культивируют в течение 1,5 часа при температуре 30°С и встряхивании (200 об/мин), добавляют 100 мкл 0,5 М изопропил β- D -1-тиогалактопиранозида (IPTG) и проводят индукцию в течение 2 часов при температуре 30°С и встряхивании (200 об/мин).
3. Выделение и очистка природной и мутантной гепариназ I.
Клетки осаждают центрифугированием (1 мин при 4°С и 5000 об/мин.), промывают 1 мл дистиллированной воды, повторно осаждают центрифугированием (90 с при 9000 об/мин), супернатант удаляют.
К промытым клеткам добавляют 100 мкл дистиллированной воды и 12 мкл раствора лизоцима (30 мг/мл), ресуспендируют и оставляют при 37°С на 30 минут для разрушения клеток. После центрифугирования (90 с при 9000 об/мин) отделяют надосадочную жидкость, содержащую гепариназу I.
Очистку полученной гепариназы I проводят методом аффинной хроматографии, для чего первоначально получают гепариназу I, меченную 6His-Tag на С-конце белка, которую затем очищают по методу (Sasisekharan, P. et al., 1995).
Чистоту белка подтверждают с использованием 12,5% SDS-PAGE в соответствии с общим методом Laemmli (Laemmli, 1970) и системы Mini Protean II (Bio Rad), проявление белков производят серебром с использованием Silver Stain Plus kit (Fermentas).
4. Измерение гепариназной активности природной и мутантной гепариназ I.
Гепариназную активность определяют в соответствии с модификацией метода Бернштейна [Methods Enzymol, 1988, V. 137, Р. 515- 529].
Для определения активности проводят ферментативную реакцию с использованием гепарина в качестве субстрата. Для чего к 1 мл раствора гепарина в буфере Трис-HCl (рН 7,4) (содержащего 25 г/л гепарина; 40 мМ NaCl; 3,5 мМ CaCl 2 и 17 мМ Трис-HCl) добавляют 10 мкл раствора очищенной гепариназы I. Реакцию проводят при 30°С в течение 1 часа. Степень деградации гепарина контролируют по изменению УФ-поглощения при 232 нм на Genesys 10S UV-VIS Thermo спектрофотометре.
Все измерения проводились в трех независимых повторностях, статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием программы MS Excel 2010.
Таким образом, удельная активность заявляемого рекомбинантного мутантного фермента гепариназа I из P. heparinus составляет 144.0±5 ЕД/мг белка, что на 29% превышает удельную активность полученного и очищенного в тех же условиях рекомбинантного не модифицированного фермента гепариназа I из P. heparinus, равную 112±5 ЕД/мг белка.
Claims (2)
1. Мутантная рекомбинантная гепариназа I, характеризующаяся аминокислотной последовательностью соответствующей аминокислотной последовательности гепариназы I Pedobacter heparinus, в которой аминокислотный остаток глутаминовой кислоты в положении 117 заменен на остаток глутамина, аминокислотный остаток глутамина в положении 118 заменен на остаток пролина, аминокислотный остаток глутаминовой кислоты в положении 362 заменен на остаток пролина, аминокислотный остаток тирозина в положении 363 заменен на остаток пролина.
2. Фрагмент ДНК, кодирующий мутантную гепариназу I по п.1, характеризующийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, указанную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO: 2, в которой нуклеотиды в положении 349-354 образуют пару кодонов, кодирующих глутамин и пролин, в положении 1084-1089 образуют пару кодонов, кодирующих два пролина, или последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 2, вследствие вырожденности генетического кода.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147379A RU2650667C1 (ru) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147379A RU2650667C1 (ru) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2650667C1 true RU2650667C1 (ru) | 2018-04-16 |
Family
ID=61977075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147379A RU2650667C1 (ru) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2650667C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109666666A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-04-23 | 天津科技大学 | 一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶i热稳定性的突变体及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7056504B1 (en) * | 1998-08-27 | 2006-06-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II |
| RU2576803C2 (ru) * | 2009-09-17 | 2016-03-10 | В.Л. Гор Энд Ассошиейтс, Инк. | Новые гепариновые частицы и способы их применения |
-
2016
- 2016-12-02 RU RU2016147379A patent/RU2650667C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7056504B1 (en) * | 1998-08-27 | 2006-06-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II |
| RU2576803C2 (ru) * | 2009-09-17 | 2016-03-10 | В.Л. Гор Энд Ассошиейтс, Инк. | Новые гепариновые частицы и способы их применения |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| UniProtKB - B3U3D9, 02.09.2008 Найдено в Интернет 09.08.2017 по адресу www.uniprot.org/uniprot/B3U3D9 * |
| UniProtKB - B3U3D9, 02.09.2008 Найдено в Интернет 09.08.2017 по адресу www.uniprot.org/uniprot/B3U3D9. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109666666A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-04-23 | 天津科技大学 | 一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶i热稳定性的突变体及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101299417B1 (ko) | 카복시-말단 아미드화 펩티드를 제조하는 방법 | |
| JP2019517799A (ja) | ｐｏｌＸファミリーＤＮＡポリメラーゼのバリアント | |
| CN107858340B (zh) | 高催化活性的d-果糖-6-磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用 | |
| Tan et al. | Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence | |
| JP2020174686A (ja) | 酵素を用いた４−アミノ桂皮酸の製造方法 | |
| CN109321549B (zh) | 一种比酶活提高的肝素酶i的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌 | |
| CN111394343A (zh) | L-苏氨酸醛缩酶突变体r318l及其应用 | |
| CN107287171A (zh) | 一种酶及其应用 | |
| KR101774354B1 (ko) | Z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질을 이용한 항체의 분리 및 정제 방법 | |
| KR20070060821A (ko) | 폴리믹신 생합성 효소 및 이를 코딩하는 유전자 군 | |
| RU2650667C1 (ru) | Мутантная рекомбинантная гепариназа I с повышенной удельной активностью из Pedobacter heparinus, фрагмент ДНК, кодирующий указанную гепариназу | |
| KR101979213B1 (ko) | 변형된 당 대사 경로를 갖는 재조합 균주 및 이를 이용한 당이성화 효소의 스크리닝 방법 | |
| JP6870102B2 (ja) | プロリン水酸化酵素及びその応用 | |
| KR20090039239A (ko) | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 | |
| CA2434414A1 (en) | Polypeptide having .alpha.-isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme activity | |
| RU2144957C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА | |
| CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
| JPWO2007145197A1 (ja) | 改変コンドロイチン合成酵素ポリペプチド及びその結晶 | |
| KR102006101B1 (ko) | 인간 섬유아세포 성장인자 21 재조합 단백질의 수용성 과발현 방법 | |
| CN101608179B (zh) | 融合肝素酶及其编码基因 | |
| KR102152625B1 (ko) | 비병원성 세균을 이용하여 히알루론산 생산을 위한 발현 시스템 및 상기 발현 시스템을 이용한 히알루론산 생산방법 | |
| CN116478969A (zh) | 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用 | |
| CN108531465B (zh) | 一种环二肽合成酶及其应用 | |
| CN113564135A (zh) | 一种酶活力和稳定性提高的裂解多糖单加氧酶突变体、基因工程菌及应用 | |
| CN108795832B (zh) | 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用 |