KR102152625B1 - 비병원성 세균을 이용하여 히알루론산 생산을 위한 발현 시스템 및 상기 발현 시스템을 이용한 히알루론산 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비병원성 균주에서 히알루론산 합성이 가능하며, 유도체 없이도 항시 발현되는 히알루론산 합성효소 발현 시스템, 상기 발현 시스템을 포함하는 형질전환된 균주, 및 상기 형질전환된 균주를 이용한 히알루론산의 생산 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 비병원성 세균을 이용하여 히알루론산을 생산하기 위한 항시 발현 프로모터(constitutive expression promoter)를 이용한 발현 시스템, 상기 발현 시스템을 포함하는 비병원성 세균, 및 이를 이용한 히알루론산의 생상방법에 관한 것이다.
히알루론산은 D-글루쿠론산(D-gluconic acid)과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)의 이당체단위로 이루어진 생체 고분자로 분자량에 따라, 성형용 필러, 관절염 치료제 및 유착방지제 등 다양한 용도로 활용되고 있다.
이러한, 히알루론산은 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.) 균주의 발효를 통해 생산할 수 있는데, 스트렙토코커스 속 균주는 감염성 미생물로 발열성 물질 등이 정제과정에서 오염될 가능성이 있다. 이러한 점을 개선하고자, GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주를 재조합벡터로 형질전환시켜 히알루론산을 생산하는 방법이 개발되었다.
등록특허 10-0879908 과 등록특허 10-0885163 (US 2003/175902)에서는 항시발현용 프로모터 (바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자 (amyQ) 프로모터)에 의해 조절되는 오페론 (스트렙토코커스 에퀴시미리스(Streptococcus equisimilis) 유래의 히알루론산 합성효소 유전자 (hasA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제(UDP-glucose 6-dehydrogenase) 유전자 (tuaD) 및 UDP-글루코스 피로포스포리라아제 (UDP-glucose pyrophosphorylase, gtaB)로 구성)을 바실러스 서브틸리스 게놈에 삽입시켜 히알루론산 생산이 가능하게 하였다.
이후, US2016/0237465에서는 히알루론산 생산 수율과 히알루론산 분자량을 향상시키고자, IPTG 유도용이며 강력한 프로모터 (Pgrac)에 의해 조절되는 오페론 (스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스 유래의 hasA 유전자와 바실러스 서브틸리스 유래의 tuaD 유전자로 구성)을 포함하는 플라스미드를 이용하여 바실러스 서브틸리스를 형질전환하였고, 향상된 수율과 분자량을 보인 바 있다.
하지만, IPTG유도형의 경우 고가의 유도체 IPTG를 사용해야 할 뿐 아니라, 유도체 처리를 위한 생산공정이 추가적으로 이루어져야 한다. 그러므로, 히알루론산 수율이 낮지 않다면 항시 발현 형태가 보다 바람직하다.
본 발명의 목적은 비병원성 균주에서 유도체 없이 히알루론산을 합성할 수 있는 발현 시스템 또는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 시스템이 도입된 균주 또는 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 균주 및 상기 균주를 이용한 히알루론산의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 및 히알루론산 합성효소 유전자를 포함하는 히알루론산 생산용 발현 시스템, 바람직하게는, 작동 가능하도록 연결된, 전사 프로모터, 히알루론산 합성효소 유전자 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자의 리보솜 결합부위(RBS), UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자를 포함하는 히알루론산 생산용 발현 시스템을 제공한다.
본 발명자들은 히알루론산 생산 수율이 높은 항시 발현용 시스템(constitutive expression system)을 만들고자 노력하여, 후술할 바와 같이 다양한 프로모터 선별을 통해 최적의 프로모터를 선별하였으며, 또한 hasA 유전자와 tuaD 유전자로 구성된 오페론에서 tuaD 유전자 발현에 필요한 다양한 리보솜 인식서열 (ribosome binding site, RBS)을 비교한 결과 적합한 서열을 확인하였다. 그 결과, IPTG유도형의 Pgrac 프로모터를 사용할 때에 비해 히알루론산 생산 효율이 높은 프로모터와 RBS로 구성된 히알루론산 생산용 발현 시스템 및 이를 포함하는 비병원성 균주를 제작하고 이를 이용하여 히알루론산을 생산하는 방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일예는 작동 가능하도록 연결된, 전사 프로모터, 리보솜 결합부위, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 및 히알루론산 합성효소 유전자를 포함하는, 히알루론산 생산용 발현 시스템에 관한 것이다. 상기 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 및 히알루론산 합성효소 유전자는 하나의 오페론을 구성하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5'에서 3'방향으로 순차적으로 히알루론산 합성효소 유전자, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자의 RBS 및 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자가 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 일예는 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주, 바람직하게는 비병원성 세균에 관한 것이다.
추가 일예는, 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주, 바람직하게는 비병원성 세균을 포함하는 히알루론산 생산용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주, 바람직하게는 비병원성 세균을 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템은 히알루론산 생산 수율과 히알루론산 분자량을 향상시키며, 히알루론산 합성시의 안전성이 증가하며, 값비싼 IPTG 유도체를 사용하지 않아 생산 비용 절감 효과를 가진다. 본 발명에 따라 생산된 히알루론산은 분자량이 500kDa 내지 10000kDa범위로서 보습 효과, 점도 상승, 관절 윤활 작용, 수분 흡수 능력, 탄성 능력 등이 우수한 장점이 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예는 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 및 히알루론산 합성효소 유전자를 포함하는 히알루론산 생산용 발현 시스템, 바람직하게는. 작동 가능하도록 연결된, 전사 프로모터, 리보솜 결합부위(RBS), UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 및 히알루론산 합성효소 유전자를 포함하는 히알루론산 생산용 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명에서 제공되는 히알루론산 생산용 발현 시스템은, 히알루론산 합성에 필요한 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 및 히알루론산 합성효소 유전자를 모두 포함하며, 상기 유전자들의 발현에 필요한 RBS 및 항시발현 프로모터를 제공함으로써, 별도의 유도체 없이도 히알루론산을 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템은 바실러스속 균주에 적용되는 것일 수 있으며, 예를 들면 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 발현 시스템에 적용 가능한 전사 프로모터는 바실러스속 균주에서 사용되는 항시 발현용 프로모터(constitutive expression promoter)일 수 있어, 상기 발현 시스템은 발현 유도제가 없이 항시 발현되는 히알루론산 합성효소를 생산하는 것이다. 또한, 상기 전사 프로모터는 P43 프로모터를 포함하는 발현 시스템을 갖는 형질전환 균주에 비해 히알루론산 생산량이 1.1 내지 10배를 갖는 높은 전사 수준을 갖는 것일 수 있다.
상기 항시 발현 프로모터는 예를 들어, P43, Pmsm, Ppbp, Pylb, Pyob, Pyqe 또는 Pyvl일 수 있으며, 바람직하게는 Psigx, Pyob, 또는 Pyqe일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 유도형 프로모터와 비교하여 유사하거나 높은 히알루론산 수율을 얻을 수 있다면 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다. 상기 Psigx 프로모터는 서열번호 53 및 54의 프라이머로 바실러스 서브틸리스 168 균주(Bacillus Genetic Stock Center)의 유전체로부터 PCR을 통해 얻은 것일 수 있다. 상기 Psigx, Pyob, 또는 Pyqe프로모터는 각각 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 프로모터의 구체적인 일 예를 하기 표 1에 기재하고, 각각의 프로모터 제조를 위해 사용한 구체적인 프라이머 세트를 하기 표 2에 나타낸다.
| 명명 | SEQ ID NO | 염기서열 |
| Psigx_promoter | 62 | aggttataaatttgaggtcggcgctgaatgaaattttggaaaagcgtagtaggcaagctgtggtttacgatcctttcactcgtcttgatcgtattgttcattttaacggttcttttgctggagtttattgaaaactaccatgtggaagaagctgagaatgatttaacacagcttgcgaataaagttgctgtcatcctagaaaatcacgaggaccaggcactggcaaggtcaatcacttgggaactcgctgataacttaacaagcattgccatcatccaggatgagaagaaccactggtattctccgaatgataaaaatcgcctgtcgtctattacggttgagcaaatacagcatgacaaagacttaaataaagctctcaaagaccataaaaaagtaagcaaacggacgggactgagcgatacagacacggataatgaacgcctgattgtaggtgtcccgtatgaaaaagacggaaagaaaggcatggtctttttatcccagtctttgcttgccgttaaagatacaacaaaacatacgacccgctatatttttcttgccgctggaattgcgattgtgctgaccacatttttcgcattctttttatcaagcagggtcacgtaccctctccgaaaaatgagagaaggcgcgcaggatttggcgaagggcaagttcgatacaaaaatcccgattttaactcaggatgaaatcggtgaactggcgaccgcttttaatcaaatgggccggcagcttaactttcatatcaatgcgctcaatcaagaaaaagagcagctttctaacattttgagcagtatggctgacggggttattaccattaatattgacggtacgattcttgtgaccaacccgccggctgaacgttttcttcaggcttggtattatgaacagaacatgaatatcaaagaaggcgacaatcttccgcctgaagcaaaagagctgtttcaaaacgctgtcagcactgaaaaagaacaaatgattgagatgacgcttcaaggcagatcatgggtgcttttgatgtcgccgctttatgcggaatcgcacgtcagaggagcggttgccgtactgcgtgacatgacagaagaacgccgccttgataagctgcgggaggactttatcgcaaatgtcagtcatgagctgagaacaccgatctccatgcttcagggatacagtgaagcaattgtcgatgacattgcaagctctgaagaagaccggaaagaaattgcccaaatcatttatgacgaatcgctccgaatgggccgtttagttaatgatttgcttgatttagcccgaatggaatcaggccatacaggcttacattatgaaaaaatcaatgtgaatgagtttttagaaaagatcattcggaagttttccggtgttgcgaaagaaaaaaatattgctttagatcatgacatttctctcacagaagaggaatttatgtttgatgaagacaagatggagcaggtatttaccaatttgattgataacgcgctgcggcatacttcagccggcggcagtgtctccatttcagtccattctgtgaaggatggattgaaaattgatatcaaagactccgggtctggcataccggaagaagatctgccatttatctttgagcggttttataaggcagataaagcgcggacaaggggcagagcaggaaccgggttagggctggctatcgttaaaaatatcgtggaagcccacaacggatcaattactgtgcacagccgaatagataaaggaacaacattttctttttatattccgacaaaacggtaaaatcgagtctgaatttgccgaagaatcttgttccataagaaacacccgctgactgagcgggtgtttttttaatagccaacattaataaaatttaaggatatgttaatataaattcccttccaaattccagttactcgtaatatagttgtaatgtaacttttcaagctattcatacgacaaaaaagtgaacggaggggtttcaa |
| Pyob_promoter | 63 | attcggcgttttggttttaggctacaactttgatcatgcatcagttgtaaatagaactaatgaatataaagaacactatggccttactgatggacttgtggttattgaagatgttgattactttgcttactgtctagatacaaataaaatgaaagacggagaatgccctgtagttgaatgggatagggtaattggttatcaagatactgttgcagacagctttattgaatttttttataataagattcaggaagcgaaagatgactgggatgaggatgaagactgggacgattaagcaaaagtattgctatagcgcaatagaaggcttgagttgcacatcctcaatctaaataaaataagctctcgcaatgagagcttattttattggattaaataattaaagtgacagaagttttctagtcccgttttatatgaaaccttttttattttagcccgtattaaaagtaaattcagagagaaggggagaagcttaa |
| Pyqe_promoter | 64 | cttcttgagcgtctcaaccaggatatgaagctgtatatgaaaaaccgtgagaaagacaaactgactgtcgttcgaatggttaaggcttcacttcaaaatgaagcaattaagcttaagaaagacagtttgaccgaggatgaggaactcactgtcctttctcgtgaacttaagcaacgtaaagactccctccaggaattttcaaacgctaatcgtttagatttagtagataaagttcaaaaagagctggacattttagaagtttatttacctgagcagctgtcagaagaagagctgcgtacaatcgtaaatgaaaccatcgcggaggtcggtgcgagctcaaaagcggacatgggcaaagtgatgggggcaattatgcctaaagtaaaaggtaaagctgacggaagtttaattaataagcttgtgagcagtcaactgtcttaaatggcaaagaaaaggacatctttctaagagagatgtctttttttatacataaaaaaatgaaacctttgatacatttgttacgtatgaagagaaggcacttattataaaaggaaggagggatacaccgcccttgcttcaaatcaaagga |
| 프로모터 | 서열번호 | 염기서열(5'-> 3') |
| P43 | 39 | gatcgctagctgataggtggtatgttttcg |
| 40 | gatcggatccgtgtacattcctctcttacctataa | |
| Pmsm | 41 | gatcgctagcagtgtctgcgaaaacattac |
| 42 | gatcggatccctaacatccccctttgttat | |
| Ppbp | 43 | gatcgctagcagatggcaagttagttacgc |
| 44 | gatcggatcctcctccacctcccatatctc | |
| Pylb | 45 | gatcgctagccatcgtcgaacgcgctccat |
| 46 | gatcggatccacgttctacctttgtcaaacaa | |
| pyob | 47 | gatcgctagcattcggcgttttggttttaggc |
| 48 | gatcggatccttaagcttctccccttctct | |
| Pyqe | 49 | gatcgctagccttcttgagcgtctcaacca |
| 50 | gatcggatcctcctttgatttgaagcaagg | |
| Pyvl | 51 | gatcgctagcttcaaaacaaaaaaggcaagat |
| 52 | gatcggatccttcattccacactcctattg | |
| Psigx | 53 | gatcgctagcaggttataaatttgaggtcggcg |
| 54 | gatcggatccttgaaacccctccgttcacttt |
본 발명의 일 실시예에서, Psigx 프로모터를 사용한 오페론을 포함하는 벡터를 바실러스 서브틸리스에 형질전환시킨 결과, IPTG 유도체를 필요로 하는 유도형 프로모터를 사용한 경우와 히알루론산 수율이 거의 동일하였다(도 4). 따라서, Psigx 프로모터가 히알루론산 생산에 적절한 항시 발현용 프로모터임을 알 수 있다.
상기 전사 프로모터는 P43 프로모터를 포함하는 발현 시스템을 갖는 형질전환 균주에 비해 히알루론산 생산량이 1.1 내지 10배, 1.15 내지 10배, 1.5 내지 10배, 2 내지 10배, 3 내지 10배, 4 내지 10배, 5 내지 10배, 1.1 내지 9배, 1.15 내지 9배, 1.5 내지 9배, 2 내지 9배, 3 내지 9배, 4 내지 9배, 5 내지 9배, 1.1 내지 8배, 1.15 내지 8배, 1.5 내지 8배, 2 내지 8배, 3 내지 8배, 4 내지 8배, 5 내지 8배, 1.1 내지 7배, 1.15 내지 7배, 1.5 내지 7배, 2 내지 7배, 3 내지 7배, 4 내지 7배, 5 내지 7배, 1.1 내지 6.5배, 1.15 내지 6.5배, 1.5 내지 6.5배, 2 내지 6.5배, 3 내지 6.5배, 4 내지 6.5배, 5 내지 6.5배, 1.1 내지 6배, 1.15 내지 6배, 1.5 내지 6배, 2 내지 6배, 3 내지 6배, 4 내지 6배, 5 내지 6배, 1.1 내지 5.5배, 1.15 내지 5.5배, 1.5 내지 5.5배, 2 내지 5.5배, 3 내지 5.5배, 4 내지 5.5배, 또는 5 내지 5.5배인 프로모터일 수 있다.
본 발명의 발현 시스템에 적용 가능한 리보솜 결합 부위(RBS)는 상기 tuaD 유전자를 hasA 유전자와 함께 발현시킴으로써 바실러스에서 히알루론산을 생산할 수 있게 된다. 상기 RBS는 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 암호화 유전자를 높은 수준으로 번역할 수 있는 것일 수 있으며, 상기 리보솜결합부위는 tuaD RBS를 사용하였을 때보다 1.1 내지 3배, 1.15 내지 3배, 1.2 내지 3배, 1.1 내지 2.5배, 1.15 내지 2.5배, 1.2 내지 2.5배, 1.1 내지 2배, 1.15 내지 2배, 1.2 내지 2배, 1.1 내지 1.5배, 1.15 내지 1.5배, 1.15 내지 1.5배, 1.1 내지 1.3배, 1.15 내지 1.3배 또는 1.2 내지 1.3배의 히알루론산 수율을 갖는 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 RBS는, BBa_B0030, BBa_B0031, BBa_B0032, BBa_B0033, BBa_B0034, BBa_B0035, tuaD 유전자의 RBS(tuaD RBS), 또는 pET 플라스미드의 RBS일 수 있으며, 각각 서열번호 65 내지 72의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며 구체적으로 표시하면 하기 표 3에 나타낸 것과 같다.
| 명명 | SEQ ID NO | 염기서열 |
| BBa_B0030-RBS | 65 | attaaagaggagaaatactag |
| BBa_B0031-RBS | 66 | tcacacaggaaacctactag |
| BBa_B0032-RBS | 67 | tcacacaggaaagtactag |
| BBa_B0033-RBS | 68 | tcacacaggactactag |
| BBa_B0034-RBS | 69 | aaagaggagaaatactag |
| BBa_B0035-RBS | 70 | attaaagaggagaatactag |
| RBS_tuaD | 71 | gacactgcgaccattataaattggaagatcattttacaggagagggttgagcgct |
| RBS_pET | 72 | aataattttgtttaactttaagaaggagatatacat |
본 발명의 일 실시예에서, BBa_B0034를 RBS로 사용하였을 때 tuaD RBS를 사용한 경우보다 우수한 수율을 나타냈으며, 기존에 BBa_B0035가 BBa_B0034에 비해 우수한 발현 효율을 보이는 것으로 알려졌던 것과는 달리, BBa_B0034 RBS 서열을 사용하였을 때 가장 높은 히알루론산 생산 수율을 나타내었다(도 5).
본 발명에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템은 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자와 히알루론산 합성효소 유전자를 포함하며, 상기 두 가지 유전자는 하나의 오페론을 구성하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5'에서 3'방향으로 순차적으로 히알루론산 합성효소 유전자, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자의 RBS 및 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자가 연결된 오페론일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자는, 예를 들어 tuaD 유전자 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 tuaD 유전자는 tuaD 유전자를 가지는 것으로 알려져 있는 종으로부터 유래된 tuaD 유전자를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 바실러스속 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 균에서 유래한 tuaD 유전자일 수 있다. 상기 tuaD 유전자는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 2217 균주의 tuaD 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 적절한 돌연변이가 도입된 tuaD 유전자일 수 있고, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제의 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 자유롭게 변형되어 사용될 수 있다. 본 발명의 일예에서, tuaD 유전자는 서열번호 73 의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 리보솜결합부위 및 tuaD는 바실러스 서브틸리스 2217 균주로부터 서열번호 37 및 38의 프라이머쌍을 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 수득되었다.
상기 히알루론산 합성효소 유전자는, 예를 들어 hasA 유전자 또는 이의 변이 유전자일 수 있다. 상기 hasA 유전자는, hasA 유전자를 가지는 것으로 알려져 있는 종으로부터 유래된 hasA 유전자를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 스트렙토코커스 속의 균주, 바람직하게는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 hasA 유전자의 변이 유전자는, 히알루론산 합성 활성이 유지되는 범위에서의 모든 유전자 상의 변이를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일예에서, hasA 유전자는 서열번호 74 또는 76의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 75 또는 77의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 히알루론산 합성효소 유전자로서 스트렙토코커스 쥬피에피데미쿠스로부터 서열번호 1 내지 36번의 프라이머 (표 4)를 사용하여 PCR-based two step DNA synthesis 방법을 통하여 hasA 유전자를 획득하였다.
구체적으로, 서열번호 1 내지 12까지의 프라이머를 이용하여 DNA 단편 1을 제작하고, 서열번호 12부터 24, 서열번호 25부터 36까지를 이용하여 각각 DNA 단편 2와 3을 제작하였다. 전체 길이의 hasA 유전자를 얻기 위해, 상기 얻어진 DNA 단편 1, 단편 2 및 단편 3을 혼합하고 서열번호 1 및 서열번호 36으로 구성된 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 진행하였다.
| 명명 | 서열 번호 |
hasA CDS 증폭부위 |
염기서열(5'-> 3') |
| hasA_frag1_forward1 | 1 | (1~42) | cgggatccatgagaacattaaaaaacctcataactgttgtggcctttagt |
| hasA_frag1_forward2 | 2 | (28~77) | gttgtggcctttagtattttttgggtactgttgatttacgtcaatgttta |
| hasA_frag1_forward3 | 3 | (63~112) | ttacgtcaatgtttatctctttggtgctaaaggaagcttgtcaatttatg |
| hasA_frag1_forward4 | 4 | (98~147) | gcttgtcaatttatggctttttgctgatagcttacctattagtcaaaatg |
| hasA_frag1_forward5 | 5 | (133~182) | ctattagtcaaaatgtccttatcctttttttacaagccatttaagggaag |
| hasA_frag1_forward6 | 6 | (168~217) | gccatttaagggaagggctgggcaatataaggttgcagccattattccct |
| hasA_frag1_reverse1 | 7 | (203~252) | ggtctctagcaatgactcagcatcttcgttataagagggaataatggctg |
| hasA_frag1_reverse2 | 8 | (238~287) | gctaggggataggtttgctgctgaacactttttaaggtctctagcaatga |
| hasA_frag1_reverse3 | 9 | (273~322) | catcagcacttccatcgtcaacaacataaatttctgctaggggataggtt |
| hasA_frag1_reverse4 | 10 | (308~357) | acgcacatagtcttcaatgcgcttaatacctgtctcatcagcacttccat |
| hasA_frag1_reverse5 | 11 | (343~392) | tgaacaatgacattgcttgataggtcaccagtgtcacgcacatagtcttc |
| hasA_frag1_reverse6 | 12 | (378~427) | gtgcatgacgctttccttgatttttctctgaccgatgaacaatgacattg |
| hasA_frag2_forward1 | 13 | (413~462) | gaaagcgtcatgcacaggcctgggcctttgaaagatcagacgctgatgtc |
| hasA_frag2_forward2 | 14 | (448~497) | tcagacgctgatgtctttttgaccgttgactcagatacttatatctaccc |
| hasA_frag2_forward3 | 15 | (483~532) | tacttatatctaccctgatgctttagaggagttgttaaaaacctttaatg |
| hasA_frag2_forward4 | 16 | (518~567) | taaaaacctttaatgacccaactgtttttgctgcgacgggtcaccttaat |
| hasA_frag2_forward5 | 17 | (553~602) | acgggtcaccttaatgtcagaaatagacaaaccaatctcttaacacgctt |
| hasA_frag2_forward6 | 18 | (588~637) | tctcttaacacgcttgacagatattcgctatgataatgcttttggcgttg |
| hasA_frag2_reverse1 | 19 | (623~672) | aaggatattacctgtaacggattgggcagctcgttcaacgccaaaagcat |
| hasA_frag2_reverse2 | 20 | (658~707) | tcgcgtctgtaaacgctaagcggacctgagcaaacaaggatattacctgt |
| hasA_frag2_reverse3 | 21 | (693~742) | ggttgatgtatctatctatgttaggaacaaccacctcgcgtctgtaaacg |
| hasA_frag2_reverse4 | 22 | (728~777) | atcaccaatacttacaggaatacccaggaaggtctggttgatgtatctat |
| hasA_frag2_reverse5 | 23 | (763~812) | cctaaatcagttgcatagttggtcaagcacctgtcatcaccaatacttac |
| hasA_frag2_reverse6 | 24 | (798~847) | taatacatttagcagtggattgataaacagtctttcctaaatcagttgca |
| hasA_frag3_forward1 | 25 | (833~882) | ctgctaaatgtattacagatgttcctgacaagatgtctacttacttgaag |
| hasA_frag3_forward2 | 26 | (868~917) | tctacttacttgaagcagcaaaaccgctggaacaagtccttctttagaga |
| hasA_frag3_forward3 | 27 | (903~952) | gtccttctttagagagtccattatttctgttaagaaaatcatgaacaatc |
| hasA_frag3_forward4 | 28 | (938~987) | aaatcatgaacaatccttttgtagccctatggaccatacttgaggtgtct |
| hasA_frag3_forward5 | 29 | (973~1022) | atacttgaggtgtctatgtttatgatgcttgtttattctgtggtggattt |
| hasA_frag3_forward6 | 30 | (1008~1057) | ttctgtggtggatttctttgtaggcaatgtcagagaatttgattggctca |
| hasA_frag3_reverse1 | 31 | (1043~1092) | aacaatgaagataatcaccagaaaggctaaaaccctgagccaatcaaatt |
| hasA_frag3_reverse2 | 32 | (1078~1127) | tgcttaagcatgtaatgaatgttccgacacagggcaacaatgaagataat |
| hasA_frag3_reverse3 | 33 | (1113~1162) | ccccataaaacggagataacaagaaggacagcgggtgcttaagcatgtaa |
| hasA_frag3_reverse4 | 34 | (1148~1197) | taatttcaagggctgtaggacaaacaaatgcagcaccccataaaacggag |
| hasA_frag3_reverse5 | 35 | (1183~1232) | ccccagtcagcatttctaatagtaaaaagagaatataatttcaagggctg |
| hasA_frag3_reverse6 | 36 | (1218~1254) | gctctagattataataattttttacgtgttccccagtcagcattt |
본 발명의 일예는 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주 또는 재조합 균주일 수 있다.
상기 균주는 GRAS 등급의 균주일 수 있으며, 그람 양성균, 예를 들어, 바실러스속 균주, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis)일 수 있다. GRAS 등급의 균주를 사용함으로써 히알루론산 합성시의 안전성이 증가할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 2217 균주에 상기 히알루론산 생산용 발현 시스템을 도입시켜 IPTG와 같은 유도체 없이도 히알루론산을 생산하는 균주를 획득하였다.
본 발명은 상기 히알루론산 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함하는 비병원성 세균을 이용한 히알루론산 생산방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 히알루론산 생산방법은 히알루론산 생산용 형질전환 균주를 배양하는 단계에 더하여, 히알루론산을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 배양액에서 균주를 제거하는 단계 및 상기 균주가 제거된 배양액에서 히알루론산을 침전시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 생산용 형질전환 균주 및 히알루론산 생산방법에서, 전사 프로모터, 히알루론난 합성효소(hyaluronan synthase) 유전자, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 발현용 리보솜 결합부위 및 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 등에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 재조합 균주를 이용한 히알루론산의 생산 방법은 IPTG 등의 유도체 없이도 항시 발현 프로모터를 통해 유도형 프로모터를 사용한 경우보다 동등하거나 그 이상의 히알루론산 수율을 나타낼 수 있다.
상기 균주를 배양하는 단계는 탄소원으로 수크로즈를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 균주의 배양, 균주 제거 및 히알루론산의 침전 단계는 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 필요에 따라 통상의 기술자가 적절히 변형하여 사용할 수 있다.
상기 히알루론산의 생산 방법은 히알루론산의 침전단계 이후 히알루론산의 농축, 정제, 또는 농축 및 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조 방법을 사용하여 수득된 히알루론산은 분자량이 100 내지 10,000kDa, 500 내지 10,000kDa, 500 내지 8,000kDa, 3,000 내지 8,000kDa, 또는 5,000 내지 6,000kDa일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 히알루론산 합성 시스템을 도입한 바실러스 균으로부터 최대 피크 5,455kDa의 초고분자 히알루론산을 수득할 수 있었다. 이러한 고분자 히알루론산은 저분자 히알루론산에 비해 보습 효과, 점도 상승, 관절 윤활 작용, 수분 흡수 능력, 탄성 능력 등이 우수한 특성을 가진다. 따라서 고분자 히알루론산은 슬관절 주사제, 점안제, 성형용 필러 등의 의약품으로의 활용 가치가 높다. 특히 본 발명이 제공하는 발현 시스템을 이용하여 제작된 히알루론산과 같은 3000kDa 이상의 초고분자 히알루론산은 체내 분해 속도가 느려서 유착 방지제로 사용 가능하다.
또한 저분자 히알루론산을 고분자 히알루론산으로 변환하기 위해서는 가교제 또는 화합물을 처리하고 복잡한 과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있는 반면, 고분자 히알루론산을 저분자 히알루론산으로 변환하는 과정은 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 비교적 용이한 장점을 가진다.
본 발명의 히알루론산 합성을 위한 균주는 비병원성 균주로서, 히알루론산 합성시의 안전성이 증가하며, 발현 유도제로서 값비싼 IPTG 유도체를 사용하지 않아 생산 비용 절감 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일예에 따라 제조된 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드의 벡터 맵을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일예에 따라 제조된 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드의 제조를 위한 클로닝 과정의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일예에 따라 다양한 프로모터를 포함하는 발현 시스템을 바실러스속 균주에 도입한 후 생산된 히알루론산의 농도를 상대적으로 표시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일예에 따라 항시 발현형 프로모터인 Psigx와 IPTC 유도형 프로모터인 Pgrac을 사용한 경우에 생산된 히알루론산의 농도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일예에 따라 다양한 리보솜 결합부위를 사용한 경우에 생산된 히알루론산의 상대적 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 상업적으로 구입한 히알루론산 표준품과 본 발명의 일예에 따라 재조합 균주의 배양액으로부터 정제한 히알루론산의 적외부스펙트럼 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 본 발명의 일예에 따라 재조합 균주의 배양액으로부터 정제된 히알루론산의 분자량을 다각도 레이저 광 산란 측정기(MALLS)로 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일예에 따라 제조된 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드의 제조를 위한 클로닝 과정의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일예에 따라 다양한 프로모터를 포함하는 발현 시스템을 바실러스속 균주에 도입한 후 생산된 히알루론산의 농도를 상대적으로 표시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일예에 따라 항시 발현형 프로모터인 Psigx와 IPTC 유도형 프로모터인 Pgrac을 사용한 경우에 생산된 히알루론산의 농도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일예에 따라 다양한 리보솜 결합부위를 사용한 경우에 생산된 히알루론산의 상대적 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 상업적으로 구입한 히알루론산 표준품과 본 발명의 일예에 따라 재조합 균주의 배양액으로부터 정제한 히알루론산의 적외부스펙트럼 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 본 발명의 일예에 따라 재조합 균주의 배양액으로부터 정제된 히알루론산의 분자량을 다각도 레이저 광 산란 측정기(MALLS)로 측정한 결과이다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 하기 실시예의 기재에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: hasA 및 tuaD 오페론의 클로닝
1-1: 히알루론산 합성효소 유전자 (hasA)의 클로닝
스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 유래의 히알루론산 합성효소 유전자 (hasA, Genbank No. AY173078의 염기서열 1~1254) (서열번호 75)는 표 4에 나타낸 서열번호 1부터 36까지의 프라이머들을 이용하여, PCR 기반의 2단계 DNA 합성 방식(PCR-based two step DNA synthesis, PTDS; Xiong, 2004, Nucleic Acids Research 32:e98)으로 합성하였다. 구체적으로, 서열번호 1부터 12까지를 이용하여 DNA 단편 1을 만들고, 마찬가지로 서열번호 13부터 24까지, 25부터 36까지를 이용하여 각각 DNA 단편 2와 단편 3을 제조하였다. 전체 길이의 hasA 유전자를 얻기 위해, 상기 얻어진 DNA 단편 1, 단편 2 및 단편 3을 혼합하고 서열번호 1 및 서열번호 36로 구성된 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 진행하여, hasA 유전자를 획득하였다. PCR조건은 Veriti® Thermal Cycler (applied biosystem)을 이용하여 94℃에서 15초 변성, 55℃에서 15초 결합, 72℃에서 1분30초 신장하는 단계를 총 25회 실시하였다. 상기 히알루론산 합성효소 유전자로서 스트렙토코커스 쥬피에피데미쿠스로부터 유래한 hasA 유전자를 사용하였으며, 상기 기재한 방법으로 서열번호 1 내지 36번의 프라이머 (표 4)를 사용하여 전장 hasA 유전자를 얻었다. 획득한 전체 길이의 hasA 유전자를 제한효소 BamHI과 XbaI으로 절단하고, BamHI과 XbaI으로 절단된 pHCMC02 (Bacillus Genetic Stock Center) 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 상기 벡터를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pHCMC02-hasA를 분리하였다. 확보된 플라스미드 pHCMC02-hasA는 염기서열 분석을 통해 정상적인 hasA 유전자가 클로닝되었음을 확인하였다.
1-2: UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자(tuaD)의 클로닝
바실러스속 균주에서 히알루론산을 생산하기 위해서는 히알루론산 합성효소만으로는 부족하고, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제(UDP-glucose 6-dehydrogenase)가 동시에 발현되어야 하며 (Winder, 2005, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71:3747-3752), 이를 위해서는 hasA와 tuaD로 이루어진 오페론을 완성하여야 한다.
상기 오페론을 구성하기 위해서는 tuaD 유전자 앞에 RBS (ribosome binding site)가 존재해야 하므로, 바실러스 서브틸리스 2217 균주 (생물자원센터(KCTC))의 DNA를 주형으로 서열번호 37의 RBS_tuaD_forward primer 및 서열번호 38의 RBS_tuaD_reverse primer를 이용하여, tuaD 유전자의 5'-말단에 RBS34 (BioBrick BBa_B0034)가 포함되도록 tuaD 유전자를 증폭하였다. PCR은 Veriti® Thermal Cycler (applied biosystem)를 이용하여 94℃에서 15초 변성, 55℃에서 15초 결합, 72℃에서 1분30초 신장하는 단계를 총 30회 실시하였다.
서열번호 37: 5'-aatctagaaaagaggagaaatactagatgaaaaaaatagctgtcattgg-3'
서열번호 38: 5'-gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt-3'
증폭된 RBS34-tuaD 유전자는 제한 효소 XbaI로 절단하였고, XbaI과 SmaI으로 절단된 pBluescriptII SK+ (Stratagene) 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pBSIISK-RBS34-tuaD를 단리하였다. 확보된 플라스미드 pBSIISK-RBS34-tuaD는 염기서열 분석을 통해 Genbank No. AF015609의 염기서열 3599~4984 bp(tuaD 유전자의 단백질 코딩 부위, 서열번호 73)가 정상적으로 클로닝되었음을 확인하였다.
1-3: hasA 및 tuaD 오페론의 클로닝
hasA와 tuaD유전자로 구성된 오페론을 완성하기 위해서, 실시예 1-2에서 얻어진 pBSIISK-RBS34-tuaD를 제한효소 XbaI과 SmaI으로 절단하고, 절단된 RBS34-tuaD유전자를 동일한 제한효소로 처리된, 실시예 1-1에서 얻어진 pHCMC02-hasA 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드를 단리하였다. 상기 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD에 대한 벡터 맵과 클로닝 과정의 모식도를 도 1 및 도 2에 각각 나타냈다.
실시예 2: hasA-tuaD 오페론 발현용 프로모터 선별
실시예 1에서 제조된 플라스미드 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD에서 hasA-tuaD 오페론의 발현은 PlepA 프로모터에 의해 조절되는데, PlepA 프로모터는 활성이 약한 것으로 알려져 있다. 이에, PlepA 프로모터를 다양한 프로모터로 교체하여 hasA-tuaD 오페론 발현 활성이 높은 프로모터를 선별하였다. 상기 후보 프로모터들은 바실러스속 균주에서 사용되는 항시 발현용 프로모터(constitutive expression promoter)인 P43에 비해 발현 활성이 높은 것들로 선정하였다 (Yu, 2015, Scientific Reports, 5:18405; Song, 2016, PLoS One. 11:e0158447).
상기 시험된 각 프로모터에 의해 조절되는 플라스미드를 제작하기 위해서, 바실러스 서브틸리스 168 균주 DNA (Bacillus Genetic Stock Center)를 주형으로 상기 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 각각의 프로모터들을 PCR로 증폭하였다. 구체적으로 PP43 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 39 및 40), Pmsm 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 41 및 42), Ppbp 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 43 및 44), Pylb 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 45 및 46), pyob 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 47 및 48), Pyqe 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 49 및 50), Pyvl 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 51 및 52), Psigx 프로모터의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 53 및 54) 를 사용하였다.
PCR을 통해 증폭된 각각의 프로모터를 제한효소 NheI과 BamHI으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 실시예 1의 pHCMC02-hasA-RBS34-tuaD에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 각각의 플라스미드를 단리하였다. 염기서열 분석을 통해 단리된 각각의 플라스미드들에 정상적으로 각 프로모터들이 클로닝되었음을 확인하였다.
서로 다른 프로모터를 가지고 있는 플라스미드들을 전기천공법(Sun, 2015, Applied Microbiology and Biotechnology, 99:5151-5162)에 의해 바실러스 2217 균주에 도입하여, 클로로암페니콜 내성을 가지는 형질전환 균주들을 제조하였다.
다음으로, 각각의 형질전환 균주들을 LB배지에 접종하고 밤샘 배양을 하였다. 밤샘 배양된 균주 0.2 mL을 250mL 삼각플라스크에 들어 있는 20 mL sucrose배지 (1L당 50g 의 수크로즈, 20g 의 효모추출물, 1.5g 의 황산마그네슘 (MgSO4)이 포함된 50mM 인산칼륨 (potassium phosphate (pH7.0))에 접종한 후, 37℃ 온도에서 180rpm으로 진탕 배양하였다. 배양시작 후 65시간에 각각의 배양액을 취하고, 10,000 rpm으로 1분간 원심분리 후 0.45 μm 필터를 통과시켜 균주를 제거하였다.
균주가 제거된 배양액에 3배 부피의 에탄올을 첨가하고 4℃ 온도에서 2 시간 동안 정치시키고, 4 ℃ 온도에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 히알루론산을 침전시켰다. 침전된 히알루론산을 건조시키고, 물에 녹인 후, HA quantitative Test Kit (Corgenix, Westminster, CO, USA)를 사용하여 히알루론산 함량을 측정하고, 항시 발현용 프로모터(constitutive expression promoter)인 P43을 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산의 함량(g/L)을 100으로 설정하고, 시험 프로모터를 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산 함량을 상대적으로 표시하여 그 % 비율을 표 5와 도 3에 나타냈다.
| 프로모터 | 상대적 히알루론산의 생산량(%) |
| P43 | 100.0 ± 4.2 |
| Pmsm | 15.1 ± 1.9 |
| Ppbp | 3.9 ± 0.8 |
| Pylb | 38.1 ± 2.3 |
| pyob | 31.6 ± 7.1 |
| Pyqe | 134.3 ± 6.7 |
| Pyvl | 15.0 ± 11.1 |
| Psigx | 488.2 ± 13.4 |
도 3에는 각 프로모터를 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 상대적 히알루론산의 함량을 그래프로 나타내었다. Psigx 프로모터(서열번호 62), Pyob 프로모터(서열번호 63), 및 pyqe 프로모터(서열번호 64)가 P43 프로모터 보다 발현양이 높았으며, 특히 Psigx 프로모터가 다른 프로모터에 비해 히알루론산 생산에 효과적임을 확인하였다. 이후 Psigx 프로모터가 클로닝된 플라스미드를 pSigx-hasA-RBS34-tuaD로 명명하였다.
실시예 3: Psigx 프로모터의 히알루론산 수율
IPTG유도형 프로모터인 Pgrac과, 실시예2에서 항시 발현용 프로모터로서 발현 효율이 높은 것으로 선별된 Psigx 프로모터의 발현 효율을 비교하기 위해서, pSigx-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드의 Psigx 프로모터를 IPTG유도형 Pgrac 프로모터로 교체하여 pgrac-hasA-RBS34-tuaD를 제작하였다.
구체적으로, 프로모터 교체를 위해서 pHT01 플라스미드 (Mobitec)를 제한효소 NheI과 BamHI으로 절단하여 Laci와 Pgrac 프로모터를 분리하고, 동일한 제한효소로 절단되어 Psigx 프로모터가 제거된 pSigx-hasA-RBS34-tuaD에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 Pgrac-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 전기천공법에 의해 바실러스 2217 균주에 도입하고, 클로람페니콜 내성을 가지는 형질전환 균주를 완성하였다.
완성된 IPTG유도형 Pgrac 프로모터에 의해 히알루론산 생산에 관련된 합성효소들의 발현이 조절되는 형질전환 균주와, 실시예 2에 따른 Psigx 프로모터에 히알루론산 생산관련 합성효소들이 항시 발현되는 균주의 히알루론산 생산 수율을 비교하였다. 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 각 균주를 배양하고, 배양 65시간에 배양액을 취하였다. 다만, IPTG유도형의 경우 합성효소들의 발현을 유도하기 위해 밤샘 배양된 균주를 수크로스 배지에 접종하고 2시간 후에 IPTG가 0.5mM이 되도록 IPTG를 첨가하였고, 유도형의 경우 72시간에 배양액을 취하였다. 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 두 균주의 히알루론산 생산량을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 두 균주는 거의 동일한 수율을 갖는 것임을 확인할 수 있었다. 이를 통해 고가의 IPTG를 사용하는 유도형에 비해 저렴하고 간단하게 히알루론산을 생산하는 방법을 구축하였다.
실시예 4: tuaD 유전자의 과발현용 RBS 선별
D-글루쿠론산은 히알루론산의 구성요소로 본래 바실러스가 가지고 있는 tuaD 유전자에 의해 생성될 수 있지만, 효율적인 히알루론산 생산을 위해서는 tuaD 유전자의 과발현이 필요하다. 이를 위해 전술한 바와 같이 hasA 유전자와 tuaD 유전자를 오페론 형태로 제작하여 hasA 유전자와 함께 tuaD 유전자의 과발현을 유도한다. 오페론을 구성하기 위해서는 tuaD 유전자 5'말단에 활성이 높은 RBS서열이 존재하여 tuaD 유전자의 번역을 조절해야 한다. RBS의 활성도는 주변 서열에 상황 의존적(sequence context-dependent)이므로, 조절받는 유전자의 서열에 따라 다를 수 있다 (Mutalik, 2013, Nature Methods, 10:347-353). 이러한 이유로 실제 tuaD의 번역에 유리하며 결과적으로 히알루론산 생산에 적합한 RBS 선별과정을 진행하였다.
구체적으로, RBS 선별에는 BioBrick Registry of standard biological parts로부터 6개의 합성 RBS (BBa_B0030, BBa_B0031, BBa_B0032, BBa_B0033, BBa_B0034, BBa_B0035), tuaD 유전자 본래의 RBS (tuaD RBS), 그리고 pET 와 같이 일반적으로 사용되는 플라스미드의 RBS (RBS)를 비교하였다. 상기 시험한 8개 RBS 서열을 표 3에 나타냈다. 각각의 RBS서열이 5'말단에 포함된 tuaD 유전자를 확보하기 위해서 표 4에 나타낸 프라이머 및 서열번호 38을 사용하여 바실러스 서브틸리스 168 균주 (Bacillus Genetic Stock Center)의 DNA를 주형으로 PCR을 진행하였다.
증폭된 각각의 RBS를 포함한 tuaD유전자는 XbaI으로 절단하였고, XbaI과 SmaI으로 절단하여 RBS34-tuaD가 제거된 pSigx-hasA-RBS34-tuaD 플라스미드에 T4 DNA 라이게이즈 (NEB)를 사용하여 연결하였다. 이를 E. coli DH5alpha (Enzynomics)에 도입하였고, 엠피실린이 포함된 평판배지에 도말하여 얻어진 엠피실린 내성 형질전환체로부터 각각의 플라스미드를 단리하였다. 염기서열 분석을 통해 단리된 각각의 플라스미드들에 정상적으로 해당하는 RBS를 포함한 tuaD유전자가 클로닝 되었음을 확인하였다.
| 명명 | 서열 번호 |
염기서열 (5'->3') |
| BBa_B0030-RBS | 65 | attaaagaggagaaatactag |
| BBa_B0031-RBS | 66 | tcacacaggaaacctactag |
| BBa_B0032-RBS | 67 | tcacacaggaaagtactag |
| BBa_B0033-RBS | 68 | tcacacaggactactag |
| BBa_B0034-RBS | 69 | aaagaggagaaatactag |
| BBa_B0035-RBS | 70 | attaaagaggagaatactag |
| tuaD RBS | 71 | gacactgcgaccattataaattggaagatcattttacaggagagggttgagcgct |
| pET RBS | 72 | aataattttgtttaactttaagaaggagatatacat |
| BBa_B0030-PCR | 55 | aatctagaattaaagaggagaaatactagatgaaaaaaatagctgtc |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| BBa_B0031-PCR | 56 | aatctagatcacacaggaaacctactagatgaaaaaaatagctgtc |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| BBa_B0032-PCR | 57 | aatctagatcacacaggaaagtactagatgaaaaaaatagctgtc |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| BBa_B0033-PCR | 58 | aatctagatcacacaggactactagatgaaaaaaatagctgtc |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| BBa_B0034-PCR | 37 | aatctagaaaagaggagaaatactagatgaaaaaaatagctgtcattgg |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| BBa_B0035-PCR | 59 | aatctagaattaaagaggagaatactagatgaaaaaaatagctgtc |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| tuaD-RBS-PCR | 60 | aatctagagacactgcgaccattataaattgg |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt | |
| pET-RBS-PCR | 61 | aatctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaaaaaatagctgtc |
| 38 | gggttataaattgacgcttcccaagtctttagccaatt |
상기에서 얻어진, 서로 다른 RBS를 가지고 있는 플라스미드들을 전기천공법으로 바실러스 서브틸리스 2217 균주에 도입하고, 클로로암페니콜 내성을 가지는 형질전환 균주들을 제조하였다.
다음으로, 실시예 2의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로, 각각의 형질전환 균주들을 배양하고 배양액을 취하여 히알루론산 함량을 측정하였으며, pET 플라스미드의 RBS를 사용한 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산의 함량(g/L)을 100으로 설정하고, 시험 RBS 서열을 포함하는 형질전환 균주가 생산하는 히알루론산 함량을 상대적으로 표시하여 그 결과를 표 7과 도 5에 나타냈다.
| RBS 종류 | 상대적 히알루론산의 생산량(%) |
| BBa_B0030-RBS | 83.6 ± 8.9 |
| BBa_B0031-RBS | 4.2 ± 1.4 |
| BBa_B0032-RBS | 4.7 ± 0.5 |
| BBa_B0033-RBS | 5.7 ± 0.9 |
| BBa_B0034-RBS | 123.3 ± 1.8 |
| BBa_B0035-RBS | 80.5 ± 1.0 |
| tuaD RBS | 75.7 ± 9.5 |
| pET RBS | 100.0 ± 6.4 |
BioBrick Registry of standard biological parts (http://parts.igem.org/Ribosome_Binding_Sites/Prokaryotic/Constitutive/Community_Collection)의 비교 결과에 따르면 BBa_B0035가 BBa_B0034 (실시예 1-2의 RBS에 해당)에 비해 더욱 발현 효율이 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 실시예의 실험결과에 따르면 RBS 자체 특성과 달리, 본 발명에 따른 발현시스템의 경우 BBa_B0034 RBS서열을 사용할 때 가장 높은 히알루론산 생산 수율을 확인하였다.
실시예 5: 생산된 히알루론산의 분자량 측정
실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 생산된 히알루론산을 한외여과를 통해 정제한 후 분자량을 측정하였다. 먼저, 생산된 히알루론산을 정제하는 과정은 다음과 같다. 배양액을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 0.45 μm 필터를 통과시켜 균주를 제거하였다. 균주가 제거된 배양액을 컷-오프(cut-off)값이 100 kDa인 한외여과막으로 여과하여 산물을 얻었다. 상기 얻어진 전체 산물에서 1%(v/v) 농도가 되도록 브롬화세틸 트리메틸 암모늄을 첨가하고 1시간 교반 및 원심분리(7,000 rpm, 30분)하여 침전물을 획득하였다. 상기 침전물을 0.25M 요오드화 나트륨 용액에 10분간 교반하며 녹여 브롬화세틸 트리메틸 암모늄이 요오드와 나트륨과 반응하도록 하였다. 반응액을 원심분리(7,000rpm, 30분)하고 상등액을 취하여 브롬화세틸 트리메틸 암모늄과 요오드화 나트륨 반응물을 제거하였다. 상등액에 2% 활성탄소를 첨가하고 1시간동안 교반하여 불순물을 흡착시키고, 0.22 μm 필터를 통과시켜 정제 시료를 획득하였다.
정제된 시료는 적외부스펙트럼을 통해 히알루론산 표준품 (sigma)과 일치함이 확인되었고, 스펙트럼 분석 결과를 도 6에 나타내었다.
다음으로, 다각도 레이저광 산란 측정기 (MALLS, multi-angle laser light scattering)를 이용하여 정제시료의 분자량을 측정하였다. 측정 조건은 아래 표 8과 같으며 분석 결과는 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타낸 다각도 레이저광 산란 측정결과, 정제된 히알루론산의 분자량은 초고분자 범위에 속하는 1,000 내지 7,000 kDa 범위에서 피크가 나타났으며, 특히 5,455 kDa에서 메인 피크가 측정되었다. 이러한 고분자 히알루론산은 저분자 히알루론산에 비해 보습 효과, 점도 상승, 관절 윤활 작용, 수분 흡수 능력, 탄성 능력 등이 우수한 특성을 가진다. 특히 본 발명의 발현 시스템을 이용하여 제작된 히알루론산과 같은 3000kDa 이상의 초고분자 히알루론산의 경우, 체내 분해 속도가 느려 유착 방지제로 사용될 수 있다.
| MALLS 측정기 | Wyatt Technology, DAWN HELEOS |
| 칼럼 | Ultrahydrogel analytical column 120, 120 7.8 x 300 mm (Waters, WAT011520) Ultrahydrogel analytical column 250, 250 7.8 x 300 mm (Waters, WAT011525) Ultrahydrogel analytical column 1000, 1000 7.8 x 300 mm (Waters, WAT011535) |
| 칼럼 온도 | 30℃ |
| 용출제 | 100mM sodium phosphate buffer pH7.2 |
| 유속 | 0.5 mL/분 |
| 주입 부피 | 100 μL |
| 레이저 파장 | 662.0 nm |
| 라인 필터 | 0.22 ㎛ |
| 다각도 피팅 방법 | Zimm |
<110> Dae Hwa Pharma. Co., Ltd.
RedoxBio
<120> Expression system for production of hyaluronic acid by using
non-pathogenic bacteria and method of preparing hyaluronic acid
using the same
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cgggatccat gagaacatta aaaaacctca taactgttgt ggcctttagt 50
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gttgtggcct ttagtatttt ttgggtactg ttgatttacg tcaatgttta 50
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic (hasA_frag1_forward3)
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ttacgtcaat gtttatctct ttggtgctaa aggaagcttg tcaatttatg 50
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gccatttaag ggaagggctg ggcaatataa ggttgcagcc attattccct 50
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<213> Artificial Sequence
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gctaggggat aggtttgctg ctgaacactt tttaaggtct ctagcaatga 50
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catcagcact tccatcgtca acaacataaa tttctgctag gggataggtt 50
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taaaaacctt taatgaccca actgtttttg ctgcgacggg tcaccttaat 50
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ggttgatgta tctatctatg ttaggaacaa ccacctcgcg tctgtaaacg 50
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (hasA_frag3_reverse4)
<400> 34
taatttcaag ggctgtagga caaacaaatg cagcacccca taaaacggag 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (hasA_frag3_reverse5)
<400> 35
ccccagtcag catttctaat agtaaaaaga gaatataatt tcaagggctg 50
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (hasA_frag3_reverse6)
<400> 36
gctctagatt ataataattt tttacgtgtt ccccagtcag cattt 45
<210> 37
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0034-RBS-tuaD_forward)
<400> 37
aatctagaaa agaggagaaa tactagatga aaaaaatagc tgtcattgg 49
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0034-RBS-tuaD_reverse)
<400> 38
gggttataaa ttgacgcttc ccaagtcttt agccaatt 38
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (P43_forward primer)
<400> 39
gatcgctagc tgataggtgg tatgttttcg 30
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (P43_reverse primer)
<400> 40
gatcggatcc gtgtacattc ctctcttacc tataa 35
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pmsm_forward primer)
<400> 41
gatcgctagc agtgtctgcg aaaacattac 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pmsm_reverse primer)
<400> 42
gatcggatcc ctaacatccc cctttgttat 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Ppbp_forward primer)
<400> 43
gatcgctagc agatggcaag ttagttacgc 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Ppbp_reverse primer)
<400> 44
gatcggatcc tcctccacct cccatatctc 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pylb_forward primer)
<400> 45
gatcgctagc catcgtcgaa cgcgctccat 30
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pylb_reverse primer)
<400> 46
gatcggatcc acgttctacc tttgtcaaac aa 32
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyob_forward primer)
<400> 47
gatcgctagc attcggcgtt ttggttttag gc 32
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyob_reverse primer)
<400> 48
gatcggatcc ttaagcttct ccccttctct 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyqe_forward primer)
<400> 49
gatcgctagc cttcttgagc gtctcaacca 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyqe_reverse primer)
<400> 50
gatcggatcc tcctttgatt tgaagcaagg 30
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyvl_forward primer)
<400> 51
gatcgctagc ttcaaaacaa aaaaggcaag at 32
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyvl_reverse primer)
<400> 52
gatcggatcc ttcattccac actcctattg 30
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Psigx_forward primer)
<400> 53
gatcgctagc aggttataaa tttgaggtcg gcg 33
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Psigx_reverse primer)
<400> 54
gatcggatcc ttgaaacccc tccgttcact tt 32
<210> 55
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0030-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 55
aatctagaat taaagaggag aaatactaga tgaaaaaaat agctgtc 47
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0031-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 56
aatctagatc acacaggaaa cctactagat gaaaaaaata gctgtc 46
<210> 57
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0032-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 57
aatctagatc acacaggaaa gtactagatg aaaaaaatag ctgtc 45
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0033-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 58
aatctagatc acacaggact actagatgaa aaaaatagct gtc 43
<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0035-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 59
aatctagaat taaagaggag aatactagat gaaaaaaata gctgtc 46
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (tuaD-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 60
aatctagaga cactgcgacc attataaatt gg 32
<210> 61
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (pET-RBS-tuaD_forward primer)
<400> 61
aatctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaaa aaaatagctg 60
tc 62
<210> 62
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Psigx_promoter )
<400> 62
aggttataaa tttgaggtcg gcgctgaatg aaattttgga aaagcgtagt aggcaagctg 60
tggtttacga tcctttcact cgtcttgatc gtattgttca ttttaacggt tcttttgctg 120
gagtttattg aaaactacca tgtggaagaa gctgagaatg atttaacaca gcttgcgaat 180
aaagttgctg tcatcctaga aaatcacgag gaccaggcac tggcaaggtc aatcacttgg 240
gaactcgctg ataacttaac aagcattgcc atcatccagg atgagaagaa ccactggtat 300
tctccgaatg ataaaaatcg cctgtcgtct attacggttg agcaaataca gcatgacaaa 360
gacttaaata aagctctcaa agaccataaa aaagtaagca aacggacggg actgagcgat 420
acagacacgg ataatgaacg cctgattgta ggtgtcccgt atgaaaaaga cggaaagaaa 480
ggcatggtct ttttatccca gtctttgctt gccgttaaag atacaacaaa acatacgacc 540
cgctatattt ttcttgccgc tggaattgcg attgtgctga ccacattttt cgcattcttt 600
ttatcaagca gggtcacgta ccctctccga aaaatgagag aaggcgcgca ggatttggcg 660
aagggcaagt tcgatacaaa aatcccgatt ttaactcagg atgaaatcgg tgaactggcg 720
accgctttta atcaaatggg ccggcagctt aactttcata tcaatgcgct caatcaagaa 780
aaagagcagc tttctaacat tttgagcagt atggctgacg gggttattac cattaatatt 840
gacggtacga ttcttgtgac caacccgccg gctgaacgtt ttcttcaggc ttggtattat 900
gaacagaaca tgaatatcaa agaaggcgac aatcttccgc ctgaagcaaa agagctgttt 960
caaaacgctg tcagcactga aaaagaacaa atgattgaga tgacgcttca aggcagatca 1020
tgggtgcttt tgatgtcgcc gctttatgcg gaatcgcacg tcagaggagc ggttgccgta 1080
ctgcgtgaca tgacagaaga acgccgcctt gataagctgc gggaggactt tatcgcaaat 1140
gtcagtcatg agctgagaac accgatctcc atgcttcagg gatacagtga agcaattgtc 1200
gatgacattg caagctctga agaagaccgg aaagaaattg cccaaatcat ttatgacgaa 1260
tcgctccgaa tgggccgttt agttaatgat ttgcttgatt tagcccgaat ggaatcaggc 1320
catacaggct tacattatga aaaaatcaat gtgaatgagt ttttagaaaa gatcattcgg 1380
aagttttccg gtgttgcgaa agaaaaaaat attgctttag atcatgacat ttctctcaca 1440
gaagaggaat ttatgtttga tgaagacaag atggagcagg tatttaccaa tttgattgat 1500
aacgcgctgc ggcatacttc agccggcggc agtgtctcca tttcagtcca ttctgtgaag 1560
gatggattga aaattgatat caaagactcc gggtctggca taccggaaga agatctgcca 1620
tttatctttg agcggtttta taaggcagat aaagcgcgga caaggggcag agcaggaacc 1680
gggttagggc tggctatcgt taaaaatatc gtggaagccc acaacggatc aattactgtg 1740
cacagccgaa tagataaagg aacaacattt tctttttata ttccgacaaa acggtaaaat 1800
cgagtctgaa tttgccgaag aatcttgttc cataagaaac acccgctgac tgagcgggtg 1860
tttttttaat agccaacatt aataaaattt aaggatatgt taatataaat tcccttccaa 1920
attccagtta ctcgtaatat agttgtaatg taacttttca agctattcat acgacaaaaa 1980
agtgaacgga ggggtttcaa 2000
<210> 63
<211> 494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyob_promoter )
<400> 63
attcggcgtt ttggttttag gctacaactt tgatcatgca tcagttgtaa atagaactaa 60
tgaatataaa gaacactatg gccttactga tggacttgtg gttattgaag atgttgatta 120
ctttgcttac tgtctagata caaataaaat gaaagacgga gaatgccctg tagttgaatg 180
ggatagggta attggttatc aagatactgt tgcagacagc tttattgaat ttttttataa 240
taagattcag gaagcgaaag atgactggga tgaggatgaa gactgggacg attaagcaaa 300
agtattgcta tagcgcaata gaaggcttga gttgcacatc ctcaatctaa ataaaataag 360
ctctcgcaat gagagcttat tttattggat taaataatta aagtgacaga agttttctag 420
tcccgtttta tatgaaacct tttttatttt agcccgtatt aaaagtaaat tcagagagaa 480
ggggagaagc ttaa 494
<210> 64
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (Pyqe_promoter)
<400> 64
cttcttgagc gtctcaacca ggatatgaag ctgtatatga aaaaccgtga gaaagacaaa 60
ctgactgtcg ttcgaatggt taaggcttca cttcaaaatg aagcaattaa gcttaagaaa 120
gacagtttga ccgaggatga ggaactcact gtcctttctc gtgaacttaa gcaacgtaaa 180
gactccctcc aggaattttc aaacgctaat cgtttagatt tagtagataa agttcaaaaa 240
gagctggaca ttttagaagt ttatttacct gagcagctgt cagaagaaga gctgcgtaca 300
atcgtaaatg aaaccatcgc ggaggtcggt gcgagctcaa aagcggacat gggcaaagtg 360
atgggggcaa ttatgcctaa agtaaaaggt aaagctgacg gaagtttaat taataagctt 420
gtgagcagtc aactgtctta aatggcaaag aaaaggacat ctttctaaga gagatgtctt 480
tttttataca taaaaaaatg aaacctttga tacatttgtt acgtatgaag agaaggcact 540
tattataaaa ggaaggaggg atacaccgcc cttgcttcaa atcaaagga 589
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0030-RBS)
<400> 65
attaaagagg agaaatacta g 21
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0031-RBS)
<400> 66
tcacacagga aacctactag 20
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0032-RBS)
<400> 67
tcacacagga aagtactag 19
<210> 68
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0033-RBS)
<400> 68
tcacacagga ctactag 17
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0034-RBS)
<400> 69
aaagaggaga aatactag 18
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (BBa_B0035-RBS)
<400> 70
attaaagagg agaatactag 20
<210> 71
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (RBS_tuaD)
<400> 71
gacactgcga ccattataaa ttggaagatc attttacagg agagggttga gcgct 55
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (RBS_pET)
<400> 72
aataattttg tttaacttta agaaggagat atacat 36
<210> 73
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (tuaD_gene)
<400> 73
gtgaaaaaaa tagctgtcat tggaacaggt tatgtaggac tcgtatcagg cacttgcttt 60
gcggagatcg gcaataaagt tgtttgctgt gatatcgatg aatcaaaaat cagaagcctg 120
aaaaatgggg taatcccaat ctatgaacca gggcttgcag acttagttga aaaaaatgtg 180
ctggatcagc gcctgacctt tacgaacgat atcccgtctg ccattcgggc ctcagatatt 240
atttatattg cagtcggaac gcctatgtcc aaaacaggtg aagctgattt aacgtacgtc 300
aaagcggcgg cgaaaacaat cggtgagcat cttaacggct acaaagtgat cgtaaataaa 360
agcacagtcc cggttggaac agggaaactg gtgcaatcta tcgttcaaaa agcctcaaag 420
gggagatact catttgatgt tgtatctaac cctgaattcc ttcgggaagg gtcagcgatt 480
catgacacga tgaatatgga gcgtgccgtg attggttcaa caagtcataa agccgctgcc 540
atcattgagg aacttcatca gccattccat gctcctgtca ttaaaacaaa cctagaaagt 600
gcagaaatga ttaaatacgc cgcgaatgca tttctggcga caaagatttc ctttatcaac 660
gatatcgcaa acatttgtga gcgagtcggc gcagacgttt caaaagttgc tgatggtgtt 720
ggtcttgaca gccgtatcgg cagaaagttc cttaaagctg gtattggatt cggcggttca 780
tgttttccaa aggatacaac cgcgctgctt caaatcgcaa aatcggcagg ctatccattc 840
aagctcatcg aagctgtcat tgaaacgaac gaaaagcagc gtgttcatat tgtagataaa 900
cttttgactg ttatgggaag cgtcaaaggg agaaccattt cagtcctggg attagccttc 960
aaaccgaata cgaacgatgt gagatccgct ccagcgcttg atattatccc aatgctgcag 1020
cagctgggcg cccatgtaaa agcatacgat ccgattgcta ttcctgaagc ttcagcgatc 1080
cttggcgaac aggtcgagta ttacacagat gtgtatgctg cgatggaaga cactgatgca 1140
tgcctgattt taacggattg gccggaagtg aaagaaatgg agcttgtaaa agtgaaaacc 1200
ctcttaaaac agccagtcat cattgacggc agaaatttat tttcacttga agagatgcag 1260
gcagccggat acatttatca ctctatcggc cgtcccgctg ttcggggaac ggaaccctct 1320
gacaagtatt ttccgggctt gccgcttgaa gaattggcta aagacttggg aagcgtcaat 1380
ttataa 1386
<210> 74
<211> 417
<212> PRT
<213> Streptococcus zooepidemicus
<400> 74
Met Arg Thr Leu Lys Asn Leu Ile Thr Val Val Ala Phe Ser Ile Phe
1 5 10 15
Trp Val Leu Leu Ile Tyr Val Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Gly
20 25 30
Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Val Lys
35 40 45
Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lys Pro Phe Lys Gly Arg Ala Gly Gln
50 55 60
Tyr Lys Val Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Leu Ala
85 90 95
Glu Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asp Glu Thr Gly Ile Lys
100 105 110
Arg Ile Glu Asp Tyr Val Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn Val
115 120 125
Ile Val His Arg Ser Glu Lys Asn Gln Gly Lys Arg His Ala Gln Ala
130 135 140
Trp Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser
145 150 155 160
Asp Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe
165 170 175
Asn Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn
180 185 190
Arg Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn
195 200 205
Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu
210 215 220
Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val Pro
225 230 235 240
Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gln Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Ser
245 250 255
Ile Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys
260 265 270
Thr Val Tyr Gln Ser Thr Ala Lys Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys
275 280 285
Met Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe
290 295 300
Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val
305 310 315 320
Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr
325 330 335
Ser Val Val Asp Phe Phe Val Gly Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu
340 345 350
Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg
355 360 365
Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Leu Ser Phe Leu Leu Ser Pro
370 375 380
Phe Tyr Gly Val Leu His Leu Phe Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu
405 410 415
Leu
<210> 75
<211> 1254
<212> DNA
<213> Streptococcus zooepidemicus
<400> 75
atgagaacat taaaaaacct cataactgtt gtggccttta gtattttttg ggtactgttg 60
atttacgtca atgtttatct ctttggtgct aaaggaagct tgtcaattta tggctttttg 120
ctgatagctt acctattagt caaaatgtcc ttatcctttt tttacaagcc atttaaggga 180
agggctgggc aatataaggt tgcagccatt attccctctt ataacgaaga tgctgagtca 240
ttgctagaga ccttaaaaag tgttcagcag caaacctatc ccctagcaga aatttatgtt 300
gttgacgatg gaagtgctga tgagacaggt attaagcgca ttgaagacta tgtgcgtgac 360
actggtgacc tatcaagcaa tgtcattgtt catcggtcag agaaaaatca aggaaagcgt 420
catgcacagg cctgggcctt tgaaagatca gacgctgatg tctttttgac cgttgactca 480
gatacttata tctaccctga tgctttagag gagttgttaa aaacctttaa tgacccaact 540
gtttttgctg cgacgggtca ccttaatgtc agaaatagac aaaccaatct cttaacacgc 600
ttgacagata ttcgctatga taatgctttt ggcgttgaac gagctgccca atccgttaca 660
ggtaatatcc ttgtttgctc aggtccgctt agcgtttaca gacgcgaggt ggttgttcct 720
aacatagata gatacatcaa ccagaccttc ctgggtattc ctgtaagtat tggtgatgac 780
aggtgcttga ccaactatgc aactgattta ggaaagactg tttatcaatc cactgctaaa 840
tgtattacag atgttcctga caagatgtct acttacttga agcagcaaaa ccgctggaac 900
aagtccttct ttagagagtc cattatttct gttaagaaaa tcatgaacaa tccttttgta 960
gccctatgga ccatacttga ggtgtctatg tttatgatgc ttgtttattc tgtggtggat 1020
ttctttgtag gcaatgtcag agaatttgat tggctcaggg ttttagcctt tctggtgatt 1080
atcttcattg ttgccctgtg tcggaacatt cattacatgc ttaagcaccc gctgtccttc 1140
ttgttatctc cgttttatgg ggtgctgcat ttgtttgtcc tacagccctt gaaattatat 1200
tctcttttta ctattagaaa tgctgactgg ggaacacgta aaaaattatt ataa 1254
<210> 76
<211> 417
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (hasA_MT_prt)
<400> 76
Met Arg Thr Leu Lys Asn Leu Ile Thr Val Val Ala Phe Ser Ile Phe
1 5 10 15
Trp Val Leu Leu Ile Tyr Val Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Gly
20 25 30
Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Val Lys
35 40 45
Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lys Pro Phe Lys Gly Arg Ala Gly Gln
50 55 60
Tyr Arg Val Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Leu Ala
85 90 95
Glu Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asp Glu Thr Gly Ile Lys
100 105 110
Arg Ile Glu Asp Tyr Val Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn Val
115 120 125
Ile Val His Arg Ser Glu Lys Asn Gln Gly Lys Arg His Ala Gln Ala
130 135 140
Trp Ala Phe Gly Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser
145 150 155 160
Asp Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe
165 170 175
Asn Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn
180 185 190
Arg Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn
195 200 205
Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu
210 215 220
Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val Pro
225 230 235 240
Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gln Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Ser
245 250 255
Ile Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys
260 265 270
Thr Val Tyr Gln Ser Thr Ala Arg Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys
275 280 285
Met Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe
290 295 300
Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val
305 310 315 320
Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr
325 330 335
Ser Val Val Asp Phe Phe Val Gly Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu
340 345 350
Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg
355 360 365
Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Leu Ser Phe Leu Leu Ser Pro
370 375 380
Phe Tyr Gly Val Leu His Leu Phe Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu
405 410 415
Leu
<210> 77
<211> 1254
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic (hasA_MT_dna)
<400> 77
atgagaacat taaaaaacct cataactgtt gtggccttta gtattttttg ggtactgttg 60
atttacgtca atgtttatct ctttggtgct aaaggaagct tgtcaattta tggctttttg 120
ctgatagctt acctattagt caaaatgtcc ttatcctttt tttacaagcc atttaaggga 180
agggctgggc aatatagggt tgcagccatt attccctctt ataacgaaga tgctgagtca 240
ttgctagaga ccttaaaaag tgttcagcag caaacctatc ccctagcaga aatttatgtt 300
gttgacgatg gaagtgctga tgagacaggt attaagcgca ttgaagacta tgtgcgtgac 360
actggtgacc tatcaagcaa tgtcattgtt catcggtcag agaaaaatca aggaaagcgt 420
catgcacagg cctgggcctt tggaagatca gacgctgatg tctttttgac cgttgactca 480
gatacttata tctaccctga tgctttagag gagttgttaa aaacctttaa tgacccaact 540
gtttttgctg cgacgggtca ccttaatgtc agaaatagac agaccaatct cttaacacgc 600
ttgacagata ttcgctatga taatgctttt ggcgttgaac gagctgccca atccgttaca 660
ggtaatatcc ttgtttgctc aggtccgctt agcgtttaca gacgcgaggt ggttgttcct 720
aacatagata gatacatcaa ccagaccttc ctgggtattc ctgtaagtat tggtgatgac 780
aggtgcttga ccaactatgc aactgattta ggaaagactg tttatcaatc cactgctaga 840
tgtattacag atgttcctga caagatgtct acttacttga agcagcaaaa ccgctggaac 900
aagtccttct ttagagagtc cattatttct gttaagaaaa tcatgaacaa tccttttgta 960
gccctatgga ccatacttga ggtgtctatg tttatgatgc ttgtttattc tgtggtggat 1020
ttctttgtag gcaatgtcag agaatttgat tggctcaggg ttttagcctt tctggtgatt 1080
atcttcattg ttgccctgtg tcggaacatt cattacatgc ttaagcaccc gctgtccttc 1140
ttgttatctc cgttttatgg ggtgctgcat ttgtttgtcc tacagccctt gaaattatat 1200
tctcttttta ctattagaaa tgctgactgg ggaacacgta aaaaattatt ataa 1254
Claims (16)
- 작동 가능하도록 연결된, 전사 프로모터, 히알루론산 합성효소(hyaluronan synthase) 유전자, UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자 발현용 리보솜 결합부위 및 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자를 포함하는, 바실러스속 균주에서의 히알루론산 생산용 발현 시스템으로서,
상기 전사 프로모터는 항시 발현 프로모터(constitutive expression promoter)로서, Psigx 프로모터이고,
상기 리보솜 결합부위는 BBa_B0030(서열번호 65), BBa_B0031(서열번호 66), BBa_B0032(서열번호 67), BBa_B0033(서열번호 68), BBa_B0034(서열번호 69), 또는 BBa_B0035(서열번호 70)이며,
상기 히알루론산의 분자량은 500 내지 10,000kDa인 히알루론산 생산용 발현 시스템. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 발현 시스템은 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스에서 히알루론산을 생산하는 것인, 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 전사 프로모터는 P43 프로모터 포함 발현 시스템을 갖는 형질전환 균주에 비해 히알루론산 생산량이 1.1 배 내지 10배인 프로모터인, 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 합성효소(hyaluronan synthase) 유전자는 hasA 유전자 또는 이의 변이 유전자인, 발현 시스템.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 리보솜 결합부위(RBS)는 tuaD의 자체 RBS에 비해 1.1 내지 3배의 히알루론산 수율을 나타내는 것인, 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 리보솜 결합부위는 서열번호 69 의 염기서열로 이루어지는 BBa_B0034인, 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 UDP-글루코스 6-디하이드로제나아제 유전자는 바실러스 서브틸리스 유래의 tuaD 유전자인 것인, 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 합성효소 유전자는 스트렙토코커스속 균주유래의 hasA인 것인, 발현 시스템.
- 제1항, 제3항 내지 제4항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하며, 상기 히알루론산의 분자량은 500 내지 10,000kDa인, 히알루론산 생산용 재조합 균주.
- 제12항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스인 것인, 히알루론산 생산용 재조합 균주.
- 제1항, 제3항 내지 제4항, 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 생산용 발현 시스템을 포함하는 히알루론산 생산용 재조합 균주를 배양하여 배양물을 얻는 단계 및 상기 배양물에서 히알루론산을 얻는 단계를 포함하며, 상기 히알루론산의 분자량은 500 내지 10,000kDa인, 재조합 균주를 이용한 히알루론산의 생산 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스인 것인, 생산 방법.
- 삭제
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