TWI707952B

TWI707952B - 新穎ｄ-阿洛酮糖３-表異構酶及使用該ｄ-阿洛酮糖３-表異構酶製造ｄ-阿洛酮糖之方法

Info

Publication number: TWI707952B
Application number: TW107140396A
Authority: TW
Inventors: 金藪珍; 李英美; 金良姬; 金成俌; 朴承源; 崔殷姃
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2020-10-21
Also published as: WO2019098723A1; TW201923075A; KR101965509B1; AR113695A1; US20210261939A1; US11485963B2

Abstract

本發明係有關一種新穎D-阿洛酮糖3-表異構酶及使用該D-阿洛酮糖3-表異構酶製造D-阿洛酮糖之方法。

Description

新穎D-阿洛酮糖3-表異構酶及使用該D-阿洛酮糖3-表異構酶製造D-阿洛酮糖之方法

本發明係有關一種D-阿洛酮糖3-表異構酶及使用該D-阿洛酮糖3-表異構酶製造D-阿洛酮糖之方法。

D-阿洛酮糖(下文中稱為「阿洛酮糖」)已知為天然界罕見之一種單糖。阿洛酮糖具有約70%之甜度，幾近零熱量，並已基於其功能性如抑制血糖、抑制脂肪合成等等而受到重視，作為新穎之食品成份。

基於此等特性，考慮採用阿洛酮糖作為甜味劑，可替代糖類用於各種不同食物中。然而，由於天然界僅有微量阿洛酮糖，極需發展有效製造阿洛酮糖之方法。

製造阿洛酮糖之已知方法為使用鉬酸根離子催化之方法(Bilik V,Tihlarik K,1973,Reaction of saccharides catalyzed by molybdate ions.IX.Epimerization of ketohexoses.Chem Zvesti 28：106-109)、由D-果糖與乙醇及三乙胺加熱來製造阿洛酮糖之化學方法(Doner LW,1979,Isomerization of d-fructose by base：liquid-chromatographic evaluation and the isolation of d-psicose.Carbohydr Res.70：209-216)、及由D-果糖使用產生D-阿洛酮糖3-表異構酶之微生物製造阿洛酮糖之生物方法(韓國專利公開申請案案號No.10-2011-0035805)，及相關技藝習知之方法。然而，此等方法之缺點在於阿洛酮糖之化學製造法因為產生大量副產物而需要繁複的純化過程，而生物方法則產率極低，需要高製造成本。

[先前技術文獻] [專利文獻]

專利案文獻1：韓國專利案號10-1318422

專利案文獻2：韓國專利公開申請案案號10-2011-0035805

[非專利文獻]

非專利案文獻1：Bilik V, Tihlarik K, 1973, Reaction of saccharides catalyzed by molybdate ions. IX. Epimerization of ketohexoses. Chem Zvesti 28:106-109

非專利案文獻2：Doner LW, 1979, Isomerization of d-fructose by base: liquid-chromatographic evaluation and the isolation of d-psicose. Carbohydr Res. 70:209-216

非專利案文獻3：Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, Lee YJ, Oh DK, 2006, Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase that converts D-fructose to D-psicose. Appl Environ Microbiol. 72(2):981-5

本發明者積極發展一種可以改良阿洛酮糖產量之方法。因此，他們發現當採用本發明之新穎D-阿洛酮糖3-表異構酶(下文中稱為「阿洛酮糖表異構酶」)時可提高D-果糖形成阿洛酮糖之轉化率，藉以顯著改善阿洛酮糖之產率，而完成本發明。

本發明之目的在於提供一種新穎之阿洛酮糖表異構酶、編碼該酵素之多核苷酸、包含該多核苷酸之重組載體、及經導入該載體之微生物。

本發明另一個目的為提供一種製造D-阿洛酮糖之組成物，該組成物包含本發明阿洛酮糖表異構酶、表現該酵素之微生物、或該微生物之培養物；及使用該酵素製造D-阿洛酮糖之方法。

本發明之阿洛酮糖表異構酶具有轉化D-果糖為阿洛酮糖之優異活性，具有可以應用在工業上之高溫安定性，及具有加速轉化反應速率之效應。因此，其優點在於當使用本發明酵素來製造阿洛酮糖時，可以高效率及高產率地製造阿洛酮糖。

第1圖為表現由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之阿洛酮糖表異構酶(KADPE)之重組載體圖解。

第2圖為出示使用本發明KADPE及D-果糖作為受質製造阿洛酮糖之結果之HPLC數據分析圖。

第3圖為出示阿洛酮糖表異構酶隨溫度變化之相對酵素活性圖。第3a圖出示衍生自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)之習知D-阿洛酮糖3-表異構酶(ATPE)活性；及第3b圖出示本發明之KADPE之活性。

第4圖為出示本發明KADPE隨pH變化之相對阿洛酮糖表異構酶活性圖。

第5圖為出示本發明KADPE隨所添加金屬之相對阿洛酮糖表異構酶活性圖。

本發明之態樣提供由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之阿洛酮糖表異構酶。

例示性具體例中，本發明阿洛酮糖表異構酶可能包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80%、90%、95%、97%、或99%同源性之多肽。咸了解，具有取代、嵌入、修飾、與/或缺失有些胺基酸序列SEQ ID NO：1之胺基酸序列之蛋白質均在本發明之範圍內，只要該胺基酸序列具有上述同源性及轉化D-果糖為阿洛酮糖之活性即可。此外，針對具有阿洛酮糖表異構酶活性之多肽，由在嚴苛條件下與可由已知基因序列，例如，與上述編碼本發明阿洛酮糖表異構酶之所有或部份核苷酸序列互補之序列(群)製備之探針(群)雜合之多核苷酸編碼之任何多肽均包括在內，沒有限制。

本文所採用術語「多核苷酸」係指多核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，其係未經修飾或經過由核苷酸單體共價鍵結成長鏈所組成之核苷酸聚合物修飾。

本文所採用術語「嚴苛條件」係指其設計在於容許多核苷酸之間進行專一性雜合之條件。此等條件隨多核苷酸之長度及互補程度，及相關技藝已知之相關參數而定，且已明確說明於參考文獻中(例如，如上述J.Sambrook等人之文獻)。例如，嚴苛條件可包括可以讓具有高同源性(亦即80%或更高、90%或更高、95%或更高、97%或更高、或99%或更高)之基因之間進行雜合，但其同源性較低之基因之間卻無法彼此雜合之條件；或習知之南方雜合條件(亦即在相當於60℃，1×SSC，0.1%SDS之鹽濃度與溫度下；明確言之在60℃，0.1×SSC，0.1%SDS下；及更明確言之在68℃，0.1×SSC，0.1%SDS下，洗滌一次，及明確言之兩次或三次之條件)。用於雜合之探針可能為與上述核苷酸序列互補之核苷酸序列之一部份。此等探針可以採用PCR，使用以已知序列作為引子及以包含此等核苷酸序列之基因片段作為模板所製成之寡核苷酸來製備。此外，彼等習此相關技藝者可依如探針長度等因素，調整溫度及洗滌溶液之鹽濃度。

本文所採用術語「同源性」係指兩個多核苷酸或多肽部份體之間之同一性百分比。可採用相關技藝已知技術測定來自一個部份體之序列與來自另一個部份體之序列之間之同源性。例如，同源性之測定為採用容易取得之電腦程式(例如，BLAST 2.0)，直接排列兩個多核苷酸分子或兩個多肽分子之序列資訊，亦即參數，如得分、同一性、相似性等等。此外，多核苷酸之間同源性之測定可由多核苷酸在同源區之間形成安定雙股之條件下雜合，使用單股專一性核酸酶解離後，測定解離片段大小來決定。

此外，只要蛋白質具有相當於本發明阿洛酮糖表異構酶(由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成)之效力，其並不排除因在胺基酸序列SEQ ID NO：1上游及下游添加無意義序列所造成之突變、天然突變、或靜默突變。此外，包括胺基酸序列SEQ ID NO：1之蛋白質亦屬於本發明範圍。

此外，本發明D-阿洛酮糖3-表異構酶可由核苷酸序列SEQ ID NO：2編碼，或D-阿洛酮糖3-表異構酶可由與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有至少80%、90%、95%、97%、或99%同源性之核苷酸序列編碼，但不受此限制。此外，依據密碼子簡併性，咸了解，由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之蛋白質、或可轉譯成與上述蛋白質具有同源性之蛋白質之多核苷酸亦包括在編碼本發明D-阿洛酮糖3-表異構酶之多核苷酸序列之範圍內。彼等習此相關技藝者咸了解，依據相關技藝已知之基因重組技術，可藉由取代、添加、及/或刪除一或多個核苷酸序列SEQ ID NO：2來製備編碼具有實質上同等活性之酵素之多核苷酸。

另一例示性具體例中，本發明阿洛酮糖表異構酶可衍生自凱斯特亞菌(Kaistia)屬微生物。明確言之，本發明阿洛酮糖表異構酶可衍生自油汙凱斯特亞菌(Kaistia adipata)，更明確言之，其可衍生自油汙凱斯特亞菌(Kaistia adipata)KCTC 12095。

再一例示性具體例中，本發明阿洛酮糖表異構酶之分子量可為25kDa至37kDa、27kDa至35kDa、或30kDa至35kDa，其係採用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測定。

本發明另一態樣提供一種編碼由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之阿洛酮糖表異構酶之多核苷酸。

例示性具體例中，本發明提供之多核苷酸可為由核苷酸序列SEQ ID NO：2組成之多核苷酸，或由與核苷酸序列SEQ ID NO：2具有80%或更高、90%或更高、95%或更高、97%或更高、或99%或更高同源性之序列組成之多核苷酸。此外，依據密碼子簡併性，咸了解，由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之蛋白質、或可轉譯成與胺基酸序列SEQ ID NO：1所組成蛋白質具有同源性之蛋白質之多核苷酸亦包括在本發明之範圍內。

本發明另一態樣提供一種包含編碼本發明D-阿洛酮糖3-表異構酶之多核苷酸之重組載體。

本發明之重組載體可呈其中編碼阿洛酮糖表異構酶之多核苷酸已採用已知標準方法嵌入選殖載體或表現載體之型式。本發明中，「選殖載體」係指可以攜帶DNA片段進入宿主細胞中並再製之載體。選殖載體可能再包含多腺苷酸化訊號、轉錄終止序列、與/或多重選殖位點。本文中，該等多重選殖位點可能包含至少一個內切核酸酶及限制酶位點。例如，編碼阿洛酮糖表異構酶之多核苷酸可能位在多腺苷酸化訊號與轉錄終止序列上游。本發明中，「表現載體」係指所選殖DNA在合適宿主中轉錄及轉譯時所必要之DNA序列。此外，本發明中，「表現載體」係指包含以可操作方式連接嵌入物之必要調節元素之基因構築體，因此該嵌入物當存在於個體之細胞中時即得以表現。「以可操作方式連接」係指一種鏈結，讓其中一或多種功能因多核苷酸序列與多核苷酸之相關性而受到另一種功能的調節。該表現載體可以採用標準重組DNA技術製備及純化。表現載體可能包括一或多個啟動子、起始密碼子、編碼阿洛酮糖表異構酶之基因、及終止密碼子。

本發明再另一態樣提供一種經導入本發明重組載體之微生物。

明確的例示性具體例中，經導入本發明重組載體之微生物可為一種被包括編碼由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之阿洛酮糖表異構酶之多核苷酸的重組載體轉形者，或可為一種被包括由核苷酸序列SEQ ID NO：2組成之多核苷酸的重組載體轉形者。

本文所採用術語「轉形」意指將基因或包括該基因之重組載體導入宿主細胞中，因此其可以在宿主細胞中表現。轉形之基因位置沒有限制，不論其是否嵌入宿主細胞之染色體中或是否位在染色體外，只要其可在宿主細胞中表現即可。本發明之轉形法可包括瞬時轉形微注射、轉導、細胞融合、磷酸鈣沉澱法、脂質體介導之轉染法、DEAE-葡聚醣介導之轉染法、電穿孔法、電注射法、化學處理法等等，但不受此限制。可以讓重組載體轉形進入之宿主細胞可包括原核生物細胞、植物細胞、動物細胞等等，但具有高度DNA導入效率及所導入DNA之高表現率之宿主細胞均可使用。例如，宿主細胞可包括大腸桿菌(E.coli)、桿菌屬(Bacillus)菌株、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)菌株、沙門氏菌屬(Salmonella)菌株等等。例如，宿主細胞可包括大腸桿菌，如W3110、BL21、JM109、K-12、LE392、RR1、及DH5。更明確言之，本發明微生物可為大腸桿菌BL21(DE3)/KADPE，其寄存編號為KCCM11918P。

本發明再另一態樣提供一種用於製造D-阿洛酮糖之組成物，其包含由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之阿洛酮糖表異構酶、表現阿洛酮糖表異構酶之微生物、或微生物之培養物。

明確的例示性具體例中，本發明微生物可為菌株本身、菌株之培養物、或微生物之裂解物。本發明之培養物或裂解物可包括本發明D-阿洛酮糖3-表異構酶。此外，本發明微生物之培養物可包括或可不包括上述微生物。再者，本發明微生物之裂解物可能為破壞微生物或其培養物所得之裂解物，或由該裂解物離心得到之上清液。

另一明確的例示性具體例中，用於製造D-阿洛酮糖之本發明組成物可進一步包含D-果糖，其可用作阿洛酮糖表異構酶之受質。

再另一明確的例示性具體例中，可使用固定在擔體之本發明微生物。可用於本發明之擔體實例包括洋菜、瓊脂糖、k-鹿角菜膠、藻酸鹽、或殼聚糖，但不受此限制。

此外，用於製造D-阿洛酮糖之本發明組成物可進一步包括可以協助製造阿洛酮糖之任何成份。明確言之，用於製造D-阿洛酮糖之本發明組成物可進一步包括金屬。更明確言之，本發明金屬可為選自下列所成群組之一種或多種金屬：錳、鎂、鐵、鋰、及鈉。此外，本發明金屬可為金屬離子或金屬鹽。本發明金屬(例如，明確言之，金屬離子或金屬鹽)之用量可為0.1mM至10mM、0.1mM至7mM、0.1mM至4mM、0.5mM至10mM、0.5mM至7mM、0.5mM至4mM、1mM至10mM、1mM至7mM、1mM至4mM、2mM至10mM、2mM至7mM、或2mM至4mM。更明確言之，本發明金屬鹽可為選自下列所成群組之一種或多種金屬鹽：LiCl、Na₂SO₄、MgCl₂、NaCl、FeSO₄、MgSO₄、MnCl₂、及MnSO₄。

本發明再另一態樣提供一種用於製造D-阿洛酮糖之方法，其包括由D-果糖與胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之阿洛酮糖表異構酶、表現本發明阿洛酮糖表異構酶之微生物、或該微生物之培養物反應。

明確的例示性具體例中，本發明製造方法可進一步包括在與本發明D-果糖反應之前、之後、或同時添加金屬。

另一明確的例示性具體例中，本發明製造方法可以在本發明D-果糖反應後或添加本發明金屬後，進一步包括單離及/或純化包括阿洛酮糖之反應所得物。該單離及/或純化可以採用一或多種已知方法進行，如透析、沉澱、吸附、電泳、離子交換層析法、及分段結晶法，但不受此等限制。

此外，本發明製造方法可以在本發明每一個單離步驟與/或純化步驟之前或之後，進一步包括進行脫色及/或脫鹽。藉由進行脫色及/或脫鹽，可以得到沒有雜質之更純阿洛酮糖。

再另一明確的具體例中，本發明製造方法可以在本發明D-果糖反應後、添加金屬後、單離及/或純化後、或脫色及/或脫鹽後，進一步包括使D-阿洛酮糖結晶。該結晶法可以使用相關技藝習知之結晶方法進行。例如，該結晶法可以使用冷卻結晶方法進行。

再另一明確的具體例中，本發明製造方法可以在進行本發明結晶步驟之前濃縮阿洛酮糖。該濃縮法可以提高結晶效率。

再另一明確的具體例中，本發明製造方法可以在本發明單離步驟及/或純化步驟之後，進一步包括由未反應之D-果糖與阿洛酮糖表異構酶反應；再度利用來自本發明結晶步驟後之單離步驟及/或純化步驟所單離晶體之母液；或其組合。透過該等外加步驟，可以得到更高產率之阿洛酮糖，並降低D-果糖之棄置量，此點具有經濟效益。

再另一明確的具體例中，本發明反應可在pH 5.0至9.0，40℃至90℃之溫度，及/或0.5小時至48小時下進行。

明確言之，本發明反應可在pH 6.0至8.5、pH 6.0至8.0、或pH 7.0至8.0下進行。

此外，本發明反應可在40℃至80℃、40℃至75℃、40℃至65℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至75℃、50℃至65℃、55℃至90℃、55℃至80℃、55℃至75℃、55℃至65℃、60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至75℃、60℃至65℃、65℃至90℃、65℃至80℃、或65℃至75℃之溫度進行。

此外，本發明反應可以進行0.5小時或更久、1小時或更久、3小時或更久、5小時或更久、或6小時或更久、及/或48小時或更短、36小時或更短、24小時或更短、12小時或更短、或9小時或更短。

本發明方法中用於製造D-阿洛酮糖所說明之阿洛酮糖表異構酶、金屬、及擔體係如上述說明。

本發明再另一態樣提供一種以本發明阿洛酮糖表異構酶、表現該酵素之微生物、或該微生物之培養物於製造阿洛酮糖之用途。

[發明模式]

下文中，本發明將利用隨附之實施例詳細說明。然而應了解，本發明不受限於下文實施例，且習此相關技藝者均可在本發明之精神與範圍內進行各種不同修飾與變化。

本發明說明書全文中，用於代表特定物質濃度之符號「%」係指固體/固體為(重量/重量)%、固體/液體為(重量/體積)%、及液體/液體為(體積/體積)%，除非另有說明。

實例

實例1：產生阿洛酮糖表異構酶之衍生自凱斯特亞菌屬(Kaistia)菌株之轉形菌株製法

製備重組表現載體及轉形微生物，其包含來自凱斯菌屬(Kaistia)微生物之基因，具有使D-果糖轉換成阿洛酮糖之阿洛酮糖表異構酶活性。

明確言之，依據凱斯特亞菌屬(Kaistia)微生物在基因銀行(Genbank)登記之基因序列，採用PCR選殖基因。然後，依據基因之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)及核苷酸序列(SEQ ID NO：2)資訊，推衍前置引子(SEQ ID NO：3)與反置引子(SEQ ID NO：4)，並合成。使用所合成之引子，採用油汙凱斯特亞菌(Kaistia adipata)KCTC 12095基因組 DNA作為模板，進行聚合酶鏈反應(PCR)，來擴增基因。明確言之，在下列條件下共進行33次循環之PCR：於94℃變性1分鐘，於58℃黏合30秒，及在72℃聚合1分鐘。所擴增之基因使用PCR純化套組(Quiagen Inc.)純化後，使用限制酵素NdeI及xhoI嵌入pET21a(+)(Novagen Inc.,U.S.A.)中，製成重組載體pET21a(+)-KADPE(第1圖)。

取該重組載體，採用熱休克轉形法(Sambrook及Russell：Molecular cloning,2001)轉形至大腸桿菌BL21(DE3)中後，於50%甘油中冷凍存放備用。轉形體菌株稱為大腸桿菌BL21(DE3)/KADPE，並寄存在韓國微生物培養中心(Korean Culture of Microorganisms(KCCM))，其係依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之國際寄存機構，於2016年10月20日寄存，登錄號KCCM11917P。

實例2：阿洛酮糖表異構酶之生產及純化

為了由實例1製備之大腸桿菌BL21(DE3)/KADPE生產洛酮糖表異構酶，取大腸桿菌BL21(DE3)/KADPE接種在5mL LB-胺苄青黴素(ampicillin)培養基(Difco^TM)中，然後在37℃及200rpm振盪培養，直到所測定之600nm吸光度到達1.5為止。之後，取振盪培養溶液接種在500mL LB-胺苄青黴素培養基中，當600nm吸光度到達0.7時，添加0.5Mm β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷異丙酯(IPTG)，然後於16℃與150rpm培養16小時。

取主要培養溶液於8000rpm離心20分鐘，僅回收細胞；使用0.85%(w/v)NaCl洗滌2次；於裂解緩衝液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl，pH 7.0)中溶解細胞；然後使用超音波處理器，於4℃破壞20分鐘。溶胞液於4℃與13,000rpm離心20分鐘，以回收上清液，施加上清液至事先經過溶胞緩衝液平衡之Ni-NTA管柱(Ni-NTA Superflow,Qiagen Inc.)。然後，由包含250mM咪唑之裂解緩衝液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl，pH 7.0)連續流入，隨後得到純化之阿洛酮糖表異構酶(下文中稱為「KADPE」)。由SDS-PAGE結果發現，KADPE具有大小約32kDa之單體。

實例3：證實KADPE活性

實例3-1：證實由D-果糖至阿洛酮糖之轉化活性

為了證實KADPE是否可以使用D-果糖作為受質來製造阿洛酮糖，取實例2產生之KADPE(50mM Tris-HCl，pH 7.0)加至含50%D-果糖及3mM MnSO₄之50mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中，於55℃反應6小時。然後，由反應物在100℃加熱5分鐘，中止反應後，採用HPLC分析法證實所製得之阿洛酮糖。HPLC分析法係採用加裝Aminex HPX-87C管柱(BIO-RAD Inc.)之HPLC(Agilent Inc.,U.S.A.)，使用折射率偵檢器(Agilent 1260 RID)進行；在HPLC分析法中，移動相溶劑為水，溫度為80℃，及流速為0.6mL/min。

結果證實KADPE可以從D-果糖製造阿洛酮糖(第2圖)。

實例3-2：證實由D-果糖轉化為阿洛酮糖

為了證實KADPE製造阿洛酮糖之能力是否優於阿洛酮糖表異構酶(ATPE，SEQ ID NO：5，韓國專利早期公開案案號10-2011-0035805)，以KADPE用於阿洛酮糖之一般製法，證實從D-果糖至阿洛酮糖的轉化率。

明確言之，取已經過重組表現載體pET24a-ATPE轉形之大腸桿菌BL21(DE3)接種在含卡納黴素(kanamycin)(濃度10μg/mL)之LB培養基中，然後依實例2之相同方式表現酵素及純化。取所得酵素加至含D-果糖(50wt%)及3mM MnSO₄之50mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中，於55℃反應6小時。然後，藉由反應物在100℃加熱5分鐘中止反應，然後採用HPLC分析法證實已製得阿洛酮糖。HPLC分析法係依實例3-1之相同條件進行。

由阿洛酮糖量(mg/分鐘)計算阿洛酮糖之轉化率，其中以每分鐘產生之酵素計。KADPE之反應速率係以相對值表示，其中使用ATPE之反應速率為100%。

結果，相較於使用ATPE時之每分鐘阿洛酮糖產量，當使用KADPE時之每分鐘阿洛酮糖產量為146.6%，因此證實使用KADPE時，由D-果糖形成阿洛酮糖之轉化率為顯著高(表1)。

實例4：KADPE性質之分析法

4-1.分析酵素活性隨溫度之變化

由KADPE與D-果糖受質在各種不同溫度(亦即40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、及75℃)反應2小時後，比較不同溫度下之酵素活性。採用實例3-1之相同方法進行反應30分鐘，但其中改變溫度與反應時間。測定D-果糖轉化成阿洛酮糖之酵素活性。

結果證實，KADPE在所有溫度範圍內均展現25%或更高之轉化活性，且KADPE之活性隨溫度上升而提高，其在最高溫度(亦即75℃)展現最大轉化率(表2)。

4-2.分析酵素之熱安定性

為了比較KADPE與ATPE(其係習知之酵素)之熱安定性，取各酵素在各種不同溫度(55℃、60℃、及65℃)進行熱處理，然後在不同熱處理時間點(0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、及6小時)取出酵素處理溶液樣本，以測定各酵素之殘留活性。採用實例3-1之相同方法進行反應30分鐘，但其中改變反應時間，並由D-果糖至阿洛酮糖之轉化率測定酵素之殘留活性。

結果證實KADPE具有高的熱安定性，因為KADPE之半衰期隨溫度上升而下降之程度顯著低於ATPE(第3a圖及第3b圖)。

實例4-3：分析酵素活性隨pH之變化

為了測定酵素活性隨pH之變化，由D-果糖受質與KADPE在各種不同pH反應。本文中，該反應係依實例3-1之相同方式進行，但改變反應時間與pH。

明確言之，該酵素反應係在55℃，使用50mM磷酸鉀，於pH 5.0、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、及pH 8.0下；及使用50mM Tris-HCl緩衝液，於pH 8.0、pH 8.5、及pH 9.0，進行30分鐘。然後，由D-果糖至阿洛酮糖之轉化率測定酵素活性。

結果證實，KADPE在pH 6至pH 8.5，相對於極大活性，展現70%或更高活性，並在pH 8.0展現最高活性(表3，第4圖)。

4-4.分析酵素活性隨所添加金屬之變化

為了測定KADPE活性隨所添加金屬之變化，依實例3-1之反應條件測定酵素活性，但其中改用各種不同金屬鹽(LiCl、Na₂SO₄、MgCl₂、NaCl、FeSO₄、及MgSO₄)替代MnSO₄，且每種金屬鹽係添加至最終濃度3mM。對照組不接受金屬鹽處理。

結果證實，不僅在添加Mn時，而且在添加Li、Na、Mg、及Fe時，均增加KADPE活性，其中以Mn增加之酵素活性最多(表4及第5圖)。

雖然本發明已參考特定具體實施例說明，但彼等熟悉本發明相關技藝者咸了解，可在不偏離本發明技術本質或基本特性下，以其他明確形式實施本發明。因此，上述實施例可視為全面說明，沒有限制。此外，本發明之範圍係由附錄之申請專利範圍而非詳細說明所界定，且應了解所有衍生自本發明定義與範圍之修飾或變化及其同等物均包括在附錄之申請專利範圍內。

【生物材料寄存】

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

[登錄號]

寄存單位名稱：韓國微生物培養中心(Korean Culture of Microorganisms)

寄存編號：KCCM11917P

寄存日期：2016年10月20日

<110> 南韓商CJ第一製糖股份有限公司

<120> 新穎D-阿洛酮糖3-表異構酶及使用該D-阿洛酮糖3-表異構酶製造D-阿洛酮糖之方法

<130> OPA18389

<150> KR 10-2017-0152619

<151> 2017-11-15

<160> 5

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KADPE之胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KADPE之核苷酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KADPE之前置引子

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KADPE之反置引子

<400> 4

<210> 5

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ATPE之胺基酸序列

<400> 5

Claims

一種D-阿洛酮糖3-表異構酶或包含該D-阿洛酮糖3-表異構酶的組成物在經由D-果糖轉化為D-阿洛酮糖之製備D-阿洛酮糖的用途，其中該D-阿洛酮糖3-表異構酶係由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該D-阿洛酮糖3-表異構酶係由多核苷酸序列SEQ ID NO：2編碼。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組成物進一步包含D-果糖。
一種表現D-阿洛酮糖3-表異構酶之微生物、該微生物之培養物或包含該微生物及/或該微生物的培養物之組成物在經由D-果糖轉化為D-阿洛酮糖之製備D-阿洛酮糖的用途，其中該微生物係藉由使用包含編碼由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶的核苷酸序列的多核苷酸或包含序列SEQ ID NO：2的多核苷酸予以轉形。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該組成物進一步包含D-果糖。
一種用於製造D-阿洛酮糖之方法，其包括將D-果糖與由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成之D-阿洛酮糖3-表異構酶、表現該D-阿洛酮糖3-表異構酶之微生物、或該微生物之培養物反應，其中該微生物係藉由包括編碼由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶的多核苷酸的重組載體或包括由核苷酸序列 SEQ ID NO：2組成的多核苷酸的重組載體予以轉形。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該反應係在pH5.0至9.0，40℃至90℃之溫度，或0.5小時至48小時進行。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該方法進一步包括在與該D-果糖反應之前、之後、或同時，將金屬與該D-阿洛酮糖3-表異構酶、該微生物、或該微生物之培養物反應。