KR20140140215A - 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함으로써, 안전하면서도 높은 효율로 과당으로부터 사이코스를 대량 생산할 수 있는, 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법 {Corynebacterium including polynucleotide coding psicose 3-epimerase and producing method for Psicose using the same}

본 발명은 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.

사이코스 (D-psicose)는 과당 (D-fructose)의 3번 탄소의 에피머 (epimer)로써 일반 당류들처럼 감미를 가지지만 인체 내에서 대사가 되지 않아서 거의 칼로리는 제로에 가까워 당뇨 및 비만환자에게 설탕 대체 기능성 감미료로 사용될 수 있는 기능성 당이다. 또한 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제해서 복부비만을 감소시키는 기능을 가지고 있고 당뇨병과 동맥경화 치료제로 현재 연구 중에 있는 당이다.

이처럼 사이코스는 감미료로 각광받으면서 식품 산업 분야에 있어 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 점점 높아지고 있다. 사이코스는 천연물질 내에는 당밀 처리 과정 또는 포도당 이성화 반응과정 중에 매우 소량 존재하기에 기존의 사이코스 생산은 주로 화학적 과정을 거쳐 이루어졌다. 빌릭 (Bilik)등은 몰리브딕산(molybdic acid) 이온의 촉매작용을 활용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 기술을 개발하였다. 맥도날드 (McDonald)는 1,2:4,5-디-o-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노즈 (1,2:4,5-di-o-isppropylidene-bata-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 사이코스를 생산하였다. 또한, 도너 (Doner)는 에탄올과 트리에틸아민과 함께 과당을 가열하는 방법으로 사이코스를 생산하였다. 그러나, 이들 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 비용이 많이 소모되는 반면 그 생산효율은 낮고 또한 부산물의 과량 발생한다는 문제점이 있다.

생물학적 방법에 의한 사이코스 생산방법으로 이즈모리 (Ken Izumori)등은 미생물 세포반응을 활용하여 갈락시톨 (galacitol), 디-타가토스 (D-tagatose) 또는 디-탈리톨 (D-talitol) 등으로부터 사이코스를 생산할 수 있다는 것을 보였다. 그러나, 이 기질들 또한 자연계에서 비교적 희귀한 당 또는 당알코올로 그 원가가 높다는 단점이 있다.

효소 전환방법으로는 분리미생물 슈도모나스 치코리 ST-24 (Pseudomonas cichorii ST-24)의 디-타가토스-3-에피머화 효소 (D-tagatose-3-epimerase)를 재조합 대장균에서 생산하고 정제하여 과당을 사이코스로 효소 전환하는 방법이 있으며, 이즈모리 등은 디-타가토스-3-에피머화 효소를 고정화시킨 반응시스템으로 약 25%의 전환율로 사이코스를 생산한 바 있다.

이러한 종래 기술에 의하면, 과당으로부터 사이코스를 생산하기 위해서 효소를 정제하고 그 정제된 효소를 고정화하여 사이코스 생산성을 높이는 방향으로 연구되어왔다. 이처럼 효소를 정제하는 과정에는 시간 및 비용이 많이 요구되는 것이 현실이다.

따라서, 효소 정제의 과정을 생략하여 제조원가가 낮고 사이코스를 높은 효율로 생산할 수 있는 균주 및 이를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법이 요구되고 있다.

한국공개특허 제2006-125971호에는 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법이 개시되어 있다.

한국공개특허 제2006-125971호

본 발명은 고효율의 사이코스 생성 효율을 갖는, 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 그로부터 안전하면서도 높은 효율로 사이코스를 대량생산할 수 있는 사이코스의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코리네박테리움속 미생물.

2. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 미생물.

3. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032인 미생물.

4. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에 그 자체로 또는 벡터를 이용하여 도입되는, 미생물.

5. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 및 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.

6. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ptsF 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 mtlD 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.

7. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물의 배양물로부터 사이코스를 회수하는 단계를 포함하는 사이코스의 생산 방법.

8. 위 7에 있어서, 과당은 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도인, 방법.

9. 위 7에 있어서, 상기 배지는 영양배지 또는 구명배지인, 방법.

10. 위 7에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계 이전에 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하지 않는 배지에서 배양하여 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.

11. 위 10에 있어서, 상기 회수한 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD₆₀₀이 0.01 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.

12. 위 11에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 1%(w/v) 내지 80%(w/v)인, 방법.

13. 위 7에 있어서, 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하여, 분리된 미생물을 다시 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.

14. 위 13에 있어서, 상기 분리된 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD₆₀₀이 5 내지 150이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.

15. 위 13에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 10%(w/v) 내지 80%(w/v)인, 방법.

본 발명의 미생물은 안전하면서도 높은 효율로 과당으로부터 사이코스를 대량 생산할 수 있다.

도 1은 사이코스 3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체로부터 사이코스 생산량을 측정한 결과이다. 회색막대는 24시간의 사이코스 생산결과이며, 진회색막대는 48시간의 사이코스 생산결과이다.
도 2는 사이코스 3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환 균체를 4회 회수하여 재배양하면서 사이코스 생산량을 측정한 결과이다. 패널 A는 사이코스 생산량을 나타낸 결과이며, 패널 B는 균체의 농도를 나타낸 결과이며, 패널 C는 사이코스 생산량을 균체 농도의 값으로 나누어 표현한 결과이다.

본 발명은 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함으로써, 안전하면서도 높은 효율로 과당으로부터 사이코스를 대량 생산할 수 있는,

본 발명의 코리네박테리움속 미생물은 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호 1의 아미노산 서열은 MKHGIYYSYW EHEWSAKFGP YIEKVAKLGF DIIEVAAHHI NEYSDAELAT IRKSAKDNGI ILTAGIGPSK TKNLSSEDAA VRAAGKAFFE RTLSNVAKLD IHTIGGALHS YWPIDYSQPV DKAGDYARGV EGINGIADFA NDLGINLCIE VLNRFENHVL NTAAEGVAFV KDVGKNNVKV MLDTFHMNIE EDSFGDAIRT AGPLLGHFHT GESNRRVPGK GRMPWHEIGL ALRDINYTGA VIMEPFVKTG GTIGSDIKVW RDLSGGADIA KMDEDARNAL AFSRFVLGG이다.

본 발명의 코리네박테리움속 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있고, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(Corynebacterium glutamcium ATCC13032, taxid: 196627; GenBank NID: NC_003450, ATCC13032)일 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰은 GRAS(Generally recognized as safe) 균주이고, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 우수한 효율로 제조할 수 있어, 과당의 사이코스로의 전환율이 매우 우수하다.

상기 효소는 아그로박테리움 투메파시엔스로부터 유래된 효소일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 자체로 또는 벡터에 의하여 도입되는 것일 수 있다.

용어 "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 발명에서 벡터는, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다.

벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 플라스미드 셔틀벡터, 바이러스 발현벡터(예, 복제결함 레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 등) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 전사종결인자로 이루어지는 하나 이상의 요소와 작동가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 요소 (regulatory element)와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조절 요소는 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소 (temperature sensitive element)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소 (inducible element)는 락 오페론(lac operon), 아라비노오스 오페론 (arabinose operon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 내재적 디-프락토오스를 디-프락토오스 1-포스페이트로 전환하면서 균체 내로 수송하는 PTS 수송 시스템인 ptsF(EII^Fru, fruA, NCgl1861, GI:19553141, EC 2.7.1.69)와 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 결손 또는 불활성화한 것일 수 있고, 바람직하게는 동일 유전자를 결손 또는 불활성화시킨 것일 수 있다.

사이코스는 D-프락토오스(D-fructose)로부터 생성되므로, 상기 유전자를 결손 또는 불활성화시키면 프락토오스의 인산화를 억제할 수 있으므로, 사이코스의 생성 효율을 현저히 개선할 수 있다.

상기 ptsF 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

서열번호 2의 아미노산 서열은 MNSVNNSSLV RLDVDFGDST TDVINNLATV IFDAGRASSA DALAKDALDR EAKSGTGVPG QVAIPHCRSE AVSVPTLGFA RLSKGVDFSG PDGDANLVFL IAAPAGGGKE HLKILSKLAR SLVKKDFIKA LQEATTEQEI VDVVDAVLNP APKTTEPAAA PAAAAVAESG AASTSVTRIV AITACPTGIA HTYMAADSLT QNAEGRDDVE LVVETQGSSA VTPVDPKIIE AADAVIFATD VGVKDRERFA GKPVIESGVK RAINEPAKMI DEAIAASKNP NARKVSGSGV AASAETTGEK LGWGKRIQQA VMTGVSYMVP FVAAGGLLLA LGFAFGGYDM ANGWQAIATQ FSLTNLPGNT VDVDGVAMTF ERSGFLLYFG AVLFATGQAA MGFIVAALSG YTAYALAGRP GIAPGFVGGA ISVTIGAGFI GGLVTGILAG LIALWIGSWK VPRVVQSLMP VVIIPLLTSV VVGLVMYLLL GRPLASIMTG LQDWLSSMSG SSAILLGIIL GLMMCFDLGG PVNKAAYLFG TAGLSTGDQA SMEIMAAIMA AGMVPPIALS IATLLRKKLF TPAEQENGKS SWLLGLAFVS EGAIPFAAAD PFRVIPAMMA GGATTGAISM ALGVGSRAPH GGIFVVWAIE PWWGWLIALA AGTIVSTIVV IALKQFWPNK AVAAEVAKQE AQQAAVNA이다.

또한, 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 만니톨 2-디하이드로게나아제(mannitol 2-dehydrogenase)를 코딩하는 mtlD (NCgl0108, GI:19551360, EC 1.1.1.67)와 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 결손 또는 불활성화한 것일 수 있고, 바람직하게는 동일 유전자를 결손 또는 불활성화시킨 것일 수 있다.

프락토오스는 만니톨 2-디하이드로게나아제에 의해 D-만니톨(D-mannitol)로 전환되므로, 상기 유전자를 결손 또는 불활성화 시키면 프락토오스의 감소를 억제할 수 있으므로, 사이코스의 생성 효율을 현저히 개선할 수 있다.

상기 mtlD 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

서열번호 3의 아미노산 서열은 MNTPLQLNTE NLQEIASTSG VQIPAFNRAD VAPGIVHFGV GGFHRAHQAM YLNELMNEGK ALDWGIIGMG VMPSDVRMRD ALASQDHLYT LTTKAPDGTL DQKIIGSIID YVFAPEDPAR AVATLAQDSI RIVSLTVTEG GYNIDPATED FDHTNPRIVA DREALQAGDT STLQTFFGLI TAALISRKES GSTPFTIMSC DNIQGNGDLA KRFFLAFAHS VSSELGEWVE NNVAFPNSMV DRITPETTDG DRDDIKEIGY IDAWPVVSED FTQWVLEDAF TQGRPAYEEV GVQVVSDVEP YELMKLRLLN ASHQGLCYFG HLAGHHMVHD VMADTRFQDF LLAYMEREAT PTLKELPGVD LDAYRRQLIA RFGNAAVKDT VPRLCAESSD RIPKWLLPVV RENLAAGRDV TLSAAIVASW ARYAEGTDEQ GNPIKIVDRL SERVQENASG NRTDILSFIR DRGIFGDLVD AEPFTKAYSE TLSSLHDRGA EATIDALLTQ VTV이다.

용어 "결손" 또는 "불활성화"란 상기 유전자의 발현이 감소되거나 발현이 이루어지지 않는 것을 의미한다. 상기 "불활성화"는 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상동 재조합 (homologuous recombination)에 의하여 불활성화된 것일 수 있다. 상기 상동 재조합은 예를 들면, 전이인자 돌연변이 (transposon mutagenesis) 또는 P1 형질도입 (P1 transduction)에 의하여 매개된 것일 수 있다.

미생물은 그 자체가 효소 담체 또는 효소를 담은 용기로서 효소 고정화와 같은 장점을 얻을 수 있다. 미생물의 경우는 원심분리를 통하여 미생물만을 회수하여 재사용이 가능하지만 효소의 경우는 그렇지 못하다. 그리고 효소는 활성을 장기간 유지시킬 수 있는 환경을 조성하기 위해 담체에 고정화시키는 부차적인 과정이 필요하지만 미생물의 경우는 그 자체가 담체의 역할을 충분히 함으로써 효소의 활성이 급격히 저하되는 것을 막아 재사용이 가능하도록 한다.

따라서, 본 발명은 종래의 효소 등을 이용한 사이코스의 생산 방법에 비해 현저히 개선된 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명은 사이코스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 사이코스의 생산 방법의 일 구현예를 그 단계별로 보다 상세히 설명한다.

먼저, 상기 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양한다.

상기 미생물의 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 당 분야에 공지된 코리네박테리움 속의 형질전환체의 배양에 사용되는 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 배양 온도가 26 내지 38℃일 수 있다.

상기 배지는 2YT 배지, LB 배지, TB 배지 등의 효모추출물과 질소원을 포함하는 영양배지일 수 있다.

또한, 포도당, 글리세롤 등을 포함하는 탄소원; 암모니아, 우레아(urea) 등을 포함하는 질소원; 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간 등의 필수 금속이온; 비타민 등을 포함하는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 구명배지(defined 배지)일 수 있다.

배지에 포함되는 과당 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있다.

상기 배양은 연속, 반연속, 또는 배치 (batch) 형식 배양일 수 있다.

상기 배양은 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 물질을 더 첨가하여 수행될 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 물질은 특별히 한정되지 않으며, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 물질일 수 있다.

이후에, 상기 미생물의 배양물로부터 사이코스를 회수한다.

사이코스를 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 예를 들면 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법을 들 수 있다.

구체적으로. 배양물을 원심분리하여 배양액을 미생물로부터 분리하고, 상기 회수 방법에 의하여 사이코스를 배양액으로부터 분리함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 사이코스의 생산 방법은 상기 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계 이전에, 상기 미생물을 과당을 포함하지 않은 배지 에서 배양하여 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 과당을 포함하지 않은 배지는, 과당을 포함하지 않은 것을 제외하고는 상기 과당을 포함한 배지와 동일한 범주의 배지일 수 있다.

상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 원심분리, 여과 등을 들 수 있다.

상기 방법으로 회수된 미생물은 원하는 농도, 예를 들면, 고농도로 농축된 상태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환체는 고농도로 상기 과당을 포함하는 배지 중에 접종되어 배양될 수 있다. 따라서, 과당을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계에서 사용되는 미생물은 상기 회수된 미생물일 수 있다.

상기 회수된 미생물은 과당을 포함하는 배지에서 균체의 탁도(600nm 흡광도에서의 측정치, 이하 OD₆₀₀)가 0.01 내지 300, 예를 들면 1 내지 300, 10 내지 300, 20 내지 300, 5 내지 300, 또는 40 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 균체를 사용함으로써, 배지 중에서 고농도로 과당이 포함된 배지에서 효율적으로 과당을 사이코스로 전환할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 회수된 균체가 사용되는 경우, 상기 과당은 예를 들면 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 배지 중에 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 예컨대, 1%(w/v) 내지 35%(w/v), 10%(w/v) 내지 80%(w/v), 20%(w/v) 내지 80%(w/v), 30%(w/v) 내지 80%(w/v), 30 %(w/v) 내지 80 %(w/v) 등 일 수 있다.

본 발명의 사이코스의 생산 방법은 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하여, 분리된 미생물을 다시 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

분리된 미생물은 2 내지 10회, 바람직하게는 3회 내지 10회, 더욱 바람직하게는 4 내지 10회 사이코스의 생산에 사용될 수 있다. 상기 분리된 미생물은 상기 배지에서 예를 들면 OD₆₀₀이 5 내지 150이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 상기 범위 내에서 예컨대, 5 내지 150, 10 내지 150, 20 내지 150, 10 내지 100, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 40, 40 내지 100 등일 수 있다.

이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 미생물을 사용함으로써 고농도의 과당에서 미생물의 생육 저해를 억제할 수 있으므로, 배지 중에서 고농도로 과당이 포함된 배지에서 효율적으로 과당을 사이코스로 전환할 수 있다.

상기 분리된 코리네박테리움 글루타미쿰 균체가 사용되는 경우, 상기 과당은 1 %(w/v) 내지 80 %(w/v), 1 %(w/v) 내지 35%(w/v), 10 %(w/v) 내지 80 %(w/v), 20 %(w/v) 내지 80 %(w/v), 또는 30 %(w/v) 내지 80 %(w/v) 또는 30 %(w/v) 내지 50 %(w/v)의 농도로 배지 중에 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 1. 코리네박테리움 형질전환체의 제조

대장균-코리네박테이룸 셔틀벡터인 pCES208 (J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)를 변형하여 종결자(terminator)와 lac 프로모터가 삽입된 pSGT208 셔틀벡터를 제작하여 사용하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰에서 사이코스를 생산하기 위하여 사이코스 3-에피머라제는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens str. C58; taxid:176299; GenBank NID: NC_003062, ATCC33970)의 dpe 유전자(AGR_L_260, GI:15890243)를 상기 제작한 pSGT208 셔틀벡터에 도입하여 사용하였다.

상세히 설명하면 프라이머 1과 2를 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 게놈으로부터 dpe 유전자를 증폭하고, 이를 제한효소 KpnI와 BamHI로 절단하여 pSGT208 셔틀벡터의 동일 부위로 삽입하여 사이코스 3-에피머라제를 포함하는 pS208-dpe 재조합 셔틀벡터를 제작하였다.

이후에, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 사이코스 3-에피머라제의 발현량을 증대시키기 위하여 pS208-dpe에서 lac 프로모터를 pTrc99a에서 유래한 trc 프로모터로 교체하였으며, 이를 pS208cT-dpe로 명명하였다.

상기 제작한 사이코스 3-에피머라제를 포함하는 재조합 벡터 pS208-dpe, pS208cT-dpe와 이에 대한 음성 대조군인 pSGT208 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 도입하여 형질전환시키고, 이를 과당으로부터 사이코스 생산에 이용하였다. 형질전환법은 Handbook of Corynebacterium glutamicum (Lothar Eggeling 등, ISBN 0-8493-1821-1, 2005 by CRC press)에 명시된 방법을 따랐다.

사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재하였다.

서열번호	프라이머	염기서열 (5'-3')
4	프라이머 1	GCAGGTACCAGGAGGTAATAAATATGAAACACGGCATCTATTATTCTTACTGG
5	프라이머 2	GCTGGATCCTTAGCCACCAAGAACGAAGCGGG

실시예 2. 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환체를 이용한 과당으로부터 사이코스의 생산

고농도의 과당을 첨가할 때 균체 생육 저해의 문제를 해결하기 위해 별도로 배양한 고농도의 균체를 첨가할 수 있다면 고농도의 사이코스 생산이 가능하다.

고농도의 균체를 확보하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체를 20㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 5 ㎖의 LB 배지(Difco)에 접종하여 30℃, 250rpm 조건으로 종배양한 후, 5g/L 포도당 및 20㎍/㎖의 카나마이신이 있는 최소 배지(1리터 당 1g K₂HPO₄, 10g (NH₄)₂SO₄, 0.4g MgSO₄7H₂O, 20mg FeSO₄7H₂O, 20mg MnSO₄H₂O, 50mg NaCl, 2 g urea, 0.1 mg biotin, 0.1 mg thiamine)에 접종하여 본배양 하였다.

본배양은 홈이 파인 300 ㎖ 삼각플라스크에 50㎖ 부피로 30℃, 180 rpm 조건에서 36 시간 배양하여 충분한 균체량과 단백질의 충분한 발현을 유도하였다.

얻어진 상기 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체를 회수하여, 기질인 40%(w/v) 과당을 함유하는 상기와 동일한 최소배지에 균체농도를 65 OD₆₀₀로 재현탁한 뒤, 30℃, 180rpm 조건에서 배양하였다.

과당 및 사이코스의 농도는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정하였다. HPLC는 SCL-10A(Shimadzu, 일본)를 사용하였으며, Kromasil 5NH₂ 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상은 75% 아세토니트릴을 이용하여 1.5 mL/분으로 흘리면서 40℃에서 분리한 후 RI(Reflective Index) 검출기를 이용하여 분석하였다. 상기의 조건에서 과당의 머무름시간(retention time)은 5.5분, 사이코스는 4.6분이었다.

측정 결과는 도 1에 나타내었다. 회색막대는 24시간의 사이코스 생산 결과이며, 진회색막대는 48시간의 사이코스 생산 결과이다.

도 1을 참조하면, 음성 대조군으로 pSGT208 셔틀벡터만을 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 경우 사이코스가 전혀 검출되지 않아 해당 코리네박테리움 글루타미쿰은 내재적으로 과당으로부터 사이코스를 생산하는 경로를 지니지 않은 것으로 보인다.

pS208-dpe 재조합 셔틀벡터를 사용한 실험군의 경우, 24시간에 약 7.4g/L의 사이코스를 생산하여 사이코스 3-에피머라제가 유의적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체에서 발현된 것을 확인할 수 있었으며, 이때 48시간에 약 8.7 g/L가 생산되어 24시간에 생산이 거의 종료된 것을 확인하였다.

pS208cT-dpe 재조합 셔틀벡터를 사용한 실험군의 경우, 사이코스 생산량은 크게 증가되어 24시간에 약 51.5 g/L, 48시간에 약 61.2 g/L로 나타났으며, 이는 사이코스 3-에피머라제가 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 높은 활성을 나타내고 있으며, 과당으로부터 사이코스의 전환율은 발현량에 의존적임을 나타내는 결과로 볼 수 있다.

실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환 균체의 반응 후 회수를 통한 과당으로부터 사이코스의 연속생산

상기 실시예 2의 결과로 보건데, 사이코스 3-에피머라제는 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체 내에서 24시간에 최대치의 활성을 나타낸 후 이후 크게 증가하지 않은 것을 알 수 있다.

이러한 결과를 토대로, 24시간 후에 사이코스 3-에피머라제가 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 얼마나 오래 유지되는지 확인하기 위하여, 과당의 존재 하에서 24시간 동안 균체를 배양하고, 배양물로부터 균체를 분리하여, 다시 과당의 존재하에서 24시간 동안 균체를 배양하는 과정을 4회 반복하였다.

배양 조건 및 분석 방법은 실시예 2와 동일하게 수행하였다.

측정 결과는 도 2에 나타내었다. 패널 A는 사이코스 생산량을 나타낸 결과이며, 패널 B는 균체의 농도를 나타낸 결과이며, 패널 C는 사이코스 생산량을 균체 농도의 값으로 나누어 표현한 결과이다.

도 2를 참조하면, 균체 농도(도 2의 패널 B)는 반응수의 증가에 따라 감소하는 경향을 보였는데, 이는 균체 반응액을 원심분리하여 반응 상층액과 균체를 분리하는 과정에서 발생하는 균체의 손실 때문으로 판단된다.

사이코스의 전환수준은 4회 반복하는 동안 약 50-60 g/L로서 큰 차이가 나지 않은 것으로 나타났으며(도 2의 패널 A), 이로서 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 균체 및 균체내에서 발현된 사이코스 3-에피머라제의 활성이 수회 반복하여도 안정한 것으로 볼 수 있다. 이러한 결과는 도 2의 패널 C에서 균체 농도에 대한 사이코스 생산 수준이 줄어들지 않은 것으로 더욱 구체적으로 확인할 수 있다.

<110> Gyungsang National University Office of Academy and Industry Collaboration <120> Corynebacterium including polynucleotide coding psicose 3-epimerase and producing method for Psicose using the same <130> P2013-183 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> psicose 3-epimerase <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 2 <211> 688 <212> PRT <213> di fructose-1-kinase <400> 2 Met Asn Ser Val Asn Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe 1 5 10 15 Gly Asp Ser Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe 20 25 30 Asp Ala Gly Arg Ala Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu 35 40 45 Asp Arg Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile 50 55 60 Pro His Cys Arg Ser Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala 65 70 75 80 Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn 85 90 95 Leu Val Phe Leu Ile Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu 100 105 110 Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile 115 120 125 Lys Ala Leu Gln Glu Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val 130 135 140 Asp Ala Val Leu Asn Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala 145 150 155 160 Pro Ala Ala Ala Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val 165 170 175 Thr Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr 180 185 190 Tyr Met Ala Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp 195 200 205 Val Glu Leu Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val 210 215 220 Asp Pro Lys Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp 225 230 235 240 Val Gly Val Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu 245 250 255 Ser Gly Val Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu 260 265 270 Ala Ile Ala Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser 275 280 285 Gly Val Ala Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly 290 295 300 Lys Arg Ile Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro 305 310 315 320 Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly 325 330 335 Gly Tyr Asp Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser 340 345 350 Leu Thr Asn Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met 355 360 365 Thr Phe Glu Arg Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe 370 375 380 Ala Thr Gly Gln Ala Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe 405 410 415 Val Gly Gly Ala Ile Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly 420 425 430 Leu Val Thr Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser 435 440 445 Trp Lys Val Pro Arg Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile 450 455 460 Pro Leu Leu Thr Ser Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu 465 470 475 480 Gly Arg Pro Leu Ala Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser 485 490 495 Ser Met Ser Gly Ser Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu 500 505 510 Met Met Cys Phe Asp Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu 515 520 525 Phe Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile 530 535 540 Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser 545 550 555 560 Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu 565 570 575 Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly 580 585 590 Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met 595 600 605 Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val 610 615 620 Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu 625 630 635 640 Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser 645 650 655 Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val 660 665 670 Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala 675 680 685 <210> 3 <211> 503 <212> PRT <213> mannitol 2-dehydrogenase <400> 3 Met Asn Thr Pro Leu Gln Leu Asn Thr Glu Asn Leu Gln Glu Ile Ala 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Val Gln Ile Pro Ala Phe Asn Arg Ala Asp Val Ala 20 25 30 Pro Gly Ile Val His Phe Gly Val Gly Gly Phe His Arg Ala His Gln 35 40 45 Ala Met Tyr Leu Asn Glu Leu Met Asn Glu Gly Lys Ala Leu Asp Trp 50 55 60 Gly Ile Ile Gly Met Gly Val Met Pro Ser Asp Val Arg Met Arg Asp 65 70 75 80 Ala Leu Ala Ser Gln Asp His Leu Tyr Thr Leu Thr Thr Lys Ala Pro 85 90 95 Asp Gly Thr Leu Asp Gln Lys Ile Ile Gly Ser Ile Ile Asp Tyr Val 100 105 110 Phe Ala Pro Glu Asp Pro Ala Arg Ala Val Ala Thr Leu Ala Gln Asp 115 120 125 Ser Ile Arg Ile Val Ser Leu Thr Val Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Ile 130 135 140 Asp Pro Ala Thr Glu Asp Phe Asp His Thr Asn Pro Arg Ile Val Ala 145 150 155 160 Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ser Thr Leu Gln Thr Phe 165 170 175 Phe Gly Leu Ile Thr Ala Ala Leu Ile Ser Arg Lys Glu Ser Gly Ser 180 185 190 Thr Pro Phe Thr Ile Met Ser Cys Asp Asn Ile Gln Gly Asn Gly Asp 195 200 205 Leu Ala Lys Arg Phe Phe Leu Ala Phe Ala His Ser Val Ser Ser Glu 210 215 220 Leu Gly Glu Trp Val Glu Asn Asn Val Ala Phe Pro Asn Ser Met Val 225 230 235 240 Asp Arg Ile Thr Pro Glu Thr Thr Asp Gly Asp Arg Asp Asp Ile Lys 245 250 255 Glu Ile Gly Tyr Ile Asp Ala Trp Pro Val Val Ser Glu Asp Phe Thr 260 265 270 Gln Trp Val Leu Glu Asp Ala Phe Thr Gln Gly Arg Pro Ala Tyr Glu 275 280 285 Glu Val Gly Val Gln Val Val Ser Asp Val Glu Pro Tyr Glu Leu Met 290 295 300 Lys Leu Arg Leu Leu Asn Ala Ser His Gln Gly Leu Cys Tyr Phe Gly 305 310 315 320 His Leu Ala Gly His His Met Val His Asp Val Met Ala Asp Thr Arg 325 330 335 Phe Gln Asp Phe Leu Leu Ala Tyr Met Glu Arg Glu Ala Thr Pro Thr 340 345 350 Leu Lys Glu Leu Pro Gly Val Asp Leu Asp Ala Tyr Arg Arg Gln Leu 355 360 365 Ile Ala Arg Phe Gly Asn Ala Ala Val Lys Asp Thr Val Pro Arg Leu 370 375 380 Cys Ala Glu Ser Ser Asp Arg Ile Pro Lys Trp Leu Leu Pro Val Val 385 390 395 400 Arg Glu Asn Leu Ala Ala Gly Arg Asp Val Thr Leu Ser Ala Ala Ile 405 410 415 Val Ala Ser Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Asp Glu Gln Gly Asn 420 425 430 Pro Ile Lys Ile Val Asp Arg Leu Ser Glu Arg Val Gln Glu Asn Ala 435 440 445 Ser Gly Asn Arg Thr Asp Ile Leu Ser Phe Ile Arg Asp Arg Gly Ile 450 455 460 Phe Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Pro Phe Thr Lys Ala Tyr Ser Glu 465 470 475 480 Thr Leu Ser Ser Leu His Asp Arg Gly Ala Glu Ala Thr Ile Asp Ala 485 490 495 Leu Leu Thr Gln Val Thr Val 500 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcaggtacca ggaggtaata aatatgaaac acggcatcta ttattcttac tgg 53 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctggatcct tagccaccaa gaacgaagcg gg 32

Claims (15)

1. 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코리네박테리움속 미생물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 미생물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032인 미생물.
   
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에 그 자체로 또는 벡터를 이용하여 도입되는, 미생물.
   
5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 및 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.
   
6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ptsF 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 mtlD 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.
   
7. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
   상기 미생물의 배양물로부터 사이코스를 회수하는 단계를 포함하는 사이코스의 생산 방법.
   
8. 청구항 7에 있어서, 과당은 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도인, 방법.
   
9. 청구항 7에 있어서, 상기 배지는 영양배지 또는 구명배지인, 방법.
   
10. 청구항 7에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계 이전에
    청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하지 않는 배지에서 배양하여 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
    상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
    
11. 청구항 10에 있어서, 상기 회수한 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD₆₀₀이 0.01 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.
    
12. 청구항 11에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 1%(w/v) 내지 80%(w/v)인, 방법.
    
13. 청구항 7에 있어서, 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하여, 분리된 미생물을 다시 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
    
14. 청구항 13에 있어서, 상기 분리된 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD₆₀₀이 5 내지 150이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.
    
15. 청구항 13에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 10 %(w/v) 내지 80 %(w/v)인, 방법.

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