WO2016159536A1 - 신규 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2016159536A1
WO2016159536A1 PCT/KR2016/002481 KR2016002481W WO2016159536A1 WO 2016159536 A1 WO2016159536 A1 WO 2016159536A1 KR 2016002481 W KR2016002481 W KR 2016002481W WO 2016159536 A1 WO2016159536 A1 WO 2016159536A1
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promoter
vector
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이승빈
김성보
이지현
장진숙
조승현
박승원
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a novel promoter, a vector comprising the same, a microorganism comprising the vector, and a method for producing a target protein using the promoter.
  • promoters available to microorganisms of the genus Corynebacterium have been used, such as several promoters of Escherichia coli (Plac, Ptrc, Ptac), and some promoters of microorganisms of the genus Corynebacterium (Psod, Peftu, PgapA).
  • lac, Ptrc, Ptac promoters of Escherichia coli
  • Ptac promoters of microorganisms of the genus Corynebacterium
  • Psod Peftu
  • PgapA promoters available to microorganisms of the genus Corynebacterium
  • most of the microbial gene expression systems of Corynebacterium genus using these showed low expression efficiency compared to E. coli gene expression system.
  • the present inventors earnestly endeavored to find a promoter capable of strongly inducing gene expression in a microorganism strain of Corynebacterium, and finally, a novel promoter was developed and completed the present invention by confirming its high activity.
  • One object of the present invention is to provide novel nucleic acid molecules with promoter activity.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant microorganism into which the vector is introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a protein of interest using a recombinant microorganism, the vector is introduced.
  • Another object of the present invention is to (a) culturing the microorganism into which the vector is introduced; And (b) reacting the cultured microorganisms with fructose to produce a psycose.
  • the promoter secured through the present invention shows a significantly increased gene expression rate compared to the promoters used for mass production of proteins in the conventional recombinant microorganisms, so that the microorganisms of the genus Corynebacterium or Escherichia can be expressed in high yield. It can be usefully used in the food, pharmaceutical and agricultural industries to produce materials.
  • 1 shows a pFIS-2-ATPE-2 vector map.
  • Figure 2 shows the HPLC chromatography after reacting with fructose substrate using Corynebacterium glutamicum ATCC13032 / pECCG117-Pcj4-ATPE (FIS-4-ATPE).
  • FIG. 3 shows HPLC chromatography after reaction with fructose substrate using Corynebacterium glutamicum ATCC13032 / pECCG117-Pspl1-ATPE (FIS-2-ATPE).
  • Figure 4 shows HPLC chromatography after reacting with fructose substrate using Corynebacterium glutamicum ATCC13032 / pECCG117-Pspl1-ATPE-2 (FIS-2-ATPE-2).
  • the present invention provides a nucleic acid molecule having promoter activity as one embodiment.
  • the nucleic acid molecule having the promoter activity may be a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid molecule having a promoter activity having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 may be mixed with "spl1 promoter" or "Pspl1".
  • nucleic acid molecules with promoter activity may also be termed promoters, and all of the terms described above are used herein.
  • the promoter of the present invention may bring about expression of a target gene operably linked with a nucleic acid molecule having the promoter activity in a desired microorganism, and may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the promoter sequence of the present invention can be easily modified by those skilled in the art by conventionally known mutagenesis, such as directional evolution and site-specific mutagenesis.
  • the promoter is at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90%, more specifically at least 95%, even more specifically at least 98%, at least 70% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequences showing 99% or more homology may be included without limitation.
  • nucleotide sequence having such homology if it is a nucleotide sequence having promoter activity, it should be interpreted that a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added is also included in the scope of the present invention.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology may be sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity, and similarity, using a computer program that aligns the sequence information and is readily available. Parameters can be determined by direct alignment (eg BLAST 2.0). In addition, homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • promoter refers to a non-ready nucleic acid sequence upstream of a coding region, that is, a polymerase, that contains a binding site for a polymerase and has a transcription initiation activity to an mRNA of a promoter subgene. Refers to the DNA region to initiate the transcription of the gene.
  • the promoter may be located at the 5 'region of the mRNA transcription start site.
  • Promoter nucleic acid molecules of the invention can be isolated or prepared using standard molecular biology techniques. For example, it may be prepared using standard synthesis techniques using an automated DNA synthesizer, but is not limited thereto.
  • the kind of the cell in which the nucleic acid molecule having the promoter activity of the present invention can function as a promoter is not particularly limited, and specifically, Corynebacterium microorganism or Escherichia microorganism may be cited. Nebacterium glutamicum, Corynebacterium ammonia genes, Escherichia coli, and the like, and more specifically, Corynebacterium glutamicum or Escherichia coli, but is not limited to, microorganisms of Corynebacterium or Microorganisms of the genus Escherichia can be included without limitation.
  • the present invention provides a target protein expression cassette comprising a nucleic acid molecule having the promoter activity and a gene encoding the target protein.
  • the nucleic acid molecule is as described above.
  • expression cassette refers to a unit cassette that contains a promoter and a gene encoding a target protein, and which can be expressed to produce a target protein operably linked downstream of the promoter. Inside or outside of such an expression cassette may include a variety of factors that can help the efficient production of the target protein.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the polynucleotide.
  • the target protein expression cassette may be one in which a gene encoding the target protein is operably linked downstream of the promoter sequence.
  • target protein refers to a protein to be expressed from a microorganism.
  • any protein to be expressed from a recombinant microorganism may be included without limitation, and examples thereof include ATPE genes, but are not limited thereto.
  • the ATPE gene is a psychocos epimerase, which means a psychocos-3-epimerase having an activity of converting fructose into psychos.
  • the sequence of the ATPE gene can be easily obtained by those skilled in the art through a known database such as GenBank of the National Institutes of Health.
  • the enzyme may have, for example, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2011-0035805, or may be a functional fragment thereof.
  • the "functional fragment” includes a variation by substitution, insertion, or deletion of some amino acids in the amino acid sequence, and is not particularly limited as long as the fragment has an activity of converting fructose into cyclose.
  • the ATPE gene is merely exemplary as one of the genes of interest that can be operably linked to a nucleic acid molecule having the promoter activity of the present invention. Any protein that can be expressed from a recombinant microorganism can be used as a target protein without limitation.
  • operably linked means that the gene sequence and the promoter sequence are functionally linked so that the nucleic acid sequence having the promoter activity of the present invention initiates and mediates the transcription of the gene encoding the protein of interest.
  • Operable linkages can be prepared using known genetic recombination techniques, and site-specific DNA cleavage and ligation can be made using, but are not limited to, cleavage and ligation enzymes in the art.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule having the promoter activity.
  • the nucleic acid molecule is as described above.
  • the recombinant vector may further include a gene encoding a protein of interest. That is, the target protein expression cassette may be included.
  • the gene may be in a form operably linked to a nucleic acid molecule having the promoter activity in a vector.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing an nucleotide sequence of a gene operably linked to a suitable regulatory sequence, which is an artificial DNA molecule that carries a genetic material to allow expression of a gene of interest in a suitable host. do.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation, but It is not limited.
  • the promoter may be the spl1 promoter of the present invention.
  • the vector to be used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ BL3, ⁇ BL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A can be used as a phage vector or cosmid vector
  • pBR, pUC, and pBluescriptII systems are used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the vector usable in the present invention is not particularly limited and known expression vectors can be used. Examples thereof include, but are not limited to, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 vectors, and the like.
  • a vector for inserting a chromosome in a host cell may replace an endogenous promoter in a chromosome with a nucleic acid molecule having a promoter activity of the present invention. Insertion of the nucleic acid molecule into the chromosome can be by any method known in the art, for example by homologous recombination. Since the vector of the present invention may be inserted into a chromosome by causing homologous recombination, the vector may further include a selection marker for confirming whether the chromosome is inserted.
  • Selection markers are used to select cells transformed with a vector, i.e., to confirm the insertion of a nucleic acid molecule of interest, and confer a selectable phenotype such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. Markers can be used. In an environment in which a selective agent is treated, only cells expressing a selection marker survive or exhibit different expression traits, so that transformed cells can be selected.
  • an intrinsic promoter in a host cell for example, a microorganism of the genus Corynebacterium can be replaced by homologous recombination with. This allows overexpression of endogenous genes of host cells such as Corynebacterium microorganisms.
  • a gene encoding the target protein may be, but is not limited to, an ATPE gene.
  • the recombinant vector may be one in which an ATPE gene is operably linked to a nucleic acid molecule having a promoter activity having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, “pFIS-2-ATPE used in one embodiment of the present invention. Or “pFIS-2-ATPE-2”, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a recombinant microorganism into which the vector is introduced.
  • the vector is as described above.
  • the vector may be a vector comprising a nucleic acid molecule having a promoter activity or a vector comprising a nucleic acid molecule having a promoter activity and a gene encoding a target protein.
  • the vector may be introduced into the microorganism by transformation.
  • transformation in the present invention means introducing into the host cell a vector comprising a promoter according to the present invention, or additionally the gene encoding the target protein.
  • the gene encoding the transformed target protein may be inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • Methods for transforming a vector of the present invention include any method for introducing nucleic acids into cells, and can be carried out by selecting appropriate standard techniques as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • electroporation calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • the microorganism may be included without limitation as long as the microorganism capable of operating as a promoter by introducing a nucleic acid molecule having a promoter activity of the present invention.
  • the microorganism may be a microorganism belonging to Corynebacterium, for example, Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium ammonia genes, but is not limited thereto.
  • the microorganism may be an Escherichia genus microorganism, for example, E. coli, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for producing a target protein by culturing the recombinant microorganism in a medium; And (b) recovering the target protein produced from the microorganism or the medium.
  • culture in the present invention means to grow microorganisms under environmental conditions that are appropriately artificially controlled.
  • a method for preparing a target protein using a recombinant microorganism may be performed using a method well known in the art.
  • the culture may be continuously cultured in a batch process, an injection batch or a repeated fed batch process, but is not limited thereto.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for strains of the genus Corynebacterium or Escherichia are known (e.g., Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • Sugar sources that may be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid Fatty acids, such as linoleic acid, glycerol, alcohols such as ethanol, gluconic acid, acetic acid, organic acids such as pyruvic acid may be included, but are not limited thereto. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that may be used may include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, It is not limited to this. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture. Personnel that may be used may include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts. In addition, the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth. Finally, in addition to the above substances, essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used.
  • the above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • Such various culture methods are disclosed, for example, in "Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C, but may be changed depending on conditions, but is not limited thereto.
  • the method for preparing the target protein of the present invention may include recovering the target protein from the microorganism or the culture, and the method for recovering the target protein from the microorganism or the culture may be a method known in the art, such as centrifugation, Filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, and the like can be used, but are not limited to these examples.
  • the recovery step may include a purification process, and those skilled in the art may select and utilize as needed from a variety of known purification processes.
  • the present invention provides a method for manufacturing a microorganism comprising: (a) culturing a microorganism into which a promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a vector comprising an ATPE gene are introduced; And (b) reacting the cultured microorganisms with fructose to produce psycos.
  • the promoter, ATPE gene, vector and microorganism are as described above.
  • the production method can significantly improve the productivity of the psychos than when it is expressed in microorganisms by operably connecting the ATPE gene to any conventionally known promoter.
  • Pspl1 in order to synthesize a promoter for inducing the expression of the target gene, by analyzing a variety of promoter sequences derived from Corynebacterium microorganisms and Escherichia microorganisms to synthesize a promoter having a nucleotide of SEQ ID NO: 1, this spl1 promoter (Hereinafter referred to as "Pspl1").
  • Pspl1 In order to measure the expression-inducing activity of Pspl1, Pspl1 was operably linked to a GFP or ATEP gene to prepare a recombinant vector, and transformed to bacteria of Corynebacterium to prepare a transformed strain.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium ammoniagenes's Ness Corynebacterium ammoniagenase
  • E. coli K12 Escherichia coli K12 Genomic DNA was used to obtain a library of promoters that expressed more strongly or showed different expression profiles through DNA shuffling techniques.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium ammoniagenes's Ness Corynebacterium ammoniagenase
  • E. coli K12 Escherichia coli Genomic DNA of K12
  • each of the fragments having a similar nucleotide sequence can act as a primer of each other to create a library.
  • the library was then introduced into the pUC19 vector by blunt-end ligation.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 including the KpnI / PstI cleavage site to prepare various synthesized promoter libraries.
  • the gene fragment encoding the green fluorescent protein is a forward primer (SEQ ID NO: 4) and a reverse primer (SEQ ID NO: 4) containing a gene encoding a green fluorescent protein (pGFPuv vector (clontech, USA)) as a template and a PstI / XbaI cleavage site.
  • PCR was performed using SEQ ID NO: 5).
  • PCR conditions were modified for 5 minutes at 94 °C, 94 °C 30 seconds denaturation, 55 °C 30 seconds annealing, 72 °C 1 min polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • a PCR product SEQ ID NO: 6
  • the PCR product and the empty vector pECCG117 were treated with restriction enzymes PstI and XbaI, respectively, and then operably linked using DNA conjugation enzymes.
  • pECCG117-gfp plasmid a recombinant vector linked with GFP, was prepared.
  • Promoter library plasmids were prepared by treating the obtained promoter library and the vector cloned with the green fluorescence protein with the restriction enzymes KpnI and PstI and conjugating them using DNA conjugation enzymes.
  • the prepared plasmid was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 to prepare a synthetic promoter library.
  • the prepared Corynebacterium glucamicum synthetic promoter library was screened through fluorescence cells by culturing, obtaining cells, and pre-treatment to express green fluorescent protein. After several screenings, the finally selected strong synthetic promoter Pspl1 was obtained and had the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Example 2 Confirmation of expression-induced activity in Corynebacterium glutamicum by comparing activity with the promoter and other promoters finally secured through screening
  • the transformed strains obtained above, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 / pECCG117, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 / pECCG117-Pcj4-gfp, and Corynebacterium glue Tamicum ATCC13032 / pECCG117-Pspl1-gfp was cultured in the following manner, and GFP activity was measured.
  • OD 600 10.0
  • the cells were collected from the culture by centrifugation (5,000 rpm, 15 minutes), washed twice with 0.1% Tris-HCl (pH 8.0) buffer, and suspended in 160 of 610 nm turbidity with the same buffer. It was. After adding 1.25 g of glass beads per 1.5 ml of the suspension, the cells were crushed for 6 minutes using a bead beater, and the supernatant was collected by centrifugation (15,000 rpm, 20 minutes). Protein concentration was quantified by the Bradford method (Bradford, MM 1976. Anal. Biochem. 72: 248-254).
  • Pspl1 actually has a promoter activity in Corynebacterium glutamicum and is an excellent promoter capable of strongly expressing the GFP gene as compared to Pcj4 produced by the company.
  • Example 3 Construction of a vector for ATPE expression comprising a Pspl1 promoter sequence
  • Corynebacterium with enhanced expression of ATPE Physical Engineering Epimerizing Enzyme from Acrobacterium kumerfaciens ATCC 33970
  • Pspl1 Physical Engineering Protein-1
  • pET24-ATPE (same as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2011-0035805) or pET24-ATPE-2 (same as the nucleotide sequence of the Republic of Korea Patent Registration No. 10-1203856: variant with improved heat safety, I33L -S213C)
  • PCR was performed with primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 (30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 30 minutes for 1 minute at 72 ° C),
  • the Open Reading Frame (ORF) of the ATPE gene was amplified.
  • the prepared pFIS-2-ATPE vector and pFIS-2-ATPE-2 vector were introduced into ATCC13032 strain using electroporation to prepare strains FIS-2-ATPE and FIS-2-ATPE-2.
  • the FIS-2-ATPE-2 strain was deposited on March 27 by the Korean spawn association (KCCM) and was given accession number KCCM11678P.
  • the strains were cultured in Example 1 (20 g glucose, 5 g ammonium sulfate, 5 g yeast extract, 1.5 g urea, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g,
  • the activity of ATPE was measured after culturing in an Erlenmeyer flask using 150 ⁇ g of biotin, 1.5 mg of thiamin hydrochloride, 3 mg of calcium pantothenic acid, 3 mg of nicotinamide (based on 1 liter of distilled water), and pH 7.2).
  • Pellets obtained by centrifugation were dissolved in EPPS solution (Ph 8.0) at 20% (w / v), and 300 g / L fructose solution as a substrate was added thereto to react at 50 ° C. for 3 hours, and then the reaction was stopped by heat treatment. . Subsequently, the supernatant was obtained by centrifugation, and the amount of cyclos was measured through HPLC analysis (FIGS. 2 to 4).
  • the Pspl1 promoter of the present invention can significantly increase the expression of a target gene in recombinant microorganisms compared to a conventionally known promoter, and thus can be usefully used in various industrial fields for producing high yields of functional materials.

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Abstract

본 발명은 신규한 프로모터, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 미생물, 및 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 확보된 프로모터는 기존의 재조합 미생물에서 단백질 대량 생산에 사용되던 프로모터들에 비하여 증가된 유전자 발현율을 보이므로, 미생물에서 고수율로 기능성 소재를 생산하고자 하는 식품, 제약, 농업 산업에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규 프로모터 및 이의 용도
본 발명은 신규한 프로모터, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 미생물, 및 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
사료, 의약품, 식품 등의 다양한 용도로 사용 가능한 아미노산 또는 유용 물질 등의 생산 균주로 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에 있어서, 생산량 증대를 위한 생합성 경로 상 유전자 조작 및/또는 외부 유전자 도입 등의 노력이 계속되어 왔다 (대한민국 등록특허 제10-0924065호). 이와 같은 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위해서는 고효율의 유전자 발현 시스템이 필요하다. 그 중 프로모터는 유전자 발현에 가장 크게 관여하는 요소이므로 유전자 발현 시스템에서는 프로모터의 선택이 가장 중요하다. 현재까지 코리네박테리움 속 미생물에서 이용 가능한 프로모터는 대장균 유래의 몇몇 프로모터 (Plac, Ptrc, Ptac)와 코리네박테리움 속 미생물 유래의 몇몇 프로모터 (Psod, Peftu, PgapA) 등이 이용되어 왔다. 그러나, 이들을 이용한 코리네박테리움 속 미생물 유전자 발현 시스템들은 대부분 대장균 유전자 발현 시스템에 비하여 낮은 발현 효율을 나타냈다.
이에, 코리네박테리움 속 미생물 유전자 발현 시스템에서 높은 발현 효율을 나타내는 프로모터의 개발 필요성이 여전히 대두되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물 균주에서 강하게 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 발굴하기 위하여 예의 노력한 결과, 최종적으로 신규한 프로모터를 개발하였고, 이의 높은 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 프로모터 활성을 갖는 신규한 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 목적 단백질 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 벡터가 도입된, 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 벡터가 도입된, 재조합 미생물을 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 (a) 상기 벡터가 도입된 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양한 미생물을 프럭토스와 반응시켜 사이코스를 생산하는 단계를 포함하는, 사이코스 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 통해 확보된 프로모터는 기존의 재조합 미생물에서 단백질 대량 생산에 사용되던 프로모터에 비하여 현저히 증가된 유전자 발현율 보이므로, 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속 미생물을 발현숙주로 하여 고수율로 기능성 소재를 생산하고자 하는 식품, 제약, 농업 산업에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 pFIS-2-ATPE-2 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pcj4-ATPE (FIS-4-ATPE)를 이용하여 과당 기질과 반응한 후 HPLC 크로마토그래피를 나타낸 것이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE (FIS-2-ATPE)를 이용하여 과당 기질과 반응한 후 HPLC 크로마토그래피를 나타낸 것이다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE-2 (FIS-2-ATPE-2)를 이용하여 과당 기질과 반응한 후 HPLC 크로마토그래피를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 구체적으로 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자일 수 있다. 본 발명에서 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자는 "spl1 프로모터" 또는 "Pspl1"과 혼용될 수 있다.
또한, 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자는 프로모터로도 명명될 수 있으며, 본 명세서에서는 상기 기술된 용어가 모두 사용된다.
본 발명의 프로모터는 목적하는 미생물에서 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 발현을 가져올 수 있으며, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 프로모터 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법 및 부위특이적 돌연변이법 등에 의하여 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 상기 프로모터는 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90 % 이상, 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 98 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열로서, 프로모터 활성을 가지는 뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 또는 부가된 뉴클레오티드 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로모터"란 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말한다. 상기 프로모터는 mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 프로모터 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자가 프로모터로서 기능할 수 있는 세포의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 대장균 등을 들 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균이나, 이에 제한되지 않으며, 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질 발현 카세트를 제공한다.
상기 핵산 분자에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "발현 카세트"란, 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 생산하기 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다.
상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질 발현 카세트는 구체적으로, 프로모터 서열 하류에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "목적 단백질"은 미생물로부터 발현시키고자 하는 단백질을 말한다. 구체적으로 재조합 미생물로부터 발현시키고자 하는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있으며, 그 예로 ATPE 유전자를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 ATPE 유전자는 사이코스 에피머화 효소로, 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 갖는 사이코스-3-에피머화 효소를 의미한다. 상기 ATPE 유전자의 서열은 미국 국립보건원의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스를 통하여 당업자가 용이하게 입수할 수 있다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 효소는 그 예로 대한민국 공개특허 제10-2011-0035805호의 서열목록 1의 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 상기 “기능성 단편”이란, 아미노산 서열에 일부 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 등에 의한 변이를 포함하며, 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 갖는 단편이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 ATPE 유전자는 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있는 목적 유전자 중 하나로서 단지 예시적인 것이다. 재조합 미생물로부터 발현될 수 있는 단백질이라면 제한 없이 목적 단백질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결"이란 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 핵산 분자에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 재조합 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 상기 목적 단백질 발현 카세트를 포함할 수 있다. 상기 유전자는 벡터 내에서 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다.
본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로, 구체적으로 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 프로모터는 본 발명의 spl1 프로모터일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λBL3, λBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 그 예로 pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 프로모터를 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자로 교체시킬 수 있다. 상기 핵산 분자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는, 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자에 목적 유전자가 작동 가능하게 연결되지 않은 벡터일 경우에도, 숙주 세포, 그 예로 코리네박테리움 속 미생물 내의 내재적 프로모터와 상동 재조합에 의해 교체될 수 있다. 이에 의해 숙주 세포, 예컨대 코리네박테리움 속 미생물의 내재적 유전자를 과발현시킬 수 있다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 ATPE 유전자일 수 있다. 이 경우 재조합 벡터는 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자에 ATPE 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서 사용된 “pFIS-2-ATPE” 또는 “pFIS-2-ATPE-2”일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 벡터가 도입된, 재조합 미생물을 제공한다.
상기 벡터에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 벡터는 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 상기 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 형질전환에 의해 미생물에 도입될 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 본 발명에 따른 프로모터, 또는 추가적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입 하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 미생물은 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자가 도입되어 프로모터로 작동할 수 있는 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 미생물은 에스케리키아 속 미생물일 수 있으며, 그 예로 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, (a) 상기 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 목적 단백질을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 미생물 또는 배지로부터 생산된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 재조합 미생물을 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌 ("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃일 수 있으나, 조건에 따라 변경이 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적 단백질을 제조하는 방법은, 미생물 또는 배양물로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있으며, 미생물 또는 배양물로부터 목적 단백질을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, (a) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터 및 ATPE 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양한 미생물을 프럭토스와 반응시켜 사이코스를 생산하는 단계를 포함하는, 사이코스 생산방법을 제공한다.
상기 프로모터, ATPE 유전자, 벡터 및 미생물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 생산방법은 종래 공지된 어떠한 프로모터에 ATPE 유전자를 작동 가능하게 연결하여 미생물에서 발현시킨 경우 보다 사이코스 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 발명에서는 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 합성하기 위해 코리네박테리움 속 미생물과 에스케리키아 속 미생물 유래의 다양한 프로모터 서열을 분석하여 서열번호 1의 뉴클레오티드를 갖는 프로모터를 합성하고, 이를 spl1 프로모터(이하 "Pspl1"이라 칭함)라 명명하였다. Pspl1의 발현 유도 활성을 측정하기 위하여, Pspl1을 GFP 또는 ATEP 유전자와 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제조하고, 이를 코리네박테리움 속 세균에 형질전환하여 형질전환 균주를 제작하였다
실시예 1: 프로모터 라이브러리 제작
코리네박테리움 속 균주에서 외래 단백질을 높은 발현량으로 발현시킬 수 있는 강한 합성 프로모터를 스크리닝하기 위해 라이브러리를 구축하였다. 상세하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum ), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenase ) 및 대장균 K12(Escherichia coli K12)의 게놈 DNA를 이용하여 DNA 셔플링 기술을 통해 보다 강력하게 발현되거나 다른 발현 프로파일을 보이는 프로모터 라이브러리를 확보하였다.
보다 상세하게는, 먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenase) 및 대장균 K12(Escherichia coli K12)의 게놈 DNA를 DNaseI을 처리하여 여러 조각으로 자른 후, 프라이머 없이 PCR 반응을 진행하였다. 이에 따라 유사한 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 각각의 단편들이 서로의 프라이머로 작용하여 라이브러리가 만들어질 수 있다. 그 다음 상기 라이브러리를 pUC19 벡터에 평활 말단 접합(blunt-end ligation) 방식으로 도입하였다. 그 다음 KpnI/PstI 절단부위를 포함하는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하여 다양하게 합성된 프로모터 라이브러리를 제작하였다.
라이브러리의 공벡터는 코리네박테리움 속 및 에스케리키아 속 균주에서 발현 가능한 셔틀벡터인 pECCG117(대한민국 등록특허 제10-0620092호, KFCC-10673/KFCC-10674)을 사용하였다. 먼저 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자 단편은 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자(pGFPuv vector (clontech 사, 미국))를 주형으로 하고 PstI/XbaI 절단부위를 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 4) 및 역방향 프라이머(서열번호 5)를 사용하여 PCR을 진행하여 제조하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 55 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, GFP 유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하는 PCR 산물(서열번호 6)을 수득하였다. 상기 PCR 산물과 공벡터 pECCG117을 제한효소 PstI과 XbaI으로 각각 처리한 후, DNA 접합 효소를 이용하여 작동가능하게 연결함으로써 최종적으로, GFP와 연결되어 있는 재조합 벡터인 pECCG117-gfp 플라스미드를 제조하였다.
상기 확보된 프로모터 라이브러리와 녹색형광 단백질이 클로닝 된 벡터를 제한 효소 KpnI과 PstI으로 처리한 후 DNA 접합 효소를 이용하여 접합시켜 프로모터 라이브러리 플라스미드를 제작하였다.
상기 제조된 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하여 합성프로모터 라이브러리를 제작하였다.
제작된 코리네박테리움 글루카미쿰 합성 프로모터 라이브러리를 배양, 균체 수득, 전처리 과정을 거쳐 녹색 형광 단백질의 발현에 의하여 형광을 나타내는 세포를 통해 스크리닝하였다. 여러 차례의 스크리닝 이후 최종적으로 선정된 강한 합성 프로모터 Pspl1을 확보하였으며, 서열번호 1과 같은 뉴클레오티드 서열을 가지고 있었다.
실시예 2 : 스크리닝을 통해 최종확보된 프로모터 및 다른 프로모터와의 활성 비교를 통한 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현유도활성 확인
실시예 1에서 최종적으로 확보된 Pspl1 프로모터를 함유하는 플라스미드 pECCG117-Pspl1-gfp, 양성대조군으로 종래 공지된 프로모터 Pcj4(대한민국 등록특허 제10-0620092호)를 가지는 플라스미드 pECCG117-Pcj4-gfp, 및 음성 대조군으로 pECCG117 플라스미드를 이용하여 리포터 단백질인 녹색 형광 단백질의 발현에 따른 프로모터 활성을 비교 분석하였다.
구체적으로, Pspl1 활성을 확인하기 위해, 상기에서 획득한 형질전환 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pspl1-gfp를 하기와 같은 방법으로 배양하고, GFP 활성을 측정하였다.
배지(포도당 20 g, 황산암모늄 5 g, 효모 추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 150 ㎍, 티아민 염산염 1.5 mg, 칼슘 판토테인산 3 mg, 니코틴아마이드 3 mg (증류수 1 리터 기준), pH 7.2) 25 ㎖가 담긴 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들을 20분의 1 비율로 각각 접종하고 30 ℃에서 배양 중기(OD600 = 10.0)까지 진탕 배양(200 rpm)하였다. 배양액으로부터 원심분리(5,000 rpm, 15 분)를 통하여 균체를 수거하여, 0.1 % Tris·HCl (pH 8.0) 완충용액으로 2 회 세척한 후, 동 완충용액으로 610 nm의 탁도가 160 가량이 되도록 현탁하였다. 현탁액 1.5 ㎖당 1.25 g의 글래스 비드(glass bead)를 첨가한 후, 비드 비터(bead beater)를 이용, 6분간 균체를 파쇄한 후, 원심분리 (15,000 rpm, 20 분)를 통하여 상층액을 수거하여, 브레드포드 방법(Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248-254)에 의한 단백질 농도를 정량하였다. 동일양의 균체 추출물에 대하여 Laure Gory등의 방법 (FEMS Microbiology Letters 194, 127-133, 2001)을 이용하여 488 nm에서 여기광을 조사하고, 511 nm 발출광을 LS-50B spectrophotometer (Perkin-Elmer) 기기를 이용하여 측정함으로써, GFP 유전자의 발현정도를 측정하였다(표 1).
균주 형광감도
ATCC13032/pECCG117 0.0
ATCC13032/Pcj4-gfp 897.2
ATCC13032/Pspl1-gfp 3256.3
표 1에 나타낸 바와 같이, Pspl1이 실제적으로 코리네박테리움 글루타미쿰에서 프로모터 활성을 가지고 있으며 기존 당사에서 제작한 Pcj4에 비하여 GFP 유전자를 강력하게 발현시킬 수 있는 우수한 프로모터임을 확인할 수 있었다.
실시예 3. Pspl1 프로모터 서열을 포함하는 ATPE 발현용 벡터 제작
코리네박테리움의 발현 개량 프로모터(이하 Pspl1)의 기능성을 평가하기 위해, 하나의 예시로서 ATPE(아크로박테리움 쿠머파시엔스 ATCC 33970 유래의 사이코스 에피머화 효소)의 발현이 증대된 코리네박테리움 균주용 벡터를 제작하였다.
pET24-ATPE(대한민국 공개특허 제10-2011-0035805호의 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 동일) 또는 pET24-ATPE-2(대한민국 등록특허 제10-1203856호의 뉴클레오티드 서열과 동일: 열안전성이 향상된 변이체, I33L-S213C) 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머로 PCR을 수행 (94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분간의 반응을 30 회)하여, ATPE 유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 증폭하였다. 실시예 1에서 제작된 코리네박테리움 균주용 벡터 pECCG117-Pspl1-GFP를 제한효소 PstI과 XbaI으로 처리한 후 ATPE 유전자 OFR 단편 및 ATPE-2 (ATPE 안정성 개량 변이주)를 BD In-Fusion kit를 이용하여 작동가능하게 연결함으로써 최종적으로 코레네박테리움 균주용 벡터 pECCG117-Pspl1-ATPE 벡터(이하 “pFIS-2-ATPE”)와 pECCG117-Pspl1-ATPE-2 벡터(이하 “pFIS-2-ATPE-2”)(도 1)를 제작하였다.
실시예 4. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내에서의 사이코스 생산효소 발현 및 활성의 확인
상기 제작된 pFIS-2-ATPE 벡터와 pFIS-2-ATPE-2 벡터를 전기천공법을 이용하여 ATCC13032 균주에 도입하여 FIS-2-ATPE 와 FIS-2-ATPE-2 균주를 제작하였다. 이 중 FIS-2-ATPE-2 균주는 한국종균협회(KCCM)에 3월 27일자로 기탁하고 기탁번호 KCCM11678P를 부여받았다. 상기 균주들을 실시예 1의 배지(포도당 20 g, 황산암모늄 5 g, 효모 추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 150 ㎍, 티아민 염산염 1.5 mg, 칼슘 판토테인산 3 mg, 니코틴아마이드 3 mg (증류수 1 리터 기준), pH 7.2)를 이용하여 삼각플라스크에서 배양한 후 ATPE의 활성을 측정하였다.
30 ℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 각각의 균주를 25 ㎖ 배지에 접종한 다음, 이를 30 ℃, 200 rpm의 배양기에서 24시간 동안 배양하였으며 배양 후 원심분리를 통해 상등액을 제거하고 차가운 PBS를 이용하여 수득 된 균체를 세척하고, 확보된 펠렛을 EPPS 용액(pH 8.0)에 20 %(w/v)로 용해시킨 후 1 mg/㎖의 POESA 첨가하여 실온에서 1시간 반응 후 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 펠렛을 EPPS 용액(Ph 8.0)에 20 %(w/v)로 용해시켜 기질인 300 g/L 프럭토스 용액을 첨가하여 50 ℃에서 3시간 반응시킨 후 열처리를 통해 반응을 정지시켰다. 이후 원심분리를 통해 상등액을 수득하고 HPLC 분석을 통해 싸이코스 생성량을 측정하였다(도 2 내지 도 4).
균주 프럭토스(g/L) 사이코스(g/L)
ATCC13032/pECCG117 300 0
ATCC13032/pECCG117-Pcj4-ATPE 285.86 11.06
ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE (FIS-2-ATPE) 224.15 71.57
ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE-2 (FIS-2-ATPE-2) 223.86 73.55
상기 표 2에 표시된 바와 같이, 상기 제작한 야생형 생산 균주 유래 ATPE 유전자가 발현된 코리네박테리움 균주 중 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE (FIS-2-ATPE) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE-2 (FIS-2-ATPE-2)는 코리네박테리움 글루타미쿰ATCC13032/pECCG117-Pcj4-ATPE (FIS-4-ATPE)보다 생산성이 현저히 향상되었음을 확인하였다.
종합하면, 본 발명의 Pspl1 프로모터는 종래 공지된 프로모터에 비하여 재조합 미생물에서 목적 유전자의 발현을 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 기능성 소재를 고수율로 생산하고자하는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2016002481-appb-I000001

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가지는, 프로모터 활성을 갖는 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항의 프로모터 활성을 갖는 분리된 핵산 분자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질 발현 카세트.
  3. 제1항의 분리된 핵산 분자 또는 제2항의 목적 단백질 발현 카세트를 포함하는, 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 ATPE 유전자인 것인, 재조합 벡터.
  5. 제3항 또는 제4항의 벡터가 도입된, 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인, 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 코리네박테리움 암모니아게네스인, 재조합 미생물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 속 미생물인, 재조합 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균인, 재조합 미생물.
  10. (a) 제5항의 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 목적 단백질을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물 또는 배지로부터 생산된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 제조하는 방법.
  11. (a) 제4항의 벡터가 도입된 미생물을 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양한 미생물을 프럭토스와 반응시켜 사이코스를 생산하는 단계를 포함하는, 사이코스 생산방법.
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